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KR102594863B1 - 인간화 프로그램화 세포 사멸 1 유전자를 가지는 비인간 동물 - Google Patents

인간화 프로그램화 세포 사멸 1 유전자를 가지는 비인간 동물 Download PDF

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KR102594863B1
KR102594863B1 KR1020227045421A KR20227045421A KR102594863B1 KR 102594863 B1 KR102594863 B1 KR 102594863B1 KR 1020227045421 A KR1020227045421 A KR 1020227045421A KR 20227045421 A KR20227045421 A KR 20227045421A KR 102594863 B1 KR102594863 B1 KR 102594863B1
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엘레나 부로바
알렉산더 오. 무지카
카-만 비너스 라이
앤드류 제이. 머피
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리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

비인간 동물 및 비인간 동물의 사용 및 제조를 위한 방법 및 조성물이 제공되되, 이러한 비인간 동물은 프로그램화 세포 사멸 1(Pdcd1) 유전자의 인간화를 포함한다. 이러한 비인간 동물은, 일부 구현예에서, 내인성 Pdcd1 유전자에 유전적 변형을 가지는 것으로 기술되어, 따라서 이러한 비인간 동물이 인간 부위 및 내인성 부위(예를 들어, 비인간 부위)를 포함하는 PD-1폴리펩티드를 발현할 수 있다.

Description

인간화 프로그램화 세포 사멸 1 유전자를 가지는 비인간 동물{NON-HUMAN ANIMALS HAVING A HUMANIZED PROGRAMMED CELL DEATH 1 GENE}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 그 내용 전체가 참조로서 본원에 포함되는 2014년 6월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 62/014,181, 2014년 12월 2일에 출원된 62/086,518 및 2015년 3월 25일에 출원된 62/138,221의 우선권의 혜택을 주장한다.
참조로서 서열 목록 포함
2015년 6월 4일에 생성되고, EFS-Web을 통해 미국 특허 상표청에 제출된 31969_SEQ.txt로 명명된　23 KB의 ASCII 텍스트 파일 내 서열 목록이 참조로서 본원에 포함된다.
비록 의학 연구 및 개발의 집중적인 초점이 암 면역요법에 맞춰져 있고 현저한 개선이 이루어졌지만, 암은 세계적으로 건강 산업에서의 주요 과제로 남아 있다. 이러한 주요 과제는, 부분적으로, 면역계의 모니터링 기전을 회피하는 암 세포의 능력에 기인하는데, 이는 부분적으로 항종양 면역의 저해 및/또는 하향조절의 결과이다. 항종양 면역을 활성하고/하거나 촉진하도록 설계된 새로운 암 치료요법의 치료적 효능을 최적으로 결정하고 암 세포가 어떻게 면역 세포(예를 들어, T 세포)에 저해 신호를 전달하는지의 분자적 양상을 결정하는 생체 내 시스템의 개발은 여전히 부족하다. 이러한 시스템은 생체 내 항종양 환경을 촉진하는 후보 제제의 치료적 가능성을 평가하기 위한 검정을 위한 근원을　제공한다.
본 발명은 암의 치료에 사용될 수 있는 새로운 치료제를 발견하고 개발하기 위한 개선된 시스템이 가능하도록 비인간 동물을 조작하는 것이 바람직하다는 인식을 포함한다. 본 발명은 또한 자가면역(또는 염증성) 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있는 새로운 치료제를 발견하고 개발하기 위한 개선된 시스템이 가능하도록 비인간 동물을 조작하는 것이 바람직하다는 인식을 포함한다. 더욱이, 본 발명은, 또한, 예를 들어, 항종양 면역을 상향조절하는 암 치료제의 발견 및 개발에 사용하기 위해 인간화 Pdcd1 유전자를 가지고/가지거나 그렇지 않으면 인간 또는 인간화 PD-1폴리펩티드를 발현하거나, 함유하거나 생산하는 비인간 동물이 바람직하다는 인식을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 PD-1을 표적화하는 것을 포함하는　병용 치료요법의 발견 및 개발을 위한 개선된 생체 내 시스템을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 2가지의 상이한 종(예를 들어, 인간 및 비인간)으로부터의 유전적 물질을 포함하는 Pdcd1 유전자를 포함하는 게놈을 가지는 비인간 동물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물의 Pdcd1 유전자는 인간 및 비인간 부위를 함유하는 PD-1 폴리펩티드를 암호화하되, 인간 및 비인간 부위가 함께 연결되어 기능적 PD-1 폴리펩티드를 형성한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물의 Pdcd1 유전자는 인간 PD-1 폴리펩티드의 세포외 도메인을 전체적 또는 부분적으로 함유하는 PD-1 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 PD-1 폴리펩티드를 발현하는 비인간 동물을 제공하되, PD-1 폴리펩티드는 인간 부위 및 내인성 부위를 포함한다. 일부 구현예에서는, 본 발명의 PD-1 폴리펩티드는 비인간 신호 펩티드를; 그리고 일부 특정 구현예에서는, 설치류 신호 펩티드를 이용하여 비인간 동물의 세포 내에서 번역된다.
일부 구현예에서, 내인성 부위는 내인성 PD-1 폴리펩티드의 세포내 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 부위는 내인성 PD-1 폴리펩티드의 막관통 부위를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 부위는 도 8에 나타낸 마우스 PD-1 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열에 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 내인성 부위는 도 8에 나타낸 마우스 PD-1 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 내인성 부위는 도 8에 나타낸 마우스 PD-1 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가진다.
일부 구현예에서, 인간 부위는 인간 PD-1 폴리펩티드의 아미노산 35~145, 27~145, 27~169, 26~169 또는 21~170을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 부위는 도 8에 나타낸 인간 PD-1 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 부위는 도 8에 나타낸 인간 PD-1 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 부위는 도 8에 나타낸 인간 PD-1 폴리펩티드의 상응하는 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 부위 및 내인성 부위를 포함하는 PD-1 폴리펩티드는 내인성 Pdcd1 유전자에 의해 암호화된다. 일부 특정 구현예에서, 내인성 Pdcd1 유전자는 내인성 Pdcd1 엑손 1, 4 및 5를 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 내인성 Pdcd1 유전자는 내인성 Pdcd1 엑손 3를, 전체적 또는 부분적으로, 더 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 내인성 Pdcd1 유전자는 서열 번호 21을 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 내인성 Pdcd1 유전자는 서열 번호 22를 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 내인성 Pdcd1 유전자는 서열 번호 21 및 서열 번호 22를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물에 의해 발현된 PD-1 폴리펩티드는 서열 번호 6에 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물에 의해 발현된 PD-1 폴리펩티드는 서열 번호 6과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물에 의해 발현된 PD-1 폴리펩티드는 서열 번호 6과 동일한 아미노산 서열을 가진다.
일부 구현예에서, 본 발명은, 전체적 또는 부분적으로, 인간 Pdcd1 유전자의 하나 이상의 엑손에 작동가능하게 연결된 비인간 Pdcd1 유전자의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간화 Pdcd1 유전좌위를 제공한다. 일부 구현예에서, 인간화 Pdcd1 유전좌위는 인간 Pdcd1 유전자의 하나 이상의 엑손 옆에 5' 및 3' 비인간 Pdcd1 미번역 영역(UTR)을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Pdcd1 유전좌위는 설치류 프로모터의 조절 하에 있으며; 일부 특정 구현예에서, 내인성 설치류 프로모터의 조절 하에 있다.
일부 구현예에서, 인간화 Pdcd1 유전좌위는 인간 Pdcd1 엑손 2에 작동가능하게 연결된 비인간 Pdcd1 엑손 1, 3, 4 및 5를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 Pdcd1 유전좌위는 비인간 Pdcd1 엑손 1, 4 및 5, 인간 Pdcd1 엑손 2를 포함하고, Pdcd1 엑손 3를 더 포함하되, Pdcd1 엑손 3는 인간 부위 및 비인간 부위를 포함하고, 상기 비인간 및 인간 엑손은 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, Pdcd1 엑손 3의 인간 부위는 PD-1 줄기 서열을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Pdcd1 엑손 3의 인간 부위는 약 71 bp의 인간 Pdcd1 엑손 3를 포함한다. 일부 구현예에서, Pdcd1 엑손 3의 비인간 부위는 막관통 서열을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, Pdcd1 엑손 3의 비인간 부위는 약 91 bp의 설치류 Pdcd1 엑손 3를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 내인성 부위 및 인간 부위를 포함하는 Pdcd1 유전자를 포함하는 비인간 동물을 제공하되, 내인성 및 인간 부위는 설치류 Pdcd1 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 설치류 Pdcd1 프로모터는 내인성 설치류 Pdcd1 프로모터이다.
일부 구현예에서, 내인성 부위는 내인성 Pdcd1 엑손 1, 4 및 5를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 부위는 내인성 Pdcd1 엑손 3을 전체적 또는 부분적으로 더 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 Pdcd1 유전자의 엑손 1, 3(전체적 또는 부분적), 4 및 5는 도 8에나타낸 내인성 Pdcd1 유전자의 상응하는 엑손 1, 3(전체적 또는 부분적), 4 및 5에 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 구현예에서, 내인성 Pdcd1 유전자의 엑손 1, 3(전체적 또는 부분적), 4 및 5는 도 8에 나타낸 내인성 Pdcd1 유전자의 상응하는 엑손 1, 3(전체적 또는 부분적), 4 및 5와 실질적으로동일하다. 일부 구현예에서, 내인성 Pdcd1 유전자의 엑손 1, 3(전체적 또는 부분적), 4 및 5는 도 8에 나타낸 내인성 Pdcd1 유전자의 상응하는 엑손 1, 3(전체적 또는 부분적), 4 및 5과 동일하다.
일부 구현예에서, 인간 부위는 인간 PD-1 폴리펩티드의 아미노산 21~170, 26~169, 27~169, 27~145 또는 35~145를 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 부위는 인간 Pdcd1 유전자의 엑손 2를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 부위는 인간 Pdcd1 엑손 3을 전체적 또는 부분적으로 더 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 Pdcd1 엑손 2 및 3은, 전체적 또는 부분적으로, 도 8에 나타낸 인간 Pdcd1 유전자의 상응하는 엑손 2 및 3과, 전체적 또는 부분적으로 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일하다. 일부 구현예에서, 인간 Pdcd1 엑손 2 및 3(전체적 또는 부분적)은 도 8에 나타낸 인간 Pdcd1 유전자의 상응하는 엑손 2 및 3(전체적 또는 부분적)과 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 인간 Pdcd1 엑손 2 및 3(전체적 또는 부분적)은 도8에 나타낸 인간 Pdcd1 유전자의 상응하는 엑손 2 및 3(전체적 또는 부분적)과 동일하다. 일부 구현예에서, 인간 부위는 비인간 동물에서의 발현; 일부 구현예에서, 설치류에서의 발현을 위해; 일부 특정 구현예에서, 마우스에서의 발현을 위해; 일부 특정 구현예에서, 랫트에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 부위는 서열 번호 23에 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 부위는 서열 번호 23과 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 부위는 서열 번호 23과 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 부위는 서열 번호 23을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 비인간 동물에 의해 생산(혹은 생성)된 PD-1 폴리펩티드를 제공한다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물에 의해 생산된 PD-1 폴리펩티드는 서열 번호 6과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물에 의해 생산된 PD-1 폴리펩티드는 서열 번호 6과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물에 의해 생산된 PD-1 폴리펩티드는 서열 번호 6과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 비인간 동물로부터 단리된 세포 또는 조직을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 Pdcd1 유전자를 포함하는 단리된 세포 또는 조직을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 림프구이다. 일부 구현예에서, 세포는 B 세포, 수지상 세포, 대식 세포, 단핵구(예를 들어, 활성화된 단핵구), NK 세포, 및 T 세포(예를 들어, 활성화된 T 세포)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 조직은 지방, 방광, 뇌, 가슴, 골수, 눈, 심장, 장, 신장, 간, 폐, 림프절, 근육, 췌장, 혈장, 혈청, 피부, 비장, 위, 흉선, 고환, 난자, 및 이의 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 그 게놈이 본원에 기술된 Pdcd1 유전자를 포함하는비인간 배아 줄기 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 비인간 배아 줄기 세포는 마우스 배아 줄기 세포이고 129 주, C57BL/6 주 또는 BALB/c 주로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 비인간 배아 줄기 세포는 마우스 배아 줄기 세포이고, 129 주, C57BL/6 주 또는 이의 혼합물로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 비인간 배아 줄기 세포는 마우스 배아 줄기 세포이고, 129 및 C57BL/6 주의 혼합물로부터 유래한다.
일부 구현예에서, 비인간 배아 줄기 세포는 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22 또는 이의 조합을 포함하는 Pdcd1 유전자를 포함하는 게놈을 가진다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비인간 동물을 제조하기 위한 본원에 기술된 비인간 배아 줄기 세포의 용도를 제공한다. 일부　특정 구현예에서, 비인간 배아 줄기 세포는 마우스 배아 줄기 세포이고 본원에 기술된 Pdcd1 유전자를 포함하는 마우스를 제조하기 위해 사용된다. 일부 특정 구현예에서, 비인간 배아 줄기 세포는 랫트 배아 줄기 세포이고, 본원에 기술된 Pdcd1 유전자를 포함하는 랫트를 제조하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 Pdcd1 유전자를 포함하는 비인간 배아 줄기 세포를 포함하거나, 이로로부터 제조되거나 수득되거나 생성된 비인간 배아를 제공한다. 일부 특정 구현예에서, 비인간 배아는 설치류 배아; 일부 구현예에서, 마우스 배아; 일부 구현예에서, 랫트 배아이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비인간 동물을 제조하기 위한 본원에 기술된 비인간 배아의 용도를 제공한다. 일부 특정　구현예에서, 비인간 배아는 마우스 배아이고 본원에 기술된 Pdcd1 유전자를 포함하는 마우스를 제조하기 위해 사용된다. 일부 특정 구현예에서, 비인간 배아는 랫트 배아이고 본원에 기술된 Pdcd1 유전자를 포함하는 랫트를 제조하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 표적화 벡터(또는 핵산 구조체)를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 인간화 Pdcd1 유전자를 포함하는 표적화 벡터(또는 핵산 구조체)를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 인간 세포외 도메인을 전체적 또는 부분적으로 포함하는 PD-1 폴펩티드; 일부 특정 구현예에서 인간 PD-1 폴리펩티드의 아미노산 21~170, 26~169, 27~169, 27~145 또는 35~145를 포함하는 PD-1폴리펩티드를 암호화하는 Pdcd1 유전자를 포함하는 표적화 벡터(또는 핵산 구조체)를 제공한다.
일부 구현예에서, 표적화 벡터(또는 핵산 구조체)는, 인간 Pdcd1 유전자의 하나 이상의 엑손(전체적 또는 부분적)에 작동가능하게 연결된 비인간 Pdcd1 유전자의 하나 이상의 엑손을 전체적 또는 부분적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 벡터(또는 핵산 구조체)는 인간 Pdcd1 유전자의 하나 이상의 엑손의 옆에 5' 및 3' 비인간 Pdcd1 미번역 영역(UTR)을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 벡터(또는 핵산 구조체)는 하나 이상의 선택 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 벡터(또는 핵산 구조체)는 하나 이상의 위치 특이적 재조합 자리를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 벡터(또는 핵산 구조체)는 인간 Pdcd1 엑손 2를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 벡터(또는 핵산 구조체)는 인간 Pdcd1 엑손 2 및 인간 Pdcd1 엑손 3를 전체적 또는 부분적으로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 변형된 비인간 배아 줄기 세포를 제조하기위한 본원에 기술된 표적화 벡터(또는 핵산 구조체)의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 변형된 비인간 배아를 제조하기 위한 본원에 기술된 표적화 벡터(또는 핵산 구조체)의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 비인간 동물을 제조하기 위한 본원에 기술된 표적화 벡터(또는 핵산 구조체)의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 내인성 Pdcd1 유전자로부터 PD-1 폴리펩티드를 발현하는 비인간 동물을 제조하는 방법을 제공하되, PD-1 폴리펩티드는 인간 서열을 포함하고, 이러한 방법은 (a) 게놈 단편을 설치류 배아 줄기 세포 내 내인성 Pdcd1 유전자에 삽입하는 단계로서, 상기 게놈 단편이 인간 PD-1 폴리펩티드를 전체적 또는 부분적으로 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 단계; (b) (a)에서 생성된 설치류 배아 줄기 세포를 수득하는 단계; 및 (b)의 설치류 배아 줄기 세포를 이용하여 설치류를 제작하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 서열은 인간 PD-1 폴리펩티드의 아미노산 35~145, 27~145, 27~169, 26~169 또는 21~170을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 인간 Pdcd1 엑손 2를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 인간 Pdcd1 엑손 3를 전체적 또는 부분적으로 더 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 선택 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 위치 특이적 재조합 자리를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 그 게놈이 설치류 Pdcd1 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 부위 및 내인성 부위를 가지는 PD-1 폴리펩티드를 암호화하는 Pdcd1 유전자를 포함하는 비인간 동물을 제조하는 방법을 제공하되, 이러한 방법은 비인간 동물의 게놈을 변형하여 게놈이 설치류 Pdcd1 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 부위 및 내인성 부위를 가지는 PD-1 폴리펩티드를 암호화하는 Pdcd1 유전자를 포함하게 함으로써, 상기 비인간 동물을 제조하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 설치류 Pdcd1 프로모터는 내인성 설치류 Pdcd1 프로모터이다.
일부 구현예에서, 인간 부위는 인간 PD-1 폴리펩티드의 아미노산 35~145, 27~145, 27~169, 26~169 또는 21~170을 포함한다.
일부 구현예에서, Pdcd1 유전자는 인간 Pdcd1 엑손 2을 포함하도록 변형된다. 일부 구현예에서, Pdcd1 유전자는 인간 Pdcd1 엑손 2 및 인간 Pdcd1 엑손 3을 전체적 또는 부분적으로 포함하도록 변형된다.
일부 구현예에서, 비인간 동물의 게놈을 변형하는 단계가 비인간 배아 줄기 세포에서 수행된 다음 상기 비인간 배아 줄기 세포로 비인간 동물을 생성하는 단계가 이어진다. 일부 특정 구현예에서, 비인간 배아 줄기 세포는 설치류 배아 줄기 세포이고; 일부 구현예에서, 마우스 배아 줄기 세포이고; 일부 구현예에서, 랫트 배아 줄기 세포이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 의해 수득할 수 있는 비인간 동물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비인간 동물에서 종양 생장을 감소시키는 방법을 제공하되, 이러한 방법은 그 게놈이 설치류 Pdcd1 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 부위 및 내인성 부위를 가지는 PD-1폴리펩티드를 암호화하는 Pdcd1유전자를 포함하는 비인간 동물에 인간 PD-1을 표적으로 하는 약물을 투여하는 단계를 포함하고; 이러한 투여는 비인간 동물에서 종양 생장이 감소되기에 충분한 시간 및 조건 하에 수행된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비인간 동물에서 종양 세포를 살상하는 방법을 제공하되, 이러한 방법은 그 게놈이 설치류 Pdcd1 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 부위 및 내인성 부위를 가지는 PD-1 폴리펩티드를 암호화하는 Pdcd1 유전자를 포함하는 비인간 동물에 인간 PD-1을 표적으로 하는 약물을 투여하는 단계를 포함하되; 이러한 투여는 비인간 동물에서 약물이 종양 세포를 살상하는 것을 매개하기에 충분한 시간 및 조건 하에 수행된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 인간 PD-1을 표적으로 하는 약물의 약동학적 성질을 평가하는 방법을 제공하되, 이러한 방법은 그 게놈이 설치류 Pdcd1 프로모터로 작동가능하게 연결된 인간 부위 및 내인성 부위를 가지는 PD-1 폴리펩티드를 암호화하는 Pdcd1 유전자를 포함하는 비인간 동물에 약물을 투여하는 단계; 및 인간 PD-1을 표적으로 하는 약물의 한 가지 이상의 약동학적 성질을 결정하기 위한 검정을 수행하는 단계를 포함한다.
많은 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물은 그 게놈이 설치류 Pdcd1 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 부위 및 내인성 부위를 가지는 PD-1 폴리펩티드를 암호화하는 Pdcd1 유전자를 포함하는 설치류이다. 많은 구현예에서, 설치류 Pdcd1 프로모터는 내인성 설치류 Pdcd1 프로모터이다. 많은 구현예에서, 인간 부위는 인간 PD-1 폴리펩티드의 아미노산 35~145, 27~145, 27~169, 26~169 또는 21~170을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 PD-1을 표적으로 하는 약물은 PD-1 길항제이다. 일부 구현예에서, 인간 PD-1을 표적으로 하는 약물은 PD-1 작용제이다. 일부 구현예에서, 인간 PD-1을 표적으로 하는 약물은 항PD-1 항체이다. 일부 구현예에서, 인간 PD-1을 표적으로 하는 약물은 정맥내로, 복강내로, 또는 피하로 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비인간 동물 종양 모델을 제공하는데, 이러한 비인간 동물은 인간 부위 및 내인성 부위를 포함하는 PD-1 폴리펩티드를 발현한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 비인간 동물 종양 모델을 제공하는데, 이러한 비인간 동물은 내인성 부위 및 인간 부위를 포함하는 Pdcd1 유전자를 포함하는 게놈을 가지되, 내인성 및 인간 부위는 비인간 동물 Pdcd1 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 그 게놈이 내인성 부위 및 인간 부위를 포함하는 Pdcd1 유전자를 포함하는 비인간 동물을 제공하는 단계로서, 내인성 및 인간 부위가 비인간 동물 Pdcd1 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 단계; 및 (b) (a)의 설치류 내에 하나 이상의 종양 세포를 이식함으로써; 상기 비인간 동물 종양 모델을 제공하는 단계에 의해 수득되는 비인간 동물 종양 모델을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물 종양 모델은 설치류 종양 모델이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물 Pdcd1 프로모터는 설치류 Pdcd1 프로모터이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 약물 또는 백신을 확인하거나 검증하는 방법을 제공하되, 이러한 방법은 약물 또는 백신을 그 게놈이 PD-1 폴리펩티드(PD-1 폴리펩티드는 인간 부위 및 내인성 부위를 포함함)를 암호화하는 Pdcd1 유전자를포함하는 비인간 동물에게 전달하는 단계, 및 약물 또는 백신에 대한 면역 반응, 약물 또는 백신의 안전성 프로파일, 또는 질환, 장애 또는 병태에 대한 효과 중 한 가지 이상을 모니터링하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 안전성 프로파일을 모니터링하는 단계는 비인간 동물이 약물 또는 백신의 전달의 결과로서 부작용 또는 역효과를 나타내는지를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 부작용 또는 역효과는 사망률, 치사율, 체중의 변화, 하나 이상의 효소(예를 들어, 간)의 수준의 변화, 하나 이상의 기관의 중량의 변화, 기능 소실(예를 들어, 감각, 운동, 기관, 등), 하나 이상의 질환에 대한 감수성의 증가, 비인간 동물의 게놈에 대한 변화, 식품 섭취에서의 증가 또는 감소 및 하나 이상의 질환의 합병증으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 질환, 장애 또는 병태는 비인간 동물에서 유도된다. 일부 구현예에서, 비인간 동물에서 유도되는 질환, 장애 또는 병태는 치료를 필요로 하는 한명 이상의 인간 환자가 고통받는 질환, 장애 또는 병태와 관련되어 있다. 일부 특정한 구현예에서, 약물은 항체이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 약제로서의 용도와 같이　의료용으로 사용하기 위한 약물 또는 백신의 개발에서 본원에 기술된 비인간 동물의 용도를제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 암, 신생물, 감염성 질환, 염증성 질환, 장애 또는 병태, 또는 자가면역 질환, 장애 또는 병태의 치료를 위한 약제의 제조에서 본원에 기술된 비인간 동물의 용도를 제공한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 Pdcd1 유전자는 본원에 기술된 Pdcd1 유전자를 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 Pdcd1 유전자는 설치류 Pdcd1 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 부위 및 내인성 부위를 가지는 PD-1 폴리펩티드를 암호화한다. 다양한 구현예에서, 설치류 프로모터는 내인성 설치류 프로모터이다. 다양한 구현예에서, 인간 부위는 인간 Pdcd1 엑손 2를 포함한다. 다양한 구현예에서, 인간 부위는 인간 Pdcd1 엑손 2를 포함하고 인간 Pdcd1 엑손 3를 전체적 또는 부분적으로 더 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 PD-1 폴리펩티드는 본원에 기술된 PD-1 폴리펩티드를 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 전장 내인성 비인간 PD-1 폴리펩티드를 검출가능하게 발현하지 않는다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 내인성 PD-1 폴리펩티드의 세포외 부위를 검출가능하게 발현하지 않는다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 내인성 PD-1 폴리펩티드의 N-말단 면역글로불린 V 도메인을 검출가능하게 발현하지 않는다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 설치류; 일부 구현예에서, 마우스; 일부 구현예에서, 랫트이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 마우스는 129 주, BALB/C 주, C57BL/6주, 및 혼합 129xC57BL/6 주; 일부 특정 구현예에서, 50% 129 및 50% C57BL/6; 일부 특정 구현예에서, 25% 129 및 75% C57BL/6로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 출원에서 사용된,"약" 및 "대략"이라는 용어는 동등하게 사용된다. 본 출원에서 사용된 임의의 수치는 약/대략을 사용하거나 사용하지 않더라도 당업자에 의해 이해되는 임의의 정상적인 변동을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 특징, 대상 및 장점은 이어지는 특정한 구현예의 상세한 설명에서 명백해 진다. 그러나, 본 발명의 특정한 구현예를 나타내지만, 상세한 설명은 단지 예시로서 제공될 뿐 제한하고자 함이 아닌 것으로 이해해야 한다. 본 발명의 범주 내 다양한 변형예들 및 수정예들이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
다음의 도면들로 구성된 본원에 포함된 도면은 단지 예시적인 목적이며 제한하고자 하는 것이 아니다.
도 1 은 비인간(예를 들어, 마우스)의 게놈 조직 및 인간 프로그램화 세포 사멸 1(Pdcd1) 유전자의 도해(일정한 비율 아님)를 나타낸 것이다. 엑손 및 미번역 영역(UTR)이 각각의 엑손 아래 및 각각의 UTR 위에 번호부여되어있다.
도 2 는 비인간 프로그램화 세포 사멸 1(Pdcd1) 유전자의 인간화를 위한 예시적인 방법의 도해(일정한 비율 아님)를 나타낸 것이다. 선택된 뉴클레오티드 접합 위치는 각각의 접합부 아래에 선으로 표기되어 있다. 이러한 선택된 뉴클레오티드 접합부의 서열은 서열 번호로 나타나 있다.
도 3 은 실시예 1에 기술된 검정에서 사용되는 프로브의 대략적인 위치를 나타내는 마우스의 게놈 조직 및 인간 프로그램화 세포 사멸 1(Pdcd1)유전자의 도해(일정한 비율 아님)를 나타낸 것이다.
도 4 는 마우스 및/또는 인간화 PD-1를 발현하는 실시예 1에 기술된 내인성 Pdcd1 유전자의 인간화를 위해 야생형 마우스 및 마우스 이형접합체로부터 단리된 CD19 및 CD8에 대하여 게이팅된 T 세포의 예시적인 히스토그램을 나타낸 것이다. 이소형 대조군으로 염색된 세포와 마찬가지로 자극된 세포 및 미자극 세포 군집이 나타나 있다.
도 5 는 실시예 1에 기술된 내인성 Pdcd1 유전자의 인간화를 위한 마우스 동형접합체에서 21일에 걸친　예시적인 종양 생장 곡선을 나타낸 것이다. 대조군: PD-1에 특이적이지 않는 항체인 a-hPD-1 Ab: 인간 PD-1에 대하여 특이적인 항체. 화살표는 항체 처리일을 나타낸다. 각 처리군에 대한 21일차에 종양이 없는 마우스의 수가 나타나 있다.
도 6 은 항PD-1 항체로의 처리 후 실시예 1에 기술된 내인성 Pdcd1 유전자의 인간화를 위한 마우스 동형접합체에서 비장 내 CD8b, CD3, IFN-g 및 PD-1 mRNA 발현의 예시적인 실시간 PCR 분석을 나타낸 것이다. A, 군 당 다섯 마리의 마우스의 평균. B, 각 처리군에서 개별적인 마우스의 발현 수준. 대조군: PD-1에 특이적이지 않은항체; a-PD-1: 항PD-1 항체.
도 7 은 0.3 ~ 25 mg/kg의 항hPD-1 항체 또는 25 mg/kg의 대조군 항체(PD-1에 특이적이지 않은 항체)가 투여되었던 실시예 1에 기술된 내인성 Pdcd1 유전자의 인간화를 위한 마우스 동형접합체에서 60일에 걸친 예시적인 종양 생장 곡선을 나타낸 것이다. 화살표는 항체 처리일을 나타낸다. 각 처리군에 대하여 60일에서의 종양이 없는 마우스의 수가 나타나 있다 .
도 8 은 예시적인 쥣과 동물, 인간 및 인간화 Pdcd1 및 PD-1 서열, 및 비인간 Pdcd1 유전자의 인간화를 위한 예시적인 인간 핵산 서열을 기재한 것이다. mRNA 서열의 경우, 굵은 글씨가 코딩 서열 및 연속적인 엑손을 가리키는데, 지시된 곳에서, 교대하는 밑줄 친 문자로 구분되고;인간화 mRNA 서열의 경우, 인간 서열은 괄호 안에 포함된다. 단백질 서열의 경우, 신호 펩티드에 밑줄이 쳐져 있고, 세포외 서열은 굵은 글씨이고, 면역글로불린 V 도메인 서열은 괄호 안에 있으며, 세포내 서열은 이탤릭체이고; 인간화 단백질 서열의 경우, 비인간 서열을 보통체로 나타내고 인간 서열을 굵은 글씨로 나타낸다.
정의
본 발명은 본원에 기술된 특정한 방법 및 실험 조건으로 제한되지 않는데, 이러한 방법 및 조건이 다양할 수 있기 때문이다. 또한 본 발명의 범주는 청구범위에 의해 정의되기 때문에 본원에서 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위한 것으로 제한하고자 하는 의도가 아닌 것으로 이해된다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어 및 구절은 용어 및 구절이 사용된 문맥으로부터 반대인 것이 명확하거나 확실하게 지시되지 않는 한 그러한 용어 및 구절이 당업계에서 달성하는 의미를 포함한다. 본원에 기술된 것과 동등하거나 유사한 임의의 방법 및 물질이 본 발명을 실행하거나 시험하기 위해 사용될 수 있지만, 특정한 방법 및 물질이 지금부터 기술된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 참조로서 본원에 포함된다.
관심 있는 하나 이상의 값에 대하여 본원에서 적용된 "대략"이라는 용어는 진술된 참조값과 유사한 값을 지칭한다. 특정한 구현예에서, "대략" 또는 "약" 이라는 용어는 다르게 진술되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한 진술된 참조 값의 양 방향(초과 또는 미만)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%,6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 이하 이내의 다양한 값을 지칭한다(이러한 수치가 가능한 값의 100%를 초과할 수 있는 경우는 제외).
"생물학적 활성" 이라는 용어는 생물학적 시스템, 시험관 내 또는 생체 내(예를 들어, 유기체 내)에서 활성을 가지는 임의의 제제의 특성을 포함한다. 예를 들어, 유기체 내에 존재할 때, 유기체 내에서 생물학적 효과를 가지는 제제는 생물학적으로 활성인 것으로 간주된다. 단백질 또는 폴리펩티드가 생물학적으로 활성인 특정한 구현예에서, 단백질 또는 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 공유하는 단백질 또는 폴리펩티드의 부위는 통상적으로 "생물학적 활성" 부위로 지칭된다.
"비견할 만한" 이라는 용어는 서로 동일하지 않을 수 있지만 이들 사이에서 비교가 가능할 만큼 충분히 유사하여 관찰된 차이점 또는 유사점에 기반하여 합리적으로 결론을 내릴 수 있는 2종 이상의 제제, 엔티티, 상황, 조건의 세트 등을 포함한다. 당업자는, 문맥 내에서 2종 이상의 이러한 제제, 엔티티, 상황, 조건의 세트 등에 대하여 임의의 주어진 상황에서 어떠한 정도의 동일성이 비견할 만한 것으로 간주되는데 필요한지를 이해할 것이다.
예를 들어, 보존적 아미노산 치환에서와 같이, "보존적" 이라는 용어는 유사한 화학적 성질(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 가지는 측쇄 R기를 가지는 다른 아미노산 잔기에 의한 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 관심 있는 기능적 성질, 예를 들어, 리간드에 결합하는 수용체의 능력을 실질적으로 변화시키지 않을　것이다. 유사한 화학적 성질을 가지는 측쇄를 가지는 아미노산의 군의 예는 다음을 포함한다: 지방족 측쇄, 예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신; 지방족-하이드록실 측쇄, 예를 들어 세린 및 트레오닌; 아미드 함유 측쇄, 예를 들어, 아스파라긴 및 글루타민; 방향족 측쇄, 예를 들어, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 염기성 측쇄, 예를 들어, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘; 산성 측쇄, 예를들어, 아스파르트산 및 글루탐산; 및, 황 함유 측쇄, 예를 들어, 시스테인 및 메티오닌. 보존적 아미노산 치환기는, 예를 들어, 발린/류신/이소류신, 페닐알라닌/티로신, 라이신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파르테이트, 및 아스파라긴/글루타민을 포함한다. 일부 구현예에서, 보존적 아미노산 치환은, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발에서 사용된 바와 같은 알라닌을 가지는 단백질 내 임의의 원래의 잔기의 치환일수 있다. 일부 구현예에서, 보존적 치환은 참조로서 본원에 포함된 문헌(Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of theEntire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45)에 개시된 PAM250 로그우도 매트릭스 내에서양성 값을 가지는것으로 만들어 진다. 일부 구현예에서, 치환은 적당한 보존적 치환인데, 이러한 치환은 PAM250 로그 우도 매트릭스에서 비음성 값을 가진다.
"대조군" 이라는 용어는 결과를 비교하는 표준이 되는 "대조군"이라는 당업계에서 이해되는 의미를 포함한다. 통상적으로, 대조군은 변수들을 분리하여 이러한 변수들에 대한 결론을 내리기 위한 실험의 완전성을 증대하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 대조군은 비교자를 제공하기 위해 시험 반응 또는 검정과 동시에 수행되는 반응 또는 검정이다. 본원에서 사용된, "대조군"은 "대조군 동물"을 포함할 수 있다. "대조군 동물"은 본원에 기술된 변형, 본원에 기술된 것과는 다른 변형울 가지거나 변형을 가지지 않을 수 있다(즉, 야생형 동물). 하나의 실험에서, "시험"(즉, 시험할 변수)이 적용된다. 제2 실험에서, "대조군," 시험할 변수가 적용되지 않는다. 일부 구현예에서, 대조군은 역사적 대조군(즉, 이전에 수행된 시험 또는 검정, 또는 이전에 알려진 양 또는 결과)이다. 일부 구현예에서, 대조군은 인쇄되거나 그렇지 않으면 저장된 기록이거나 이를 포함한다. 대조군은 양성 대조군 또는 음성 대조군일 수 있다.
"파괴"라는 용어는 DNA 분자(예를 들어, 유전자 또는 유전자 유전좌위와 같은 내인성 상동성 서열)를 이용한 상동성 재조합 사건의 결과를 포함한다. 일부 구현예에서, 파괴는 DNA 서열(들)의 삽입, 결실, 치환, 교체, 미스센스 돌연변이, 또는 프레임 전환 또는 임의의 이의 조합을 달성할 수 있거나 이를 나타낼 수 있다. 삽입은 전체 유전자 또는 유전자의 단편, 예를 들어, 내인성 서열이 아닌 기원일 수 있는 엑손(예를 들어, 이종 서열)의 삽입을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물(예를 들어, 유전자에 의해 암호화된 단백질)의 발현 및/또는 활성을 증가시킬수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자의 서열 또는 암호화된 유전자 산물(예를 들어, 암호화된 단백질)을 바꿀 수　있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 암호화된 유전자 산물(예를 들어, 암호화된 단백질)을 절단하거나 단편화할 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 암호화된 유전자 산물을 연장할 수 있는데; 일부 이러한 구현예에서, 파괴는 융합 단백질의 조립을 달성할 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 수준에 영향을 미칠 수 있지만 활성에는 영향을 미치지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 활성에는 영향을 미칠 수 있지만 수준에는 영향을 미치지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 수준에 유의한 효과를 가지지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 활성에 유의한 효과를 가지지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 파괴는 유전자 또는 유전자 산물의 수준 또는 활성 유의한 효과를 가지지 않을 수 있다.
"결정하는", "측정하는", "확인하는", "평가하는", "검정하는" 및 "분석하는"이라는 용어는 임의의 형태의 측정을 지칭하기 위해 교환가능하게 사용되고, 요소의 존재여부를 결정하는 것을 포함한다. 이러한 용어들은 정량적 및/또는 정성적 결정을 포함한다. 검정은 상대적이거나 절대적일 수 있다. "의 존재를 검정하는"것은 존재하는 어떤 것의 양을 결정하고/하거나 존재 여부를 결정하는 것일 수 있다.
"투여 계획" 또는 "치료 계획"이라는 용어는, 일부 구현예에서, 통상적으로 일정한 기간으로 나누어서 대상체에게 개별적으로 투여되는 하나를 초과하는 단위 용량의 세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 주어진 치료제는 한 가지 이상의 용량과 관련될 수 있는 권고된 투여 계획을 가진다. 일부 구현예에서, 투여 계획은 각각이 동일한 길이의 기간으로 서로 나누어진 복수의 용량을 포함하며; 일부 구현예에서, 투여 계획은 복수의 용량 및 개별적인 용량을 구분하는 적어도 2가지의 상이한 기간을 포함한다.
"내인성 유전좌위" 또는 "내인성 유전자"라는 구절은 모 또는 참조 유기체에서 발견되는 유전적인 유전좌위를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 유전좌위는 자연계에서 발견되는 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 내인성 유전좌위는 야생형 유전좌위이다. 일부 구현예에서, 참조 유기체는 야생형 유기체이다. 일부 구현예에서, 참조 유기체는 조작된 유기체이다. 일부 구현예에서, 참조 유기체는 (야생형이든 조작되든) 실험실에서 배양된 유기체이다.
"내인성 프로모터"라는 구절은, 예를 들어, 야생형 유기체에서, 내인성 유전자와 자연적으로 연관된 프로모터를 포함한다.
"이종"이라는 용어는 상이한 근원으로부터의 제제 또는 엔티티를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드, 유전자, 또는 유전자 산물에 관하여 사용되거나 특정한 세포 또는 유기체 내에 존재할 때, 이러한 용어는 관련된 폴리펩티드, 유전자, 또는 유전자 산물이: 1) 사람의 손에 의해 조작되었다; 2) 사람의 손에 의해(예를 들어, 유전자 조작에 의해) 세포 또는 유기체(또는 이의 전구체)에 도입되었다; 그리고/또는 3) 관련 세포 또는 유기체(예를 들어, 관련 세포 유형 또는 유기체 유형)에 의해 자연적으로 생산되지 않거나 이에 존재하지 않는다는 것을 명확하게 한다.
"숙주 세포"라는 용어는 이종(예를 들어, 외인성) 핵산 또는 단백질이 도입된 세포를 포함한다. 본 개시를 읽는 당업자는 이러한 용어가 특정한 대상 세포를 언급하는것 뿐 아니라 이러한 세포의 자손을 언급하기 위해 사용된다는 것을 이해할 것이다. 돌연변이 또는 환경적 영향에 의해 다음 세대에서 일정한 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은, 사실, 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, "숙주 세포"라는 용어의 범주 내에 여전히 포함된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포이거나 이를 포함한다. 일반적으로, 숙주 세포는 세포가　지정된 계(Kingdom of life)에 관계없이 이종 핵산 또는 단백질을 수여받고/받거나 생산하기에 적합한 임의의 세포이다. 예시적인 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포(단일 세포 또는 다수 세포), 박테리아 세포(예를 들어, E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp의 주 등), 마이코박테리아세포, 진균 세포, 효모 세포(예를 들어, S.cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, 등), 식물 세포, 곤충 세포(예를 들어, SF-9, SF-21, 배큘로바이러스에 감염된 곤충 세포, Trichoplusia ni, 등), 비인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 세포 융합물, 예를 들어, 하이브리도마 또는 퀴드로마(quadroma)를포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 랫트, 또는 마우스 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 진핵세포이고, 다음의 세포로부터 선택된다: CHO(예를 들어, CHOK1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어,COS-7), 망막 세포,Vero, CV1, 신장(예를 들어,HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60,(예를 들어, BHK21), Jurkat, Daudi, A431(epidermal), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포, 및 전술된 세포로부터 유래한 세포주. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어, 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6™ cell)를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 단리된 세포이거나 이를포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 조직의 일부이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 유기체의 일부이다.
"인간화"라는 용어는 구조(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열)이 자연계에서 비인간 동물에서 발견되는 특정한 유전자 또는 단백질의 구조와 상응하거나 실질적으로 동일한 부위를 포함하는 핵산 또는 단백질을 포함하고, 또한 관련된 특정한 비인간 유전자 또는 단백질에서 발견되는 것과 상이하고, 대신 상응하는 인간 유전자 또는 단백질에서 발견되는 비견할 만한 구조에 더욱 가깝게 상응하는 부위도 포함한다. 일부 구현예에서, "인간화" 유전자는 인간 폴리펩티드(예를 들어, 인간 단백질 또는 이의 일부 - 예를 들어, 이의 특징적 부위)의 아미노산 서열과 같은 아미노산 서열을 실질적으로 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자이다. 하나의 실시예로서, 막 수용체의 경우, "인간화" 유전자는, 전체적 또는 부분적으로, 인간 세포외 부위의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지는 세포외 부위 및 비인간(예를 들어, 마우스) 폴리펩티드의 서열과 동일한 남은 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간화 유전자는 인간 유전자의 DNA 서열의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 유전자는 인간 유전자의 전체 DNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 단백질은 인간 단백질에서 나타나는부분을 가지는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 단백질은 인간 단백질의 전체 서열을 포함하고 인간 유전자의 상동체 또는 오르소로그에 상응하는 비인간 동물의 내인성 유전좌위로부터 발현된다.
"동일성"이라는 용어는, 예를 들어, 서열의 비교와 연관하여, 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 당해 분야에 알려진 다수의 상이한 알고리즘에 의해 결정되는 동일성을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 동일성은 10.0의 오픈 갭 패널티, 0.1의 연장갭 패널티를 채용한 ClustalW v. 1.83(slow)정렬 및 Gonnet 유사성 매트릭스(MACVECTOR™ 10.0.2, MacVECTOR Inc., 2008)를 사용하여 결정된다.
"단리된"이라는 용어는 (1)(자연계에서이든 실험실 세팅 내에서이든) 초기에 생산될 때 연관되었던 적어도 일부의 구성요소로부터 분리되고/되거나, (2) 사람의 손에 의해 설계되고/되거나, 생산되고/되거나, 제조되고/되거나 제작된 물질 및/또는 엔티티를 포함한다. 단리된 물질 및/또는 엔티티는 초기에 연관되었던 다른 구성요소로부터 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99%초과로 분리될수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 제제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99%초과 순수하다. 실질적으로 다른 구성요소가 없는 경우에 물질은 "순수"하다. 일부 구현예에서, 당업자에게 이해될 것인 바와 같이, 물질은, 예를 들어, 하나 이상의 담체 또는 부형제(예를 들어, 완충액, 용매, 물, 등)과 같은 일정한다른 구성 요소와 조합된 후에도 여전히 "단리"되거나 심지어"순수"한 것으로 간주될 수 있는데; 이러한 구현예에서, 물질의 단리 또는 순도 백분율은 이러한 담체 또는 부형제를 포함하지 않고 계산된다. 하나의 실시예로서, 일부 구현예에서, 자연계에서 발생하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 생물학적 폴리머는: a) 파생의 기원 또는 근원이 자연계에서의 원래의 상태에서 동반되는 일부 또는 전체 구성요소와 연관되어 있지 않기 때문에; b) 자연계에서 이를 생산하는 종과 동일한 종의 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 실질적으로없는 경우; 또는 c) 자연계에서 이를 생산하는 종이 아닌 세포 또는 다른 발현 시스템으로부터의 구성 요소에 의해 발현되거나 아니면 이와 관련되면 "단리된" 것으로 간주된다. 따라서, 예를 들어, 일부 구현예에서, 화학적으로 합성되거나　자연계에서 폴리펩티드를 생산하는 세포 시스템과 상이한 세포 시스템에서 합성된 폴리펩티드는 "단리된" 폴리펩티드로 간주된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 하나 이상의 정제 기술의 대상이 되는 폴리펩티드는, a) 자연계에서 폴리펩티드와 연관되고/되거나 b) 초기에 생산될때 폴리펩티드와 연관되었던 다른 구성 요소로부터 분리되어 있는 한"단리된" 폴리펩티드로간주된다.
"비인간 동물"이라는 구절은 인간이 아닌 임의의 척추 동물 개체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 원구류, 경골어, 연골 어류(예를 들어, 상어 또는 가오리), 양서류, 파충류, 포유동물, 및 새이다. 일부 구현예에서, 비인간 포유동물은 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소, 또는 설치류이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 랫트 또는 마우스와 같은 설치류이다.
"핵산"이라는 구절은 올리고뉴클레오티드 사슬에 삽입되거나 삽입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 인산이에스테르 결합을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬에 삽입되거나 삽입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 문맥으로부터 명백해질 것인 바와 같이, 일부 구현예에서, "핵산"은 개별적인 핵산 잔기(예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 포함하되; 일부 구현예에서, "핵산"은 개별적인 핵산 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA이거나 이를 포함하고; 일부 구현예에서, "핵산"은 DNA이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 하나 이상의 자연적인 핵산 잔기이거나 이를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, "핵산"은 핵산 유사체이거나 이를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산 유사체는 인산이에스테르 골격을 활용하지 않는다는 점에서 "핵산"과 다르다. 예를 들어, 일부 구현예에서, "핵산"은 당해 분야에 알려지고 골격 내에 인산이에스테르 결합 대신 펩티드 결합을 가지는 하나 이상의 "펩티드 핵산"이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성되고, 본 발명의 범주 내인 것으로 간주된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, "핵산"은 인산이에스테르 결합보다는 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 5'-N-포스포라미디트 결합을 가진다. 일부 구현예에서, "핵산"은 하나 이상의 자연적인 뉴클레오시드(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘)이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다. 일부 구현예에서, "핵산"은 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데자아데노신, 7-데자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화 염기, 삽입 염기, 및 이의 조합)이거나, 이를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, "핵산"은 자연적인 핵산의 당과 비교하여 하나 이상의 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스)을 포함한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA 또는 단백질과 같은 기능적 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가진다. 일부 구현예에서, "핵산"은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 자연적인 근원으로부터의 하나 이상의 단리체, 상보적인 주형에 기반한 중합에 의한 효소적 합성(생체 내 또는 시험관 내), 재조합 세포 또는 시스템에서의 재생산, 및 화학적 합성에 의해 제조된다. 일부 구현예에서, "핵산"은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개 이상의 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, "핵산"은 단일 가닥이고; 일부 구현예에서, "핵산"은 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, "핵산"은 폴리펩티드를 암호화하는 서열에 상보적이거나 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 가진다. 일부 구현예에서, "핵산"은 효소적 활성을 가진다.
"작동가능하게연결된"이라는 구절은 기술된 구성 요소가 의도된 방식으로 기능하는 것을 허용하도록 하는 관계에 있는 병치를 포함한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된"　조절 서열은 코딩 서열의 발현이　조절 서열과 호환가능한 조건 하에 달성되도록 연결된다. "작동가능하게 연결된" 서열은 관심 있는 유전자에 인접한 발현 조절 서열 및 관심 있는 유전자를 조절하기 위해 일정한 거리에서 또는 트랜스로 작용하는 발현 조절 서열을 포함한다. "발현 조절 서열" 이라는 용어는 발현을 개시하고, 발현 조절 서열이　연결된 코딩 서열의 가공에 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. "발현　조절 서열"은 다음을 포함한다: 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닌화 신호와 같은 효율적인 RNA 가공 신호; 세포질 mRNA를 안정화하는 서열; 번역 효율을 증진하는 서열; 단백질 안정성을 증진하는 서열(즉, 코작 공통(Kozak consensus) 서열); 및 원하는 경우, 단백질 분비를 증진하는 서열. 이러한　조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 다르다. 예를 들어, 원핵생물에서, 이러한　조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합자리, 및 전사 종결 서열을 포함하는반면, 진핵생물에서, 통상적으로, 이러한　조절 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. "조절 서열"이라는 용어는 이의 존재가 발현 및 가공에 필수적인 구성 요소를 포함하는 것으로 의도되고 이의 존재가 유리한　추가적인 구성 요소, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열도 포함할 수 있다.
"환자" 또는 "대상체"라는 용어는, 예를 들어, 실험적, 진단적, 예방적, 미용적, 및/또는 치료적 목적으로제공된 임의의 조성물이 투여되거나 투여될 수 있는 임의의 유기체를　포함한다. 통상적인 환자는 동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 비인간 영장류, 및/또는 인간과 같은 포유동물)을 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 비인간 동물이다. 일부 구현예에서, 환자(예를 들어, 비인간 동물 환자)는 본원에 기술된 본원에 기술된 변형과는 다른 변형을 가질 수 있거나 변형을 가지지 않을 수 있다(즉, 야생형 비인간 동물 환자). 일부 구현예에서, 비인간 동물은 하나 이상의 장애 또는 병태로 고통받거나 이에 민감하다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 나타낸다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 하나 이상의 장애 또는 병태로 진단받았다.
"폴리펩티드"라는 용어는 아미노산의 임의의　폴리머 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 자연계에서 발생하는 아미노산 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 자연계에서 발생하지않는 아미노산 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서로 별개로 자연계에서 발생하는 부위(즉, 2종 이상의 상이한 유기체로부터, 예를 들어, 인간 및 비인간 부위)를 함유하는아미노산 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 사람의 손의 작용을 통해 설계되고/되거나 생산된 조작된 아미노산 서열을 가진다.
"재조합"이라는 용어는 숙주 세포 내에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 폴리펩티드, 재조합체, 조합 인간 폴리펩티드 라이브러리로부터 단리된 폴리펩티드(Hoogenboom H. R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., and Highsmith W. E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J. V., and Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., and Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), antibodies isolated from an animal (e.g., a mouse) that is transgenic for human immunoglobulin genes (see e.g., Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., and Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al. (2000) Immunology Today 21:364-370; Murphy, A.J., et al. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111(14):5153-5158참조) 또는 스플라이싱 선택 서열 요소와 서로 관련된 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 폴리펩티드와 같은 재조합 수단에 의해 설계되거나, 조작되거나, 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 폴리펩티드(예를 들어, 본원에 기술된 PD-1 폴리펩티드)를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 이러한 선택된 서열 요소는 자연계에서 발견된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 이러한 선택된 서열 요소는 인 실리코로 설계된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 이러한 선택된 서열 요소는, 예를 들어, 자연적 또는 합성 공급원으로부터의 알려진 서열 요소의 돌연변이 유발(예를 들어, 생체 내 또는 시험관 내)에 기인한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩티드는 관심있는　근원 유기체(예를 들어, 인간, 마우스, 등)의 게놈에서 발견되는 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, 재조합 폴리펩티드는 (예를 들어, 비인간 동물 내에서, 예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내) 돌연변이 유발로부터 기인한 아미노산 서열을 가져서, 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 폴리펩티드 서열로부터 기원하고 이와 관련되었지만 비인간 동물 생체 내의 게놈내에는 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
"교체"라는 용어는 숙주 유전좌위(예를 들어, 게놈 내)에서 발견되는 "교체된" 핵산 서열(예를 들어, 유전자)이 유전좌위로부터 제거되는 과정을 포함하며, 상이한 "교체" 핵산이 그 자리에 위치한다. 일부 구현예에서, 교체된 핵산 서열 및 교체 핵산 서열은 서로 비견할 만한데, 예를 들어, 이들은 서로 상동성이고/이거나 상응하는 요소(예를 들어, 단백질-코딩 요소, 조절 요소, 등)을 함유한다. 일부 구현예에서, 교체된 핵산 서열은 프로모터, 인핸서, 스플라이싱 공여 자리, 스플라이싱 수여 자리, 인트론, 엑손, 미번역 영역(UTR) 중 하나 이상을 포함한다; 일부 구현예에서, 교체 핵산 서열은 하나 이상의 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 교체 핵산 서열은 교체된 핵산 서열의 상동체이다. 일부 구현예에서, 교체 핵산 서열 교체된 서열의 오소로그이다. 일부 구현예에서, 교체 핵산 서열은 인간 핵산 서열이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 교체 핵산 서열이 인간 핵산 서열이거나 이를 포함하는 곳을 포함하여, 교체된 핵산 서열은 설치류 서열(예를 들어, 마우스 또는 랫트 서열)이거나 이를 포함한다. 이렇게 위치한 핵산 서열은 이렇게 위치한 서열을 수득하기 위해 사용된 근원 핵산 서열의 일부(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 5'- 또는 3'-미번역 영역, 등)인 하나 이상의 조절 서열을 포함할수 있다. 예를 들어, 다양한 구현예에서, 교체는 이렇게 위치한 핵산 서열(이종 서열을 포함함)로부터의 유전자 산물의 생산을 초래하지만, 내인성 서열의 발현을 초래하지 않는 내인성 서열의 이종 서열로의 치환이고; 교체는 내인성 서열(예를 들어, 내인성 게놈 서열은 PD-1 폴리펩티드를 암호화하고 DNA 단편은 하나 이상의 인간 PD-1 폴리펩티드를 암호화함)에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 유사한 기능을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열로의 내인성 게놈 서열의 치환이다. 다양한 구현예에서, 내인성 유전자 또는 이의 단편은 상응하는 인간 유전자 또는 이의 단편으로 교체된다. 상응하는 인간 유전자 또는 이의 단편은 교체된 내인성 유전자 또는 이의 단편의 오소로그이거나 구조 및/또는 기능에서 이와 실질적으로 유사하거나 이와 동일한 인간 유전자 또는 단편이다.
"프로그램화 세포 사멸 1 단백질"또는 "PD-1 단백질"이라는 구절은 T 세포 조절자의 CD28/CTLA-4 패밀리에 속하는 I형 막관통 단백질을 포함한다. PD-1 단백질의 단백질 구조는 세포외 아미노-말단 면역글로불린 V 도메인, 막관통 도메인 및 카복실-말단 세포내 꼬리(세포내 꼬리가 면역수용체 티로신-기반 저해 모티프(ITIM) 및 면역수용체 티로신-기반 전환 모티프를 함유함)를 포함한다. PD-1은 세포 표면에서 발현되고, B7 패밀리 면역-조절 리간드의 구성원인 PD-L1 및 PD-L2와 상호작용한다(Collins, M. et al.(2005) Genome Biol. 6:223). PD-1은, 그 중에서도, 활성화 T 세포, B 세포, 대식 세포, 단핵구, 비만 세포, 및 또한 다수의 종양에서 발현된다. PD-1은 면역 반응의 음성 조절, 특히, T 세포 반응의 음성 조절에 관련된 것으로 보인다. 예시로서, PD-1 단백질을 암호화하는 마우스 및 인간　　Pdcd1 유전자의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 도 8에 제공되어 있다. 본 개시를 읽는 당업자는 게놈 내 하나 이상의 내인성 Pdcd1 유전자(또는 전체)가 하나 이상의 이종 Pdcd1 유전자(예를 들어, 다형성 변이체, 서브타입 또는 돌연변이체, 다른 종으로부터의 유전자, 인간화 형태, 등)에 의해 교체될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
"PD-1을 발현하는 세포"는 PD-1 I형 막 단백질을 발현하는세포를 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1을 발현하는 세포는 PD-1 I형 막 단백질을 그 표면에 발현한다. 일부 구현예에서, PD-1 단백질은 세포-대-세포 상호작용을 매개하기에 충분한 양으로 세포의 표면에 발현된다. 예시적인 PD-1을 발현하는 세포는 B 세포, 대식 세포 및 T 세포를 포함한다. PD-1을 발현하는 세포는 면역 세포(예를 들어, T 및 B 세포)의 표면에 발현된 PD-1의 상호작용을통해 다양한 세포 과정을 조절하고 이러한 세포의 분화 및 운명을 결정하는 역할을 수행한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 비인간 동물의 하나 이상의 세포의 표면에 발현된 인간화 PD-1 단백질을 통해 (본원에 기술된) 다양한 세포 과정의 조절을 보여준다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 비인간 동물의 하나 이상의 세포의 표면에 발현된 인간화 PD-1 단백질을 통해 T 세포 수용체(TCR)를 통한 신호전달의 음성 조절을 보여준다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 비인간 동물의 하나 이상의 세포의 표면에 발현된 인간화 PD-1 단백질을 통해 면역 반응의 음성 조절을 보여준다.
"참조"라는 용어는 관심 있는 제제, 동물, 코호트, 개체, 군집, 시료, 서열 또는 값을 비교하는 표준 또는 대조 제제, 코호트, 개체, 군집, 시료, 서열 또는 값을 포함한다. 일부 구현예에서, 참조 제제, 코호트, 개체, 군집, 시료, 서열 또는 값은 관심 있는 제제, 코호트, 개체, 군집, 시료, 서열 또는 값의 시험 또는 결정과 실질적으로 동시에 시험하고/하거나 결정한다. 일부 구현예에서, 참조 제제, 코호트, 개체, 군집, 시료, 서열 또는 값은, 선택적으로 유형 매체 내에 내장된 역사적 참조이다. 일부 구현예에서, 참조는 대조군을 지칭할수 있다. 본원에서 사용된, "참조" "참조 동물"을 포함할 수 있다. "참조 동물"은 본원에 기술된 변형, 본원에 기술된 것과는 다른 변형울 가지거나 변형을 가지지 않을 수 있다(즉, 야생형 동물). 통상적으로, 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 참조 제제, 동물, 코호트, 개체, 군집, 시료, 서열 또는 값은 관심 있는 제제, 동물(예를 들어, 포유동물), 코호트, 개체, 군집, 시료, 서열 또는 값을 결정하거나 특성분석하기 위해 사용된 것과 비견할　만한　조건 하에 결정하거나 특성분석한다.
"실질적으로"라는 용어는 관심 있는 특성　또는 성질의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를나타내는 정성적인 조건을 포함한다. 생물학 분야의 숙련자는 생물학적 및 화학적 현상이, 설사, 완전하게 되고/되거나 완결하게 진행되거나 절대적 결과를 달성하거나 피하는 것이 드물다는 것을 이해할 것이다. "실질적으로"라는 용어는, 따라서, 본원에서 많은 생물학적 및 화학적 현상에서 유래된 완전성의 잠재적인 부족을 포착하는 것으로 사용된다.
"실질적 상동"라는 구절은 아미노산 또는 핵산 서열간의 비교를 포함한다. 당업자에 의해 이해될　것인 바와 같이, 2개의 서열은 일반적으로 상응하는 위치에 상동성 잔기를 함유하는경우 "실질적 상동"이라고 간주된다. 상동성 잔기는 동일한 잔기일 수 있다. 대안적으로, 상동성 잔기는 동일하지 않은 잔기일 수 있고 적절하게는 유사한 및/또는 기능적 특성을 가질 것이다. 예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 일정한 아미노산은 통상적으로 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산, 및/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄를 가지는 것으로 구분된다. 하나의 아미노산의 동일한 유형의 다른 것으로의 치환은 종종 "상동성" 치환으로 간주된다. 통상적인 아미노산 분류가 표 1 및 2에 요약되어 있다.
당해 분야에 잘 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오티드 서열에 대한 BLASTN 및 아미노산 서열에 대한 BLASTP, 갭 BLAST,및 PSI-BLAST와 같이 상업적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램을 포함하는다양한 임의의 알고리즘을 사용하여 비교할 수 있다. 예시적인 이러한 프로그램은문헌(Altschulet al. (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschulet al. (1997) Methods in Enzymology;Altschul et al., "Gapped BLAST　and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis et al. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; and　Miseneret al. (eds.)(1999) Bioinformatics Methods Protocols(Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press)에 기술되어 있다. 상동성 서열을 확인하는것에 추가하여, 전술된 프로그램은 통상적으로 상동성의 정도의 지표를 제공한다. 일부 구현예에서, 2개의 서열은 잔기의 관련 구간에 걸쳐 상응하는 잔기가 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상이 상동성인 경우 실질적으로 상동성인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 관련 구간은 완전한 서열이다. 일부 구현예에서, 관련 구간은 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 이상의 잔기이다. 일부 구현예에서, 관련 구간은 완전한 서열을 따르는 인접 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 관련 구간은 완전한 서열을 따르는　불연속　잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 관련 구간은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35,40, 45, 50개 이상의 잔기이다.
"실질적 동일성"라는 구절은 아미노산 또는 핵산 서열간의 비교를 포함한다. 당업자에 의해 이해될　것인 바와 같이, 2개의 서열은 일반적으로 상응하는 위치에 동일한 잔기를 함유하는경우 "실질적으로 동일"하다고 간주된다. 당해 분야에 잘 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오티드 서열에 대한 BLASTN 및 아미노산 서열에 대한 BLASTP, 갭 BLAST,및 PSI-BLAST와 같이 상업적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램을 포함하는다양한 임의의 알고리즘을 사용하여 비교할 수 있다. 예시적인 이러한 프로그램은문헌(Altschulet al. (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul et al., Methods in Enzymology; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis et al. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; and Misener et al., (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press)에 기술되어 있다. 동일한 서열을 확인하는것에 추가하여, 전술된 프로그램은 통상적으로 동일성의 정도의 지표를 제공한다. 일부 구현예에서, 2개의 서열은 잔기의 관련 구간에 걸쳐 상응하는 잔기가 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상이　동일한 경우 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 관련 구간은 완전한 서열이다. 일부 구현예에서, 관련 구간은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35,40, 45, 50개 이상의 잔기이다.
"표적화 벡터"또는 "표적화 구조체"라는 용어는 표적 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 표적 영역은 표적 세포, 조직 또는 동물 내 서열에 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하고 상동성 재조합을 통해 세포, 조직 또는 동물의 게놈 내 위치에 표적 구조체의 삽입을 제공한다 표적이 위치 특이적 재조합효소 인식 자리(예를 들어, loxP 또는 Frt 자리)를 이용하는 표적 영역도 또한 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 표적화 구조체는 특히 관심 있는 핵산 서열 또는 유전자, 선택가능한 마커, 제어 및 또는 조절 서열, 및 이러한 서열과 관련된 재조합을 돕거나 촉진하는 단백질의 외인성 첨가를 통해 매개되는 재조합을 가능하게하는 다른 핵산 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 표적화 구조체는, 전체적 또는 부분적으로, 관심 있는 유전자를 더 포함하되, 관심 있는 유전자는 내인성 서열에 의해 암호화된 단백질과 유사한 기능을 가지는 단백질을 전체적 또는 부분적으로 암호화하는 이종 유전자이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 표적화 구조체는, 전체적 또는 부분적으로, 관심 있는 인간화 유전자를 더 포함하되, 관심 있는 인간화 유전자는 내인성 서열에 의해 암호화된 단백질과 유사한 기능을 가지는 단백질을 전체적 또는 부분적으로 암호화한다.
"치료적으로 유효한 양"이라는 구절은 투여되는 것에서 원하는 효과를 생산하는 양을 포함한다. 일부 구현예에서,　 이러한 용어는 치료적 투여 계획에 따라　질환, 장애, 및/또는 병태로 고통받고 있거나 이에 민감한 대상체(예를 들어, 동물)에 투여될 때 질환, 장애, 및/또는 병태를 치료하기에 충분한 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료적으로 유효한 양은 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상의 유발 및 이의 중증도를 감소시키고/감소시키거나 발병을 지연시키는 양이다. 당업자는 "치료적으로 유효한 양"이라는 용어는, 사실상, 특정한 개체에서 달성되는 성공적인 치료를 필요로 하는 것이 아니라는 것을 이해할 것이다. 그보다, 치료적으로 유효한 양은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에 투여될 때 대상체 중 유의한 수에서 특정한 원하는 약리학적 반응을 제공하는 양일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료적으로 유효한 양에 대한 언급은 하나 이상의 특정 조직(예를 들어, 질환, 장애 또는 병태에 의해 영향 받는 조직) 또는 유체(예를 들어, 혈액, 침, 혈청, 땀, 눈물, 소변, 등)에서 측정된 양에 대한 언급일 수 있다. 당업자는, 일부 구현예에서, 특정한 제제 또는 치료법의 치료적으로 유효한 양은 단일 용량으로 제형화되고/되거나 투여될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 치료적으로 유효한 제제는 복수의 용량, 예를 들어, 투여 계획의 일부로서 제형화되고/되거나 투여될 수 있다.
"치료"(또한 "치료하다" 또는 "치료하는")이라는 용어는, 가장 넓은 의미에서, 특정한 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징, 및/또는 원인을 부분적으로 또는 완전히 완화하고/하거나 개선하고/하거나 해소하고/하거나 저해하고/하거나 발병을 지연시키고/시키거나　 중증도를 감소시키고/시키거나 유발을 감소시키는 물질(예를 들어, 제공된 조성물)의 임의의 투여를포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 징후를나타내지 않는 대상체에게 투여될 수 있고/있거나 질환, 장애, 및/또는 병태의 초기 징후만을 나타내는 대상체에게 도움이 될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 치료는 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 확립된 징후를 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 관련 질환, 장애, 및/또는 병태로 고통받는 것으로 진단된 대상체에게 도움이 될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 관련 질환, 장애, 및/또는 병태의 발달의 위험의 증가와 통계적으로 상호관련된 하나 이상의 감수성 인자를 가지는 것으로 알려진 대상체에게 도움이 될 수 있다.
"변이체"라는 용어는 참조 엔티티와 유의한 구조적 동일성을 보이지만, 참조 엔티티와 비교하여 하나 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 수준에서 참조 엔티티와 구조적으로 상이한 엔티티를 포함한다. 많은 구현예에서, "변이체"는 또한 참조 엔티티와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정한 엔티티가 참조 엔티티의 "변이체"로 간주되는 것이 적절한지는 참조 엔티티와의 구조적 동일성의 정도에 기반한다. 당업자에게 이해될 것인 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 엔티티는 특정한 특징적인 구조적 요소를 가진다. "변이체"는, 정의에 의해, 하나 이상의 이러한 특징적 구조적 요소를 공유하는 상이한 화학적 엔티티이다. 소수의 실시예로서, 소분자는 특징적인 코어 구조적 요소(예를 들어, 거대고리 코어)　 및/또는 하나 이상의 특징적인 팬턴트 모이어티를 가질 수 있어서 소분자의 변이체는 코어 구조적 요소 및 특징적인 팬던트 모이어티를 공유하지만 다른 팬던트 모이어티 및/또는 코어 내 존재하는 결합의 유형(단일 대 이중, E 대 Z, 등)이 다른 것이고, 폴리펩티드는 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해　지정된 위치를 가지고/가지거나 특정한 생물학적 기능에 기여하는 복수의 아미노산으로 이루어진 특징적인 서열 요소를 가질 수 있고, 핵산은 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 가지는 복수의 뉴클레오티드 잔기로 이루어진 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다. 예를 들어, "변이체 폴리펩티드"는 아미노산 서열에서의 하나 이상의 차이 및/또는 폴리펩티드 골격에 공유부착된 화학적 모이어티(예를 들어, 탄수화물, 지질, 등) 에서의 하나 이상의 차이의 결과로서 참조 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, "변이체 폴리펩티드"는 참조 폴리펩티드와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 또는 99%인 전체 서열 동일성을 보인다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, "변이체 폴리펩티드"는 참조 폴리펩티드와 적어도 하나의 특징적인 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 구현예에서, 참조 폴리펩티드는 하나 이상의 생물학적 활성을 가진다. 일부 구현예에서, "변이체 폴리펩티드"는　 참조 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 공유한다. 일부 구현예에서, "변이체 폴리펩티드"는 참조 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, "변이체 폴리펩티드"는 참조 폴리펩티드와 비교하여　하나 이상의 생물학적 활성의 수준의 감소를 나타낸다. 많은 구현예에서, 관심 있는 폴리펩티드는 관심 있는 폴리펩티드가 모체의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지지만 특정한 위치에 소수의 서열 변경을 가지는 경우 모 또는 참조 폴리펩티드의"변이체"인 것으로 간주된다. 통상적으로, 변이체 내 잔기의 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만이 모체와 비교하여 치환된다. 일부 구현예에서, "변이체"는 모체와 비교하여 10,9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 치환된 잔기를 가진다. 종종, "변이체"는 매우 적은 수(예를 들어, 5, 4, 3, 2, 또는 1 미만)의 수의 치환된 기능적 잔기(즉, 특정한 생물학적 활성에 참여하는 잔기)를 가진다. 나아가, "변이체"는 통상적으로 모체와 비교하여 5, 4, 3, 2, 또는 1개를 넘지 않는 첨가 또는 결실을 가지고 종종 첨가 또는 결실을 가지지않는다. 더욱이, 임의의 첨가 또는 결실은, 통상적으로 약 25, 약 20, 약 19, 약 18, 약 17, 약 16, 약 15, 약 14, 약 13, 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6개 미만이고, 일반적으로 약 5, 약 4, 약 3, 또는 약 2개의 잔기 미만이다. 일부 구현예에서, 모 또는 참조 폴리펩티드는자연계에서 발견되는 것이다. 당업자에게 이해될 것인 바와 같이, 관심 있는 특정한 폴리펩티드의 복수의 변이체는 관심 있는 폴리펩티드가 특히 감염성 제제 폴리펩티드인 경우 자연계에서 흔히 발견될 수 있다.
"벡터"라는 용어는 결합된 다른 핵산을 이송할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 진핵 및/또는 원핵세포와 같은 벡터가 결합된 숙주 세포에서 염색체외 복제 및/또는 핵산을 발현　시킬수 있다. 작동가능하게 결합된 유전자의 발현을 유도할 수 있는 벡터를 본원에서 "발현 벡터"로 지칭한다.
"야생형"이라는 용어는 "정상"(돌연변이, 질환, 변형, 등과 대조됨) 상태 또는 맥락에서 자연계에서 발견되는 것과 동일한 구조 및/또는 활성을 가지는 엔티티를 포함한다. 당업자는 야생형 유전자 및 폴리펩티드는 다수의 상이한 형태(예를 들어, 대립형질)로 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
특정　구현예의 상세한 설명
본 발명은, 다른 것 중에서도, 암의 치료를 위한 Pdcd1 조절제(예를 들어, 항PD-1 항체)의 치료적 효능을 결정하기 위해 프로그램화 세포 사멸 1(Pdcd1) 유전자를 암호화하는 인간화 유전 물질을 가지는 개선되고/되거나 조작된 비인간 동물을 제공하고, T 세포 반응 및 신호 전달을 검정한다. 이러한 비인간 동물은 PD-1 조절제의 치료적 효능 및 PD-1 차단에 대한 가능성을 결정하는 데에서 개선을 제공하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 　다양한 암의 치료뿐 아니라 비인간 동물에서 바이러스 감염을 치료하고/하거나 제거하기 위한 면역 반응을 증강시키기 위한 항PD-1 치료요법의 개발에 특히 유용하다. 특히, 본 발명은 비인간 동물의 세포의 표면의 인간화 PD-1 단백질의 발현을 초래하는 쥣과 동물 Pdcd1 유전자의 인간화를 포함한다. 이러한 인간화 PD-1 단백질은 항종양 면역 반응을 촉진하기 위한 항PD-1 치료제 효능을 결정하기위한 인간 PD-1+　세포의 원천을 제공하는 능력을 가진다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 비인간 동물의 세포의 표면에 발현된 인간화 PD-1 단백질을 통한 PD-1 신호전달의 차단을 통해 증강된 면역 반응을 나타낸다. 일부 구현예에서, 인간화 PD-1 단백질은, 전체적 또는 부분적으로, 인간 PD-1 단백질의 N-말단 면역글로불린 V 도메인에　상응하는　서열을 가진다. 일부 구현예에서, 인간화 PD-1 단백질은 쥣과 동물 PD-1 단백질의 세포내 꼬리에 상응하는 서열; 일부 구현예에서, 쥣과 동물 PD-1 단백질의 막관통 도메인 및 세포내 꼬리에 상응하는 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 인간화 PD-1 단백질은 인간 PD-1 단백질의 아미노산 잔기 21~170(또는 26~169, 27~169, 또는 27~145, 또는 35~145)에 상응하는 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 비인간 동물 및 이종 종(예를 들어, 인간)으로부터의 유전적 물질을 함유하는 내인성 Pdcd1 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간화 Pdcd1 유전자를 포함하되, 인간화 Pdcd1 유전자는 인간 PDCD1 유전자의 엑손 2 및 엑손 3을 전체적 또는 부분적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간화 Pdcd1 유전자를 포함하되, 인간화 Pdcd1 유전자는 인간 PDCD1유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 처음 71 bp (즉, 줄기를 암호화함)에 상응하는 883 bp의인간PDCD1 유전자를 포함한다.
본 발명의 다양한 양태는 다음의 섹션에서 상세히 설명된다. 섹션의 용도는 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 각각의 섹션은 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있다. 본 출원에서,"또는"의 사용은 다르게 지시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다.
프로그램화 세포 사멸 1(Pdcd1) 유전자
Pdcd1(또한 CD279로도 지칭됨)은 원래 아폽토시스를 거치는 T 세포 하이브리도마 내 상향조절된 유전자로 발견되었다(Ishida, Y. et al.(1992)EMBO J. 11(11):3887-3895). Pdcd1 유전자는 N-말단 면역글로불린 V(IgV) 도메인, 줄기(길이가 약 20 아미노산), 막관통 도메인, 및 면역수용체 티로신 저해 모티프(ITIM) 및 면역수용체 티로신 전환 모티프(ITSM)를 함유하는 세포내 꼬리를 포함하는 I형 막 단백질(PD-1으로 지칭됨)인 PD-1을 암호화하는5개의 엑손으로 이루어진다. PD-1은, 예를 들어, B 세포, 수지상 세포, 활성화 단핵구, 자연 살상(NK) 세포 및 활성화 T 세포와 같은 많은 세포 유형에서 발현된다(Keir, M.E., et al.(2008)Annu. Rev. Immunol. 26:677-704) PD-1의 다양한 스플라이싱 변이체도 또한 보고되어 있고, 어떤 엑손이 결여되었는지에 따라 다양하다(Nielsen, C. et al.(2005) Cell. Immunol. 235:109-116). 즉, 일정한 스플라이싱 변이체는 자가면역 질환의 원인 인자로서 관찰된다(Wan,B. et al.(2006) J. Immunol. 177(12):8844-8850). 또한, Pdcd1 결핍 마우스에서도 자가면역 병태가 발달하는것으로 보고되어 있는데(Nishimura,H. et al.(1998) Intern. Immunol. 10(10):1563-1572; Nishimura, H. et al.(1999) Immunity 11:141-151; Nishimura, H.et al.(2001) Science 291:319-322), 이는 활성화된 림프구의 음성 조절자로서 PD-1을 견고히 하는것을 야기하고, 자가면역 질환의 발달로부터 보호하는 역할을 수행한다. 흥미롭게도, 종양이 면역계의 감시를 회피하기 위해 PD-1 신호전달을 사용하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, PD-1 및 적어도 하나의 PD-1의 리간드(즉, PD-L1)는 종양 미세환경에서 PD-1 차단을 통한 항종양 활성의 촉진에 의한 암 치료법을 위한 표적으로서 현재 탐색되고 있다(예를 들어, Pedoeem, A. et al.(2014)Clin. Immunol. 153:145-152; and Philips, G.K. and Atkins, M.(2014) Intern.Immunol. 8 pages 참조).
PD-1 매개 기능 및 PD-1 경로의 더욱 완전하고 상세한 이해는 향후 암 치료를 위한 실질적으로표적화된 치료요법을 개발하기 위해 필요하다.
Pdcd1 및 PD-1 서열
예시적인 쥣과 동물, 인간 및 인간화 Pdcd1 및 PD-1 서열이 도 8에 기재되어 있다. 비인간 Pdcd1 유전자의 인간화를 위한 예시적인 인간 핵산 서열도 또한 도 8에 기재되어 있다.
인간화 Pdcd1비인간 동물
비인간 동물의 세포의 표면에 인간화 PD-1 단백질을 발현하여 PD-1 단백질을 암호화하는비인간 동물의 내인성 유전좌위(예를 들어, Pdcd1 유전좌위)의 유전적 변형을초래하는 비인간 동물이 제공된다. 본원에 기술된 적합한 실시예는 설치류, 특히, 마우스를 포함한다.
인간화 Pdcd1 유전자는, 일부 구현예에서, 이종 종(예를 들어, 인간)으로부터의 유전적 물질을 포함하되, 인간화 Pdcd1 유전자는 이종 종으로부터의 유전적 물질의 암호화된 부위를 포함하는 PD-1 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 인간화된 Pdcd1 유전자는 세포의 원형질막 상에 발현된 PD-1 단백질의 세포외 부위를 암호화하는 이종 종의 게놈 DNA를 포함한다. 상기 인간화 Pdcd1 유전자를 함유하는 비인간 동물, 비인간 배아, 및 세포를 제조하기 위한 비인간 동물, 배아, 세포 및 표적화 구조체도 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 내인성 Pdcd1 유전자가 결실된다. 일부 구현예에서, 내인성 Pdcd1 유전자가 변경되되, 내인성 Pdcd1 유전자의 일부는 이종 서열(예를 들어, 전체적 또는 부분적으로 인간 PDCD1 서열)으로 교체된다. 일부 구현예에서, 전체 또는 실질적으로 전체의 내인성 Pdcd1 유전자는 이종 유전자(예를 들어, 인간 PDCD1 유전자)로 교체된다. 일부 구현예에서, 이종 Pdcd1 유전자의 일부는 내인성 Pdcd1 유전좌위에서 내인성 비인간 Pdcd1 유전자로 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종 유전자는 인간 유전자이다. 일부 구현예에서, 변형 또는 인간화는 내인성 Pdcd1 유전자의 두 개의 카피 중 하나를 만들어서, 인간화 Pdcd1 유전자에 대해 이형접합체인 비인간 동물을 생성한다. 다른 구현예에서, 인간화 Pdcd1 유전자에 대하여 동형접합성인 비인간 동물이 제공된다.
다양한 양태에서, 비인간 동물은 내인성 비인간 Pdcd1 유전좌위에서 전체적 또는 부분적으로 인간 PDCD1 유전자를 함유한다. 따라서, 이러한 비인간 동물은 이종 Pdcd1 유전자를 가지는 것으로 기술될 수 있다. 내인성 Pdcd1 유전좌위에서 교체, 삽입, 변형 또는 변경된 Pdcd1 유전자 또는 이러한 유전자로부터 발현된 단백질은, 예를 들어, PCR, 웨스턴 블랏, 서던 블랏, 제한 단편 길이 다형성(RFLP), 또는 대립형질의 획득 또는 소실 검정을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 인간화 Pdcd1 유전자에 대하여 이형접합체이다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 Pdcd1 유전자는 도 8의 인간 PDCD1 유전자에 나타나는 제2 엑손에 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 서열을 가지는 제2 엑손을 가지는 Pdcd1 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 Pdcd1 유전자는 도 8의 인간 PDCD1 유전자에 나타나는 제2 엑손에 실질적으로 동일한 서열을 가지는 제2 엑손을 가지는 Pdcd1 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 Pdcd1 유전자는 도 8의 인간 PDCD1 유전자에 나타나는 제2 엑손과 동일한 서열을 가지는 제2 엑손을 가지는 Pdcd1 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 Pdcd1 유전자는 도 8의 인간화 PDCD1 mRNA 서열에 나타나는 제3 엑손에 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 서열을 가지는 제3 엑손을 가지는 Pdcd1 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 Pdcd1 유전자는 도 8의 인간화 PDCD1 mRNA 서열에 나타나는 제3 엑손에 실질적으로 동일한 서열을 가지는 제3 엑손을 가지는 Pdcd1 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 Pdcd1 유전자는 도 8의 인간화 PDCD1 mRNA 서열에 나타나는 제3 엑손과 동일한 서열을 가지는 제3 엑손을 가지는 Pdcd1 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 Pdcd1 유전자는 서열 번호21 또는 서열 번호 23에 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 서열을 포함하는 Pdcd1 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 Pdcd1 유전자는 서열 번호 21 또는 서열 번호 23에 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 Pdcd1 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 Pdcd1 유전자는 서열 번호 21 또는 서열 번호 23과 동일한 서열을 포함하는 Pdcd1 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 Pdcd1 유전자는 도 8의 인간 PDCD1 유전자에 나타나는 제2 엑손 및 제3 엑손의 일부와 각각 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 제2 엑손 및 제3 엑손의 일부를 가지는 Pdcd1 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 Pdcd1 유전자는 도 8의　마우스 PDCD1 유전자에 나타나는 제1, 제4 및 제5 엑손에 각각 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 서열을 가지는 제1, 제4 및 제5 엑손을 가지는 Pdcd1 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 Pdcd1 유전자는 도 8의마우스 Pdcd1 유전자에 나타나는 제1, 제3의 일부, 제4　및 제5 엑손에 각각 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 서열을 가지는 제1, 제3의 일부, 제4 및 제5 엑손을 가지는 Pdcd1 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 Pdcd1 유전자는 도 8의 마우스 Pdcd1 유전자에 나타나는 5' 미번역 영역 및 3' 미번역 영역에 각각 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%,75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)동일한 서열을 가지는 5' 미번역 영역 및 3' 미번역 영역을 가지는 Pdcd1 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 Pdcd1 유전자는 도 8의 인간화 PDCD1 뉴클레오티드 코딩 서열에 나타나는 뉴클레오티드 코딩 서열과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 뉴클레오티드 코딩 서열을 가지는 Pdcd1 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 Pdcd1 mRNA 서열은　도 8에 나타난　인간화 PDCD1 mRNA 서열과 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 Pdcd1 유전자는 도 8의　 PD-1 폴리펩티드 서열에 나타난 아미노산 서열과　적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 아미노산 서열을 가지는 PD-1 폴리펩티드를 암호화한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 도 8에 나타낸 인간 PD-1 단백질의 세포외 부위에 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 아미노산 서열을 가지는 세포외 부위를 가진다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 세포외 부위를 가지는데, 이러한 세포외 부위는 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 21~170에 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 세포외 부위를 가지는데, 이러한 세포외 부위는 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 21~170에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 세포외 부위를 가지는데, 이러한 세포외 부위는 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 21~170과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 세포외 부위를 가지는데, 이러한 세포외 부위는 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 26~169에 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 세포외 부위를 가지는데, 이러한 세포외 부위는 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 26~169에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 세포외 부위를 가지는데, 이러한 세포외 부위는 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 26~169와 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 세포외 부위를 가지는데, 이러한 세포외 부위는 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 27~169에 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 세포외 부위를 가지는데, 이러한 세포외 부위는 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 27~169에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 세포외 부위를 가지는데, 이러한 세포외 부위는 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 27~169와 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 세포외 부위를 가지는데, 이러한 세포외 부위는 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 27~145에 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 세포외 부위를 가지는데, 이러한 세포외 부위는 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 27~145에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 세포외 부위를 가지는데, 이러한 세포외 부위는 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 27~145와 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 세포외 부위를 가지는데, 이러한 세포외 부위는 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 37~145에 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 세포외 부위를 가지는데, 이러한 세포외 부위는 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 35~145에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 세포외 부위를 가지는데, 이러한 세포외 부위는 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 35~145와 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 도 8에 나타낸 인간 또는 인간화 PD-1 단백질의 N-말단 면역글로불린 V 도메인에 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 아미노산 서열을 가지는 N-말단 면역글로불린 V 도메인을 가진다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타낸 N-말단 면역글로불린 V 도메인과 실질적으로　동일한 아미노산 서열을 가지는 N-말단 면역글로불린 V 도메인을 가진다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 도 8의 인간 또는 인간화 PD-1 단백질에 나타낸 N-말단 면역글로불린 V 도메인과 동일한 아미노산 서열을 가지는 N-말단 면역글로불린 V 도메인을 가진다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 도 8에 나타낸　마우스 PD-1 단백질의 막관통 도메인에 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 서열을 가지는 막관통 도메인을 가진다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 도 8에 나타낸 마우스 PD-1 단백질의 세포내 꼬리에 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 서열을 가지는 세포내 꼬리를 가진다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 도 8의 인간 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 21~169(또는 26~169)에 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 아미노산 서열을 가진다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 도 8의 인간 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 21~169(또는 26~169)에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 도 8의 인간 PD-1 단백질에 나타난 아미노산 잔기 21~169(또는 26~169)와 동일한 아미노산 서열을 가진다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 도 8에 나타낸　인간 PD-1 단백질의 아미노산 잔기에 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 동일한 아미노산 서열을 가진다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 도 8에 나타낸　인간 PD-1 단백질의 아미노산 서열에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 의해 생산된 인간화 PD-1 단백질은 도 8에 나타낸 인간화 PD-1 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가진다.
인간 프로모터 및 인간 조절 서열로부터 이러한 단백질을 발현하는비인간 동물을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 포함하는,특이적 다형성 형태, 대립형질 변이체(예를 들어, 단일 아미노산 차이) 또는 대안적 스플라이싱 이소형을 포함하는, 인간화 PD-1 단백질을 발현하는 비인간 동물을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 내인성 프로모터 및 내인성 조절 서열로부터 이러한 단백질을 발현하는 비인간 동물을 제조하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 일부　특정 구현예에서, 내인성 프로모터 및 내인성 조절 서열은 내인성 설치류 프로모터 및 내인성 설치류 조절 서열이다. 이러한 방법은 전체적 또는 부분적으로 인간 PD-1 단백질을 암호화하는 유전적 물질을 내인성 Pdcd1 유전자에 상응하는 비인간 동물의 게놈 내 정확한 위치에 삽입하여 전체적 또는 부분적으로 인간인 PD-1 단백질을 발현하는 인간화 Pdcd1 유전자를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은, 전체적 또는 부분적으로, 인간 PDCD1 유전자의 엑손 2 및 엑손 3에 상응하는 게놈 DNA를 비인간 동물의 내인성 Pdcd1 유전자에 삽입함으로써 삽입된 엑손에 의해 암호화된 아미노산을 함유하는 인간 부위를 함유하는 PD-1 단백질을 암호화하는 인간화 유전자를 생성하는 단계를 포함한다.
적절한 경우, 전체적 또는 부분적으로 인간(또는 인간화) PD-1 단백질을 암호화하는 유전적 물질 또는 폴리뉴클레오티드 서열(들)의 코딩 영역은 비인간 동물(예를 들어, 미국 특허 번호 5,670,356 및 5,874,304 참조) 내 세포로부터의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하도록 변형될 수 있다. 코돈 최적화 서열은 합성 서열이고, 바람직하게는 코돈 최적화되지 않은 모 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 동일한 폴리펩티드(또는 전장 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 가지는 전장 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 단편)를 암호화한다. 일부 구현예에서, 전체적 또는 부분적으로 인간(또는 인간화) PD-1 단백질을 암호화하는 유전적 물질의 코딩 영역은, 특정한 세포 유형(예를 들어, 설치류 세포)을 위해 코돈 사용을 최적화하기 위해 변경된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비인간 동물(예를 들어, 설치류)의 내인성 Pdcd1 유전자 내로 삽입되는 인간 PDCD1 유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 일부(예를 들어, 71 bp)에 상응하는 게놈 DNA의 코돈은 비인간 동물의 세포 내 발현을 위해 최적화될수 있다. 이러한 서열은 코돈 최적화 서열로 기술될 수 있다.
인간화 Pdcd1 유전자 접근법은 내인성 유전자의 상대적으로 최소의 변형을 채용하고, 비인간 동물 내 자연적인 PD-1 매개 신호 전달을 초래하는데, 다양한 구현예에서, Pdcd1 서열의 게놈 서열이 단일 단편에서 변형되기 때문에, 이에 따라 필수 조절 서열을 포함함으로써 정상적인 기능성을 보유한다. 따라서, 이러한 구현예에서, Pdcd1 유전자 변형은 다른 주위 유전자 또는 다른 내인성 Pdcd1-상호작용 유전자(예를 들어, PD-L1, PD-L2, 등)에 영향을 미치지 않는다. 더욱이, 다양한 구현예에서, 변형은 세포 막 상 기능적 PD-1 막관통 단백질의 조립에 영향을미치지 않고, 변형에 의해 영향을 받지 않은 단백질의 세포질 부위의 순차적인 신호 전달 및 결합을 통해 정상적인 효과기 기능을 유지한다.
내인성 쥣과 동물 Pdcd1 유전자 및 인간 Pdcd1 유전자의 게놈 조직의 개략도(일정한 비율 아님)가 도 1에 제공된다. 인간 PDCD1 유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 일부를 함유하는 게놈 단편을 사용한 내인성 쥣과 동물 Pdcd1　유전자를 인간화하기 위한 예시적인 방법이 도 2에 제공된다. 예시된 바와 같이, 인간 PDCD1 유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 일부(예를 들어, 처음 71 bp)를 함유하는883 bp 게놈 DNA 단편이 표적화 구조체에 의해 내인성 쥣과 동물 PDCD1 유전자 유전좌위의 900 bp 서열의 자리에 삽입된다. 883 bp 인간 DNA 단편은 인간 DNA로부터 직접적으로 클로닝되거나 근원 서열(예를 들어, Genbank 접근 번호 NM_005018.2)로부터 합성될수 있다. 이러한 게놈 DNA는 리간드 결합을 담당하는인간 PD-1 단백질의 세포외 부위의 실질적으로 전체(예를 들어, 아미노산 잔기 27~169또는 26~169)를 암호화하는 유전자의 부위를 포함한다.
내인성 Pdcd1 유전좌위에서 인간화 Pdcd1 유전자를 가지는 비인간 동물(예를 들어, 마우스)은 당해 분야에알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 선택가능한 마커 유전자를 가지는 인간 Pdcd1 유전자를 전체적 또는 부분적으로 도입하는 표적화 벡터가 제조될 수 있다. 도 2는 인간 PDCD1 유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 처음 71 bp를 포함하는883bp 인간 DNA 단편의 삽입을 포함하는,마우스 게놈의 내인성 Pdcd1 유전좌위를 함유하는 표적화 벡터를 예시한 것이다. 예시된 바와 같이, 표적화 구조체는 약물 선택 카세트(예를 들어, loxP 서열 양쪽 옆의 네오마이신 내성 유전자; 약 5 Kb)가 뒤따르는 내인성 쥣과 동물 Pdcd1 유전자의 엑손 2의 상류의 서열(약 61.7 Kb)을 함유하는 5' 상동 암(arm), 인간 Pdcd1 유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 처음 71 bp를 함유하는게놈 DNA 단편(883 bp), 및 내인성 쥣과 동물 엑손 3의 남은 서열(즉, PD-1 단백질의 막관통 부위를 암호화하는 부위), 내인성 쥣과 동물 Pdcd1 유전자의 엑손 4 및 엑손 5를 함유하는 3' 상동 암(약 84 Kb)을 함유한다. 표적화 구조체는 자가 삭제 약물 선택 카세트(예를 들어, loxP 서열 옆의 네오마이신 내성 유전자; 모두 참조로서 본원에 포함된 미국 특허 번호 8,697,851, 8,518,392 및 8,354,389 참조)를 함유한다. 배아 줄기 세포의 전기천공 시, 900 bp의 내인성 야생형 Pdcd1 유전자를 표적화 벡터에 함유된 883 bp의인간 PDCD1 유전자(즉, 엑손 2 및 엑손 3의 처음 71 bp)로 교환하는 변형된 내인성 Pdcd1 유전자가 생성된다. 883 bp 인간 DNA 단편(즉, 인간 PDCD1 유전자의 엑손 2 및 71 bp의 엑손 3)에 의해 암호화된 아미노산을 함유하는 인간화 PD-1 단백질을 발현하는세포 또는 비인간 동물을 초래하는 인간화 Pdcd1 유전자가 생성된다. 약물 선택 카세트는 발달 의존 방식으로 제거되는데, , 즉, 생식계열 세포가 전술된 인간화 Pdcd1 유전자를 함유하는 마우스로부터 유래된 자손이 발달 중에 분화된세포로부터 선택가능한 마커를 분쇄할 것이다(도 2의 하단 참조).
마우스에서 인간화 Pdcd1 유전자를 채용한 구현예(즉, 인간 부위 및 마우스 부위를 포함하는 PD-1 단백질을 암호화하는Pdcd1 유전자를 가지는 마우스)가 본원에서집중적으로 논의되지만, 인간화 Pdcd1 유전자를 포함하는 다른 비인간 동물도 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 이러한 비인간 동물은 설치류 Pdcd1 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간화 Pdcd1 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 비인간 동물은 내인성 Pdcd1 프로모터에; 일부 구현예에서, 내인성 설치류 Pdcd1 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간화 Pdcd1 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 비인간 동물은 내인성 유전좌위로부터 인간화 PD-1단백질을 발현하되, 인간화 PD-1 단백질은 인간 PD-1 단백질의 아미노산 잔기 21~170(또는26~169, 또는 27~169, 27~145 또는 35~145)을 포함한다. 이러한 비인간 동물은, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 돼지, 소(예를 들어, 젖소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 흰담비, 영장류(예를 들어, 마모셋, 붉은털 원숭이), 등을 포함하는 본원에 개시된 PD-1 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있는 임의의 동물을 포함한다. 예를 들어, 적합하게 유전적으로 변형가능한 ES 세포가 쉽게 입수가능하지 않은 이러한 비인간 동물의 경우, 유전적 변형을 포함하는 비인간 동물을 제조하기위한 다른 방법이 채용된다. 이러한 방법은, 예를 들어, 비ES 세포 게놈(예를 들어, 섬유아세포 또는 유도 다능성 세포)을 변형하는 단계 및 적합한 세포, 예를 들어, 핵이 없는 난모세포에 유전적으로 변형된 게놈을 전달하기 위해 체세포 핵 전달(SCNT)을 채용하는 단계, 및 변형된 세포(예를 들어, 변형된 난모세포)를 배아를 형성하기에 적합한 조건 하에 비인간 동물에 잉태시키는 단계를 포함한다.
비인간 동물 게놈(예를 들어, 돼지, 젖소, 설치류, 닭, 등 게놈)을 변형하기 위한 방법은, 예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 전사 활성인자 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)를 채용하여게놈이 인간화 Pdcd1 유전자를 포함하도록 변형시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 포유동물이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은, 예를 들어, 뛰는쥐과(Dipodoidea) 또는 쥐상목(Muroidea) 슈퍼패밀리의 작은 포유동물이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 동물은 설치류이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 설치류는 마우스, 랫트, 및 햄스터로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 설치류는 쥐상목 슈퍼패밀리로부터선택된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 동물은 칼로미스쿠스과(Calomyscidae)(예를 들어, 마우스 유사 햄스터), 비단털쥐과(Cricetidae)(예를 들어, 햄스터, 미국 랫트 및 마우스, 들쥐), 쥐과(Muridae(트루 마우스 및 랫트, 게르빌루스쥐, 아프리카가시쥐, 크레스티드 랫트), 네소미스과(Nesomyidae)(클라이밍 마우스, 락 마우스(rock mice), 흰꼬리 랫트, 말라가시 랫트 및 마우스), 가시겨울잠쥐과(Platacanthomyidae)(예를 들어, 가시겨울잠쥐), 및 소경쥐과(Spalacidae)(예를 들어, 두더쥐쥐, 대나무쥐, 및 동북)로부터 선택된 패밀리로부터 유래한다. 일부 특정 구현예에서, 유전적으로 변형된 본 발명의 설치류는 트루 마우스 또는 랫트(패밀리 쥐과), 게르빌루스쥐, 아프리카가시쥐, 크레스티드 랫트로부터선택된다. 일부 특정 구현예에서, 유전적으로 변형된 본 발명의 마우스는쥐과의 구성원으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 설치류이다. 일부 특정 구현예에서, 본 발명의 설치류는 마우스, 및 랫트로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 마우스이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 C57BL/A, C57BL/An,C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10,C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C57BL 주의 마우스인 설치류이다. 일부 특정 구현예에서, 본 발명의 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8,129T1, 129T2(예를 들어, Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032)인 주로 이루어진 군으로부터 선택된 129 주이다. 일부 특정 구현예에서, 유전적으로 변형된 본 발명의 마우스는 전술된 129 주 및 전술된 C57BL/6 주의 혼합이다. 일부 특정　구현예에서, 본 발명의 마우스는 전술된 129 주의 혼합, 또는 전술된 BL/6 주의 혼합이다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 기술된 혼합의 129 주는 129S6(129/SvEvTac) 주이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 마우스는 BALB 주, 예를 들어, BALB/c 주이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 마우스 BALB 주 및 다른 전술된 주의 혼합이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물 은 랫트이다. 일부 특정 구현예에서, 본 발명의 랫트는 Wistar rat, LEA 주, Sprague Dawley 주, Fischer 주, F344, F6, 및 Dark Agouti로부터 선택된다. 일부 특정 구현예에서, 본원에 기술된 랫트주는 Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6, 및 Dark Agouti로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상 주의 혼합이다.
인간화 Pdcd1유전자를가지는 비인간 동물을 채용한 방법
PD-1 기능의 조사는 다양한 Pdcd1 돌연변이체 및 형질전환 비인간 동물(예를 들어, 참조로서 본원에 포함된 Nishimura, H. et al. (1998) Intern. Immunol. 10(10):1563-1572; Nishimura, H. et al. (1999) Immunity 11:141-151; Nishimura, H. et al. (2001) Science 291:319-322; Iwai, Y. et al. (2004) Intern. Immunol. 17(2):133-144; Keir, M. E. et al. (2005) J. Immunol. 175:7372-7379; Keir, M. E. et al. (2007) J. Immunol. 179:5064-5070; Carter, L.L. et al. (2007) J. Neuroimmunol. 182:124-134; Chen, L. et al. (2007) Europ. Soc. Organ Transplant. 21:21-29; Okazaki, T. et al. (2011) J. Exp. Med. 208(2):395-407; 미국 특허 번호 7,414,171; 및 유럽 특허 번호 1 334659 B1 참조)의 사용을 채용하였다. 이러한 돌연변이체 및 형질전환 동물은 PD-1 발현, 기능 및 다양한 세포 과정의 조절의 분자적 양태를 결정하는데 유용하다. 그러나, 이러한 돌연변이체 및 형질전환 동물은 제한이 없지않다. 예를 들어, 마우스 Pdcd1 유전자의 엑손 1에 인간 PD-1 cDNA를 녹인(knock-in)하여 생성된 PD-1-결핍 마우스는 PMA로의 자극 후에도 인간 PD-1을 생성하지않았다(Carter,L.L. et al., 위와 같음). 더욱이, 상이한 유전적 배경에서 PD-1 돌연변이체 동물 사이의 상당한 표현형 차이는 특히 PD-1에 대한 다양한 기능 및/또는 조절 활성을 할당하기 위한 시도를 할 때 조사를 복잡하게만든다. 여전히, PD-1을 과발현하는다른 형질전환 동물이 생성되고 있다(Chen, L. et al., 위와 같음). 이러한 동물은 트랜스 유전자의 상이한 발현 패턴을 나타내고, 이는 구조체 설계에 합리적으로기여할 수 있다. 더욱이, 동일한 근원(즉, 마우스) 유전적 물질의 사용으로 인해, PD-1 과발현은, 트랜스 유전자의 가능한 위치 효과로 인해 형질전환 PD-1보다 내인성 PD-1에 상응할 수 있다. PD-1 형질전환 마우스가 일부 PD-1 매개 생물학적 기능을 규명하는 데 유용한 것으로 입증되었지만, 적어도 부분적으로 PD-1 형질전환 마우스를 제조하기 위해 채용된 상이한 접근법에 기반하여 얻어진 결과에 차이를 나타내었다. 따라서, PD-1 매개 생물학을 탐색하는 현재의 생체 내 시스템은 불완전하다. PD-1 매개 생물학적 기능 및 신호전달 경로의 분자적 양상은 그 완전한 가능성을 형질전환 마우스에서 탐색할 수 없다.
본 발명의 비인간 동물은 다양한 검정에 유용한 인간(또는인간화) PD-1을 발현하는 생물학적 물질(예를 들어, 세포)의 근원 및 개선된 생체 내 시스템을 제공한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 PD-1 신호전달(예를 들어, PD-L1 및/또는 PD-L2와의 상호작용의 방해)을 조절하고/하거나 PD-1을 표적으로 하는 치료제를 개발하기 위해 사용된다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-1에 결합하는 후보 치료제(예를 들어, 항체)를 확인하고/하거나 스크리닝하고/하거나 개발하기 위해 사용된다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-1의 인간 PD-L1 및/또는 인간 PD-L2와의 상호작용을 차단하는 후보 치료제(예를 들어, 항체)를 스크리닝하고 개발하기 위해 사용된다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 본원에 기술된 비인간 동물의 세포의 표면 상 인간화 PD-1의 길항제 및/또는 작용제의 결합 프로파일을 결정하기 위해 사용되고; 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-1에 결합하는 하나 이상의 후보 치료적 항체의 에피토프 또는 에피토프들을 결정하기 위해 사용된다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 항PD-1 항체의 약동학 프로파일을 결정하기 위해 사용된다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 본 발명의 비인간 동물 및 하나 이상의 대조 또는 참조 비인간 동물은 각각 다양한 용량(예를 들어, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/mg, 7.5mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 또는 50 mg/kg 이상)의 하나 이상의 후보 치료적 항PD-1 항체에 노출된다. 후보 치료적 항체는 비경구 및 비경구가 아닌 투여의 경로를 포함하는, 임의의 원하는 투여의 경로를 통해 투여될수 있다. 비경구 경로는, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 내문내, 근육내, 피하, 복강내, 척수내, 척추강내, 뇌심실내, 두개내, 흉막내 또는 다른 주입 경로를 포함한다. 비경구가 아닌 경로는, 예를 들어, 경구, 비강, 경피, 폐, 직장, 볼, 질내, 안내를 포함한다. 투여는 또한 연속적 주입, 국소 투여, 이식물(겔, 막 등)으로부터의 서방출, 및/또는 정맥내 주입일 수 있다. 혈액은 다양한 시점(예를 들어, 0시간, 6시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 또는 최대 30일 이상)에서 비인간 동물(인간화 및 대조군)로부터 단리된다. 총 IgG, 항치료적 항체 반응, 응집 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 검정이 본원에 기술된 비인간 동물로부터 수득한 시료를 사용하여 투여된 후보 치료적 항체의 약동학 프로파일을 결정하기 위해 수행될 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 세포 변화의 결과로서 유전자 발현에 대한 효과 및 PD-1 신호전달을 차단하거나 조절하는 치료적 효과를 측정하기 위해 사용된다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물 또는 이로부터 단리된 세포는 비인간 동물의 세포의 표면 상 인간화 PD-1 단백질(또는 PD-1 단백질의 인간 부위)에 결합하는 후보 치료제에 노출되고, 이후 일정 시간 후, PD-1 의존성 과정, 예를 들어, 부착, 아폽토시스, 사이토카인 생산, 염증, 증식, 자기 관용 및 바이러스 감염(또는 반응)에 대한 효과를 분석한다.
본 발명의 비인간 동물은 인간화 PD-1 단백질을 발현하고, 따라서 결합 및 기능적 검정, 예를 들어, 특히 길항제 또는 작용제가 인간 PD-1 서열 또는 에피토프에 특이적이거나, 대안적으로, PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하는 인간 PD-1 서열 또는 에피토프에 특이적인 경우 PD-1 길항제 또는 작용제의 결합 또는 기능을 검정하기 위해 사용하기 위한 인간화 PD-1의 근원으로서의 역할을 하는 세포, 세포주, 및 세포 배양물이 생성될 수 있다. 다양한 구현예에서, 후보 치료적 항체에 결합된 PD-1 에피토프는 본 발명의 비인간 동물로부터 단리된 세포를 사용하여 결정될 수 있다. 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 비인간 동물에 의해 발현된 인간화 PD-1 단백질은 변이체 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 자가면역 및 감염성 질환에 연관된 변이체 인간 PD-1 단백질(예를 들어, 다형성)이 문헌(예를 들어, Lee, Y.H. et al. (2014) Z. Rheumatol. PMID: 24942602; Mansur, A. et al. (2014) J. Investig. Med. 62(3):638-643; Nasi, M. et al. (2013) Intern. J. Infect. Dis. 17:e845-e850; Piskin, I.E. et al. (2013) Neuropediatrics 44(4):187-190; Carter, L.L. et al. (2007) J. Neuroimmunol. 182(1-2):124-134; Wan, B. et al. (2006) J. Immunol. 177(12):8844-8850 참조)에 보고되어 있다. 예시적인 인간 PD-1 변이체는 NCBI로부터의 SNP GeneView 웹페이지에 열거되어 있고 표 3에 요약되어 있다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간화 PD-1 단백질 변이체를 발현한다. 다양한 구현예에서, 변이체는 리간드 결합에 연관된 아미노산 위치에서 다형성이다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-1의 다형성 변이체와의 상호작용을 통해 리간드 결합의 효과를 결정하기 위해 사용된다. 일부 특정 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 표 3에 나타낸 인간 PD-1 변이체를 발현한다.
본 발명의 비인간 동물로부터의 세포는 단리되고 애드 호크(ad hoc) 기반으로 사용될 수 있거나, 많은 세대 동안 배양물 내에 유지될 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물로부터의 세포는　 (예를 들어, 바이러스의 사용을 통해) 불멸화되고, 배양물 내(예를 들어, 계대 배양물)에 무기한으로 유지된다.
다양한 구현예에서, 세포 및/또는 본 발명의 비인간 동물은 항원에 대한 면역 반응에서 PD-1 매개 기능을 결정하기 위한 다양한 면역화 계획에서 사용된다. 일부 구현예에서, 인간(또는인간화) PD-1에 결합하거나 이의 하나 이상의 기능을 차단하는 후보 치료제가 본 발명의 비인간 동물에서 특성분석된다. 적합한 측정은 다양한 세포 검정, 증식 검정, 혈청 면역글로불린 분석(예를 들어, 항체 역가), 세포독성 검정, 리간드-수용체 상호작용의 특성분석(예를 들어, 면역침전 검정)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 PD-1 매개 기능을 특성분석하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 항원은 자가면역 질환, 장애 또는 병태와 연관된다. 일부 구현예에서, 항원은 염증성 질환, 장애 또는 병태와 연관된다. 일부 구현예에서, 항원은 시험 항원(예를 들어, 오브알부민 또는 OVA)이다. 일부 구현예에서, 항원은 치료가 필요한 한 명 이상의 인간 환자가 고통받고 있는 질환 또는 병태와 연관된 표적이다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-1을 표적으로 하는 후보 치료제의 약물 독성학적 양상을 시험하기 위한 자가항체 생산의 역가를 결정하기 위한 혈청 검정에서 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에서 자가항체 생산은 비인간 동물에서 유도된 하나 이상의 자가면역 질환, 장애 또는 병태로부터 기인한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은, 주어진 항원에 대한 특이적 T 세포 의존성 및 B 세포 의존성 반응을 포함하나 이에 제한되지는 않는 면역 반응의 PD-1 의존성 조절을 조절하기 위한 화합물 또는 생물학적 제제의 치료적 효능을 결정하기 위한 하나 이상의 항원으로의 챌린지에 사용된다.
다양한 구현예에서, 세포 및/또는 본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-1 신호전달을 조절하는 후보 치료제를 스크리닝하고 개발하기 위한 생존 및/또는 증식 검정(예를 들어, B 또는 T 세포를 채용함)에 사용된다. PD-1의 활성화 또는 소실은 T 세포 반응의 조절에서 중요한 역할을 수행하고, PD-1에 의한 자기관용의 조절은 PD-1의 세포외 도메인의 특이적 에피토프의 활성화에 기인할 수 있는데, 따라서, 후보 PD-1 조절제(예를 들어, 길항제 또는 작용제)는 본 발명의 비인간 동물의 세포 및/또는 본원에 기술된 비인간 동물을 사용하여 확인하고, 특성분석하고, 개발될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물 및/또는 세포는 PD-1의 존재 및 부재 하에 특이적 세포(들)(예를 들어, 암 세포)의 증식 또는 아폽토시스에 대한 효과를 결정하기 위한 생존 또는 사멸 검정(들)에 사용된다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물 및/또는 세포는 이식된 인간 세포 또는 조직에 대한 생리학적(예를 들어, 면역) 반응에서 PD-1 매개 기능을 결정하기위한 이종(예를 들어, 인간) 세포 또는 조직의 이종기관이식에 사용된다. 일부 구현예에서, 인간 PD-1에 결합하거나 이의 하나 이상의 기능을 차단하는 후보 치료제는 본 발명의 비인간 동물에서 특성분석된다. 적합한 측정은 다양한 세포 검정, 증식 검정, 혈청 면역글로불린 분석(예를 들어, 항체 역가), 세포독성 검정, 및 리간드-수용체 상호작용의 특성분석(예를 들어, 면역침전 검정)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 PD-1 매개 기능을 특성분석하기위해 사용된다. 일부 구현예에서, 항원은 신생물과 연관된다. 일부 구현예에서, 항원은 자가면역 질환, 장애 또는 병태와 연관된다. 일부 구현예에서, 항원은 염증성 질환, 장애 또는 병태와 연관된다. 일부 구현예에서, 항원은 치료가 필요한 한 명 이상의 인간 환자가 고통받고 있는 질환 또는 병태와 연관된 표적이다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 새로운 림프구 및 림프구의 면역 기능의 PD-1 의존성 조절을 조절하기 위한 화합물 또는 생물학적 제제의 치료적 효능을 결정하기 위한 이식 또는 입양 전달 실험에 사용된다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 인간 T 세포; 일부 구현예에서, 순수한(naive) T 세포; 일부 구현예에서, 활성화된 T 세포가 이식된다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물의 세포는 T 세포 의존성 반응 및 기능의 PD-1 의존성 조절을 조절하기 위한 화합물 또는 생물학적 제제의 치료적효능을 결정하기 위한 T 세포 검정에 사용된다. 예시적인 T 세포 검정은, 이에 제한되지는 않으나, ELISpot, 세포내 사이토카인 염색, 주요 조직적합 복합체(MHC)제한, 바이러스 억제 검정, 세포독성 검정, 증식 검정 및 조절 T 세포 억제 검정을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물의 세포는 인간 PD-1을 조절하는 후보 치료제를 스크리닝하고 개발하기 위한 세포 이행 검정에서 사용된다. 세포 이행은 내피를 가로지르는 세포의 이동과 관련되며, 이행 검정은 백혈구 또는 종양 세포에 의한 내피의 이행 및 이와의 상호작용의 측정을 허용한다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물의 세포는 종양 세포의 PD-1 의존성 조절 및/또는 아폽토시스를 조절하는 화합물 또는 생물학적 제제의 치료적 효능을 결정하기 위한 종양 세포 생장(또는 증식) 검정에서 사용된다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물의 세포는 T 세포로부터의 사이토카인 방출의 PD-1 의존성 조절을 조절하는 화합물 또는 생물학적 제제의 치료적 효능을 결정하기 위한 사이토카인 생산 검정에 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물의 세포는 인간화 PD-1의 인간 PD-1을 표적으로 하는 약물 또는 PD-1 리간드(예를 들어, PD-L1 또는 PD-L2)와의 상호작용에 기인한 세포내 사이토카인 방출의 검출(및/또는 측정)을 위해 사용된다.
다양한 구현예에서, 자가면역 질환, 장애 또는 병태는, 자가면역 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 기능의 PD-1 의존성 조절을 조절하기 위한 화합물 또는 생물학적 제제의 치료적 효능을 결정하기 위한 생체 내 시스템을 제공하기 위해 하나 이상의 본 발명의 비인간 동물에서 유도된다. 하나 이상의 본 발명의 비인간 동물에서 유도될 수 있는 예시적인 자가면역 질환, 장애 또는 병태는 당뇨병, 실험적인 자가면역 뇌척수염(예를 들어, 다발성 경화증을 위한 모델), 류머티스 관절염, 및 전신 홍반성 루프스를 포함한다.
본 발명의 비인간 동물은 약물 또는 백신의 분석을 위한 생체 내 시스템을 제공한다. 다양한 구현예에서, 후보 약물 또는 백신이 하나 이상의 본 발명의 비인간 동물에게 전달된 다음, 약물 또는 백신에 대한 한 가지 이상의 면역 반응, 약물 또는 백신의 안전성 프로파일, 또는 질환 또는 병태에 대한 효과를 결정하기 위해 비인간 동물을 모니터링할 수 있다. 일부 구현예에서, 백신은, 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 또는 간염 바이러스(예를 들어 HCV)와 같은 바이러스를 표적으로 한다. 안전성 프로파일을 결정하기 위해 사용되는 예시적인 방법은 약물 또는 백신의 독성, 최적 용량 농도, 효능, 및 가능한 위험 인자의 측정을 포함한다. 이러한 약물 또는 백신은 이러한 비인간 동물에서 개선되고/되거나 개발될 수 있다.
본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-1을 표적으로 하는 약물의 약동학적 성질을 평가하기 위한 생체 내 시스템을 제공한다. 다양한 구현예에서, 인간 PD-1을 표적으로 하는 약물을 하나 이상의 본 발명의 비인간 동물에게 전달하거나 투여한 후 비인간 동물에 대한 약물의 효과를 결정하기 위해 비인간 동물(또는 이로부터 단리된 세포)에 대해 하나 이상의 검정을 수행하거나 이를 모니터링할 수 있다. 약동학적 성질은, 이에 제한되지는 않으나, 동물이 어떻게 약물을 다양한 대사산물로 가공하는지(또는 독성 대사산물을 포함하는 하나 이상의 약물 대사산물의 존재 여부의 검출), 약물 반감기, 투여후 약물의 순환 수준(예를 들어, 약물의 혈청 농도) , 항약물 반응(예를 들어, 항약물 항체), 약물 흡수 및 분포, 투여의 경로, 약물의 배출 및/또는 제거의 경로를 포함한다. 일부 구현예에서, 약물(예를 들어, PD-1 조절제)의 약동학 및 약력학적 성질이 본 발명의 비인간 동물의 사용을 통해 또는 본 발명의 비인간 동물에서 모니터링된다.
본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-1을 표적으로 하는 약물의 온 타겟(on-target) 독성을 평가하기 위한 생체 내 시스템을 제공한다. 다양한 구현예에서, 인간 PD-1을 표적으로 하는 약물을 하나 이상의 본 발명의 비인간 동물에게 전달하거나 투여한 후 비인간 동물에 대한 약물의 온 타겟 독성 효과를 결정하기 위해 비인간 동물(또는 이로부터 단리된 세포)에 대해 하나 이상의 검정을 수행하거나 이를 모니터링할 수 있다. 통상적으로, 약물은 약물의 표적의 하나 이상의 기능을 조절하도록 의도된다. 하나의 실시예로서, PD-1 조절제는 어떤 방식으로든 하나 이상의 세포의 표면 상 PD-1 분자와의 상호작용을 통해 PD-1 매개 기능(예를 들어, PD-1 신호 전달)을 조절하도록 의도된다. 일부 구현예에서, 이러한 조절제는 조절제의 원하는 약리학적 작용(들)의 과장인 역효과를 가질 수 있다. 이러한 효과는 온 타겟 효과로 지칭된다. 예시적인 온 타켓 효과는 지나치게 높은 용량, 만성 활성화/불활성화, 및 부정확한 조직에서의 정확한 작용을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물의 사용을 통해 또는 본 발명의 비인간 동물에서 확인된 PD-1을 표적으로 하는 약물의 온 타겟 효과는 PD-1의 이전에 알려지지 않은 기능(들)을 결정하기 위해 사용된다.
본 발명의 비인간 동물은 인간 PD-1을 표적으로 하는 약물의 오프 타겟(off-target) 독성을 평가하기 위한 생체 내 시스템을 제공한다. 다양한 구현예에서, 인간 PD-1을 표적으로 하는 약물을 하나 이상의 본 발명의 비인간 동물에게 전달하거나 투여한 후 비인간 동물에 대한 약물의 오프 타겟 독성 효과를 결정하기 위해 비인간 동물(또는 이로부터 단리된 세포)에 대해 하나 이상의 검정을 수행하거나 이를 모니터링할 수 있다. 오프 타겟 효과는 약물이 의도하지 않은 표적과 상호작용할 때 발생할 수 있다(예를 들어, 공통의 에피토프에 대한 교차반응성) 이러한 상호작용은 의도되거나 의도되지 않은 조직에서 발생할 수 있다. 하나의 실시예로서, 약물의 거울상 이미지 이성질체(거울상체)가 오프 타겟 독성 효과를 초래할 수 있다. 더욱이, 약물은 상이한 수용체 서브타입과 부적절하게 상호작용하고, 의도하지 않게 활성화시킬 수 있다. 예시적인 오프 타겟 효과는 부적절한 표적이 발견되는 조직에 구애받지 않고 부적절한 표적의 부적절한 활성화/저해를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 PD-1을 표적으로 하는 약물의 오프 타겟 효과는 본 발명의 비인간 동물에 대한 약물의 투여의 효과를 하나 이상의 참조 비인간 동물에 비교하여 결정한다.
일부 구현예에서, 검정의 수행은 약물이 투여된 비인간 동물의 표현형 및/또는 유전자형에 대한 효과를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 검정의 수행은 PD-1 조절제(예를 들어, 길항제 또는 작용제)에 대한 로트 간(lot-to-lot) 가변성을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 검정의 수행은 본 발명의 비인간 동물 및 참조 비인간 동물에 투여된 PD-1을 표적으로 하는 약물의 효과 간 차이를 결정하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, 참조 비인간 동물은 본원에 기술된 변형, 본원에 기술된 변형과는 상이한 변형(예를 들어, 파괴, 결실 또는 그렇지 않으면 비기능적 Pdcd1 유전자를 가지는 변형)을 가지거나 변형을 가지지 않을 수 (즉, 야생형 비인간 동물) 있다.
인간 PD-1을 표적으로 하는 약물의 온 타겟 독성, 및/또는 오프 타겟 독성의 약동학적 성질을 평가하기위한 비인간 동물 내(또는 이로부터 단리된 세포 내 및/또는 이를 이용하여) 측정될 수 있는 예시적인 파라미터는, 이에 제한되지는 않으나, 응집, 자가포식, 세포 분열, 세포 사멸, 보체 매개 용혈, DNA 완결성, 약물 특이적 항체 역가, 약물 대사, 유전자 발현 어레이, 대사 활성, 미토콘드리아 활성, 산화적 스트레스, 식세포작용, 단백질 생합성, 단백질 분해, 단백질 분비, 스트레스 반응, 표적 조직 약물 농도, 온 타겟 조직 약물 농도, 전사 활성 등을 포함한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 PD-1 조절제의 약학적으로 유효한 용량을 결정하기 위해 사용된다.
본 발명의 비인간 동물은 암에서 사용하기 위한 후보 치료제의 특성분석 및 개발을 위한 개선된 생체 내 시스템을 제공한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물이 종양에 이식된 다음, 하나 이상의 후보 치료제가 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 후보 치료제는 다중 특이적항체(예를 들어, 이중 특이적 항체) 또는 항체 칵테일을 포함할 수 있고; 일부 구현예에서, 후보 치료제는, 예를 들어, 순차적으로 또는 동시에 투여되는 단일 특이적 항체와 같은 병용 치료법을 포함한다. 종양은 비인간 동물 내 하나 이상의 위치에 확립되기에 충분한 시간을 허용할 수 있다. 종양 세포 증식, 생장, 생존, 등은 후보 치료제(들)의 투여 전후에 측정될 수 있다. 후보 치료제의 세포독성은 또한 원하는 바와 같이 비인간 동물에서도 측정될 수 있다.
본 발명의 비인간 동물은 인간에 영향을 미치는 질환, 장애 또는 병태를 효과적으로 치료하기 위한 후보 치료제 및/또는 치료 계획(예를 들어, 단일 치료법, 조합치료법, 용량 범위 시험, 등)을 확인하거나평가하기 위한 하나 이상의 질환 모델을 개발하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 질환 조건이 본 발명의 비인간 동물에서 확립된 후 하나 이상의 후보 분자(예를 들어, PD-1을 표적화하는 약물)가 투여되어 질환 조건에서 하나 이상의 후보 분자의 효능이 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 질환 모델은 자가면역, 염증성 및/또는 신생 질환, 장애 또는 병태를 포함한다.
하나의 실시예로서, 본 발명의 비인간 동물은 종양 또는 종양 세포의 예방 및/또는 치료적 처치를 위한 개선된 동물 모델을 제공한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 하나 이상의 종양 세포가 이식된 다음, 하나 이상의 후보 치료제(예를 들어, 항체)가 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 후보 치료제의 투여는 하나 이상의 종양 세포의 이식 후(예를 들어, 수분 또는 수 시간, 그러나 통상적으로 동일한 날) 순차적으로 수행되고 하나 이상의 후보 치료제가 본 발명의 비인간 동물에서 상기 비인간 동물 내 종양 세포의 생장 및/또는 고체 종양의 확립을 예방하는 효능에 대하여 평가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 후보 치료제의 투여는 하나 이상의 종양 세포의 이식 후 (예를 들어, 하루 후), 일부 특정 구현예에서, 하나 이상의 이식된 종양 세포가 본 발명의 비인간 동물에서 사전결정된 크기(예를 들어, 부피)에 도달하기에 충분한 시간 후 순차적으로수행되고; 하나 이상의 후보 치료제를 하나 이상의 확립된 종양의 치료에 대한 효능에 관해 평가한다. 비인간 동물은 용량에 따른 상이한 치료군에 적용될 수 있고 확립된 종양의 효과적인 치료에 상응하는 최적 용량 또는 용량 범위가 결정될 수 있다.
후보 분자가 비경구 및 비경구가 아닌 경로의 투여를 포함하는 임의의 방법의 투여를 사용한 비인간 동물 질환 모델에 투여될 수 있다. 비경구 경로는, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 내문내, 근육내, 피하, 복강내, 척수내, 척추강내, 뇌심실내, 두개내, 흉막내 또는 다른 주입 경로를 포함한다. 비경구가 아닌 경로는, 예를 들어, 경구, 비강, 경피, 폐, 직장, 볼, 질내, 안내를 포함한다. 투여는 또한 연속적 주입, 국소 투여, 이식물(겔, 막 등)으로부터의 서방출, 및/또는 정맥내 주입일 수 있다. 볍용 치료법이 본 발명의 비인간 동물에서 평가될 때, 후보 분자는 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여 계획이 본 발명의 비인간 동물에서 평가될 때, 후보 분자는 격월, 매월, 3주마다, 2주마다, 매주, 매일, 다양한 간격 및/또는 증가하는 농도로 하나 이상의 질환 모델이 확립된 비인간 동물에서 원하는 치료적 또는 예방적 효과를 입증하는 투여 계획을 결정하기 위해 투여될 수 있다.
본 발명의 비인간 동물은 감염성 질환에서 사용하기 위한 후보 치료제의 특성분석 및 개발을 위한 개선된 생체 내 시스템을 제공한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 바이러스(예를 들어, MHV, HIV, HCV, 등) 또는 병원균(예를 들어, 박테리아)를 이용한 주입에 의한 감염 후, 하나 이상의 후보 치료제가 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 후보 치료제는 다중 특이적항체(예를 들어, 이중 특이적 항체) 또는 항체 칵테일을 포함할 수 있고; 일부 구현예에서, 후보 치료제는, 예를 들어, 순차적으로 또는 동시에 투여되는 단일 특이적 항체와 같은 병용 치료법을 포함하고;일부 구현예에서, 후보 치료제는 백신을 포함할 수 있다. 바이러스 또는 병원균은 비인간 동물 내 하나 이상의 위치 또는 세포에 확립되기에 충분한 시간 동안 허용되어, 바이러스 또는 병원균의 감염에 연관된 하나 이상의 증상이 비인간 동물에서 발달될 수 있다. T 세포 증식 및 생장은 후보 치료제(들)의 투여 전후에 측정될 수 있다. 더욱이, 생존, 혈청 및/또는 세포내 사이토카인 분석, 간 및/또는 비장 조직병리학은 바이러스 또는 병원균에 감염된 비인간 동물에서 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물이 바이러스 감염에 연관된 기관 손상의 정도를 결정하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물은 특정한 바이러스에 감염된 비인간 동물의 다양한 기관 내 사이토카인 발현 프로파일을 결정하기 위해 사용된다.
본 발명의 비인간 동물은 인간 세포를 표적으로 하는 치료적 약물의 효능을 평가하기 위해 채용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물이 인간 세포에 이식되고, 이러한 인간 세포를 표적으로 하는 약물 후보가 이러한 비인간 동물에 투여된다. 약물의 치료적 효능이, 그런 다음, 약물의 투여 후 비인간 동물에서 인간 세포를 모니터링함으로써 결정된다. 비인간 동물에서 시험할 수 있는 약물은 인간 세포를 표적화(예를 들어, 이에 결합 및/또는 이에 작용) 함으로써 인간 질환 및 병태의 치료를 위한 의도된 치료적 효과를 가지는 소분자 화합물, 즉, 분자량이 1500 kD, 1200 kD, 1000 kD, 또는 800 달톤 미만인화합물, 고분자 화합물(예를 들어, 단백질, 예를 들어, 항체)을 포함한다.
일부 구현예에서, 약물은 항암 약물이고 인간 세포는, 원발성 암의 세포 또는 원발성 암으로부터 확립된 세포주의 세포일 수 있는 암 세포이다. 이러한 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물에 인간 암 세포가 이식되고, 항암 약물이 비인간 동물에 제공된다. 약물의 효능은 약물의 투여의 결과로서 비인간 동물에서 인간 암 세포의 생장 또는 전이가 저해되는지를 평가함으로써 결정될 수 있다.
특정한 구현예에서, 항암 약물은, 인간 암 세포 상 항원에 결합하는 항체 분자이다. 특정한 구현예에서, 항암 약물은 인간 암 세포 상 항원 및 다른 인간 세포, 예를 들어, B 세포 및 T 세포와 같은 인간 면역계(또는"인간 면역 세포")의 세포 상 항원에 결합하는 이중 특이적 항체이다.
실시예
다음의 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 어떻게 제조하고 사용하는지를 설명하기 위해 제공되며, 발명자가 그들의 발명으로 간주한 것의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 다르게 지시되지 않는 한, 온도는 섭씨로 나타내고, 압력은 상압 또는 거의 상압이다.
실시예 1 내인성 프로그램화 세포 사멸 1(Pdcd1) 유전자의 인간화
본 실시예는 설치류(예를 들어, 마우스)와 같은 비인간 포유동물에서 프로그램화 세포 사멸 단백질 1(PD-1)을 암호화하는내인성 Pdcd1 유전자의 인간화의 예시적인 방법을 예시한다. 본 실시예에 기술된 방법은 임의의 인간 서열, 또는 원하는 인간 서열(또는 서열 단편)의 조합을 사용하여 비인간동물의 내인성 Pdcd1 유전자를 인간화하기 위해 채용될 수 있다. 본 실시예에서, GenBank 접근 NM_005018.2(서열 번호23)에 나타낸 인간 PDCD1 유전자의 엑손 2, 인트론 2, 및 엑손 3의 처음 71 bp를 함유하는 약 883bp 인간 DNA 단편이 마우스의 내인성 Pdcd1 유전자의 인간화를 위해 채용된다. 내인성 Pdcd1 유전자의 세포외 N-말단 IgV 도메인을 암호화하는 유전적 물질의 인간화를 위한 표적화 벡터는 VELOCIGENE® 기술(예를 들어, 미국 특허 번호. 6,586,251 및 Valenzuela et al., 2003, NatureBiotech. 21(6):652-659 참조; 참조로서 본원에 포함됨)을 사용하여 제작되었다.
간략하게, 마우스 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론 RP23-93N20(Invitrogen)이 내인성Pdcd1 유전자의 엑손 2, 인트론 2 및 엑손 3의 일부를 함유하는 서열이 결실되고 인간 PD-1 폴리펩티드의 아미노산 26~169를 암호화하는약 883 bp 인간 DNA 단편을 사용하여 인간 PDCD1 유전자의 엑손 2, 인트론 2 및 엑손 3의 일부가 삽입되도록변 형되었다. 엑손 1, 엑손 3의 일부(즉, 막관통 도메인을 암호화하는 부분), 4 및 5뿐 아니라 5’ 및 3’ 미번역 영역(UTR)을 함유하는내인성 DNA는 유지되었다. 약 883 bp 인간 DNA 단편의 서열 분석은 모든 인간 PDCD1 엑손(즉, 엑손 2 및 71 bp의엑손 3) 및 스플라이싱 신호를 확인되었다. 서열 분석은 서열이 참조 게놈 및 PDCD1 전사체 NM_005018.2에 매칭되었다는 것을 밝혔다.
더욱 상세하게, 우선, 작은 박테리아 상동성 재조합 공여자가 다음을 함유하는합성 DNA단편으로부터 제작되었다: [(HindIII)-(마우스 상류 78bp)?(XhoI/NheI 제한효소 자리)?(인간 PDCD1 883bp)?(마우스 하류 75bp)-(HindIII)]. 이러한 단편은 Genescript 사(Piscataway, NJ)에 의해 합성되고 암피실린-내성 플라스미드 벡터 내에 클로닝되었다. XhoI-NheI 자리는 재조합효소 인식 자리 옆의 약 4,996 bp 자가 삭제 네오마이신 카세트에 라이게이션하기위해 채용되었다(loxP-hUb1-em7-Neo-pA-mPrm1-Crei-loxP;참조로서 본원에 포함된 미국 특허 번호 8,697,851, 8,518,392 및 8,354,389 참조). 차후의 선택은 네오마이신을 채용하였다. 옆의 HindIII 자리가 마우스 BAC 클론 RP23-93N20과의 상동성 재조합에 앞서 표적화 벡터를 선형화하기위해 사용되었다. 설계 상, 인간 PDCD1 883bp 단편 및 마우스 하류 75 bp 사의의 접합은 엑손 3에서 열린 해독틀을 보존하였다(도 2). 얻어진 표적화 벡터는, 5’으로부터 3으로’, BAC 클론 RP23-93N20으로부터의 약61.7kb의 마우스 게놈 DNA를 함유하는 5’ 상동 암, loxP 자리 옆의 자가 삭제 네오마이신 카세트, 883 bp 인간 게놈 DNA 단편(인간 Pdcd1 유전자의 엑손 2 내지 엑손 3의 처음 71 bp를 함유함) 및 BAC 클론 RP23-93N20으로부터의 약 84 kb의 마우스 게놈 DNA를 함유하였다.
전술된 변형된 RP23-93N20 BAC 클론이 엑손 2로부터 엑손 3의 일부(즉, 900 bp의 내인성 Pdcd1 유전자의 결실 및 883 bp의 인간 서열의 삽입)까지 인간화된 내인성 Pdcd1 유전자를 포함하는 변형된 ES 세포를 생성하기 위해 마우스 배아 줄기(ES) 세포를 전기천공하기 위해 사용되었다. 인간화 Pdcd1 유전자를 함유하는 양성으로 표적화된 ES 세포를 인간 PDCD1 서열(예를 들어, 엑손 2 및 엑손 3의 일부)의 존재를 검출하는검정(Valenzuelaet al., 위와 같음)으로 확인하였고 마우스 Pdcd1 서열(예를 들어, 엑손 2 및 엑손 3의 일부, 및/또는 엑손 1, 4 및 5)의 소실 및/또는 보유를 확인하였다. 표 4에는 전술된 내인성 Pdcd1 유전자의 인간화를 확인하기 위해 사용하였던 프라이머 및 프로브가 기재되어 있다(도 3). 상류 삼입점을 지나는 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, loxP 자리(굵은 글씨)에 인접하게 연결된 삽입점의 자가 삭제 네오마이신 카세트의 5' 말단의 상류 내인성 마우스 서열(이탤릭체로 표시된 Xho1 제한 자리와 함께 아래의 괄호 내에 포함됨) 및 삽입점에 존재하는 카세트 서열을 나타낸다: (TCAAAGGACA GAATAGTAGC CTCCAGACCC TAGGTTCAGT TATGCTGAAG GAAGAGCCCT CTCGAG) ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATATGCAT GGCCTCCGCG CCGGGTTTTG GCGCCTCCCG CGGGCGCCCC CCTCCTCACG (서열 번호 19). 자가 삭제 네오마이신 카세트의 3' 말단의 하류 삼입점을 지나는 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 삽입점의 하류의 인간 Pdcd1 게놈 서열에 인접한 카세트 서열(굵은 글씨로 나타낸 loxP 서열 및 이탤릭체로 표시된 Nhe1 제한 자리와 함께 아래의 괄호 내에 포함됨)을 나타낸다: (CTGGAATAAC TTCGTATAAT GTATGCTATA CGAAGTTATG CTAGTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA GCTAGC) AAGAGGCTCT GCAGTGGAGG CCAGTGCCCA TCCCCGGGTG GCAGAGGCCC CAGCAGAGAC TTCTCAATGA CATTCCAGCT GGGGTGGCCC TTCCAGAGCC CTTGCTGCCC GAGGGATGTG AGCAGGTGGC CGGGGAGGCT TTGTGGGGCC ACCCAGCCCC (서열 번호 20).
인간 PDCD1 게놈 서열의 3' 말단의 하류 삽임점을 지나는 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 마우스 PDCD1 게놈 서열에 인접한 인간 PDCD1 서열(아래의 괄호 내에 포함됨)을 나타낸다: CCCTTCCAGA GAGAAGGGCA GAAGTGCCCA CAGCCCACCC CAGCCCCTCA CCCAGGCCAG CCGGCCAGTT CCAAACCCTG (GTCATTGGTA TCATGAGTGC CCTAGTGGGT ATCCCTGTAT TGCTGCTGCT GGCCTGGGCC CTAGCTGTCT TCTGCTCAAC) (서열 번호 21). 네오마이신 카세트의 결실 후 상류 삽입점을 지나는 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하였는데, 남은 카세트 서열 loxP 서열의 사이에 위치한 마우스 및 인간 게놈 서열(이탤릭체로 표시된 XhoI 및 Nhe1 제한 자리 및 굵은 글씨로 나타낸 loxP와 함께 아래의 괄호 내에 포함됨)을 나타낸다: TCAAAGGACA GAATAGTAGC CTCCAGACCC TAGGTTCAGT TATGCTGAAG GAAGAGCCCT (CTCGAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATGCTAGT AACTATAACG GTCCTAAGGT AGCGA GCTAGC) AAGAG GCTCTGCAGT GGAGGCCAGT GCCCATCCCC GGGTGGCAGA GGCCCCAGCA GAGACTTCTC AATGACATTC CAGCTGGGGT GGCCCTTCCA (서열 번호 22).
양성 ES 세포 클론을, 그런 다음, 인간 PDCD1 엑손 2 및 인간 PDCD1 엑손 3의 일부의 마우스의 내인성 Pdcd1 유전자 내로의 삽입을 가지는 한 배의 강아지들을 생성하기 위한 VELOCIMOUSE® 방법(예를 들어, 미국 특허 번호 7,294,754 및 Poueymirou et al., 2007, Nature Biotech. 25(1):91-99 참조)을 사용하여암컷 마우스에 이식하기 위해 사용되었다. 내인성 Pdcd1 유전자의 엑손 2 및 3의 일부의 인간화(즉, 883 bp 인간 DNA 단편)를 지니는 마우스를 재확인하였고, 인간 PDCD1 유전자 서열의 존재를 검출하는 대립형질 검정의 변형을 사용하여 꼬리 조각으로부터 단리된 DNA의 유전형을확인하였다(Valenzuelaet al., 위와 같음). 강아지의 유전형을 확인하고 인간화 Pdcd1 유전자 구조체에 대한 동물 이형접합체의 코호트를 특성분석하기 위해 선택한다.
실시예 2 활성화된 T 세포 상 인간화 PD-1의 발현
본 실시예는 실시예 1에 따른 인간화 Pdcd1 유전자를 함유하도록 변형된 비인간 동물(예를 들어, 설치류)이 활성화된 림프구의 표면에 인간화 PD-1 단백질을 발현한다는 것을 입증한다. 본 실시예에서, 실시예 1에 기술된 내인성 Pdcd1 유전자의 인간화를 위한 마우스 이형접합체로부터의 활성화된 T 세포를 항PD-1 항체로 염색하여 야생형 및 인간화 마우스로부터 단리된 자극된 T 세포 내 PD-1의 발현을 결정하였다 .
간략하게, 야생형 마우스 및 실시예 1에 기술된 내인성 Pdcd1 유전자의 인간화를 위한 마우스 이형접합체로부터 비장을 수확하고 기계적 해리를 통해 단일 세포 현탁액으로 가공하였다. 세포를 배지(10% FBS가 보충된 RPMI)에서 세척하고, 1x106/mL로 재현탁하였고 200 μL(200,000 세포)를 96-웰 플레이트에 평판배양하였다. 선택된 웰 내 세포를 항CD3 및 항CD28 항체(둘 다, 1 μg/mL)로 72시간동안 자극하였다. 세포를 CD4, CD8, CD19 및 인간(클론 MIH4, BD Biosciences) 또는 마우스(클론 J43, eBioscience) PD1을 인식하는항체로 제조자의 사양서에 따라 FACS로 염색하였다 염색된 세포를 LSRII 유세포 분석기에서 운용하였고 데이터를 Flowjo 소프트웨어를사용하여 분석하였다. CD8+ T 세포를 인간 및 마우스 PD1의 발현에 대하여 게이팅(CD19-CD8+)하였다. 예시적인 결과가 도 4에 나타나 있다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에 기술된 인간화 Pdcd1 유전자를 지니는 마우스는 인간 부위 및 내인성 마우스 부위를 포함하는 PD-1 폴리펩티드를 발현한다. 인간 부위는 완전한 인간 PD-1 폴리펩티드를 인식하는 항체에 의한 인식을 통해 검출가능하게 발현된다.
실시예 3 PD-1 조절제의 생체 내 효능
본 실시예는 실시예 1에 따라 인간화 Pdcd1 유전자를 함유하도록 변형된 비인간 동물(예를 들어, 설치류)이 PD-1 조절제(예를 들어, 항PD-1 항체) 를 스크리닝하고, 예를 들어, 종양 생장 및/또는 종양 세포의 살상과 같은 다양한 특성을 결정하기 위한 생체 내 검정에 사용될 수 있다는 것을 입증하는 것이다. 본 실시예에서,몇몇 항PD-1 항체가 실시예 1에 기술된 내인성 Pdcd1 유전자의 인간화를 위한 마우스 동형접합체에서 스크리닝되어 종양 생장을 저해하는 최적 항체 용량 및 항PD-1 항체가 종양 세포의 살상을 매개하는 범위를 결정한다.
간략하게, 마우스를 체중에 따라 연구 1의 경우 5개의 처리 또는 대조군(n=5/군), 연구 2의 경우(n=5/군) 8개의 처리 또는 대조군, 및 연구 3의 경우5개의 처리 또는 대조군(n=7/군)으로 균일하게 나누었다. 0일에, 마우스를 이소플루란 흡입으로 마취시킨 후 100 μL의 DMEM 현탁액 중 MC38.ova 세포를 오른쪽 옆구리에 피하로 주사(연구 1: 5x105; 연구 2/3: 1x106) 하였다. 종양 면역원성을 증가시키기 위해 닭 오브알부민을 발현하도록 MC38.ova(마우스 대장 암종) 세포를 조작하였다. 연구 1의 경우, 처리군에 200 μg의 3종의 항PD-1 항체 중 하나, 또는 관련 없는 특이성을 가지는 이소형 대조군 항체를 실험 3, 7, 10, 14, 및 17일에 복강내로 주사하였고, 마우스의 하나의 군은 미처리로 남겼다. 연구 2의 경우, 처리군에 3종의 항PD-1 항체 중 하나를 용량 당 10mg/kg 또는 5mg/kg으로, 하나의 항PD-1 항체(Ab B, IgG4)를 용량 당 10mg/kg으로, 또는 관련 없는 특이성을 가지는 이소형 대조군 항체를 10mg/kg으로 실험 3, 7, 10, 14, 및 17일에 복강내로 주사하였다. 연구 3의 경우, 처리군에 2종의 항PD-1 항체 중 하나를 용량 당 5 mg/kg 또는 2.5 mg/kg으로, 또는 PD-1에 특이적이지 않은 대조군 항체(대조군)를 5mg/kg으로 실험 3, 7, 10, 14, 및 17일에 복강내로 주사하였다. 표 5는 마우스군에 대한 실험 용량 및 치료 프로토콜을 기재한 것이다.
각각의 연구에서, 평균 종양 부피는 칼리퍼 측정에 의해 결정되었고, 각 처리군에 대한 각 실험에서의 14 또는 17일 및 23 또는 24일에서의 생존 백분율을 기록하였다. 종양이 없는 마우스의 수를 또한 연구의 종료(연구 1의 경우 42일 및 연구 2 및 연구 3의 경우31일) 시 평가하였다. 각각의 연구에 대한 평균 종양 부피(mm3)(±SD), 생존 백분율, 및 종양이 없는 마우스의 수를 계산하였다(표 7~9). 예시적인 종양 생장 곡선이 도 5에 제공되어 있다.
연구 1의 경우에 대하여 표 6에 나타낸 바와 같이, , Ab A로 처리된 마우스에서는 연구의 과정 중 임의의 검출가능한 종양이 발달하지 않았다. Ab C로 처리된 마우스는 연구 17 및 24일에 대조군과 비교하여 지속적으로 감소된 종양 부피를 나타냈고; 5마리의 마우스 중 3마리에서 실험의 종료 시 종양이 없었다. 반대로, Ab B로의 처리는 대조군과 비교하여 본 연구에서 종양 부피의 감소에서 유의한 효능을 나타내지 않았다. 연구 23일까지, 5 마리의 마우스 중 1 마리가 Ab B를 수여 받은 군에서 사망하였고, 5 마리의 마우스 중 2 마리가 이소형 대조군 처리군에서 사망하였다. 비처리 및 이소형 대조군에서, 일부 마우스는 종양의 자발적인퇴행(각각, 5 마리의 마우스 중 1마리 및 5마리의 마우스 중 2마리)을 나타냈다.
연구 2의 경우에 대하여 표 7에 나타낸 바와 같이, Ab A 10mg/kg으로 처리된 마우스에서는 연구의 과정 중 검출가능한 종양이 발달하지 않았다. 10 mg/kg의 Ab C 또는 Ab D 중 하나로 처리된 마우스의 군은 대조군과 비교하여 연구 17 및 24일에 실질적으로 감소된 종양 부피를 나타냈다. 10 mg/kg의 Ab C 또는 Ab D 중 하나로 처리된 각 군 내 5 마리의 마우스 중 네 마리는 31일에 종양이 없었던 반면, 이소형 대조군 처리군에서는 5마리의 동물 중 단 1마리 만이 자발적 종양 퇴행의 결과로 종양이 없었다. 10 mg/kg으로 시험한 Ab B는 대조군과 비교하여 연구 17 및 24일에 실질적으로 감소한 종양 부피를 나타냈는데, 이러한 항체는 실험의 종료 시 5 마리의 마우스 중 2마리만 살아남은 가장 덜 효과적인 항PD1 항체였다.
시험된 용량(5 mg/kg 및 10 mg/kg)에서 종양 억제에서의 용량 의존성 반응이 Ab A, Ab C, 및 Ab D로 처리된 군에서 관찰되었다. 5 mg/kg의 Ab A 또는 Ab C 치료법은 가장 덜 효과적이었는데, 31일 째 실험의 종료 시 5 마리 중 4 마리의 종양이 없는 마우스를 가진 반면, Ab A의 10 mg/kg 용량군에서는 5 마리의 중 5마리가 마우스 종양없이 유지되었다. 이원 ANOVA 다중 비교에서의 던넷 시험(Dunett’s test)은 참조로서10 mg/kg의 이소형 대조군 항체로 처리된 군과 Ab A, Ab C 또는 Ab D 10 mg/kg로 처리된 군 사이의 종양 생장에서의 차이가 p 값<0.005으로 통계적으로 유의하였다는 것을 밝혔다. 참조로서10 mg/kg의 이소형 대조군 항체로 처리된 군과 5 mg/kg Ab A, Ab C 또는 Ab D로 처리된 군 사이의 종양 생장에서의 차이도 또한 p 값<0.05로 통계적으로 유의하였다.
연구 3의 경우에 대해 표 8에 나타낸 바와 같이, Ab A 또는 Ab C 5mg/kg으로 처리된 7 마리의 마우스 중 6 마리에서 실험의 종료 시 종양이 없었던 반면 이소형 대조군에서는 종양이 없는 동물이 없었다. IgG4 대조군 내 한 마리의종양을 지니는 마우스는 이식 후 17일에 사망하였다. 2.5 mg/kg의 Ab C로 처리된 7 마리의 마우스 중 4 마리 만이 실험 종료 시 종양이 없는 상태를 유지하였다. 21일에서 시험한 항PD-1 항체 및 이소형 대조군 사이의 종양 부피에서의 차이는 일원 ANOVA에 의해 통계적으로 유의한 것으로 결정되었고 던넷 다중 비교 사후 검정에서 p<0.01을 가진다. 시험한 4종의 항PD-1 항체 모두 동일하게 2.5 mg/kg 용량보다는 5 mg/kg 용량에서 더욱 효과적이었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 항PD-1 항체는 실시예 1에 따라 제조된 PD-1 인간화 마우스 내 예방적 MC38.ova 종양 생장 모델에서 유의하게 종양 생장을 저해하였다. 10 mg/kg의 항PD-1 Ab 치료법은 실험의 과정 전체에 걸쳐 종양 퇴행(5 마리 중 5 마리)을 증진하였던반면, 대조군에서는 자발적 종양 퇴행의 결과로 다섯 마리의 동물 중 단지 한 마리 만이 종양이 없는 채로 남아있었다. 5 mg/kg의 항PD-1 치료법은 약간 덜 효과적이었는데 실험의 종료 시 다섯 마리 중 네 마리의 종양이 없는 마우스를 가졌다. 던넷 다중 비교 사후 검정을 이용한 일원 ANOVA는 항PD-1과 대조군 항체 처리 간 종양 부피에서 p 값 < 0.05(5 mg/kg) 및 p 값 <0.01(10 mg/kg)으로 유의한 차이를 밝혔다.
유사한 실험에서, 실시예 1에 따라 제조된 PD-1 인간화 마우스에서 온전한 기능적 PD-1 신호전달을 항PD-1 항체로 처리된 종양을 지니는 마우스의 비장 내 IFNγ 생산 및 CD8+ T 세포 및 CD3+ T 세포 반응을 측정함으로써 조사하였다
간략하게, 21일차에 실험의 종료 시 항PD-1 또는 대조군 항체로 처리된 PD-1 인간화 마우스(75% C57BL/6/25% 129)로부터 비장 세포를 수득하였다(전술됨), 총 RNA를 단리하였고, 마우스 CD8b (정방향 프라이머: GCTCTGGCTG GTCTTCAGTA TG, 서열 번호 24; 역방향 프라이머: TTGCCGTATG GTTGGTTTGA AC, 서열 번호 25; 프로브: AGCAGCTCTG CCCTCAT, 서열 번호 26), 마우스 CD3τ (Mm00446171_m1, Applied Biosystems), 우스 IFN-γ (Mm01168134_m1, Applied Biosystems), 인간 PD-1 (정방향 프라이머: ACTTCCACAT GAGCGTGG, 서열 번호 27; 역방향 프라이머: GGGCTGTGGG CACTTCTG, 서열 번호 28; 프로브: GCAGATCAAA GAGAGCCTGC, 서열 번호 29) 및 마우스PD-1 (Mm01285676_m1, Applied Biosystems)에 특이적인 taqman 프로브 믹스 및 올리고뉴클레오티드를 사용하여 역전사 cDNA에 대한 실시간 PCR을 수행하였다. 마우스 사이클로필린 B의 발현에 대해 시료를 정규화하였다. 예시적인 결과가 도 6에 제공된다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 항hPD-1 항체의 투여는 MC38.ova 종양을 지니는 인간화 마우스(실시예 1에 따라 제조됨)의 비장 내에서 CD8+ 및 CD3+ T 세포의 증가된 생산을 유도하였다. 더욱이, 종양을 지니는 PD-1 인간화 마우스에서 항hPD-1 항체의 활성은 IFNγ에 의존적이었는데, 이는 세포 표면 상 인간화 PD-1을 통한 적절한 신호전달을 확인하는 것이다. 전체적으로, 대조군 처리 마우스에 비하여 T 세포 및 IFNγ에서의 증가가 두 처리군에서 관찰되었다.
인간 PD-1 mRNA 발현은 PD-1 단백질의 세포외 부위에 대하여 설계된 인간 특이적 프로브로 측정하였고 세포 표면 상 인간화 PD-1 단백질의 적절한 발현을 확인하였다. 추가적으로, 마우스 PD-1의 세포외 부위를 검출하도록 설계된 프라이머를 이용한마 우스 PD-1 mRNA 발현의 측정은 생성물을 생산하는데 실패하였다.
종합하면, 본 실시예는 본 발명의 비인간 동물이 PD-1을 표적화하는 약물(예를 들어, 항체)의 생체 내 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있고, 이러한 동물이 항PD-1 항체의 치료적 효과를 구분하는 데 유용하다는 것을 입증한다. 더욱이, 본원에 기술된 비인간 동물은 PD-1을 표적화하는 약물이 종양 생장을 저해할 수 있고/있거나 및 종양 세포의 살상을 매개할 수 있는 범위를 평가하는 데 사용할 수 있다. 본 발명의 비인간 동물(예를 들어, 마우스)은 T 세포 및 사이토카인 발현(예를 들어, IFN-γ)의 확장에 의해 입증된 바와 같이 인간화 PD-1을 통한 기능적 PD-1-신호전달 및 적절한 PD-1 의존성 면역 반응을 입증한다.
실시예 4 항PD-1 종양 치료법의 설치류 모델
본 실시예는 실시예 1에 따라 인간화 Pdcd1 유전자를 함유하도록 변형된 비인간 동물(예를 들어, 설치류)이 PD-1 조절제(예를 들어, 항PD-1 항체)의 최적 치료적 용량(들)을 결정하기위해 종양 모델에서 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 본 실시예에서, 항PD-1 항체가 실시예 1에 기술된 내인성 Pdcd1 유전자의 인간화를 위한 마우스 동형접합체에 투여되어 확립된 종양의 치료를 위한 최적 치료적 용량을 결정한다.
간략하게, (실시예 1에 기술된) 인간화 Pdcd1 유전자를 함유하는 마우스에 1x106MC38.Ov세포(전술됨)를 피하로 이식하고, 이어서 종양 부피가 80 ~ 120 mm3 (0일)에 도달하면 6개의 처리군 (군 당 n=8 ~ 9)으로 무작위화하였다. 마우스에 0.3~25 mg/kg(즉, 0.3, 1, 3, 10 또는 25 mg/kg)의 증가하는 용량 범위의 항hPD-1 항체 또는 25 mg/kg의 이소형 대조군 항체를 복강내로 투여하였다. 항체를 0, 3, 7, 10 및 13일에 투여하였다. 실험 기간(60일) 동안 종양 부피를 주 당 2회 캘리퍼 측정으로 모니터링하였다. 예시적인 종양 생장 곡선이 도 7에 제공되어 있다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군 항체가 투여된 마우스 중 어떤 것도 실험의 종료 시 종양이 없지 않았다. 반대로, 3 ~ 25 mg/kg 용량 범위의 항hPD-1 항체는 상이한 치료군 사이에서 약 44~55% 종양이 없는 마우스를 초래하였다. 종합하면, 본 실시예는 본 발명의 비인간 동물이 확립된 종양을 효과적으로 치료하기 위해 PD-1을 표적으로 하는 약물(예를 들어, 항체)의 최적 용량 및/또는 용량 범위을 결정하기 위한 설치류 종양 모델로서 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
등가물
본 발명의 적어도 하나의 구현예의 몇몇 양태가 설명되었는데, 당업자에게는 다양한 수정, 변형 및 개선이 용이하게 발생할 것으로 당업자에게 이해된다. 이러한 수정, 변형 및 개선은 본 개시의 일부인 것으로 의도되며, 본 발명의 사상 및 범주 이내인 것으로 의도된다. 따라서, 전술된 설명 및 도면은 단지 예시이며, 본 발명은 이어지는 청구범위에 의해 상세히 기술된다.
청구범위 요소를 변형하기 위한 청구범위 내 “제1”, “제2”, “제3” 등과 같은 서수 용어의 사용은 그 자체가 하나의 청구범위 요소가 다른 것을 앞서는 어떠한 우선순위, 선행, 또는 순서 또는 방법의 작용이 수행되는 일시적인 순서를 나타내지 않으며, 단지 청구범위 요소들을 구분하기 위해 일정한 이름을 가지는 하나의 청구범위 요소를 (서수 용어의 사용이 없었다면) 동일한 이름을 가진 다른 요소로부터 구분하기 위한 표지로서 사용된다.
본 명세서 및 청구범위 내에서, 여기에 사용된 관사 “a” 및 “an”은 명확하게 반대로 지시되지 않는 한 복수 언급을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 하나의 군의 하나 이상의 구성원 사이에서 “또는”을 포함하는 첨구범위 또는 상세한 설명은 반대로 지시되거나 그렇지 않으면 문맥으로부터 명백하지 않는 한 하나, 하나 초과 또는 전체의 군 구성원이 주어진 산물 또는 과정에 존재하거나 채용되거나 그렇지 않으면 관련되는 것을 만족하는 것으로 간주된다 본 발명은 군의 정확히 하나의 구성원이 주어진 산물 또는 과정에 존재하거나 채용되거나 그렇지 않으면 관련된 구현예를 포함한다. 본 발명은 또한 하나 초과, 또는 전체 군의 구성원이 주어진 산물 또는 과정에 존재하거나 채용되거나 그렇지 않으면 관련된 구현예를 포함한다. 나아가, 본 발명은 그렇지 않은 것으로 지시되거나 반대 또는 불일치가 일어날 수 있다는 것이 당업자에게 명백하지 않는 한 하나 이상의 열거된 청구범위로부터 하나 이상의 제한, 요소, 항목, 서술 용어 등이 동일한 기반의 청구범위에 의존하는 다른 청구범위에 도입된 모든 변형, 조합, 치환을 포함하는 것으로 이해된다. 요소가 (예를 들어, 마커시 군 또는 유사한 형식 내) 목록으로서 제시된 경우, 이러한 요소의 각각의 하위군도 또한 개시되고, 임의의 요소(들)가 이러한 군으로부터 제거될 수 있는 것으로 이해된다. 일반적으로, 본 발명, 또는 본 발명의 양태가 특정 요소, 특징 등을 포함하는 것으로 지칭되는 경우, 본 발명의 특정 구현예 또는 본 발명의 양태는 이러한 요소, 특징으로 이루어지거나 필수적으로 이루어지는 것으로 이해되어야 한다. 간결성을 위해, 이러한 구현예들은 본원에서 글자 그대로 모든 경우에서 구체적으로 기재되지 않는다. 또한 본 발명의 임의의 구현예 또는 양태는 특정한 배제가 본 명세서 내에 언급되었는지에 관계없이 청구범위로부터 명백하게 제외될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
당업자는 본원에 기술된 검정 또는 다른 과정들에서 얻어진 값에서 기인할 수 있는 통상적인 오차 또는 표준 편차를 이해할 것이다. 간행물, 웹사이트 및 다른 참조 물질들은 본 발명의 배경기술을 설명하고, 그의 시행이 참조로서 본원에 포함되는 것을 고려하여 추가적인 상세한 설명을 제공하기 위해 언급되었다.
SEQUENCE LISTING <110> BUROVA, Elena MUJICA, Alexander O. LAI, Ka-Man Venus O. MURPHY, Andrew J. <120> NON-HUMAN ANIMALS HAVING A HUMANIZED PROGRAMMED CELL DEATH 1 GENE <130> 31969 (10121US1) <150> 62/086,518 <151> 2014-12-02 <150> 62/138,221 <151> 2015-03-25 <150> 62/014,181 <151> 2014-06-19 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1972 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 tgagcagcgg ggaggaggaa gaggagactg ctactgaagg cgacactgcc aggggctctg 60 ggcatgtggg tccggcaggt accctggtca ttcacttggg ctgtgctgca gttgagctgg 120 caatcagggt ggcttctaga ggtccccaat gggccctgga ggtccctcac cttctaccca 180 gcctggctca cagtgtcaga gggagcaaat gccaccttca cctgcagctt gtccaactgg 240 tcggaggatc ttatgctgaa ctggaaccgc ctgagtccca gcaaccagac tgaaaaacag 300 gccgccttct gtaatggttt gagccaaccc gtccaggatg cccgcttcca gatcatacag 360 ctgcccaaca ggcatgactt ccacatgaac atccttgaca cacggcgcaa tgacagtggc 420 atctacctct gtggggccat ctccctgcac cccaaggcaa aaatcgagga gagccctgga 480 gcagagctcg tggtaacaga gagaatcctg gagacctcaa caagatatcc cagcccctcg 540 cccaaaccag aaggccggtt tcaaggcatg gtcattggta tcatgagtgc 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Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly 165 170 175 Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 180 185 190 Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205 Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 210 215 220 Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro 225 230 235 240 Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly 245 250 255 Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 260 265 270 Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285 <210> 5 <211> 1972 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Pdcd1 <400> 5 tgagcagcgg ggaggaggaa gaggagactg ctactgaagg cgacactgcc aggggctctg 60 ggcatgtggg tccggcaggt accctggtca ttcacttggg ctgtgctgca gttgagctgg 120 caatcagggt ggcttctaga ctccccagac aggccctgga acccccccac cttctcccca 180 gccctgctcg tggtgaccga aggggacaac gccaccttca cctgcagctt ctccaacaca 240 tcggagagct tcgtgctaaa ctggtaccgc atgagcccca gcaaccagac ggacaagctg 300 gccgccttcc ccgaggaccg cagccagccc ggccaggact gccgcttccg tgtcacacaa 360 ctgcccaacg ggcgtgactt ccacatgagc gtggtcaggg cccggcgcaa tgacagcggc 420 acctacctct gtggggccat ctccctggcc cccaaggcgc agatcaaaga gagcctgcgg 480 gcagagctca gggtgacaga gagaagggca gaagtgccca cagcccaccc cagcccctca 540 cccaggccag ccggccagtt ccaaaccctg gtcattggta tcatgagtgc cctagtgggt 600 atccctgtat tgctgctgct ggcctgggcc ctagctgtct tctgctcaac aagtatgtca 660 gaggccagag gagctggaag caaggacgac actctgaagg aggagccttc agcagcacct 720 gtccctagtg tggcctatga ggagctggac ttccagggac gagagaagac accagagctc 780 cctaccgcct gtgtgcacac agaatatgcc accattgtct tcactgaagg gctgggtgcc 840 tcggccatgg gacgtagggg ctcagctgat ggcctgcagg gtcctcggcc tccaagacat 900 gaggatggac attgttcttg gcctctttga ccagattctt cagccattag catgctgcag 960 accctccaca gagagcaccg gtccgtccct cagtcaagag gagcatgcag gctacagttc 1020 agccaaggct cccagggtct gagctagctg gagtgacagc ccagcgcctg caccaattcc 1080 agcacatgca ctgttgagtg agagctcact tcaggtttac cacaagctgg gagcagcagg 1140 cttcccggtt tcctattgtc acaaggtgca gagctggggc ctaagcctat gtctcctgaa 1200 tcctactgtt gggcacttct agggacttga gacactatag ccaatggcct ctgtgggttc 1260 tgtgcctgga aatggagaga tctgagtaca gcctgctttg aatggccctg tgaggcaacc 1320 ccaaagcaag ggggtccagg tatactatgg gcccagcacc taaagccacc cttgggagat 1380 gatactcagg tgggaaattc gtagactggg ggactgaacc aatcccaaga tctggaaaag 1440 ttttgatgaa gacttgaaaa gctcctagct tcgggggtct gggaagcatg agcacttacc 1500 aggcaaaagc tccgtgagcg tatctgctgt ccttctgcat gcccaggtac ctcagttttt 1560 ttcaacagca aggaaactag ggcaataaag ggaaccagca gagctagagc cacccacaca 1620 tccagggggc acttgactct ccctactcct cctaggaacc aaaaggacaa agtccatgtt 1680 gacagcaggg aaggaaaggg ggatataacc ttgacgcaaa ccaacactgg ggtgttagaa 1740 tctcctcatt cactctgtcc tggagttggg ttctggctct ccttcacacc taggactctg 1800 aaatgagcaa gcacttcaga cagtcagggt agcaagagtc tagctgtctg gtgggcaccc 1860 aaaatgacca gggcttaagt ccctttcctt tggtttaagc ccgttataat taaatggtac 1920 caaaagcttt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1972 <210> 6 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized PD-1 <400> 6 Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Ile Gly Ile Met Ser Ala 165 170 175 Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val 180 185 190 Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp 195 200 205 Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala 210 215 220 Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro 225 230 235 240 Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly 245 250 255 Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln 260 265 270 Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide: 7106 hTU Forward <400> 7 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<220> <223> Synthetic Oligonucleotide: Human 883 bp DNA fragment <400> 23 aagaggctct gcagtggagg ccagtgccca tccccgggtg gcagaggccc cagcagagac 60 ttctcaatga cattccagct ggggtggccc ttccagagcc cttgctgccc gagggatgtg 120 agcaggtggc cggggaggct ttgtggggcc acccagcccc ttcctcacct ctctccatct 180 ctcagactcc ccagacaggc cctggaaccc ccccaccttc tccccagccc tgctcgtggt 240 gaccgaaggg gacaacgcca ccttcacctg cagcttctcc aacacatcgg agagcttcgt 300 gctaaactgg taccgcatga gccccagcaa ccagacggac aagctggccg ccttccccga 360 ggaccgcagc cagcccggcc aggactgccg cttccgtgtc acacaactgc ccaacgggcg 420 tgacttccac atgagcgtgg tcagggcccg gcgcaatgac agcggcacct acctctgtgg 480 ggccatctcc ctggccccca aggcgcagat caaagagagc ctgcgggcag agctcagggt 540 gacaggtgcg gcctcggagg ccccggggca ggggtgagct gagccggtcc tggggtgggt 600 gtcccctcct gcacaggatc aggagctcca gggtcgtagg gcagggaccc cccagctcca 660 gtccagggct ctgtcctgca cctggggaat ggtgaccggc atctctgtcc tctagctctg 720 gaagcacccc agcccctcta gtctgccctc acccctgacc ctgaccctcc accctgaccc 780 cgtcctaacc cctgaccttt gtgcccttcc agagagaagg gcagaagtgc ccacagccca 840 ccccagcccc tcacccaggc cagccggcca gttccaaacc ctg 883 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 24 gctctggctg gtcttcagta tg 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 25 ttgccgtatg gttggtttga ac 22 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 26 agcagctctg ccctcat 17 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 27 acttccacat gagcgtgg 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 28 gggctgtggg cacttctg 18 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 29 gcagatcaaa gagagcctgc 20

Claims (79)

  1. 설치류에서 인간화 PD-1 폴리펩티드를 발현하기 위한 인간화 프로그램화 세포 사멸 1(Pdcd1) 유전자로서,
    인간화 Pdcd1 유전자는 인간화 PD-1 폴리펩티드를 암호화하고 인간 Pdcd1 유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 일부를 포함하고,
    인간 부위는 인간 PD-1 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하고 인간 Pdcd1 유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 일부에 의해 암호화되고,
    설치류 부위는 설치류 PD-1 폴리펩티드의 세포내 부위를 포함하고,
    설치류는 마우스 또는 래트인, 인간화 Pdcd1 유전자.
  2. 제1 항에 있어서, 인간화 PD-1 폴리펩티드는 설치류 PD-1 폴리펩티드의 막관통 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 Pdcd1 유전자.
  3. 제1 항에 있어서, 인간화 PD-1 폴리펩티드의 인간 부위는 인간 PD-1 폴리펩티드의 아미노산 26-169를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 Pdcd1 유전자.
  4. 제1 항에 있어서, 인간화 Pdcd1 유전자는 설치류 Pdcd1 유전자의 엑손 1, 4 및 5를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 Pdcd1 유전자.
  5. 제4 항에 있어서, 인간화 Pdcd1 유전자는 설치류 Pdcd1 유전자의 엑손 3의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 Pdcd1 유전자.
  6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류 Pdcd1 프로모터 에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 인간화 Pdcd1 유전자.
  7. 마우스 Pdcd1 유전자의 엑손 2의 상류의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5' 상동 암(arm),
    인간 Pdcd1 유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 일부를 포함하고 인간 Pdcd1 유전자에 의해 암호화된 인간 PD-1 폴리펩티드의 세포외 도메인을 암호화하는, 인간 Pdcd1 유전자의 게놈 DNA 단편, 및
    마우스 Pdcd1 유전자의 엑손 3의 일부, 엑손 4 및 엑손 5를 포함하는 3' 상동 암으로서, 여기서 엑손 3의 일부는 마우스 Pdcd1 유전자에 의해 암호화된 마우스 PD-1 폴리펩티드의 막관통 부위의 아미노산을 암호화하는, 3' 상동 암
    을 포함하는 표적화 핵산 벡터.
  8. 제7 항에 있어서, 인간 Pdcd1 유전자의 게놈 DNA 단편은 인간 PD-1 폴리펩티드의 아미노산 26-169를 암호화하는 것을 특징으로 하는 표적화 핵산 벡터.
  9. 인간 부위 및 설치류 부위를 포함하는 인간화 PD-1 폴리펩티드로서,
    인간 부위는 인간 PD-1 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하고 인간 Pdcd1 유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 일부에 의해 암호화되고,
    설치류 부위는 설치류 PD-1 폴리펩티드의 세포내 부위를 포함하고,
    설치류는 마우스 또는 래트인, 인간화 PD-1 폴리펩티드.
  10. 제9 항에 있어서, 인간화 PD-1 폴리펩티드는 설치류 PD-1 폴리펩티드의 막관통 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 PD-1 폴리펩티드.
  11. 제9 항 또는 제10 항에 있어서, 인간 부위는 인간 PD-1 폴리펩티드의 아미노산 26-169를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 PD-1 폴리펩티드.
  12. 인간 PD-1을 표적화하는 약물의 특성을 평가하는 방법으로서,
    상기 방법은
    마우스 Pdcd1 프로모터에 작동가능하게 연결된, 내인성 마우스 Pdcd1 자리(locus)에 인간화 Pdcd1 유전자를 게놈 내에 포함하고 있는 마우스에 상기 약물을 투여하는 단계; 및
    상기 약물의 특성을 결정하기 위해 마우스를 모니터링하는 단계
    를 포함하고,
    여기서, 인간화 Pdcd1 유전자는 인간화된 PD-1 폴리펩티드를 암호화하고 인간 Pdcd1 유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 일부를 포함하고,
    인간화 PD-1 폴리펩티드는 인간 부위 및 내인성 부위를 포함하고,
    인간 부위는 인간 PD-1 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하고 인간 Pdcd1 유전자의 엑손 2 및 엑손 3의 일부에 의해 암호화되고,
    내인성 부위는 내인성 마우스 PD-1 폴리펩티드의 세포내 부위를 포함하는, 방법.
  13. 제12 항에 있어서, 인간 PD-1을 표적화하는 약물은 PD-1 길항제인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12 항에 있어서, 인간 PD-1을 표적화하는 약물은 항-인간 PD-1 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제12 항에 있어서, 마우스는 종양을 가지며, 상기 약물의 특성은 약물의 항-종양 효과를 포함하고, 상기 모니터링하는 단계는 종양에 대한 약물의 효과를 결정하기 위해 마우스를 모니터링하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제12 항에 있어서, 인간화 PD-1 폴리펩티드는 마우스 신호 펩티드를 이용하여 마우스의 세포 내에서 번역되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제12 항에 있어서, 인간화 PD-1 폴리펩티드는 내인성 마우스 PD-1 폴리펩티드의 막관통 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제12 항에 있어서, 인간화 PD-1 폴리펩티드의 인간 부위는 인간 PD-1 폴리펩티드의 아미노산 26-169를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제12 항에 있어서, 인간화 Pdcd1 유전자는 내인성 마우스 Pdcd1 엑손 1, 4 및 5를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제12 항에 있어서, 인간화 Pdcd1 유전자는 내인성 Pdcd1 엑손 3의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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