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JP2021094035A - ヒト化プログラム細胞死１遺伝子を持つ非ヒト動物 - Google Patents

ヒト化プログラム細胞死１遺伝子を持つ非ヒト動物 Download PDF

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JP2021094035A
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ブロバ エレナ
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オー． ムジカ アレクサンダー
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Venus Lai Ka-Man
ビーナス ライ カ−マン
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Anteneh Kebbede
ジェイ． マーフィー アンドリュー
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Abstract

【課題】ヒト化プログラム細胞死１遺伝子を持つ非ヒト動物の提供。【解決手段】非ヒト動物、ならびにそれを作成および使用するための方法および組成物が提供されており、ここで前記非ヒト動物はプログラム細胞死１（Ｐｄｃｄ１）遺伝子のヒト化を含む。一部の実施形態では、前記非ヒト動物が、ヒト部分および内因性部分（例えば、非ヒト部分）を含むＰＤ−１ポリペプチドを発現するように、前記非ヒト動物は内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子に対する遺伝子改変を持つとして記述される場合がある。本発明は、例えば、ＰＤ−１ポリペプチドを発現する齧歯類であって、前記ＰＤ−１ポリペプチドがヒト部分および内因性部分を備える齧歯類を提供する。【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１４年６月１９日出願の米国仮特許出願第６２／０１４，１８１号、２
０１４年１２月２日出願の第６２／０８６，５１８号、および２０１５年３月２５日出願
の第６２／１３８，２２１号の優先権の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願
の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
（配列表の参照による組み込み）
２０１５年６月４日に作製され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された
３１９６９＿ＳＥＱ．ｔｘｔという名称の２３ ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの形
態をとる配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。
医学研究と開発の焦点ががん免疫療法に向けられ、顕著な改善がなされてきたが、がん
は今もなお世界中の医療産業の大きな課題である。この大きな課題は、一つには免疫系の
モニタリング機構をうまく逃れるというがん細胞の能力のためであり、これは一部には抗
腫瘍免疫の阻害および／または下方制御の結果である。それでも、抗腫瘍免疫を活性化お
よび／または促進するようにデザインされた新しいがん治療の治療可能性を最適に決定し
、がん細胞がどのように阻害信号を免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に提供するかという分子
的な側面を決定するためのインビボシステムは開発されていない。このようなシステムは
、インビボでの抗腫瘍環境を促進する候補薬剤の治療有効性を評価するためのアッセイ源
を提供する。
本発明は、がん治療のために使用できる新しい治療薬を特定し開発するための改善され
たシステムを許容する非ヒト動物を設計することが望ましいという認識を包含する。本発
明は、自己免疫性（または炎症性）疾患、障害または状態を治療するために使用できる新
しい治療薬を特定し開発するための改善されたシステムを許容する非ヒト動物を設計する
ことが望ましいという認識も包含する。さらに、本発明は、例えば、抗腫瘍免疫を上方修
正するがん治療薬を特定および開発するために使用するには、ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を
持つ、および／またはそうでなければヒトまたはヒト化ＰＤ−１ポリペプチドを発現、含
有または生成する非ヒト動物が望ましいという認識も包含する。一部の実施形態では、本
発明の非ヒト動物は、ＰＤ−１を標的とすることを含む併用療法の特定および開発のため
の、改善されたインビボシステムを提供している。
一部の実施形態では、本発明は、二つの異なる種（例えば、ヒトおよび非ヒト）からの
遺伝物質を含むＰｄｃｄ１遺伝子を備えるゲノムを持つ非ヒト動物を提供している。一部
の実施形態では、本明細書に記述された非ヒト動物のＰｄｃｄ１遺伝子は、ヒトおよび非
ヒト部分を含むＰＤ−１ポリペプチドをコードし、ここでヒトおよび非ヒト部分は互いに
連結して機能的ＰＤ−１ポリペプチドを形成する。一部の実施形態では、本明細書に記述
された非ヒト動物のＰｄｃｄ１遺伝子は、ヒトＰＤ−１ポリペプチドの細胞外領域の全部
または一部を含むＰＤ−１ポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、本発明はＰＤ−１ポリペプチドを発現する非ヒト動物を提供し、
ＰＤ−１ポリペプチドはヒト部分および内因性部分を備える。一部の実施形態では、本発
明のＰＤ−１ポリペプチドは非ヒトシグナルペプチドを持つ非ヒト動物の細胞に翻訳され
、一部の実施形態ではそれは齧歯類シグナルペプチドである。
一部の実施形態では、内因性部分は内因性ＰＤ−１ポリペプチドの細胞内部分を備える
。一部の実施形態では、内因性部分は内因性ＰＤ−１ポリペプチドの膜貫通部分もさらに
備える。一部の実施形態では、内因性部分は、図８に見られるマウスＰＤ−１ポリペプチ
ドの対応するアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、
少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を持
つ。一部の実施形態では、内因性部分は、図８に見られるマウスＰＤ−１ポリペプチドの
対応するアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を持つ。一部の実施形態では、内因
性部分は、図８に見られるマウスＰＤ−１ポリペプチドの対応するアミノ酸配列と同一の
アミノ酸配列を持つ。
一部の実施形態では、ヒト部分はヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸３５〜１４５、
２７〜１４５、２７〜１６９、２６〜１６９または２１〜１７０を備える。一部の実施形
態では、ヒト部分は、図８に見られるヒトＰＤ−１ポリペプチドの対応するアミノ酸配列
と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なく
とも９０％、または少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を備える。一部の実施形態では
、ヒト部分は、図８に見られるヒトＰＤ−１ポリペプチドの対応するアミノ酸配列と実質
的に同一のアミノ酸配列を持つ。一部の実施形態では、ヒト部分は、図８に見られるヒト
ＰＤ−１ポリペプチドの対応するアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を持つ。
一部の実施形態では、ヒト部分および内因性部分を備えるＰＤ−１ポリペプチドは内因
性Ｐｄｃｄ１遺伝子によってコードされる。一部の特定実施形態では、内因性Ｐｄｃｄ１
遺伝子は内因性Ｐｄｃｄ１エクソン１、４および５を備える。一部の特定実施形態では、
内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子は内因性Ｐｄｃｄ１エクソン３の全部または一部をさらに備える
。一部の特定実施形態では、内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子は配列番号：２１を備える。一部の
特定実施形態では、内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子は配列番号：２２を備える。一部の特定実施
形態では、内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子は配列番号：２１および配列番号：２２を備える。
一部の実施形態では、本明細書に記述された非ヒト動物によって発現されるＰＤ−１ポ
リペプチドは、配列番号：６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％
、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を持つ。
一部の実施形態では、本明細書に記述された非ヒト動物によって発現されるＰＤ−１ポリ
ペプチドは、配列番号：６と実質的に同一のアミノ酸配列を持つ。一部の実施形態では、
本明細書に記述された非ヒト動物によって発現されるＰＤ−１ポリペプチドは、配列番号
：６と同一のアミノ酸配列を持つ。
一部の実施形態では、本発明は、ヒトＰｄｃｄ１遺伝子の一つ以上のエクソンの全部ま
たは一部と動作可能なように連結した非ヒトＰｄｃｄ１遺伝子の一つ以上のエクソンを備
えるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子座を提供する。一部の実施形態では、ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝
子座は、ヒトＰｄｃｄ１遺伝子の一つ以上のエクソンに隣接する５’および３’非ヒトＰ
ｄｃｄ１非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに備える。一部の実施形態では、ヒト化Ｐｄｃｄ１
遺伝子座は齧歯類プロモーターの制御下にあり、一部の特定の実施形態では、内因性齧歯
類プロモーターの制御下にある。
一部の実施形態では、ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子座は、ヒトＰｄｃｄ１エクソン２に動作
可能なように連結した非ヒトＰｄｃｄ１エクソン１、３、４および５を備える。一部の実
施形態では、ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子座は、非ヒトＰｄｃｄ１エクソン１、４および５、
ヒトＰｄｃｄ１エクソン２を備え、Ｐｄｃｄ１エクソン３をさらに備え、Ｐｄｃｄ１エク
ソン３はヒト部分および非ヒト部分を備えるが、ここで前記非ヒトおよびヒトエクソンは
動作可能なように連結している。一部の実施形態では、Ｐｄｃｄ１エクソン３のヒト部分
はＰＤ−１柄配列をコードするヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Ｐｄｃｄ１エ
クソン３のヒト部分は約７１ ｂｐのヒトＰｄｃｄ１エクソン３を含む。一部の実施形態
では、Ｐｄｃｄ１エクソン３の非ヒト部分は膜貫通配列をコードするヌクレオチドを含む
。一部の実施形態では、Ｐｄｃｄ１エクソン３の非ヒト部分は約９１ ｂｐの齧歯類Ｐｄ
ｃｄ１エクソン３を含む。
一部の実施形態では、本発明は、内因性部分およびヒト部分を備えるＰｄｃｄ１遺伝子
を備える、非ヒト動物を提供し、ここで内因性部分およびヒト部分は齧歯類Ｐｄｃｄ１プ
ロモーターと動作可能なように連結している。一部の実施形態では、齧歯類Ｐｄｃｄ１プ
ロモーターは内因性齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターである。
一部の実施形態では、内因性部分は内因性Ｐｄｃｄ１エクソン、１、４および５を備え
る。一部の実施形態では、内因性部分は内因性Ｐｄｃｄ１エクソン３の全部または一部を
さらに備える。一部の実施形態では、内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子のエクソン１、３の全部ま
たは一部、４および５は、図８に見られる内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子の対応するエクソン１
、３の全部または一部、４および５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも
７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である。一
部の実施形態では、内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子のエクソン１、３の全部または一部、４およ
び５は、図８に見られる内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子の対応するエクソン１、３の全部または
一部、４および５と実質的に同一である。一部の実施形態では、内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子
のエクソン１、３の全部または一部、４および５は、図８に見られる内因性Ｐｄｃｄ１遺
伝子の対応するエクソン１、３の全部または一部、４および５と同一である。
一部の実施形態では、ヒト部分はヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２１〜１７０、
２６〜１６９、２７〜１６９、２７〜１４５または３５〜１４５をコードする。
一部の実施形態では、ヒト部分はヒトＰｄｃｄ１遺伝子のエクソン２を備える。一部の
実施形態では、ヒト部分はヒトＰｄｃｄ１エクソン３の全部または一部をさらに備える。
一部の実施形態では、ヒトＰｄｃｄ１エクソン２および３の全部または一部は、図８に見
られるヒトＰｄｃｄ１遺伝子の対応するエクソン２および３の全部または一部と少なくと
も５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％
、または少なくとも９５％同一である。一部の実施形態では、ヒトＰｄｃｄ１エクソン２
および３の全部または一部は、図８に見られるヒトＰｄｃｄ１遺伝子の対応するエクソン
２および３の全部または一部と実質的に同一である。一部の実施形態では、ヒトＰｄｃｄ
１エクソン２および３の全部または一部は、図８に見られるヒトＰｄｃｄ１遺伝子の対応
するエクソン２および３の全部または一部と同一である。一部の実施形態では、ヒト部分
は、非ヒト動物の発現のためにコドン最適化された配列を備え、一部の実施形態では齧歯
類での発現、一部の特定の実施形態ではマウスでの発現、一部の特定の実施形態ではラッ
トでの発現のためにコドン最適化されている。
一部の実施形態では、ヒト部分は、配列番号：２３と少なくとも５０％、少なくとも６
０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５
％同一の配列を備える。一部の実施形態では、ヒト部分は配列番号：２３と実質的に同一
の配列を備える。一部の実施形態では、ヒト部分は配列番号：２３と同一の配列を備える
。一部の実施形態では、ヒト部分は配列番号：２３を備える。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記述された非ヒト動物によって生成される
（または発生される）ＰＤ−１ポリペプチドを提供する。一部の特定実施形態では、本明
細書に記述された非ヒト動物によって生成されるＰＤ−１ポリペプチドは、配列番号：６
と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なく
とも９０％、少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を備える。一部の特定実施形態では、
本明細書に記述された非ヒト動物によって生成されるＰＤ−１ポリペプチドは、配列番号
：６と実質的に同一のアミノ酸配列を備える。一部の特定実施形態では、本明細書に記述
された非ヒト動物によって生成されるＰＤ−１ポリペプチドは、配列番号：６と同一のア
ミノ酸配列を備える。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記述された非ヒト動物からの単離細胞また
は組織を提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記述されたＰｄｃｄ１遺
伝子を備える単離細胞または組織を提供する。一部の実施形態では、細胞はリンパ球であ
る。一部の実施形態では、細胞は、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球（例えば、
活性化単球）、ＮＫ細胞、およびＴ細胞（例えば、活性化Ｔ細胞）から選択される。一部
の実施形態では、組織は、脂肪、膀胱、脳、乳房、骨髄、目、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺
、リンパ節、筋肉、膵臓、血漿、血清、皮膚、脾臓、胃、胸腺、精巣、卵子、およびこれ
らの組み合わせから選択される。
一部の実施形態では、本発明は、ゲノムが本明細書に記述されたＰｄｃｄ１遺伝子を備
える非ヒト胚性幹細胞を提供する。一部の実施形態では、非ヒト胚性幹細胞はマウス胚性
幹細胞であり、１２９系、Ｃ５７ＢＬ／６系、またはＢＡＬＢ／ｃ系からのものである。
一部の実施形態では、非ヒト胚性幹細胞はマウス胚性幹細胞であり、１２９系、Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６系、またはこれらの混合物からのものである。一部の実施形態では、非ヒト胚性幹
細胞はマウス胚性幹細胞であり、１２９系およびＣ５７ＢＬ／６系の混合物からのもので
ある。
一部の実施形態では、非ヒト胚性幹細胞は、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番
号：２１、配列番号：２２またはこれらの組み合わせを備えるＰｄｃｄ１遺伝子を備える
ゲノムを持つ。
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物を作るための本明細書に記述された非ヒト
胚性幹細胞の利用法を提供する。一部の特定実施形態では、非ヒト胚性幹細胞はマウス胚
性幹細胞であり、本明細書に記述されたＰｄｃｄ１遺伝子を備えるマウスを作るために使
用される。一部の特定実施形態では、非ヒト胚性幹細胞はラット胚性幹細胞であり、本明
細書に記述されたＰｄｃｄ１遺伝子を備えるラットを作るために使用される。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記述されたＰｄｃｄ１遺伝子を備える非ヒ
ト胚性幹細胞を備える、それから作られる、それから得られる、またはそれから生成され
る非ヒト胚を提供する。一部の特定実施形態では、非ヒト胚は齧歯類胚であり、一部の実
施形態ではマウス胚、一部の実施形態ではラット胎芽である。
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物を作るための本明細書に記述された非ヒト
胎芽の利用法を提供する。一部の特定実施形態では、非ヒト胚性幹細胞はマウス胚性幹細
胞であり、本明細書に記述されたＰｄｃｄ１遺伝子を備えるマウスを作るために使用され
る。一部の特定実施形態では、非ヒト胚はラット胚であり、本明細書に記述されたＰｄｃ
ｄ１遺伝子を備えるラットを作るために使用される。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記述された標的化ベクター（または核酸構
築物）を提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記述されたヒト化Ｐｄｃ
ｄ１遺伝子を備える標的化ベクター（または核酸構築物）を提供する。一部の実施形態で
は、本発明は、ヒト細胞外領域の全部または一部を備えるＰＤ−１ポリペプチドをコード
するＰｄｃｄ１遺伝子を備える標的化ベクター（または核酸構築物）を提供し、一部の特
定実施形態では、ヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２１〜１７０、２６〜１６９、２
７〜１６９、２７〜１４５または３５〜１４５を備えるＰＤ−１ポリペプチドである。
一部の実施形態では、標的化ベクター（または核酸構築物）は、ヒトＰｄｃｄ１遺伝子
の一つ以上のエクソンの全部または一部と動作可能なように連結した非ヒトＰｄｃｄ１遺
伝子の一つ以上のエクソンの全部または一部を備える。一部の実施形態では、標的化ベク
ター（または核酸構築物）は、ヒトＰｄｃｄ１遺伝子の一つ以上のエクソンに隣接する５
’および３’非ヒトＰｄｃｄ１非翻訳領域（ＵＴＲ）を備える。一部の実施形態では、標
的化ベクター（または核酸構築物）は一つ以上の選択マーカーを備える。一部の実施形態
では、標的化ベクター（または核酸構築物）は一つ以上の部位特異的組み換え部位を備え
る。一部の実施形態では、標的化ベクター（または核酸構築物）はヒトＰｄｃｄ１エクソ
ン２を備える。一部の実施形態では、標的化ベクター（または核酸構築物）はヒトＰｄｃ
ｄ１エクソン２およびヒトＰｄｃｄ１エクソン３の全部または一部を備える。
一部の実施形態では、本発明は、改変非ヒト胚性幹細胞を作るための本明細書に記述さ
れた標的化ベクター（または核酸構築物）の利用法を提供する。一部の実施形態では、本
発明は、改変非ヒト胚を作るための本明細書に記述された標的化ベクター（または核酸構
築物）の利用法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、改変非ヒト動物を作るため
の本明細書に記述された標的化ベクター（または核酸構築物）の利用法を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子からＰＤ−１ポリペプチドを
発現する非ヒト動物を作る方法を提供しており、ここでＰＤ−１ポリペプチドはヒト配列
を備え、方法は、（ａ）齧歯類胚性幹細胞の内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子にゲノムフラグメン
トを挿入する工程であって、前記ゲノムフラグメントが、ヒトＰＤ−１ポリペプチドの全
部または一部をコードするヌクレオチド配列を備える工程と、（ｂ）（ａ）で生成された
齧歯類胚性幹細胞を取得する工程と、（ｂ）の齧歯類胚性幹細胞を使用して齧歯類を作る
工程とを含む。
一部の実施形態では、ヒト配列はヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸３５〜１４５、
２７〜１４５、２７〜１６９、２６〜１６９または２１〜１７０を備える。
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列はヒトＰｄｃｄ１エクソン２を備える。一部の
実施形態では、ヌクレオチド配列はヒトＰｄｃｄ１エクソン３の全部または一部をさらに
備える。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は一つ以上の選択マーカーを備える。一
部の実施形態では、ヌクレオチド配列は一つ以上の部位特異的組み換え部位を備える。
一部の実施形態では、本発明は、そのゲノムが、ヒト部分および内因性部分を持つＰＤ
−１ポリペプチドをコードするＰｄｃｄ１遺伝子を備え、前記部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プ
ロモーターに動作可能なように連結している非ヒト動物を作る方法を提供し、方法は、ヒ
ト部分および内因性部分を持つＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰｄｃｄ１遺伝子を非
ヒト動物のゲノムが備え、前記部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターに動作可能なように
連結しており、それによって前記非ヒト動物を作るように、非ヒト動物のゲノムを改変す
る工程を含む。
一部の実施形態では、齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターは内因性齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモ
ーターである。
一部の実施形態では、ヒト部分はヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸３５〜１４５、
２７〜１４５、２７〜１６９、２６〜１６９または２１〜１７０を備える。
一部の実施形態では、Ｐｄｃｄ１遺伝子はヒトＰｄｃｄ１エクソン２を含むように改変
される。一部の実施形態では、Ｐｄｃｄ１遺伝子はヒトＰｄｃｄ１エクソン２およびヒト
Ｐｄｃｄ１エクソン３の全部または一部を含むように改変される。
一部の実施形態では、非ヒト動物のゲノムの改変は非ヒト胚性幹細胞で実施され、その
後、前記非ヒト胚性幹細胞で非ヒト動物を生成する。一部の特定実施形態では、非ヒト胚
は齧歯類胚性幹細胞であり、一部の実施形態ではマウス胚性幹細胞、一部の実施形態では
ラット胚性幹細胞である。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記述された方法によって得られた非ヒト動
物を提供する。
一部の実施形態では、本発明は非ヒト動物の腫瘍増殖を減少させる方法を提供し、方法
は、そのゲノムが、ヒト部分および内因性部分を持つＰＤ−１ポリペプチドをコードする
Ｐｄｃｄ１遺伝子を備え、前記部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能なように
連結している非ヒト動物に、ヒトＰＤ−１を標的とする薬剤を投与する工程を含み、投与
は、腫瘍増殖が非ヒト動物で減少する条件下でそれに十分な時間の間行われる。
一部の実施形態では、本発明は非ヒト動物の腫瘍細胞を殺す方法を提供し、方法は、そ
のゲノムが、ヒト部分および内因性部分を持つＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰｄｃ
ｄ１遺伝子を備え、前記部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能なように連結し
ている非ヒト動物に、ヒトＰＤ−１を標的とする薬剤を投与する工程を含み、投与は、薬
剤が非ヒト動物の腫瘍細胞の殺傷を媒介する条件下でそれに十分な時間の間行われる。
一部の実施形態では、本発明は、ヒトＰＤ−１を標的とする薬剤の薬物動態特性を評価
する方法を提供し、方法は、そのゲノムが、ヒト部分および内因性部分を持つＰＤ−１ポ
リペプチドをコードするＰｄｃｄ１遺伝子を備える非ヒト動物に薬剤を投与する工程であ
って、前記部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能なように連結している工程と
、ヒトＰＤ−１を標的とする薬剤の一つ以上の薬物動態特性を決定するためにアッセイを
実施する工程とを含む。
多くの実施形態で、本明細書に記述された非ヒト動物は、そのゲノムがヒト部分および
内因性部分を持つＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰｄｃｄ１遺伝子を含む齧歯類であ
り、前記部分は齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能なように連結している。多くの
実施形態では、齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターは内因性齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターで
ある。多くの実施形態では、ヒト部分はヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸３５〜１４
５、２７〜１４５、２７〜１６９、２６〜１６９または２１〜１７０を備える。
一部の実施形態では、ヒトＰＤ−１を標的とする薬剤はＰＤ−１拮抗薬である。一部の
実施形態では、ヒトＰＤ−１を標的とする薬剤はＰＤ−１作動薬である。一部の実施形態
では、ヒトＰＤ−１を標的とする薬剤は抗ＰＤ−１抗体である。一部の実施形態では、ヒ
トＰＤ−１を標的とする薬剤は、静脈内、腹腔内、または皮下に投与される。
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物がヒト部分および内因性部分を備えるＰＤ
−１ポリペプチドを発現する、非ヒト動物モデルを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物が内因性部分およびヒト部分を備えるＰｄ
ｃｄ１遺伝子を備える、非ヒト動物を提供し、ここで内因性部分およびヒト部分は齧歯類
Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能なように連結している。
一部の実施形態では、本発明は、（ａ）そのゲノムが、内因性部分およびヒト部分を含
むＰｄｃｄ１遺伝子を備える非ヒト動物を提供する工程であって、内因性部分およびヒト
部分が非ヒト動物Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能なように連結している工程と、（ｂ
）（ａ）の齧歯類の一つ以上の腫瘍細胞を移植する工程とによって得らえる非ヒト動物腫
瘍モデルを提供し、それによって前記非ヒト動物腫瘍モデルを提供する。
一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物腫瘍モデルは齧歯類腫瘍モデルである。一部
の実施形態では、非ヒト動物Ｐｄｃｄ１プロモーターは齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターで
ある。
一部の実施形態では、本発明は薬剤またはワクチンの特定または検証方法を提供し、方
法は、そのゲノムがＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰｄｃｄ１遺伝子を含む非ヒト動
物に薬剤またはワクチンを送達する工程であって、ＰＤ−１ポリペプチドがヒト部分およ
び内因性部分を含む工程と、薬剤またはワクチンに対する免疫反応、薬剤もしくはワクチ
ンの安全性プロファイル、または疾患、障害もしくは状態への効果の一つ以上をモニター
する工程とを含む。一部の実施形態では、安全性プロファイルのモニタリングには、非ヒ
ト動物が、薬剤またはワクチン送達の結果として副作用または有害反応を呈するかどうか
を決定することを含む。一部の実施形態では、副作用または有害反応は、罹患率、死亡率
、体重の変化、一つ以上の酵素レベルの変化（例えば、肝臓）、一つ以上の臓器の重量の
変化、機能の喪失（例えば、感覚、運動、臓器など）、一つ以上の疾患に対する感受性の
増加、非ヒト動物のゲノムの改変、食物摂取および一つ以上の疾患の合併症の増加または
減少から選択される。一部の実施形態では、疾患、障害または状態が非ヒト動物に誘発さ
れる。一部の実施形態では、非ヒト動物に誘発される疾患、障害または状態は、治療を必
要とする一人以上のヒト患者が患っている疾患、障害または状態と関連している。一部の
特定実施形態では、薬剤は抗体である。
一部の特定実施形態では、本発明は、薬品としての使用など医学で使用するための薬剤
またはワクチンの開発での本明細書に記述された非ヒト動物の利用法を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、がん、新生物、感染症、炎症性の疾患、障害または状
態、または自己免疫性の疾患、障害または状態を治療するための薬品の製造における、本
明細書に記述された非ヒト動物の利用法を提供する。
さまざまな実施形態で、本発明のＰｄｃｄ１遺伝子は本明細書に記述されたＰｄｃｄ１
遺伝子を含む。さまざまな実施形態で、本発明のＰｄｃｄ１遺伝子は、ヒト部分および内
因性部分を持つＰＤ−１ポリペプチドをコードし、前記部分は齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモー
ターと動作可能なように連結している。さまざまな実施形態で、齧歯類プロモーターは内
因性齧歯類プロモーターである。さまざまな実施形態で、ヒト部分はヒトＰｄｃｄ１エク
ソン２を備える。さまざまな実施形態で、ヒト部分はヒトＰｄｃｄ１エクソン２を備え、
ヒトＰｄｃｄ１エクソン３の全部または一部をさらに備える。
さまざまな実施形態で、本発明のＰＤ−１ポリペプチドは本明細書に記述されたＰＤ−
１ポリペプチドを含む。さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物は、全長内因性非ヒ
トＰＤ−１ポリペプチドを検出可能な程度には発現しない。さまざまな実施形態で、本発
明の非ヒト動物は、内因性非ヒトＰＤ−１ポリペプチドの細胞外部分を検出可能な程度に
は発現しない。さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物は、内因性非ヒトＰＤ−１ポ
リペプチドのＮ末端免疫グロブリンＶ領域を検出可能な程度には発現しない。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物は齧歯類であり、一部の実施形態ではマウ
スであり、一部の実施形態ではラットである。一部の実施形態では、本発明のマウスは、
１２９系、ＢＡＬＢ／Ｃ系、Ｃ５７ＢＬ／６系、および混合１２９ｘＣ５７ＢＬ／６系か
ら成る群から選択され、一部の特定実施形態では５０％ １２９および５０％ Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６であり、一部の特定実施形態では２５％ １２９および７５％ Ｃ５７ＢＬ／６で
ある。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＰＤ−１ポリペプチドを発現する齧歯類であって、前記ＰＤ−１ポリペプチドがヒト部
分および内因性部分を備える齧歯類。
（項目２）
前記ＰＤ−１ポリペプチドが齧歯類シグナルペプチドで前記齧歯類の細胞に翻訳される
、項目１に記載の齧歯類。
（項目３）
前記内因性部分が内因性ＰＤ−１ポリペプチドの細胞内部分を備える、項目１または２
に記載の齧歯類。
（項目４）
前記内因性部分が内因性ＰＤ−１ポリペプチドの膜貫通部分をさらに備える、項目３に
記載の齧歯類。
（項目５）
前記内因性部分が、図８に見られるマウスＰＤ−１ポリペプチドの対応するアミノ酸配
列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少な
くとも９０％、または少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を持つ、項目４に記載の齧歯
類。
（項目６）
前記内因性部分が、図８に見られるマウスＰＤ−１ポリペプチドの対応するアミノ酸配
列と同一のアミノ酸配列を持つ、項目４に記載の齧歯類。
（項目７）
前記ヒト部分がヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸３５〜１４５を備える、項目１〜
６のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目８）
前記ヒト部分がヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２７〜１４５を備える、項目１〜
６のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目９）
前記ヒト部分がヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２６〜１６９を備える、項目１〜
６のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１０）
前記ヒト部分が、図８に見られるヒトＰＤ−１ポリペプチドの対応するアミノ酸配列と
少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくと
も９０％、または少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を備える、項目１〜６のいずれか
一項に記載の齧歯類。
（項目１１）
前記ヒト部分が、図８に見られるヒトＰＤ−１ポリペプチドの対応するアミノ酸配列と
同一のアミノ酸配列を備える、項目１〜６のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１２）
ヒト部分および内因性部分を備える前記ＰＤ−１ポリペプチドが内因性Ｐｄｃｄ１遺伝
子によってコードされる、項目１〜１１のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１３）
前記内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子が内因性Ｐｄｃｄ１エクソン１、４および５を備える、項
目１２に記載の齧歯類。
（項目１４）
前記内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子が内因性Ｐｄｃｄ１エクソン３の全部または一部をさらに
備える、項目１３に記載の齧歯類。
（項目１５）
内因性部分およびヒト部分を備えるＰｄｃｄ１遺伝子を備える齧歯類であって、前記内
因性およびヒト部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能なように連結した齧歯類
。
（項目１６）
前記齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターが内因性齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターである、項
目１５に記載の齧歯類。
（項目１７）
前記内因性部分が内因性Ｐｄｃｄ１エクソン１、４および５を備える、項目１５または
１６に記載の齧歯類。
（項目１８）
前記内因性部分が内因性Ｐｄｃｄ１エクソン３の全部または一部をさらに備える、項目
１７に記載の齧歯類。
（項目１９）
内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子のエクソン１、３の全部または一部、４および５が、図８に見
られる内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子の対応するエクソン１、３の全部または一部、４および５
と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なく
とも９０％、または少なくとも９５％同一である、項目１７または１８に記載の齧歯類。
（項目２０）
前記ヒト部分がヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２６〜１６９をコードする、項目
１５〜１９のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目２１）
前記ヒト部分がヒトＰｄｃｄ１遺伝子のエクソン２を備える、項目１５〜１９のいずれ
か一項に記載の齧歯類。
（項目２２）
前記ヒト部分がヒトＰｄｃｄ１エクソン３の全部または一部をさらに備える、項目２１
に記載の齧歯類。
（項目２３）
ヒトＰｄｃｄ１エクソン２および３の全部または一部が、図８に見られるヒトＰｄｃｄ
１遺伝子の対応するエクソン２および３の全部または一部と少なくとも５０％、少なくと
も６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも
９５％同一である、項目２２に記載の齧歯類。
（項目２４）
前記ヒト部分が前記齧歯類の発現のためにコドン最適化された配列を備える、項目２２
に記載の齧歯類。
（項目２５）
前記ヒト部分が配列番号：２３を備える、項目２２に記載の齧歯類。
（項目２６）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目１〜２５のいずれか一項に記載の齧歯類
。
（項目２７）
項目１〜２６のいずれか一項の齧歯類によって生産されるＰＤ−１ポリペプチド。
（項目２８）
前記ＰＤ−１ポリペプチドが、図８に見られるヒト化ＰＤ−１ポリペプチドと少なくと
も５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％
、または少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を備える、項目２７に記載のＰＤ−１ポリ
ペプチド。
（項目２９）
そのゲノムがヒト部分および内因性部分を持つＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰｄ
ｃｄ１遺伝子を備え、前記部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能なように連結
した、単離齧歯類細胞または組織。
（項目３０）
前記齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターが内因性齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターである、項
目２９に記載の齧歯類細胞または組織。
（項目３１）
前記ヒト部分がヒトＰｄｃｄ１エクソン２を備える、項目２９または３０に記載の単離
細胞または組織。
（項目３２）
前記ヒト部分がヒトＰｄｃｄ１エクソン３の全部または一部をさらに備える、項目３１
に記載の単離細胞または組織。
（項目３３）
前記齧歯類細胞または組織がマウス細胞もしくはマウス組織、またはラット細胞もしく
はラット組織である、項目２９〜３２のいずれか一項に記載の単離齧歯類細胞または組織
。
（項目３４）
そのゲノムがヒト部分および内因性部分を持つＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰｄ
ｃｄ１遺伝子を備え、前記部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能なように連結
した、齧歯類胚性幹細胞。
（項目３５）
前記齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターが内因性齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターである、項
目３４に記載の齧歯類胚性幹細胞。
（項目３６）
前記ヒト部分がヒトＰｄｃｄ１エクソン２を備える、項目３４または３５に記載の齧歯
類胚性幹細胞。
（項目３７）
前記ヒト部分がヒトＰｄｃｄ１エクソン３の全部または一部をさらに備える、項目３６
に記載の齧歯類胚性幹細胞。
（項目３８）
前記齧歯類胚性幹細胞がマウス胚性幹細胞であり、１２９系、Ｃ５７ＢＬ系、またはそ
れらの混合である、項目３４〜３７のいずれか一項に記載の齧歯類胚性幹細胞。
（項目３９）
前記齧歯類胚性幹細胞がマウス胚性幹細胞であり、１２９およびＣ５７ＢＬ系の混合で
ある、項目３８に記載の齧歯類胚性幹細胞。
（項目４０）
項目３４〜３９のいずれか一項に記載の胚性幹細胞から生成される齧歯類胚。
（項目４１）
内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子からＰＤ−１ポリペプチドを発現する齧歯類を作る方法であっ
て、前記ＰＤ−１ポリペプチドがヒト配列を備え、前記方法が、
（ａ）齧歯類胚性幹細胞の内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子にゲノムフラグメントを挿入する
工程であって、前記ゲノムフラグメントが、ヒトＰＤ−１ポリペプチドの全部または一部
をコードするヌクレオチド配列を備える工程と、
（ｂ）（ａ）で生成された齧歯類胚性幹細胞を得る工程と、
（ｃ）（ｂ）の齧歯類胚性幹細胞を使用して齧歯類を作る工程とを含む方法。
（項目４２）
前記ヒト配列がヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸３５〜１４５を備える、項目４１
に記載の方法。
（項目４３）
前記ヒト配列がヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２７〜１４５を備える、項目４１
に記載の方法。
（項目４４）
前記ヒト配列がヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２６〜１６９を備える、項目４１
に記載の方法。
（項目４５）
前記ヌクレオチド配列がヒトＰｄｃｄ１エクソン２を備える、項目４１〜４４のいずれ
か一項に記載の方法。
（項目４６）
前記ヌクレオチド配列がヒトＰｄｃｄ１エクソン３の全部または一部をさらに備える、
項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ヌクレオチド配列が一つ以上の選択マーカーを備える、項目４１〜４６のいずれか
一項に記載の方法。
（項目４８）
前記ヌクレオチド配列が一つ以上の部位特異的組み換え部位を備える、項目４１〜４７
のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
そのゲノムがヒト部分および内因性部分を持つＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰｄ
ｃｄ１遺伝子を備え、前記部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能なように連結
した、齧歯類を作る方法であって、前記方法が、
それがヒト部分および内因性部分を持つＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰｄｃｄ
１遺伝子を備え、前記部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能なように連結して
おり、それによって前記齧歯類を作るように、齧歯類の前記ゲノムを改変する工程を含む
方法。
（項目５０）
前記齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターが内因性齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターである、項
目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記ヒト部分がヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸３５〜１４５を備える、項目４９
に記載の方法。
（項目５２）
前記ヒト部分がヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２７〜１４５を備える、項目４９
に記載の方法。
（項目５３）
前記ヒト部分がヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２６〜１６９を備える、項目４９
に記載の方法。
（項目５４）
前記Ｐｄｃｄ１遺伝子がヒトＰｄｃｄ１エクソン２を含むように改変される、項目４９
〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記Ｐｄｃｄ１遺伝子が、ヒトＰｄｃｄ１エクソン２およびヒトＰｄｃｄ１エクソン３
の全部または一部を含むように改変される、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目４１〜５５のいずれか一項に記載の方法
。
（項目５７）
項目４１〜５６のいずれか一項に記載の方法から取得可能な齧歯類。
（項目５８）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目５７に記載の齧歯類。
（項目５９）
齧歯類の腫瘍増殖を減少させる方法であって、前記方法が、
そのゲノムがヒト部分および内因性部分を持つＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰ
ｄｃｄ１遺伝子を備え、前記部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能なように連
結した齧歯類に、ヒトＰＤ−１を標的とする薬剤を投与する工程を含み、
前記投与が、前記齧歯類で腫瘍増殖が減少するのに十分な条件下および時間の間実施
される方法。
（項目６０）
齧歯類の腫瘍細胞を殺傷する方法であって、前記方法が、
そのゲノムがヒト部分および内因性部分を持つＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰ
ｄｃｄ１遺伝子を備え、前記部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能なように連
結した齧歯類に、ヒトＰＤ−１を標的とする薬剤を投与する工程を含み、
前記投与が、前記腫瘍細胞の殺傷を媒介するのに十分な条件下および時間の間実施さ
れる方法。
（項目６１）
ヒトＰＤ−１を標的とする薬剤の薬物動態特性を評価する方法であって、前記方法が、
そのゲノムがヒト部分および内因性部分を持つＰＤ−１ポリペプチドをコードするＰ
ｄｃｄ１遺伝子を備え、前記部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能なように連
結した齧歯類に、前記薬剤を投与する工程と、
ＰＤ−１を標的とする前記薬剤の一つ以上の薬物動態特性を決定するためにアッセイ
を実施する工程とを含む方法。
（項目６２）
前記ヒト部分がヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸３５〜１４５を備える、項目５９
〜６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記ヒト部分がヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２７〜１４５を備える、項目５９
〜６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記ヒト部分がヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２６〜１６９を備える、項目５９
〜６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記ヒトＰＤ−１を標的とする薬剤がＰＤ−１拮抗薬である、項目５９〜６４のいずれ
か一項に記載の方法。
（項目６６）
前記ヒトＰＤ−１を標的とする薬剤がＰＤ−１作動薬である、項目５９〜６４のいずれ
か一項に記載の方法。
（項目６７）
前記ヒトＰＤ−１を標的とする薬剤が抗ＰＤ−１抗体である、項目５９〜６４のいずれ
か一項に記載の方法。
（項目６８）
前記ヒトＰＤ−１を標的とする薬剤が前記齧歯類に静脈内投与される、項目５９〜６７
のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記ヒトＰＤ−１を標的とする薬剤が前記齧歯類に腹腔内投与される、項目５９〜６７
のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記ヒトＰＤ−１を標的とする薬剤が前記齧歯類に皮下投与される、項目５９〜６７の
いずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターが内因性齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターである、項
目５９〜７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目５９〜７１のいずれか一項に記載の方法
。
（項目７３）
齧歯類腫瘍モデルであって、前記齧歯類が、ヒト部分および内因性部分を備えるＰＤ−
１ポリペプチドを発現する齧歯類腫瘍モデル。
（項目７４）
齧歯類腫瘍モデルであって、前記齧歯類が内因性部分およびヒト部分を備えるＰｄｃｄ
１遺伝子を備え、前記内因性およびヒト部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能
なように連結した齧歯類腫瘍モデル。
（項目７５）
齧歯類腫瘍モデルであって、
ａ）内因性部分およびヒト部分を備えるＰｄｃｄ１遺伝子を備える齧歯類を提供する
工程であって、前記内因性およびヒト部分が齧歯類Ｐｄｃｄ１プロモーターと動作可能な
ように連結した工程と、
ｂ）（ａ）の前記齧歯類の一つ以上の腫瘍細胞を移植し、
それによって前記齧歯類腫瘍モデルを提供する工程とによって得らえる齧歯類腫瘍モ
デル。
（項目７６）
前記齧歯類がマウスまたはラットである、項目７３〜７５のいずれか一項に記載の齧歯
類腫瘍モデル。
（項目７７）
前記齧歯類がマウスである、項目７６に記載の齧歯類腫瘍モデル。
（項目７８）
前記マウスが、１２９系、Ｃ５７ＢＬ／６系、および混合１２９×Ｃ５７ＢＬ／６系か
ら成る群から選択される、項目７７に記載の齧歯類腫瘍モデル。
（項目７９）
前記マウスが２５％ １２９および７５％ Ｃ５７ＢＬ／６である、項目７８に記載の
齧歯類腫瘍モデル。
本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」という用語は同意義として使用さ
れる。約／およその有無に関わらず、本明細書で使用される任意の数字は、当業者によっ
て理解される任意の正常変動を網羅することが意図される。
本発明のその他の特徴、目的および利益は、以下の特定実施形態の詳細説明で明らかで
ある。しかし、本発明の特定の実施形態を示しながらの詳細説明は、例示のみでなされる
ものであり、限定を意味しないことを理解すべきである。本発明の範囲内のさまざまな変
更および修正は、詳細説明から当業者には明らかとなるであろう。
以下の図から成る本明細書に含まれる図面は、例示目的のみであり限定を目的としない
。
非ヒト（例えば、マウス）およびヒトプログラム細胞死１（Ｐｄｃｄ１）遺伝子のゲノム構造の図（正確な縮尺ではない）を示す。エクソンおよび非翻訳領域（ＵＴＲ）は各エクソンの下方および各ＵＴＲの上方に数字が付けられている。 非ヒトプログラム細胞死１（Ｐｄｃｄ１）遺伝子のヒト化のための例示的方法の図（正確な縮尺ではない）を示す。選択されたヌクレオチド接合部の場所は各接合部の下の線で示されている。これらの選択されたヌクレオチド接合部の配列は配列番号で示される。 実施例１に記述されたアッセイで使用されるプローブのおよその場所を示す、マウスおよびヒトプログラム細胞死１（Ｐｄｃｄ１）遺伝子のゲノム構造の図（正確な縮尺ではない）を示す。 マウスおよび／またはヒト化ＰＤ−１を発現する実施例１に記述された内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子のヒト化のためのヘテロ接合性の野生型マウスおよびマウスから単離されたＣＤ１９およびＣＤ８でゲートされた例示的ヒストグラムを示す。刺激および非刺激細胞集団が示されており、アイソタイプ対照で染色された細胞も示されている。 実施例１に記述された内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子のヒト化のためのホモ接合性のマウスの２１日にわたる例示的腫瘍増殖曲線を示す。対照：ＰＤ−１に特異的でない抗体、ａ−ｈＰＤ−１ Ａｂ：ヒトＰＤ−１に対して特異的な抗体。矢印は抗体治療の日を示す。２１日目の無腫瘍マウスの数が各治療群に対して示されている。 抗ＰＤ−１抗体を使用した治療後の、実施例１に記述された内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子のヒト化のためのホモ接合性のマウスにおける脾臓のＣＤ８ｂ、ＣＤ３、ＩＦＮ−ｇおよびＰＤ−１ ｍＲＮＡの例示的リアルタイムＰＣＲ解析を示す。Ａ、群あたりマウス５匹の平均。Ｂ、各治療群の個別マウスの発現レベル。対照：ＰＤ−１に特異的でない抗体、α−ＰＤ−１：抗ＰＤ−１抗体。 ０．３〜２５ ｍｇ／ｋｇの抗ｈＰＤ−１抗体または２５ ｍｇ／ｋｇの対照抗体（ＰＤ−１に特異的でない抗体）を投与された、実施例１に記述の内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子のヒト化のためのホモ接合性のマウスにおける６０日にわたる例示的腫瘍増殖曲線を示す。矢印は抗体治療の日を示す。６０日目の無腫瘍マウスの数が各治療群に対して示されている。 例示的マウス、ヒトおよびヒト化Ｐｄｃｄ１およびＰＤ−１配列、ならびに非ヒトＰｄｃｄ１遺伝子のヒト化のための例示的ヒト核酸配列を示す。ｍＲＮＡ配列については、太字はコード配列および連続的エクソンを示し、示される場合、交互の下線文字で分けられている。ヒト化ｍＲＮＡ配列については、ヒト配列は括弧に入っている。タンパク質配列については、シグナルタンパク質は下線、細胞外配列は太字、免疫グロブリンＶ領域配列は括弧内、細胞内配列は斜字で示されており、ヒト化タンパク質配列については、非ヒト配列は通常の文字で示され、ヒト配列は太字で示されている。 例示的マウス、ヒトおよびヒト化Ｐｄｃｄ１およびＰＤ−１配列、ならびに非ヒトＰｄｃｄ１遺伝子のヒト化のための例示的ヒト核酸配列を示す。ｍＲＮＡ配列については、太字はコード配列および連続的エクソンを示し、示される場合、交互の下線文字で分けられている。ヒト化ｍＲＮＡ配列については、ヒト配列は括弧に入っている。タンパク質配列については、シグナルタンパク質は下線、細胞外配列は太字、免疫グロブリンＶ領域配列は括弧内、細胞内配列は斜字で示されており、ヒト化タンパク質配列については、非ヒト配列は通常の文字で示され、ヒト配列は太字で示されている。 例示的マウス、ヒトおよびヒト化Ｐｄｃｄ１およびＰＤ−１配列、ならびに非ヒトＰｄｃｄ１遺伝子のヒト化のための例示的ヒト核酸配列を示す。ｍＲＮＡ配列については、太字はコード配列および連続的エクソンを示し、示される場合、交互の下線文字で分けられている。ヒト化ｍＲＮＡ配列については、ヒト配列は括弧に入っている。タンパク質配列については、シグナルタンパク質は下線、細胞外配列は太字、免疫グロブリンＶ領域配列は括弧内、細胞内配列は斜字で示されており、ヒト化タンパク質配列については、非ヒト配列は通常の文字で示され、ヒト配列は太字で示されている。 例示的マウス、ヒトおよびヒト化Ｐｄｃｄ１およびＰＤ−１配列、ならびに非ヒトＰｄｃｄ１遺伝子のヒト化のための例示的ヒト核酸配列を示す。ｍＲＮＡ配列については、太字はコード配列および連続的エクソンを示し、示される場合、交互の下線文字で分けられている。ヒト化ｍＲＮＡ配列については、ヒト配列は括弧に入っている。タンパク質配列については、シグナルタンパク質は下線、細胞外配列は太字、免疫グロブリンＶ領域配列は括弧内、細胞内配列は斜字で示されており、ヒト化タンパク質配列については、非ヒト配列は通常の文字で示され、ヒト配列は太字で示されている。
（用語の定義）
本発明は本明細書に記述された特定の方法および実験条件に限定されないが、それはこ
のような方法および条件は変化する場合があるからである。本発明の範囲は請求項によっ
て定義されるので、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを記述する目的で
使用されており、意図しないことも理解される。
別段の定めがない限り、本明細書に使用されるすべての用語および語句は、そうでない
ことが明確に示されている、または用語または語句が使用されている文脈から明らかに明
白な場合を除き、その用語および語句が当技術分野で獲得された意味を含む。本明細書で
説明したものと類似または同等な任意の方法および材料も、本発明の実施または試験に使
用できるが、特定の方法および材料をこれから説明する。本明細書で言及されたすべての
出版物は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で一つ以上の対象の値に適用される場合、「およそ」という用語は指定された
参照値と類似の値を指す。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、
別段定めがない限り、または文脈からそうでないことが明らかな場合（このような数字が
可能な値の１００％を超える場合を除く）を除いて、指定された参照値のいずれかの方向
に２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％
、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ
未満以内の範囲の値を指す。
「生物学的に活性」という用語は、生物系、インビトロまたは（例えば、生物中の）イ
ンビボで活性を持つ任意の薬剤の特徴を含む。例えば、生物内に存在する時、その生物内
で生物学的効果を持つ薬剤は生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態では、
タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性な場合、タンパク質またはポリペプチド
の少なくとも一つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの一部は
、「生物学的に活性」な部分と一般的に呼ばれる。
「同等」という用語は、お互いに同一ではない場合があるが、それらの間の比較を許容
するのに十分類似しており、従って観察された差または類似性に基づいて合理的に結論を
出すことができる、二つ以上の薬剤、実在物、状況、状態のセットなどを含む。当業者で
あれば、文脈内において、同等とみなされるために二つ以上のこのような薬剤、実在物、
状況、状況のセットなどに対して、ある所定の状況でどの程度の同一性が必要かを理解す
るであろう。
例えば、保存的アミノ酸置換などでの「保存的」という用語は、類似の化学特性（例え
ば、電荷または疎水性）を備える側鎖Ｒ基を持つ別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の
置換を含む。一般的に、保存的アミノ酸置換は、関心タンパク質の機能特性（例えば、リ
ガンドに結合する受容体の能力）を実質的に変化させない。類似の化学特性を備える側鎖
を持つアミノ酸群の例には次が含まれる：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およ
びイソロイシンなどの脂肪族側鎖、セリンおよびスレオニンなどの脂肪族−ヒドロキシル
側鎖、アスパラギンおよびグルタミンなどのアミド含有側鎖、フェニルアラニン、チロシ
ン、およびトリプトファンなどの芳香族側鎖、リジン、アルギニン、およびヒスチジンな
どの塩基性側鎖、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性側鎖、ならびにシステイ
ンおよびメチオニンなどの硫黄含有側鎖。保存的アミノ酸置換基には、例えば、バリン／
ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン
／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが含まれる
。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えばアラニンスキャニング変異誘発な
どで使用される、アラニンを含むタンパク質の任意の未変性残基の置換である可能性があ
る。一部の実施形態では、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｅｘｈａｕｓｔ
ｉｖｅ Ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｔｉｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−４５（これは参照に
より本明細書に組み込まれる）に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスで正の値を
持つ保存的置換が行われる。一部の実施形態では、置換は中等度に保存的な置換であり、
ここで置換はＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスで負でない値を持つ。
「対照」という用語は、結果がそれに対して比較される基準としての「対照」という当
技術分野で理解される意味を含む。一般的に、対照は、このような変数についての結論を
出すために、変数を分離することによって実験の完全性を増加させるために使用される。
一部の実施形態では、対照は、コンパレーターを提供するために、試験反応またはアッセ
イと同時に実施される反応またはアッセイである。本明細書で使用される場合、「対照」
は、「対照動物」を含む場合がある。「対照動物」は本明細書に記述された改変、本明細
書に記述されたものとは異なる改変を持つか、または未改変（すなわち、野生型動物）で
ある場合がある。一つの実験では、「試験」（すなわち、試験されている変数）が適用さ
れる。第二の実験では、「対照」、試験されている変数は適用されない。一部の実施形態
では、対照は歴史的対照（すなわち、以前に実施された試験またはアッセイの、または以
前に知られた量または結果）である。一部の実施形態では、対照は印刷されたかまたはそ
れ以外の方法で保存された記録であるか、またはそれを含む。対照は、陽性対照または陰
性対照である場合がある。
「破壊」という用語は、（例えば、遺伝子または遺伝子座などの内因性相同配列での）
ＤＮＡ分子での相同組み換えイベントの結果を含む。一部の実施形態では、破壊は、ＤＮ
Ａ配列の挿入、欠失、置換、交換、ミスセンス変異、もしくはフレームシフト、またはこ
れらの任意の組み合わせを達成または示す場合がある。挿入は、遺伝子全体または遺伝子
のフラグメント（例えば、エクソン）の挿入を含む場合があり、これは内因性配列以外の
起源のもの（例えば、異種配列）であってもよい。一部の実施形態では、破壊は遺伝子ま
たは遺伝子産物の（例えば、遺伝子によってコードされたタンパク質の）発現および／ま
たは活性を増加する場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物の
発現および／または活性を減少する場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子また
はコードされた遺伝子産物（例えば、コードされたタンパク質）の配列を変える場合があ
る。一部の実施形態では、破壊は遺伝子またはコードされた遺伝子産物（例えば、コード
されたタンパク質）を切断または断片化する場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺
伝子またはコードされた遺伝子産物を延長する場合があり、一部の実施形態では、破壊は
融合タンパク質の組立てを達成する場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子また
は遺伝子産物のレベルに影響するが活性には影響しない場合がある。一部の実施形態では
、破壊は遺伝子または遺伝子産物の活性に影響するがレベルには影響しない場合がある。
一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物のレベルに対して顕著な効果を持た
ない場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物の活性に対して顕
著な効果を持たない場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物の
レベルまたは活性のいずれに対しても顕著な効果を持たない場合がある。
「決定する」、「測定する」、「評価する」、「査定する」、「アッセイする」および
「分析する」という用語は互換的に使用されて、測定の任意の形態を指し、要素が存在す
るかどうかを決定することを含む。これらの用語は、定量的および／または定性的決定の
両方を含む。アッセイは相対的または絶対的である場合がある。「の存在をアッセイする
」ことは、存在する何かの量を決定するおよび／またはそれが存在するか不在かを決定す
ることである可能性がある。
「投与レジメン」または「治療レジメン」という用語は、一部の実施形態では、一つ以
上の、一般的には期間を置いて被験者に個別に投与される一式の単位用量を含む。一部の
実施形態では、所定の治療薬剤は推奨投与レジメンを持ち、これには一つ以上の用量が関
与する場合がある。一部の実施形態では、投与レジメンは、それぞれがお互いに同じ長さ
の期間を置いた複数の用量を含み、一部の実施形態では、投与レジメンは複数の用量を含
み、少なくとも二つのことなる期間がこ個別用量を分離している。
「内因性遺伝子座」または「内因性遺伝子」という語句は、親生物または指標生物内に
見られる遺伝子座を含む。一部の実施形態では、内因性遺伝子座は天然で見られる配列を
持つ。一部の実施形態では、内因性遺伝子座は野生型遺伝子座である。一部の実施形態で
は、指標生物は野生型生物である。一部の実施形態では、指標生物は遺伝子操作された生
物である。一部の実施形態では、指標生物は実験室で繁殖された生物（野生型または遺伝
子操作された）である。
「内因性プロモーター」という語句は、例えば、野生型生物で、内因性遺伝子と自然に
関連するプロモーターを含む。
「異種」という用語は、異なる起源からの薬剤または実在物を含む。例えば、ポリペプ
チド、遺伝子、もしくは遺伝子産物、または特定の細胞もしくは生物に存在することに関
連して使用される時、本用語は、関連ポリペプチド、遺伝子、または遺伝子産物が１）人
の手によって遺伝子操作されたこと、２）人の手によって（例えば、遺伝子操作によって
）細胞または生物（またはその前駆体）に導入されたこと、および／または３）関連細胞
または生物（例えば、関連細胞タイプまたは生物タイプ）によって自然には生成されない
、またはその中に存在しないことを明確にする。
「宿主細胞」という用語は、その中に異種（例えば、外来性）核酸またはタンパク質が
導入された細胞を含む。当業者が本開示を読めば、このような用語が特定の主題細胞を指
すだけでなく、このような細胞の子孫を指すためにも使用されることを理解するであろう
。特定の改変は突然変異または環境の影響のために後続世代にも起こる可能性があるので
、このような子孫は、実際は、親細胞と同一でない場合があるが、それでも「宿主細胞」
という用語の範囲内に含まれる。一部の実施形態では、宿主細胞は原核細胞または真核細
胞であるかそれを含む。一般的に、宿主細胞は、細胞が指定される種に関わらず、異種核
酸またはタンパク質の受け入れおよび／または生産に適した任意の細胞である。例示的細
胞には、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）の細胞、細菌細胞（例えば、大
腸菌、バチルス属、ストレプトマイセス属などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞
、酵母細胞（例えば、出芽酵母、分裂酵母、ピヒア メタノリカなど）、植物細胞、昆虫
細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウ
ワバなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または例えば、ハイブリドーマもしくはクアド
ローマなどの細胞融合を含む。一部の実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムス
ター、ラット、またはマウス細胞である。一部の実施形態では、細胞は原核であり以下の
細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇ
ｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（
例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ
）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、
ＨＬ−６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、
ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ
０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍
細胞、および前述細胞から派生する細胞株。一部の実施形態では、細胞は一つ以上のウィ
ルス遺伝子、例えば、ウィルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標
）細胞）を備える。一部の実施形態では、宿主細胞は単離細胞であるかそれを含む。一部
の実施形態では、宿主細胞は組織の一部である。一部の実施形態では、宿主細胞は生物の
一部である。
「ヒト化」という用語は、その構造（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列）が
、非ヒト動物に天然で見られる特定遺伝子またはタンパク質の構造と実質的にまたは全く
同一に対応する部分を含み、関連する特定の非ヒト遺伝子またはタンパク質で見られるも
のとは異なり、その代わりに対応するヒト遺伝子またはタンパク質で見られる同等構造と
より近く対応する部分も含む核酸またはタンパク質を含む。一部の実施形態では、「ヒト
化」遺伝子は、実質的にヒトポリペプチドのもののようなアミノ酸配列を持つポリペプチ
ドをコードする遺伝子（例えば、ヒトタンパク質またはその一部―例えば、その特性的部
分）である。一例を挙げると、膜受容体の場合、「ヒト化」遺伝子は、ヒト細胞外部分の
もののようなアミノ酸配列および非ヒト（例えば、マウス）ポリペプチドのもののような
残りの配列を持つ、細胞内部分の全部または一部を持つポリペプチドをコードする遺伝子
の場合がある。一部の実施形態では、ヒト化遺伝子は、ヒト遺伝子のＤＮＡ配列の少なく
とも一部分を備える。一部の実施形態では、ヒト化遺伝子は、ヒト遺伝子のＤＮＡ配列全
体を備える。一部の実施形態では、ヒト化タンパク質は、ヒトタンパク質に見られる一部
分を持つ配列を備える。一部の実施形態では、ヒト化タンパク質は、ヒトタンパク質の配
列全体を備え、ヒト遺伝子のホモログまたはオルソログに対応する非ヒト動物の内因性遺
伝子座から発現される。
例えば、配列の比較での「同一性」という用語は、ヌクレオチドおよび／またはアミノ
酸配列同一性を測定するために使用できる当技術分野で知られた多くの異なるアルゴリズ
ムによって決定される同一性を含む。一部の実施形態では、本明細書に記述された同一性
は、１０．０のギャップ開始ペナルティ、０．１のギャップ延長ペナルティを用い、Ｇｏ
ｎｎｅｔ類似性マトリックス（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃ
ｔｏｒ Ｉｎｃ．、２００８年）を使用したＣｌｕｓｔａｌＷ ｖ． １．８３ （ｓｌ
ｏｗ） アラインメントを使用して決定される。
「単離された」という用語は、（１）（天然および／または実験環境のいずれかで）最
初に生成された時にそれが関連していた成分の少なくとも一部から分離された、および／
または （２） 人の手によって設計、生産、調製、および／または製造された物質およ
び／または実在物を含む。分離された物質および／または実在物は、それらが最初に関連
していたその他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％
、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％
、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離される場合があ
る。一部の実施形態では、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％
、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％
、または約９９％を超えて純粋である。物質は、それにその他の成分が実質的に含まれな
い場合、「純粋」である。一部の実施形態では、当業者であれば理解するように、例えば
、一つ以上の担体または賦形剤（例えば、緩衝剤、溶媒、水など）などの特定のその他の
成分と組み合わされた後でも、物質はまだ「単離された」または「純粋」とさえもみなさ
れる場合があり、このような実施形態では、物質の単離または純度のパーセントはこのよ
うな担体または賦形剤を含めることなく計算される。一例を挙げると、一部の実施形態で
は、自然界に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの生体高分子は、ａ）
導出の起源またはソースが、自然界の天然状態でそれに付随する成分の一部またはすべて
と関連していない時、ｂ） それが、自然界でそれを生産する種と同じ種のその他のポリ
ペプチドまたは核酸を実質的に含まない時、またはｃ） 自然界でそれを生産する種では
ない細胞またはその他の発現系によって発現されるか、またはそうでなければそれからの
成分と関連している時、「単離された」とみなされる。従って、例えば、一部の実施形態
では、化学的に合成された、または自然界でそれを生産するものとは異なる細胞系で合成
されたポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドとみなされる。あるいはまたは追加
的に、一部の実施形態では、一つ以上の精製技術を受けたポリペプチドは、それが、ａ）
それが自然界で関連している、および／またはｂ） 最初に生産された時にそれが関連
していたその他の成分から分離されている限りは「単離された」ポリペプチドとみなされ
ることができる。
「非ヒト動物」という語句は、ヒトではない任意の脊椎生物を含む。一部の実施形態で
は、非ヒト動物は、円口類、硬骨魚、軟骨魚（例えば、サメまたはエイ）、両生類、は虫
類、哺乳類、および鳥である。一部の実施形態では、非ヒト哺乳類は、霊長類、ヤギ、ヒ
ツジ、ブタ、イヌ、ウシ、または齧歯類である。一部の実施形態では、非ヒト動物はラッ
トまたはマウスなどの齧歯類である。
「核酸」という語句は、オリゴヌクレオチド鎖であるか、またはオリゴヌクレオチド鎖
に組み込むことができる任意の化合物および／または物質を含む。一部の実施形態では、
「核酸」はオリゴヌクレオチド鎖であるか、またはホスホジエステル結合でオリゴヌクレ
オチド鎖組み込むことができる化合物および／または物質である。文脈から明らかになる
ように一部の実施形態では、「核酸」は個別の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／
またはヌクレオシド）を含み、一部の実施形態では、「核酸」は個別の核酸残基を備える
オリゴヌクレオチド鎖を含む。一部の実施形態では、「核酸」はＲＮＡであるかまたはそ
れを備え、一部の実施形態では、「核酸」はＤＮＡであるかまたはそれを備える。一部の
実施形態では、「核酸」は、一つ以上の天然核酸残基を備えるかまたはそれらから成る。
一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上の核酸類似体を備えるかまたはそれらから成
る。一部の実施形態では、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を利用しないという点で
「核酸」とは異なる。例えば、一部の実施形態では、「核酸」は、当技術分野では知られ
ており、骨格にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を持つ、一つ以上の「ペプ
チド核酸」であるか、またはそれらを備え、それらは本発明の範囲内であるとみなされる
。あるいはまたはさらに、一部の実施形態では、「核酸」は、ホスホジエステル結合では
なく、一つ以上のホスホロチオエートおよび／または５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合を
持つ。一部の実施形態では、「核酸」は一つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシ
ン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジ
ン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）であるか、または一つ以上の天然ヌ
クレオシドから成る。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上のヌクレオシド類似体
（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、
３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５ プロピニル−シチジン、Ｃ−５
プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−ウルオロ
ウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シ
チジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デ
アザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグア
ニン、２−チオシチジン、メチル化塩基、インターカレート塩基、およびそれらの組み合
わせ）であるか、またはそれらから成る。一部の実施形態では、「核酸」は、天然核酸の
ものと比べて、一つ以上の修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、
２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）を備える。一部の実施形態
では、「核酸」は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレ
オチド配列を持つ。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上のイントロンを含む。一
部の実施形態では、「核酸」は、天然起源物からの単離、相補的鋳型に基づく重合による
酵素合成（インビボまたはインビトロ）、組み換え細胞または系での複製、および化学合
成の一つ以上によって調製される。一部の実施形態では、「核酸」は、少なくとも３、４
、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５
、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０
、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、
３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、
７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５０
０、４０００、４５００、５０００またはそれを超える残基の長さである。一部の実施形
態では、「核酸」は一本鎖であり、一部の実施形態では、「核酸」は二重鎖である。一部
の実施形態では、「核酸」はポリペプチドをコードするか、またはポリペプチドをコード
する配列の補体である少なくとも一つの要素を備えるヌクレオチド配列を持つ。一部の実
施形態では、「核酸」は酵素活性を持つ。
「動作可能なように連結した」という語句には、記述された要素が、それらが意図され
た方法で機能できるような関係にある並置を含む。コード配列に「動作可能なように連結
した」対照配列は、対照配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように結
合されている。「動作可能なように連結した」配列には、関心の遺伝子と隣接する発現制
御配列および、トランスにまたは距離を置いて作用して対象の遺伝子を制御する発現制御
配列の両方を含む。「発現制御配列」という用語はポリヌクレオチド配列を含み、これは
発現およびそれらが結合されているコード配列のプロセスを引き起こすために必要である
。「発現制御配列」には、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列
、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセシングシグナ
ル、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を強化する配列（すなわち、コザック配
列）、タンパク質安定性を強化する配列、および望ましい場合、タンパク質分泌を強化す
る配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる。例えば、原核生
物では、このような制御配列は一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転
写終結配列を含む一方、真核生物では、一般的に、このような制御配列はプロモーターお
よび転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現およびプロセシン
グのために必須である要素を含むことを意図しており、その存在が有利である追加的要素
、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。
「患者」または「被験者」という用語は、例えば、実験、診断、予防、美容、および／
または治療目的で、それに対して提供された組成物が投与されるまたは投与される場合が
ある任意の生物を含む。一般的な患者には動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒ
ト霊長類、および／またはヒトなどの哺乳類）を含む。一部の実施形態では、患者は非ヒ
ト動物である。一部の実施形態では、患者（例えば、非ヒト動物患者）は、本明細書に記
述された改変、本明細書に記述されたものとは異なる改変を持つ場合、または改変を持た
ない（すなわち、野生型非ヒト動物患者）場合がある。一部の実施形態では、非ヒト動物
は、一つ以上の障害または状態を患っているかまたはそれらにかかりやすい。一部の実施
形態では、非ヒト動物は障害または状態の一つ以上の症状を示す。一部の実施形態では、
非ヒト動物は一つ以上の障害または状態と診断されている。
「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の任意の重合鎖を含む。一部の実施形態では
、ポリペプチドは、自然界に存在するアミノ酸配列を持つ。一部の実施形態では、ポリペ
プチドは、自然界に存在しないアミノ酸配列を持つ。一部の実施形態では、ポリペプチド
は、お互いに別々に自然界に存在する部分を含むアミノ酸配列を持つ（すなわち、例えば
、ヒトおよび非ヒト部分など、二つ以上の異なる生物からのもの）。一部の実施形態では
、ポリペプチドは、それが人の手の作用を通して、設計および／または生産されるという
点で、遺伝子操作されたアミノ酸配列を持つ。
「組み換え」という用語は、組み換え手段によって設計、遺伝子操作、調製、発現、生
成または単離されたポリペプチド（例えば、本明細書に記述されたＰＤ−１ポリペプチド
）を含むことが意図されており、例えば、宿主細胞中にトランスフェクトされた組み換え
発現ベクターを使用して発現されたポリペプチド、組み換え組み合わせヒトポリペプチド
ライブラリから単離されたポリペプチド（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ． Ｒ．， （１９
９７） ＴＩＢ Ｔｅｃｈ． １５：６２−７０； Ａｚｚａｚｙ Ｈ．， ａｎｄ Ｈ
ｉｇｈｓｍｉｔｈ Ｗ． Ｅ．， （２００２） Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５
：４２５−４４５； Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ Ｊ． Ｖ．， ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ Ｊ
． Ｗ． （２００２） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９：１２８−１４５； Ｈｏ
ｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ．， ａｎｄ Ｃｈａｍｅｓ Ｐ． （２０００） Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ２１：３７１−３７８）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対するト
ランスジェニック動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，
Ｌ． Ｄ．， ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２
０：６２８７−６２９５； Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ Ｓ−Ａ．， ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ
Ｌ． Ｌ． （２００２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ １３：５９３−５９７； Ｌｉｔｔｌｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２０００
） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ２１：３６４−３７０； Ｍｕｒｐｈｙ， Ａ
．Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
． Ｕ． Ｓ． Ａ． １１１（１４）：５１５３−５１５８を参照）または選択された
配列要素をお互いにスプライスすることを伴うその他任意の手段によって調製、発現、生
成または単離されたポリペプチドを含む。一部の実施形態では、このような選択された配
列要素の一つ以上は自然界に存在する。一部の実施形態では、このような選択された配列
要素の一つ以上はインシリコで設計される。一部の実施形態では、一つ以上のこのような
選択配列要素は、例えば、天然または合成起源の既知の配列要素の変異誘発（例えば、イ
ンビボまたはインビトロ）から生じる。例えば、一部の実施形態では、組み換えポリペプ
チドは、対象のソース生物（例えば、ヒト、マウスなど）のゲノムに見られる配列から成
る。一部の実施形態では、組み換えポリペプチドは、変異誘発（例えば、非ヒト動物での
、インビトロまたはインビボ）から生じるアミノ酸配列を持ち、従って、組み換えポリペ
プチドのアミノ酸配列は、ポリペプチド配列から由来するが、インビボで非ヒト動物のゲ
ノム内に自然には存在しない場合がある。
「置換」という用語は、それを通して（例えば、ゲノムの）宿主遺伝子座に見られる「
置換された」核酸配列（例えば、遺伝子）がその遺伝子座から取り除かれ、異なる「置換
用」核酸がその場所に配置されるプロセスを含む。一部の実施形態では、置換された核酸
配列および置換用核酸配列は、例えば、それらがお互いに相同である、および／または対
応する要素（例えば、タンパク質コード要素、調節要素など）を含むという点でお互いに
同等である。一部の実施形態では、置換された核酸配列には、プロモーター、エンハンサ
ー、スプライス供与部位、スプライス受容部位、イントロン、エクソン、非翻訳領域（Ｕ
ＴＲ）のうち一つ以上を含み、一部の実施形態では、置換用核酸配列には、一つ以上のコ
ード配列を含む。一部の実施形態では、置換用核酸配列は置換された核酸配列のホモログ
である。一部の実施形態では、置換用核酸配列は置換された配列のオルソログである。一
部の実施形態では、置換用核酸配列はヒト核酸配列であるかまたはそれを備える。一部の
実施形態では、置換用核酸配列がヒト核酸配列であるかまたはそれを備える場合を含め、
置換された核酸配列は齧歯類配列（例えば、マウスまたはラット配列）であるかまたはそ
れを備える。そのように配置された核酸配列は、そのように配置された配列を得るために
使用されるソース核酸配列の一部である一つ以上の調節配列を含む場合がある（例えば、
プロモーター、エンハンサー、５’−または３’−非翻訳領域など）。例えば、さまざま
な実施形態で、置換は、そのように配置された核酸配列（異種配列を備える）からの遺伝
子産物の生産を生じる異種配列を伴う内因性配列の代替であるが、内因性配列の発現の代
替ではない。置換は、内因性配列によってコードされるポリペプチドと類似の機能を持つ
ポリペプチドをコードする核酸配列を持つ内因性ゲノム配列のものである（例えば、内因
性ゲノム配列はＰＤ−１ポリペプチドをコードし、ＤＮＡフラグメントは一つ以上のヒト
ＰＤ−１ポリペプチドをコードする）。さまざまな実施形態で、内因性遺伝子またはその
フラグメントは、対応するヒト遺伝子またはそのフラグメントで置換される。対応するヒ
ト遺伝子またはそのフラグメントは、置換される内因性遺伝子またはそのフラグメントの
オルソログである、またはそれと構造および／もしくは機能が実質的に類似しているかも
しくは同じヒト遺伝子またはフラグメントである。
「プログラム細胞死１タンパク質」または「ＰＤ−１タンパク質」という語句には、Ｔ
細胞調節因子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーに属するタイプＩ膜貫通タンパク質を
含む。ＰＤ−１タンパク質のタンパク質構造には、細胞内アミノ末端免疫グロブリンＶ領
域、膜貫通領域およびカルボキシ末端細胞外尾部を含み、細胞内尾部は免疫受容体チロシ
ン依存性抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）および免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフを
含む。ＰＤ−１は細胞表面で発現され、Ｂ７ファミリー免疫調節リガンドのメンバーのＰ
Ｄ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２と相互作用する（Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （
２００５） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ６：２２３）。ＰＤ−１は、とりわけ、活性化
Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、マスト細胞で発現され、多くの腫瘍でも発現さ
れる。ＰＤ−１は、免疫反応の負の調節、特にＴ細胞反応の負の調節に関与することが示
されている。例示として、ＰＤ−１タンパク質をコードする、マウスおよびヒトＰｄｃｄ
１遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が図８に提供されている。当業者であれば本
開示を読んだ時に、ゲノムの一つ以上のＰｄｃｄ１遺伝子（またはすべて）を一つ以上の
異種Ｐｄｃｄ１遺伝子（例えば、多型バリアント、サブタイプまたは突然変異体、別の種
からの遺伝子、ヒト化形態など）で置換できることを認識するであろう。
「ＰＤ−１発現細胞」には、ＰＤ−１タイプＩ膜タンパク質を発現する細胞を含む。一
部の実施形態では、ＰＤ−１発現細胞はその表面上でＰＤ−１タイプＩ膜タンパク質を発
現する。一部の実施形態では、ＰＤ−１タンパク質は、細胞間相互作用を媒介するのに十
分な量で細胞の表面に発現される。例示的ＰＤ−１発現細胞にはＢ細胞、マクロファージ
およびＴ細胞を含む。ＰＤ−１発現細胞は、免疫細胞（例えば、ＴおよびＢ細胞）の表面
に発現されたＰＤ−１の相互作用を介してさまざまな細胞プロセスを調節し、このような
細胞の分化および運命の決定において役割を果たす。一部の実施形態では、本発明の非ヒ
ト動物は、非ヒト動物の一つ以上の細胞の表面上に発現されたヒト化ＰＤ−１タンパク質
を介して、（本明細書に記述された）さまざまな細胞プロセスの調節を発揮する。一部の
実施形態では、本発明の非ヒト動物は、非ヒト動物の一つ以上の細胞の表面上に発現され
たヒト化ＰＤ−１タンパク質を介して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を通したシグナル伝達の
負の調節を発揮する。一部の実施形態では、非ヒト動物は、非ヒト動物の一つ以上の細胞
の表面上に発現されたヒト化ＰＤ−１タンパク質を介して、免疫反応の負の調節を発揮す
る。
「参照」という用語には、それに対して対象の薬剤、動物、コホート、個人、集団、サ
ンプル、配列または値が比較される、標準または対照薬剤、コホート、個人、集団、サン
プル、配列または値を含む。一部の実施形態では、参照薬剤、コホート、個人、集団、サ
ンプル、配列または値は、対象の薬剤、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値
の試験または決定と実質的に同時に試験および／または決定される。一部の実施形態では
、参照薬剤、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値は、随意に有形媒体で具現
化された歴史的参照である。一部の実施形態では、参照は対照を指す場合がある。本明細
書で使用される場合、「参照」は「参照動物」を含む場合がある。「参照動物」は本明細
書に記述された改変、本明細書に記述されたものとは異なる改変を持つか、または未改変
（すなわち、野生型動物）である場合がある。一般的には、当業者には理解されるであろ
うように、参照薬剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値は、対象の
薬剤、動物（例えば、哺乳類）、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値を決定
または特徴付けるために利用されるものと同等の条件下で決定または特徴付けられる。
「実質的に」という用語には、対象の特徴または特性の完全またはほぼ完全な範囲また
は程度を示す定性的条件を含む。生物学分野の当業者であれば、生物学的および化学的な
現象はあったとしても、完了まで進む、および／または完全な状態まで進行する、または
絶対的な結果を達成または避けることは稀であることを理解するであろう。従って「実質
的に」という用語は本明細書では、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の欠
如の可能性をとらえるために使用される。
「実質的な相同性」という語句には、アミノ酸または核酸配列間の比較を含む。当業者
であれば理解するように、二つの配列はそれらが対応する位置に相同な残基を含む場合、
「実質的に相同」であると一般的にみなされる。相同残基は同一の残基である場合がある
。あるいは、相同残基は、適切に類似の構造および／または機能的特徴を持つ非同一残基
である場合がある。例えば、当業者には周知のように、特定のアミノ酸は「疎水性」また
は「親水性」アミノ酸、および／または「極性」または「非極性」側鎖を持つものとして
一般的に分類される。一つのアミノ酸の同じタイプの別のアミノ酸での置換は、「相同」
置換とみなされる場合がよくある。一般的なアミノ酸分類が表１および２に要約されてい
る。
Figure 2021094035
Figure 2021094035
当技術分野で周知のように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢ
ＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびアミノ酸配列に対す
るＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む、さ
まざまなアルゴリズムの任意のものを使用して比較することができる。例示的なこのよう
なプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｂａｓｉｃ ｌｏｃ
ａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，
２１５（３）： ４０３−４１０； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７）
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，
”Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅ
ｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａ
ｍｓ”， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２； Ｂａ
ｘｅｖａｎｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ： Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ
ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｗｉｌｅｙ； ａｎｄ Ｍｉｓｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．
（ｅｄｓ．） （１９９９） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎ
ｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ， Ｖｏｌ． １３２）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓに記述されている。相同配列を
特定することに加えて、上述のプログラムは相同性の程度の指標を一般的に提供する。一
部の実施形態では、二つの配列は、残基の関連する区間に渡って、その対応残基の少なく
とも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１
％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上
が相同の場合、実質的に相同であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する区間は
完全配列である。一部の実施形態では、関連する区間は少なくとも９、１０、１１、１２
、１３、１４、１５、１６、１７またはそれ以上の残基である。一部の実施形態では、関
連する区間は完全配列に沿った隣接残基を含む。一部の実施形態では、関連する区間は完
全配列に沿った不連続残基を含む。一部の実施形態では、関連する区間は少なくとも１０
、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上の残基である。
「実質的な同一性」という語句には、アミノ酸または核酸配列間の比較を含む。当業者
であれば理解するように、二つの配列はそれらが対応する位置に同一な残基を含む場合、
「実質的に同一」であると一般的にみなされる。当技術分野で周知のように、アミノ酸ま
たは核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐ
ｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびアミノ酸配列に対するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピ
ュータプログラムで利用可能なものを含む、さまざまなアルゴリズムの任意のものを使用
して比較することができる。例示的なこのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ
ａｌ． （１９９０） Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ
ｔｏｏｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５（３）： ４０３−４１０； Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ； Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
２５：３３８９−３４０２； Ｂａｘｅｖａｎｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂ
ｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｗｉｌｅｙ； ａ
ｎｄ Ｍｉｓｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．） （１９９９） Ｂｉｏｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １３２）， Ｈｕｍａｎａ Ｐ
ｒｅｓｓに記述されている。同一配列を特定することに加えて、上述のプログラムは同一
性の程度の指標を一般的に提供する。一部の実施形態では、二つの配列は、残基の関連す
る区間に渡って、その対応残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、
７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、
９７％、９８％、９９％またはそれ以上が同一の場合、実質的に同一であるとみなされる
。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列である。一部の実施形態では、関連する
区間は少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以
上の残基である。
「標的化ベクター」または「標的化構築物」という語句には、標的化領域を備えるポリ
ヌクレオチド分子を含む。標的化領域は、標的細胞、組織または動物の配列と同一または
実質的に同一の配列を備え、相同組み換えにより、標的化構築物を、細胞、組織または動
物のゲノム内の位置に統合する。部位特異的リコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ
またはＦｒｔ部位）を使用して狙う標的化領域も含まれる。一部の実施形態では、本発明
の標的化構築物は、特に関心のある核酸配列または遺伝子、選択可能マーカー、制御およ
びまたは調節配列、ならびにこのような配列が関与する組み換えを支援または促進するタ
ンパク質の外からの追加を通して媒介される組み換えを許容するその他の核酸配列をさら
に備える。一部の実施形態では、本発明の標的化構築物は対象の遺伝子の全部または一部
をさらに備え、対象の遺伝子は、内因性配列によってコードされるタンパク質と類似の機
能を持つたんぱく質の全部または一部をコードする異種遺伝子である。一部の実施形態で
は、本発明の標的化構築物は対象のヒト化遺伝子の全部または一部をさらに備え、対象の
ヒト化遺伝子は、内因性配列によってコードされるタンパク質と類似の機能を持つたんぱ
く質の全部または一部をコードする対象のヒト化遺伝子である。
「治療有効量」という語句には、投与される対象に対して望ましい効果をもたらす量を
含む。一部の実施形態では、この用語は、治療投与レジメンに従って、疾患、障害、およ
び／または状態を患うまたはそれにかかりやすい被験者（例えば、動物）に投与された時
、疾患、障害、および／または状態を治療するために十分な量を指す。一部の実施形態で
は、治療有効量は、疾患、障害、および／または状態の一つ以上の症状の発生率および／
または重症度を減少する、および／またはその発症を遅延するものである。当業者であれ
ば、「治療有効量」という用語は実際は、特定個人で治療の成功が達成されることを必要
としないことを理解するであろう。むしろ、治療有効量は、このような治療を必要とする
被験者に投与された時、かなりの数の被験者に特定の望ましい薬理反応を提供する量であ
ることがある。一部の実施形態では、治療有効量への言及は、一つ以上の特定組織（例え
ば、疾患、障害または状態によって影響される組織）または体液（例えば、血液、唾液、
血清、汗、涙、尿など）で測定された量への言及である場合がある。当業者であれば、一
部の実施形態では、特定薬剤または治療の治療有効量は単一用量で処方および／または投
与される場合があることを理解するであろう。一部の実施形態では、治療有効量は、例え
ば、投与レジメンの一部として、複数の用量で処方および／または投与される場合がある
。
「治療」（また「治療する」または「治療すること」）という用語は、広い意味では、
特定の疾患、障害、および／または状態の一つ以上の症状、特徴、および／または原因を
部分的または完全に軽減、改善、緩和、阻害、発症を遅延、および／または発生率を減少
する物質（例えば、提供された組成物）の任意の投与を含む。一部の実施形態では、この
ような治療は、関連する疾患、障害および／または状態の兆候を示さない被験者、および
／または疾患、障害、および／または状態の早期兆候のみを示す被験者に対して行われる
場合がある。あるいはまたはさらに、一部の実施形態では、治療は、関連する疾患、障害
および／または状態の一つ以上の確立された兆候を示す被験者に対して行われる場合があ
る。一部の実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、および／または状態を患うとし
て診断された被験者に対するものである場合がある。一部の実施形態では、治療は、関連
する疾患、障害、および／または状態の発症リスクの増加と統計的に相関する一つ以上の
感受性因子を持つことが知られている被験者に対するものである場合がある。
「バリアント」という用語には、参照実在物とかなりの構造的同一性を示すが、参照実
在物と比べて一つ以上の化学的部分の存在が参照実在物から構造的に異なる実在物を含む
。多くの実施形態では、「バリアント」は、その参照実在物とは機能的にも異なる。一般
的に、特定の実在物が、参照実在物の「バリアント」と正しくみなされるかどうかは、参
照実在物とのその構造同一性の程度に基づく。当業者であれば理解するように、すべての
生物学的または化学的参照実在物は特定の特徴的構造要素を持つ。「バリアント」は、定
義によると、一つ以上のこのような特徴的構造要素を共有する別個の化学的実在物である
。いくつかの例を挙げると、小分子は特徴的なコア構造要素（例えば、マクロサイクルコ
ア）および／または一つ以上の特徴的懸垂部分を持つ場合があり、従って小分子のバリア
ントは、コア構造要素および特徴的懸垂部分を共有するが、その他の懸垂部分および／ま
たはコア内に存在する結合のタイプ（単に対する二重、Ｅに対するＺなど）が異なるもの
であり、ポリペプチドは、直線または三次元空間でお互いに対して指定された位置を持つ
および／または特定の生物学的機能に寄与する複数のアミノ酸から成る特徴的配列要素を
持つ場合があり、核酸は、直線または三次元空間でお互いに対して指定された位置を持つ
複数のヌクレオチド残基から成る特徴的配列要素を持つ場合がある。例えば、「バリアン
トポリペプチド」は、アミノ酸配列の一つ以上の差異および／またはポリペプチド骨格に
共有結合した化学的部分（例えば、炭化水素、脂質など）の一つ以上の差異の結果として
、参照ポリペプチドとは異なる場合がある。一部の実施形態では、「バリアントポリペプ
チド」は、参照ポリペプチドと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％の全体
的配列同一性を示す。あるいはまたはさらに、一部の実施形態では、「バリアントポリペ
プチド」は、少なくとも一つの特徴的配列要素を参照ポリペプチドと共有しない。一部の
実施形態では、参照ポリペプチドは一つ以上の生物活性を持つ。一部の実施形態では、「
バリアントポリペプチド」は参照ポリペプチドの生物活性の一つ以上を共有する。一部の
実施形態では、「バリアントポリペプチド」は参照ポリペプチドの生物活性の一つ以上を
欠く。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は参照ポリペプチドと比べて一
つ以上の生物活性のレベル減少を示す。多くの実施形態で、特定位置での少数の配列変更
がなければ対象のポリペプチドが親のものと同一のアミノ酸配列を持つ場合、対象のポリ
ペプチドは親または参照ポリペプチドの「バリアント」であるとみなされる。一般的に、
親と比べて、バリアントの残基の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５
％、４％、３％、２％未満が置換される。一部の実施形態では、「バリアント」は親と比
べて、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個の置換残基を持つ。しばしば
、「バリアント」は、非常に少数の（例えば、５、４、３、２、または１未満）の置換さ
れた機能残基（すなわち、特定の生物活性に参加する残基）を持つ。さらに、「バリアン
ト」は一般的には５、４、３、２、または１以下の付加または欠失を持ち、親と比べて付
加または欠失を持たないことがよくある。さらに、任意の付加または欠失は一般的には、
約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、
約９、約８、約７、約６未満であり、通常は約５、約４、約３、または約２残基である。
一部の実施形態では、親または参照ポリペプチドは自然界に見られるものである。当業者
であれば理解するように、特に対象のポリペプチドが感染因子ペプチドである時、対象の
特定ポリペプチドの複数のバリアントは、通常は自然界に見られる場合がある。
「ベクター」という用語には、それが関連している別の核酸を輸送することができる核
酸分子を含む。一部の実施形態では、ベクターは、染色体外複製および／または、真核お
よび／または原核細胞などの宿主細胞中でそれらが連結している核酸の発現能力がある。
動作可能なように連結された遺伝子の発現を方向付けることができるベクターは、本明細
書では「発現ベクター」と呼ばれる。
「野生型」という用語には、「正常」（変異体、病気の、変更されたなどに対して）な
状態または状況で自然界に見られる構造および／または活性を持つ実在物を含む。当業者
であれば、野生型遺伝子およびポリペプチドはしばしば複数の異なる形態（例えば、アレ
ル）で存在することを理解するであろう。
（発明を実施するための形態）
本発明は、とりわけ、がんの治療のためのＰｄｃｄ１調節因子（例えば、抗ＰＤ−１抗
体）の治療有効性を決定するため、およびＴ細胞反応およびシグナル伝達のアッセイのた
めの、プログラム細胞死１（Ｐｄｃｄ１）をコードするヒト化遺伝物質を持つ改善された
および／または遺伝子操作された非ヒト動物を提供する。このような非ヒト動物は、ＰＤ
−１調節因子の治療有効性およびそれらのＰＤ−１阻害能力の決定の改善を提供する。従
って、本発明は、さまざまながんの治療のための抗ＰＤ−１療法の開発のため、および免
疫反応を増大して非ヒト動物のウィルス感染を治療および／または除去するために特に有
用である。特に、本発明は、非ヒト動物の細胞の表面のヒト化ＰＤ−１タンパク質の発現
をもたらすマウスＰｄｃｄ１遺伝子のヒト化を包含する。このようなヒト化ＰＤ−１タン
パク質は、抗腫瘍免疫反応を促進する抗ＰＤ−１治療薬の有効性を決定するための、ヒト
ＰＤ−１＋細胞の供給源を提供する能力を持つ。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動
物は、非ヒト動物の細胞の表面上に発現されたヒト化ＰＤ−１タンパク質を通したＰＤ−
１シグナル伝達の阻害を介して、免疫反応の増大を示す。一部の実施形態では、ヒト化Ｐ
Ｄ−１タンパク質は、ヒトＰＤ−１タンパク質のＮ末端免疫グロブリンＶ領域の全部また
は一部に対応する配列を持つ。一部の実施形態では、ヒト化ＰＤ−１タンパク質は、マウ
スＰＤ−１タンパク質の細胞内尾部に対応する配列を持ち、一部の実施形態では、マウス
ＰＤ−１タンパク質の膜貫通領域および細胞内尾部に対応する配列を持つ。一部の実施形
態では、ヒト化ＰＤ−１タンパク質は、ヒトＰＤ−１タンパク質のアミノ酸残基２１−１
７０（または２６−１６９、２７−１６９、または２７−１４５、または３５−１４５）
に対応する配列を持つ。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、非ヒト動物および
異種性種（例えば、ヒト）からの遺伝物質を含む内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子を備える。一部
の実施形態では、本発明の非ヒト動物はヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を備え、ここでヒト化Ｐ
ｄｃｄ１遺伝子はヒトＰＤＣＤ１遺伝子のエクソン２およびエクソン３の全体または一部
を備える。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物はヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を備え、
ここでヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、ヒトＰＤＣＤ１遺伝子のエクソン２およびエクソン３
の最初の７１ ｂｐ（すなわち、柄をコードする）に対応するヒトＰＤＣＤ１の８８３
ｂｐを備える。
本発明のさまざまな態様が以下のセクションに詳細に記述されている。セクションの使
用は本発明を限定することを意図しない。各セクションは本発明の任意の態様に適用する
ことができる。本明細書では、特に指定のない限り、「または」の使用は「および／また
は」を意味する。
プログラム細胞死１（Ｐｄｃｄ１）遺伝子
Ｐｄｃｄ１（ＣＤ２７９とも呼ばれる）は、アポトーシスを受けているＴ細胞ハイブリ
ドーマの上方制御された遺伝子として最初に発見された（Ｉｓｈｉｄａ， Ｙ． ｅｔ
ａｌ． （１９９２） ＥＭＢＯ Ｊ． １１（１１）：３８８７−３８９５）。Ｐｄｃ
ｄ１遺伝子は、Ｎ末端免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）領域を含むタイプＩ膜タンパク質（Ｐ
Ｄ−１と呼ばれる）であるＰＤ−１をコードする５つのエクソン、柄（〜２０アミノ酸の
長さ）、膜貫通領域、および免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）および
免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）の両方を含む細胞内尾部から成
る。ＰＤ−１は、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、活性化単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細
胞および活性化Ｔ細胞などの、多くの細胞タイプ上で発現される（Ｋｅｉｒ， Ｍ．Ｅ．
， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２６：６
７７−７０４）。ＰＤ−１のさまざまなスプライスバリアントも報告されており、どのエ
クソンを欠くかに基づいて異なる（Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． （２００５
） Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３５：１０９−１１６）。実際に、特定のスプラ
イスバリアントは、自己免疫性疾患の原因因子として観察されている（Ｗａｎ， Ｂ．
ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７７（１２）：８８４４−８
８５０）。さらに、Ｐｄｃｄ１欠損マウスは自己免疫状態を発症することが報告されてお
り（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｉｎｔｅｒｎ． Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ． １０（１０）：１５６３−１５７２； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ｈ． ｅ
ｔ ａｌ． （１９９９） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：１４１−１５１； Ｎｉｓｈｉｍ
ｕｒａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：３１９−３２
２）、これはＰＤ−１を活性化リンパ球の負調節因子として固める案内をし、自己免疫性
疾患の発症を防ぐ役割をする。興味深いことに、腫瘍がＰＤ−１シグナル伝達を使用して
、免疫系によるサーベイランスを逃れることが発見されている。従って、ＰＤ−１および
少なくとも一つのそのリガンド（すなわち、ＰＤ−Ｌ１）が、ＰＤ−１阻害を介した腫瘍
微小環境の抗腫瘍活性の促進によるがん療法のための標的として、現在調査されている（
例えば、Ｐｅｄｏｅｅｍ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ． １５３：１４５−１５２； およびＰｈｉｌｉｐｓ， Ｇ．Ｋ． ａｎｄ Ａ
ｔｋｉｎｓ， Ｍ． （２０１４） Ｉｎｔｅｒｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８ページを参
照）。
将来のがん治療のための実用的な標的化療法を開発するためには、ＰＤ−１媒介機能お
よびＰＤ−１経路のより徹底的で詳細な理解が必要である。
Ｐｄｃｄ１およびＰＤ−１配列
例示的なマウス、ヒトおよびヒト化Ｐｄｃｄ１およびＰＤ−１配列が図８に記載されて
いる。非ヒトＰｄｃｄ１遺伝子のヒト化のための例示的ヒト核酸配列も図８に記載されて
いる。
ヒト化Ｐｄｃｄ１非ヒト動物
ＰＤ−１タンパク質をコードする非ヒト動物の内因性遺伝子座（例えば、Ｐｄｃｄ１遺
伝子座）の遺伝子改変から生じる非ヒト動物の細胞表面上に、ヒト化ＰＤ−１タンパク質
を発現する非ヒト動物が提供されている。本明細書に記述された適切な例には齧歯類、特
にマウスが含まれる。
一部の実施形態では、ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、異種性種（例えば、ヒト）からの遺
伝物質を備え、ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は異種性種からの遺伝物質のコード化部分を備え
るＰＤ−１タンパク質をコードする。一部の実施形態では、本発明のヒト化Ｐｄｃｄ１遺
伝子は、細胞の血漿膜上に発現されるＰＤ−１タンパク質の細胞外部分をコードする異種
性種のゲノムＤＮＡを備える。前記ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を含む非ヒト動物、非ヒト胚
、および細胞を作るための非ヒト動物、胚、細胞および標的化構築物も提供されている。
一部の実施形態では、内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子は欠損している。一部の実施形態では、
内因性Ｐｄｃｄ１は変更されており、内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子の一部分が異種性種配列（
例えば、ヒトＰＤＣＤ１配列の全部または一部）で置換されている。一部の実施形態では
、内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子のすべてまたは実質的にすべてが、異種性遺伝子（例えば、ヒ
トＰＤＣＤ１遺伝子）で置換される。一部の実施形態では、異種Ｐｄｃｄ１遺伝子の一部
分が、内因性非ヒトＰｄｃｄ１遺伝子の内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子座に挿入される。一部の
実施形態では、異種遺伝子はヒト遺伝子である。一部の実施形態では、改変またはヒト化
は、内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子の二つの複製の一つに対して行われ、ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝
子に対してヘテロ接合性の非ヒト動物を生じる。その他の実施形態では、ヒト化Ｐｄｃｄ
１遺伝子に対してホモ接合性の非ヒト動物が提供されている。
さまざまな態様で、非ヒト動物は、ヒトＰＤＣＤ１遺伝子の全部または一部を内因性非
ヒトＰｄｃｄ１遺伝子座に含む。従って、このような非ヒト動物は異種Ｐｄｃｄ１遺伝子
を持つとして説明することができる。内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子座で置換、挿入、改変され
たまたは変更されたＰｄｃｄ１遺伝子、またはこのような遺伝子から発現されたタンパク
質は、例えば、ＰＣＲ、ウェスタンブロット、サザンブロット、制限酵素断片長多型（Ｒ
ＦＬＰ）、または対立遺伝子の獲得または欠失アッセイを含む、さまざまな方法を使用し
て検出できる。一部の実施形態では、非ヒト動物は、ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子に対してヘ
テロ接合性である。
さまざまな実施形態で、本発明によるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、図８のヒトＰＤＣＤ
１遺伝子に見られる第二のエクソンと少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０
％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一の配列を持つ第二の
エクソンを持つＰｄｃｄ１遺伝子を含む。
さまざまな実施形態で、本発明によるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、図８のヒトＰＤＣＤ
１遺伝子に見られる第二のエクソンと実質的に同一の配列を持つ第二のエクソンを持つＰ
ｄｃｄ１遺伝子を含む。
さまざまな実施形態で、本発明によるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、図８のヒトＰＤＣＤ
１遺伝子に見られる第二のエクソンと同一の配列を持つ第二のエクソンを持つＰｄｃｄ１
遺伝子を含む。
さまざまな実施形態で、本発明によるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、図８のヒト化Ｐｄｃ
ｄ１ ｍＲＮＡ配列に見られる第三のエクソンと少なくとも５０％（例えば、５０％、５
５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９
３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一の配列を
持つ第三のエクソンを持つＰｄｃｄ１遺伝子を含む。
さまざまな実施形態で、本発明によるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、図８のヒト化Ｐｄｃ
ｄ１ ｍＲＮＡ配列に見られる第三のエクソンと実質的に同一の配列を持つ第三のエクソ
ンを持つＰｄｃｄ１遺伝子を含む。
さまざまな実施形態で、本発明によるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、図８のヒト化Ｐｄｃ
ｄ１ ｍＲＮＡ配列に見られる第三のエクソンと同一の配列を持つ第三のエクソンを持つ
Ｐｄｃｄ１遺伝子を含む。
さまざまな実施形態で、本発明によるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、配列番号：２１また
は配列番号：２３と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０
％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６
％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一の配列を備えるＰｄｃｄ１遺伝子を含
む。
さまざまな実施形態で、本発明によるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、配列番号：２１また
は配列番号：２３と実質的に同一の配列を備えるＰｄｃｄ１遺伝子を含む。
さまざまな実施形態で、本発明によるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、配列番号：２１また
は配列番号：２３と同一の配列を備えるＰｄｃｄ１遺伝子を含む。
さまざまな実施形態で、本発明によるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、図８のヒトＰＤＣＤ
１遺伝子に見られる第二のエクソンおよび第三のエクソンの一部分と少なくとも５０％（
例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ
以上）同一の配列をそれぞれが持つ第二のエクソンおよび第三のエクソンの一部分を持つ
Ｐｄｃｄ１遺伝子を含む。
さまざまな実施形態で、本発明によるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、図８のマウスＰｄｃ
ｄ１遺伝子に見られる第一、第四および第五のエクソンと少なくとも５０％（例えば、５
０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一
の配列をそれぞれが持つ第一、第四および第五のエクソンを持つＰｄｃｄ１遺伝子を含む
。
さまざまな実施形態で、本発明によるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、図８のマウスＰｄｃ
ｄ１遺伝子に見られる第一、第三の一部分、第四および第五のエクソンと少なくとも５０
％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０
％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または
それ以上）同一の配列をそれぞれが持つ第一、第三の一部分、第四および第五のエクソン
を持つＰｄｃｄ１遺伝子を含む。
さまざまな実施形態で、本発明によるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、図８のマウスＰｄｃ
ｄ１遺伝子に見られる５’非翻訳領域および３’非翻訳領域と少なくとも５０％（例えば
、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％
、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）同
一の配列をそれぞれ持つ５’非翻訳領域および３’非翻訳領域を持つＰｄｃｄ１遺伝子を
含む。
さまざまな実施形態で、本発明によるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、図８のヒト化Ｐｄｃ
ｄ１ヌクレオチドコード配列に見られるヌクレオチドコード化配列と少なくとも５０％（
例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ
以上）同一のヌクレオチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡ配列）を持つＰｄｃｄ１遺伝子
を含む。
さまざまな実施形態で、本発明によるヒト化Ｐｄｃｄ１ ｍＲＮＡ配列は、図８に見ら
れるヒト化ｍＲＮＡ配列と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％
、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一の配列を備える。
さまざまな実施形態で、本発明によるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子は、図８のＰＤ−１ポリ
ペプチド配列に見られるアミノ酸配列と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６
０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一のアミノ酸配列を
持つＰＤ−１ポリペプチドをコードする。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は、図８に見られるヒトＰＤ−１タンパク質の細胞外部分と少なくとも５０％（例え
ば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１
％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上
）同一のアミノ酸配列を持つ細胞外部分を持つ。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は細胞外部分を持ち、細胞外部分は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に
見られるアミノ酸残基２１〜１７０と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０
％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一のアミノ酸配列を備
える。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は細胞外部分を持ち、細胞外部分は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に
見られるアミノ酸残基２１〜１７０と実質的に同一のアミノ酸配列を備える。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は細胞外部分を持ち、細胞外部分は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に
見られるアミノ酸残基２１〜１７０と同一のアミノ酸配列を備える。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は細胞外部分を持ち、細胞外部分は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に
見られるアミノ酸残基２６〜１６９と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０
％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一のアミノ酸配列を備
える。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は細胞外部分を持ち、細胞外部分は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に
見られるアミノ酸残基２６〜１６９と実質的に同一のアミノ酸配列を備える。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は細胞外部分を持ち、細胞外部分は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に
見られるアミノ酸残基２６〜１６９と同一のアミノ酸配列を備える。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は細胞外部分を持ち、細胞外部分は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に
見られるアミノ酸残基２７〜１６９と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０
％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一のアミノ酸配列を備
える。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は細胞外部分を持ち、細胞外部分は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に
見られるアミノ酸残基２７〜１６９と実質的に同一のアミノ酸配列を備える。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は細胞外部分を持ち、細胞外部分は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に
見られるアミノ酸残基２７〜１６９と同一のアミノ酸配列を備える。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は細胞外部分を持ち、細胞外部分は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に
見られるアミノ酸残基２７〜１４５と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０
％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一のアミノ酸配列を備
える。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は細胞外部分を持ち、細胞外部分は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に
見られるアミノ酸残基２７〜１４５と実質的に同一のアミノ酸配列を備える。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は細胞外部分を持ち、細胞外部分は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に
見られるアミノ酸残基２７〜１４５と同一のアミノ酸配列を備える。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は細胞外部分を持ち、細胞外部分は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に
見られるアミノ酸残基３５〜１４５と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０
％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一のアミノ酸配列を備
える。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は細胞外部分を持ち、細胞外部分は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に
見られるアミノ酸残基３５〜１４５と実質的に同一のアミノ酸配列を備える。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は細胞外部分を持ち、細胞外部分は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に
見られるアミノ酸残基３５〜１４５と同一のアミノ酸配列を備える。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は、図８に見られるヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質のＮ末端免疫グロブリンＶ
領域と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、
８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、
９８％、９９％またはそれ以上）同一のアミノ酸配列を持つＮ末端免疫グロブリンＶ領域
を持つ。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に見られるＮ末端免疫グロブリンＶ
領域と実質的に同一のアミノ酸配列を持つＮ末端免疫グロブリンＶ領域を持つ。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は、図８のヒトまたはヒト化ＰＤ−１タンパク質に見られるＮ末端免疫グロブリンＶ
領域と同一のアミノ酸配列を持つＮ末端免疫グロブリンＶ領域を持つ。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は、図８に見られるマウスＰＤ−１タンパク質の膜貫通領域と少なくとも５０％（例
えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９
１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以
上）同一の配列を持つ膜貫通領域を持つ。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は、図８に見られるマウスＰＤ−１タンパク質の細胞内尾部と少なくとも５０％（例
えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９
１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以
上）同一の配列を持つ細胞内尾部を持つ。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は、図８のヒトＰＤ−１タンパク質に見られるアミノ酸残基２７〜１６９（または２
６〜１６９）と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、
７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、
９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一のアミノ酸配列を持つ。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は、図８のヒトＰＤ−１タンパク質に見られるアミノ酸残基２７〜１６９（または２
６〜１６９）と実質的に同一のアミノ酸配列を持つ。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は、図８のヒトＰＤ−１タンパク質に見られるアミノ酸残基２７〜１６９（または２
６〜１６９）と同一のアミノ酸配列を持つ。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は、図８に見られるヒト化ＰＤ−１タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも５０％（
例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ
以上）同一のアミノ酸配列を持つ。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は、図８に見られるヒト化ＰＤ−１タンパク質のアミノ酸配列と実質的に同一のアミ
ノ酸配列を持つ。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物によって生産されるヒト化ＰＤ−１タンパ
ク質は、図８に見られるヒト化ＰＤ−１タンパク質のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列
を持つ。
特定の多型形態、アレルバリアント（例えば、単一のアミノ酸の差）または代替的にス
プライスされたイソフォームを含む、ヒト化ＰＤ−１タンパク質を発現する非ヒト動物を
作るための組成物および方法が提供されており、これにはこのようなタンパク質をヒトプ
ロモーターおよびヒト調節配列から発現する非ヒト動物を作るための組成物および方法を
含む。一部の実施形態では、このようなタンパク質を内因性プロモーターおよび内因性調
節配列から発現する非ヒト動物を作るための組成物および方法も提供されている。一部の
特定実施形態では、内因性プロモーターおよび内因性調節配列は、内因性齧歯類プロモー
ターおよび内因性齧歯類調節配列である。方法は、ヒトＰＤ−１タンパク質の全部または
一部をコードする遺伝物質を、内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子に対応する非ヒト動物のゲノムの
正確な位置に挿入し、それによって、全部または一部がヒトであるＰＤ−１タンパク質を
発現するヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を生成する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、
ヒトＰＤＣＤ１遺伝子のエクソン２およびエクソン３の全部または一部に対応するゲノム
ＤＮＡを非ヒト動物の内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子に挿入し、それによって、挿入されたエク
ソンによりコードされるアミノ酸を含有するヒト部分を含むＰＤ−１タンパク質をコード
するヒト化遺伝子を生成する工程を含む。
適切な場合、ヒト（またはヒト化）ＰＤ−１タンパク質の全部または一部をコードする
遺伝物質のコード領域またはポリヌクレオチド配列は、非ヒト動物の細胞からの発現のた
めに最適化されたコドンを含むように改変される場合がある（例えば、米国特許第５，６
７０，３５６号および第５，８７４，３０４号を参照）。コドン最適化配列は合成配列で
あり、非コドン最適化親ポリヌクレオチドによってコードされる同一ポリペプチド（また
は全長ポリペプチドと実質的に同じ生物学的に活性な全長ポリペプチドの生物学的活性フ
ラグメント）をコードすることが好ましい。一部の実施形態では、ヒト（またはヒト化）
ＰＤ−１タンパク質の全部または一部をコードする遺伝物質のコード領域は、特定の細胞
タイプ（例えば、齧歯類細胞）に対してコドン使用頻度を最適化するように変更された配
列を含む場合がある。例えば、非ヒト動物（例えば、齧歯類）の内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子
に挿入される、ヒトＰＤＣＤ１遺伝子のエクソン２およびエクソン３の一部分（例えば、
７１ ｂｐ）に対応するゲノムＤＮＡのコドンは、非ヒト動物の細胞での発現のために最
適化される場合がある。このような配列はコドン最適化配列として記述される場合がある
。
ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子アプローチは、内因性遺伝子の比較的最小限の改変を利用し、
非ヒト動物の自然ＰＤ−１媒介シグナル伝達をもたらすが、これはさまざまな実施形態で
は、Ｐｄｃｄ１配列のゲノム配列が単一フラグメントで改変されており、従って必要な調
節配列を含むことによって正常機能を維持するためである。従って、このような実施形態
では、Ｐｄｃｄ１遺伝子改変はその他の周囲の遺伝子またはその他の内因性Ｐｄｃｄ１相
互作用遺伝子（例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２など）に影響を与えない。さらに、さま
ざまな実施形態で、改変は、細胞膜上の機能的ＰＤ−１膜貫通タンパク質の組み立てに影
響を与えず、結合および、改変によって影響を受けないタンパク質の細胞質部分を通した
その後のシグナル伝達を介して正常なエフェクター機能を維持する。
内因性マウスＰｄｃｄ１遺伝子およびヒトＰＤＣＤ１遺伝子のゲノム構造の略図（正確
な縮尺ではない）が図１に提供されている。ヒトＰＤＣＤ１遺伝子のエクソン２およびエ
クソン３の一部分を含むゲノムフラグメントを使用して、内因性マウスＰｄｃｄ１遺伝子
をヒト化するための例示的方法が図２に提供されている。図示されるように、ヒトＰＤＣ
Ｄ１遺伝子のエクソン２およびエクソン３の一部分（例えば、最初の７１ ｂｐ）を含む
８８３ ｂｐゲノムＤＮＡフラグメントが、標的化構築物によって内因性マウスＰｄｃｄ
１遺伝子座の９００ ｂｐ配列の場所に挿入されている。８８３ ｂｐヒトＤＮＡフラグ
メントは、ヒトＤＮＡから直接クローンを作るか、またはソース配列（例えば、Ｇｅｎｂ
ａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５０１８．２）から合成される場合がある。このゲノムＤＮＡ
には、リガンド結合に関与するヒトＰＤ−１タンパク質の細胞外部分（例えば、アミノ酸
残基２７〜１６９または２６〜１６９）の実質的にすべてをコードする遺伝子の部分を含
む。
内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子座にヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を持つ非ヒト動物（例えば、マウ
ス）は、当技術分野で知られている任意の方法で作ることができる。例えば、選択可能な
マーカー遺伝子を持つヒトＰｄｃｄ１遺伝子の全部または一部を導入する標的化ベクター
を作ることができる。図２は、ヒトＰＤＣＤ１遺伝子のエクソン２およびエクソン３の最
初の７１ ｂｐを含む８８３ ｂｐヒトＤＮＡフラグメントの挿入物を備えるマウスゲノ
ムの内因性Ｐｄｃｄ１座を含む標的化ベクターを示す。図示されるように、標的化構築物
は、内因性マウスＰｄｃｄ１遺伝子（〜６１．７ Ｋｂ）のエクソン２の上流の配列を含
む５’ホモロジーアームに続く薬剤選択カセット（例えば、ｌｏｘＰ配列のそばの両側に
隣接するネオマイシン耐性遺伝子、〜５ Ｋｂ）、ヒトＰｄｃｄ１遺伝子のエクソン２お
よびエクソン３の最初の７１ ｂｐを含むゲノムＤＮＡフラグメント（８８３ ｂｐ）、
および内因性マウスエクソン３の残りの配列（すなわち、ＰＤ−１タンパク質の膜貫通部
分をコードする部分）、内因性マウスＰｄｃｄ１のエクソン４およびエクソン５を含む３
’ホモロジーアーム（〜８４ Ｋｂ）を含む。標的化構築物は、自動削除薬物選択カセッ
ト（例えば、ｌｏｘＰ配列のそばに隣接したネオマイシン耐性遺伝子、米国特許第８，６
９７，８５１号、第８，５１８，３９２号および第８，３５４，３８９号を参照のこと、
これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）を含む。胚性幹細胞を電気穿孔する
と、内因性野生型Ｐｄｃｄ１遺伝子の９００ ｂｐをヒトＰＤＣＤ１遺伝子の８８３ ｂ
ｐ（すなわち、エクソン２およびエクソン３の最初の７１ ｂｐ）と交換する改変内因性
Ｐｄｃｄ１遺伝子が作られ、これは標的化ベクターに含有される。ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝
子が作られ、８８３ ｂｐのヒトＤＮＡフラグメント（すなわち、ヒトＰＤＣＤ１遺伝子
のエクソン２およびエクソン３の７１ ｂｐ）によってコードされるアミノ酸を含むヒト
化ＰＤ−１タンパク質を発現する細胞または非ヒト動物が結果として生じる。薬剤選択カ
セットは発達依存性の様式で除去される、すなわち、その生殖系細胞に上述のヒト化Ｐｄ
ｃｄ１遺伝子を含むマウスから派生した子孫は、発達中に分化細胞から選択可能マーカー
を脱落させる（図２の下部を参照）。
マウスのヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子（すなわち、ヒトタンパク質部分およびマウス部分を
含むＰＤ−１タンパク質をコードするＰｄｃｄ１遺伝子を持つマウス）を用いる実施形態
が本明細書では広く検討されているが、ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を備えるその他の非ヒト
動物も提供されている。一部の実施形態では、このような非ヒト動物は、齧歯類Ｐｄｃｄ
１プロモーターに動作可能なように連結したヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を備える。一部の実
施形態では、このような非ヒト動物は、内因性Ｐｄｃｄ１プロモーターに動作可能なよう
に連結したヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を備え、一部の実施形態では、内因性齧歯類Ｐｄｃｄ
１プロモーターである。一部の実施形態では、このような非ヒト動物は、内因性遺伝子座
からヒト化ＰＤ−１タンパク質を発現し、ヒト化ＰＤ−１タンパク質はヒトＰＤ−１タン
パク質のアミノ酸残基２１〜１７０（または２６〜１６９、または２７〜１６９、２７〜
１４５または３５〜１４５）を備える。このような非ヒト動物には、本明細書に開示され
たＰＤ−１タンパク質を発現するように遺伝子改変された動物のいずれかを含み、例えば
、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、未去勢オスウシ、バッファロー
）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモ
セット、アカゲザル）などの哺乳類が含まれる。例えば、好適な遺伝子改変可能ＥＳ細胞
が直ちに利用可能でない非ヒト動物については、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作るため
に他の方法が採用される。このような方法には、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線
維芽細胞または誘発された多能性細胞）を改変すること、および体細胞核移植（ＳＣＮＴ
）を利用して好適な細胞、例えば除核卵母細胞、に遺伝子改変されたゲノムを導入するこ
と、および改変された細胞（例えば、改変された卵母細胞）を胚の形成に好適な条件下で
非ヒト動物に懐胎させることが挙げられる。
非ヒト動物ゲノム（例えば、ブタ、メスウシ、齧歯類、ニワトリなどのゲノム）の改変
方法には、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬエフェクター
ヌクレアーゼ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅ
ｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＴＡＬＥＮ）を用い、ゲノムを改変してヒト化Ｐｄｃｄ１
遺伝子を含める方法が含まれる。
一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は哺乳動物である。一部の実施形態では、本
発明の非ヒト動物は、例えばトビネズミ上科またはネズミ上科の小さな哺乳動物である。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子改変動物は齧歯類である。一部の実施形態では、本
発明の齧歯類はマウス、ラット、ハムスターから選択される。一部の実施形態では、本発
明の齧歯類はネズミ上科から選択される。一部の実施形態では、本発明の遺伝子改変動物
は、ヨルマウス科（例えば、マウス様のハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムス
ター、Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄラットおよびマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（純種のマウス
およびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノ
ボリマウス、ロックマウス、オジロラット、マダガスカルラットおよびマウス）、トゲヤ
マネ科（例えば、トゲヤマネ）、およびメクラネズミ科（例えば、メクラネズミ、タケネ
ズミ、および高原モグラネズミ）から選択された科からのものである。一部の実施形態で
は、本発明の遺伝子改変齧歯類は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズ
ミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。一部の実施形態では、本発明の
遺伝子改変マウスはネズミ科のメンバーからのものである。一部の実施形態では、本発明
の非ヒト動物は齧歯類である。一部の実施形態では、本発明の齧歯類はマウスおよびラッ
トから選択される。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物はマウスである。
一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ
５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ
５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳ
ｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系のマ
ウスである齧歯類である。一部の実施形態では、本発明のマウスは、１２９Ｐ１、１２９
Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／
ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／
ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９
Ｔ１、１２９Ｔ２である系から成る群から選択される１２９系である（例えば、Ｆｅｓｔ
ｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３
６； Ａｕｅｒｂａｃｈ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ２９（５）：１０２４−１０２８， １０３０， １０３２を参照）。一部の実
施形態では、本発明の遺伝子改変マウスは、前述の１２９系と前述のＣ５７ＢＬ／６系と
の混合である。一部の実施形態では、本発明の遺伝子改変マウスは、前述の１２９系の混
合、または前述のＢＬ／６系の混合である。一部の実施形態では、本明細書に記述された
混合の１２９系は１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系である。一部の実施形態では
、本発明のマウスはＢＡＬＢ系（例えばＢＡＬＢ／ｃ系）である。一部の実施形態では、
本発明のマウスはＢＡＬＢ系と別の前述の系との混合である。
一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物はラットである。一部の実施形態では、本発
明のラットは、ウィスターラット、ＬＥＡ系、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系、フィッ
シャー系、Ｆ３４４、Ｆ６およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される。一部の実施形
態では、本明細書に記述されたラット系は、ウィスター、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａ
ｗｌｅｙ、フィッシャー、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから成る群か
ら選択された二つ以上の系の混合である。
ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を持つ非ヒト動物を用いる方法
ＰＤ−１機能の調査ではさまざまなＰｄｃｄ１変異体およびトランスジェニック非ヒト
動物の使用を採用した（例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． （１９９
８） Ｉｎｔｅｒｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０（１０）：１５６３−１５７２； Ｎｉ
ｓｈｉｍｕｒａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：１４
１−１５１； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２９１：３１９−３２２； Ｉｗａｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｉ
ｎｔｅｒｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７（２）：１３３−１４４； Ｋｅｉｒ， Ｍ．
Ｅ． ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７５：７３７２−７３
７９； Ｋｅｉｒ， Ｍ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ
． １７９：５０６４−５０７０； Ｃａｒｔｅｒ， Ｌ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２０
０７） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． １８２：１２４−１３４； Ｃｈｅｎ，
Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｅｕｒｏｐ． Ｓｏｃ． Ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓ
ｐｌａｎｔ． ２１：２１−２９； Ｏｋａｚａｋｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２０１
１） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２０８（２）：３９５−４０７；米国特許第７，４１
４，１７１号、およびヨーロッパ特許第１ ３３４ ６５９ Ｂ１を参照、これらは参照
により本明細書に組み込まれる）。このような変異体およびトランスジェニック動物は、
ＰＤ−１発現の分子側面、さまざまな細胞プロセスの機能および調節を決定する上で有用
であった。しかし、それらには限界がある。例えば、マウスＰｄｃｄ１遺伝子のエクソン
１への、ヒトＰＤ−１ ｃＤＮＡのノックインによって作製されたＰＤ−１欠損マウスは
、ＰＭＡ（Ｃａｒｔｅｒ， Ｌ．Ｌ．ら、上記参照）で刺激した後でもヒトＰＤ−１を発
現しなかった。さらに、異なる遺伝的背景のＰＤ−１変異動物での表現型のかなりの差が
、特に、さまざまな機能および／または調節活性をＰＤ−１に割り当てようとする際、調
査を複雑化した。それでも、ＰＤ−１を過剰発現するその他のトランスジェニック動物が
作製されてきた（Ｃｈｅｎ， Ｌ．ら、上記参照）。このような動物は、導入遺伝子の異
なる発現パターンを示しており、これは構築物のデザインに合理的に起因しうる。さらに
、同じソース遺伝物質（すなわちマウス）を使用したために、ＰＤ−１過剰発現は、導入
遺伝子の潜在的な位置効果のために、トランスジェニックＰＤ−１ではなく、内因性ＰＤ
−１に対応していた可能性がある。ＰＤ−１トランスジェニックマウスは、一部のＰＤ−
１媒介生物機能を明らかにする上で有用なことが示されているが、それらは得られた結果
で変動性を示しており、これは少なくとも一部は、マウスを作製するために用いられた異
なるアプローチに基づく。従って、ＰＤ−１媒介生物学を利用している現在のインビボシ
ステムは不完全である。ＰＤ−１媒介生物機能およびシグナル伝達経路の分子側面は、ト
ランスジェニックマウスではその潜在的能力の限界まで利用されていない。
本発明の非ヒト動物は、さまざまなアッセイに有用なヒト（またはヒト化）ＰＤ−１を
発現する、改善されたインビボシステムおよび生体物質（例えば、細胞）の供給源を提供
する。さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物は、ＰＤ−１を標的とする、および／
またはＰＤ−１シグナル伝達を調節する（例えば、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２
との相互作用を妨げる）治療薬を開発するために使用される。さまざまな実施形態では、
本発明の非ヒト動物は、ヒトＰＤ−１を結合する候補治療薬（例えば、抗体）を特定、ス
クリーニングおよび／または開発するために使用される。さまざまな実施形態では、本発
明の非ヒト動物は、ヒトＰＤ−１のヒトＰＤ−Ｌ１および／またはヒトＰＤ−Ｌ２との相
互作用を阻害する候補治療薬（例えば、抗体）をスクリーニングおよび開発するために使
用される。さまざまな実施形態では、本発明の非ヒト動物は、本明細書に記述された非ヒ
ト動物の細胞の表面上のヒト化ＰＤ−１の拮抗薬および／または作動薬の結合プロファイ
ルを決定するために使用され、一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、ヒトＰＤ−
１に結合するひとつ以上の候補治療薬抗体のエピトープまたは複数のエピトープを決定す
るために使用される。
さまざまな実施形態では、本発明の非ヒト動物は、抗ＰＤ−１抗体の薬物動態プロフィ
ルを決定するために使用される。さまざまな実施形態で、本発明の一つ以上の非ヒト動物
およびひとつ以上の対照または参照非ヒト動物がそれぞれ、ひとつ以上の候補治療抗ＰＤ
−１抗体にさまざまな用量（例えば、０．１ ｍｇ／ｋｇ、０．２ ｍｇ／ｋｇ、０．３
ｍｇ／ｋｇ、０．４ ｍｇ／ｋｇ、０．５ ｍｇ／ｋｇ、１ ｍｇ／ｋｇ、２ ｍｇ／
ｋｇ、３ ｍｇ／ｋｇ、４ ｍｇ／ｋｇ、５ ｍｇ／ｍｇ、７．５ ｍｇ／ｋｇ、１０
ｍｇ／ｋｇ、１５ ｍｇ／ｋｇ、２０ ｍｇ／ｋｇ、２５ ｍｇ／ｋｇ、３０ ｍｇ／ｋ
ｇ、４０ ｍｇ／ｋｇ、または５０ ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上）で曝露される。候補治
療薬抗体は、非経口および非注射投与経路を含む、任意の望ましい投与経路で投薬される
場合がある。非経口経路には、例えば、静脈内、動脈内、門脈内、筋肉内、皮下、腹腔内
、髄腔内、くも膜下腔内、側脳室内、頭蓋内、胸腔内または注入のその他の経路を含む。
非注射経路には、例えば、経口、鼻、経皮、肺、直腸、口腔、膣、眼を含む。投与は、連
続注入、局所投与、インプラント（ゲル、膜など）からの持続放出、および／または静脈
内注射による場合もある。非ヒト動物（ヒト化および対照）から血液がさまざまな時点（
例えば、０時間、６時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１
０日、１１日、または最大３０日またはそれ以上の日数）で単離される。さまざまなアッ
セイは、総ＩｇＧ、抗治療抗体反応、凝集などを含むがこれらに限定されない、本明細書
に記述された非ヒト動物から取得されたサンプルを使用して、投与された候補治療抗体の
薬物動態プロファイルを決定するために実施される場合がある。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物は、ＰＤ−１シグナル伝達阻害または調節
の治療効果および細胞変化の結果としての遺伝子発現への効果を測定するために使用され
る。さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物またはそれらから単離された細胞は、非
ヒト動物の細胞表面上のヒト化ＰＤ−１タンパク質（またはＰＤ−１タンパク質のヒト部
分）に結合する候補治療薬に曝露され、それに続く期間の後、例えば、接着、アポトーシ
ス、サイトカイン生産、炎症、増殖、自己免疫寛容およびウィルス感染（または反応）な
ど、ＰＤ−１依存性プロセスへの効果について分析された。
本発明の非ヒト動物は、ヒト化ＰＤ−１タンパク質、従って、細胞、細胞株を発現し、
細胞培養物を生成して、例えば、特に拮抗薬または作動薬がヒトＰＤ−１配列もしくはエ
ピトープに特異的であるかまたは、代替的に、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２と関
連するヒトＰＤ−１配列またはエピトープに特異的である場合に、ＰＤ−１拮抗薬または
作動薬の結合または機能をアッセイするための、結合および機能アッセイに使用するため
のヒト化ＰＤ−１の供給源としての役割を果たすことができる。さまざまな実施形態で、
本発明の非ヒト動物から単離された細胞を使用して、候補治療抗体によって結合されたＰ
Ｄ−１エピトープを決定することができる。さまざまな実施形態で、本明細書に記述され
た非ヒト動物によって発現されたヒト化ＰＤ−１タンパク質は、バリアントアミノ酸配列
を備える場合がある。自己免疫性および感染性の疾患と関連するバリアントヒトＰＤ−１
タンパク質（例えば、多型）が報告されている（例えば、Ｌｅｅ， Ｙ．Ｈ． ｅｔ ａ
ｌ． （２０１４） Ｚ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ＰＭＩＤ： ２４９４２６０２；
Ｍａｎｓｕｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇ． Ｍｅ
ｄ． ６２（３）：６３８−６４３； Ｎａｓｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２０１３）
Ｉｎｔｅｒｎ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７：ｅ８４５−ｅ８５０； Ｐ
ｉｓｋｉｎ， Ｉ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｎｅｕｒｏｐｅｄｉａｔｒｉｃ
ｓ ４４（４）：１８７−１９０； Ｃａｒｔｅｒ， Ｌ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２０
０７） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． １８２（１−２）：１２４−１３４； Ｗ
ａｎ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７７（１２）
：８８４４−８８５０を参照）。例示的ヒトＰＤ−１バリアントは、ＮＣＢＩからのＳＮ
Ｐ ＧｅｎｅＶｉｅｗウェブページに記載されているものを含み、表３に要約されている
。さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物はヒト化ＰＤ−１タンパク質バリアントを
発現する。さまざまな実施形態で、バリアントは、リガンド結合と関連するアミノ酸位置
の多型である。さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物は、ヒトＰＤ−１の多型バリ
アントとの相互作用を通したリガンド結合の効果を決定するために使用される。一部の実
施形態では、本発明の非ヒト動物は、表３に見られるヒトＰＤ−１タンパク質バリアント
を発現する。
Figure 2021094035
Figure 2021094035
Figure 2021094035
本発明の非ヒト動物からの細胞は、その場限りで単離して使用するか、または多世代に
わたって培養物中で維持することができる。さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物
からの細胞は（例えば、ウィルスの使用によって）不死化され、培養物中（例えば、連続
培養物中）で無期限に維持される。
さまざまな実施形態で、本発明の細胞および／または非ヒト動物は、抗原に対する免疫
反応のＰＤ−１媒介機能を決定するために、さまざまな免疫付与レジメンで使用される。
一部の実施形態では、ヒト（またはヒト化）ＰＤ−１に結合する、またはその一つ以上の
機能を阻害する候補治療薬が、本発明の非ヒト動物で特徴付けられる。適切な測定法には
、さまざまな細胞アッセイ、増殖アッセイ、血清免疫グロブリン分析（例えば、抗体価）
、細胞毒性アッセイ、リガンド・受容体相互作用の特徴付け（例えば、免疫沈降アッセイ
）が含まれる。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、抗原に対する免疫反応のＰ
Ｄ−１媒介機能調節を特徴付けるために使用される。一部の実施形態では、抗原は自己免
疫性の疾患、障害または状態と関連している。一部の実施形態では、抗原は炎症性疾患、
障害または状態と関連している。一部の実施形態では、抗原は検査抗原（例えば、オボア
ルブミンまたはＯＶＡ）である。一部の実施形態では、抗原は、治療を必要とする一人以
上のヒト患者が患っている疾患または状態と関連する標的である。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物は、ヒトＰＤ−１を標的とする候補治療薬
の薬理・毒性学的側面を検査するための自己抗体生産の力価を決定するために血清アッセ
イで使用される。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物での自己抗体生産は、非ヒト
動物に誘発された一つ以上の自己免疫性の疾患、障害または状態から生じる。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物は、ある抗原に対する特異的Ｔ細胞依存性
およびＢ細胞依存性反応を含むがそれらに限定されない、免疫反応のＰＤ−１依存性調節
を調節する化合物または生物薬剤の治療能力を決定するために、一つ以上の抗原を使用し
た曝露に使用される。
さまざまな実施形態で、本発明の細胞および／または非ヒト動物は、ヒトＰＤ−１シグ
ナル伝達を調節する候補治療薬をスクリーニングおよび開発するために、生存および／ま
たは増殖アッセイ（例えば、ＢまたはＴ細胞を用いて）で使用される。ＰＤ−１の活性化
または喪失は、Ｔ細胞反応の調節に重要な役割を果たし、ＰＤ−１による自己免疫寛容の
調節は、ＰＤ−１の細胞外領域の特異的エピトープの活性化から生じる可能性があり、従
って、本発明の非ヒト動物の細胞および／または本明細書に記述された非ヒト動物を使用
して、候補ＰＤ−１調節因子（例えば、拮抗薬または作動薬）が特定、特徴付けおよび開
発される可能性がある。一部の実施形態では、本発明の細胞および／または非ヒト動物は
、ＰＤ−１の存在下および不在下で特定細胞（例えば、がん細胞）の増殖またはアポトー
シスへの効果を決定するための生存または死亡アッセイで使用される。
さまざまな実施形態で、本発明の細胞および／または非ヒト動物は、移植されたヒト細
胞または組織に対する生理的（例えば、免疫）反応でのＰＤ−１媒介機能を決定するため
の、異種（例えば、ヒト）細胞の異種移植に使用される。一部の実施形態では、ヒトＰＤ
−１に結合する、またはその一つ以上の機能を阻害する候補治療薬が、本発明の非ヒト動
物で特徴付けられる。適切な測定法には、さまざまな細胞アッセイ、増殖アッセイ、血清
免疫グロブリン分析（例えば、抗体価）、細胞毒性アッセイ、およびリガンド・受容体相
互作用の特徴付け（免疫沈降アッセイ）が含まれる。一部の実施形態では、本発明の非ヒ
ト動物は、抗原に対する免疫反応のＰＤ−１媒介機能調節を特徴付けるために使用される
。一部の実施形態では、抗原は新生物と関連している。一部の実施形態では、抗原は自己
免疫性の疾患、障害または状態と関連している。一部の実施形態では、抗原は炎症性疾患
、障害または状態と関連している。一部の実施形態では、抗原は、治療を必要とする一人
以上のヒト患者が患っている疾患または状態と関連する標的である。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物は、新しいリンパ球およびその免疫機能の
ＰＤ−１依存性調節を調節する化合物または生物薬剤の治療能力を決定するための、移植
または養子移入実験で使用される。さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物はヒトＴ
細胞で移植され、一部の実施形態ではナイーブＴ細胞、一部の実施形態では活性化Ｔ細胞
で移植される。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物の細胞は、Ｔ細胞依存性反応および機能の
ＰＤ−１依存性調節を調節する化合物または生物薬剤の治療能力を決定するための、Ｔ細
胞アッセイで使用される。例示的Ｔ細胞アッセイには、ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞内サイトカ
イン染色、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）制限、ウィルス抑制アッセイ、細胞毒性
アッセイ、増殖アッセイおよび調節Ｔ細胞抑制アッセイが含まれるがこれらに限定されな
い。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物の細胞は、ヒトＰＤ−１を調節する候補治
療薬をスクリーニングおよび開発するために、細胞遊走アッセイで使用される。細胞遊走
には、内皮を横切る細胞の移動を伴い、遊走アッセイは、白血球または腫瘍細胞による内
皮との相互作用および、内皮の遊走の測定を可能にする。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物の細胞は、ＰＤ−１依存性調節および／ま
たは腫瘍細胞のアポトーシスを調節する化合物の治療能力を決定するための、腫瘍細胞成
長（または増殖）アッセイで使用される。
さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物の細胞は、Ｔ細胞から放出されるサイトカ
インのＰＤ−１依存性調節を調節する化合物または生物薬剤の治療能力を決定するための
、サイトカイン生産アッセイで使用される。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物の
細胞は、ヒト化ＰＤ−１と、ヒトＰＤ−１またはＰＤ−１リガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１
またはＰＤ−Ｌ２）標的化薬剤の相互作用から生じる細胞内サイトカイン放出の検出（お
よび／または測定）のために使用される。
さまざまな実施形態で、自己免疫性の疾患、障害または状態の一つ以上の機能のＰＤ−
１依存性調節を調節する化合物または生体薬剤の治療能力を決定するためのインビボシス
テムを提供するために、自己免疫性の疾患、障害または状態が本発明の一つ以上の非ヒト
動物に誘発される。本発明の一つ以上の非ヒト動物に誘発される例示的自己免疫性の疾患
、障害または状態には、糖尿病、実験的自己免疫性脳脊髄炎（例えば、多発性硬化症のモ
デル）、リューマチ性関節炎、および全身性エリテマトーデスを含む。
本発明の一つ以上の非ヒト動物は、薬剤またはワクチンの分析および検査のためのイン
ビボシステムを提供する。さまざまな実施形態で、候補薬剤またはワクチンが本発明の一
つ以上の非ヒト動物に送達され、その後非ヒト動物をモニターして、薬剤またはワクチン
に対する免疫反応、薬剤またはワクチンの安全性プロファイル、または疾患または状態に
対する効果の一つ以上を決定する場合がある。一部の実施形態では、ワクチンは、例えば
ヒト免疫不全ウィルスまたは肝炎ウィルス（例えば、ＨＣＶ）などのウィルスを標的とす
る。安全性プロファイルを決定するために使用される例示的方法には、毒性、最適な用量
濃度、薬剤またはワクチンの有効性、および潜在的リスク因子の測定を含む。このような
薬剤またはワクチンはこのような非ヒト動物で改善および／または開発される場合がある
。
本発明の非ヒト動物は、ヒトＰＤ−１標的化薬剤の薬物動態特性を評価するためのイン
ビボシステムを提供する。さまざまな実施形態で、ヒトＰＤ−１標的化薬剤は、本発明の
一つ以上の非ヒト動物に送達または投与され、その後非ヒト動物（またはそれから単離さ
れた細胞）をモニターするか、または一つ以上のアッセイを実施して、非ヒト動物に対す
る薬剤の効果を決定する場合がある。薬物動態特性には、動物がどのように薬剤を処理し
てさまざまな代謝物にするか（または、有毒代謝物を含む一つ以上の薬剤代謝物の有無の
検出）、薬剤半減期、投与後の薬剤の循環レベル（例えば、薬剤の血清濃度）、抗薬物反
応（例えば、抗薬物抗体）、薬剤の吸収および分布、投与経路、薬剤の排泄および／また
はクリアランス経路を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、薬剤（例えば
、ＰＤ−１調節因子）の薬物動態および薬力学特性は、本発明の非ヒト動物で、またはそ
の使用を通してモニターされる。
本発明の非ヒト動物は、ヒトＰＤ−１標的化薬剤の標的毒性を評価するためのインビボ
システムを提供する。さまざまな実施形態で、ヒトＰＤ−１標的化薬剤は、本発明の一つ
以上の非ヒト動物に送達または投与され、その後非ヒト動物（またはそれから単離された
細胞）をモニターするか、または一つ以上のアッセイを実施して、非ヒト動物に対する薬
剤の標的毒性効果を決定する場合がある。一般的に、薬剤は標的の一つ以上の機能を調節
することを目的としている。一例を挙げると、ＰＤ−１調節因子は、一つ以上の細胞の表
面上のＰＤ−１分子と何らかの方法で相互作用することによりＰＤ−１媒介機能（例えば
、ＰＤ−１シグナル伝達）を調節することを目的としている。一部の実施形態では、この
ような調節因子は、調節因子の望ましい薬理作用の誇張である有害作用を持つ場合がある
。このような効果は標的効果と呼ばれる。例示的標的効果には、高すぎる用量、慢性活性
化／不活性化、および正しい組織での正しい作用を含む。一部の実施形態では、本発明の
非ヒト動物で、またはその使用を通して特定されたＰＤ−１標的化薬剤の標的効果は、以
前は知られていなかったＰＤ−１の機能を決定するために使用される。
本発明の非ヒト動物は、ヒトＰＤ−１標的化薬剤の標的外毒性を評価するためのインビ
ボシステムを提供する。さまざまな実施形態で、ヒトＰＤ−１標的化薬剤は、本発明の一
つ以上の非ヒト動物に送達または投与され、その後非ヒト動物（またはそれから単離され
た細胞）をモニターするか、または一つ以上のアッセイを実施して、非ヒト動物に対する
薬剤の標的外毒性効果を決定する場合がある。標的外効果は、薬剤が意図しない標的と相
互作用する時（例えば、共通エピトープに対する交差反応）に起こる可能性がある。この
ような相互反応は、意図するまたは意図しない組織で起こる可能性がある。一例を挙げる
と、薬剤の鏡像異性体（エナンチオマー）は標的外毒性効果をもたらす可能性がある。ら
に、薬剤は異なる受容体サブタイプと不適切に相互作用し、それを非意図的に活性化する
可能性がある。例示的標的外効果には、誤った標的がある組織の組織とは関係のない、誤
った標的の誤った活性化／阻害を含む。一部の実施形態では、ヒトＰＤ−１標的化薬剤の
標的外効果は、薬剤を本発明の非ヒト動物に投与した効果と一つ以上の参照非ヒト動物に
投与した効果とを比較することによって決定される。
一部の実施形態では、アッセイを行うことには、薬剤が投与される非ヒト動物の表現型
および／または遺伝子型への効果を決定することを含む。一部の実施形態では、アッセイ
を行うことには、ＰＤ−１調節因子（例えば、拮抗薬または作動薬）のロット間変動を決
定することを含む。一部の実施形態では、アッセイを行うことには、本発明の非ヒト動物
に投与されたＰＤ−１標的化薬剤の効果と、参照非ヒト動物への効果との差を決定するこ
とを含む。さまざまな実施形態で、参照非ヒト動物は、本明細書に記述された改変、本明
細書に記述されたものとは異なる改変（例えば、Ｐｄｃｄ１遺伝子の破壊、欠失またはそ
うでなければ非機能的Ｐｄｃｄ１遺伝子を持つもの）を持つかまたは改変を持たない（す
なわち、野生型非ヒト動物）場合がある。
ヒトＰＤ−１標的化薬剤の薬物動態特性、標的毒性、および／または標的外毒性を評価
するために非ヒト動物で（またはそれらから単離された細胞でおよび／またはそれらを使
用して）測定されうる例示的パラメーターには、凝集、オートファジー、細胞分裂、細胞
死、補体媒介溶血、ＤＮＡ完全性、薬物特異抗体力価、薬剤代謝、遺伝子発現アレイ、代
謝活性、ミトコンドリア活性、酸化ストレス、食作用、タンパク質生合成、タンパク質分
解、タンパク質分泌、ストレス反応、標的組織薬剤濃度、標的外組織薬剤濃度、転写活性
などが含まれるがこれらに限定されない。さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物は
、ＰＤ−１調節因子の薬学的有効量を決定するために使用される。
本発明の非ヒト動物は、がんで使用する候補治療薬の開発および特徴付けのための、改
善されたインビボシステムを提供する。さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物に腫
瘍が移植され、その後に、一つ以上の候補治療薬を投与する場合がある。一部の実施形態
では、候補治療薬には、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）または抗体カクテルを
含む場合があり、一部の実施形態では、候補治療薬は、例えば、連側的または同時に投薬
される単一特異性抗体の投与などの併用療法を含む。腫瘍は、非ヒト動物内の一つ以上の
場所で定着するために十分な時間を与えられる場合がある。腫瘍細胞増殖、成長、生存な
どは、候補治療薬の投与前と後の両方で測定される場合がある。候補治療薬の細胞毒性も
、望ましい場合非ヒト動物で測定される場合がある。
本発明の非ヒト動物は、ヒトに影響する疾患、障害または状態を効果的に治療するため
、候補治療薬および／または治療レジメン（例えば、単剤療法、併用療法、用量範囲試験
など）を評価または査定するための一つ以上の疾患モデルの開発に使用される場合がある
。さまざまな疾患状態が本発明の非ヒト動物で確立され、その後、疾患状態での一つ以上
の分子（例えば、ＰＤ−１標的化薬剤）の有効性を決定できるように、一つ以上の候補分
子が投与される場合がある。一部の実施形態では、疾患モデルには、自己免疫性、炎症性
および／または新生物の疾患、障害または状態を含む。
一例を挙げると、本発明の非ヒト動物は、腫瘍または腫瘍細胞の予防および／または治
療的治療のための改善された動物モデルを提供する。さまざまな実施形態で、本発明の非
ヒト動物に一つ以上の腫瘍細胞が移植され、その後に、一つ以上の候補治療薬（例えば、
抗体）を投与する場合がある。一部の実施形態では、一つ以上の候補治療薬の投与は、一
つ以上の腫瘍細胞の移植および一つ以上の候補治療薬が本発明の非ヒト動物で、前記非ヒ
ト動物の固形腫瘍の定着および／または腫瘍細胞の成長を防ぐ上での有効性について評価
された後（例えば、数分または数時間後だが一般的には同じ日）に実施される。一部の実
施形態では、一つ以上の候補治療薬の投与は、ひとつ以上の腫瘍細胞の移植の後（例えば
、数日後）に実施され、一部の特定実施形態では、一つ以上の移植された腫瘍細胞が本発
明の非ヒト動物で所定サイズ（例えば、体積）に達するように十分な時間の後に実施され
、一つ以上の定着腫瘍の治療での有効性について一つ以上の候補治療薬が評価される。非
ヒト動物は、定着腫瘍の効果的な治療に相関する最適用量または用量範囲を決定できるよ
うに、用量によって異なる治療群に配置される場合がある。
候補分子は、非経口および非注射投与経路を含む任意の投与方法を使用して、非ヒト動
物疾患モデルに投与することができる。非経口経路には、例えば、静脈内、動脈内、門脈
内、筋肉内、皮下、腹腔内、髄腔内、くも膜下腔内、側脳室内、頭蓋内、胸腔内または注
入のその他の経路を含む。非注射経路には、例えば、経口、鼻、経皮、肺、直腸、口腔、
膣、眼を含む。投与は、連続注入、局所投与、インプラント（ゲル、膜など）からの持続
放出、および／または静脈内注射による場合もある。併用療法を本発明の非ヒト動物で評
価する時、候補分子は、同じ投与経路または異なる投与経路で投与することができる。投
与レジメンを本発明の非ヒト動物で評価する時、候補分子は、一つ以上の疾患モデルが確
立されている非ヒト動物で望ましい治療または予防効果を示す投与レジメンを決定するた
めに、２か月毎、毎月、３週間毎、２週間毎、毎週、毎日、可変間隔で、および／または
段階的に増大する濃度で投与される場合がある。
本発明の非ヒト動物は、感染疾患で使用する候補治療薬の開発および特徴付けのための
、改善されたインビボシステムを提供する。さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物
は、ウィルス（例えば、ＭＨＶ、ＨＩＶ、ＨＣＶなど）または病原体（例えば、細菌）の
注射で感染させられ、その後、一つ以上の候補治療薬を投与される場合がある。一部の実
施形態では、候補治療薬には、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）または抗体カク
テルを含む場合があり、一部の実施形態では、候補治療薬は、例えば、連側的または同時
に投薬される単一特異性抗体の投与などの併用療法を含み、一部の特定実施形態では、候
補治療薬はワクチンを含む場合がある。ウィルスまたは病原体は、ウィルスまたは病原体
の感染に関連する一つ以上の症状が非ヒト動物に発症するように、非ヒト動物内の一つ以
上の場所または細胞に定着するのに十分な時間を与えられる場合がある。Ｔ細胞の増殖お
よび成長は、候補治療薬の投与前と後の両方で測定される場合がある。さらに、生存、血
清および／または細胞内サイトカイン分析、肝臓および／または脾臓組織病理が、ウィル
スまたは病原体に感染した非ヒト動物で測定される場合がある。一部の実施形態では、本
発明の非ヒト動物は、ウィルス感染と関連する臓器障害の程度を決定するために使用され
る。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、特定ウィルスに感染した非ヒト動物の
さまざまな臓器のサイトカイン発現プロファイルを決定するために使用される。
本発明の非ヒト動物は、ヒト細胞標的化治療薬剤を評価するために用いることができる
。さまざまな実施形態で、本発明の非ヒト動物にヒト細胞が移植され、ヒト細胞などを標
的とする薬剤候補がこのような非ヒト動物に投与される。次に薬剤の治療有効性が、薬剤
の投与後に非ヒト動物のヒト細胞をモニターすることによって決定される。非ヒト動物で
試験できる薬剤には、小分子化合物、すなわち１５００ ｋＤ、１２００ ｋＤ、１００
０ ｋＤ、または８００ダルトン未満の分子量の化合物、および大分子化合物（タンパク
質など、例えば抗体）の両方を含み、これらはヒト細胞を標的化する（例えば、結合する
および／または作用する）ことによってヒト疾患および状態の治療に対して意図する治療
効果を持つ。
一部の実施形態では、薬剤は抗がん剤であり、ヒト細胞はがん細胞であり、これらは原
発がんの細胞または原発がんから定着した細胞株の細胞でありうる。これらの実施形態で
、本発明の非ヒト動物はヒトがん細胞を移植され、抗がん剤が非ヒト動物に投与される。
薬剤の有効性は、非ヒト動物のヒトがん細胞の成長または転移が、薬剤の投与の結果とし
て阻害されるかどうかを評価することで決定することができる。
特定の実施形態では、抗がん剤は抗体分子であり、これはヒトがん細胞上の抗原に結合
する。特定の実施形態では、抗がん剤は、ヒトがん細胞上の抗原、およびその他のヒト細
胞（例えばＢ細胞およびＴ細胞などのヒト免疫系の細胞（または「ヒト免疫細胞」））上
の抗原に結合する二重特異性抗体である。
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作成し使用するかを当業者に
説明するために提供されており、発明者がその発明として見なすものの範囲を限定するこ
とを意図していない。別途示されていない限り、温度は摂氏で示され、圧力は大気圧また
はその近くである。
（実施例１） 内因性プログラム細胞死１（Ｐｄｃｄ１）遺伝子のヒト化
この例は、齧歯類（例えば、マウス）などの非ヒト哺乳動物のプログラム細胞死１（Ｐ
Ｄ−１）をコードする内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子をヒト化する例示的方法を示している。こ
の例に記述された方法は、任意のヒト配列、または望ましいヒト配列（または配列フラグ
メント）の組み合わせを使用して、非ヒト動物の内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子をヒト化するた
めに用いることができる。この例では、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５０１８．２
（配列番号：２３）に見られるヒトＰＤＣＤ１遺伝子のエクソン２、イントロン２、およ
びエクソン３の最初の７１ ｂｐを含む〜８８３ ｂｐのヒトＤＮＡフラグメントが、マ
ウスの内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子のヒト化のために用いられている。内因性Ｐｄｃｄ１遺伝
子の細胞外Ｎ末端ＩｇＶ領域をコードする遺伝物質のヒト化のための標的化ベクターは、
ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して作製された（米国特許第６，５８６，
２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｎａｔｕｒｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ． ２１（６）：６５２−６５９を参照、これらは参照により本明細書に組
み込まれる）。
簡潔に述べると、マウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンＲＰ２３−９３Ｎ２０（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、ヒトＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸２６〜１６９をコードす
る、〜８８３ ｂｐヒトＤＮＡフラグメントを使用して、内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子のエク
ソン２、イントロン２およびエクソン３の一部を含む配列を欠失して、ヒトＰＤＣＤ１遺
伝子のエクソン２、イントロン２およびエクソン３の一部を挿入するように改変された。
エクソン１、エクソン３の一部（すなわち、膜貫通領域をコードする）、４および５なら
びに５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む内因性ＤＮＡが保持された。〜８８３
ｂｐヒトＤＮＡフラグメントの配列解析で、すべてのヒトＰＤＣＤ１エクソン（すなわち
、エクソン２およびエクソン３の７１ ｂｐ）およびスプライシングシグナルが確認され
た。配列解析で、配列が参照ゲノムおよびＰＤＣＤ１転写ＮＭ＿００５０１８．２に一致
したことが判明した。
より詳細には、最初に、小さな細菌性の相同的組み換えドナーが、以下を含む合成ＤＮ
Ａフラグメントから作製された：［（ＨｉｎｄＩＩＩ）−（マウス上流７８ｂｐ）−（Ｘ
ｈｏＩ／ＮｈｅＩ 制限酵素部位）−（ヒトＰＤＣＤ１ ８８３ｂｐ）−（マウス下流７
５ｂｐ）− （ＨｉｎｄＩＩＩ）］。このフラグメントはＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ
．（ニュージャージー州、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）によって合成され、アンピシリン耐性
プラスミドベクターにクローン化された。ＸｈｏＩ−ＮｈｅＩ部位を用いて、リコンビナ
ーゼ認識部位のそばに隣接した〜４，９９６ ｂｐ自動削除ネオマイシンカセットを結合
した（ｌｏｘＰ−ｈＵｂ１−ｅｍ７−Ｎｅｏ−ｐＡ−ｍＰｒｍ１−Ｃｒｅｉ−ｌｏｘＰ、
米国特許第８，６９７，８５１号、第８，５１８，３９２号および第８，３５４，３８９
号を参照、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。その後の選択にはネオマイシ
ンを用いた。隣接ＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用して、マウスＢＡＣクローンＲＰ２３−９３
Ｎ２０相同的組み換えの前に、標的化ベクターを直線化した。意図的に、ヒトＰＤＣＤ１
８８３ｂｐフラグメントとマウス下流７５ ｂｐの間の接合部はエクソン３にオープン
リーディングフレームを保った（図２）。結果得られた標的化ベクターは、５’から３’
まで、ＢＡＣクローンＲＰ２３−９３Ｎ２０からのマウスゲノムＤＮＡの〜６１．７ ｋ
ｂを含む５’相同アーム、ｌｏｘＰ部位のそばに隣接した自動削除ネオマイシンカセット
、８８３ ｂｐヒトゲノムＤＮＡフラグメント（ヒトＰｄｃｄ１遺伝子のエクソン２から
エクソン３の最初の７１ ｂｐを含む）およびＢＡＣクローンＲＰ２３−９３Ｎ２０から
のマウスゲノムＤＮＡの〜８４ ｋｂを含んでいた。
上述の改変ＲＰ２３−９３Ｎ２０ ＢＡＣクローンは、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞を電
気穿孔して、エクソン２からエクソン３の一部までヒト化された（すなわち、内因性Ｐｄ
ｃｄ１遺伝子の９００ ｂｐの欠失およびヒト配列の８８３ ｂｐの挿入）内因性Ｐｄｃ
ｄ１を備える改変ＥＳ細胞を作るために使用された。ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を含む明確
に標的化されたＥＳ細胞が、ヒトＰＤＣＤ１配列（例えば、エクソン２およびエクソン３
の一部）の存在を検出するアッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記参照）によって特定
され、マウスＰｄｃｄ１配列（例えば、エクソン２およびエクソン３の一部、および／ま
たは１、４および５）の喪失および／または保持を確認した。表４は、上述の内因性Ｐｄ
ｃｄ１遺伝子のヒト化を確認するために使用されたプライマーおよびプローブを示す（図
３）。上流挿入点にわたるヌクレオチド配列には以下を含み、これはｌｏｘＰ部位（太字
）に隣接して連結した挿入点の自動削除ネオマイシンカセットの５’末端の上流の内因性
マウス配列（以下の括弧内に含まれ、ＸｈｏＩ制限部位は斜字で示される）および削除点
にあるカセット配列を示す：（ＴＣＡＡＡＧＧＡＣＡ ＧＡＡＴＡＧＴＡＧＣ ＣＴＣＣ
ＡＧＡＣＣＣ ＴＡＧＧＴＴＣＡＧＴ ＴＡＴＧＣＴＧＡＡＧ ＧＡＡＧＡＧＣＣＣＴ
ＣＴＣＧＡＧ）ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴ ＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧ ＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧ
ＴＴＡＴＡＴＧＣＡＴ ＧＧＣＣＴＣＣＧＣＧ ＣＣＧＧＧＴＴＴＴＧ ＧＣＧＣＣＴＣ
ＣＣＧ ＣＧＧＧＣＧＣＣＣＣ ＣＣＴＣＣＴＣＡＣＧ（配列番号：１９）。自動削除ネ
オマイシンカセットの３’末端にある下流挿入点にわたるヌクレオチド配列には以下を含
み、これは挿入点の下流のヒトＰｄｃｄ１ゲノム配列に隣接するカセット配列（以下の括
弧内に含まれ、ｌｏｘＰ配列は太字およびＮｈｅＩ制限部位は斜字で示される）を示す：
（ＣＴＧＧＡＡＴＡＡＣ ＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴ ＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡ ＣＧＡＡＧＴ
ＴＡＴＧ ＣＴＡＧＴＡＡＣＴＡ ＴＡＡＣＧＧＴＣＣＴ ＡＡＧＧＴＡＧＣＧＡ ＧＣ
ＴＡＧＣ） ＡＡＧＡＧＧＣＴＣＴ ＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧ ＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡ Ｔ
ＣＣＣＣＧＧＧＴＧ ＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣ ＣＡＧＣＡＧＡＧＡＣ ＴＴＣＴＣＡＡＴ
ＧＡ ＣＡＴＴＣＣＡＧＣＴ ＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣ ＴＴＣＣＡＧＡＧＣＣ ＣＴＴＧ
ＣＴＧＣＣＣ ＧＡＧＧＧＡＴＧＴＧ ＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣ ＣＧＧＧＧＡＧＧＣＴ
ＴＴＧＴＧＧＧＧＣＣ ＡＣＣＣＡＧＣＣＣＣ（配列番号：２０）。ヒトＰＤＣＤ１ゲノ
ム配列の３’末端の下流挿入点にわたるヌクレオチド配列には以下が含まれ、これはマウ
スＰｄｃｄ１ゲノム配列（以下のカッコ内に含まれる）に隣接するヒトＰＤＣＤ１配列を
示す：ＣＣＣＴＴＣＣＡＧＡ ＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡ ＧＡＡＧＴＧＣＣＣＡ ＣＡＧＣ
ＣＣＡＣＣＣ ＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡ ＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧ ＣＣＧＧＣＣＡＧＴＴ
ＣＣＡＡＡＣＣＣＴＧ （ＧＴＣＡＴＴＧＧＴＡ ＴＣＡＴＧＡＧＴＧＣ ＣＣＴＡＧＴ
ＧＧＧＴ ＡＴＣＣＣＴＧＴＡＴ ＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴ ＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣ ＣＴ
ＡＧＣＴＧＴＣＴ ＴＣＴＧＣＴＣＡＡＣ）（配列番号：２１）。ネオマイシンカセット
（残り７７ ｂｐ）の欠失後、上流挿入点にわたるヌクレオチド配列は以下を含み、これ
は残りのカセット配列ｌｏｘＰ配列（以下の括弧内に含まれ、ＸｈｏＩおよびＮｈｅＩ制
限部位は斜字、ｌｏｘＰ配列は太字で示される）と並置されたマウスおよびヒトゲノム配
列を示す：ＴＣＡＡＡＧＧＡＣＡ ＧＡＡＴＡＧＴＡＧＣ ＣＴＣＣＡＧＡＣＣＣ ＴＡ
ＧＧＴＴＣＡＧＴ ＴＡＴＧＣＴＧＡＡＧ ＧＡＡＧＡＧＣＣＣＴ （ＣＴＣＧＡＧ Ａ
ＴＡＡＣＴＴＣＧＴ ＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧ ＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧ ＴＴＡＴＧＣＴＡ
ＧＴ ＡＡＣＴＡＴＡＡＣＧ ＧＴＣＣＴＡＡＧＧＴ ＡＧＣＧＡ ＧＣＴＡＧＣ） Ａ
ＡＧＡＧ ＧＣＴＣＴＧＣＡＧＴ ＧＧＡＧＧＣＣＡＧＴ ＧＣＣＣＡＴＣＣＣＣ ＧＧ
ＧＴＧＧＣＡＧＡ ＧＧＣＣＣＣＡＧＣＡ ＧＡＧＡＣＴＴＣＴＣ ＡＡＴＧＡＣＡＴＴ
Ｃ ＣＡＧＣＴＧＧＧＧＴ ＧＧＣＣＣＴＴＣＣＡ（配列番号：２２）。
次に陽性ＥＳ細胞クローンを使用して、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例え
ば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．， ２
００７， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２５（１）：９１−９９を参照）で雌マウ
スに移植し、ヒトＰＤＣＤ１エクソン２およびヒトＰＤＣＤ１エクソン３の一部の、マウ
スの内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子への挿入を含む一腹の子を作った。内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子
のエクソン２および３の一部（すなわち、８８３ ｂｐヒトＤＮＡフラグメント）のヒト
化を持つマウスは、ヒトＰＤＣＤ１遺伝子配列の存在を検出したアレルアッセイ（Ｖａｌ
ｅｎｚｕｅｌａら、上記参照）の改良型を使用した尾部断片から単離されたＤＮＡの遺伝
子型同定によって再び確認・特定された。子は遺伝子型同定され、ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝
子構築物に対してヘテロ接合性の動物のコホートが特徴付けのために選択された。
Figure 2021094035
（実施例２） 活性化Ｔ細胞上のヒト化ＰＤ−１の発現
この例は、実施例１に従ってヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を含むように改変された非ヒト動
物（例えば、齧歯類）が、活性化リンパ球の表面上にヒト化ＰＤ−１タンパク質を発現す
ることを実証する。この例では、野生型およびヒト化マウスから単離された刺激Ｔ細胞の
ＰＤ−１の発現を決定するために、実施例１に記述された内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子のヒト
化についてヘテロ接合性のマウスからの活性化Ｔ細胞が、抗ＰＤ−１抗体で染色された。
簡潔に述べると、野生型マウスおよび実施例１に記述された内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子の
ヒト化に対してヘテロ接合性のマウスから脾臓が採取され、機械解離によって単一細胞懸
濁液へと処理された。細胞は培養液（１０％ ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ）で洗浄され、１×１
０６／ｍＬで再懸濁されて、２００ μＬ（細胞２００，０００個）が９６ウェルプレー
トに蒔かれた。選択されたウェルの細胞が、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（両方とも１
μｇ／ｍＬ）で７２時間刺激された。細胞はＦＡＣＳのために、製造業者の仕様に従っ
て、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９およびヒト（クローンＭＩＨ４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ）またはマウス（クローンＪ４３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ＰＤ１を認識する抗
体で染色された。染色された細胞はＬＳＲＩＩフローサイトメーターにかけられ、Ｆｌｏ
ｗｊｏソフトウェアを使用してデータが分析された。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ヒトおよびマ
ウスＰＤ１の発現に対してゲート化された（ＣＤ１９−ＣＤ８＋）。例示的結果が図４に
示されている。
図４に示されるように、実施例１に記述されたヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を持つマウスは
、ヒト部分および内因性マウス部分を備えるＰＤ−１ポリペプチドを発現する。ヒト部分
は、完全なヒトＰＤ−１ポリペプチドを認識する抗体による認識を介して検出可能なよう
に発現される。
（実施例３） ＰＤ−１調節因子のインビボ有効性
この例は、ＰＤ−１調節因子（例えば、抗ＰＤ−１抗体）をスクリーニングし、例えば
、腫瘍増殖の阻害および／または腫瘍細胞の殺傷などのさまざまな特徴を決定するために
、実施例１に従ってヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を含むように改変された非ヒト動物（例えば
、齧歯類）をインビボアッセイで使用できることを実証する。この例では、腫瘍成長を阻
害する最適な抗体用量および抗ＰＤ−１抗体が腫瘍細胞の殺傷を媒介する程度を決定する
ために、実施例１に記述された内因性Ｐｄｃｄ１遺伝子のヒト化に対してホモ接合性のマ
ウスで、いくつかの抗ＰＤ−１抗体がスクリーニングされる。
簡潔に述べると、マウスは体重によって試験１では５つの治療群または対照群（ｎ＝５
／群）に、試験２では８つの治療群または対照群に（ｎ＝５／群）、試験３では５つの治
療群または対照群（ｎ＝７／群）に均等に分けられた。０日目に、マウスはイソフルラン
吸入で麻酔され、その後ＤＭＥＭ１００ μＬ中に懸濁したＭＣ３８．ｏｖａ細胞を右脇
腹に皮下注射された（試験１：５×１０５、試験２／３：１×１０６）。ＭＣ３８．ｏｖ
ａ（マウス結腸腺がん）細胞は、腫瘍免疫原性を増加するためにニワトリ卵白アルブミン
を発現するよう遺伝子操作された。試験１では、治療群は、抗ＰＤ−１抗体３つのうちの
１つ、または無関係の特異性を持つアイソタイプ対照抗体の２００ μｇを実験の３、７
、１０、１４および１７日目に腹腔内注射された一方、マウスの一群は未治療のままとさ
れた。試験２では、治療群は、投与量当たり１０ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ
−１抗体３つのうちの１つ、投与量当たり１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１抗体（Ａｂ Ｂ、
ＩｇＧ４）１つ、または１０ｍｇ／ｋｇの無関係の特異性を持つアイソタイプ対照抗体を
実験の３、７、１０、１４および１７日目に腹腔内注射された。試験３では、治療群は、
投与量当たり５ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１抗体２つのうちの１つ、
または５ｍｇ／ｋｇのＰＤ−１に特異的でない対照抗体（対照）を実験の３、７、１０、
１４および１７日目に腹腔内注射された。表５はマウスの群に対する実験投与量および治
療プロトコルを示す。
試験のそれぞれについて、各治療群に対する各実験の１４または１７日目および２３ま
たは２４日目での、キャリパー測定で決定された平均腫瘍体積および生存パーセントが記
録された。腫瘍のないマウスの数も試験終了時（試験１の４２日目ならびに試験２および
試験３の３１日目）に評価された。平均腫瘍体積（ｍｍ３）（±ＳＤ）、生存パーセント
、および腫瘍のないマウスの数が各試験について計算された（表７〜９）。例示的腫瘍増
殖曲線が図５に提供されている。
試験１について表６に示されるように、Ａｂ Ａで治療されたマウスは試験過程の間、
検出可能な腫瘍を発症しなかった。Ａｂ Ｃで治療されたマウスは、試験の１７および２
４日目で対照と比べて腫瘍体積の持続的減少を示し、マウス５匹中３匹が実験終了まで腫
瘍がなかった。対照的に、Ａｂ Ｂでの治療はこの試験では対照と比べて、腫瘍体積の減
少での有意な有効性を示さなかった。試験の２３日目までに、Ａｂ Ｂを投与された群の
マウス５匹中１匹が死亡し、アイソタイプ対照抗体治療群のマウス５匹中２匹が死亡した
。非治療群およびアイソタイプ対照群では、一部のマウスが腫瘍の自然退縮を示した（そ
れぞれマウス５匹中１匹および５匹中２匹）。
試験２について表７に示されるように、１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ Ａで治療されたマウス
は試験過程の間、検出可能な腫瘍を発症しなかった。１０ ｍｇ／ｋｇのＡｂ Ｃまたは
Ａｂ Ｄのいずれかで治療されたマウスの群は、試験の１７および２４日目に対照と比べ
て、腫瘍体積の大幅な減少を示した。１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ ＣまたはＡｂ Ｄいずれか
で治療された各群のマウス５匹中４匹が、３１日目に腫瘍がなかったのに対し、アイソタ
イプ対照治療群では５匹中１匹のみが腫瘍の自然退縮の結果、腫瘍がなかった。１０ｍｇ
／ｋｇで試験されたＡｂ Ｂは、試験の１７および２４日目に対照と比べて腫瘍体積の大
幅な減少を示したが、この抗体は最も有効性の少ない抗ＰＤ１抗体で、実験の終了時に生
存していたマウスは５匹中２匹のみであった。
試験用量（５ ｍｇ／ｋｇおよび１０ ｍｇ／ｋｇ）での腫瘍抑制の用量依存性反応が
、Ａｂ Ａ、Ａｂ ＣおよびＡｂ Ｄ治療群で観察された。５ ｍｇ／ｋｇでのＡｂ Ａ
またはＡｂ Ｃ療法は有効性が少なく、３１日目の実験終了時に腫瘍のないマウスは５匹
中４匹だったのに対し、Ａｂ Ａの１０ ｍｇ／ｋｇ用量群ではマウス５匹中５匹が腫瘍
のないままであった。２元配置ＡＮＯＶＡ多重比較のダネットの検定で、参照として１０
ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体で治療された群と１０ ｍｇ／ｋｇのＡｂ Ａ、Ａ
ｂ ＣまたはＡｂ Ｄで治療された群との間の腫瘍増殖の差は、ｐ値＜０．００５で統計
的に有意であることが判明した。参照として１０ ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体で
治療された群と５ ｍｇ／ｋｇのＡｂ Ａ、Ａｂ ＣまたはＡｂ Ｄで治療された群との
間の腫瘍増殖の差も、ｐ値＜０．０５で統計的に有意であった。
試験３について表８に示されるように、５ｍｇ／ｋｇのＡｂ ＡまたはＡｂ Ｃで治療
されたマウス７匹中６匹が実験の終了時に腫瘍がなかったのに対し、アイソタイプ対照群
に腫瘍のないマウスはいなかった。ＩｇＧ４対照群の腫瘍を持つマウス１匹が移植後１７
日目に死亡した。２．５ｍｇ／ｋｇのＡｂ Ｃで治療されたマウス７匹中４匹のみが、実
験終了時に腫瘍がないままであった。試験された抗ＰＤ−１抗体とアイソタイプ対照群と
の間の２１日目の腫瘍体積の差は、試験後のダネットの多重検定比較を使用した一元配置
ＡＮＯＶＡで決定した時、統計的に有意でありｐ＜０．０１であった。試験された４つの
抗ＰＤ−１抗体はすべて同じように、２．５ ｍｇ／ｋｇ用量よりも５ ｍｇ／ｋｇ用量
でより有効であった。
図５に示されるように、抗ＰＤ−１抗体は、実施例１に従って作られたＰＤ−１ヒト化
マウスの予防的ＭＣ３８．ｏｖａ腫瘍成長モデルの腫瘍成長を有意に阻害した。１０ ｍ
ｇ／ｋｇでの抗ＰＤ−１ Ａｂ療法は、実験の過程全体を通して、すべてのマウス（５匹
中５匹）に腫瘍退縮を促進したのに対し、対照群では腫瘍の自然退縮の結果、５匹中１匹
のみで腫瘍がないままであった。５ ｍｇ／ｋｇでの抗ＰＤ−１療法は有効性がわずかに
少なく、実験終了時に腫瘍がないマウスは５匹中４匹であった。試験後のダネットの多重
検定比較を使用した一元配置ＡＮＯＶＡでは、ｐ値 ＜ ０．０５（５ ｍｇ／ｋｇ）お
よびｐ値＜０．０１（１０ ｍｇ／ｋｇ）で、抗ＰＤ−１治療と対照抗体治療との間に有
意な差があることが判明した。
類似の実験で、実施例１に従って作られたＰＤ−１ヒト化マウスでの無傷の機能的ＰＤ
−１シグナル伝達が、抗ＰＤ−１抗体で治療された腫瘍を持つマウスのＣＤ８＋ Ｔ細胞
およびＣＤ３＋ Ｔ細胞反応および脾臓のＩＦＮγ生産を測定することによって調べられ
た。
簡潔に述べると、実験終了時の２１日目に抗ＰＤ−１または対照抗体で治療されたＰＤ
−１ヒト化マウス（７５％ Ｃ５７ＢＬ／６／２５％ １２９）から脾臓細胞が採取され
た。全ＲＮＡが単離され、オリゴヌクレオチドおよび、マウスＣＤ８ｂ（フォワードプラ
イマー：ＧＣＴＣＴＧＧＣＴＧ ＧＴＣＴＴＣＡＧＴＡ ＴＧ、配列番号：２４；リバー
スプライマー：ＴＴＧＣＣＧＴＡＴＧ ＧＴＴＧＧＴＴＴＧＡ ＡＣ、配列番号：２５；
プローブ：ＡＧＣＡＧＣＴＣＴＧ ＣＣＣＴＣＡＴ、配列番号：２６）、マウスＣＤ３ζ
（Ｍｍ００４４６１７１＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、マウスＩＦ
Ｎ−γ（Ｍｍ０１１６８１３４＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒト
ＰＤ−１（フォワードプライマー：ＡＣＴＴＣＣＡＣＡＴ ＧＡＧＣＧＴＧＧ、配列番号
：２７；リバースプライマー：ＧＧＧＣＴＧＴＧＧＧ ＣＡＣＴＴＣＴＧ、配列番号：２
８；プローブ：ＧＣＡＧＡＴＣＡＡＡ ＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣ、配列番号：２９）および
マウスＰＤ−１（Ｍｍ０１２８５６７６＿ｍ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）に対して特異的なｔａｑｍａｎプローブミックスを使用して、逆転写ｃＤＮＡに対して
リアルタイムＰＣＲが実施された。サンプルは、マウスシクロフィリンＢの発現に対して
正規化された。例示的結果が図６に提供されている。
図６に示されるように、抗ｈＰＤ−１抗体の投与は、（実施例１に従って作られた）Ｍ
Ｃ３８．ｏｖａ腫瘍を持つヒト化マウスの脾臓のＣＤ８＋およびＣＤ３＋ Ｔ細胞の生産
増加を誘発した。さらに、腫瘍を持つＰＤ−１ヒト化マウスの抗ｈＰＤ−１抗体活性はＩ
ＦＮγに依存し、これは細胞表面上のヒト化ＰＤ−１を通した適正なシグナル伝達を確認
した。全体として、対照治療マウスと比べて、Ｔ細胞およびＩＦＮγの増加が両方の治療
群で観察された。
ヒトＰＤ−１ ｍＲＮＡ発現は、ＰＤ−１タンパク質の細胞外部分に対して設計された
ヒト特異的プローブで測定され、細胞表面上のヒト化ＰＤ−１タンパク質の適正な発現を
確認した。さらに、マウスＰＤ−１の細胞外部分を検出するように設計されたプライマー
でのマウスＰＤ−１ ｍＲＮＡ発現の測定では、生成物を生産できなかった。
まとめると、この例は、本発明の非ヒト動物が、ＰＤ−１を標的とする薬剤（例えば、
抗体）のインビボでの有効性を評価するために使用でき、このような動物が抗ＰＤ−１抗
体の治療効果の区別において有用であることを示している。さらに、本明細書に記述され
た非ヒト動物は、ＰＤ−１を標的とする薬剤が腫瘍成長を阻害するおよび／または腫瘍細
胞の殺傷を媒介する程度を評価するために使用できる。本発明の非ヒト動物（例えば、マ
ウス）は、Ｔ細胞およびサイトカイン発現（例えば、ＩＦＮ−γ）によって証拠付けられ
る、ヒト化ＰＤ−１を介した機能的ＰＤ−１信号伝達および適正なＰＤ−１依存性免疫反
応を実証している。
Figure 2021094035
Figure 2021094035
Figure 2021094035
Figure 2021094035
（実施例４） 抗ＰＤ−１腫瘍療法の齧歯類モデル
この例は、実施例１によるヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を含むように改変された非ヒト動物
（例えば、齧歯類）は、ＰＤ−１調節因子（例えば、抗ＰＤ−１抗体）の最適な治療用量
を決定するための腫瘍モデルに使用できることを示している。この例では、抗ＰＤ−１抗
体が、定着腫瘍の治療のための最適治療用量を決定するために、実施例１に記述された内
因性Ｐｄｃｄ１遺伝子のヒト化に対してホモ接合性のマウスに投与される。
簡潔に述べると、（実施例１に記述された）ヒト化Ｐｄｃｄ１遺伝子を含むマウスに、
（上述の）１×１０６ ＭＣ３８．Ｏｖａ細胞が皮下移植され、その後、腫瘍体積が８０
〜１２０ ｍｍ３に達した時点で、６つの治療群（群あたりｎ＝８〜９）に無作為化され
た（０日目）。マウスは、０．３〜２５ ｍｇ／ｋｇの段階的増大範囲（すなわち、０．
３、１、３、１０または２５ ｍｇ／ｋｇ）の抗ｈＰＤ−１抗体または２５ ｍｇ／ｋｇ
のアイソタイプ対照抗体を腹腔内投与された。抗体は０、３、７、１０および１３日目に
投与された。腫瘍体積が、実験の持続期間（６０日）の間、週２回キャリパー測定でモニ
ターされた。例示的腫瘍増殖曲線が図７に提供されている。
図７に示されるように、対照抗体を投与されたマウスで実験の終了時に腫瘍がなかった
マウスはいなかった。対照的に、抗ｈＰＤ−１抗体の３〜２５ ｍｇ／ｋｇの用量範囲は
、異なる治療群で約４４〜５５％の腫瘍のないマウスをもたらした。まとめると、この例
は、本発明の非ヒト動物が、定着腫瘍を効果的に治療するためにＰＤ−１を標的にした薬
剤（例えば、抗体）の最適用量および／または用量範囲を決定する齧歯類腫瘍モデルとし
て使用できることを実証している。
同等物
本発明の少なくとも一つの実施形態のこのような記述されたいくつかの側面を持つ、さ
まざまな修正、変更、および改善を当業者であれば容易に思いつくことが当業者には理解
されるはずである。このような修正、変更、および改善は本開示の一部であることが意図
され、本発明の精神および範囲内であることが意図される。従って、前述の説明および図
面は例示のみとしてのものであり、本発明は以下の請求項によって詳細に記述される。
請求項で請求項を変更するための「第一の」、「第二の」、「第三の」などの順序の用
語の使用は、それ自体は一つの請求項要素の別の要素に対する優位性、先行、もしくは順
序、または方法の行為が実施される時間的順序を暗示せず、特定の名称を持つ一つの請求
項要素を（順序の用語の使用以外は）同じ名称を持つ別の要素から区別して請求項要素を
区別するための標識としてのみ使用される。
本明細書および請求項で使用される場合、「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、そうで
ないことが明確に示されない限り、複数参照を含むと理解されるべきである。群の一つ以
上の要素の間に「または」を含む請求項または記述は、そうではないことが示されるかま
たはそうでなければ文脈から明らかでない限り、一つ、二つ以上、または群のすべての要
素が、所定の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連
する場合に満足される。本発明は、群の正確に一つの要素が所定の生成物またはプロセス
に存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する実施形態を含む。本発明は、二
つ以上、または群の要素全体が所定の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、ま
たはそうでなければ関連する実施形態も含む。さらに、本発明は、別途指定されない限り
、または矛盾または不一致が起こることが当業者には明らかでない限り、変形、組み合わ
せ、および記載された請求項の一つ以上からの一つ以上の限定、要素、句、記述用語など
が、同じ基礎請求項に依存する別の請求項（または関連する任意のその他の請求項）に導
入される並べ替えすべてを網羅することを理解すべきである。記載されたような要素が存
在する場合（例えば、マーカッシュ群または類似の形式で）、要素の各サブグループも開
示され、任意の要素を群から除去することができる。当然のことながら、一般的に、本発
明、または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むとして言及される場合、本発明の
特定実施形態または本発明の態様は、このような要素、特徴などから成る、または実質的
にそれらから成る。簡潔にするために、これらの実施形態はすべての場合において、多く
の言葉では本明細書に特に記述されていない。これも当然のことながら、本発明の任意の
実施形態または態様は、特定の除外が明細書に列挙されているかどうかにかかわらず、請
求項から明示的に除外される可能性がある。
当業者であれば、アッセイまたは本明細書に記述されたその他のプロセスで得られた値
に起因する一般的な標準偏差または誤差を理解するであろう。本発明の背景を説明し、そ
の実践に関して追加的詳細を提供するための本明細書の出版物、ウェブサイトおよびその
他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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