KR102662155B1

KR102662155B1 - 대사성 질환의 예방 또는 치료를 위한 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102662155B1
Application number: KR1020217012396A
Authority: KR
Inventors: 빈 웬; 구앙 닝; 신 마; 웨이칭 왕; 홍징 유; 지에 홍; 닝윤 순; 지치우 왕; 페이준 인; 루이신 리우; 위안 가오; 샤샤 왕
Original assignee: 에스피에이치 사인 파마슈티컬 래보러토리즈 컴파니 리미티드; 상하이 인스티튜트 오브 엔도크린 앤드 메타볼릭 디지지즈
Priority date: 2018-09-27
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2024-04-29
Anticipated expiration: 2039-09-25
Also published as: WO2020063646A1; DK3858977T5; EP3858977A1; DK3858977T3; EP3858977B1; EP3858977A4; US12036251B2; KR20210069663A; CN110964650A; AU2019346903A1; ES2974171T3; CN110964650B; US20220031769A1; CA3114471A1; AU2019346903C1; AU2019346903B2

Abstract

본 발명은 아커만시아(Akkermansia muciniphila) 균주 및 대사성 질환의 예방 또는 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다. 상기 균주는 Akkermansia muciniphila SSYD-3으로 명명되었고, 이의 수탁번호는 CGMCC 14764이다. 해당 아커만시아 균주는 종래의 아커만시아 균주 ATCC BAA835보다 발효 성능, 보존 안정성, 내산성과 내담즙염 측면 및 대사성 질환 치료 효과가 더 이상적이다.

Description

대사성 질환의 예방 또는 치료를 위한 균주 및 이의 용도

본원은 2018년 9월 27일자 출원된 중국특허출원 201811132882.1을 우선권 주장한다. 본원은 상기 중국특허출원의 전문을 인용한다.

기술분야

본 발명은 생명공학 분야의 미생물 분야에 관한 것이고, 구체적으로 대사성 질환의 예방 또는 치료를 위한 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

비만은 전세계적인 건강 문제이고, 글로벌 질병 부담 협회(The Global Burden of Disease)의 연구에 따르면 글로벌 비만 역학(epidemiology)은 점차 악화되어 생리적 위생 및 보건경제학에 부정적인 영향을 미치고 있다. 국제적으로 체질량지수(Body Mass Index, BMI)를 기준으로 비만의 정도를 판단하며 18.5≤BMI≤24.9일 경우는 정상 범위, BMI≥25는 과체중, BMI≥30은 비만이다. 전세계 195개 나라의 연구 데이터에 따르면 비만 발생률은 1980년 이후 두 배로 증가하였고 현재 어린이의 5%, 성인의 12%가 비만에 직면해 있으며 비만 발생 추세는 제2형 당뇨병과 유사한데, 이 추세에 따르면 2025년에는 전세계 5명 중 1명은 비만이 될 수 있다. 1975년부터 2014년까지 전세계 남성의 평균 BMI는 21.7kg/m²에서 24.2kg/m², 여성의 경우 22.1kg/m²에서 24.4kg/m²로 증가하였다. 2014년 기준 중국 성인 비만 발생률은 12.9%이고, 과체중률은 41.2%이고, 중심성 비만률은 20.9%로 해마다 증가하고 있다. 비만은 신체의 대사적 항상성을 파괴하여 대사성 질환을 유발하며, 비만은 제2형 당뇨병의 중요한 발병 위험 요인이다. 현재의 치료 방법은 주로 칼로리 섭취를 줄이고 열량 흡수를 저해하며, 수술로 위의 체적을 축소시켜 에너지 섭취를 줄일 수 있고, 기초 대사 및 운동으로 칼로리 소모 및 손실을 증가시킬 수 있으며, 갈색 지방, 베이지색 지방 조직의 증가는 열 생성을 증가시킬 수 있다. 또한, 장내 세포 및 세균총은 섭식 행동에 관여하며 비만 치료의 잠재적인 표적으로 사용될 수 있다.

비만과 제2형 당뇨병은 환경 및 유전적 요인의 영향을 받으며 인간 세균총의 유전자도 두 질병에서 중요한 역할을 하며; 세균총은 칼로리 흡수에 영향을 미치는 등 방식으로 비만에 영향을 줄 수 있고, 비만 또한 역으로 장내 세균총의 구성에 영향을 미칠 수 있다. 인간의 장내에는 1,000개 이상의 다른 종류의 세균이 있으며 총 수는 대략 1014개이다. 장내 세균총의 불균형은 비만을 포함한 많은 질병과 연관되며 비만 환자는 체내의 항 염증성 아커만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila)(이하, "아커만시아(Ackermania)")가 감소하는 반면 프로테오박테리아(Proteobacteria), 박테로이데스(Bacteroides), 캄필로박터(Campylobacter) 및 쉬겔라 종(Shigella spp.)이 증가하였다. 피르미쿠테스 문(phylum Firmicutes)과 의간균문(phylum Bacteroidetes)의 비율은 탄수화물 대사에 영향 줄 뿐만 아니라 단쇄 지방산의 생성을 변화시키고, 혈 중 아세트산 수치의 증가는 인슐린 저항성 및 그렐린 생성을 증가시킬 수 있으며 세균총은 그 중 가장 중요한 변수 요인일 수 있다. 장내 세균총은 에너지 대사의 균형을 중심으로 한 다양한 대사 경로를 변화시켜 비만의 발생과 발전에 영향을 미칠 수 있다. 프로바이오틱스와 프리바이오틱스는 장내 세균성 지질 다당류를 줄이고, 세균총의 구성을 변경시키며, 지방의 저장을 줄이는 등 방식으로 비만에 저항하는 역할을 할 수 있다.

출원번호 CN 201380070847.0, 공개번호 CN 104918626A인 중국 발명특허출원은 "대사성 질환의 치료를 위한 아커만시아(Akkermansia)의 용도"를 개시하였고, 이 특허출원에서 스크리닝된 아커만시아(Akkermansia) 세균총 ATCC BAA835는 도움이 필요한 피시험자의 체중 감량을 촉진하는데 사용할 수 있다. 본 발명자들은 연구를 통해 비록 아커만시아(Akkermansia) 균주 ATCC BAA835가 공인된 가장 고전적이고 가장 효과적인 아커만시아(Akkermansia) 균주로 인식되지만 이 균주가 발효, 보존 안정성, 내산성 및 내담즙염, 및 대사성 질환의 치료에 미치는 영향은 특별히 이상적이지 않음을 보여주었다.

본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 종래 기술의 아커만시아 균주 ATCC BAA835가 발효 성능, 보존 안정성, 내산성과 내담즙염 측면 및 대사성 질환의 치료에 있어서 효과가 특별히 이상적이지 않은 문제점을 극복하여, 대사성 질환의 예방 또는 치료를 위한 균주 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 대사성 질환의 예방 또는 치료를 위한 균주를 제공하며, 상기 균주는 아커만시아(Akkermansia muciniphila) 균주이고, 이는 Akkermansia muciniphila SSYD-3으로 명명되고, 이의 수탁번호는 CGMCC 14764이다.

본 발명은 대사성 질환의 예방 또는 치료를 위한 제제의 조제에 있어서, 상기 아커만시아(Akkermansia muciniphila) 균주의 용도를 제공한다.

본 발명에서, 대사성 질환은 당뇨병, 비만, 인슐린 저항, 알코올성 및 비알코올성 지방간, 고혈압, 고지혈증, 고콜레스테롤, 심장병 등 질환을 포함하는 당업계에서 통상적인 의미를 갖는다. 상기 예방, 치료 효과는 대사성 질환의 발생 및 발전의 예방, 대사성 질환의 치료 및 보조치료를 의미한다.

특히, 본 발명에서 아커만시아 균주가 대사성 질환의 치료 또는 예방에 있어서의 용도는 비만, 제2형 당뇨병, 대사증후군, 및 체중 증가와 글루코스 대사성 질환이 있는 기타 합병적 질환의 예방 또는 치료 중 하나 이상의 용도를 포함하며; 더 바람직하게는, 상기 용도는 체중 증가 지연, 내장 지방 조직 감소, 글루코스 주사 투여 후 15분 내지 30분 내의 혈당 감소, 및 공복 혈당 감소와 인슐린 투여 후 60분 내의 혈당 감소를 포함한다.

본 발명에서, 상기 제제의 형태는 당업계의 통상적인 형태이고 아커만시아를 함유한 의약품, 건강 식품, 기능성 식품, 식품, 음료, 사료 제품 및 식이보조제를 포함한다.

본 발명에서, 상기 아커만시아는 살아있는 유기체 또는 저온살균된 유기체를 의미한다.

본 발명에서, 상기 제제는 유효량의 상기 아커만시아를 활성 성분으로 사용하고 통상적인 부형제, 조미제, 붕해제, 접착제, 보조제, 점도증진제, 가용화제, 방부제, 윤활제 등 약품 보조제를 첨가하여 특정 제조 공정에 따라 제조된다. 상기 제형은 바람직하게 동결건조 균제이고, 그 중의 생균 수는 바람직하게 10¹⁰CFU/g이다.

그 중에서, 상기 유효량은 아커만시아를 주요 약물 활성 성분으로 조제된 고형의 생균 제제에 함유된 총 생균 수가 10⁶ 내지 10¹⁴CFU/g임을 의미한다. 그 중에서, 상기 유효량은 아커만시아를 주요 약물 활성 성분으로 조제된 액상의 생균 제제에 함유된 총 생균 수가 10⁶ 내지 10¹⁴CFU/mL임을 의미한다.

당업계의 상식에 부합되는 기초하에, 상기 언급된 바람직한 조건은 본 발명의 바람직한 실시예를 얻기 위해 임의로 조합될 수 있다.

본 발명에 사용된 시약 및 원료는 시판되고 있다.

본 발명의 긍정적인 효과는 다음과 같다: 본 발명은 연구를 통해 Akkermansia muciniphila SSYD-3이 발효 성능, 보존 안정성, 내산성과 내담즙염 측면에서 아커만시아 표준 균주(ATCC BAA835)보다 현저히 우수하며, 또한 체중 증가 지연, 내장 지방 조직 감소, 글루코스 주사 투여 후 15분 내지 30분 내의 혈당 감소, 및 공복 혈당 감소와 인슐린 투여 후 60분 내의 혈당 감소 등 기능 면에서 표준 균주(ATCC BAA835)보다 현저히 우수하다는 것을 보여준다.

미생물 물질의 기탁 정보

본 발명의 Akkermansia muciniphila SSYD-3(W03 균주로 약칭)은 2017년 09월 29일 중국 일반 미생물 균주 수집 센터(CGMCC)에 기탁되었다. 기탁주소: 중국 베이징 100101 차오양 디스트릭트 웨스트 베이첸 로드 레인 1 빌딩 3, 수탁번호: CGMCC 14764, 배양물 명칭은 Akkermansia muciniphila SSYD-3이고, 분류 명칭은 Akkermansia muciniphila이다.

도 1은 실시예 3에서의 아커만시아 성장 곡선이다.
도 2는 4℃ 보존 조건 하에서 실시예 5의 아커만시아 균 함량 변화 곡선이다.
도 3은 25℃ 보존 조건 하에서 실시예 5의 아커만시아 균 함량 변화 곡선이다.
도 4는 실시예 8에서 W03 및 ATCC BAA835를 마우스에 적용하였을 경우, 이의 체중 증가 결과이다.
도 5는 실시예 8에서 W03 및 ATCC BAA835를 마우스에 적용하였을 경우, 이의 내장 지방 조직 상황이다.
도 6은 실시예 8에서 W03 및 ATCC BAA835를 마우스에 적용하였을 경우, 복강 내 글루코스 주사 투여 시의 내당능 상황이다.
도 7은 실시예 8에서 W03 및 ATCC BAA835를 마우스에 적용하였을 경우, 인슐린 복강 내 주사 투여 후의 혈당 상황이다.
도 8은 실시예 8에서 W03 및 ATCC BAA835를 마우스에 적용하였을 경우, 체지방 변화 상황이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하지만, 본 발명은 설명된 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다. 하기 실시예에 구체적인 조건이 표기되지 않은 실험 방법은 통상적인 방법 및 조건에 따라, 또는 제품 사양에 따라 선택된다.

각 그룹의 실험 데이터는 평균±표준편차로 표시되며, 분류 후 SPSS18.0 통계 소프트웨어에 도입하여 데이터를 분석하였다. 분산 분석을 통해 각 군의 평균 간의 차이를 검정하였다. 동물 실험에서는 Shapiro-Wilk로 데이터 분포를 확인하였고, Levene's test로 분산의 동질성을 추가로 테스트하였으며, 해당 t-검정으로 지정된 두 그룹간의 중요성을 평가하였다. P＜0.05는 유의한 차이를 보이고, 통계학적 의미를 가짐을 의미한다.

실시예 1: 균의 스크리닝

1. 배양 배지

분리 배지: 0.4g KH₂PO₄; 0.53g Na₂HPO₄; 0.3g NH₄Cl; 0.3g NaCl; 0.1g MgCl₂·6H₂O; 0.11g CaCl₂; 0.5mg 레자주린; 4g NaHCO₃; 0.25g Na₂S·7-9H₂O; 0.25% 뮤코 단백질.

발효 배지 1: Brain Heart Infusion Broth(뇌심장 침출액 브로스, BHI).

발효 배지 2: 5g 트립톤, 5g 소이펩톤, 5g 쇠고기 분말, 5g 효모 분말, 4g 글루코스, 3gNaCl, 1.5g MgSO₄, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, 물 1L, pH=7.2.

분리 및 발효 배지는 121℃에서 15분 동안 고압 멸균하여 준비하였다.

2. 균주의 분리 및 동정

① 조제된 뮤코 단백질 분리 배지를 세럼병에 담았다(액체 부피 10/30 mL).

② 건강한 성인 분변 0.5g을 멸균된 PBS 인산 완충염 용액에 담아 골고루 분산시킨 후, 분변을 PBS 용액에 10 배 구배로 연속 희석하고 1mL 희석액을 취하여 뮤코 단백질 세럼병에 접종하였다.

③ 뮤코 단백질 세럼병을 37℃에 방치하고, 혐기적 조건에서 48시간 동안 배양하였다.

④ 육안으로 혼탁 정도를 관찰할 수 있는 가장 높은 희석 구배를 갖는 뮤코 단백질 발효액을 취하여 PBS 완충액으로 10^-6 내지 10^-9이 되게끔 희석하였다.

⑤ 희석액을 뇌심장 한천 배지에 도말하고 24 내지 48시간 동안 배양하였으며, 1mm 크기의 콜로니(colony)를 형성한 집락을 취하여 정제 및 배양 후 균주의 16S rDNA 균종을 동정하였다.

결과: 콜로니의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 결부하고, 또한 균주의 16S rDNA 증폭 결과 W03 균주의 16S rDNA 서열은 서열 표 중의 서열번호 1에 기재된 바와 같았다. 서열화된 서열을 GenBank에 이미 등록된 16S rDNA유전자 서열과 상동성을 비교하여 동정한 결과 분리된 박테리아는 Akkermansia muciniphila였으며, Akkermansia muciniphila SSYD-3으로 명명되었다. 기존 서열에 비해 상동성이 가장 높은 것은 99%였다.

실시예 2: 아커만시아 발효

① 아커만시아를 뇌심장 한천 배지에 3개 구역으로 나누어 접종하고 37℃ 혐기적 조건에서 48시간 동안 배양하였다.

② 한천 플레이트에서 아커만시아 단일 콜로니를 취하여 15mL의 뇌심장 침출액 배지에 접종하고 37℃ 혐기적 조건에서 48시간 동안 배양하였다.

③ 15mL의 혐기성 튜브에서 10mL의 발효액을 200mL의 뇌심장 침출액 배지에 옮기고, 37℃ 혐기적 조건에서 24시간 동안 배양하였다.

④ 200mL의 아커만시아 발효액을 뇌심장 침출액 배지에 접종하였으며, 5L의 발효 탱크의 적재량 부피는 4L이고, 혐기성 가스는 질소와 이산화탄소의 혼합 이원가스(N₂:CO₂=9:1)이고, 교반 속도는 100r/분이고, 온도는 37℃이고, 24시간 동안 혐기적으로 배양하였다.

실시예 3: 아커만시아 발효

① W03 및 표준 균주 ATCC BAA835(미국 표준 균주 기탁 센터, American Type Culture Collection(ATCC)에서 구매)의 단일 콜로니를 취하여 각각 15mL의 발효 배지 2에 접종하고, 혐기적 조건에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

② 15mL의 혐기성 튜브에서 10mL의 발효액을 200mL의 발효 배지 2에 옮기고, 37℃ 혐기적으로 24시간 동안 배양하였다.

③ 200mL의 아커만시아 발효액을 발효 배지 2에 접종하였으며, 5L의 발효탱크의 적재량 부피는 4L이고, 혐기성 가스는 질소와 이산화탄소의 혼합 이원가스(N₂:CO₂=9:1)이고, 교반 속도는 100r/분이고, 온도는 37℃이고, pH는 6.5이 되게끔 공정을 제어하고, OD가 변하지 않을 때까지 혐기적으로 배양하였다.

결과: 도 1에 도시된 바와 같이, W03 균은 13시간 발효시켰을 경우 OD 값이 최대 2.26(2.13×10⁹CFU/mL)으로 안정기에 도달하였고, ATCC BAA835 균은 18시간 발효시켰을 경우 OD 값이 최대 1.87(9.67×10⁸CFU/mL)로 안정기에 도달하였으며, W03 균의 발효 시간이 더 짧아 산업화 생산에 더 유리하였다. W03 균은 발효 과정에서 OD 값이 ATCC BAA835보다 유의하게 높았고, 발효 단위가 더 높았다.

실시예 4: 아커만시아 CGMCC 14764의 동결건조 균제

① 동결건조 보호제: 트레할로스, 수크로오스, 분유.

② 실시예 3에서 얻은 발효액 8000R을 20분 동안 원심분리하여 균체를 수집하였다.

③ 아커만시아를 원심분리하여 얻은 균체를 동결건조 보호제, 물과 혼합하였으며, 동결건조 전의 용액 내 트레할로스, 수크로오스, 분유의 질량 백분율이 각각 5%, 5% 및 10%가 되도록 하고, 동결 건조하여 동결건조 균 분말을 얻었으며, 균 분말 중 CGMCC 14764의 수탁번호를 가진 아커만시아 균주의 생균 수는 10¹⁰CFU/g였다.

비교예 1: 아커만시아 균주 ATCC BAA835의 동결건조 균제

비교예 1의 동결건조 균제의 제조 방법 및 매개변수 조건은 균주가 아커만시아 균주 ATCC BAA835인 것을 제외하고는 실시예 4와 동일하다.

실시예 5: 아커만시아 균 분말의 보존 안정성

실시예 4에서 얻은 W03 균 분말과 비교예 1에서 얻은 ATCC BAA835 균 분말을 4℃에서 24개월, 25℃에서 6개월 동안 보존하여, 보존 안정성을 비교하였다.

결과: 도 2에서 알 수 있듯이, 4℃에서 2년 동안 보존 후, W03 균 분말의 생균 수는 4.85×10⁸CFU/g으로, ATCC BAA835 균 분말의 생균 수(6.69×10⁷CFU/g)보다 한 자릿수가 더 높으며, W03 균주가 더 안정적이고, 보존 수명이 더 길었다. 도 3에서 알 수 있듯이, 25℃에서 6개월 동안 보존한 후, W03 균 분말의 생균 수는 8.23×10⁸CFU/g으로, ATCC BAA835 균 분말의 생균 수(7.79×10⁷CFU/g)보다 한 자릿수가 더 높으며, W03 균주의 보존 안정성이 더 높았다.

실시예 6: 모의 위액에서 아커만시아의 활성 실험

염화나트륨 2.0g과 펩신 3.2g에 7.0mL의 염산 및 물을 넣고 용해시켰으며, 부피가 1000mL가 되게끔 하고, pH가 1.2인 인공 위액을 0.22μm 필터 맴브레인으로 필터링하여 멸균하였다. 멸균된 인공 위액 20mL을 30 mL의 무균 바이알에 분주하고, 인공 위액 3개 바이알을 알류미늄 캡으로 밀봉하여 질소 가스를 사용하여 치환 보호를 하였다. W03 및 ATCC BAA835의 동결건조 균 분말을 1 mL의 무균 PBS에 넣고, 1 mL의 균 현탁액을 상기 바이알에 접종였으며, 37 ℃에 방치하고, 서로 다른 시간에 샘플을 채취하여 생존율을 계산하였다.

결과: 본 실험은 모의 위액 환경에서 두 균주의 활성을 연구하였다. 표 1에서 알 수 있듯이, 두 균주의 생존율은 시간이 지남에 따라 유의하게 감소하는 추세를 보여주며, 서로 다른 시간대에서의 W03 균의 생존율은 모두 ATCC BAA835 균보다 높음으로써, W03 균이 더 강한 내산성을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 7: 모의 장액에서 아커만시아의 활성 실험

인산이수소칼륨 6.8 g 및 담즙염 3호 3 g에 물 500 mL을 넣고, 0.4%의 수산화나트륨 용액으로 pH가 6.8이 되게끔 조정하며; 따로 판크레아틴 10g을 취한 후 물을 넣어 적당히 녹이고, 두 가지 액체를 혼합한 후, 물을 넣어 부피가 1000 mL이 되게끔 하며, 0.22μm 필터 맴브레인으로 필터링하여 멸균하였다. 멸균된 인공 장액 20mL를 30 mL의 무균 바이알에 나누어 담고, 인공 위액 3개 바이알을 알류미늄 캡으로 밀봉하여 질소 가스를 사용하여 치환 보호를 하였다. W03 및 ATCC BAA835의 동결건조 균 분말을 1 mL의 무균 PBS에 넣고, 1 mL의 균 현탁액을 상기 바이알에 접종하였으며, 37 ℃에 방치하고, 서로 다른 시간에 샘플을 채취하여 생존율을 계산하였다.

결과: 표 2에서 알 수 있듯이, 동일한 조건 하에, W03 균은 대조균주 ATCC BAA 835보다 담즙염 내성이 더 우수하고, W03 균이 고담즙염 환경에서 장내 집락에 저항하는데 더 유리함을 확인할 수 있었다.

실시예 8: 대사성 질환에서 아커만시아의 용도

8주령의 수컷 C57BL/6마우스(특이성 병원체가 없음, 상하이 실험동물센터)를 케이지당(필터케이지) 3마리씩 나누고, 12시간의 엄격한 일광 사이클 통제하에 자유롭게 음식을 섭취하도록 하였다. 새로운 환경에 적응시킨 후, 표준 식단 또는 60kcal% 지방이 포함된 고지방식이(Research Diet, D12492i)를 제공하였다. 동물을 무작위로 2그룹으로 나누고, 200μL의 무균 PBS 및 아커만시아 균 용액(10⁸CFU/100μL)을 매일 한번씩 8주 동안 지속적으로 경구 투여하였다.

경구 위관 투여 전과 실험 종료 시 체중을 측정하였다. 연속 7일 동안의 음식 섭취량은 케이지(케이지당 3마리 마우스)로 기록하여, 마우스 당 일일 평균 음식 섭취량을 계산하였다. 경구 위관 투여 전 및 실험 종료 시 분변 샘플을 수집하고 추가 분석을 위해 즉시 -80℃ 냉장고에 보존하였다. 생체 체질량 분석기(EchoMRI)를 사용하여 체지방량을 평가하였다. 마우스 꼬리 정맥에서 전혈을 채취하고, 혈당 측정기(LifeScan)로 혈당 수치와 인슐린 수치를 측정하였다. 동일한 시작점을 확보하기 위해 본 연구에서는 무작위 할당 방법을 채택하지 않고 체중에 따라 환경에 적응한 마우스를 그룹화하였다. 모든 작업은 상하이 교통대학 의학원 동물윤리위원회의 승인을 받았다.

실험 결과는 아래와 같다:

1. W03은 고지방식이로 유도된 비만 마우스의 체중 증가를 지연시키며, PBS 및 양성 대조군 ATCC BAA835보다 효과가 우수하며, W03을 적용한 마우스의 체중 증가율은 ATCC BAA835를 적용한 마우스보다 낮았으며, 또한 유의한 차이가 있었다. ** p<0.01(도 4: 군당 n=9 내지 10마리, 평균 수치±표준 오차로 표시, * 통계적으로 유의함을 나타냄. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).

2. W03의 적용은 고지방식이로 유도된 비만 마우스의 내장 지방 조직을 감소시키며, 양성 대조군 ATCC BAA835보다 효과가 우수하며, 또한 유의한 차이가 있었다. *** p<0.001; ATCC BAA835 및 대조군 PBS 군간에 유의한 차이가 없었으며, 즉 P>0.05이였으며, 이는 해당 균주가 고지방 비만 마우스의 내장 지방 조직을 개선하지 않음을 나타내었다(도 5: 군당 n=9 내지 10마리, 평균 수치±표준 오차로 표시, *통계적으로 유의함을 나타냄. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001). 내장 지방 축적은 중심성 비만의 주요 특징이고， 또한 내장 지방은 인슐린 저항성 및 심혈관 위험 사건과 같은 비만 관련 대사성 합병증과 유의한 연관이 있는 것으로 생각되고 있다. 따라서, 내장 지방 조직을 줄이면 비만 환자의 대사 관련 합병증 및 심혈관 위험 사건 발생에 대해 양호한 예방 효과가 있다.

3. W03의 적용은 고지방식이로 유도된 비만 마우스의 내당능을 개선하였다. 글루코스 주사 투여 15분, 30분 후 혈당은 양성 대조군 ATCC BAA835보다 유의하게 낮았으며, 15분 및 30분일 경우 유의한 차이가 있었다(도 6: 군당 n=9 내지 10마리, 평균 수치±표준 오차로 표시, *PBS에 비해 통계적으로 유의한 차이가 있음을 의미함. # ATCC BAA835에 비해 통계적으로 유의한 차이가 있음을 의미함. * # p<0.05, ** ## p<0.01, *** ###p<0.001). 고지방식이는 글루코스 조절 능력을 손상시킬 수 있으며, W03의 처리는 손상 정도를 완화시킬 수 있고, 복강 내 투여에 의한 마우스의 내당능이 PBS 군에 비해 개선된 것으로 나타났다. W03의 적용은 ATCC BAA835 적용 후에 비해 내당능의 개선이 더 현저했으며, 그 효과는 양성 대조군 ATCC BAA835보다 우수하였다. W03은 당뇨병 전기 단계에서 손상된 글루코스 조절을 개선하고 당뇨병의 발생 및 발전의 예방에 일정하게 기여하였다고 제시되었다.

4. W03의 적용은 고지방식이로 유도된 비만 마우스의 인슐린 내성을 개선시켰고, 공복 혈당 및 인슐린 주사 투여 후 15분, 30분, 60분, 120분 시점에서의 혈당 수치가 모두 대조군 PBS보다 낮았으며, 그 중 공복 혈당 수치 및 인슐린 주사 투여 후 15분, 30분, 60분 시점에서의 혈당은 양성 대조군 ATCC BAA835(도 7: 군당 n=9 내지 10마리, 평균 수치±표준 오차로 표시, * PBS에 비해 통계적으로 유의한 차이가 있음을 의미함, # ATCC BAA835에 비해 통계적으로 유의한 차이가 있음을 의미함. * # p<0.05, ** ## p<0.01, *** ###p<0.001)보다 우월하였다. 고지방식이는 인슐린 감수성을 감소시키고, 인슐린 내성을 악화시키는 반면에 W03의 적용은 고지방식이로 유도된 인슐린 내성의 악화를 완화시킬 수 있으며, 그 효과는 양성 대조군 ATCC BAA835보다 우월하였다. W03의 적용은 인슐린 감수성이 감소된 환자에게 혜택을 주어 당뇨병의 발생과 반전을 예방할 수 있다고 제시하였다.

5, 본 연구에서 모델 동물의 체지방 구성은 비교적 복잡하며, 무게를 측정할 수 있는 사타구니 지방(피하 지방), 부고환옆 지방(내장 지방)외에도, 그물 막(omental) 지방과 같은 수집 및 무게 측정이 어려운 지방도 있었다. 따라서, 모델동물의 체성분은 소동물 체지방 영상 장치로 분석되었고, 결과는 도 8에 나타낸 바와 같이, 결과적으로 원 균주 ATCC BAA835에 비해 W03 균의 적용은 체지방량을 감소시키고, 비 체지방함량(근육, 골격 등)을 크게 증가시키는 추세인 것으로 나타났다.

약력학 실험의 임상면에서 긍정적인 의미:

비만 환자의 약 50%가 고혈당증, 고지혈증, 고혈압 등과 같은 “3고” 증상이 있으며, 내장 지방 침착은 중심성 비만의 주요 특징인 동시에 내장 지방은 인슐린 저항성, 심혈관 및 뇌혈관 위험 사건과 같은 비만 관련 대사성 합병증과 유의한 연관이 있는 것으로 간주되었다. 따라서, 내장 지방 조직을 줄이면 위와 같은 위험 이벤트의 발생에 대해 양호한 예방 효과가 있다. 경구 내당능 향상 측면에서 W03을 사용한 마우스는 식 후 30분 및 60분 시점에 정맥 내 혈당의 3 내지 4mmol/L감소하였으며, 비중증 당뇨병 환자의 경우 임상적으로 1.5 내지 2U 인슐린을 적게 사용하거나 2차 저혈당 약물의 사용을 줄일 수 있음을 의미한다. W03의 사용은 또한 고지방식이로 유도된 비만 마우스의 정맥 내 인슐린 내성을 개선할 수 있으며, 그 실질적인 의미는 인슐린 저항성의 대부분은 지방의 축적에 의해 유발되는 것인데 인슐린 저항을 개선하면 당뇨병 전기에서 당뇨병으로의 진행을 늦추고, 또한 인슐린 주사 투여 환자의 인슐린 용량을 줄일 수 있다. 인슐린의 장기적인 임상적 사용은 체중 증가의 위험이 있기 때문에 인슐린 사용량을 줄이는 것은 당뇨병이 있는 비만 환자에게 실질적으로 매우 중요한 의의가 있다. 또한, 많은 약물은 간에서 대사되고 해독되어야 하는데 비만 환자의 간은 이미 경도의 염증이 있고 간 기능이 약간 증가되어 있으며 약물 사용을 줄이는 것은 비만 또는 당뇨병이 있는 비만과 같은 만성 질환 환자의 신체적 부담과 치료 비용을 줄이는 데 매우 중요한 의의가 있다.

위에서 본 발명의 구체적인 실시형태에 대해 설명을 하였지만, 당업자라면 이것들이 단순한 예이고, 본 발명의 원리 및 본질을 벗어나지 않는 전제하에, 이들 실시형태에 대해 다양한 변경 또는 수정이 가능함을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 첨부된 청구범위에 한정된다.

[수탁번호]

기탁기관명 : 중국 일반 미생물 균주 수집 센터(CGMCC)

수탁번호 : CGMCC 14764

수탁일자 : 20170929

SEQUENCE LISTING <110> SPH SINE PHARMACEUTICAL LABORATORIES CO., LTD SHANGHAI INSTITUTE OF ENDOCRINE AND METABOLIC DISEASES <120> Strain for Preventing and Treating Metabolic Diseases and Use Thereof <130> P20417246KR <140> PCT/CN2019/107757 <141> 2019-09-25 <150> CN 201811132882.1 <151> 2018-09-27 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1421 <212> DNA <213> Akkermansia muciniphila <400> 1 gaccccgtct aaccttagga ccctgcctcc ttgcggttgg cttcagatac ttcgggtgcg 60 accggcttcc atgatgtgac gggcggtgtg tacaagaccc gggaacgtat tcacggcgcc 120 gtagctgatg cgccattact agcgattccg gcttcgtgta ggcgggttgc agcctacagt 180 ccgaactggg cccagttttt aggatttcct ccgcctcgcg gcttcggccc cctctgtact 240 gggcattgta gtacgtgtgc agccctgggc ataagggcca tactgacctg acgtcgtccc 300 caccttcctc ccagttgatc tgggcagtct cgccagagtc cccaccttca cgtgctggta 360 actggcaaca ggggttgcgc tcgttgctgg acttaaccaa acatctcacg acacgagctg 420 acgacggcca tgcagcacct gtgtaacgcc tccgaagagt cgcatgcttt cacatgttgt 480 tcattacatg tcaagcccag gtaaggttct tcgcgttgca tcgaattaag ccacatactc 540 caccgcttgt gcgggtcccc gtcaatttct ttgagtttta atcttgcgac cgtactcccc 600 aggcggcacg cttaacgcgt tagctccggc acgcaggggg tcgattcccc gcacaccaag 660 cgtgcaccgt ttactgccag gactacaggg gtatctaatc cctttcgctc ccctggcctt 720 cgtgcctcag cgtcagttaa tgtccaggaa cccgccttcg ccacgagtgt tcctctcgat 780 atctacgcat ttcactgcta caccgagaat tccggttccc cctccattac tctagtctcg 840 cagtatcatg tgccgtccgc gggttgagcc cgcgcctttc acacacgact tacgaaacag 900 cctacgcacg ctttacgccc agtgattccg aacaacgctt gagacctctg tattaccgcg 960 gctgctggca cagagttagc cgtctcttcc tcttgtggta ctatcttttt aatttgctcc 1020 cacatgacag gggtttacaa tccgaagacc ttcattcccc cacgcggcgt cgcaccatca 1080 gggtttcccc cattgtgaat gattctcgac tgctgccacc cgtaggtgtc tggaccgtgt 1140 ctcagttcca gtgtggccgg acatcctctc agaccggcta cccgtcatcg ccttggtgag 1200 ccgttacctc accaactaac taataggccg cgagcccatc cccaagcgca ttgctgcttt 1260 aatctttcga tactatgcgg tattaatccc agtttcccag ggctatcccg ctctcggggg 1320 caggttactc acgtgttact cacccgtgcg ccactagaga attattagca agctagcaat 1380 tctctcgttc gacttgcatt ctaagcaggc cggccacggc c 1421

Claims

수탁번호 CGMCC 14764로 기탁된 아커만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila) SSYD-3으로 명명되는 아커만시아 무시니필라 균주인 것을 특징으로 하는, 대사성 질환의 예방 또는 치료를 위한 균주.
제1항에 따른 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는, 대사성 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 제제.
제2항에 있어서,
상기 제제는 유효량의 아커만시아 무시니필라 균주를 활성 성분으로 사용하고, 약물 부형제를 첨가하여 조제되는 것을 특징으로 하는, 제제.
제2항 또는 제3항에 있어서,
상기 제제는 동결건조 균제이고, 그 중 아커만시아 무시니필라 균주의 생균 수는 10¹⁰CFU/g인 것을 특징으로 하는, 제제.
제3항에 있어서,
상기 유효량은 아커만시아 무시니필라가 고형의 생균 제제 중 주요 활성 성분으로서, 10⁶ 내지 10¹⁴CFU/g의 생균 수를 가짐을 나타내는 것을 특징으로 하는, 제제.
제3항에 있어서,
상기 유효량은 아커만시아 무시니필라가 액상의 생균 제제 중 주요 활성 성분으로서, 10⁶ 내지 10¹⁴CFU/mL의 생균 수를 가짐을 나타내는 것을 특징으로 하는, 제제.
제2항에 있어서,
상기 제제는 비만, 제2형 당뇨병, 대사증후군, 및 체중 증가와 글루코스 대사성 질환이 있는 기타 합병적 질환의 예방 또는 치료 중 하나 이상의 용도에 사용되는 것을 특징으로 하는, 제제.
제2항에 있어서,
상기 제제는 체중 증가 지연, 내장 지방 조직 감소, 글루코스 주사 후 15분 내지 30분 내의 혈당 감소, 및 공복 혈당 감소와 인슐린 주사 후 60분 내의 혈당 감소 중 하나 이상의 용도에 사용되는 것을 특징으로 하는, 제제.
제1항에 있어서,
상기 균주는 유효량으로 사용되는 것을 특징으로 하는, 균주.
제9항에 있어서,
상기 유효량은 균주가 10⁶ 내지 10¹⁴CFU/g의 생균 수를 가짐을 나타내는 것을 특징으로 하는, 균주.
제1항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 균주는 비만, 제2형 당뇨병, 대사증후군, 및 체중 증가와 글루코스 대사성 질환이 있는 기타 합병적 질환의 예방 또는 치료 중 하나 이상의 용도에 사용되는 것을 특징으로 하는, 균주.
제1항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 균주는 체중 증가 지연, 내장 지방 조직 감소, 글루코스 주사 후 15분 내지 30분 내의 혈당 감소, 및 공복 혈당 감소와 인슐린 주사 투여 후 60분 내의 혈당 감소 중 하나 이상의 용도에 사용되는 것을 특징으로 하는, 균주.