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CN110267669A - 与分离并纯化的微生物有关的方法和组合物 - Google Patents

与分离并纯化的微生物有关的方法和组合物 Download PDF

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CN110267669A
CN110267669A CN201780085731.2A CN201780085731A CN110267669A CN 110267669 A CN110267669 A CN 110267669A CN 201780085731 A CN201780085731 A CN 201780085731A CN 110267669 A CN110267669 A CN 110267669A
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CN
China
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clostridium
composition
microorganism
group
rrna
Prior art date
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Pending
Application number
CN201780085731.2A
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English (en)
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科琳·卡特克利菲
约翰·S·艾德
詹姆斯·H·布拉德
马库斯·F·施克尔伯格
安德鲁·T·程
奥维尔·G·科尔特曼
托马·奥特曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pandlem Therapeutic Co
Pendulum Therapeutics Inc
Original Assignee
Pandlem Therapeutic Co
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Abstract

本公开内容提供了配制分离并纯化的微生物的组合物的方法。本公开内容提供了配制用于向有需要的受试者施用的组合物的方法。该方法可包括获得基本上干燥且包含约10％或更少的残余水分的混合物。该混合物可包含分离并纯化的微生物的群体和药学上可接受的载体。该群体可包含一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物。该方法可以进一步包括将所述混合物包封在肠溶衣胶囊中以供递送至所述受试者。

Description

与分离并纯化的微生物有关的方法和组合物
交叉引用
本申请要求2016年12月6日提交的第62/430,891号美国临时申请和2017年5月5日提交的第62/502,483号美国临时申请的优先权，这些临时申请各自通过引用整体并入本文。
背景技术
数万亿微生物可寄居在个体身体的不同位置。这些不同位置处的群体通常被称为微生物组。微生物组可在许多健康状况和疾病中发挥作用。尽管微生物组与健康之间存在相互联系，但各种微生物组的复杂性以及在微生物组组成的表征、分类和分析方面的困难可使了解微生物组具有挑战性。这些挑战可对微生物组相关健康状况和疾病的诊断和治疗应用的开发构成障碍。
生物保藏
本申请包含对生物材料保藏的提及。以下生物材料已经保藏在Manassas,VA的美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并具有以下名称、保藏号和保藏日期：拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)；(PTA-123634，2016年12月14日保藏)；丁酸梭菌(Clostridium butyricum)；(PTA-123635，2016年12月14日保藏)。
发明内容
本文公开了一种用于向有需要的受试者施用的组合物，其包含：一种或多种分离并纯化的微生物的群体，其包含一种或多种专性厌氧微生物，其中如通过在第一时间使用流式细胞术测量活微生物或活性(active)细胞的第一细胞计数并在第二时间使用流式细胞术测量活微生物或活性细胞的第二细胞计数所确定的，所述组合物在4摄氏度的温度或室温下储存2周或更长时间时保持稳定，其中所述第一时间和所述第二时间间隔2周或更长时间，并且进一步其中所述第二细胞计数是所述第一细胞计数的至少0.1％。
在另一个方面是一种用于向有需要的受试者施用的组合物，其包含：一种或多种分离并纯化的微生物的群体，所述群体包含一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物，使得当在4摄氏度或室温下储存14天的时间时，所述一种或多种专性厌氧微生物中的至少0.1％是活微生物或活性细胞，其中所述群体是基本上干燥的并且包含约5％或更少的残余水分。
在一个实施方案中，所述一种或多种专性厌氧微生物中的至少1％是活细胞或活性细胞。在一个实施方案中，所述组合物被包封并且所述一种或多种专性厌氧微生物中的至少20％是活细胞或活性细胞。在一个实施方案中，所述一种或多种专性厌氧微生物中的5％至75％是活微生物或活细胞。在一个实施方案中，所述一种或多种专性厌氧微生物中的10％至50％是活微生物或活性细胞。在一个实施方案中，所述组合物在所述群体中包含至少108个活性细胞/g的一种或多种微生物。室温为20至25摄氏度。室温可以是20摄氏度。
在又一个方面，提供了一种用于向有需要的受试者施用的组合物，其包含一种或多种分离并纯化的微生物的群体，其中所述组合物包含以下性质：a)至少1.0x 108个活性细胞/g，以及b)所述组合物包含不超过5.0mcg/g的砷、不超过3.3mcg/g的铅、不超过5.0mcg/g的汞和不超过1.6mcg/g的镉。
在又一个方面，提供了一种用于向有需要的受试者施用的组合物，其包含一种或多种分离并纯化的微生物的群体，其中所述组合物包含以下性质：a)约8.2x 109个活性细胞/g，以及b)所述组合物包含不超过约0.02mcg/g的砷、不超过约0.2mcg/g的铅、不超过约0.01mcg/g的汞和不超过约0.12mcg/g的镉。
在一个实施方案中，所述组合物的颜色为米色至深棕褐色。在一个实施方案中，所述组合物的颜色为棕褐色。
在一个实施方案中，所述组合物是粉末。
在一个实施方案中，一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物在高于5μM的氧气下存活。在一个实施方案中，一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物在包含20体积％或更多氧气的条件下存活。在一个实施方案中，所述一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物中的至少一种能够在具有5μM或更少溶解氧的条件下生长。
在一个实施方案中，所述组合物包含90％或更多的未形成孢子的专性厌氧微生物。
在一个实施方案中，所述群体可包含一种或多种分离并纯化的微生物，该微生物选自：Akkermansia muciniphila、Anaerostipes caccae、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、嗜胺梭菌(Clostridium aminophilum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、鹌鹑梭菌(Clostridium colinum)、球形梭菌(Clostridiumcoccoides)、吲哚梭菌(Clostridium indolis)、系结梭菌(Clostridium nexile)、园环梭菌(Clostridium orbiscindens)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、解木素梭菌(Clostridium xylanolyticum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、高加索乳杆菌(Lactobacillus caucasicus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、乳乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、吉氏颤螺菌(Oscillospira guilliermondii)、Roseburiacecicola、Roseburia inulinivorans、生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、卵瘤胃球菌(Ruminococcus obeum)、Stenotrophomonasnitritireducens、酪链球菌(Streptococcus cremoris)、屎链球菌(Streptococcusfaecium)、婴儿链球菌(Streptococcus infantis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、Anaerofustis stercorihominis、Anaerostipes hadrus、Anaerotruncus colihominis、生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、粪球菌属(Coprococcus)、规则粪球菌(Coprococcus eutactus)、柱状真杆菌(Eubacterium cylindroides)、长真杆菌(Eubacterium dolichum)、凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)、Roseburia faeccis、Roseburia hominis、Roseburia intestinalis、两杈乳杆菌(Lacatobacillus bifidus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、乳杆菌(Lactobacilli)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、肠氨基酸球菌(Acidaminococcus intestine)、Blautiahydrogenotrophica、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)Clostridiumbartlettii、匙形梭菌(Clostridium cochlearium)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、泥渣梭菌(Clostridium limosum)、坏名梭菌(Clostridium malenominatum)、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、Clostridium peptidivorans、糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)、球孢梭菌(Clostridium sporosphaeroides)、斯氏梭菌(Clostridium sticklandii)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、共生梭菌(Clostridium symbiosum)、假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)、氧化还原真杆菌(Eubacterium oxidoreducens)、Eubacterium pyruvativorans、史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)、不解糖嗜胨菌(Peptoniphilus asaccharolyticus)和消化链球菌属(Peptostreptococcus)，及其任意组合。
在一个实施方案中，所述群体可包含2种或更多种、3种或更多种、2至10种、3至7种、最多7种或最多10种分离并纯化的微生物，这些微生物选自：Akkermansiamuciniphila、Anaerostipes caccae、青春双歧杆菌、双歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、溶纤维丁酸弧菌、丙酮丁醇梭菌、嗜胺梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、鹌鹑梭菌、球形梭菌、吲哚梭菌、系结梭菌、园环梭菌、丙酸梭菌、解木素梭菌、屎肠球菌、霍氏真杆菌、直肠真杆菌、普氏粪杆菌、产琥珀酸丝状杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、高加索乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳乳杆菌、植物乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、吉氏颤螺菌、Roseburia cecicola、Roseburia inulinivorans、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、卵瘤胃球菌、Stenotrophomonas nitritireducens、酪链球菌、屎链球菌、婴儿链球菌、变异链球菌、嗜热链球菌、Anaerofustis stercorihominis、Anaerostipes hadrus、Anaerotruncus colihominis、生孢梭菌、破伤风梭菌、粪球菌属、规则粪球菌、柱状真杆菌、长真杆菌、凸腹真杆菌、Roseburia faeccis、Roseburia hominis、Roseburiaintestinalis、两杈乳杆菌、约氏乳杆菌、乳杆菌、发酵氨基酸球菌、肠氨基酸球菌、Blautiahydrogenotrophica、无丙二酸柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、氨基丁酸梭菌、Clostridiumbartlettii、匙形梭菌、克氏梭菌、泥渣梭菌、坏名梭菌、巴氏梭菌、Clostridiumpeptidivorans、糖丁酸梭菌、球孢梭菌、斯氏梭菌、近端梭菌、共生梭菌、假破伤风梭菌、氧化还原真杆菌、Eubacterium pyruvativorans、史氏甲烷短杆菌、摩氏摩根氏菌、不解糖嗜胨菌和消化链球菌属，及其任意组合。
在一个实施方案中，所述组合物进一步包含益生元。在一个实施方案中，该益生元包括菊粉。在一个实施方案中，该菊粉以至少约50mg/ml的量存在。
在一个实施方案中，所述组合物进一步包含菊粉、蔗糖、海藻糖、甘油、麦芽糖糊精和羟丙基甲基纤维素。
在一个实施方案中，所述药物组合物被配制用于口服递送。在一个实施方案中，所述组合物是片剂。
在一个实施方案中，所述组合物是栓剂。
在又一个方面，本公开内容提供了一种获得如上所述的组合物的方法，该方法包括：(a)在培养基中培养所述一种或多种分离并纯化的微生物的群体，所述群体包含一种或多种专性厌氧微生物；以及(b)冻干所述群体，从而产生所述一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括包封所述群体。
在一个实施方案中，一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物用冷冻保护剂冻干，该冷冻保护剂选自：甘油、海藻糖、蔗糖、菊粉、水、植物介质、脱脂乳、葡聚糖、谷氨酸、组氨酸、甘露醇及其任意组合。
在一个实施方案中，所述冷冻保护剂包含10％甘油。
在一个实施方案中，冻干一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物产生干粉。
在一个实施方案中，培养包括在包含N-乙酰基葡糖胺的培养基中生长。在一个实施方案中，所述培养基包含有效量的右旋糖。
在一个实施方案中，所述培养基进一步包含有效量的盐。在一个实施方案中，所述盐选自：氯化铵、氯化钙、二水合氯化钙、六水合氯化钙、十水合氯化钙、硝酸铁、一水合硫酸镁、五水合硫酸镁、七水合硫酸镁、氯化镁、硫酸镁、九水合硫酸镁、meridianiite、十二水合硫酸镁、氯化钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、磷酸一钾、磷酸氢二钾、硫酸钾、碳酸氢钠、磷酸氢钠、氯化钠及其任意组合。在一个实施方案中，所述盐选自：磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、氯化钠及其任意组合。
在一个实施方案中，所述培养基进一步包含维生素。在一个实施方案中，所述维生素选自：D-生物素、泛酸钙、肌醇、对氨基苯甲酸、叶酸、盐酸吡哆醇、吡哆醇(B6)、生物素、核黄素、硫辛酸、二氯化硫胺素、巯基乙磺酸、烟酸、泛酸、维生素A、维生素B12、维生素K、核黄素(B2)、硫胺素(B1)、K-Ca-泛酸盐、氯化胆碱、内消旋肌醇(i-inositol)、烟酰胺、吡哆醛HCl、吡哆醇HCl、硫胺素HCl、对氨基苯甲酸、尼克酸、抗坏血酸、磷酸α-生育酚、钙化醇、甲萘醌、烟酸及其任意组合。在一个实施方案中，所述维生素选自：D-生物素、泛酸钙、肌醇、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、核黄素、二氯化硫胺素、维生素B12、烟酸及其任意组合。
在一个实施方案中，所述培养基进一步包含表面活性剂。
在一个实施方案中，所述培养基进一步包含氨基酸来源。
在一个实施方案中，所述氨基酸来源是L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-羟脯氨酸、蛋白胨、大豆蛋白胨、HiVeg Peptone#1、HiVeg Peptone#2、HiVeg Peptone#3、HiVeg Peptone#4、HiVeg Peptone#5、HiVeg Special Peptone、蛋白酶蛋白胨或其组合。
在一个实施方案中，所述培养基的pH约为7.0。
在又一个方面，本公开内容提供产生本文公开的组合物的方法，另外，该方法进一步包括向有需要的受试者施用治疗有效量。在一个方面，所述方法包括(a)获得所述组合物；以及(b)将治疗有效量的所述组合物施用于有需要的受试者。该组合物可以口服施用。该组合物可以直肠施用。
在一个实施方案中，施用所述治疗有效量的所述组合物包括每天施用一个或多个剂型，持续至少7天的时间。
在一个实施方案中，施用所述治疗有效量的所述组合物包括每天施用一个或多个剂型，持续7天至14天的时间。
本文公开了一种配制用于向有需要的受试者施用的组合物的方法。该方法可以包括获得包含分离并纯化的微生物的群体的混合物，其中该混合物可以是基本上干燥的并且可以包含约5％或更少的残余水分，其中该群体包含一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物，以及包封该混合物以供递送至受试者。在一个实施方案中，所述一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物中的0.1％或更多是存活的。在一个实施方案中，所述混合物可包含约90％或更多的未形成孢子的专性厌氧微生物。在一个实施方案中，所述混合物可以包封在肠溶衣胶囊中。在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括在肠溶衣中涂覆所述混合物。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自Akkermansia muciniphila的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自青春双歧杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自婴儿双歧杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自长双歧杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自拜氏梭菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自丁酸梭菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自吲哚梭菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自霍氏真杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自普氏粪杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可包含至少一种来自Akkermansia属的微生物和至少一种来自选自真杆菌属(Eubacterium)、梭菌属(Clostridium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和粪杆菌属(Faecalibacterium)的属的微生物。在一个实施方案中，所述微生物群体可包含至少两种各来自疣微菌门(Verrucomicrobia)和放线菌门(Actinobacteria)的分离并纯化的微生物。在一个实施方案中，所述一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物在约5μM或更多的氧气下可以存活。在一个实施方案中，所述一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物在包含约20体积％或更多氧气的条件下可以存活。在一个实施方案中，所述一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物中的至少一种可以在具有5μM或更少溶解氧的条件下生长。在一个实施方案中，所述群体可包含一种或多种分离并纯化的微生物，该微生物选自：Akkermansia muciniphila、Anaerostipes caccae、青春双歧杆菌、双歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、溶纤维丁酸弧菌、丙酮丁醇梭菌、嗜胺梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、鹌鹑梭菌、球形梭菌、吲哚梭菌、系结梭菌、园环梭菌、丙酸梭菌、解木素梭菌、屎肠球菌、霍氏真杆菌、直肠真杆菌、普氏粪杆菌、产琥珀酸丝状杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、高加索乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳乳杆菌、植物乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、吉氏颤螺菌、Roseburia cecicola、Roseburiainulinivorans、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、卵瘤胃球菌、Stenotrophomonasnitritireducens、酪链球菌、屎链球菌、婴儿链球菌、变异链球菌、嗜热链球菌、Anaerofustis stercorihominis、Anaerostipes hadrus、Anaerotruncus colihominis、生孢梭菌、破伤风梭菌、粪球菌属、规则粪球菌、柱状真杆菌、长真杆菌、凸腹真杆菌、Roseburia faeccis、Roseburia hominis、Roseburia intestinalis、两杈乳杆菌、约氏乳杆菌、乳杆菌、发酵氨基酸球菌、肠氨基酸球菌、Blautia hydrogenotrophica、无丙二酸柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、氨基丁酸梭菌、Clostridium bartlettii、匙形梭菌、克氏梭菌、泥渣梭菌、坏名梭菌、巴氏梭菌、Clostridium peptidivorans、糖丁酸梭菌、球孢梭菌、斯氏梭菌、近端梭菌、共生梭菌、假破伤风梭菌、氧化还原真杆菌、Eubacteriumpyruvativorans、史氏甲烷短杆菌、摩氏摩根氏菌、不解糖嗜胨菌和消化链球菌属，及其任意组合。在一个实施方案中，所述混合物可以进一步包含益生元。在一个实施方案中，该益生元可包括菊粉。在一个实施方案中，该菊粉可以以至少约50mg/ml的量存在于组合物中。在一个实施方案中，所述混合物可被包封以供递送至受试者的小肠、大肠、回肠或其组合。在一个实施方案中，所述包封的混合物可以在受试者的小肠或大肠之前基本上不释放分离并纯化的微生物的群体。在一个实施方案中，所述胶囊可在大于至少约pH 6.5的pH下溶解。在一个实施方案中，所述胶囊可包含一个或多个肠溶衣。在一个实施方案中，所述组合物可被配制用于口服递送。在一个实施方案中，所述包封的混合物可在4℃下稳定2周。在一个实施方案中，所述包封的混合物可以在所述分离并纯化的微生物的群体中包含至少约105个菌落形成单位(CFU)的量的一种或多种微生物。在一个实施方案中，所述包封的混合物可包含至少约0.1％的量的活微生物。在一个实施方案中，所述受试者可以是人。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括产生一种或多种分离并纯化的氧稳定的厌氧微生物。在一个实施方案中，该产生步骤可包括冻干一种或多种分离并纯化的厌氧微生物。在一个实施方案中，所产生的一种或多种分离并纯化的厌氧微生物可以用冷冻保护剂冻干，该冷冻保护剂选自：甘油、海藻糖、蔗糖、菊粉、水、植物介质、脱脂乳、葡聚糖、谷氨酸、组氨酸、甘露醇及其任意组合。在一个实施方案中，冻干一种或多种分离并纯化的厌氧微生物可产生无需进一步加工而获得的干粉。在一个实施方案中，所述混合物可进一步包含药学上可接受的载体。在一个实施方案中，所述混合物可以是粉末。在一个实施方案中，该粉末可包含具有均匀颗粒大小的颗粒。在一个实施方案中，该粉末中的颗粒可以是非粘性的。
在一个实施方案中，本文公开了用于向有需要的受试者施用的组合物，其包含a)一种或多种分离并纯化的专性厌氧微生物的群体，和b)将所述群体包封于其中的胶囊，其中如通过使用流式细胞术测量第一时间的活微生物的第一细胞计数和第二时间的活微生物的第二细胞计数所确定的，所述组合物在4摄氏度的温度下储存2周或更长时间时保持稳定，其中第一时间和第二时间最多间隔2周，并且所述组合物可以在4摄氏度下从第一时间储存到第二时间，并且进一步其中第二细胞计数是第一细胞计数的至少60％。在一个实施方案中，所述一种或多种分离并纯化的专性厌氧微生物可以是氧稳定的。在一个实施方案中，所述组合物可进一步包含药学上可接受的载体。在一个实施方案中，所述一种或多种分离并纯化的专性厌氧微生物中的0.1％或更多可以存活。在一个实施方案中，所述一种或多种分离并纯化的专性厌氧微生物可包含约90％或更多的未形成孢子的专性厌氧微生物。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自Akkermansia muciniphila的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自青春双歧杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自婴儿双歧杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自长双歧杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自拜氏梭菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自丁酸梭菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自吲哚梭菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自霍氏真杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可包含至少一种来自Akkermansia属的微生物和至少一种来自选自真杆菌属、梭菌属、双歧杆菌属和粪杆菌属的属的微生物。在一个实施方案中，所述微生物群体可包含至少两种各来自疣微菌门和放线菌门的分离并纯化的微生物。在一个实施方案中，所述群体可包含一种或多种分离并纯化的微生物，该微生物选自：Akkermansia muciniphila、Anaerostipes caccae、青春双歧杆菌、双歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、溶纤维丁酸弧菌、丙酮丁醇梭菌、嗜胺梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、鹌鹑梭菌、球形梭菌、吲哚梭菌、系结梭菌、园环梭菌、丙酸梭菌、解木素梭菌、屎肠球菌、霍氏真杆菌、直肠真杆菌、普氏粪杆菌、产琥珀酸丝状杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、高加索乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳乳杆菌、植物乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、吉氏颤螺菌、Roseburiacecicola、Roseburia inulinivorans、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、卵瘤胃球菌、Stenotrophomonas nitritireducens、酪链球菌、屎链球菌、婴儿链球菌、变异链球菌、嗜热链球菌、Anaerofustis stercorihominis、Anaerostipes hadrus、Anaerotruncuscolihominis、生孢梭菌、破伤风梭菌、粪球菌属、规则粪球菌、柱状真杆菌、长真杆菌、凸腹真杆菌、Roseburia faeccis、Roseburia hominis、Roseburia intestinalis、两杈乳杆菌、约氏乳杆菌、乳杆菌、发酵氨基酸球菌、肠氨基酸球菌、Blautia hydrogenotrophica、无丙二酸柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、氨基丁酸梭菌、Clostridium bartlettii、匙形梭菌、克氏梭菌、泥渣梭菌、坏名梭菌、巴氏梭菌、Clostridium peptidivorans、糖丁酸梭菌、球孢梭菌、斯氏梭菌、近端梭菌、共生梭菌、假破伤风梭菌、氧化还原真杆菌、Eubacteriumpyruvativorans、史氏甲烷短杆菌、摩氏摩根氏菌、不解糖嗜胨菌和消化链球菌属，及其任意组合。在一个实施方案中，所述组合物可进一步包含益生元。在一个实施方案中，该益生元可包括菊粉。在一个实施方案中，该菊粉可以以至少约50mg/ml的量存在于组合物中。在一个实施方案中，所述胶囊可包含肠溶衣。在一个实施方案中，所述组合物可进一步包含肠溶衣。在一个实施方案中，所述胶囊可被配置用于递送至受试者的小肠、大肠、回肠或其组合。在一个实施方案中，所述胶囊可在所述受试者的小肠或大肠之前基本上不释放所述分离并纯化的微生物的群体。在一个实施方案中，所述胶囊可在大于至少约pH6.5的pH下溶解。在一个实施方案中，所述药物组合物可包含一个或多个肠溶衣。在一个实施方案中，所述组合物可在4℃下稳定2周。在一个实施方案中，所述组合物可在所述群体中包含至少约105个菌落形成单位(CFU)的量的一种或多种微生物。在一个实施方案中，所述包封的混合物可包含至少约0.1％的量的活微生物。在一个实施方案中，所述受试者可以是人。在一个实施方案中，所述混合物可以是粉末。在一个实施方案中，该粉末可包含具有均匀颗粒大小的颗粒。在一个实施方案中，该粉末中的颗粒可以是非粘性的。
在一个实施方案中，本文公开了用于向有需要的受试者施用的组合物，该组合物包含a)一种或多种分离并纯化的专性厌氧微生物的群体，和b)将所述群体包封于其中的胶囊，其中如通过在第一时间和第二时间使用具有火焰电离检测器的气相色谱法测量所述胶囊中一种或多种分离并纯化的专性厌氧微生物群体的短链脂肪酸产量所确定的，所述组合物是稳定的，其中第一时间和第二时间可以间隔2周或更长时间，并且所述组合物可以在4摄氏度下从第一时间储存到第二时间，并且进一步其中在第一时间测量的短链脂肪酸产量可以是在第二时间测量的短链脂肪酸产量的约60％或更多。在一个实施方案中，所述一种或多种分离并纯化的专性厌氧微生物可以是氧稳定的。在一个实施方案中，所述组合物可进一步包含药学上可接受的载体。在一个实施方案中，所述一种或多种分离并纯化的专性厌氧微生物中的0.1％或更多可以存活。在一个实施方案中，所述一种或多种分离并纯化的专性厌氧微生物可包含约90％或更多的未形成孢子的专性厌氧微生物。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自Akkermansia muciniphila的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自青春双歧杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自婴儿双歧杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自长双歧杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自拜氏梭菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自丁酸梭菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自吲哚梭菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自霍氏真杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。在一个实施方案中，所述群体可包含至少一种来自Akkermansia属的微生物和至少一种来自选自真杆菌属、梭菌属、双歧杆菌属和粪杆菌属的属的微生物。在一个实施方案中，所述微生物群体可包含至少两种各来自疣微菌门和放线菌门的分离并纯化的微生物。在一个实施方案中，所述群体可包含一种或多种分离并纯化的微生物，该微生物选自：Akkermansia muciniphila、Anaerostipes caccae、青春双歧杆菌、双歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、溶纤维丁酸弧菌、丙酮丁醇梭菌、嗜胺梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、鹌鹑梭菌、球形梭菌、吲哚梭菌、系结梭菌、园环梭菌、丙酸梭菌、解木素梭菌、屎肠球菌、霍氏真杆菌、直肠真杆菌、普氏粪杆菌、产琥珀酸丝状杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、高加索乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳乳杆菌、植物乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、吉氏颤螺菌、Roseburia cecicola、Roseburia inulinivorans、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、卵瘤胃球菌、Stenotrophomonas nitritireducens、酪链球菌、屎链球菌、婴儿链球菌、变异链球菌、嗜热链球菌、Anaerofustis stercorihominis、Anaerostipes hadrus、Anaerotruncus colihominis、生孢梭菌、破伤风梭菌、粪球菌属、规则粪球菌、柱状真杆菌、长真杆菌、凸腹真杆菌、Roseburia faeccis、Roseburia hominis、Roseburia intestinalis、两杈乳杆菌、约氏乳杆菌、乳杆菌、发酵氨基酸球菌、肠氨基酸球菌、Blautia hydrogenotrophica、无丙二酸柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、氨基丁酸梭菌、Clostridium bartlettii、匙形梭菌、克氏梭菌、泥渣梭菌、坏名梭菌、巴氏梭菌、Clostridium peptidivorans、糖丁酸梭菌、球孢梭菌、斯氏梭菌、近端梭菌、共生梭菌、假破伤风梭菌、氧化还原真杆菌、Eubacterium pyruvativorans、史氏甲烷短杆菌、摩氏摩根氏菌、不解糖嗜胨菌和消化链球菌属，及其任意组合。在一个实施方案中，所述组合物可进一步包含益生元。在一个实施方案中，该益生元可包括菊粉。在一个实施方案中，该菊粉可以以至少约50mg/ml的量存在于组合物中。在一个实施方案中，所述胶囊可包含肠溶衣。在一个实施方案中，所述组合物可进一步包含肠溶衣。在一个实施方案中，所述胶囊可被配置用于递送至受试者的小肠、大肠、回肠或其组合。在一个实施方案中，所述胶囊可在所述受试者的小肠或大肠之前基本上不释放所述分离并纯化的微生物的群体。在一个实施方案中，所述胶囊可在大于至少约pH6.5的pH下溶解。在一个实施方案中，所述药物组合物可包含一个或多个肠溶衣。在一个实施方案中，所述组合物可在4℃下稳定2周或长达30天。在一个实施方案中，所述组合物可在所述群体中包含至少约105个菌落形成单位(CFU)的量的一种或多种微生物。在一个实施方案中，所述包封的混合物可包含至少约0.1％的量的活微生物。在一个实施方案中，所述受试者可以是人。在一个实施方案中，所述混合物可以是粉末。在一个实施方案中，该粉末可包含具有均匀颗粒大小的颗粒。在一个实施方案中，该粉末中的颗粒可以是非粘性的。
通过以下详细描述，本公开内容的其它方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，在详细描述中仅示出并描述了本公开内容的说明性实施方案。正如将会认识到的，本发明能够有其它不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开内容。因此，附图和描述将被视为本质上是说明性的，而非限制性的。
援引并入
本说明书提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出其中每一个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。如果通过引用而并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容存在矛盾，则本说明书旨在取代和/或优先于任何这样的矛盾材料。
附图说明
本发明的新特征在随附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图(在本文中也称为“图”)，将会对本发明的特征和优点获得更好的理解，在附图中：
图1示出了用于施用的组合物的配制方法的示例性实施方案。
图2示出了用于使一种或多种分离并纯化的微生物生长的生物反应器配置的示例性实施方案。
图3显示了用于冻干一种或多种分离并纯化的微生物并在制剂中包含微生物的示例性过程。
图4示出了菌株在室温(RT)和4℃下的稳定性。
图5A示出了包封的制剂在室温(RT，20-25℃)和4℃下的稳定性。
图5B示出了制剂随时间的稳定性。
图6示出了Akkermansia muciniphila在植物浸液(infusion)中的成功GMP生长随时间的最佳密度测量。
图7示出了可用来为其它测量创建标准曲线的代表性活微生物和死微生物计数。
图8示出了在确定长双歧杆菌的OD与CFU之间的线性关系时来自一系列稀释度的可重复测量。
图9A示出了在冻干之前和之后进行比较的长双歧杆菌在96孔板中的活细菌细胞计数。
图9B示出了将循环阈值相对于微生物浓度稀释度进行作图的标准曲线。
图10示出了针对乙酸和丁酸这两种代谢物，在七种菌株中的SCFA的测量。
图11使用具有火焰电离检测器的气相色谱法(GC/FID)将GC峰面积(a.u.)与微生物浓度(mM)相关联。
图12示出了在使用具有火焰电离检测器的气相色谱法监测短链脂肪酸的高通量产生时，微生物细胞的代谢活性随时间的测量。
图13示出了计算机控制系统，其可被编程为或以其它方式配置为用来实现本文提供的方法。
具体实施方式
概况
改变微生物组以治疗各种病症和改善健康是一个非常令人感兴趣且值得探究的领域。然而，将关于微生物组和其中的各个微生物的发现转化为可以容易地施用于受试者的组合物可能是非常具有挑战性的。产生这样的组合物需要(1)有效地使这类微生物生长，以及(2)以贮存稳定的形式保存这类微生物。
关于生长，除天然存在的微生物组外，治疗相关的分离并纯化的微生物可能具有难以在培养中复制的代谢需求。例如，许多分离并纯化的位于肠中的微生物可能不容易在肠环境之外培养。一些微生物可能需要特定的营养物。对于专性厌氧微生物，必须限制暴露于大气氧。此外，分离并纯化的微生物必须以对于具有体积约束的制剂(例如，用于口服给药的胶囊或片剂)而言足够的浓度生长。
此外，分离并纯化的微生物，特别是专性厌氧微生物，即使在冻干时也可能是不稳定的。用于施用于受试者的分离并纯化的微生物必须是稳定的，使得活性细胞或活细胞在数天、数周或数月的一段时间后得到保留。这样的保存期限允许制剂以有效且贮存稳定的形式施用于受试者。
本公开内容的方法和组合物解决了尚未得到满足的对分离并纯化的微生物，特别是专性厌氧微生物的稳定组合物的需求，该组合物可以被配制用于施用于受试者。本公开内容提供了用于产生专性厌氧微生物的稳定(例如，氧稳定的)组合物的方法。本公开内容提供了用于产生包含专性厌氧微生物的制剂的技术，所述专性厌氧微生物在数天、数周或数月的时间内保持稳定，使得所述组合物可在施用前储存。作为稳定性，特别是氧稳定性的实例，如本文所述的一种或多种分离并纯化的专性厌氧微生物的组合物在4摄氏度下储存14天后可剩余至少0.1％、1％-5％、至少10％或至少20％的初始活性细胞/g(例如，相对于包封(t＝0)时的1x 1010个活性细胞/克，在储存(t＝14天)后剩余2x 109个活性细胞/克))。本发明提供了用于使氧稳定的专性厌氧微生物生长的组合物和方法，该专性厌氧微生物用于多种制剂，包括用于口服给药的胶囊和片剂。本文描述的技术可用来产生高度浓缩的组合物(例如，1x 109个活性细胞/g或更多)。这些组合物可以是可容易地配制成多种剂型的干粉。例如，本文描述的组合物可以被配制成胶囊、片剂或栓剂。因此，可以将一个或多个剂型施用于受试者以治疗病症或作为医疗食品。
本公开内容提供了专性厌氧微生物的组合物和可用来产生专性厌氧微生物的组合物的方法，所述专性厌氧微生物在14天或更长时间内保持存活，甚至在暴露于大气氧时也是如此。本文所述方法和组合物的另一个优点是冻干产品以粉末形式提供，从而不需要进一步加工(例如粉碎)。
尽管已经在本文中显示并描述了本发明的多个实施方案，但是对本领域技术人员显而易见的是这些实施方案仅作为实例提供。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多改变、变化和替换。应当理解，可以使用本文所述发明的实施方案的各种替代方案。
除非上下文另有明确规定，否则如本说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”可包括复数指示物。例如，术语“一个样品”可包括多个样品，包括其混合物。
术语“微生物(microbes)”和“微生物(microorganisms)”在本文中可互换使用，并且可指细菌、古菌、真核生物(例如原生动物、真菌、酵母)和病毒，包括细菌病毒(即噬菌体)。
术语“微生物组”、“微生物群”和“微生物生境”在本文中可互换使用，并且可指寄居在受试者身体之上或之内的微生物的生态群落。微生物组可由共生、共栖和/或病原微生物组成。微生物组可存在于受试者的许多部位(如果不是大多数部位的话)之上或之中。微生物组的生境的一些非限制性实例可包括：体表、体腔、体液、肠、结肠、皮肤表面和孔、阴道腔、脐区、结膜区、肠区、胃、鼻腔和通道、胃肠道、泌尿生殖道、唾液、粘液和粪便。
如本文所用的术语“益生元”可以是通用术语，是指可以影响微生物在宿主中的生长和/或活动(例如，可允许微生物组中的组成和/或活动的特定变化)的化学物质和/或成分。益生元可以给宿主带来健康益处。益生元可以例如在结肠中选择性发酵。益生元的一些非限制性实例可包括：复合碳水化合物、复合糖、抗性糊精、抗性淀粉、氨基酸、肽、营养化合物、生物素、聚右旋糖、寡糖、多糖、果寡糖(FOS)、果聚糖、可溶性纤维、不溶性纤维、纤维、淀粉、半乳寡糖(GOS)、菊粉、木质素、车前草、壳多糖、壳聚糖、树胶(例如瓜尔胶)、高直链淀粉玉米淀粉(HAS)、纤维素、β-葡聚糖、半纤维素、乳果糖、甘露寡糖、寡甘露聚糖(MOS)、富含低聚果糖的菊粉、低聚果糖、低聚右旋糖、塔格糖、反式半乳寡糖、果胶、抗性淀粉、木寡糖(XOS)、刺槐豆胶、P-葡聚糖和甲基纤维素。益生元可在食物(例如阿拉伯胶、瓜尔豆籽、糙米、米糠、大麦壳、菊苣根、菊芋(Jerusalem artichoke)、蒲公英叶、大蒜、韭葱、洋葱、芦笋、麦麸、燕麦麸、烘豆、全麦面粉、香蕉)和母乳中发现。益生元还可以以其它形式(例如胶囊或膳食补充剂)来施用。
如本文所用的术语“益生菌”可指一种或多种微生物，其在适当施用时可以给宿主或受试者带来健康益处。益生菌的一些非限制性实例可包括：Akkermansia muciniphila、Anaerostipes caccae、青春双歧杆菌、双歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、溶纤维丁酸弧菌、丙酮丁醇梭菌、嗜胺梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、鹌鹑梭菌、球形梭菌、吲哚梭菌、系结梭菌、园环梭菌、丙酸梭菌、解木素梭菌、屎肠球菌、霍氏真杆菌、直肠真杆菌、普氏粪杆菌、产琥珀酸丝状杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、高加索乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳乳杆菌、植物乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、吉氏颤螺菌、Roseburia cecicola、Roseburia inulinivorans、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、卵瘤胃球菌、Stenotrophomonas nitritireducens、酪链球菌、屎链球菌、婴儿链球菌、变异链球菌、嗜热链球菌、Anaerofustis stercorihominis、Anaerostipes hadrus、Anaerotruncuscolihominis、生孢梭菌、破伤风梭菌、粪球菌属、规则粪球菌、柱状真杆菌、长真杆菌、凸腹真杆菌、Roseburia faeccis、Roseburia hominis、Roseburia intestinalis、两杈乳杆菌、约氏乳杆菌、乳杆菌、发酵氨基酸球菌、肠氨基酸球菌、Blautia hydrogenotrophica、无丙二酸柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、氨基丁酸梭菌、Clostridium bartlettii、匙形梭菌、克氏梭菌、泥渣梭菌、坏名梭菌、巴氏梭菌、Clostridium peptidivorans、糖丁酸梭菌、球孢梭菌、斯氏梭菌、近端梭菌、共生梭菌、假破伤风梭菌、氧化还原真杆菌、Eubacteriumpyruvativorans、史氏甲烷短杆菌、摩氏摩根氏菌、不解糖嗜胨菌和消化链球菌属，及其任意组合。
在本公开内容中，一种或多种微生物的“氧稳定”或氧稳定性可指微生物响应于暴露于气态氧或溶解氧的响应。氧稳定的微生物可以在具有气态氧或溶解氧的环境中保持存活。微生物可以是需氧的、厌氧的或兼性的，这取决于它们产生供生长使用的能量的特有机制。在含能量化合物的代谢过程中，需氧微生物可能需要分子氧作为末端电子接受体，并且在其不存在时可能不会生长。相反，分子氧对厌氧微生物可能是有毒的，厌氧微生物在存在分子氧的情况下可能不会生长。因此，厌氧微生物可能依赖于电子接受体。厌氧微生物的发酵代谢可以使有机化合物还原成不同的最终产物。最终产物可包含醇和有机酸(例如乙酸和丁酸)。氧可以是反应性分子并且偏向于处于还原状态。氧可以容易地被还原成极具还原性的物质，如超氧自由基和过氧化氢。当与细胞脂膜和蛋白质反应时，这些高反应性物质可能是有害的，并且可导致细胞死亡。需氧生物体可能包含除去活性氧所必需的酶，而在厌氧微生物中，这些酶可能是低浓度的或者不存在。这些酶可包括过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。此外，许多适合于厌氧微生物的酶在一些情况下可能是氧敏感的。本公开内容提供了用于制备包含氧稳定的厌氧微生物的制剂的方法，该制剂在氧气的存在下可能是不稳定的。
兼性微生物可以选择性地选择氧作为末端电子接受体。兼性微生物也可以通过其它化合物的还原而在无氧的情况下代谢。使用氧作为末端电子接受体的能力可以是产生能量的有效机制。
另一类微生物可以是专性厌氧微生物。专性厌氧微生物的稳定性可归因于多种因素。与需氧生物体相比，专性厌氧微生物可能不会产生足够的酶来将细胞中的超氧化物和过氧化氢解毒。这些酶可包括过氧化氢酶、过氧化物酶、固氮酶和超氧化物歧化酶。此外，由于硫化物可能是某些酶的成分，因此氧可以将硫化物氧化成二硫化物并使酶失活。厌氧微生物一般不稳定的另一个原因可能是它们可含有氧敏感的酶。该酶可以是金属酶。该蛋白质可以在活性位点含有金属，如钼、钨和铁。这些金属可能对氧具有反应性，并且可能使蛋白质去稳定。本公开内容描述了用于配制包含一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物的组合物的方法。
术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”、“测定”和“分析”在本文中可互换使用，并且可指任意形式的测量，并且包括确定元素是否存在(例如，检测)。这些术语可包括定量和/或定性测定。评估可以是相对的或绝对的。这些术语可包括本文所述的算法和数据库的使用。“检测……的存在”可包括测定某物的存在量以及确定其存在与否。如本文所用的术语“基因组组装算法”可指在可测定基因组的完整序列的条件下能够将测序读取相互(从头)比对或与参考序列(重新测序)进行比对的任何方法。
如本文所用的术语“基因组”可指在一级DNA序列中编码的生物遗传信息的整体。基因组可包括基因和/或非编码序列。例如，基因组可表示微生物基因组。微生物组的遗传内容可包括：基因组DNA、RNA和核糖体RNA，表观基因组，质粒，和在构成微生物组的微生物中发现的所有其它类型的遗传信息。
如本文所用的“核酸序列”和“核苷酸序列”可指寡核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，还指基因组来源或合成来源的DNA或RNA(其可以是单链或双链的)，并且表示有义链或反义链。核酸序列可由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶(A、T、C、G和U)以及修饰形式(例如N6-甲基腺苷、5-甲基胞嘧啶等)组成。
如本文关于核苷酸序列所用的术语“同源性”和“同源的”可指与其它核苷酸序列的互补性程度。可能存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。与核酸序列部分互补，即“基本同源”的核苷酸序列，可以是至少部分地抑制完全互补序列与靶核酸序列杂交的核苷酸序列。
如本文所用的术语“测序”可指用于确定核酸分子(例如，DNA或RNA核酸分子)中的核苷酸碱基——A、T、C、G和U——的顺序的测序方法。
术语“生物芯片”或“阵列”可指具有可附着有吸附剂的、一般为平面的表面的固体基底。生物芯片的表面可包含多个可寻址的位置，其中每个位置可结合有吸附剂。生物芯片可适合于接合探针接口，并因此用作探针。蛋白质生物芯片可适合于捕获多肽，并可包含在可寻址位置处附着有层析或生物特异性吸附剂的表面。微阵列芯片可用于DNA和RNA基因表达检测。
如本文所用的术语“条形码”可指任何独特的、非天然存在的核酸序列，它可用来标识核酸片段的起源基因组。
术语“受试者”、“个体”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，是指任何动物受试者，包括：人、实验室动物、家畜和家养宠物。受试者可以寄居有多种微生物。受试者可在其身体之上和之内的各种生境中具有不同的微生物组。受试者可被诊断出疾病或被怀疑具有患病的高风险。受试者可具有导致疾病的微生物组状态(生态失调)。在一些情况下，受试者不一定被诊断出疾病或被怀疑具有患病的高风险。在一些情况下，受试者可以遭受感染或有发生感染或将感染传播给其他受试者的风险。
术语“治疗”或“处理”在本文中可互换使用。这些术语可指用于获得有益的或期望的结果的方法，该结果包括但不限于治疗性益处和/或预防性益处。治疗性益处可意指正在被治疗的潜在疾病的根除或改善。另外，治疗性益处也能如下实现：根除或改善与潜在病症相关的一种或多种生理学症状，使得在受试者中观察到改善，尽管该受试者可能仍受到该潜在病症的折磨。预防性效果可包括延缓、防止或消除疾病或状况的出现，延缓或消除疾病或状况的症状发作，减慢、终止或逆转疾病或状况的进展，或其任意组合。对于预防性益处，具有发生特定疾病的风险的受试者或报告疾病的一种或多种生理学症状的受试者可接受治疗，即使可能尚未作出该疾病的诊断。
术语“16S”、“16S核糖体亚单位”和“16S核糖体RNA(rRNA)”在本文中可互换使用，并且可指原核生物(例如细菌、古菌)核糖体的小亚单位(例如30S)的组分。16S rRNA在微生物物种之间在进化上可能是高度保守的。因此，16S核糖体亚单位的测序可用来鉴定和/或比较样品中存在的微生物(例如微生物组)。
术语“23S”、“23S核糖体亚单位”和“23S核糖体RNA(rRNA)”在本文中可互换使用，并且可指原核生物(例如细菌、古菌)核糖体的大亚单位(例如50S)的组分。23S核糖体亚单位的测序可用来鉴定和/或比较样品中存在的微生物(例如微生物组)。
如本文所用的术语“孢子”可指由微生物产生的、用以抵抗诸如高温、湿度和化学试剂等不利条件的活细胞。孢子可具有允许微生物在恶劣条件下长时间存活的厚壁。在合适的环境条件下，孢子可以萌发，从而产生能够繁殖且具有该微生物的所有生理活性的活体形式微生物。
如本文所用的术语“厌氧微生物”可指在不存在氧气的情况下可以生长和存活的生物体或微生物，如细菌。厌氧微生物可以是单细胞或多细胞的。厌氧微生物的三个类别可包括专性厌氧微生物、耐氧生物体和兼性厌氧微生物。
向受试者(例如，向肠道)施用微生物组合物(例如益生菌)可提供许多治疗益处。肠微生物群可以通过维持健康的胃肠(GI)道来预防疾病。益生菌中的微生物菌株可以在例如正常(例如，健康的)肠微生物群中发现，并且可以有益于保持健康的胃肠道。益生菌疗法可以帮助治疗例如腹泻疾病、肠状况和临床症状。该治疗可以被认为是天然的非侵入性方法，例如，用来治疗病症和/或抑制病原体。益生菌疗法可以通过药物或食物口服施用。然而，益生菌的组合物可能难以配制、稳定和施用。
在一个方面，本公开内容提供了配制用于向有需要的受试者施用的组合物的方法。该方法可包括获得基本上干燥并且包含约10％或更少的残余水分的混合物。该混合物可包含至多约0％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％的残余水分。该混合物可包含分离并纯化的微生物的群体。该群体可包含一种或多种专性厌氧微生物。该专性厌氧微生物可以是氧稳定的。可以使用合适的技术测量残余水分。在一些情况下，对残余水分的检测可以满足并且可能不超过美国联邦法规(例如21C.F.R.610.13(与生物制品纯度有关的规定))中规定的、美国食品与药品管理局批准的限度。用于测量残余水分的技术可包括例如重量分析或干燥失重检测、用于水分测定的Karl Fischer方法、热重分析法和热重分析法/质谱法。
所述群体可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40种专性厌氧微生物。所述混合物还可包含药学上可接受的载体。所述方法还可以包括将该混合物包封在肠溶衣胶囊中以供递送至所述受试者。
在另一个方面，本公开内容提供了配制用于向有需要的受试者施用的组合物的方法。该方法可包括获得干混合物。该混合物可包含分离并纯化的微生物的群体。该群体可包含一种或多种在包含约15体积％或更多氧气的条件下存活的专性厌氧微生物。该群体可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40种专性厌氧微生物。该群体还可包含按体积计至少约0％、1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的氧气。此外，该组合物可包含药学上可接受的载体。所述方法然后可包括将所述混合物包封在胶囊片剂、胶囊或肠溶衣胶囊中以供递送至所述受试者。
图1提供了配制方法的非限制性示例性实施方案。在该实例100中，使微生物生长101并通过冻干将其转化为贮存稳定的组合物102。然后通过将三种微生物菌株的稳定颗粒与菊粉组合来制备制剂103。用该制剂填充胶囊壳104，并将胶囊壳组合以包封所述组合物。将胶囊清洁并抛光105。将包封的产品储存并包装106以供施用于受试者。
图2提供了如何使本公开内容的一种或多种分离并纯化的微生物生长的实例。图2描述了包括7升(L)玻璃罐210的生物反应器205。首先，将培养基215进料到生物反应器容器210中。该培养基以20升(L)的批次生产，并按照现行良好生产规范(cGMP)生产。将培养基和生物反应器容器高压灭菌。将分离并纯化的微生物的接种物225(例如，婴儿双歧杆菌)添加到容器210中。当达到至少0.5、1、2、3或4的光密度(OD)时，收获生物反应器。对于每个接种物，生物反应器收获两次。在第一次收获时，通过从生物反应器中泵送培养物来收获50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的培养物。在收获第一体积的培养物后立即用培养基215向生物反应器中重新进料220。与第一批类似地，该生物反应器发酵第二批接种物225。微生物生长符合现行良好生产规范(cGMP)。
一旦生长，将所述一种或多种微生物冻干以产生稳定的颗粒组合物102。如图3所示，首先将收获的产物离心。弃去过量的培养基310，保留分离并纯化的微生物的沉淀物315。将微生物特异性冷冻保护剂320加入到沉淀的微生物中以形成冷冻保护的混合物325。冷冻保护剂320符合cGMP。将混合物325铺展到金属托盘中以进行冻干330。产品335是米色至深棕褐色的颗粒。微粒状颗粒也可以被表征为粉末。在一些情况下，该组合物在掺入胶囊、片剂、栓剂或其它适合施用于受试者的剂型之前不需要进一步加工(例如粉碎或研磨)。然而，可任选地将颗粒产品研磨或粉碎以实现大小均匀性。各个分离并纯化的微生物菌株的颗粒在室温或4摄氏度下可以是稳定的(图4)。室温为20至25摄氏度。
任选地，通过将冻干的微生物与赋形剂和/或益生元混合来进一步制备制剂103。如图3所示，在一个实例345中，将各自分别冻干的分离并纯化的微生物群体与益生元如菊粉组合(340)。按重量计以大致相等的份数加入每种分离并纯化的微生物和益生元。
将所述组合物填充到胶囊壳104中并闭合胶囊以产生包封制剂。胶囊壳可以是pH敏感/不敏感的或经特别涂覆，以在胃肠道的特定部分释放。每个胶囊含有1x 108至1x 1010个活性细胞。每个胶囊壳含有相对于用于包封的配方345成比例量的每种微生物和益生元。清洁并抛光该胶囊以去除任何碎屑105。
将抛光的胶囊包装并储存106在安全密封的塑料中，该塑料可以来自Bel-Art、Biorx、ColorSafe、CSP Vials、Dynalon、MP Vials、PSA、Pill Pod、Qorpak、Safer Lock或Wheaton。当在4摄氏度和室温(20至25摄氏度)下储存时，制剂保持稳定2周或更长时间(图5A和图5B)。
细菌的益生菌菌株
组合物可包含分离并纯化的微生物。
所述微生物可以是发酵菌。发酵微生物(例如，发酵菌)可以是厌氧的并且可以利用有机分子，因为它们的最终电子接受体产生最终的发酵产物。发酵菌可以微生物特异性地代谢某些糖及其类似物。发酵菌的产物可包含丙酸(例如，吲哚-3-丙酸)和短脂肪链酸。短脂肪链酸可包括但不限于：甲酸、乙酸、丙酸(例如吲哚-3-丙酸)、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸。所述组合物可包含至少一种初级发酵菌。另外，治疗组合物可包含至少一种初级发酵菌和至少一种次级发酵菌。治疗组合物可包含至少一种初级发酵菌、至少一种次级发酵菌和至少一种益生元。
所述微生物可以选自门、纲、目、科、属、种和梭菌集群(cluster)。该门可以选自放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝菌门(Cyanobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、软壁菌门(Tenericutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)。该纲可以选自疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、梭菌纲(Clostridia)或放线菌纲(Actinobacteria)。该目可以选自疣微菌目(Verrucomicrobiales)、梭菌目(Clostridiales)、双歧杆菌目(Bificobacteriales)或梭菌目(Clostridiales)。该科可以选自产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、Erysipelotricaceae、真杆菌科(Eubacteriaceae)、Incertae-Cedis-XIII、Incertae-Sedis-XIV、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、巴斯德氏菌科(Pasturellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、韦荣氏菌科(Veillonellaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)。该属可以选自Akkermansia、梭菌属、真杆菌属、双歧杆菌属或粪杆菌属。梭菌集群可以选自集群I、集群XIVA或集群IV。
在一个非限制性实例中，治疗组合物可包含青春双歧杆菌、吲哚梭菌和菊粉。在另一个非限制性实例中，治疗组合物可包含长双歧杆菌、普氏粪杆菌和淀粉。在又另一个非限制性实例中，组合物可包含Akkermansia muciniphila、拜氏梭菌、丁酸梭菌、霍氏真杆菌和菊粉。在又另一个非限制性实例中，该组合物可包含Akkermansia muciniphila、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、吲哚梭菌、霍氏真杆菌和益生元。在又另一个非限制性实例中，该组合物可包含Akkermansia muciniphila、婴儿双歧杆菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、霍氏真杆菌和益生元。在又另一个非限制性实例中，该组合物可包含拜氏梭菌、丁酸梭菌、婴儿双歧杆菌和益生元。在又另一个非限制性实例中，该组合物可包含Akkermansia muciniphila、拜氏梭菌、丁酸梭菌、霍氏真杆菌、婴儿双歧杆菌和益生元。在另外的实例中，该组合物可包含Akkermansia muciniphila、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、吲哚梭菌、霍氏真杆菌和普氏粪杆菌中的1、2、3、4、5种或更多种以及益生元。在又另一个实例中，该组合物可包含Akkermansia muciniphila、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、吲哚梭菌、霍氏真杆菌和普氏粪杆菌中的1、2、3、4、5种或更多种以及菊粉。
Akkermansia muciniphila可以是可在粘蛋白降解中发挥作用的革兰氏阴性严格厌氧菌。Akkermansia muciniphila的水平在患有代谢紊乱例如肥胖和T2DM的受试者中可能降低。Akkermansia muciniphila可以通过例如提高控制炎症、肠屏障和肠肽分泌的内源性大麻素的水平来防止代谢紊乱。
青春双歧杆菌可以是革兰氏阳性厌氧菌，其可在婴儿期的健康人肠中发现。青春双歧杆菌可合成B族维生素。青春双歧杆菌可充当初级发酵菌。
婴儿双歧杆菌可以是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、微耐氧的厌氧菌。婴儿双歧杆菌可充当初级发酵菌。
长双歧杆菌可以是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、微耐氧的厌氧菌。长双歧杆菌可充当初级发酵菌。
拜氏梭菌可以是属于梭菌集群I的革兰氏阳性严格厌氧菌。拜氏梭菌可充当次级发酵菌。
丁酸梭菌可以是可充当次级发酵菌的革兰氏阳性严格厌氧菌。
吲哚梭菌可以是属于梭菌集群XIVA的革兰氏阳性严格厌氧菌。吲哚梭菌可充当次级发酵菌。
霍氏真杆菌可以是属于排列A梭菌集群XIVA的革兰氏阳性厌氧菌。霍氏真杆菌可充当次级发酵菌。
普氏粪杆菌可以是属于梭菌集群IV的革兰氏阳性厌氧菌。普氏粪杆菌可以是最常见的肠细菌和最高产的丁酸产生者之一。普氏粪杆菌可充当次级发酵菌。
生孢梭菌可以产生短链脂肪酸如吲哚-3-丙酸，或参与其产生。
测量宿主的微生物组可表明，缺乏各种微生物菌株的微生物组可导致健康状况和/或疾病状态(例如T2DM和肥胖)。恢复一种或多种缺乏的菌株(例如经由细菌菌株如霍氏真杆菌或用发酵乳制品处理)可导致健康状况的改变。一些非限制性实例包括改变肠微生物组，使得宿主具有增加的能量获取能力、增加的胰岛素敏感性和/或降低的食欲。
可以配制组合物，使得所述群体包含一种或多种分离并纯化的微生物，该微生物选自：Akkermansia muciniphila、Anaerostipes caccae、青春双歧杆菌、双歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、溶纤维丁酸弧菌、丙酮丁醇梭菌、嗜胺梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、鹌鹑梭菌、球形梭菌、吲哚梭菌、系结梭菌、园环梭菌、丙酸梭菌、解木素梭菌、屎肠球菌、霍氏真杆菌、直肠真杆菌、普氏粪杆菌、产琥珀酸丝状杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、高加索乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳乳杆菌、植物乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、吉氏颤螺菌、Roseburia cecicola、Roseburia inulinivorans、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、卵瘤胃球菌、Stenotrophomonas nitritireducens、酪链球菌、屎链球菌、婴儿链球菌、变异链球菌、嗜热链球菌、Anaerofustis stercorihominis、Anaerostipes hadrus、Anaerotruncus colihominis、生孢梭菌、破伤风梭菌、粪球菌属、规则粪球菌、柱状真杆菌、长真杆菌、凸腹真杆菌、Roseburia faeccis、Roseburia hominis、Roseburia intestinalis、两杈乳杆菌、约氏乳杆菌、乳杆菌、发酵氨基酸球菌、肠氨基酸球菌、Blautia hydrogenotrophica、无丙二酸柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、氨基丁酸梭菌、Clostridium bartlettii、匙形梭菌、克氏梭菌、泥渣梭菌、坏名梭菌、巴氏梭菌、Clostridium peptidivorans、糖丁酸梭菌、球孢梭菌、斯氏梭菌、近端梭菌、共生梭菌、假破伤风梭菌、氧化还原真杆菌、Eubacterium pyruvativorans、史氏甲烷短杆菌、摩氏摩根氏菌、不解糖嗜胨菌和消化链球菌属，及其任意组合。
所述组合物可包含分离并纯化的Akkermansia muciniphila、婴儿双歧杆菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌和霍氏真杆菌。所述组合物可包含分离并纯化的拜氏梭菌、丁酸梭菌和婴儿双歧杆菌。
所述组合物可包含分离并纯化的青春双歧杆菌、Akkermansia muciniphila、霍氏真杆菌和吲哚梭菌。所述组合物可包含两种或更多种分离并纯化的微生物，所述微生物选自：青春双歧杆菌、Akkermansia muciniphila、霍氏真杆菌和吲哚梭菌。
所述组合物可包含分离并纯化的Akkermansia muciniphila、拜氏梭菌、丁酸梭菌、霍氏真杆菌和婴儿双歧杆菌.
所述组合物可包含分离并纯化的婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌和霍氏真杆菌。所述组合物可包含两种或更多种分离并纯化的微生物，所述微生物选自：婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌和霍氏真杆菌。
所述组合物可包含分离并纯化的吲哚梭菌、长双歧杆菌和Akkermansiamuciniphila。
所述组合物可包含分离并纯化的双歧双歧杆菌和短乳杆菌。
专性厌氧细菌属的实例可包括Akkermansia、放线菌属(Actinomyces)、拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、真杆菌属、粪杆菌属、梭杆菌属(Fusobacterium)、消化链球菌属、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、普氏菌属(Prevotella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)和韦荣氏球菌属(Veillonella)。梭菌属的种可以是形成内生孢子的细菌，并且可以在大气浓度的氧气中以这种休眠形式存活。
高度浓缩的菌株的生长
可以使用多种技术培养在包含分离并纯化的微生物的群体的组合物中配制的微生物，该群体包含一种或多种专性厌氧微生物。这些技术可以涉及生长或培养厌氧细菌。
微生物可以在任何合适的生长培养基中产生，培养基的一些非限制性实例包括：RCM(增强的梭菌培养基(Reinforced Clostridial Medium))、营养培养基、基本培养基、选择性培养基、鉴别培养基和运输培养基。
样品生长培养基配方可包含诸如基于动物和/或植物的蛋白胨、氨基酸、提取物、碳和能源、水解产物、浸液和酵母提取物、大豆蛋白胨、乳白蛋白、胆盐和衍生物、糖、HiVeg水解产物、HiVeg提取物、酵母提取物、硫代乙醇酸钠、氧化还原指示剂、维生素、盐、碳酸钙、消泡剂、缓冲剂、表面活性剂、还原剂、酚红、丙酮酸钠、谷胱甘肽、次黄嘌呤.Na、胸苷、硫辛酸、亚油酸、腐胺2HCl、细菌蛋白胨、胸腺嘧啶、硫酸腺嘌呤、腺嘌呤-5-三磷酸、胆固醇、2-脱氧-D-核糖、鸟嘌呤HCl、乙酸钠、尿嘧啶、黄嘌呤Na、半胱氨酸HCl、水和琼脂等元素。生长培养基可以是固体或液体。固体生长培养基可包含硅胶、果胶、明胶和琼脂。
碳和能源可包括葡萄糖、淀粉、乙酸钠、柠檬酸钠和草酰乙酸盐。糖可包括蔗糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、右旋糖、麦芽糖、木糖、核糖、山梨醇、N-乙酰基葡糖胺和甘露醇。氧化还原指示剂可包括亚甲基蓝、刃天青、靛蓝胭脂红、5,5’,7-靛蓝三磺酸、四钾盐、2,6-二氯靛酚钠盐水合物、甲基紫精二氯化物、试卤灵钠盐和酚藏花红。缓冲剂可包括二甲胂酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷(tris)、乙酸盐、硼酸盐和碳酸盐如碳酸氢钠、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、N-(2-乙酰胺基)-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙酰胺基)-亚氨基二乙酸、2-氨基乙磺酸、氨、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPSO)、ammediol、N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-甘氨酸(bicine)、[双-(2-羟乙基)-亚氨基]-三-(羟甲基甲烷)(Bis-Tris)、1,3-双[三(羟甲基)-甲基氨基]丙烷(双-三-丙烷)、硼酸、二甲胂酸盐、3-(环己基氨基)-丙磺酸(CAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、环己基氨基乙磺酸(CHES)、3-[N-双(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)和磷酸氢钾。
表面活性剂可包括聚氧乙二醇辛基酚醚、脂肪醇和聚氧乙二醇失水山梨醇烷基酯。表面活性剂也可以是非离子表面活性剂。表面活性剂可选自吐温80、聚山梨醇酯20(PS20)和泊洛沙姆188(P188)。氨基酸可包括L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-羟脯氨酸。蛋白胨可包括大豆蛋白胨、HiVeg Peptone#1、HiVegPeptone#2、HiVeg Peptone#3、HiVeg Peptone#4、HiVeg Peptone#5、HiVeg SpecialPeptone、蛋白酶蛋白胨。
其它元素可包括HiVeg Special Infusion、HiVeg Extract#2、Cystein-HCl和消泡剂B硅氧烷乳液(Antifoam B silicone Emulsion)。消泡剂B硅氧烷乳液可以是至少约20微升/升(μL/L)、25μL/L、30μL/L、35μL/L、40μL/L、45μL/L、50μL/L、55μL/L、60μL/L、65μL/L或70μL/L肉汤。
添加到生长培养基中的元素的量可以是至少约0.01g/L、0.02g/L、0.03g/L、0.04g/L、0.05g/L、0.06g/L、0.07g/L、0.08g/L、0.09g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L或30g/L。添加到生长培养基中的元素的量可以是至少约0.01mL/L、0.02mL/L、0.03mL/L、0.04mL/L、0.05mL/L、0.06mL/L、0.07mL/L、0.08mL/L、0.09mL/L、0.1mL/L、0.5mL/L、1mL/L、5mL/L、10mL/L、15mL/L、20mL/L、25mL/L、30mL/L、35mL/L、40mL/L、45mL/L、50mL/L、100mL/L、200mL/L、300mL/L、400mL/L、500mL/L、600mL/L、700mL/L、800mL/L、900mL/L、1000mL/L或1500mL/L。
生长培养基可具有不同水平的酸度。生长培养基的优选pH可取决于所培养的微生物(例如嗜酸菌)的最佳生长环境。生长培养基的pH可以是，例如约7。生长培养基的pH可以是，例如，约3、约4、约5、约6、约7或约8。
为了生长和培养在包含一种或多种专性厌氧微生物的组合物中配制的微生物，生长培养基可以具有可能有利于配制包含一种或多种微生物的组合物的其它属性。例如，该生长培养基可提高微生物菌株可以生长到的最大密度。该生长培养基可允许更高的菌株浓度。该生长培养基可缓冲微生物菌株的酸产生，从而可使例如极低pH的抑制作用最小化。
微量矿物质可包括无水硫酸铝钾、无水氯化钙、氯化钴(II)、二水合氯化铜(II)、五水合硫酸铜(II)、二水合硝酸钴(II)、六水合硝酸钴(II)、硼酸、五水合硫酸铁(II)、七水合硫酸铁(II)、二水合氯化锰(II)、四水合氯化锰(II)、七水合氯化锰(II)、一水合硫酸锰(II)、二水合硫酸锰(II)、四水合硫酸锰(II)、七水合硫酸锰(II)、一水合硫酸镁、五水合硫酸镁、七水合硫酸镁、九水合硫酸镁、乙二胺四乙酸二钠、脱水钼酸钠、氯化钠、亚硒酸钠、二水合钨酸钠、氯化镍(II)、六水合氯化镍(II)、一水合硫酸锌和七水合硫酸锌。添加到生长培养基中的微量矿物质可以是至少约0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L、0.6mg/L、0.7mg/L、0.8mg/L、0.9mg/L、1mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、11mg/L、12mg/L、13mg/L、14mg/L、15mg/L、16mg/L、17mg/L、18mg/L、19mg/L、20mg/L、21mg/L、22mg/L、23mg/L、24mg/L、25mg/L、26mg/L、27mg/L、28mg/L、29mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L、45mg/L或50mg/L。
维生素可包括D-生物素、泛酸钙、肌醇、对氨基苯甲酸、叶酸、盐酸吡哆醇、吡哆醇(B6)、生物素、核黄素、硫辛酸、二氯化硫胺素、巯基乙磺酸、烟酸、泛酸、维生素A、维生素B12、维生素K、核黄素(B2)、硫胺素(B1)、K-Ca-泛酸盐、氯化胆碱、内消旋肌醇、烟酰胺、吡哆醛HCl、吡哆醇HCl、硫胺素HCl、对氨基苯甲酸、尼克酸、抗坏血酸、磷酸α-生育酚、钙化醇、甲萘醌和烟酸。添加到生长培养基中的维生素可以是至少约0.01毫克/升(mg/L)、0.02mg/L、0.03mg/L、0.04mg/L、0.05mg/L、0.06mg/L、0.07mg/L、0.08mg/L、0.09mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L、0.6mg/L、0.7mg/L、0.8mg/L、0.9mg/L、1mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、11mg/L、12mg/L、13mg/L、14mg/L、15mg/L、16mg/L、17mg/L、18mg/L、19mg/L、20mg/L、21mg/L、22mg/L、23mg/L、24mg/L、25mg/L、26mg/L、27mg/L、28mg/L、29mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L、45mg/L或50mg/L。维生素混合物可以是至少约50x、55x、60x、65x、70x、75x、80x、85x、90x、95x、100x、150x或200x。
盐可包括氯化铵、氯化钙、二水合氯化钙、六水合氯化钙、十水合氯化钙、硝酸铁、一水合硫酸镁、五水合硫酸镁、七水合硫酸镁、氯化镁、硫酸镁、九水合硫酸镁、meridianiite、十二水合硫酸镁、氯化钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、磷酸一钾、硫酸钾、碳酸氢钠、磷酸氢钠和氯化钠。添加到生长培养基中的盐可以是至少约0.01mg/L、0.02mg/L、0.03mg/L、0.04mg/L、0.05mg/L、0.06mg/L、0.07mg/L、0.08mg/L、0.09mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L、0.6mg/L、0.7mg/L、0.8mg/L、0.9mg/L、1mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L或5mg/L。盐溶液可以是5x、10x、15x、20x、25x、30x、35x或40x。
生长培养基可包含PYGveg、维生素、盐和缓冲液。
微生物培养期间使用的营养来源可包括氮源、碳源、生长因子、微量元素、诱导物、阻抑物、前体、消泡剂和水。氮源可选自玉米浆、屠宰场废物、尿素、铵盐、硝酸盐、花生颗粒、大豆粉、大豆粕、酵母提取物和蒸馏可溶物。碳源可包括玉米浆、屠宰场废物、尿素、铵盐、硝酸盐、花生颗粒、大豆粉、大豆粕、酵母提取物和蒸馏可溶物。细菌可能还需要可与代谢的刺激相关的微量元素或酶和蛋白质。所述元素可包括锌、锰、钼、铁、铜和钴。分解代谢酶可以在诱导物的存在下使用。例如，诱导物可以是酵母提取物。分解代谢酶可以被培养基中的其它化合物阻抑。
可以使用计算模型来预测最佳生长培养基。计算模型可以使用多项式回归。计算模型可以使用通量平衡分析(FBA)。最佳生长培养基可以是确定产生组合物中至少一种微生物的最佳生长速率的生长培养基。最佳生长培养基可以选自例如Autoinducer Bioassay(AB)基本培养基、Davis Mingioli(DM)培养基和Bochner定义的基本培养基等生长培养基。最佳生长培养基可包含至少一种确定诱导组合物中至少一种微生物的生长的组分。在一些情况下，对组合物中的至少一种微生物进行代谢重建以确定目标代谢途径。代谢重建可以包括确定至少一种微生物的基因组中至少一种与生长相关的酶。可以确定目标代谢途径的电子供体和电子接受体的量。确定目标代谢途径的电子供体和电子接受体的量可以确定生长培养基的至少一种组分以诱导至少一种微生物的生长。
确定分离并纯化的微生物的生长以供配制成用于向有需要的受试者施用的组合物可以以多种不同的方式完成。微生物生长可以通过诸如染色、液体琼脂培养基、自动荧光微菌落检测或电子显微镜检查等检测方法来评估。
可以使用一种或多种方法来确定微生物细胞数。该方法可选自分子活力检验、聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶PCT(RT-PCR)、实时定量聚合酶链反应、叠氮溴乙锭-PCR、叠氮溴丙锭PCR、荧光激活细胞分选、总群体计数、活细胞计数、平板计数和浊度测量。可以使用直接或间接方法测量总群体计数。相差显微镜检查过程中的直接方法可包括在专门的计数室载玻片中直接观察细胞。该值可以被表示为样品中每毫米死亡或存活细菌的细菌总数。液体培养基中的细胞计数可被表示为每单位体积的细胞数浓度。相反，间接方法可以包括阻抗微生物学技术和使用分光光度计对培养物的浊度测量或相对于浊度标准的定性测量。该标准可以是McFarland标准。由于细胞可以吸收并散射光，因此细胞浓度可以与浊度成正比。分光光度计可以检测光强度。当将细胞培养物置于透明比色皿中时，相对于培养基测量光吸收。可以采集光密度(OD)测量值，所述测量值可以在细胞类型特定的给定范围内与细胞悬浮液中的生物量成正比。
在一些情况下，计数室可用于计数。计数室可包括显微镜载玻片，在其中间具有槽，以用于接纳一滴细胞培养物。
可以使用活菌计数法确定样品中活细菌的数目。确定活菌计数可包括通过连续稀释微生物样品来测量生长速率并确定消毒剂有效性。在连续稀释后，可以将微生物样品涂布在合适的生长培养基上。可以在生长培养基浸泡的垫上通过膜进一步过滤样品。可将平板孵育至少约10小时、15小时、20小时、25小时或30小时，直到出现活菌落。平板上菌落的生长可能源自一个活微生物单位。菌落也可能源自一组细胞或单个细胞。结果被报告为菌落形成单位(CFU)。每个细胞可以是单个菌落或CFU。菌落计数后，从涂布于平板上的培养物，可以计算细胞浓度。
微生物计数方法可选自覆盖平板、倾注平板和表面计数。在覆盖和倾注方法期间，可以使用熔化的琼脂来悬浮微生物样品。菌落可以保持小而紧凑。可以对更高浓度的平板进行计数，因为菌落是独立的并且彼此不接触。也可以使用表面计数方法，该方法可以提供准确且可靠的结果。该过程包括稀释具有浊度的细菌培养物，将少量细菌吸移到平板表面上，并均匀地铺展在表面上。
在一些情况下，细胞计数可以通过诸如电阻、流式细胞术和图像分析等方法自动化。在流式细胞术期间，细胞可以在激光束之前以窄流行进。当每个细胞被激光束激发时，光检测器鉴别在细胞中反射的光。除了定量，流式细胞仪还可以检测细胞形状并对细胞中的蛋白质和其它生化标志物进行定量。
图6示出了在良好生产规范(GMP)条件下，Akkermansia muciniphila在基于植物的生长培养基(蔬菜浸液和PYG Veg)中的生长随时间的光密度测量值。
在一些情况下，可以通过延长微生物生长的对数生长期来增加培养物中微生物的浓度。这可以通过使用微生物的生长曲线并测量培养物中微生物的OD来实现。微生物的OD可以与微生物生长曲线相关联，以检测微生物的不同生长阶段。当微生物离开对数生长期进入静止生长期时，可以向培养物中添加额外的营养物。这些额外的营养物可导致第二生长期，从而增强培养物中微生物的生长。在一些实施方案中，所述营养物可包括糖或碳水化合物。
在一些情况下，微生物可以在第一组营养物中生长，并且当微生物离开对数生长期时，可以在培养物中提供额外量的第一组营养物以增强微生物的生长。在一些实施方案中，添加的营养物的额外量是初始量的5％。在一些实施方案中，该额外量可以是初始量的至多1％、2％、5％、10％、20％、30％或50％。
在一些实施方案中，当微生物离开对数生长期时，可以提供第二组营养物或营养物来源。
在一些实施方案中，当微生物离开对数生长期时，可以提供额外量的第一组营养物与第二组营养物的混合物。在一些情况下，第一组营养物的额外量可以是初始量的至多1％、2％、5％、10％、20％、30％或50％。
在一些情况下，可以在离开第二生长期时收获微生物。或者，可以在第二生长期完成之前收获微生物。
可以通过测序来评估微生物生长。在一些情况下，可以从每种至少微生物的基因组序列确定多个菌株特异性序列。所述至少微生物可以来自组合物中的至少两种微生物。所述至少两种微生物可以是来自个体的肠微生物组中的至少两种微生物。可以针对所述多个菌株特异性序列设计靶引物对。在一些情况下，使用靶引物对平行进行定量聚合酶链反应(qPCR)，以对所述多个菌株特异性序列进行测序。qPCR可以产生测序数据。在一些情况下，qPCR包括使用纳米孔阵列。该纳米孔阵列可以是任何合适的纳米孔阵列，如SmartChipTM(WafterGen)。该测序数据可用来确定组合物中每种微生物的生长速率。该测序数据可用来计算所述多个菌株特异性序列中的每一个从复制起点到复制终点的DNA比例。从复制起点到复制终点的DNA比例可以与作为细胞复制的函数的生长速率成比例。在一些情况下，个体肠中微生物的量或生长在原位确定。
菌株向氧稳定的微生物的转化
一旦生长，可以将细菌菌株冻干或冷冻干燥。在冻干(也称为冷冻干燥)过程中，可能发生升华，液体可以作为水蒸气除去。冻干可用来保存微生物培养物并使严格干燥样品所造成的损害减至最小。当在组合物中施用时，冻干还可以促进高细胞活力和代谢活性。冻干可以是细菌的适当脱水过程，以获得固体和稳定的最终制剂。如果没有通过冻干保存所提供的保护，细胞可能会死亡，而存活的细胞可能会在储存后迅速死亡。合适的冷冻保护剂和干燥介质混合物的选择对于在冻干和随后的储存期间提高微生物的存活率可能至关重要。
在冻干过程中，冻干参数的影响、冷冻干燥基质和不同储存条件是可能影响短期和长期微生物活力的因素。冻干参数可以涉及在冻干过程中使用的材料和条件。参数可包括但不限于冷冻保护剂、介质、温度、压力、时间、样品体积和样品水分含量。冻干介质可包含冷冻保护剂和/或基质剂。基质剂可以指导整个样品在冻干期间和之后保持其形状。基质剂可选自脱脂乳、甘露醇、血清和牛血清白蛋白(BSA)。储存条件可包括冻干微生物的稳定持续时间、温度和大气氧条件。
一种或多种分离并纯化的厌氧微生物可以用冷冻保护剂冻干。各种冷冻保护剂组合可用于细菌在冷冻干燥后的活力增加，冻干饼的质地改善以便于研磨，以及冷冻干燥的细菌在不同温度条件下的长期稳定性改善。冷冻保护剂可包括脱脂奶粉、乳清蛋白、水、植物介质、葡聚糖、谷氨酸、组氨酸、甘露醇、海藻糖、甘油、麦芽糖糊精、菊粉、甜菜碱、侧金盏花醇(adonitol)、蔗糖、葡萄糖、乳糖和聚合物，以及它们的任意组合。这类组合可在冷冻干燥后立即产生活细胞。冷冻保护剂组合可包含与冷冻保护剂如海藻糖和蔗糖组合的谷氨酸钠或山梨醇和葡聚糖。
冷冻保护剂与菌株的比例可以是残余的冷冻保护剂，其中可以除去所有的冷冻保护剂上清液。
冷冻保护剂元素可包括甲酰胺、二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、甘油、胶体、蔗糖、海藻糖、菊粉、甘油、海藻糖、脱脂乳和2-甲基-2,4-戊二醇、水和生长培养基。冷冻保护剂可以是按体积计至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。冷冻保护剂可以是按重量计至少约1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x、20x、25x、30x、35x或40x。冷冻保护剂可以是至少约1x。冷冻保护剂可以是按重量计至多约1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x、20x、25x、30x、35x或40x。冷冻保护剂可以是至多约1x。
在微生物培养物生长后，可以将冻干缓冲液加入板中，并且可以使用无菌玻璃棒悬浮细胞。也可加入冷冻保护剂。可以将培养悬浮液冷冻至少约20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、10小时、15小时、20小时或25小时。温度应至多约为-90℃、-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、-30℃、-20℃或-10℃。也可以快速冷冻微生物。快速冷冻可以在干冰和乙醇浴中进行。冷冻方法也可以使用液氮。在冷冻期间，可以开启冻干器，并且可以使适当的温度和真空条件稳定。为了确保冷冻，样品可以在至少约-60℃、-50℃、-40℃、-30℃的温度下放置至少约20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时或3小时。冻干器可以能够达到至多约75毫托(mtorr)、100mtorr、125mtorr、150mtorr、175mtorr、200mtorr、250mtorr、300mtorr、350mtorr、400mtorr、450mtorr或500mtorr的压力。达到压力的持续时间可以是至多约10分钟、20分钟、30分钟、40分钟或50分钟。然后，干燥架的温度可以升高到至多-90℃、-85℃、-80℃、-75℃、-70℃、-65℃、-60℃、-55℃、-50℃、-45℃、-40℃、-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-15℃或-10℃。
可以使用架子或歧管进行冷冻干燥。可以将冷冻培养物小心地且无菌地放置在冷冻干燥室中。样品可以是至少约0.1毫升(mL)、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8ml、0.9mL或1mL。可以对该室施加真空。培养物可以在至少约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、10小时、15小时、20小时、25或48小时后完全冻干。然后可以将样品从冷冻干燥器室中取出并储存在低于约30℃、10℃、0℃、-20℃、-30℃或-80℃的温度下。样品还可含有至多约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的水分。样品还可含有至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的水分。在二次干燥阶段期间，可以通过在样品上加热至多约30分钟、40分钟、50分钟、1小时、1.5小时、2小时或3小时来降低水分含量。
冻干细菌可以是氧稳定的。冻干菌株在含有至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％氧气的气氛中可以是稳定的。可以监测冻干培养物的稳定性和活力至少约7天、14天、30天、60天、90天、120天、150天、180天、365天或730天。冻干培养物在至少约0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃或30℃的温度下可以是稳定的。所述方法可以产生至少约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3％、3.2％、3.4％、3.6％、3.8％、4％、4.2％、4.4％、4.6％、4.8％、5％、10％或100％的活细胞。一种或多种氧稳定的微生物可以在百万分之0(ppm)的氧气至100ppm的氧气之间存活。氧稳定的微生物可以在至多0.1ppm、0.2ppm、0.3ppm、0.4ppm、0.5ppm、0.6ppm、0.7ppm、0.8ppm、0.9ppm、1ppm、1.2ppm、1.4ppm、1.6ppm、1.8ppm、2ppm、2.2ppm、2.4ppm、2.6ppm、2.8ppm、3ppm、3.2ppm、3.4ppm、3.6ppm、3.8ppm、4ppm、4.2ppm、4.4ppm、4.6ppm、4.8ppm、5ppm、10ppm或100ppm的氧气中存活。氧稳定的微生物可以在0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2％的溶解氧(DO)中存活。
在一些实施方案中，例如通过喷雾干燥或冻干将所述微生物制成干燥形式。在一些实施方案中，将该制剂制成液体胶囊以维持微生物的液体形式。
冻干细菌可以在大气氧中存活至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年、3年、4年或5年。
可以在冻干后通过流式细胞术确定细菌检测和活/死数据。流式细胞术可用来确定细菌的活力、代谢状态和抗原标志物。具体而言，该方法可以对样品中的活微生物进行定量。例如，活细胞的特征可以是未损伤的膜，并且对某些染料如碘化丙锭(PI)而言是不可透过的。PI可能能够透过死细胞的破损的膜。相反，其它染料如噻唑橙(TO)可能是透过性的并且可以进入所有细胞。细胞可以具有完整的膜并且可以存活或死亡。这两种染料的组合可用来在活/死细胞试验中表征冻干后的微生物。图7示出了可用来为其它测量创建标准曲线的代表性活微生物和死微生物计数。活/死数据也可以与光密度相关联。例如，读板仪可以测量光密度并将测量值与CFU相关联。在图7中，右图表示对所有活细胞和死细胞的噻唑橙染色，而左图表示碘化丙锭对死细胞的染色。
图8示出了在确定长双歧杆菌的OD与CFU之间的线性关系时来自一系列稀释度的可重复测量。OD是一种快速光学方法，它简单地报告液体的“透明度”。CFU是一种更难获得的量度，因为需要确定活细胞和死细胞。以前用于CFU测量的标准方法是使细菌在平板上生长，然后对之后观察到的菌落数进行计数(因此称为菌落形成单位)。最近的一种方法(在该图中使用的方法)涉及用细胞透过性和不可透过性染料对细菌培养物进行染色，以便能够区分死细胞和活细胞。然后使用流式细胞仪进行荧光计数。如果OD方法可以使用更相关的CFU方法进行归一化，那么它可以用作监测生长的替代方法。
在图9A中，比较了冻干之前和之后长双歧杆菌在96孔板中的活细菌细胞计数。在生长曲线中观察到的延迟与初始起始浓度直接相关，因此冻干后向右侧的偏移表明在该过程中发生了活力的损失。通过使用浓度标准，可以将该Δ值转化为浓度下降(例如冻干后10％存活)。此外，在图9B中，可以在将循环阈值相对于微生物稀释度进行作图时开发标准。这显示了使用特异性引物的定量聚合酶链反应(qPCR)数据，并且表明我们确实观察到了我们期望的浓度范围
用于向有需要的受试者施用的组合物可包含Roseburia inulinivorans、史氏甲烷短杆菌、婴儿双歧杆菌、壳多糖、右旋糖、核糖、吐温、甘油和P-聚糖。
用于向有需要的受试者施用的组合物可包含粪球菌属、生黄瘤胃球菌、婴儿双歧杆菌、生物素、山梨醇、蔗糖、抗坏血酸、侧金盏花醇和抗性淀粉。
用于向有需要的受试者施用的组合物可包含普氏粪杆菌、消化链球菌属、婴儿双歧杆菌、P-葡聚糖、甘露醇、乳糖、黄原胶、谷氨酸和木寡糖。
用于向有需要的受试者施用的组合物可包含拜氏梭菌、丁酸梭菌、婴儿双歧杆菌、菊粉、蔗糖、海藻糖、甘油、麦芽糖糊精和羟丙基甲基纤维素。
用于向有需要的受试者施用的组合物可包含Akkermansia muciniphila、婴儿双歧杆菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、霍氏真杆菌、菊粉、蔗糖、海藻糖、甘油、麦芽糖糊精和羟丙基甲基纤维素。
用于向有需要的受试者施用的组合物可包含青春双歧杆菌、Akkermansiamuciniphila、霍氏真杆菌和吲哚梭菌、菊粉、蔗糖、海藻糖、甘油、麦芽糖糊精和羟丙基甲基纤维素。
用于向有需要的受试者施用的组合物可包含婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌和霍氏真杆菌、菊粉、蔗糖、海藻糖、甘油、麦芽糖糊精和羟丙基甲基纤维素。
用于向有需要的受试者施用的组合物可包含普氏粪杆菌、拜氏梭菌、双歧双歧杆菌和短乳杆菌、菊粉、蔗糖、海藻糖、甘油、麦芽糖糊精和羟丙基甲基纤维素。
用于向有需要的受试者施用的组合物可包含拜氏梭菌、丁酸梭菌、婴儿双歧杆菌、菊粉、蔗糖、海藻糖、甘油、麦芽糖糊精和羟丙基甲基纤维素。
用于向有需要的受试者施用的组合物可包含Akkermansia muciniphila、拜氏梭菌、丁酸梭菌、霍氏真杆菌、婴儿双歧杆菌、菊粉、蔗糖、海藻糖、甘油、麦芽糖糊精和羟丙基甲基纤维素。
用于向有需要的受试者施用的组合物可包含吲哚梭菌、长双歧杆菌和Akkermansia muciniphila、菊粉、蔗糖、海藻糖、甘油、麦芽糖糊精和羟丙基甲基纤维素。
用于向有需要的受试者施用的组合物可包含双歧双歧杆菌和短乳杆菌、菊粉、蔗糖、海藻糖、甘油、麦芽糖糊精和羟丙基甲基纤维素。
用于向有需要的受试者施用的组合物可包含普氏粪杆菌、消化链球菌属、婴儿双歧杆菌、果胶、乳糖、甘露醇、棕榈油、乳清蛋白和反式半乳寡糖。
用于向有需要的受试者施用的组合物可包含肠氨基酸球菌、Anaerostipescaccae、婴儿双歧杆菌、塔格糖、葡萄糖、蔗糖、角叉菜胶、水和β-葡聚糖。
用于向有需要的受试者施用的组合物可包含园环梭菌、干酪乳杆菌、婴儿双歧杆菌、纤维素、麦芽糖、N-乙酰基葡糖胺、聚-L-赖氨酸、植物介质和刺槐豆胶。
用于向有需要的受试者施用的组合物，其中该组合物具有以下性质：a)该组合物包含至少1.0x 108个活性细胞/g，以及b)该组合物包含不超过5.0mcg/g的砷、不超过3.3mcg/g的铅、不超过5.0mcg/g的汞和不超过1.6mcg/g的镉。该组合物可以是粉末。该组合物的颜色可以是米色至深棕褐色。
用于向有需要的受试者施用的组合物，其具有至少三种选自下组的性质：a)该组合物包含约1.0x 108个活性细胞/g，b)该组合物是粉末，c)该组合物的颜色为米色至深棕褐色，以及d)该组合物包含不超过5.0mcg/g的砷、不超过3.3mcg/g的铅、不超过5.0mcg/g的汞和不超过1.6mcg/g的镉。
用于向有需要的受试者施用的组合物，其中该组合物具有以下性质：a)该组合物包含约8.2x 109个活性细胞/g，b)该组合物是粉末，c)该组合物的颜色为棕褐色，以及d)该组合物包含不超过约0.02mcg/g的砷、不超过约0.2mcg/g的铅、不超过约0.01mcg/g的汞和不超过约0.12mcg/g的镉。
用于向有需要的受试者施用的组合物，其具有至少三种选自下组的性质：a)该组合物包含约8.2x 109个活性细胞/g，b)该组合物是粉末，c)该组合物的颜色为棕褐色，以及d)该组合物包含不超过约0.02mcg/g的砷、不超过约0.2mcg/g的铅、不超过约0.01mcg/g的汞和不超过约0.12mcg/g的镉。
包封方法
配制的组合物可能比基于食物的载体系统更有效并且可能更具特色。用于益生菌递送的制剂的实例可包括胶囊、片剂或珠粒。配制过程可以影响剂型施用正确量和数目的活微生物的能力。可以将额外的参数整合到组合物中以增加微生物的存活率。
本文中讨论的包含一种或多种分离并纯化的微生物的组合物可以被包封以供递送至受试者的小肠、大肠、回肠或其组合。包封的混合物可以在受试者的小肠或大肠之前基本上不释放分离并纯化的微生物的群体。
包封技术可以选自多种途径，包括在流化床或锅包衣机中对制剂的壳包衣，或者将制剂作为小液滴分散在不混溶的液体或空气中并使小液滴凝固。分散技术可包括液体空气分散或液体液体分散。液体空气分散包括雾化和滴落以及射流破裂。液体液体分散包括乳化和胶束化。雾化可以通过压力喷嘴、两个流体喷嘴和旋转盘来完成。滴落和射流破裂包括简单的滴落、静电挤出、同轴空气和液体流动、喷射切割、离心喷嘴或振动喷嘴。乳化包括高压匀浆器、超声匀浆器、静态混合器、转子和定子装置、微流体装置、膜乳化、微通道乳化和喷墨打印。
在硬化浴中的溶剂蒸发和冷却或交联可以凝固空气悬浮的小液滴。乳化是另一种方法，其可以涉及活性物质在连续相液体中的悬浮液或溶液的乳化。然后可以通过内部凝胶化、聚合、逐层静电沉积、内部相分离和凝聚来产生基质/壳。在包封过程中形成固体壳和基质的常用方法可以是机械和热、物理化学或化学方法。机械和热方法包括冷却、冷冻、锅包衣或流化床包衣。流化床包衣可包括顶喷、底喷、切向喷射或沃斯特(wurster)工艺。物理化学方法可包括溶剂去除、逐层沉积、自组装、简单和复杂的凝聚、离子凝胶化或内部相分离。溶剂去除包括蒸发或干燥和液体萃取。化学方法可包括悬浮聚合、界面缩聚或溶胶-凝胶化学法。悬浮聚合可包括一级(直接)悬浮聚合或两级悬浮聚合(小液滴溶胀)方法。脂质体也可用于包封。
水凝胶可用来包封微生物。微生物可包含一种或多种菌株。水凝胶可包含被捕获在亲水性聚合物网络中的亲水性活性物质。化学或物理凝胶化可形成凝胶网络。化学凝胶化可包括自由基聚合过程或缩合。物理凝胶化可以利用热定型凝胶的加热、冷凝固凝胶的冷却，或通过离子移变凝胶化添加多价抗衡离子。相反，凝聚可以包括首先在活性成分的乳液或悬浮液中静电相分离成含有富聚合物的液相、贫聚合物的液相和含有活性成分的液相或固相的三相系统。其次，凝聚可包括将凝聚相沉积到分散的小液滴或颗粒上，随后使涂层硬化。
在溶剂蒸发方法中，有机溶剂可以溶解高熔点油，并且混合物在室温下用水相乳化。接下来，可以通过有机溶剂蒸发来产生固体颗粒。结果，固体脂质颗粒小于初始小油滴。另一方面，在温度控制乳化期间，固体脂质微粒通常可以与初始小油滴具有相同的大小。在溶剂蒸发或冷却之前，可以通过形成水包油包水乳液(W/O/W)来包封亲水性样品。
微生物作为生物膜的生长
在一些情况下，生物膜形成可用作改善微生物的活力和保存期限的技术。可使微生物产生细胞外基质，该细胞外基质可包含蛋白质、糖、脂质的支架，并且在一些情况下包含生物膜形式的细胞外DNA。在一些情况下，生物膜形成可能有益于微生物的生长。在一些情况下，生物膜形成的益处可包括培养中微生物活力的增加。
在一些实施方案中，作为生物膜生长的微生物可以在干燥程序后储存。干燥程序的非限制性实例是：冻干、冷冻干燥、喷雾干燥等。
在一些实施方案中，可以冻干作为生物膜生长的微生物以提高储存时间和活力。
在一些实施方案中，在生物膜中生长的微生物可以用冷冻保护剂涂覆，以改善微生物的活力。或者，培养中的微生物可包含冷冻保护剂作为培养基的一部分。
在一些实施方案中，可以包封冻干的微生物。在一些情况下，包封程序可以是微胶囊化。在一些情况下，可以进行微胶囊化以增加微生物产品在室温下的储存时间或保存期限。
治疗受试者的方法
本公开内容提供了用于治疗健康状况，例如，微生物组相关的健康状况的方法和组合物。治疗可以通过例如在显示与疾病发作相关联的合适的身体部位施用治疗有效量的基于微生物的组合物来实现。可将组合物递送至受试者的肠。可以施用组合物以供在受试者的肠中释放。
本公开内容提供了用于将受试者的微生物生境恢复到健康状态的方法。该方法可包括微生物组纠正和/或调整，包括例如补充天然微生物、去除病原微生物、施用益生元和微生物组存活所必需的生长因子。该方法可包括施用抗微生物剂，如抗生素。
微生物组相关病症
提出了可能与微生物组相关的健康状况的非限制性实例。这些健康状况可包括，例如，2型糖尿病(T2DM)、早产、慢性疲劳综合征、皮肤状况如痤疮、变态反应、自闭症、哮喘、抑郁症、高血压、肠易激综合征、代谢综合征、肥胖、乳糖不耐受、鹅口疮、溃疡性结肠炎、药物代谢、阴道病、特应性皮炎、银屑病、I型糖尿病(T1DM)、糖尿病、多发性硬化、神经系统病症如帕金森病、艰难梭菌(Clostridium Difficile)感染、炎性肠病、克罗恩病、心脏病、糖尿病足溃疡、菌血症、婴儿腹痛、癌症、囊性纤维化、多发性硬化、尿路感染、放射性肠病、药物代谢、龋齿、口臭、代谢紊乱、胃肠病症、胰岛素不敏感、代谢综合征、胰岛素缺乏、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、非酒精性脂肪酸肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、心血管疾病、高血压、与胆固醇相关的病症、与甘油三酯相关的病症、肥胖、超重状况、炎症、婴儿配方食品喂养、阑尾炎、特应性疾病、衰老、禁食、妊娠、妊娠期间肥胖、葡聚糖硫酸钠诱发的结肠炎、腹泻、变应性腹泻和动脉粥样硬化。
在一些实施方案中，所述病症与受试者的改变的微生物组相关和/或由其引起。在一些实施方案中，病症与肠生态失调相关和/或由其引起。在一些实施方案中，所述病症与受试者中一种或多种短链脂肪酸(SCFA)的产生改变相关和/或由其引起。在一些实施方案中，该短链脂肪酸是丁酸。在一些实施方案中，该短链脂肪酸是丙酸(例如，吲哚3-丙酸)。在一些实施方案中，该短链脂肪酸是乙酸。在一些实施方案中，所述病症由降低的丁酸产生引起。例如，患者可以具有减少的产生短链脂肪酸(例如产生丁酸)的微生物。改变的SCFA产生可以由例如改变的SCFA途径(例如，改变的丁酸途径)、改变的产生SCFA的微生物或者SCFA途径或产生SCFA的微生物所需的底物或辅因子的增加或减少引起。改变的丁酸产生可以影响受试者中的一种或多种下游信号传导途径，这可以导致病症。例如，包含益生菌以增加丁酸产生的方法和组合物可用于治疗病症。
受试者可具有作为病症的标记或特征(例如，病症的微生物组标记)的微生物组谱。例如，患有代谢紊乱如IBD或克罗恩病的患者可以具有减少的微生物如拟杆菌、真杆菌、粪杆菌和瘤胃球菌群体，和/或增加的放线菌和双歧杆菌群体。与健康对照相比，该患者可具有降低的丁酸浓度(例如，在粪便中)。疾病的微生物群标记可用作确定病症的诊断。肠微生物区系组成的失衡可能与炎性肠病的发病机制有关。
用本公开内容的组合物治疗的病症或状况可包括皮肤或皮肤学病症、代谢紊乱、神经系统病症、癌症、心血管病症、免疫功能病症、炎性病症、肺病症、转移、化疗或放疗诱发的状况、年龄相关的病症、早衰症和睡眠障碍。
肠微生物群的改变可能与病症的病理生理学有关，该病症例如是皮肤或皮肤学病症、代谢紊乱、神经系统病症、癌症、心血管病症、免疫功能病症、炎性病症、肺病症、转移、化疗或放疗诱发的状况、年龄相关的病症、早衰症和睡眠障碍。
患有代谢紊乱或代谢综合征的受试者可患有共病，包括例如皮肤或皮肤学病症、代谢紊乱、神经系统病症、癌症、心血管病症、免疫功能病症、炎性病症、肺病症、转移、化疗或放疗诱发的状况、年龄相关的病症、早衰症和睡眠障碍。
代谢紊乱
在一些实施方案中，所述病症可以是代谢紊乱。代谢紊乱的非限制性实例包括糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、青少年糖尿病、代谢综合征、炎性肠病(IBD)、肠易激综合征、肥胖、超重状况、缺血再灌注损伤如肝脏缺血再灌注损伤、脂肪肝病、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非肥胖受试者中的NAFLD(例如，不是由肥胖或体重过重问题引起的或不与之相关的NAFLD)、非肥胖受试者中的NASH(例如，不是由肥胖或体重过重问题引起的或不与之相关的NASH)、克罗恩病、结肠炎、溃疡性结肠炎、假膜性结肠炎、肾功能不全、肾病病理学、肾小球疾病、药物代谢、乳糖不耐受、胰岛素不敏感、胰岛素缺乏、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、腹泻、变应性腹泻、葡聚糖硫酸钠诱发的结肠炎。
代谢紊乱患者可以具有减少的丁酸产生者。患有代谢状况(例如，克罗恩病；炎性肠病)的受试者可显示出拟杆菌、真杆菌、粪杆菌和瘤胃球菌减少；放线菌和双歧杆菌增加；丁酸产生途径减少；丁酸产生菌株减少；丁酸浓度降低(例如，在粪便中)；和肠微生物区系组成的失衡。
在一些实施方案中，所述病症可以是I型糖尿病(T1DM)。T1DM患者可以具有减少的细菌多样性和减少的产生丁酸的微生物。增加丁酸产量，例如通过施用包含A.muciniphila的组合物，可用于T1DM治疗。
在一些实施方案中，所述病症可以是炎性肠病(IBD)。IBD患者可以具有降低的丁酸产量(例如，由于产生丁酸的微生物减少)。增加丁酸产量可导致IBD减轻。丁酸可以改善与IBD相关的结肠炎症。
在一些实施方案中，所述病症可以是克罗恩病。丁酸可以例如减少细胞因子(例如，肿瘤坏死因子；促炎性细胞因子mPRA)的产生；消除脂多糖诱导的细胞因子的表达；并消除NFkappaB(NF-kB)向血细胞核的迁移。丁酸可以减少促炎性细胞因子的表达，例如，通过抑制NF-κB活化和IkappaBalpha(IdBa)降解。丁酸可通过NFκB抑制来抑制炎性应答(例如，在克罗恩病中)。
在一些实施方案中，所述病症可以是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。在一些实施方案中，所述病症可以是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。患有NAFLD的受试者可以具有减少的丁酸产量和/或产生丁酸的微生物。例如，施用产生丁酸的微生物(例如，丁酸梭菌)可以降低NAFLD进展、减少肝脏脂质沉积、改善甘油三酯含量、改善胰岛素抵抗、改善血清内毒素水平和改善肝脏炎症指数。改变的肠微生物组可以独立地引起肥胖，肥胖可能是NAFLD最重要的危险因素之一。这种能力可以归因于短链脂肪酸(SCFA)，SCFA是肠微生物发酵产物。SCFA可以占宿主的热量摄入的很大一部分。SCFA可通过激活GLP-2信号传导来增强肠吸收。SCFA升高可能是抑制结肠炎的适应性措施，其可能比热量摄入失衡更优先。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者的微生物组可具有升高的酒精产生能力。酒精性脂肪性肝炎的病理机制可适用于NASH。NAFLD和NASH可能与升高的革兰氏阴性微生物组和内毒素血症相关。NASH患者可表现出正常的血清内毒素，表明NASH的发病机制可能不需要内毒素血症。本公开内容的微生物组合物可使NAFLD和NASH患者受益。
在一些实施方案中，所述病症可以是全肝缺血再灌注损伤。丁酸预处理可改善缺血再灌注损伤后的肝功能和组织学。炎性因子水平、巨噬细胞活化、TLR4表达和嗜中性粒细胞浸润可被丁酸减弱。
在一些实施方案中，所述病症可以是妊娠糖尿病。
神经系统和行为状况
在一些实施方案中，所述病症可以是神经系统状况。神经系统状况包括但不限于神经活动障碍、焦虑、抑郁、食物成瘾、慢性疲劳综合征、自闭症、自闭症谱系病症、Asperger综合征、广泛性发育障碍、帕金森病、阿尔茨海默病、痴呆、肌萎缩侧索硬化(ALS)、延髓性麻痹、假性延髓麻痹、原发性侧索硬化、运动神经元功能障碍(MND)、轻度认知障碍(MCI)、亨廷顿病、眼部疾病、年龄相关性黄斑变性、青光眼、视力减退、老花眼、白内障、进行性肌萎缩、下运动神经元疾病、脊髓性肌萎缩(SMA)、Werdnig-Hoffman病(SMA1)、SMA2、Kugelberg-Welander病(SM3)、肯尼迪病、脊髓灰质炎后综合征和遗传性痉挛性截瘫。本公开内容的组合物可用于例如稳定情绪、改善情绪、调节过度情感抑郁、减轻焦虑、减轻压力及其组合。在一些实施方案中，所述病症是行为状况。
肠微生物可以在神经系统和宿主行为中发挥作用。增加SCFA产量(例如，通过增加丁酸产生者)可以例如改善大脑发育、运动活动、减轻焦虑、改善抑郁、增加免疫调节性Treg细胞以及改善心理状态。
本公开内容的方法和组合物可以调节例如下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)、免疫系统、肠神经系统、自主神经系统、中枢神经系统、神经活性物质的产生、短链脂肪酸(SCFA)的产生、抗生素活性物质的产生和肠功能的改变(例如，感觉-运动功能、屏障功能)。
本公开内容的方法和组合物可以通过例如调节皮质醇、5-羟色胺、多巴胺和/或GABA来调节行为。本公开内容的方法和组合物可以用来通过例如调节胰岛素、瘦素、生长素释放肽和/或GLP-1来调节食欲。
本公开内容的方法和组合物可以通过例如调节肥大细胞活化和/或炎性细胞因子产生来调节肠免疫系统。
丁酸可激活胰岛素敏感和胰岛素不敏感状态下的肠糖异生，这可促进葡萄糖和能量稳态。微生物组合物可以改变控制情绪和感觉的中枢处理的大脑区域的活动。
本公开内容的方法和组合物可以调节(例如，降低)受试者的食欲。方法和组合物可以调节(例如，改善)受试者的行为。本公开内容的方法和组合物可以调节(例如，促进)受试者的饱腹感。
肠微生物组的丁酸产生可以降低食欲，例如，通过肠-脑联系。与消瘦受试者相比，肥胖受试者在食物添加和食物渴望量表上的分数可能增加。肠微生物群的改变可能与几种脑病症的病理生理学相关，包括焦虑、抑郁和食欲。当摄入纤维时，肠微生物可以将纤维代谢成短链脂肪酸，包括丁酸。丁酸可以与受体，例如G蛋白偶联受体结合。例如，丁酸可以与G蛋白偶联受体GPR41结合并触发酪氨酸-酪氨酸肽(PYY)和胰高血糖素样肽1(GLP-1)。PYY和GLP-1可以与肠神经系统中的受体结合，导致通过迷走神经向大脑发出信号，这可导致食欲降低。
本公开内容的方法和组合物可以改变受试者中神经递质物质(例如，5-羟色胺、多巴胺、GABA)、神经活性代谢物(例如，支链和芳香族氨基酸、对甲酚、N-乙酰基腐胺、邻甲酚、苯酚硫酸盐、kinurate、己酸、组胺、胍丁胺)和炎性剂(例如，脂多糖、IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、CRP)的水平。
本公开内容的微生物组合物可以产生丙酸，例如，吲哚3-丙酸，或调节其产生。吲哚-3-丙酸可以起抗氧化剂的作用。吲哚-3-丙酸可与神经系统病症例如阿尔茨海默病相关。吲哚-3-丙酸可以保护神经元和神经母细胞瘤细胞免受β-淀粉样蛋白毒性。吲哚-3-丙酸可以由胃肠道中的微生物如生孢梭菌由例如膳食色氨酸产生。本公开内容的微生物组合物——其包含分离并纯化的微生物群体，该微生物与生孢梭菌的rRNA(例如，16S或23S)序列具有至少约85％(例如，90％、95％、98％、99％或100％)的序列同一性——可用来治疗神经系统病症(例如，阿尔茨海默病)。
免疫系统状况
在一些实施方案中，所述病症可以是免疫系统病症。在一些实施方案中，所述病症可以是炎性状况。在一些实施方案中，所述病症可以是炎症。
免疫系统相关病症的非限制性实例包括变态反应、炎症、炎性病症、过敏性休克、自身免疫病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、糖尿病、自身免疫性肠病、腹部疾病、克罗恩病、显微镜下结肠炎、溃疡性结肠炎、骨关节炎、骨质疏松症、口腔粘膜炎、炎性肠病、脊柱后凸、椎间盘突出、溃疡性哮喘、肾纤维化、肝纤维化、胰腺纤维化、心脏纤维化、皮肤伤口愈合和口腔粘膜下纤维化。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗有需要的受试者中由对器官移植物的宿主免疫应答所导致的状况或降低其可能性的方法。器官移植的非限制性实例包括肾脏器官移植、骨髓移植、肝移植、肺移植和心脏移植。在一些实施方案中，本公开内容提供了治疗有需要的受试者中的移植物抗宿主病的方法。
微生物代谢物可以在免疫系统的发育中发挥作用。肠微生物组可以在变态反应的发展中发挥作用。微生物可以介导免疫调节。基于细菌的免疫调节能力，益生菌可用于治疗湿疹，例如双歧双歧杆菌、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalissubsp.Lactis)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。较少量的代谢物SCFA、琥珀酸、苯丙氨酸和丙氨酸可以在后来发生皮肤病症(例如湿疹)的受试者(例如，儿童)的粪便样品中发现，而葡萄糖、半乳糖、乳酸和乳糖的量与未发生皮肤病症的受试者相比可以更高。补充多个物种的益生菌可以诱导更高水平的乳酸和SCFA，以及更低水平的乳糖和琥珀酸盐。
施用包含SCFA或产生SCFA的微生物的组合物可以增加免疫调节性细胞。
皮肤病症
在一些实施方案中，所述病症可以是皮肤学病症。皮肤学状况包括但不限于皮肤健康、痤疮、银屑病、湿疹、皮疹、皱纹、瘙痒、感觉迟钝、丘疹鳞屑性病症、红皮病、扁平苔癣、苔癣样皮肤病、特应性皮炎、湿疹、嗜酸性粒细胞性皮肤病、反应性嗜中性粒细胞性皮肤病、天疱疮、类天疱疮、免疫大疱性皮肤病、皮肤纤维组织细胞增生、皮肤淋巴瘤和皮肤狼疮。
在一些实施方案中，所述病症可以是特应性皮炎。在一些实施方案中，所述病症可以是湿疹。
患有皮肤病症(例如，特应性皮炎)的患者可以具有例如减少的产生丁酸的微生物、较低的拟杆菌门多样性、改变的肠微生物组多样性以及改变的规则粪球菌丰度。
心血管状况
在一些实施方案中，所述病症可以是心血管病症。心血管状况的非限制性实例包括但不限于心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、心肌病、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病(CAD)、颈动脉疾病、心内膜炎、心脏病发作、冠状动脉血栓形成、心肌梗死(MI)、高血压(high blood pressure)/高血压(hypertension)、主动脉瘤、脑动脉瘤、心肌纤维化、心脏舒张功能障碍、高胆固醇血症/高脂血症、心脏病、二尖瓣脱垂、周围血管疾病、外周动脉疾病(PAD)、心脏应激抗性、中风、与胆固醇相关的病症、与甘油三酯相关的病症。
肺状况
在一些实施方案中，所述病症可以是肺状况。肺状况包括但不限于特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、囊性纤维化、支气管扩张和肺气肿。
在一些实施方案中，受试者可能已暴露于环境污染物，例如二氧化硅。受试者可能已暴露于职业污染物，例如灰尘、烟雾、石棉或烟气。在一些实施方案中，受试者曾经吸烟。
在一些实施方案中，受试者可患有结缔组织病。该结缔组织病可以是例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病或韦格纳氏肉芽肿病。在一些实施方案中，受试者具有感染。在一些实施方案中，受试者曾服用或正在服用药物(例如，胺碘酮、博来霉素、白消安(busufan)、甲氨蝶呤或呋喃妥因)或曾接受胸部放疗。
癌症
在一些实施方案中，所述病症可以是癌症。癌症的非限制性实例包括：结直肠癌、急性淋巴母细胞性白血病、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤如小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始性神经外胚层肿瘤、视通路和下丘脑胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤、原发不明癌症、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因肉瘤、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠间质瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇与口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌如非小细胞和小细胞肺癌、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性隐匿原发鳞状颈癌、口癌、多发性内分泌瘤病综合征、骨髓增生异常综合征、髓样白血病、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、merkel细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞瘤(妊娠)、原发部位不明癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和维尔姆斯瘤、转移。
在一些实施方案中，所述病症可以是结直肠癌。
患有癌症的受试者可能具有改变的丁酸产生，例如，由于产生丁酸的微生物减少。本公开内容的方法和组合物可用于肿瘤治疗和减少，例如，通过向受试者递送产生丁酸的微生物。
体内的大多数细胞类型可以利用葡萄糖作为其初级能量来源，而正常的结肠细胞可以依赖丁酸作为其能量的约60-70％。丁酸可以在线粒体中经历β-氧化，这可以支持能量稳态以供结肠上皮的快速细胞增殖。相反，肿瘤细胞(例如，结直肠肿瘤细胞)可以转换为葡萄糖利用和有氧糖酵解。由于这种代谢转变，丁酸可能不会在肿瘤细胞的线粒体中以相同的程度代谢，并且可以在细胞核中累积。在细胞核中，丁酸可以起到组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂的作用，以在表观遗传上调节基因表达。结肠炎患者可以具有例如高达10倍的结直肠癌增加。
本公开内容的方法和组合物可以增加丁酸的水平，丁酸可以充当内源性HDAC抑制剂。由于丁酸的生物利用度可能主要局限于结肠，因此丁酸可能不会具有与合成HDAC抑制剂(例如化疗中使用的那些)相关的不良反应。例如，由于Warburg效应，丁酸可以靶向肿瘤细胞。
癌症(例如，结肠癌)的膳食风险可以由肠微生物群及其代谢物(例如，SCFA，如丁酸)的生态失调来介导。膳食纤维和/或复合碳水化合物可促进糖分解发酵，其可产生抗炎性和抗增殖SCFA，如丁酸。红肉可以通过促进蛋白水解发酵——从红肉中富含硫的氨基酸内含物产生硫化氢——来产生炎性和遗传毒性代谢物，并将结肠粘膜暴露于致癌成分。
膳食纤维摄入可以促进健康的肠微生物组，后者继而可以增强SCFA(例如丁酸、乙酸、丙酸)的产生。增强的SCFA产生可导致例如减少的食物摄入，增加的能量水平，更好的结肠健康，促进健康的肠道肠屏障，减少结肠内容物通过时间和暴露于致癌物，癌细胞周期停滞和凋亡，抑制癌细胞迁移和侵袭，抑制早期结肠病变，抑制腺瘤形成，抑制结肠腺瘤，抑制肿瘤进展，以及抑制结肠癌。
阴道状况
在一些实施方案中，所述病症可以是阴道状况。阴道状况的非限制性实例包括：阴道病、细菌性阴道病、病毒性阴道病、外阴阴道炎、酵母感染、早产、生育力相关的状况(例如，低生育力)、毛滴虫、外阴痛冲洗后续治疗(例如，针对所冲洗的任何病因)、外阴前庭炎、外阴痛、阴道冲洗。在冲洗后(例如，在患有外阴痛的受试者冲洗后)可以使用本公开内容的组合物。
牙科状况
在一些实施方案中，所述病症可以是牙科状况。牙科状况的非限制性实例包括：阴道病、细菌性阴道病、病毒性阴道病、外阴阴道炎、酵母感染、早产、生育力相关的状况(例如，低生育力)、毛滴虫、外阴痛冲洗后续治疗(例如，针对所冲洗的任何病因)、外阴前庭炎、外阴痛、阴道冲洗。在冲洗后(例如，在患有外阴痛的受试者冲洗后)可以使用本公开内容的组合物。
妊娠相关的状况
在一些实施方案中，所述病症可以是妊娠相关的状况。妊娠相关的状况的非限制性实例包括：早产、未足月产、妊娠期肥胖、妊娠糖尿病。本公开内容的组合物可以施用于怀有将要通过剖腹产出生的婴儿的孕妇和/或施用于通过剖腹产出生的婴儿。本公开内容的组合物可以施用于婴儿、孕妇或两者，以减少这些婴儿中肠病原体或本文所述的任何病症的出现。
制剂
本文提供了可以作为治疗剂(例如，药物组合物)和/或化妆品施用的组合物。该组合物可以作为医疗食品施用。医疗食品可以在医师或医生的在场下肠内递送和施用。可以施用医疗食品以用于疾病状况的特定饮食控制，根据熟悉的科学原理而创建的针对该疾病状况的独特营养需求可以通过医学评估来确定。
本文所述的一种或多种微生物可用来制备包含有效量的用于治疗受试者的组合物的制剂。一些非限制性实例可包括外用剂、胶囊、丸剂、灌肠剂、液体、注射剂等。在一些实施方案中，本文公开的一种或多种菌株可包含在食品或酒水产品、化妆品或营养补充物中。
所述制剂可包含一种或多种额外的活性成分。活性成分可选自：抗生素、益生元、益生菌、聚糖(例如，作为将限制特定细菌/病毒与肠壁结合的诱饵)、噬菌体、微生物等。
组合物可包含微生物，该微生物例如是完整的微生物(例如，完整的细菌)。该组合物可包含，例如，存活的(例如，活的)、休眠的、灭活的或死的微生物(例如细菌)。在一些实施方案中，该组合物可包含活微生物菌株。在一些实施方案中，该组合物可包含死微生物菌株。在一些实施方案中，该组合物可包含活的和死的微生物菌株。该微生物菌株可以是例如本文公开的任何微生物菌株。
组合物可包含微生物组分，例如，细胞组分、细胞部分、蛋白质(例如，膜蛋白、可溶性蛋白质)、降解产物、代谢物、核酸、分泌的分子和由微生物代谢产生的化合物。微生物组分(例如，膜蛋白)可以有益于微生物制剂，例如，用以增加组合物中微生物的稳定性和活力。例如，通过回收微生物培养物的上清液可以获得微生物组分。例如，可以通过从微生物培养物中提取细胞组分或细胞部分、代谢物或分泌的化合物来获得微生物组分。微生物组分可以是分离形式的组分或一种或多种组分的混合物。微生物组分可以是纯化的微生物组分。可以使用纯化的微生物组分的混合物。
在一些实施方案中，所述制剂包含益生元。该益生元可以选自反式半乳寡糖、菊粉、落叶松阿拉伯半乳聚糖(LAG)、抗性淀粉、果胶、β-葡聚糖、木寡糖、刺槐豆胶、P-聚糖和甲基纤维素。该益生元可包括菊粉。菊粉可以以至少约30毫克/毫升(mg/mL)、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL或70mg/mL的量存在于组合物中。菊粉可以充当微生物制剂的能量来源。
可通过合适的方法施用制剂，以供递送至受试者消化道的任何部位，包括口腔，口，食道，胃，十二指肠，包括十二指肠、空肠、回肠在内的小肠区域，以及包括盲肠、结肠、直肠和肛管在内的大肠区域。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于递送至胃肠道的回肠和/或结肠区域。
在一些实施方案中，例如通过旨在于消化道中释放所述组合物的胶囊、丸剂、粉末、片剂、凝胶或液体，经口进行制剂的施用。在一些实施方案中，例如对于包含丁酸、丙酸、乙酸和短链脂肪酸的制剂，通过注射进行制剂的施用。在一些实施方案中，通过将例如乳膏、液体或贴剂施加于皮肤来进行制剂的施用。在一些实施方案中，通过栓剂和/或灌肠剂来进行制剂的施用。在一些实施方案中，采用给药途径的组合。
可将微生物组合物配制成膳食补充剂。微生物组合物可合并有维生素补充剂。可将微生物组合物配制成可咀嚼形式，如益生菌胶剂(gummy)。微生物组合物可并入到食品和/或饮料形式中。可并入微生物组合物的食品和饮料的非限制性实例包括，例如，棒、摇粒(shakes)、果汁、婴儿配方食品、饮料、冷冻食品、发酵食品，以及培养的乳制品，如酸奶、酸奶饮料、奶酪、嗜酸菌饮料和开菲尔(kefir)。
本公开内容的制剂可作为粪便移植过程的一部分来施用。可通过管，例如鼻胃管、鼻空肠管、鼻十二指肠管、口腔胃管、口腔空肠管或口腔十二指肠管将制剂施用于受试者。可通过结肠镜术、内窥镜术、乙状结肠镜术和/或灌肠将制剂施用于受试者。
在一些实施方案中，配制微生物组合物，使得一种或多种微生物一旦被递送至目标生境(例如肠)即可复制。在一个非限制性实例中，将微生物组合物配制成丸剂，使得该丸剂在4℃下储存时具有至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月、24个月和36个月的保存期限。在一个非限制性实例中，包封微生物组合物，使得包封的产品在4℃下储存时具有至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月、24个月和36个月的保存期限。在另一个非限制性实例中，将微生物组合物的储存物配制成使得微生物一旦进入肠中即可繁殖。在一些实施方案中，可加入其它组分以有助于微生物组合物的保存期限。在一些实施方案中，可以以能够在非天然环境中存活的方式配制一种或多种微生物。例如，以肠作为天然环境的微生物在富含氧气的环境中可能无法存活。为了克服这一限制，可将该微生物配制或包封成可减少或避免氧气暴露的丸剂。延长微生物保存期限的其它策略可包括其它微生物(例如，细菌群组构成一种组合物，借此一种或多种菌株有助于一种或多种菌株的存活)。
可将微生物组合物冻干(例如，冷冻干燥)，并配制成可通过任何合适的途径施用于受试者的粉末、片剂、肠溶衣胶囊(例如用于递送至回肠/结肠)或丸剂。冻干后直接获得的组合物可以是不经进一步加工(例如研磨或破碎)而获得的干粉。微生物组合物(例如粉末)可以是非粘性的。微生物组合物(例如粉末)可以是粘性的。微生物组合物(例如粉末)可以是自由流动的。微生物组合物(例如粉末)可以是，例如，基本上非粘性的、基本上粘性的或基本上自由流动的。微生物组合物中的颗粒可以是粘结性的或非粘结性的。在一些情况下，微生物组合物中的颗粒可以是基本上非粘结性的。微生物组合物(例如粉末)可具有均匀的颗粒大小。微生物组合物(例如粉末)可具有不均匀的颗粒大小(例如，不同大小或范围的颗粒)。颗粒大小可以是，例如，小于2目大小，约2至约10目大小，约10至约20目大小，约20至约40目大小，约40至约80目大小，80至约120目大小，约120至约200目大小，超过200目大小，或其混合物。微生物组合物(例如粉末)可具有例如约0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、15wt％、20wt％、25wt％、30wt％、35wt％、40wt％、45wt％、50wt％或更高的流体含量(例如，水含量)。微生物组合物(例如粉末)可具有例如至多约0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、15wt％、20wt％、25wt％、30wt％、35wt％、40wt％、45wt％、50wt％或更高的流体含量(例如，水含量)。微生物组合物(例如粉末)可具有例如至少约0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、15wt％、20wt％、25wt％、30wt％、35wt％、40wt％、45wt％或50wt％的流体含量(例如，水含量)。冻干制剂可在施用之前与盐水或其它溶液混合。
可将组合物配制用于口服递送，例如配制成肠溶衣胶囊或丸剂，以将该制剂的内容物递送至受试者的回肠和/或结肠区域。
可将组合物配制用于口服施用。在一些实施方案中，将组合物配制成肠溶衣丸剂或胶囊以供口服施用。在一些实施方案中，将组合物配制成用于将微生物递送至受试者的回肠区域。在一些实施方案中，将组合物配制成用于将微生物递送至受试者的结肠区域(例如结肠上部)。在一些实施方案中，将组合物配制成用于将微生物递送至受试者的回肠和结肠区域。
肠溶衣可保护口服制剂(例如丸剂或胶囊)的内容物免受胃的酸性侵害，并提供向回肠和/或结肠上部区域的递送。肠溶衣的非限制性实例包括pH敏感性聚合物(例如，eudragit FS30D)、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙酸琥珀酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯(例如羟丙甲纤维素乙酸琥珀酸酯)、聚乙烯乙酸邻苯二甲酸酯(PVAP)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、虫胶、醋酸偏苯三酸纤维素、藻酸钠、玉米醇溶蛋白、其它聚合物、脂肪酸、蜡、虫胶、塑料、植物纤维和CapsugelDR。保持效力的包装技术可以是Bel-Art、Biorx、ColorSafe、CSP Vials、Dynalon、MPVials、PSA、Pill Pod、Qorpak、Safer Lock或Wheaton。在一些实施方案中，肠溶衣由pH敏感性聚合物形成。在一些实施方案中，肠溶衣由eudragit FS30D形成。肠溶衣胶囊可包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个肠溶衣。
可将肠溶衣设计成在任何合适的pH下溶解。在一些实施方案中，将肠溶衣设计成在高于约pH 6.5至约pH 7.0的pH下溶解。在一些实施方案中，将肠溶衣设计成在高于约pH6.5的pH下溶解。在一些实施方案中，将肠溶衣设计成在高于约pH 7.0的pH下溶解。可将肠溶衣设计成在高于大约5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5个pH单位的pH下溶解。
图4提供了各种菌株在室温(RT)和4℃下的稳定性的非限制性实施方案。微生物可以在室温和4℃下稳定。微生物可以稳定至少5天、至少10天、至少15天或至少30天。微生物可以稳定长达30天或长达15天。
图5A提供了胶囊制剂在室温(RT)和4℃下的稳定性的非限制性实施方案。图5B提供了两种制剂的另外的非限制性实施方案，它们在28天的时期内保持稳定。该胶囊可以稳定至少5天、至少10天、至少15天、至少25天或至少30天。
聚合物包衣可包含聚乙烯醇(PVA)、羟丙基甲基纤维素和羟丙基纤维素、增塑剂和可选的着色剂。用于胶囊或片剂的膜包衣可包含聚乙烯醇(PVA)、二氧化钛、聚乙二醇、滑石和着色剂。外保护涂层还可包含抗粘附剂、助流剂和遮光剂。至少1、2、3、4或5个胶囊可用于靶向递送。配制的组合物可包含一个或多个肠溶包衣。多个包衣可以分阶段溶解，以允许选择性递送。多个包衣还可以提供组合物的控制释放。如果使用单独的多个肠溶聚合物包衣层，则可以减少实现结肠释放所需的肠溶聚合物包衣的总量。例如，最外层可由一定量的在至少约pH6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5下开始溶解的肠溶聚合物组成，使得该包衣层在回肠(小肠)的远端部分内完全溶解。内包衣层可包含一定量的在至少约pH 4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5下开始溶解的肠溶聚合物，其中在近端结肠内发生完全溶解。因此，最外包衣层可用来防止当剂型从胃肠道转移到远端小肠时治疗剂的释放。内包衣层可以起到进一步延迟治疗剂释放的作用，直到剂型到达近端结肠。
在施用制剂之前，可以净化结肠以除去不需要的细菌、粘液和陈旧的粪便物质，以备摄取和吸收微生物制剂。在一些实施方案中，可在施用本公开内容的制剂之前进行例如结肠净化方法，如结肠灌洗/水疗法，灌肠，轻泻剂、膳食补充剂、膳食纤维、酶和镁的施用。
在一些实施方案中，将微生物配制成按比例具有少量孢子的微生物的群体。配制的组合物可以基本上不含孢子。含孢子的制剂可通过本文所述的任何合适的途径施用。口服施用的含孢子制剂可在胃的低pH环境中存活。所采用的孢子的量可以是，例如，整个制剂的约1％w/w至约99％w/w。配制的组合物可以基本上不含孢子。示例性组合物可包含少于约1％、3％、5％、7％、9％、10％、20％、30％、40％或50％w/w的孢子。微生物的混合物可含有至少约90％的未形成孢子的专性厌氧微生物。包含孢子的组合物的比例可以使用一次性Neubauer室通过显微镜检查来确定。孢子可以在显微镜下在随机样品中容易地检测，而无需进一步染色。
本文提供的制剂可包括向治疗剂或化妆品中添加一种或多种试剂，以便增强微生物制剂的稳定性和/或存活率。稳定剂的非限制性实例包括遗传元件、甘油、抗坏血酸、脱脂乳、乳糖、吐温、藻酸盐、黄原胶、角叉菜胶、甘露醇、棕榈油和聚-L-赖氨酸(POPL)。
在一些实施方案中，制剂包含一种或多种重组微生物或经遗传修饰的微生物。在其它实施方案中，一种或多种微生物不是修饰或重组的。在一些实施方案中，该制剂包含可被调节的微生物，例如，包含用来控制微生物生长的操纵子或启动子的微生物。可使用包括重组方法在内的任何合适的方法产生、生长或修饰本公开内容的微生物。
在一些实施方案中，组合物可被配制用于在用抗微生物剂如抗生素治疗之前、期间和/或之后施用。例如，可在用抗生素治疗之前和/或之后至少约1小时、2小时、5小时、12小时、1天、3天、1周、2周、1个月、6个月或1年施用该制剂。可在用抗生素治疗之前和/或之后至多1小时、2小时、5小时、12小时、1天、3天、1周、2周、1个月、6个月或1年施用该制剂。
在一些实施方案中，所述组合物可被配制用于在用抗生素治疗之后施用。例如，可在整个抗生素治疗方案或疗程完成后施用该制剂。
在一些实施方案中，在受试者摄取食物之前、期间和/或之后施用制剂。在一些实施方案中，该制剂与受试者摄取食物一起施用。在一些实施方案中，与食物摄取一起(例如，同时)施用该制剂。
在一些实施方案中，在受试者摄取食物之前施用所述制剂。在一些实施方案中，该制剂在食物摄取之前施用时在治疗微生物状况方面更有效或更高效。例如，可在受试者摄取食物之前约1分钟、约2分钟、约3分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时或约1天施用该制剂。例如，可在受试者摄取食物之前至少约1分钟、约2分钟、约3分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时或约1天施用该制剂。例如，可在受试者摄取食物之前至多约1分钟、约2分钟、约3分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时或约1天施用该制剂。
在一些实施方案中，在受试者摄取食物之后施用所述制剂。在一些实施方案中，该制剂在摄取食物之后施用时在治疗微生物状况方面更有效或更高效。例如，可在受试者摄取食物之后至少约1分钟、2分钟、3分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、5小时、10小时、12小时或1天施用该制剂。例如，可在受试者摄取食物之后至多约1分钟、2分钟、3分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、5小时、10小时、12小时或1天施用该制剂。
本文提供的制剂可包括适合于以下给药途径的制剂：包括颊部和舌下给药的口服、鼻内、局部、经皮、透皮贴剂、经肺、阴道、直肠、栓剂、粘膜、全身给药，或包括肌肉内、动脉内、鞘内、皮内、腹膜内、皮下和静脉内给药的肠胃外给药，或作为适于通过雾化、吸入或吹入进行施用的形式。
组合物可包含载体和赋形剂(包括但不限于缓冲液、碳水化合物、脂质、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂)，金属(例如铁、钙)，盐，维生素，矿物质，水，油(包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)，盐溶液，右旋糖和甘油水溶液，调味剂，着色剂，防粘剂(detackifier)和其它可接受的添加剂、佐剂或粘合剂，达到近似的生理条件所需的其它药学上可接受的辅助物质，如pH缓冲剂、张度调节剂、乳化剂、湿润剂等。赋形剂的实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干燥脱脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
适用于本公开内容的药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括制粒剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、甜味剂、助流剂、抗粘剂、抗静电剂、表面活性剂、抗氧化剂、树胶、包衣剂、着色剂、调味剂、分散增强剂、崩解剂、包衣剂、增塑剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、植物纤维素材料和滚圆剂、填料、填充剂、润滑剂及其任意组合。
药学上可接受的赋形剂的非限制性实例可见于，例如，Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.编著,Pharmaceutical DosageForms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems,第七版(Lippincott Williams&Wilkins1999)，其中每一个均通过引用整体并入本文。
组合物可基本上不含防腐剂。在一些应用中，该组合物可含有至少一种防腐剂。
组合物可包封在合适的媒介物，例如脂质体、微球或微粒内。或者，可并入化合物，并植入微球或微球的复合物以供在从数天至数月的时间段内缓慢释放。
包封的混合物在1℃、2℃、3℃、4℃或5℃下冷藏至少约1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月或5个月时可以是稳定的。该混合物在4℃温度下可以稳定至少约1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、15个月、20个月或30个月。
所述组合物可以在分离并纯化的微生物的群体中包含至少约108个活性细胞/g的一种或多种微生物。该组合物可包含至少约1.0x 108个活性细胞/g。该组合物可包含至少约0.1％、1％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％或75％的量的活微生物。该组合物可包含至少1％至5％的量的活专性厌氧微生物。该组合物可包含至少5％至75％的量的活专性厌氧微生物。该组合物可包含至少10％至50％的量的活专性厌氧微生物。
可将组合物配制成无菌溶液或悬浮液。该治疗或美容组合物可通过常规技术进行灭菌或者可以过滤除菌。所得水溶液可按原样包装以供使用或冻干。可以将微生物组合物的冻干制剂包装成适于口服给药的形式，例如胶囊或丸剂。
所述组合物可以局部施用并且可被配制成多种可局部施用的组合物，如溶液、悬浮液、洗剂、凝胶、糊剂、药物棒、药膏、乳膏和软膏。这类组合物可以含有增溶剂、稳定剂、张度增强剂、缓冲液和防腐剂。
还可将所述组合物配制成直肠组合物，如灌肠剂、直肠凝胶、直肠泡沫、直肠气雾剂、栓剂、胶冻状栓剂或保留灌肠剂，该直肠组合物含有常规栓剂基质如可可脂或其它甘油酯，以及合成聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、PEG等。在栓剂形式的组合物中，可使用低熔点蜡，如任选与可可脂组合的脂肪酸甘油酯的混合物。
在实施本文提供的治疗方法或使用方法时，治疗有效量的本文所述的微生物组合物以组合物形式施用于具有待治疗的疾病或状况的受试者。在一些实施方案中，该受试者是哺乳动物，诸如人。治疗有效量可根据疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康、制剂的效力和其它因素而广泛变化。受试者可以是，例如人、老年人、成年人、青少年、青春期前儿童、儿童、幼儿、婴儿或新生儿。受试者可以是患者。受试者可以是加入临床研究的个体。受试者可以是实验室动物，例如哺乳动物或啮齿动物。
可利用包含赋形剂和助剂的一种或多种生理学上可接受的载体来配制组合物，该载体有助于将微生物加工成药学上可使用的制品。可根据所选择的给药途径来改进制剂。本文所述的组合物可以以常规方式制备，例如借助常规的混合、溶解、制粒、玻璃化、喷雾干燥、冻干、制锭、研磨、包封、包埋、乳化或压缩过程。
在一些实施方案中，例如通过喷雾干燥或冻干将所述组合物制备成干燥形式。在一些实施方案中，将所述制剂制备成液体胶囊以维持微生物的液体形式。
所述组合物可以长时间保持稳定。例如，该组合物可以在4摄氏度储存14天或更长时间后保持稳定(例如，保留治疗有效量的一种或多种分离并纯化的专性厌氧微生物)。或者，在一些情况下，当在室温下储存14天或更长时间时，该组合物可保持稳定。在各个实施方案中，该组合物可以稳定至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年、3年、4年或5年。在约4℃下储存时，该组合物可以稳定至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年、3年、4年或5年。在环境温度和压力(约20℃至约30℃，约1巴压力)下储存时，该组合物可保持稳定至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年、3年、4年或5年。
使用活/死细胞染色的流式细胞术(如图4所讨论的)可以允许对活细胞进行计数。可以在时间点0时对样品进行这种计数，然后将其与在不同条件(例如温度、氧气暴露、湿度等)下储存样品的后续时间点进行比较。
本文提供的组合物可在任何合适的温度下储存。所述制剂可冷藏储存，例如，储存在约-80℃、约-20℃、约-4℃或约4℃的温度下。储存温度可以是，例如约0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约12℃、约14℃、约16℃、约20℃、约22℃或约25℃。在一些实施方案中，储存温度为约2℃至约8℃。例如当存在于液体或凝胶制剂中时，微生物组合物在低温例如约2℃至约8℃下的储存可保持微生物存活并增加该组合物的有效性。用冷冻保护剂在低于0℃的冷冻温度下储存可进一步延长稳定性。
所述组合物的pH可在约3至约12的范围内。该组合物的pH可以是，例如约3至约4、约4至约5、约5至约6、约6至约7、约7至约8、约8至约9、约9至约10、约10至约11或约11至约12个pH单位。该组合物的pH可以是，例如约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12个pH单位。该组合物的pH可以是，例如至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11或至少12个pH单位。该组合物的pH可以是，例如至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11或至多12个pH单位。如果pH在配制者所期望的范围之外，则可使用足够的药学上可接受的酸和碱来调节pH。在一些实施方案中，该组合物的pH为约4至约6。
可施用含有本文所述微生物的组合物以用于预防性和/或治疗性处理。在治疗性应用中，可以以足以治愈或至少部分阻止疾病或状况的症状或者治愈、治疗、改善或缓解该状况的量将该组合物施用于已经患有该疾病或状况的受试者。也可施用微生物组合物以减小状况发展、感染或恶化的可能性。对于这种用途有效的量可基于疾病或状况的严重程度和病程，既往治疗，受试者的健康状态、体重和对药物的反应以及主治医师的判断而变化。
多种治疗剂可以以任意顺序施用或同时施用。如果同时施用，则可以以单一、统一的形式或以多种形式，例如作为多个独立的丸剂来提供多种治疗剂。所述组合物可以一起包装在一个包装中或独立地包装在多个包装中。可以以多个剂量来给予一种或全部治疗剂。如果并非同时施用，则多个剂量之间的时间可以变化长达约一个月。
可以在疾病或状况发生之前、期间或之后施用本文所述的组合物，并且施用该组合物的时机可以变化。例如，该微生物组合物可用作预防剂并且可连续施用于具有状况或疾病倾向的受试者，以便减少发生该疾病或状况的可能性。可在症状发作期间或发作之后尽可能快地将该微生物组合物施用于受试者。可在症状发作的前48小时内、症状发作的前24小时内、症状发作的前6小时内或症状发作的3小时内开始该微生物组合物的施用。可使用本文所述的任何制剂，经由任何实用的途径，如通过本文所述的任何途径进行初始施用。可在检测到或怀疑疾病或状况发作之后尽可能快地施用微生物组合物，并持续治疗该疾病所需的时间长度，例如约1个月至约3个月。治疗的长度可因每个受试者而异。
本公开内容的组合物可与另一种疗法联合施用，该疗法例如是免疫疗法、化疗、放疗、抗炎剂、抗病毒剂、抗微生物剂和抗真菌剂。
本公开内容的组合物可被包装成药盒。在一些实施方案中，药盒包含关于该组合物的施用/使用的书面说明书。该书面材料可以是，例如标签。该书面材料可建议施用的条件和方法。该说明书为受试者和主管医师提供关于从疗法的施用中获得最佳临床结果的最佳指导。该书面材料可以是标签。在一些实施方案中，该标签可由监管机构，例如美国食品和药品管理局(FDA)、欧洲药品管理局(EMA)或其它监管机构批准。
例如，所述组合物被配制用于通过pH依赖性释放递送、微生物触发的递送、时间控制的递送、渗透调节的递送、压力控制的递送、多基质系统递送、生物粘附递送或多微粒递送来施用。该组合物还可被配制用于在小肠或大肠、结肠、直肠、胃、肛门或食管中释放。
可以使用即时(just-in-time，JIT)工艺来制备本公开内容的组合物。即时制备或精益制备可以包括根据对组合物的需求的增加而制备组合物。在一些情况下，该组合物在施用于个体前1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、10小时、15小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月或4个月制备。
给药
待施用的治疗或美容组合物的合适的量、治疗次数和单位剂量可根据受试者和/或该受试者的疾病状态而变化。
本文所述的组合物可以是适合于单次施用精确剂量的单位剂型的形式。在单位剂型中，所述制剂可分为含有适量的一种或多种微生物组合物的单位剂量。该单位剂量可以是含有离散量的该制剂的包装的形式。非限制性实例为小瓶或安瓿中的液体。水性悬浮液组合物可以被包装在不可重新封闭的单剂量容器中。该组合物可以是多剂量的形式。可重新封闭的多剂量容器可以例如与防腐剂组合使用。用于肠胃外注射的制剂可呈现为单位剂型，例如，在安瓿或具有防腐剂的多剂量容器中。
所述剂型可以是固体、半固体或液体组合物的形式。适用于本发明的剂型的非限制性实例包括饲料、食品、丸粒、锭剂、液体、酏剂、气雾剂、吸入剂、喷雾剂、粉末、片剂、丸剂、胶囊、凝胶、凝胶片(geltab)、纳米悬浮液、纳米颗粒、微凝胶、栓剂锭、水性或油性悬浮液、软膏、贴剂、洗剂、洁齿剂、乳剂、乳膏、滴剂、可分散的粉末或颗粒、硬凝胶或软凝胶胶囊中的乳液、糖浆、植物性药剂(phytoceuticals)、保健品、膳食补充剂及其任意组合。
本文描述了含有高度浓缩的微生物的组合物和产生高度浓缩的微生物的方法。微生物的浓度可以是，例如，每个单位剂型约101至约1018个菌落形成单位(CFU)。微生物的浓度可以是，例如，每个单位剂型至少101、至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017或至少1018CFU。微生物的浓度可以是，例如，每个单位剂型至多101、至多102、至多103、至多104、至多105、至多106、至多107、至多108、至多109、至多1010、至多1011、至多1012、至多1013、至多1014、至多1015、至多1016、至多1017或至多1018CFU。一种或多种微生物可以以约108CFU至约1011CFU的量存在于单一单位剂型中。在一些实施方案中，单位剂型中存在的一种或多种微生物的量为至少约108CFU。在一些实施方案中，单位剂型中存在的微生物的量为至少约109CFU。
本文所述组合物的单位剂型可包含一种或多种高度浓缩的微生物。微生物的量可以是，例如，约106至约1011个微生物/克。微生物的浓度可以是，例如，至少101、至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017或至少1018个微生物/克。微生物的浓度可以是，例如，至多101、至多102、至多103、至多104、至多105、至多106、至多107、至多108、至多109、至多1010、至多1011、至多1012、至多1013、至多1014、至多1015、至多1016、至多1017或至多1018/克。
所述组合物的单位剂型可包含一种或多种高度浓缩的微生物，它们是活性细胞。活性细胞可以是活的微生物。单位剂型可包含约109至约1011个活性细胞/克。单位剂型可包含至少101、至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015、至少1016、至少1017或至少1018个活性细胞/克。单位剂型可包含至多101、至多102、至多103、至多104、至多105、至多106、至多107、至多108、至多109、至多1010、至多1011、至多1012、至多1013、至多1014、至多1015、至多1016、至多1017或至多1018/克。
本文公开的组合物可以以一个或多个剂量单位施用。包含一种或多种高度浓缩的微生物菌株的组合物可以以比施用包含非浓缩微生物的制剂所需的更少的单位剂型施用。以更高浓度和更少剂型施用组合物可以改善向受试者施用的容易性并增强治疗结果。作为非限制性实例，组合物可以在单次给药中以10个或更少的单位剂型施用。组合物可以在单次给药中以1个单位剂型至5个单位剂型施用。每次给药可以以单一单位剂型施用组合物。每次给药可以以两个或三个单位剂型施用组合物。
本文所述的组合物可被配制成具有任何合适的治疗有效浓度的益生元。例如，益生元的治疗有效浓度可以是至少约1mg/ml、约2mg/ml、约3mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约25mg/ml、约30mg/ml、约35mg/ml、约40mg/ml、约45mg/ml、约50mg/ml、约55mg/ml、约60mg/ml、约65mg/ml、约70mg/ml、约75mg/ml、约80mg/ml、约85mg/ml、约90mg/ml、约95mg/ml、约100mg/ml、约110mg/ml、约125mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml或约150mg/ml。例如，益生元的治疗有效浓度可以是至多约1mg/ml、约2mg/ml、约3mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约25mg/ml、约30mg/ml、约35mg/ml、约40mg/ml、约45mg/ml、约50mg/ml、约55mg/ml、约60mg/ml、约65mg/ml、约70mg/ml、约75mg/ml、约80mg/ml、约85mg/ml、约90mg/ml、约95mg/ml、约100mg/ml、约110mg/ml、约125mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml或约150mg/ml。例如，益生元的治疗有效浓度可以是约1mg/ml、约2mg/ml、约3mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约10mg/ml、约15mg/ml、约20mg/ml、约25mg/ml、约30mg/ml、约35mg/ml、约40mg/ml、约45mg/ml、约50mg/ml、约55mg/ml、约60mg/ml、约65mg/ml、约70mg/ml、约75mg/ml、约80mg/ml、约85mg/ml、约90mg/ml、约95mg/ml、约100mg/ml、约110mg/ml、约125mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml或约150mg/ml。在一些实施方案中，组合物中益生元的浓度为约70mg/ml。在一些实施方案中，该益生元为菊粉。
本公开内容的组合物可以每天施用例如1、2、3、4、5次或更多次。本公开内容的组合物可以例如每天、每隔一天、每周三次、每周两次、每周一次或以其它适当的间隔进行施用，以用于状况的治疗。
组合物可以每天施用，其中向受试者施用5个或更少的单位剂型。组合物可以每天施用两次，其中向受试者施用5个或更少的单位剂型。可以每天向受试者施用10、8、6、5、4、3或2个或更少的单位剂型。
丁酸的作用
短链脂肪酸(SCFA)如丁酸可在调节各种身体功能中发挥核心作用。例如，丁酸可以保护大脑并增强在神经系统疾病中的塑性。丁酸可以起到抗炎因子的作用。丁酸可影响肠通透性。低水平的产生丁酸的微生物(例如梭菌集群XIVa和IV)和/或减少的产生乳酸的细菌(例如青春双歧杆菌)可与例如肠生态失调、皮肤病症、代谢紊乱和行为/神经系统病症相关。包含至少一种初级发酵菌和至少一种次级发酵菌的制剂的子集可用于治疗和/或减缓病症或状况的进展。
在结肠中，膳食纤维可被产生丁酸的微生物加工，以产生作为SCFA的丁酸(即丁酸酯)。继而，丁酸可以启动G蛋白偶联受体(GPCR)信号传导，导致例如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)分泌。GLP-1可导致胰岛素敏感性增加。受试者中产生丁酸的微生物组的改变可以与病症相关。
在一些实施方案中，所述组合物包含具有丁酸激酶的微生物。丁酸激酶是可隶属于转移酶家族的酶，例如以羧基作为接受体转移含磷基团的酶(例如，磷酸转移酶)。该酶类别的系统名称可以是ATP:丁酸酯1-磷酸转移酶。丁酸激酶可参与丁酸代谢。丁酸激酶可催化以下反应：
在一些实施方案中，所述组合物包含具有丁酸辅酶A的微生物。丁酸辅酶A，亦即丁酰辅酶A，可以是丁酸的辅酶A活化形式。它可被丁酰辅酶A脱氢酶作用，并且可以是丙酮-丁醇-乙醇发酵中的中间化合物。丁酸辅酶A可参与丁酸代谢。
在一些实施方案中，所述组合物包含具有丁酸辅酶A转移酶的微生物。丁酸辅酶A转移酶，也被称为丁酸乙酰乙酸辅酶A转移酶，可隶属于例如辅酶A转移酶的转移酶家族。该酶类别的系统名称可以是丁酰辅酶A:乙酰乙酸辅酶A转移酶。其它常用名称可包括丁酰辅酶A-乙酰乙酸辅酶A转移酶和丁酰辅酶A-乙酰乙酸辅酶A转移酶。丁酸辅酶A转移酶可催化以下化学反应：
在一些实施方案中，所述组合物包含具有丁酰辅酶A脱氢酶的微生物。丁酰辅酶A脱氢酶可隶属于氧化还原酶家族，例如以其它接受体作用于供体的CH-CH基团的酶。该酶类别的系统名称可以是丁酰辅酶A:接受体2,3-氧化还原酶。其它常用名称可包括丁酰脱氢酶、不饱和酰基辅酶A还原酶、乙烯还原酶、烯酰辅酶A还原酶、不饱和酰基辅酶A还原酶、丁酰辅酶A脱氢酶、短链酰基CoA脱氢酶、短链酰基辅酶A脱氢酶、3-羟基酰基辅酶A还原酶和丁酰辅酶A:(接受体)2,3-氧化还原酶。丁酰辅酶A脱氢酶可参与的代谢途径的非限制性实例包括：脂肪酸代谢；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解；和丁酸酯代谢。丁酰辅酶A脱氢酶可使用一种辅因子——FAD。丁酰辅酶A脱氢酶可催化以下反应：
在一些实施方案中，所述组合物包含具有β-羟基丁酰辅酶A脱氢酶的微生物。β-羟基丁酰辅酶A脱氢酶或3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶可隶属于氧化还原酶家族，例如，以NAD+或NADP+为接受体作用于供体的CH-OH基团的酶。该酶类别的系统名称可以是(S)-3-羟基丁酰辅酶A:NADP+氧化还原酶。其它常用名称可包括β-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、L(+)-3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、BHBD、脱氢酶、L-3-羟基丁酰辅酶A(烟酰胺腺嘌呤、磷酸二核苷酸)、L-(+)-3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶。β-羟基丁酰辅酶A脱氢酶可经由共同连接参与苯甲酸酯降解。β-羟基丁酰辅酶A脱氢酶可参与丁酸酯代谢。β-羟基丁酰辅酶A脱氢酶可催化以下反应：
在一些实施方案中，所述组合物包含具有巴豆酸酶的微生物。巴豆酸酶可包括具有例如脱卤素酶、水合酶、异构酶活性的酶。巴豆酸酶可与碳-碳键形成、断裂和硫酯的水解有关。巴豆酸酶超家族中的酶可包括，例如，可催化2-反式-烯酰辅酶A水合成3-羟基酰基辅酶A的烯酰辅酶A水合酶；可将不饱和脂肪酸氧化中间体的3-双键转移到2-反式位置的3-2反式烯酰辅酶A异构酶或十二碳烯酰辅酶A异构酶(例如，EC 5.3.3.8)；可参与产生丁酸/丁醇的途径的3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(例如，巴豆酸酶；EC 4.2.1.55)；可催化4-氯苯甲酸辅酶A转化为4-羟基苯甲酸辅酶A的4-氯苯甲酰辅酶A脱卤素酶(例如，EC 3.8.1.6)；可催化3-反式,5-顺式-二烯酰辅酶A异构化为2-反式,4-反式-二烯酰辅酶A的二烯酰辅酶A异构酶；可参与甲萘醌(例如，维生素K2)的生物合成的萘甲酸合酶(例如，MenB或DHNA合成酶；EC4.1.3.36)；可在大肠杆菌(Escherichia coli)中催化巴豆甜菜碱可逆转化为L-肉碱的肉碱消旋酶(例如，基因caiD)；甲基丙二酰辅酶A脱羧酶(例如，MMCD；EC 4.1.1.41)；可参与碳青霉烯生物合成的羧甲基脯氨酸合酶(例如，CarB)；可催化双环β-二酮去对称化为旋光性酮酸的6-氧代樟脑水解酶；可催化脂肪酸β-氧化循环中最后三个反应的脂肪酸氧化复合物(多酶复合物)的α亚单位；以及可以是烯酰辅酶A水合酶的双功能RNA结合同源物的AUH蛋白。
在一些实施方案中，所述组合物包含具有硫解酶的微生物。硫解酶，也被称为乙酰辅酶A乙酰基转移酶(ACAT)，例如可在甲羟戊酸途径中将两个单位的乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A。硫解酶可包括，例如，降解型硫解酶(例如，EC 2.3.1.16)和生物合成型硫解酶(例如，EC 2.3.1.9)。3-酮脂酰辅酶A硫解酶，也被称为硫解酶I，可参与降解途径，如脂肪酸β-氧化。乙酰乙酰辅酶A硫解酶，也被称为硫解酶II，可对乙酰乙酰辅酶A的硫解具有特异性，并且可参与生物合成途径，如聚β-羟基丁酸合成或类固醇生物发生。硫解酶可催化以下反应：
丁酸的产生可涉及两个主要阶段或微生物，例如，初级发酵菌和次级发酵菌。当给予能量来源(例如纤维)时，初级发酵菌可产生中间分子(例如乳酸、乙酸)。次级发酵菌可将由初级发酵菌产生的中间分子转化为丁酸。初级发酵菌的非限制性实例包括Akkermansiamuciniphila、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌。次级发酵菌的非限制性实例包括拜氏梭菌、丁酸梭菌、吲哚梭菌、霍氏真杆菌和普氏粪杆菌。初级和次级发酵菌的组合可用来在受试者中产生丁酸。包含至少一种初级发酵菌和至少一种次级发酵菌的制剂的子集可用于治疗和/或减缓代谢健康状况的进展。该制剂可另外包含益生元。
在一些实施方案中，治疗组合物包含至少一种初级发酵菌和至少一种次级发酵菌。在一些实施方案中，治疗组合物包含至少一种初级发酵菌、至少一种次级发酵菌和至少一种益生元。在一个非限制性实例中，治疗组合物可包含青春双歧杆菌、吲哚梭菌和菊粉。在另一个非限制性实例中，治疗组合物可包含长双歧杆菌、普氏粪杆菌和淀粉。在一个非限制性实例中，治疗组合物可包含Akkermansia muciniphila、婴儿双歧杆菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、霍氏真杆菌和菊粉。在一个非限制性实例中，治疗组合物可包含拜氏梭菌、丁酸梭菌、婴儿双歧杆菌和菊粉。在一个非限制性实例中，治疗组合物可包含Akkermansiamuciniphila、拜氏梭菌、丁酸梭菌、霍氏真杆菌、婴儿双歧杆菌和菊粉。
SCFA相对于彼此的相对丰度的改变可导致病症。例如，改变的纤维至乙酸产生途径或乙酸至丁酸产生途径可导致诸如腹胀(bloating)等代谢紊乱。
Akkermansia muciniphila可以是可在粘蛋白降解中发挥作用的革兰氏阴性严格厌氧菌。Akkermansia muciniphila可以与控制炎症、肠屏障和肠肽分泌的内源性大麻素的水平升高有关。Akkermansia muciniphila可充当初级发酵菌。
青春双歧杆菌可以是革兰氏阳性厌氧菌，其可在婴儿期的健康人肠中发现。青春双歧杆菌可合成B族维生素。青春双歧杆菌可充当初级发酵菌。
婴儿双歧杆菌可以是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、微耐氧的厌氧菌。婴儿双歧杆菌可充当初级发酵菌。
长双歧杆菌可以是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、微耐氧的厌氧菌。长双歧杆菌可充当初级发酵菌。
拜氏梭菌可以是属于梭菌集群I的革兰氏阳性严格厌氧菌。拜氏梭菌可充当次级发酵菌。
丁酸梭菌可以是可充当次级发酵菌的革兰氏阳性严格厌氧菌。
吲哚梭菌可以是属于梭菌集群XIVA的革兰氏阳性严格厌氧菌。吲哚梭菌可充当次级发酵菌。
霍氏真杆菌可以是属于排列A梭菌集群XIVA的革兰氏阳性厌氧菌。霍氏真杆菌可充当次级发酵菌。
普氏粪杆菌可以是属于梭菌集群IV的革兰氏阳性厌氧菌。普氏粪杆菌可以是最常见的肠细菌和最高产的丁酸产生者之一。普氏粪杆菌可充当次级发酵菌。
参与丁酸生成的基因和/或蛋白质的非限制性实例包括：丁酰辅酶A脱氢酶、β-羟基丁酰辅酶A脱氢酶或3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、电子转移蛋白a、电子转移蛋白b和硫解酶。在一些实施方案中，所述组合物包含具有参与产生SCFA(例如丁酸)的基因或蛋白质的微生物。
图10示出了针对乙酸和丁酸这两种代谢物，在七种菌株中的SCFA的测量。可配制制剂以允许各种量的初级和次级发酵菌。图11使用具有火焰电离检测器的气相色谱法(GC/FID)将GC峰面积(a.u.)与微生物浓度(mM)相关联。事实上，至少约0.010mM、0.015mM、0.020mM、0.025mM、0.030mM、0.04mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.20mM、0.25mM、0.30mM、0.35mM或0.40mM的浓度可以可靠地测量。如图12所示，GC/FID(具有火焰电离检测器的气相色谱法)可以用来测量微生物细胞随时间的代谢活性，以监测短链脂肪酸的高通量产生。图12中的代谢活性测定(MAC测定)也可用来确定微生物细胞的代谢活性。这两种代谢物可以是乙酸和丁酸。该测定使用具有火焰电离检测器(FID)的气相色谱(GC)仪器以及设计用于检测各种短链脂肪酸的特定柱。
生物样品
可从受试者收集生物样品，以确定该受试者的微生物组谱。生物样品可以是来自受试者身体上的任何微生物生境的任何样品类型。微生物生境的非限制性实例包括皮肤生境、脐生境、阴道生境、羊水生境、结膜生境、肠内生境、胃生境、肠生境、口腔生境、鼻生境、胃肠道生境、呼吸道生境和泌尿生殖道生境。
根据应用，生物样品的选择可针对具体应用予以调整。生物样品可以是，例如，全血、血清、血浆、粘膜、唾液、颊拭子、尿、粪便、细胞、组织、体液、淋巴液、CNS液和病灶渗出物。本公开内容的方法可使用生物样品的组合。
制剂和微生物组中的微生物的表征
微生物可以在制剂中表征并确认用于施用至宿主。对宿主微生物组进行测序可用来开发针对个体的制剂。可对从生物样品制备的核酸样品实施检测方法，以生成与该样品相关的微生物组谱。微生物组的谱分析可包括一种或多种检测方法。
本公开内容的方法可用来测量，例如，16S核糖体亚单位、23S核糖体亚单位、基因间区和其它遗传元件。可选择合适的检测方法以在特定的微生物中提供足够的辨别力，以便鉴定含信息的微生物组谱。
在一些应用中，对微生物的16S或23S核糖体亚单位的整个基因组区域进行分析以确定受试者的微生物组谱。在一些应用中，对微生物的16S和/或23S核糖体亚单位的可变区进行分析以确定受试者的微生物组谱。
在一些应用中，对微生物的整个基因组进行分析以确定受试者的微生物组谱。在其它应用中，对微生物基因组的可变区进行分析以确定受试者的微生物组谱。例如，基因组中的遗传变异可包括限制性片段长度多态性、单核苷酸多态性、插入、缺失、插入缺失(插入-缺失)、微卫星重复、小卫星重复、短串联重复、转座元件、随机扩增多态性DNA、扩增片段长度多态性或其组合。
在一些实施方案中，使用诸如长读长单分子测序等测序方法进行检测。长读测序可在低至每种微生物的菌株分辨率水平上提供微生物分类。本公开内容可用于实现长读长的测序技术的实例包括，来自Pacific Biosciences的SMRT测序系统、长读长Sanger测序、长读总体测序方法，例如，Illumina/Moleculo测序和潜在的其它单分子测序方法，如Nanopore测序技术。
长读测序可包括提供例如长于500个碱基、长于800个碱基、长于1000个碱基、长于1500个碱基、长于2000个碱基、长于3000个碱基或长于4500个碱基的连续序列读取的测序。
在一些实施方案中，本公开内容的检测方法包括用来对微生物组进行谱分析的扩增模式测序。在一些实施方案中，本公开内容的检测方法包括用来对微生物组进行谱分析的非扩增模式，例如全基因组鸟枪法(Whole Genome Shotgun，WGS)测序。
可通过任何合适的方法，例如克隆合适的序列和直接化学合成来制备本公开内容中使用的引物。引物还可从商业来源获得。此外，可利用计算机程序设计引物。引物可包含独特的条形码标识符。
微生物组谱分析可进一步包括使用例如核酸微阵列、生物芯片、蛋白质微阵列、分析蛋白质微阵列、反相蛋白质微阵列(RPA)、数字PCR装置和/或小液滴数字PCR装置。
在一些情况下，对来自组合物中至少两种微生物或来自个体的肠微生物组样品的至少一种靶核酸进行测序。该测序可以确定该组合物中或来自肠微生物组样品的至少两种微生物的量。靶核酸可以是DNA或RNA。靶核酸可以是物种特异性标志物。物种特异性标志物可以是含系统发生信息的标志物。含系统发生信息的标志物的实例包括但不限于5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA、内部转录间隔区(ITS)、细胞色素氧化酶I(COI)、细胞色素氧化酶II(COII)和细胞色素b。在一些情况下，条形码可以附接至靶核酸或包含靶核酸的核酸。条形码可以在扩增之前附接。在一些情况下，在测序之后，使用算法来校正由扩增引入的错误。用来校正由扩增引入的错误的算法的实例包括但不限于DADA2。测序可用来确定来自个体的肠微生物组样品中的微生物种。测序可用来确定组合物或来自个体的肠微生物组样品中的至少两种微生物的量。向靶核酸或包含靶核酸的核酸添加条形码与使用算法来校正由扩增引入的错误相组合可以减少检测到的至少两种微生物的量的偏差。
在一些情况下，使用人肠微生物生态系统模拟器(SHIME)。SHIME可用来：a)检测组合物对个体中存在的肠微生物组的影响，b)检测组合物中的微生物在新环境中或在特定条件下的存活率，c)检测特定条件下目标代谢物的产生，d)检测胆汁酸或其它宿主特异性代谢物对细菌组成的影响，以及e)通过操纵SHIME系统富集某些微生物。所测试的具体条件可包括pH的变化以及与组合物共同施用的益生元的变化。可以使用稳定的同位素探针来测定SHIME中至少一种微生物的代谢活性。
在一些实施方案中，使用另外的信息如年龄、体重、性别、医疗史、危险因素、家族史或任何其它临床相关信息来确定微生物谱。
在一些应用中，受试者的微生物组谱包含单一微生物组。例如，受试者的微生物组谱可由仅来自受试者的肠内微生物组的至少一种生物样品组成。在另一实例中，受试者的微生物组谱可由仅来自受试者的胃微生物组的至少一种生物样品组成。在另一实例中，受试者的微生物组谱可由仅来自受试者的肠微生物组的至少一种生物样品组成。在另一实例中，受试者的微生物组谱可由仅来自受试者的口腔微生物组的至少一种生物样品组成。
在一些应用中，受试者的微生物组谱包含来自超过一种微生物组的至少一种生物样品。例如，受试者的微生物组谱可由来自受试者的皮肤微生物组的至少一种生物样品和来自脐微生物组的至少一种生物样品组成。在另一实例中，受试者的微生物组谱可由来自受试者的肠内微生物组的至少一种生物样品、来自胃微生物组的至少一种生物样品、来自肠微生物组的至少一种生物样品和来自口腔微生物组的至少一种生物样品组成。在另一实例中，受试者的微生物组谱可由来自受试者的肠内微生物组的至少一种生物样品和来自胃微生物组的至少一种生物样品组成。在另一实例中，受试者的微生物组谱可由来自受试者的肠微生物组的至少一种生物样品和来自口腔微生物组的至少一种生物样品组成。在一些应用中，受试者的微生物组谱可由至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种微生物组组成。
受试者的微生物组谱可由一种微生物组成。在一些应用中，受试者的微生物组谱由例如2种微生物、3种或更少的微生物、4种或更少的微生物、5种或更少的微生物、6种或更少的微生物、7种或更少的微生物、8种或更少的微生物、9种或更少的微生物、10种或更少的微生物、11种或更少的微生物、不多于12种微生物、13种或更少的微生物、14种或更少的微生物、15种或更少的微生物、16种或更少的微生物、18种或更少的微生物、19种或更少的微生物、20种或更少的微生物、25种或更少的微生物、30种或更少的微生物、35种或更少的微生物、40种或更少的微生物、45种或更少的微生物、50种或更少的微生物、55种或更少的微生物、60种或更少的微生物、65种或更少的微生物、70种或更少的微生物、75种或更少的微生物、80种或更少的微生物、85种或更少的微生物、90种或更少的微生物、100种或更少的微生物、200种或更少的微生物、300种或更少的微生物、400种或更少的微生物、500种或更少的微生物、600种或更少的微生物、700种或更少的微生物或者800种或更少的微生物组成。
在一些实施方案中，提供了用来治疗微生物组相关的健康状况和疾病的治疗组合物，可以对该状况和疾病使用微生物组治疗剂和诊断剂。这些健康状况可包括：早产、慢性疲劳综合征、皮肤健康(例如痤疮)、2型糖尿病(T2DM)、变态反应、抑郁症、自闭症、哮喘、高血压、肠易激综合征和/或与之相关的疼痛、代谢、肥胖、药物代谢、阴道病、特应性皮炎、银屑病、I型糖尿病(T1DM)、多发性硬化、艰难梭菌感染、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、泌尿生殖系统病症和心脏病。
所述组合物可以包含纯化的微生物群体，该群体由与选自下组的微生物的16SrRNA和/或23S rRNA具有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的细菌组成：Akkermansiamuciniphila、Anaerostipes caccae、青春双歧杆菌、双歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、溶纤维丁酸弧菌、丙酮丁醇梭菌、嗜胺梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、鹌鹑梭菌、球形梭菌、吲哚梭菌、系结梭菌、园环梭菌、丙酸梭菌、解木素梭菌、屎肠球菌、霍氏真杆菌、直肠真杆菌、普氏粪杆菌、产琥珀酸丝状杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、高加索乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳乳杆菌、植物乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、吉氏颤螺菌、Roseburia cecicola、Roseburia inulinivorans、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、卵瘤胃球菌、Stenotrophomonas nitritireducens、酪链球菌、屎链球菌、婴儿链球菌、变异链球菌、嗜热链球菌、Anaerofustis stercorihominis、Anaerostipes hadrus、Anaerotruncus colihominis、生孢梭菌、破伤风梭菌、粪球菌属、规则粪球菌、柱状真杆菌、长真杆菌、凸腹真杆菌、Roseburia faeccis、Roseburia hominis、Roseburiaintestinalis、两杈乳杆菌、约氏乳杆菌、乳杆菌、发酵氨基酸球菌、肠氨基酸球菌、Blautiahydrogenotrophica、无丙二酸柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、氨基丁酸梭菌、Clostridiumbartlettii、匙形梭菌、克氏梭菌、泥渣梭菌、坏名梭菌、巴氏梭菌、Clostridiumpeptidivorans、糖丁酸梭菌、球孢梭菌、斯氏梭菌、近端梭菌、共生梭菌、假破伤风梭菌、氧化还原真杆菌、Eubacterium pyruvativorans、史氏甲烷短杆菌、摩氏摩根氏菌、不解糖嗜胨菌和消化链球菌属，及其任意组合。
在一些实施方案中，提供了包含分离和/或纯化的微生物群体的治疗组合物，该群体由与选自下组的微生物的16SrRNA和/或23S rRNA具有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的细菌组成：Akkermansia muciniphila、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、吲哚梭菌、霍氏真杆菌，及其任意组合。
在一些实施方案中，提供了包含分离和/或纯化的微生物群体的治疗组合物，该群体由与选自下组的微生物的16SrRNA和/或23S rRNA具有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的细菌组成：Akkermansia muciniphila、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、吲哚梭菌、霍氏真杆菌、普氏粪杆菌，及其任意组合。
在一些实施方案中，提供了包含分离和/或纯化的微生物群体的治疗组合物，该群体由与选自下组的微生物的16SrRNA和/或23S rRNA具有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的细菌组成：Akkermansia muciniphila、婴儿双歧杆菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、霍氏真杆菌，及其任意组合。
在一些实施方案中，提供了包含分离和/或纯化的微生物群体的治疗组合物，该群体由与选自下组的微生物的16SrRNA和/或23S rRNA具有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的细菌组成：拜氏梭菌、丁酸梭菌、婴儿双歧杆菌，及其任意组合。
在一些实施方案中，提供了包含分离和/或纯化的微生物群体的治疗组合物，该群体由与选自下组的微生物的16SrRNA和/或23S rRNA具有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的细菌组成：普氏粪杆菌、拜氏梭菌、双歧双歧杆菌和短乳杆菌，及其任意组合。
在一些实施方案中，提供了包含分离和/或纯化的微生物群体的治疗组合物，该群体由与选自下组的微生物的16SrRNA和/或23S rRNA具有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的细菌组成：吲哚梭菌、长双歧杆菌和Akkermansia muciniphila。
在一些实施方案中，提供了包含分离和/或纯化的微生物群体的治疗组合物，该群体由与选自下组的微生物的16SrRNA和/或23S rRNA具有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的细菌组成：Akkermansia muciniphila、婴儿双歧杆菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌和霍氏真杆菌，及其任意组合。
在一些实施方案中，提供了包含分离和/或纯化的微生物群体的治疗组合物，该群体由与选自下组的微生物的16SrRNA和/或23S rRNA具有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列同一性的细菌组成：Akkermansia muciniphila、拜氏梭菌、丁酸梭菌、霍氏真杆菌、婴儿双歧杆菌，及其任意组合。
所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自Akkermansia muciniphila的rRNA序列有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的序列同一性。
所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自青春双歧杆菌的rRNA序列有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的序列同一性。
所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自婴儿双歧杆菌的rRNA序列有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的序列同一性。
所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自长双歧杆菌的rRNA序列有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的序列同一性。
所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自拜氏梭菌的rRNA序列有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的序列同一性。
所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自丁酸梭菌的rRNA序列有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的序列同一性。
所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自吲哚梭菌的rRNA序列有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的序列同一性。
所述群体可以包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自霍氏真杆菌的rRNA序列有至少约70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的序列同一性。
用于确定微生物生境成员的方法
本公开内容提供了包含用于治疗受试者中微生物组相关健康状况和/或病症的微生物群体的方法和组合物。本公开内容的方法可包括微生物收集、稳定化和提取以用于微生物组分析。本公开内容的方法可包括确定宿主的微生物生境的组成，以生成微生物组谱。微生物生境的组成可用来诊断宿主的健康状况，例如，用来确定病症的可能性和/或病症的疗程。
在一些实施方案中，本公开内容的方法可用来确定受试者的肠或胃肠道的微生物生境。肠包含复杂的微生物组，该微生物组包括可促进维生素产生和吸收、蛋白质和胆汁酸的代谢、膳食碳水化合物的发酵以及病原体过度生长的预防的多种微生物种。肠内微生物的组成可与受试者中的功能性代谢途径相关联。与肠微生物群相关联的代谢途径的非限制性实例包括能量平衡调节、瘦素分泌、脂质合成、肝胰岛素敏感性、肠内环境的调节和食欲信号传导。肠微生物组的改变可增加诸如溃疡性结肠炎、结直肠癌、自身免疫性病症、肥胖、糖尿病和炎性肠病等健康状况的风险。
在一些实施方案中，检测方法(例如测序)可用来鉴定与例如肥胖和肥胖诱发的糖尿病相关的肠微生物组生物标志物。例如，可根据其微生物组中存在的微生物种的差异，对非肥胖和肥胖受试者进行分类。与非肥胖受试者相比，肥胖受试者可具有降低的微生物多样性和更高水平的引起发酵的微生物，例如拟杆菌门和产甲烷古菌。患有肥胖诱发的糖尿病的受试者可具有促进质量增加、代谢性内毒素血症、脂肪组织炎症和胰岛素抵抗的微生物群。肥胖和消瘦受试者之间的微生物差异可用来生成与肥胖相关的、可用来预测风险因素和/或疗程的微生物生物标志物谱。
在一些实施方案中，本公开内容的检测方法(例如，测序)可用来分析例如在抗生素治疗、肠微生物组疗法和各种饮食期间，肠微生物组组成随时间的变化。在暴露于消除天然微生物群体的抗生素和饮食后，微生物组可显著改变。本公开内容的方法可用来在施用治疗剂之前和之后生成受试者的谱，以表征微生物群的差异。
在一些实施方案中，提供了基于测序标记使微生物组可视化的方法。在一些实施方案中，提供了基于测序信息随时间推移使微生物组可视化的方法。
本公开内容的方法可用来检测、表征和量化孕妇羊水的微生物生境。与足月分娩的孕妇相比，经历早产的孕妇的羊膜腔可携带来自更多样化的微生物(包括先前未表征的微生物)的遗传物质。微生物生境可用来定义侵入羊膜腔的微生物的多样性和丰度，以便评价早产的临床意义和因果关系。可以比较足月分娩妇女和早产妇女的羊水的微生物组谱，以确定可用作预测和/或治疗早产的生物标志物的微生物。
微生物可通过母乳中的母体单个核细胞从母亲转移到婴儿，这可以引发发育中的婴儿的免疫系统，以对共生和致病细菌产生适当的响应。本公开内容的方法可用来确定婴儿的肠微生物生境，以生成微生物定植模式以及微生物对婴儿期和幼儿期免疫力发育的影响。
本公开内容的方法可用来分析皮肤的微生物生境。皮肤的部分，包括皮肤凹陷和附属物、汗腺(外分泌和顶分泌)、皮脂腺和毛囊，可各自与独特的微生物群相关。比较健康受试者和患有例如痤疮的受试者的皮肤微生物组谱，可提供对于微生物参与皮肤健康和疾病的了解。
可以为受试者定制制剂。可以将组合物配制成包含基于宿主微生物组选择的分离并纯化的微生物组群体。定制制剂可包含，例如，益生元、益生菌、抗生素或本文所述的活性剂的组合。包含例如年龄、性别和体重的受试者特异性数据可与分析结果组合，以提供为该受试者定制的治疗剂。例如，对于相对于年龄和性别匹配的健康受试者亚群发现特定微生物含量低的受试者的微生物组，可以向其中提供包含该特定微生物的治疗和/或美容制剂，以匹配同该受试者具有相同年龄和性别的健康受试者亚群的微生物组。
动物健康
动物的营养需求可以通过补充限制营养物来实现。可能有至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或300种细菌菌株占据动物和人的胃肠道。这些细菌可产生危险且有毒的废物，该废物可导致腹胀和胀气、便秘、溃疡、腹泻和有益细菌。有益细菌可通过其原生微生物区系对动物的健康产生积极影响。益生菌可能有助于促进肠中特定菌株的存在，并阻止不太理想的菌株。由于肠细菌可能对营养物有特定需求，因此提供这些营养物可能会导致肠细菌的生长。
计算机系统
本公开内容还提供了被配置为实现本公开内容的方法的计算机系统。该系统可包括被编程为实现本文所述方法的计算机服务器(“服务器”)。图13描绘了适合于让用户能够检测、分析并处理数据(例如测序数据；菌株分类、功能性途径、表观遗传变化、患者信息、外部数据、数据库、微生物组菌株；治疗群组等)的系统900。系统900包括被编程为实现本文所述的示例性方法的中央计算机服务器901。服务器901包括中央处理单元(CPU，也称为“处理器”)905，其可以是单核处理器、多核处理器，或用于并行处理的多个处理器，或云处理器。服务器901还包括存储器910(例如随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)；电子存储单元915(例如，硬盘)；用于与一个或多个其它系统进行通信的通信接口920(例如，网络适配器)；以及外围设备925，其可包括高速缓冲存储器、其它存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器910、存储单元915、接口920和外围设备925通过通信总线(实线)如主板与处理器1005进行通信。存储单元1015可以是用于存储数据的数据存储单元。服务器901在通信接口920的帮助下可操作地耦合至计算机网络(“网络”)930。网络930可以是因特网、内联网和/或外联网、与因特网进行通信的内联网和/或外联网、电信或数据网络。在一些情况下，网络930在服务器901的帮助下可以实现对等网络，这可以使耦合至服务器901的设备能够作为客户端或服务器发挥作用。外围设备可包括，例如定序器925或远程计算机系统940。
存储单元915可存储文件(例如与本公开内容相关的数据的任何方面)。在一些情况下，使用云存储。云存储可以是将数字数据存储在逻辑池中的数据存储模型，其中物理存储可跨越多个服务器，并且在一些情况下可跨越一个或多个位置。在一些实施方案中，该物理环境由托管公司拥有并管理。例如，可通过共址云计算服务、网络服务应用程序编程接口(API)或通过利用API的应用程序，如云桌面存储、云存储网关或基于网络的内容管理系统来访问云存储服务。
服务器可通过网络930与一个或多个远程计算机系统进行通信。所述一个或多个远程计算机系统可以是，例如，个人计算机、膝上型计算机、平板计算机、电话、智能电话或个人数字助理。
在一些情况下，系统900包括一台服务器901。在其它情况下，该系统包括多个服务器，它们通过内联网、外联网和/或因特网彼此通信。
服务器901可适配为存储信息。这样的信息可以存储在存储单元915或服务器901上，并且这样的数据可以通过网络进行传输。
如本文所述的方法可通过存储在服务器901的电子存储位置上，例如，存储在存储器910或电子存储单元915上的机器(例如，计算机处理器)计算机可读介质(或软件)来实现。在使用期间，其代码可由处理器905来执行。在一些情况下，其代码可从存储单元915中检索到并存储在存储器910上，以备处理器905访问。在一些情况下，可排除电子存储单元915，而将机器可执行指令存储在存储器910上。或者，可以在第二计算机系统940上执行代码。
本文提供的系统和方法的方面，如服务器901，可在编程中具体体现。该技术的各个方面可被看作“产品”或“制品”，其通常为在某种类型的机器可读介质(例如，计算机可读介质)中携带或具体体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式。机器可执行代码可存储在电子存储单元如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”类型介质可包括计算机、处理器等的任何或全部的有形存储器或其相关的模块，如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可在任何时间提供非临时存储用于软件编程。全部或部分软件可不时地通过因特网或各种其它电信网络进行通信。例如，这样的通信可以使得软件能够从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器，例如从管理服务器或主机加载至应用服务器的计算机平台中。因此，另一种类型的可承载软件元素的介质包括光波、电波和电磁波，如跨越本地设备之间的物理接口使用的，通过有线和光学陆上线路网络以及通过各种空中链路使用的。携带此类波的物理元素，如有线或无线链路、光学链路等，也可被认为是承载软件的介质。如本文所用的，除非局限于非暂时性有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，机器可读介质，如计算机可执行代码，可采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质可包括，例如光盘或磁盘，如任何计算机中的任何存储设备等，以便可用来实现该系统。有形传输介质可包括：同轴电缆、铜线和光纤(包括构成计算机系统内的总线的导线)。载波传输介质可采取电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信过程中生成的那些电信号或电磁信号或者声波或光波。因此，计算机可读介质的常见形式包括，例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其它磁性介质、CD-ROM、DVD、DVD-ROM、任何其它光学介质、穿孔卡片、纸带、任何其它具有孔洞图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其它存储器芯片或匣盒、传送数据或指令的载波、电缆，或传送这样的载波的链路，或计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其它介质。这些形式的计算机可读介质中的许多形式可参与将一个或多个指令的一个或多个序列载送到处理器以供执行。
实施例
实施例1：高度浓缩的菌株的生长
图2示出了Akkermansia muciniphila在植物浸液中的成功GMP生长随时间的最佳密度测量。例如，通过光密度测量所确定的，与不存在植物浸液时的微生物生长相比，植物浸液可以使微生物的生长随时间推移增加至少约5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在一些情况下，与不存在植物浸液时的微生物生长相比，植物浸液可以使微生物的生长增加至少10倍。蔬菜浸液可包含一种或多种糖，如氨基糖和/或己糖(例如右旋糖)；盐；蛋白质和/或氨基酸来源(例如植物蛋白质；蛋白胨)；缓冲液；维生素；还原剂(例如L-半胱氨酸)；和消泡剂。
实施例2：冻干成稳定的粉末
在图9A中，比较了在冻干之前和之后长双歧杆菌在96孔板中的活细菌细胞计数。此外，在图9A中，可以在将循环阈值(Ct)相对于微生物稀释度进行作图时开发标准。该标准可用来基于微生物培养物的光密度确定细胞计数。
实施例3：在室温和4摄氏度下的菌株稳定性
在图4中示出了如通过对在不同温度条件下储存30天的冻干分离并纯化的微生物的组合物中的总活性细胞进行计数而确定的，分离并纯化的菌株的冻干组合物的稳定性。菌株1、菌株2和菌株3均为专性厌氧菌。菌株1、菌株2和菌株3在4摄氏度和室温下储存。当在室温或4摄氏度下储存时，如总活性细胞计数所示，菌株1保持稳定30天。当在4摄氏度或室温下储存时，菌株3保持稳定。确定菌株2在4摄氏度下储存时比在室温下储存时具有更高的稳定性。
图5A示出了如通过随时间测量活性细胞/g所确定的，冻干的专性厌氧微生物的包封制剂的稳定性。图5B示出了当在4摄氏度下储存时，制剂随时间的稳定性(活性细胞数)。
虽然本文已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员现将想到许多更改、改变和替换，而不会偏离本发明。应当理解，在实施本发明时可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。旨在用以下权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (65)

1.一种用于向有需要的受试者施用的组合物，其包含：
一种或多种分离并纯化的微生物的群体，其包含一种或多种专性厌氧微生物，
其中如通过在第一时间使用流式细胞术测量活微生物或活性细胞的第一细胞计数并在第二时间使用流式细胞术测量活微生物或活性细胞的第二细胞计数所确定的，所述组合物在4摄氏度的温度或室温下储存2周或更长时间时保持稳定，
其中所述第一时间和所述第二时间间隔2周或更长时间，并且
进一步其中所述第二细胞计数是所述第一细胞计数的至少0.1％。
2.一种用于向有需要的受试者施用的组合物，其包含：
一种或多种分离并纯化的微生物的群体，所述群体包含一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物，使得当在4摄氏度或室温下储存14天的时间时，所述一种或多种专性厌氧微生物中的至少0.1％是活微生物或活性细胞，其中所述群体是基本上干燥的并且包含约5％或更少的残余水分。
3.一种用于向有需要的受试者施用的组合物，其包含一种或多种分离并纯化的微生物的群体，其中所述组合物包含以下性质：
a)至少1.0x 108个活性细胞/g，以及
b)所述组合物包含不超过5.0mcg/g的砷、不超过3.3mcg/g的铅、不超过5.0mcg/g的汞和不超过1.6mcg/g的镉。
4.一种用于向有需要的受试者施用的组合物，其包含一种或多种分离并纯化的微生物的群体，其中所述组合物包含以下性质：
a)约8.2x 109个活性细胞/g，以及
b)所述组合物包含不超过约0.02mcg/g的砷、不超过约0.2mcg/g的铅、不超过约0.01mcg/g的汞和不超过约0.12mcg/g的镉。
5.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述一种或多种专性厌氧微生物中的至少1％是活细胞或活性细胞。
6.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物被包封并且所述一种或多种专性厌氧微生物中的至少20％是活细胞或活性细胞。
7.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述一种或多种专性厌氧微生物中的5％至75％是活微生物或活性细胞。
8.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述一种或多种专性厌氧微生物中的10％至50％是活微生物或活性细胞。
9.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物在所述群体中包含至少108个活性细胞/g的量的一种或多种微生物。
10.根据权利要求1或2所述的组合物，其中室温为20至25摄氏度。
11.根据权利要求1或2所述的组合物，其中室温为20摄氏度。
12.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物的颜色为米色至深棕褐色。
13.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物的颜色为棕褐色。
14.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物是粉末。
15.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物在高于5μM的氧气下存活。
16.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物在包含20体积％或更多氧气的条件下存活。
17.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物中的至少一种能够在具有5μM或更少溶解氧的条件下生长。
18.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含90％或更多的未形成孢子的专性厌氧微生物。
19.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述群体的活性细胞包含3种或更多种分离并纯化的微生物，所述微生物选自：Akkermansia muciniphila、Anaerostipescaccae、青春双歧杆菌、双歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、溶纤维丁酸弧菌、丙酮丁醇梭菌、嗜胺梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、鹌鹑梭菌、球形梭菌、吲哚梭菌、系结梭菌、园环梭菌、丙酸梭菌、解木素梭菌、屎肠球菌、霍氏真杆菌、直肠真杆菌、普氏粪杆菌、产琥珀酸丝状杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、高加索乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳乳杆菌、植物乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、吉氏颤螺菌、Roseburiacecicola、Roseburia inulinivorans、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、卵瘤胃球菌、Stenotrophomonas nitritireducens、酪链球菌、屎链球菌、婴儿链球菌、变异链球菌、嗜热链球菌、Anaerofustis stercorihominis、Anaerostipes hadrus、Anaerotruncuscolihominis、生孢梭菌、破伤风梭菌、粪球菌属、规则粪球菌、柱状真杆菌、长真杆菌、凸腹真杆菌、Roseburia faeccis、Roseburia hominis、Roseburia intestinalis、两杈乳杆菌、约氏乳杆菌、乳杆菌、发酵氨基酸球菌、肠氨基酸球菌、Blautia hydrogenotrophica、无丙二酸柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、氨基丁酸梭菌、Clostridium bartlettii、匙形梭菌、克氏梭菌、泥渣梭菌、坏名梭菌、巴氏梭菌、Clostridium peptidivorans、糖丁酸梭菌、球孢梭菌、斯氏梭菌、近端梭菌、共生梭菌、假破伤风梭菌、氧化还原真杆菌、Eubacteriumpyruvativorans、史氏甲烷短杆菌、摩氏摩根氏菌、不解糖嗜胨菌和消化链球菌属，及其任意组合。
20.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述群体包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自Akkermansia muciniphila的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。
21.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述群体包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自青春双歧杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。
22.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述群体包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自婴儿双歧杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。
23.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述群体包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自长双歧杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。
24.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述群体包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自拜氏梭菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。
25.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述群体包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自丁酸梭菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。
26.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述群体包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自吲哚梭菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。
27.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述群体包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自霍氏真杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。
28.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述群体包含分离并纯化的微生物，该微生物具有的核糖体RNA(rRNA)序列与来自普氏粪杆菌的rRNA序列有至少约85％的序列同一性。
29.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述群体包含至少一种来自Akkermansia属的微生物和至少一种来自选自真杆菌属、梭菌属、双歧杆菌属和粪杆菌属的属的微生物。
30.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述微生物群体包含至少两种各来自疣微菌门和放线菌门的分离并纯化的微生物。
31.根据权利要求20-28中任一项所述的组合物，其中所述群体进一步包含第二微生物，该第二微生物选自：Akkermansia muciniphila、Anaerostipes caccae、青春双歧杆菌、双歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、溶纤维丁酸弧菌、丙酮丁醇梭菌、嗜胺梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、鹌鹑梭菌、球形梭菌、吲哚梭菌、系结梭菌、园环梭菌、丙酸梭菌、解木素梭菌、屎肠球菌、霍氏真杆菌、直肠真杆菌、普氏粪杆菌、产琥珀酸丝状杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、高加索乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳乳杆菌、植物乳杆菌、路氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、吉氏颤螺菌、Roseburia cecicola、Roseburiainulinivorans、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、卵瘤胃球菌、Stenotrophomonasnitritireducens、酪链球菌、屎链球菌、婴儿链球菌、变异链球菌、嗜热链球菌、Anaerofustis stercorihominis、Anaerostipes hadrus、Anaerotruncus colihominis、生孢梭菌、破伤风梭菌、粪球菌属、规则粪球菌、柱状真杆菌、长真杆菌、凸腹真杆菌、Roseburia faeccis、Roseburia hominis、Roseburia intestinalis、两杈乳杆菌、约氏乳杆菌、乳杆菌、发酵氨基酸球菌、肠氨基酸球菌、Blautia hydrogenotrophica、无丙二酸柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、氨基丁酸梭菌、Clostridium bartlettii、匙形梭菌、克氏梭菌、泥渣梭菌、坏名梭菌、巴氏梭菌、Clostridium peptidivorans、糖丁酸梭菌、球孢梭菌、斯氏梭菌、近端梭菌、共生梭菌、假破伤风梭菌、氧化还原真杆菌、Eubacteriumpyruvativorans、史氏甲烷短杆菌、摩氏摩根氏菌、不解糖嗜胨菌和消化链球菌属，及其任意组合。
32.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其进一步包含益生元。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述益生元包括菊粉。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述菊粉以至少约50mg/ml的量存在。
35.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含菊粉、蔗糖、海藻糖、甘油、麦芽糖糊精和羟丙基甲基纤维素。
36.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于口服递送。
37.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物是栓剂。
38.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物是片剂。
39.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述组合物是胶囊。
40.根据权利要求38或39所述的组合物，其进一步包含一个或多个肠溶衣。
41.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述组合物被配置用于递送至所述受试者的小肠、大肠、回肠或其组合。
42.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述胶囊在所述受试者的小肠或大肠之前基本上不释放所述分离并纯化的微生物的群体。
43.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
44.一种获得根据权利要求1-43中任一项所述的组合物的方法，其包括：
(a)在培养基中培养所述一种或多种分离并纯化的微生物的群体，所述群体包含一种或多种专性厌氧微生物；
(b)冻干所述群体，从而产生所述一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物。
45.根据权利要求44所述的方法，其进一步包括包封所述群体。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述产生的一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物用冷冻保护剂冻干，该冷冻保护剂选自：甘油、海藻糖、蔗糖、菊粉、水、植物介质、脱脂乳、葡聚糖、谷氨酸、组氨酸、甘露醇及其任意组合。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含10％甘油。
48.根据权利要求44所述的方法，其中所述冻干一种或多种氧稳定的专性厌氧微生物产生干粉。
49.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含有效量的右旋糖。
50.根据权利要求44-49所述的方法，其中所述培养基进一步包含有效量的盐。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述盐选自：氯化铵、氯化钙、二水合氯化钙、六水合氯化钙、十水合氯化钙、硝酸铁、一水合硫酸镁、五水合硫酸镁、七水合硫酸镁、氯化镁、硫酸镁、九水合硫酸镁、meridianiite、十二水合硫酸镁、氯化钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、磷酸一钾、磷酸氢二钾、硫酸钾、碳酸氢钠、磷酸氢钠、氯化钠，及其任意组合。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述盐选自：磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、氯化钠及其任意组合。
53.根据权利要求1-52中任一项所述的方法，其中所述培养基进一步包含维生素。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述维生素选自：D-生物素、泛酸钙、肌醇、对氨基苯甲酸、叶酸、盐酸吡哆醇、吡哆醇(B6)、生物素、核黄素、硫辛酸、二氯化硫胺素、巯基乙磺酸、烟酸、泛酸、维生素A、维生素B12、维生素K、核黄素(B2)、硫胺素(B1)、K-Ca-泛酸盐、氯化胆碱、内消旋肌醇、烟酰胺、吡哆醛HCl、吡哆醇HCl、硫胺素HCl、对氨基苯甲酸、尼克酸、抗坏血酸、磷酸α-生育酚、钙化醇、甲萘醌、烟酸及其任意组合。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述维生素选自：D-生物素、泛酸钙、肌醇、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、核黄素、二氯化硫胺素、维生素B12、烟酸及其任意组合。
56.根据权利要求44-55中任一项所述的方法，其中所述培养基进一步包含表面活性剂。
57.根据权利要求44-56中任一项所述的方法，其中所述培养基进一步包含氨基酸来源。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述氨基酸来源是L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-羟脯氨酸、蛋白胨、大豆蛋白胨、HiVeg Peptone#1、HiVeg Peptone#2、HiVeg Peptone#3、HiVeg Peptone#4、HiVeg Peptone#5、HiVeg SpecialPeptone、蛋白酶蛋白胨或其组合。
59.根据权利要求44-58中任一项所述的方法，其中所述培养基的pH约为7.0。
60.根据权利要求44-59中任一项所述的方法，其进一步包括向有需要的受试者施用治疗有效量。
61.一种方法，其包括：
(a)获得根据权利要求1-43中任一项所述的组合物；以及
(b)将治疗有效量的所述组合物施用于有需要的受试者。
62.根据权利要求61所述的方法，其中口服施用所述组合物。
63.根据权利要求61所述的方法，其中直肠施用所述组合物。
64.根据权利要求61所述的方法，其中施用所述治疗有效量的所述组合物包括每天施用一个或多个剂型，持续至少7天的时间。
65.根据权利要求61所述的方法，其中施用所述治疗有效量的所述组合物包括每天施用一个或多个剂型，持续7天至14天的时间。
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