KR102540778B1 - 아포리포단백질 c-iii(apoc3) 유전자의 발현 억제를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 APOC3 유전자를 표적하는 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 및 상기 dsRNA를 이용하여 APOC3의 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다.
Description
[관련출원]
본 출원은 그 전체가 본원에서 참조로 포함되는 2011년 6월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 제61/499,620호의 이익을 주장한다.
[서열 목록에 대한 참조]
본 출원은 201X년 모월 XX일에 생성한, X00,000 바이트 크기의 11111US_sequencelisting.txt라는 이름의 텍스트 파일로서 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. 서열 목록은 참조로서 포함된다.
[기술분야]
본 발명은 APOC3 유전자를 표적하는 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 및 상기 dsRNA를 이용하여 APOC3의 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다.
미국에서, 성인의 30%는 150 mg/dL을 초과하는 고도 중성지방(TG)를 가지고 있다. 심각한 고중성지방혈증(TG > 500 mg/dL)이 있는 성인의 유병율은 1.7%이다. 현행 치료법으로는 생활습관 개선(다이어트, 운동 및 금연), 의약품 등급 생선 오일, 피브레이트(fibrates) 및 나이아신을 포함한다.
ApoC3은 유리 지방산으로 TG를 가수 분해하는 리포단백질 리파아제를 억제하고; 수용체 독립 엔도시토시스(receptor independent endocytosis)뿐만 아니라 LDLR 및 LRP를 통해 TG-다량함유 리포단백질의 ApoE-매개 간 섭취를 억제하며; 간 VLDL 분비를 촉진하는 것으로 알려져 있는 분비 간 단백질이다. 인간 APOC3 유전자에서 적어도 하나의 돌연변이는 바람직한 지질 프로파일과 연관되어 있다. (Pollin TI 등(2008) 인간 APOC3에서 삭제 돌연변이는 바람직한 혈장 지질 프로파일 및 표면상의 심장보호를 부여한다. 사이언스. 322(5908): 1702-5).
이중-가닥 RNA 분자(dsRNA)는 RNA 간섭(RNAi)으로 알려진 고도로 보존된 조절 메커니즘에 있어서 유전자 발현을 차단하는 것으로 알려져 있다. WO 99/32619(Fire 등)은 길이가 적어도 25 뉴클레오티드의 dsRNA를 이용하여 C. 엘레간스에서 유전자의 발현을 억제하는 것을 개시한다. dsRNA는 식물(예컨대, WO 99/53050, Waterhouse 등; 및 WO 99/61631, Heifetz 등 참조), 초파리(예컨대, Yang, D. 등, Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200 참조) 및 포유류(WO 00/44895, Limmer; 및 독일 특허 DE 101 00 586.5, Kreutzer 등 참조)를 포함하는 기타 유기체에서 목적 RNA를 분해시키는 것으로도 알려져 있다.
본원에서 APOC3 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 리보핵산(dsRNA)로서, 상기 dsRNA는 각각 길이가 30 뉴클레오티드 이하인 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 표 1, 2, 6, 7 또는 10에서 안티센스 서열의 적어도 15 개 연속 뉴클레오티드들을 포함하는 이중-가닥 리보핵산이 개시되어 있다. 일 실시형태에 있어서, 상기 dsRNA는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 70으로 이루어진 센스 가닥 및 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO: 151(AD-45149.1UM)으로 이루어진 안티센스 가닥을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 센스 가닥 서열은 표 1, 2, 6, 7 또는 10으로부터 선택되며, 상기 안티센스 가닥은 1, 2, 6, 7 또는 10으로부터 선택된다.
일부 실시형태들에 있어서, 상기 dsRNA의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이고, 예컨대, 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드는 2' O-메틸 변형 뉴클레오티드, 5' 포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데카노산 비스데실아미드기에 연결된 터미널(terminal) 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'데옥시-변형 뉴클레오티드, 잠금 뉴클레오티드, 무염기(abasic) 뉴클레오티드, 2'아미노-변형 뉴클레오티드, 2'알킬-변형 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포아미데이트 및 뉴클레오티드를 포함하는 비-천연 염기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태들에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 하나의 뉴클레오티드의 3'오버행(overhang)을 포함하거나 각각의 가닥은 적어도 두 개의 뉴클레오티드의 3'오버행을 포함한다.
본 발명의 임의의 dsRNA는 리간드, 예를 들면, dsRNA의 센스 가닥의 3'말단에 콘쥬게이트된(conjugated) 리간드를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에 있어서, 본 발명의 dsRNA는 적어도 하나의 N-아세틸-갈락토사민을 더 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 임의의 dsRNA를 포함하는 세포; 본 발명의 임의의 dsRNA의 적어도 하나의 가닥을 인코딩하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명의 임의의 dsRNA를 포함하는 APOC3 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물도 본 발명에 포함된다. 상기 약학적 조성물은 지질 제형, 예컨대, MC3을 포함하는 지질 제형을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 세포 내에서 APOC3 발현을 억제하는 방법에 있어서, (a) 상기 세포를 본 발명의 APOC3 dsRNA와 접촉시키는 단계 및 (b) 상기 단계 (a)에서 생성된 세포를 APOC3 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 얻는데 충분한 시간 동안 유지하여 상기 세포 내에서 상기 APOC3 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 방법이다. 일부 실시형태들에 있어서, APOC3 발현은 적어도 30%가 억제된다.
본 발명의 다른 양태는 APOC3 발현에 의해 매개된 질환을 치료하는 방법에 있어서, 이러한 치료를 필요로 하는 사람에게 본 발명의 APOC3 dsRNA 또는 본 발명의 약학적 조성물의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함하는 방법이다. 상기 질환은 예컨대, 고도 중성지방 레벨, 예컨대, 150 mg/dL 또는 500 mg/dL 초과의 중성지방 레벨일 수 있다. 일부 실시형태들에 있어서, 투여는 리포단백질 리파아제 및/또는 간 리파아제 활성의 증가를 유발한다. 상기 dsRNA 또는 약학적 조성물은 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 0.5 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
도 1은 APOC3을 표적하는 siRNA("siRNA#1" 및 "siRNA#2"으로 처리한 이후에 쥐들에 있어서 표적 mRNA, 중성지방(TG) 및 총 콜레스테롤 레벨에 미치는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 Ga1NAc의 구조를 도시한다.
도 3은 3' 말단에서 포스페이트 연결을 통해 Chol-p-(Ga1NAc)3에 콘쥬게이트된 siRNA의 구조를 도시한다.
도 4는 LCO(Ga1NAc)3에 콘쥬게이트된 siRNA((Ga1NAc)3 - 3' -리토콜릭-올레오일 siRNA 콘쥬게이트)의 구조를 도시한다.
도 2는 Ga1NAc의 구조를 도시한다.
도 3은 3' 말단에서 포스페이트 연결을 통해 Chol-p-(Ga1NAc)3에 콘쥬게이트된 siRNA의 구조를 도시한다.
도 4는 LCO(Ga1NAc)3에 콘쥬게이트된 siRNA((Ga1NAc)3 - 3' -리토콜릭-올레오일 siRNA 콘쥬게이트)의 구조를 도시한다.
본 발명의 하나 이상의 실시형태들의 상세사항은 하기 설명에 설명되어 있다. 본 발명의 기타 특징, 목적 및 장점은 설명 및 도면들 및 청구의 범위로부터 명백해 질 것이다.
본 발명은 dsRNA 및 상기 dsRNA가 APOC3 유전자를 표적하는 세포 또는 포유류에서 APOC3 유전자의 발현을 억제하기 위해 상기 dsRNA를 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 APOC3 유전자의 발현에 의해 유발된 포유류의 병적 상태 및 질병을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. APOC3 dsRNA는 APOC3 mRNA의 서열-특이적 분해를 유도한다.
정의
편의상 본 명세서, 실시예 및 첨부된 청구의 범위에 사용된 특정 용어 및 어귀의 의미가 하기에 제공된다. 본 명세서의 기타 부분에서 용어의 사용 및 이 섹션에서 제공된 그 정의 사이에 명백한 불일치가 있으면, 이 섹션에서의 정의가 우선한다.
"G", "C", "A" 및 "U"는 각각, 일반적으로 염기로서 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실 각각을 포함하는 뉴클레오티드를 나타낸다. "T" 및 "dT"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 데옥시리보뉴클레오티드로서, 상기 뉴클레오염기는 티민, 예컨대, 데옥시리보티민인 데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. 그러나, "리보뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드" 또는 "데옥시리보뉴클레오티드"라는 용어는 하기에 더욱 상술된 바와 같이 변형 뉴클레오티드, 또는 대리 대체 모이어티(surrogate replacement moiety)를 지칭할 수도 있다는 것을 알 것이다. 당업자는 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실이 이러한 대체 모이어티를 보유하는 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 염기 짝지음 성질을 실질적으로 변경하지 않으면서 기타 모이어티에 의해 대체될 수 있다는 것을 충분히 인지한다. 예를 들면, 제한 없이, 염기로서 이노신을 포함하는 뉴클레오티드는 아데닌, 시토신 또는 우라실을 포함하는 뉴클레오티드와 염기쌍을 이룰 수 있다. 따라서, 우라실, 구아닌 또는 아데닌을 포함하는 뉴클레오티드는 본 발명의 뉴클레오티드 서열 내에서, 예를 들면, 이노신을 포함하는 뉴클레오티드에 의해 대체될 수 있다. 이런 대체 모이어티를 포함하는 서열은 본 발명의 실시형태이다.
"APOC3"은 아포리포단백질 C-III 유전자를 지칭한다. NCBI NLM 웹사이트에 따르면, 아포리포단백질 C-III은 매우 낮은 밀도의 리포단백질(VLDL) 단백질이다. APOC3은 리포단백질 리파아제 및 간 리파아제를 억제하며; 중성지방-다량함유 입자의 이화 작용을 늦추는 것으로 여겨진다. APOA1, APOC3 및 APOA4 유전자는 생쥐 및 인간 게놈 양쪽 모두에 밀접히 연결되어 있다. A-I 및 A-IV 유전자는 동일한 가닥으로부터 전사되는 반면에, A-1 및 C-III 유전자는 집중되어 전사된다. apoC-III 레벨의 증가는 고중성지방혈증의 진전을 유도한다. 인간 APOC3 mRNA 서열은 본원에서 SEQ ID NO:1로 포함된 유전자은행 접근 번호 NM_000040.1이다. 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) ANGPTL3 mRNA 서열은 유전자은행 접근 번호 X68359.1이다.
본원에 사용된 "표적 서열"은 일차 전사 산물의 RNA 가공의 산물인 mRNA를 포함하여, APO3 유전자의 전사 동안에 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 연속 부분을 지칭한다.
본원에 사용된 "서열을 포함하는 가닥"이라는 용어는 표준 뉴클레오티드 명명법을 이용하여 지칭되는 서열에 의해 기술되는 뉴클레오티드의 사슬을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에 사용되고 달리 지시되지 않으면, 제2 뉴클레오티드 서열과 관련하여 제1 뉴클레오티드 서열을 기술하는데 이용될 때 "상보적"이라는 용어는 당업자가 이해하는 바와 같이, 상기 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 특정 조건 하에서 듀플렉스(duplex) 구조를 혼성화하여 형성하는 상기 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 능력을 지칭한다.
예를 들면, 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열이 가혹한 혼성화 조건 하에서 혼성화(예컨대, 어닐링)되는 경우 상기 제1 뉴클레오티드 서열은 상기 제2 뉴클레오티드 서열과 상보적이라고 기술될 수 있다. 혼성화 조건으로는 어닐링 및/또는 세척 단계를 위한 온도, 이온 강도, pH 및 유기 용매 농도를 포함한다. 가혹한 혼성화 조건이라는 용어는 제1 뉴클레오티드 서열이 그 표적 서열, 예컨대, 제2 뉴클레오티드 서열과 우선적으로 혼성화되고, 기타 서열들과는 못 미치는 정도 혼성화되거나 전혀 혼성화되지 않는 조건을 지칭한다. 가혹한 혼성화 조건은 서열 의존적이며, 상이한 환경 매개변수들 하에서 상이하다. 일반적으로, 가혹한 혼성화 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 뉴클레오티드 서열에 대한 열용용점(Tm)보다 약 5℃ 더 낮은 것으로 선택된다. Tm은 제1 뉴클레오티드 서열의 50%가 완벽히 매칭된 표적 서열과 혼성화되는 (정의된 이온 강도 및 pH 하에서) 온도이다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 가이드는 예컨대, Tijssen (1993) 생화학 및 분자 생물학에 있어서 실험실 기법 - 핵산 탐침을 이용한 혼성화 파트 I, 2 장, "혼성화의 원리 및 핵산 탐침 분석의 전략의 개요" Elsevier, N.Y. ("Tijssen")에서 보게 된다.
유기체 내에서 직면할 수 있는 생리학적으로 적절한 조건과 같은 기타 조건이 적용될 수 있다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오티드의 최종적인 적용에 따른 2 개 서열들의 상보성의 시험에 대해 가장 적절한 조건들의 세트를 결정할 수 있다.
이는 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 대하여 상기 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 상기 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 염기 짝지음을 포함한다. 이러한 서열은 본원에서 각각에 대하여 "완전 상보적(fully complementary)"이라고 지칭될 수 있다. 그러나, 제1 서열이 본원에서 제2 서열에 대하여 "실질적으로 상보적"으로 지칭되는 경우, 상기 두 서열들은 완전 상보적일 수 있거나, 이들의 최종적인 적용에 대하여 가장 적절한 조건하에서 혼성화할 수 있는 능력을 유지하면서, 혼성화 시에 이들은 하나 이상이지만, 일반적으로 4, 3 또는 2 개 이하의 미스매치된 염기쌍들을 형성할 수 있다. 그러나, 2 개의 올리고뉴클레오티드들이 혼성화 시에 하나 이상의 단일 가닥 오버행들을 형성하도록 설계되는 경우, 그러한 오버행들은 상보성의 결정에 대하여 미스매치로 간주되지 않는다. 예를 들면, 길이가 더 긴 올리고뉴클레오티드가 길이가 더 짧은 올리고뉴클레오티드에 대하여 완전 상보적인 21 개 뉴클레오티드들의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 길이가 21 뉴클레오티드인 하나의 올리고뉴클레오티드 및 길이가 23 뉴클레오티드인 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA는 본원에 기술된 목적을 위해 "완전 상보적"으로도 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 "상보적" 서열은 혼성화할 수 있는 능력에 대하여 상기 요구사항이 충족되는 한, 비-천연 및 변형 뉴클레오티드로부터 형성된 비-왓슨-크릭 염기쌍들 및/또는 염기쌍들을 포함하기도 하거나 완전히 이들로부터 형성될 수도 있다. 이러한 비-왓슨-크릭 염기쌍들은 G:U 워블(Wobble) 또는 후그스타인 염기 짝지음을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
본원에서 "상보적", "완전 상보적" 및 "실질적으로 상보적"이라는 용어들은 이들의 이용의 맥락에서 이해될 수 있는 바와 같이, dsRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 사이, 또는 dsRNA의 안티센스 가닥 및 표적 서열 사이의 염기 매칭에 대하여 이용될 수 있다.
본원에 사용된, 전령 RNA(mRNA)의 "적어도 일부에 실질적으로 상보적"인 폴리뉴클레오티드는 5' UTR, 개방된 해독틀(open reading frame: ORF) 또는 3' UTR을 포함하는, 관심 대상의 mRNA(예컨대, APOC3을 인코딩하는 mRNA)의 연속 부분에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들면, 서열이 APOC3을 인코딩하는 mRNA의 비 단속(non-interrupted) 부분에 실질적으로 상보적이라면 폴리뉴클레오티드는 APOC3 mRNA의 적어도 일부분에 상보적이다.
일 실시형태에 있어서, dsRNA의 안티센스 가닥은 표적 mRNA의 절단을 유발시킬만큼 표적 mRNA에 충분히 상보적이다.
본원에 사용된 "이중-가닥 RNA" 또는 "dsRNA"라는 용어는 상기에서 정의된 바와 같이 2 개의 안티-평형 및 실질적으로 상보적인 핵산 가닥들을 포함하는 듀플렉스 구조를 갖는 리보핵산 분자들의 복합체를 지칭한다. 일반적으로, 각각의 가닥의 뉴클레오티드들의 대부분은 리보뉴클레오티드들이지만, 본원에서 상세히 기술된 바와 같이, 각각의 가닥 또는 양 가닥들은 적어도 하나의 비-리보뉴클레오티드, 예컨대, 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 변형 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 바와 같이, "dsRNA"는 복수의 뉴클레오티드들에서 실질적인 변형을 포함하고 본원에 개시되거나 업계에 알려진 모든 유형의 변형을 포함하는, 리보뉴클레오티드에 대한 화학적 변형을 포함할 수 있다. siRNA 형 분자에 사용된 바와 같이 임의의 그러한 변형은 본 명세서 및 청구의 범위의 목적을 위해 "dsRNA"에 포함된다.
듀플렉스 구조를 형성하는 두 개의 가닥들은 하나의 더 큰 RNA 분자의 상이한 부분들일 수 있거나, 개별 RNA 분자들일 수 있다. 두 개 가닥들이 하나의 더 큰 분자의 부분이며, 따라서 듀플렉스 구조를 형성하는 하나의 가닥의 3'-말단 및 각각의 나머지 가닥의 5'-말단 사이의 뉴클레오티드들의 비단속 사슬에 의하여 연결되는 경우에, 연결 RNA 사슬은 "헤어핀 루프"로 지칭된다. 두 개 가닥들이 듀플렉스 구조를 형성하는 하나의 가닥의 3'-말단 및 각각의 나머지 가닥의 5'-말단 사이의 뉴클레오티드들의 비단속 사슬이 아닌 수단에 의하여 공유적으로 연결되는 경우에, 연결 구조는 “링커”로 지칭된다. RNA 가닥들은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오티드들을 가질 수 있다. 염기 쌍들의 최대수는 dsRNA의 최단 가닥의 뉴클레오티드들의 수에서 듀플렉스에 존재하는 임의의 오버행들을 차감한 것이다. 듀플렉스 구조에 더하여, dsRNA는 하나 이상의 뉴클레오티드 오버행들을 포함할 수 있다. “siRNA”라는 용어는 상술한 dsRNA를 지칭하는 것으로 본원에서 이용되기도 한다.
본원에 사용된 “뉴클레오티드 오버행”은 dsRNA의 일 가닥의 3'-말단이 나머지 가닥의 5'-말단을 벗어나 연장하거나 그 반대인 경우 dsRNA의 듀플렉스 구조로부터 돌출하는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들을 지칭한다. “평활성” 또는 “평활성 말단”은 dsRNA의 말단에 짝을 이루지 않은 뉴클레오티드들이 없는 것, 즉, 뉴클레오티드 오버행이 없는 것을 의미한다. “평활성 말단인” dsRNA는 그 전체 길이에 대하여 이중-가닥인 dsRNA이며, 즉, 분자의 어느 말단에서도 뉴클레오티드 오버행이 없다.
“안티센스 가닥”이라는 용어는 표적 서열에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA의 가닥을 지칭한다. 본원에 사용된 “상보성의 영역”이라는 용어는 서열, 예를 들면, 본원에 정의된 바와 같이 표적 서열에 대하여 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥에 대한 영역을 지칭한다. 상보성의 영역이 표적 서열에 대하여 완전히 상보적이지 않은 경우에, 미스매치들은 터미널 영역들에서 가장 내성이 있으며, 만약 존재한다면, 일반적으로, 예컨대, 5' 및/또는 3' 터미널의 6, 5, 4, 3 또는 2 개의 뉴클레오티드들 내에서 터미널 영역 또는 영역들에 있다.
본원에 사용된 “센스 가닥”이라는 용어는 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA의 가닥을 지칭한다.
본원에 사용된 “핵산 지질 입자”라는 용어는 “SNALP”라는 용어를 포함하며, 이로부터 dsRNA가 전사되는 dsRNA 또는 플라스미드와 같은 핵산을 포함하는 환원된 수용성 인테리어(reduced aqueous interior)를 코팅하는 지질 소낭을 지칭한다. 핵산 지질 입자, 예컨대, SNALP는 예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 제20060240093호 및 제20070135372호 및 2008년 4월 15일에 제출된 USSN 61/045,228호에 기술되어 있다. 이러한 출원은 본원에 참조로서 포함되어 있다.
dsRNA를 언급하는 경우, “세포로의 도입”은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 세포로의 섭취 또는 흡수를 촉진하는 것을 의미한다. dsRNA의 흡수 또는 섭취는 도움받지 않은 확산성 또는 활성 세포 공정(unaided diffusive or active cellular processes)을 통해 또는 보조 작용제 또는 장치에 의하여 발생할 수 있다. 이 용어의 의미는 시험관 내 세포들에 한정되지 않으며; dsRNA는 “세포로 도입”될 수도 있으며, 상기 세포는 살아있는 유기체의 일부이다. 그러한 경우에, 상기 세포로의 도입은 상기 유기체로의 전달을 포함할 것이다. 예를 들면, 생체 내 전달을 위해, dsRNA는 조직 부위로 주입되거나 전신으로 투여될 수 있다. 세포로의 시험관 내 도입은 전기 천공법 및 리포펙션과 같이 업계에 알려진 방법들을 포함한다. 다른 접근법들은 본원에 기술되어 있거나 업계에 알려져 있다.
“침묵”, “~의 발현을 억제하다”, “~의 발현을 하향조절하다”, “~의 발현을 억제하다” 등의 용어들은 APOC3 유전자를 지칭하는 한, 본원에서 APOC3 유전자가 전사되며, APOC3 유전자의 발현이 억제되도록 처리된 제1 세포 또는 세포들의 군으로부터 분리될 수 있는 mRNA의 양이 제1 세포 또는 세포들의 군과 실질적으로 동일하지만 그렇게 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포들의 군(대조군 세포들)에 비해 감소하는 것에 의해 분명해지는 바와 같이, APOC3 유전자의 발현을 적어도 부분적으로 억제하는 것을 지칭한다. 억제도는 통상적으로 하기의 식으로 표현된다
대안적으로, 억제도는 APOC3 유전자 발현에 기능적으로 연결된 매개변수의 감소, 예컨대, 세포에 의해 분비된 APOC3 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 양 또는 특정 표현형, 예컨대, 세포자살을 나타내는 세포들의 숫자로 환산하여 주어질 수 있다. 원칙적으로, APOC3 유전자 침묵화는 상기 표적을 발현하는 임의의 세포 내에서 구성적으로 또는 유전 공학에 의하여 그리고 임의의 적절한 분석에 의하여 결정될 수 있다. 그러나, 주어진 dsRNA가 APOC3 유전자의 발현을 특정 정도만큼 억제함으로써 당해 발명에 포함되는지 여부를 결정하기 위해 참조가 필요한 경우, 하기 실시예에 제공된 분석은 그러한 참조 역할을 한다.
예를 들면, 특정한 경우에 있어서, APOC3 유전자의 발현은 본 발명에서 특징되는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의하여 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 정도 억제된다. 일부 실시형태들에 있어서, APOC3 유전자는 본 발명에서 특징되는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의하여 적어도 약 60%, 70% 또는 80% 정도 억제된다. 일부 실시형태들에 있어서, APOC3 유전자는 본 발명에서 특징되는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 투여에 의하여 적어도 약 85%, 90% 또는 95% 정도 억제된다.
APOC3 발현의 맥락에서 본원에서 사용된 “치료하다”, “치료” 등의 용어들은 APOC3 발현에 의해 매개되는 병적 과정으로부터 경감 또는 병적 과정의 완화를 지칭한다. 본 발명이 (APOC3 발현에 의해 매개되는 병적 과정이 아닌) 하기에서 본원에 열거된 기타 조건들 중 임의의 조건에 관한 한, 본 발명의 맥락에서, “처리하다”, “처리” 등의 용어들은 그러한 조건과 연관된 적어도 하나의 증상을 경감시키거나 완화시키고 또는 그러한 조건의 진행을 지연시키거나 반전시키는 것을 의미한다.
본원에 사용된 “유효량”이라는 어구는 APOC3 발현에 의해 매개된 병적 과정 또는 APOC3 발현에 의해 매개된 병적 과정의 명백한 증상의 치료, 예방 또는 관리에 있어서 치료적 이득을 제공하는 양을 지칭한다. 유효한 특정량은 통상적인 의료인에 의하여 용이하게 결정될 수 있으며, 예를 들면, APOC3 발현에 의하여 매개되는 병적 과정의 유형, 환자의 병력 및 연령, APOC3 발현에 의하여 매개되는 병적 과정의 단계 및 APOC3 발현제(expression agents)에 의하여 매개되는 기타 항-병적 과정의 투여와 같이, 업계에 알려진 요소에 따라 달라질 수 있다.
본원에 사용된 “약학적 조성물”은 dsRNA의 약리학적 유효량 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본원에 사용된 “약리학적 유효량”, “치료학적 유효량” 또는 단순히 “유효량”은 의도된 약리학적, 치료학적 또는 예방적 결과를 가져오는데 효과적인 RNA의 양을 지칭한다. 예를 들면, 질병 또는 질환과 연관된 측정가능한 매개변수에 있어서 적어도 25%의 감소가 있는 경우 주어진 임상적 치료가 유효하다고 간주되면, 그 질병 또는 질환의 치료를 위한 약물의 치료학적 유효량은 그 매개변수에 있어서 적어도 25% 감소를 일으키는데 필요한 양이다. 예를 들면, APOC3을 표적하는 dsRNA의 치료학적 유효량은 APOC3 혈청 수준을 적어도 25% 감소시킬 수 있다.
“약학적으로 허용 가능한 담체”라는 용어는 치료제의 투여용 담체를 지칭한다. 그러한 담체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로오스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 상기 용어는 구체적으로 세포 배양 배지를 제외한다. 경구적으로 투여된 약물에 대하여, 약학적으로 허용 가능한 담체는 불활성 희석제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 착색제 및 보존제 등의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 적당한 불활성 희석제는 탄산 나트륨 및 칼슘, 인산 나트륨 및 칼슘 및 락토오스를 포함하는 반면, 옥수수 전분 및 알긴산은 적당한 붕해제이다. 결합제는 전분 및 젤라틴을 포함하는 반면에, 윤활제는 존재한다면, 일반적으로 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 또는 활석일 것이다. 원한다면, 정제를 모노스테아르산 글리세릴 또는 디스테아르산 글리세릴과 같은 물질로 코팅하여 위장관에서의 흡수를 지연시킬 수 있다.
본원에 사용된 “형질변환 세포”는 dsRNA 분자가 발현될 수 있는 벡터가 도입된 세포이다.
이중-가닥 리보핵산(dsRNA)
본원에서 더 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명은 세포 또는 포유류 내에서 APOC3 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 분자로서, dsRNA는 APOC3 유전자의 발현에서 형성된 mRNA의 적어도 일부에 상보적인 상보성의 영역을 갖는 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 상보성의 영역은 길이가 30 뉴클레오티드 미만이고, 일반적으로 길이가 19 내지 24 뉴클레오티드이며, 상기 dsRNA는 상기 APOC3 유전자를 발현하는 세포와 접촉시에 상기 APOC3 유전자의 발현을 예를 들면, PCR 또는 분지 DNA(bDNA)-계 방법에 의하거나 웨스턴 블랏(Western blot)과 같은 단백질-계 방법에 의하여 분석된 바와 같이 적어도 30% 정도 상기 APOC3 유전자의 발현을 억제하는 이중-가닥 리보핵산 분자를 제공한다. APOC3 유전자의 발현은 하기 실시예에서 기술된 바와 같이 분석에 의하여 측정되는 경우 적어도 30% 감소될 수 있다. 예를 들면, Hep3B 세포에서와 같이 세포 배양에서 APOC3 유전자의 발현은 bDNA 또는 TaqMan 분석법 등에 의해 APOC3 mRNA 수준을 측정하거나 ELISA 분석법 등에 의한 것과 같이 단백질 수준을 측정함으로써 분석될 수 있다. 본 발명의 dsRNA는 하나 이상의 단일-가닥 뉴클레오티드 오버행들을 더 포함할 수 있다.
dsRNA는 예를 들면, Biosearch, Applied Biosystems 사로부터 상업적으로 이용가능한 것과 같이, 예컨대, 자동화된 DNA 합성기를 이용함으로써 하기에 더 토의된 바와 같이 업계에 알려진 표준 방법에 의하여 합성될 수 있다. dsRNA는 혼성화되어 듀플렉스 구조를 형성하는데 충분히 상보적인 2 개 RNA 가닥들을 포함한다. dsRNA의 한 가닥(안티센스 가닥)은 APOC3 유전자의 발현이 있는 동안에 형성된 mRNA의 서열로부터 유래된 표적 서열에 실질적으로 상보적이며 일반적으로 완전 상보적인 상보성의 영역을 포함하고, 나머지 가닥(센스 가닥)은 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함하여, 상기 두 가닥들이 혼성화되고 적당한 조건 하에서 조합되는 경우 듀플렉스 구조를 형성한다. 일반적으로, 듀플렉스 구조는 길이가 15에서 30 사이의 염기쌍 또는 25에서 30 사이의 염기쌍 또는 18에서 25 사이의 염기쌍 또는 19에서 24 사이의 염기쌍 또는 19에서 21 사이의 염기쌍 또는 19, 20 또는 21 염기쌍이다. 일 실시형태에 있어서, 듀플렉스는 길이가 19 염기쌍이다. 다른 실시형태에 있어서, 듀플렉스는 길이가 21 염기쌍이다. 2 개의 상이한 siRNA들이 병용되는 경우, 듀플렉스 길이는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 dsRNA의 각각의 가닥은 일반적으로 길이가 15에서 30 뉴클레오티드 사이, 또는 18에서 25 뉴클레오티드 사이 또는 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오티드 사이이다. 기타 실시형태들에 있어서, 각각의 가닥은 길이가 25 내지 30 뉴클레오티드이다. 듀플렉스의 각각의 가닥은 동일한 길이이거나 상이한 길이일 수 있다. 2 개의 상이한 siRNA들이 병용되는 경우, 각각의 siRNA의 각 가닥의 길이는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 dsRNA는 21 내지 23 뉴클레오티드를 초과하는 dsRNA, 예컨대, RNase III 효소 다이서에 의해 21 내지 23 염기쌍 siRNA로 처리되어 이후 RISC로 포함되기에 충분히 긴 dsRNA를 포함한다. 따라서, 본 발명의 dsRNA는 길이가 적어도 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 염기쌍, 또는 적어도 100 염기쌍일 수 있다.
본 발명의 dsRNA는 하나 이상의 뉴클레오티드들의 하나 이상의 단일-가닥 오버행(들)을 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, dsRNA의 적어도 하나의 말단은 1 내지 4, 일반적으로 1 또는 2 뉴클레오티드의 단일-가닥 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, dsRNA의 안티센스 가닥은 센스 가닥 상의 3' 말단 및 5' 말단에서 각각 1 내지 10 뉴클레오티드의 오버행들을 갖는다. 또 다른 실시형태에 있어서, dsRNA의 센스 가닥은 안티센스 가닥 상의 3' 말단 및 5' 말단에서 각각 1 내지 10 뉴클레오티드의 오버행들을 갖는다.
적어도 하나의 뉴클레오티드 오버행을 갖는 dsRNA는 평활성-말단의 상대역보다 예상외로 우수한 억제성을 가질 수 있다. 일부 실시형태들에 있어서, 유일한 뉴클레오티드 오버행이 존재하면 전체 안정성에 영향을 주지 않으면서 dsRNA의 간섭 활성이 강화된다. 유일한 오버행을 갖는 dsRNA는 다양한 세포, 세포 배양 배지, 혈액 및 혈청뿐만 아니라 생체 내에서 특히 안정적이며 효과적인 것으로 증명되었다. 일반적으로, 단일-가닥 오버행은 안티센스 가닥의 3'-터미널 말단에 또는, 대안적으로는 센스 가닥의 3'-터미널 말단에 위치한다. dsRNA는 안티센스의 5'-말단에 일반적으로 위치한 평활성 말단을 가질 수도 있다. 그러한 dsRNA는 개선된 안정성 및 억제 활성을 가져서, 낮은 투여량, 즉, 일당 수여자의 체중 1 kg당 5 mg 미만으로 투여할 수 있다. 일반적으로, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단에서 뉴클레오티드 오버행을 가지며, 5'-말단은 평활성이다. 다른 실시형태에 있어서, 오버행에 있어서 뉴클레오티드 중 하나 이상은 뉴클레오시드 티오인산염으로 대체된다.
일 실시형태에 있어서, APOC3 유전자는 인간 APOC3 유전자이다. 특정 실시형태들에 있어서, dsRNA의 센스 가닥은 표 1, 2, 6, 7, 11 또는 12의 센스 서열들 중 하나이고, 안티센스 가닥은 표 1, 2, 6, 7, 11 또는 12의 안티센스 서열들 중 하나이다. 표 1, 2, 6, 7, 11 또는 12에 제공된 표적 서열의 어딘가를 표적하는 대안적인 안티센스 작용제는 표적 서열 및 플랭킹 APOC3 서열을 이용하여 용이하게 결정될 수 있다.
당업자는 20에서 23 사이이지만, 구체적으로는 21 개의 염기쌍의 듀플렉스 구조를 갖는 dsRNA는 RNA 간섭을 유도하는데 특히 효과적인 것으로 인정되는 것을 잘 알고 있다(Elbashir 등, EMBO 2001, 20:6877-6888). 그러나, 다른 자들은 더 짧거나 더 긴 dsRNA도 효과적일 수 있다는 것을 알게 되었다. 상술한 실시형태들에 있어서, 표 1, 2, 6, 7, 11 또는 12에 제공된 올리고뉴클레오티드 서열들의 성질로 인해 본 발명에 특징된 dsRNA는 본원에 기술된 길이의 적어도 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 표 1, 2, 6, 7, 11 또는 12의 서열들 중 하나에서 하나 또는 양 말단 상의 일부 뉴클레오티드들만 뺀 길이가 더 짧은 dsRNA는 상술한 dsRNA와 비교하여 유사하게 효과적일 수 있다고 합리적으로 예상할 수 있다. 따라서, 표 1, 2, 6, 7, 11 또는 12의 서열들 중 하나로부터 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 연속 뉴클레오티드들의 부분 서열을 가지며, 본원의 하기에 기술된 바와 같이 분석법에서 APOC3 유전자의 발현을 억제하는 능력에 있어서 전체 서열을 포함하는 dsRNA와는 5, 10, 15, 20, 25 또는 30% 이하의 억제로 상이한 dsRNA가 본 발명에서 고려된다. 또한, 소기의 APOC3 표적 서열 내에서 절단되는 dsRNA들은 해당하는 APOC3 안티센스 서열 및 상보적인 센스 서열을 이용하여 용이하게 제작될 수 있다.
또한, 표 1, 2, 6, 7, 11 또는 12에서 제공된 dsRNA는 RNAi 계 절단에 감수성인 APOC3에서의 일 부위를 동정한다. 이와 같이, 본 발명은 또한 본 발명의 작용제들 중 하나에 의하여 표적되는 서열 내에서 표적하는 dsRNA를 특징으로 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 제2 dsRNA는 상기 제2 dsRNA가 제1 dsRNA의 안티센스 가닥에 상보적인 mRNA 내의 어딘가에서 메시지를 절단하면 제1 dsRNA의 서열을 표적한다라고 전해진다. 그러한 제2 dsRNA는 APOC3 유전자에서 선택된 서열에 연속적인 영역으로부터 취한 추가적인 뉴클레오티드 서열들에 결합된, 표 1, 2, 6, 7, 11 또는 12에 제공된 서열들 중 하나로부터 적어도 15 개의 연속적인 뉴클레오티드들로 일반적으로 이루어질 것이다.
RNA 표적의 절단은 겔 전기영동 및 필요하면, 업계에 알려진 연관된 핵산 혼성화 기법에 의하여 통상적으로 검출될 수 있다. dsRNA의 표적 mRNA상의 절단 부위는 당업자에게 일반적으로 알려진 방법, 예컨대, (모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함되어 있는) Soutschek 등, Nature; 2004, Vol. 432, pp. 173-178에 기술된 5 -RACE 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명에서 특징되는 dsRNA는 표적 서열에 하나 이상의 미스매치를 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명에서 특징되는 dsRNA는 불과 3 개의 미스매치들만 포함한다. dsRNA의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 미스매치를 포함하면, 미스매치의 구역이 상보성의 영역의 중앙에 위치되어 있지 않는 것이 바람직하다. dsRNA의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 미스매치를 포함하면, 상기 미스매치는 어느 한 말단으로부터 5 개의 뉴클레오티드들, 예를 들면, 상보성 영역의 5' 또는 3' 말단으로부터 5, 4, 3, 2 또는 1 개 뉴클레오티드로 한정되는 것이 바람직하다. 예를 들면, APOC3 유전자의 영역에 상보적인 23 뉴클레오티드 dsRNA 가닥에 대하여, dsRNA는 일반적으로 중앙의 13 개 뉴클레오티드들 내에서 어떠한 미스매치를 포함하지 않는다. 본 발명 내에서 기술된 방법을 이용하여 표적 서열에 대해 미스매치를 포함하는 dsRNA가 APOC3 유전자의 발현을 억제하는데 효과적인지 여부를 결정할 수 있다. 특히, APOC3 유전자에서 특정한 상보성의 영역이 군집 내에서 다형성 서열 변이(polymorphic sequence variation)를 갖는 것으로 알려져 있으면, APOC3 유전자의 발현을 억제하는데 있어서 미스매치들과 dsRNA들의 효능의 고려는 중요하다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 RNAi이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 mRNA 내에서 서열에 상보적인 단일-가닥 올리고뉴클레오티드이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA에 염기 짝지음 및 번역 과정을 물리적으로 가로막음으로써 화학양론 방식으로 번역을 억제할 수 있다, Dias, N. 등, (2002) Mol. Cancer Ther. 1:347-355 참조. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA 표적에 결합하고 RNase-H를 통하여 mRNA 표적 파괴를 촉진함으로써 표적 단백질 발현을 억제할 수도 있다. 단일-가닥 안티센스 RNA 분자는 길이가 약 13 내지 약 30 뉴클레오티드일 수 있고, 표적 서열에 상보적인 서열을 가질 수 있다. 예를 들면, 단일-가닥 안티센스 RNA 분자는 표 1, 2, 6, 7 또는 10에서 안티센스 서열들 중 하나로부터 적어도 약 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 연속 뉴클레오티드들인 서열을 포함할 수 있다.
변형
또 다른 실시형태에 있어서, dsRNA는 화학적으로 변형되어 안정성을 향상시킨다. 본 발명에서 특징되는 핵산은 본원에 참조로 포함되어 있는 “Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage, S.L. 등(Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA에 기술된 방법과 같이 업계에 잘 확립된 방법에 의하여 합성되고/되거나 변형될 수 있다. 본 발명에서 유용한 dsRNA 화합물의 구체적인 예로는 변형된 골격을 포함하거나 천연 인터뉴클레오시드 연결(internuleoside linkages)을 포함하지 않는 dsRNA를 포함한다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, 변형된 골격을 갖는 dsRNA는 상기 골격 내에 인 원자를 보유하는 것들과 상기 골격 내에 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 본 명세서를 위해, 그리고 때로는 업계에 참조된 바와 같이, 그 인터뉴클레오시드 골격 내에 인 원자를 갖지 않는 변형 dsRNA도 올리고뉴클레오시드로 간주될 수 있다.
변형 dsRNA 골격은 예를 들면, 포스포로티오에이트, 카이랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 카이랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포아미데이트 및 아미노알킬포스포아미데이트를 포함하는 포스포아미데이트, 티오노포스포아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 보통의 3'-5' 연결, 이들의 2'-5' 연결된 유사체 및 반전된 극성을 갖는 보라노포스페이트를 포함하며, 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍들은 연결된 3'-5' 내지 5'-3' 또는 2'-5' 내지 5'-2'이다. 다양한 염, 혼합된 염 및 유리 산 형태도 포함된다.
상기 인-함유 연결의 제제를 교시하는 대표적인 미국 특허들은 그 각각이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 및 5,625,050 호를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
그 안에 인 원자를 포함하지 않는 변형 dsRNA 골격은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 인터뉴클레오시드 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 인터뉴클레오시드 연결 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 인터뉴클레오시드 연결에 의하여 형성된 골격을 갖는다. 이들은 (부분적으로는 뉴클레오시드의 당 부분으로부터 형성된) 모르폴리노 연결; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 기타사항을 갖는 것들을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제제를 교시하는 대표적인 미국 특허들은 그 각각이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 및 5,677,439 호를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
기타 적당한 dsRNA 의태물(mimetics)에 있어서, 뉴클레오티드 단위의 당 및 인터뉴클레오시드 연결, 즉, 골격은 모두 신규한 그룹으로 대체된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과 혼성화되기 위해 유지된다. 하나의 그러한 올리고머 화합물, 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 밝혀진 dsRNA 의태물은 펩티드 핵산(PNA)로 지칭된다. PNA 화합물에 있어서, dsRNA의 당 골격은 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격을 포함하는 아미드로 대체된다. 뉴클레오염기는 지탱되며 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접으로 결합된다. PNA 화합물의 제제를 교시하는 대표적인 미국 특허들은 그 각각이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262 호를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. PNA 화합물의 다른 교시는 Nielsen 등, Science, 1991, 254, 1497-1500에서 찾을 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태들은 포스포로티오에이트 골격을 갖는 dsRNA 및 헤테로원자 골격, 및 특히, 상기 참조된 미국 특허 번호 5,489,677 호의 --CH2--NH--CH2--, [메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 알려진] --CH2--N(CH3)--O--CH2--, --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2--CH2-- [여기서, 자연상태 포스포디에스테르 골격(native phosphodiester backbone)은 --O--P--O--CH2--로 표시됨] 및 상기 참조된 미국 특허 번호 5,602,240 호의 아미드 골격을 갖는 올리고뉴클레오시드이다. 또한, 상기 참조된 미국 특허 번호 5,034,506 호의 모르폴리노 골격 구조를 갖는 dsRNA가 바람직하다.
변형 dsRNA는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티들을 포함할 수 있다. 바람직한 dsRNA는 2' 위치에서 하기 사항들 중 하나를 포함한다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬로서, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 비치환 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2로서, n 및 m은 1 내지 약 10인 것이 특히 바람직하다. 다른 바람직한 dsRNA는 2' 위치에서 하기사항들 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 시릴, RNA 절단기(cleaving group), 지시기, 인터컬레이터, dsRNA의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기 또는 dsRNA의 약력학적 특성을 개선하기 위한 기 및 유사한 특성을 갖는 기타 치환체. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 알려진 2'-O--CH2CH2OCH3)(Martin 등, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) 즉, 알콕시-알콕시기를 포함한다. 다른 바람직한 변형은 본원에서 하기 실시예에 기술된 바와 같이, 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 2'-DMAOE로도 알려진 O(CH2)2ON(CH3)2 기, 및 본원에서 하기 실시예에 기술된 바와 같이, (업계에서 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로도 알려진) 2'-디메틸아미노에톡시에톡시, 즉, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2를 포함한다.
다른 바람직한 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. dsRNA 상의 기타 위치들, 특히, 3' 터미널 뉴클레오티드 상 또는 2'-5' 연결된 dsRNA에서 당의 3' 위치 및 5' 터미널 뉴클레오티드의 5' 위치에서 유사한 변형도 이루어질 수 있다. dsRNA는 펜토퓨라노실 당을 대신하여 시클로부틸 모이어티들과 같은 당 의태물을 가질 수도 있다. 그러한 변형 당 구조의 제제를 교시하는 대표적인 미국 특허들은 그중 특정한 것이 당해 출원과 공유되며 그 각각이 본원에 전체가 참조로 포함된 미국 특허 번호 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 및 5,700,920 호를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
dsRNA는 (업계에서 단순히 "염기"로 자주 지칭되는) 뉴클레오염기 변형 또는 치환을 포함할 수도 있다. 본원에 사용된 “비변형” 또는 “천연” 뉴클레오염기는 퓨린계인 아데닌(A) 및 구아닌(G) 및 피리미딘계인 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)를 포함한다. 변형 뉴클레오염기는 5-메틸시토신(5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히, 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-디아자구아닌 및 7-디아자아데닌, 및 3-디아자구아닌 및 3-디아자아데닌과 같은 기타 합성 및 천연 뉴클레오염기를 포함한다. 다른 뉴클레오염기는 미국 특허 번호 3,687,808 호에 개시된 것들, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990에 개시된 것들, Englisch 등, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613에 개시된 것들 및 Sanghvi, Y S., Chapter 15, DsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. 및 Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993에 개시된 것들을 포함한다. 이러한 뉴클레오염기들 중 특정한 것들은 본 발명에서 특징된 올리고머 화합물의 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 이러한 것들은 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환으로 인해 핵산 듀플렉스 안정성이 0.6°C 내지 1.2°C 정도 증가하는 것으로 밝혀져 있으며(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. 및 Lebleu, B., Eds., DsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 5-메틸시토신 치환은 더욱 더 특히, 2'-O-메톡시에틸 당 변환과 조합되는 경우 예시적인 염기 치환이다.
기타 변형 뉴클레오염기뿐만 아니라 상기 언급된 변형 뉴클레오염기의 일부의 제제를 교시하는 대표적인 미국 특허는 그 각각이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 및 5,681,941 호 뿐만 아니라 상기 언급된 미국 특허 번호 3,687,808 호 및 또한 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,750,692 호도 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
콘쥬게이트
본 발명의 dsRNA의 다른 변형은 dsRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 섭취를 향상시키는 dsRNA 하나 이상의 모이어티들 또는 콘쥬게이트들에 화학적으로 연결하는 것을 포함한다. 그러한 모이어티는 콜레스테롤 모이어티(Letsinger 등, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), 콜산(Manoharan 등, Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), 티오에테르, 예컨대, 베릴-S-트리틸티올(Manoharan 등, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan 등, Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), 티오콜레스테롤(Oberhauser 등, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), 지방족 사슬, 예컨대, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras 등, EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov 등, FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk 등, Biochimie, 1993, 75:49-54), 인지질, 예컨대, 디-헥사데실-락(rac)-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-락-글리세로-3-H포스포네이트(Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea 등, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan 등, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), 팔미틸 모이어티(Mishra 등, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke 등, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)와 같은 지질 모이어티들을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다.
주어진 화합물 내의 모든 위치들이 균일하게 변형되는 것은 필요하지 않으며, 사실상 상기 언급된 변형들 중 하나를 초과하는 것이 단일 화합물 내 또는 심지어 dsRNA 내의 단일 뉴클레오시드에 포함될 수 있다. 본 발명은 키메릭 화합물인 dsRNA 화합물도 포함한다. 본 발명의 맥락에 있어서 “키메릭” dsRNA 화합물 또는 “키메라”는 각각이 적어도 하나의 모노머 단위, 즉, dsRNA 화합물의 경우 뉴클레오티드로 이루어진 둘 이상의 화학적으로 별개인 영역들을 포함하는 dsRNA 화합물, 특히, dsRNA이다. 이러한 dsRNA는 통상적으로 적어도 하나의 영역을 포함하며, dsRNA는 변형되어 dsRNA 상에 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 섭취 및/또는 표적 핵산에 대해 증가된 결합 친화도를 부여한다. dsRNA의 추가적인 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 혼성물을 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로 작용할 수 있다. 예를 들면, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포 엔도뉴클레아제(cellular endonuclease)이다. 그러므로, RNase H의 활성화로 인해 RNA 표적의 절단이 일어나서, 유전자 발현의 dsRNA 억제의 효율을 현저히 향상시킨다. 결과적으로, 동일한 표적 영역에 혼성화되는 포스포로티오에이트 데옥시 dsRNA와 비교하여, 키메릭 dsRNA가 이용되는 경우 더 짧은 dsRNA으로 필적할만한 결과를 종종 얻을 수 있다.
특정한 경우에 있어서, dsRNA는 비-리간드 기에 의해 변형될 수 있다. dsRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 섭취를 향상시키기 위해 수많은 비-리간드 분자들이 dsRNA에 콘쥬게이트 되었으며, 그러한 콘쥬게이션을 수행하기 위한 절차는 과학 문헌에서 이용가능하다. 그러한 비-리간드 모이어티들은 콜레스테롤(Letsinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), 콜산(Manoharan 등, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), 티오에테르, 예컨대, 헥실-S-트리틸티올(Manoharan 등, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan 등, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), 티오콜레스테롤(Oberhauser 등, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), 지방족 사슬, 예컨대, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras 등, EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov 등, FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk 등, Biochimie, 1993, 75:49), 인지질, 예컨대, 디-헥사데실-락-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-락-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea 등, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan 등, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan 등, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), 팔미틸 모이어티(Mishra 등, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke 등, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)과 같은 지질 모이어티들을 포함한다. 그러한 dsRNA 콘쥬게이트의 제제를 교시하는 대표적인 미국 특허는 상기에 열거되어 있다. 통상적인 콘쥬게이션 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치들에서 아미노링커를 보유하는 dsRNA의 합성을 포함한다. 이후 아미노기는 적절한 커플링제 또는 활성화제를 이용하여 콘쥬게이트되는 분자와 반응된다. 콘쥬게이션 반응은 용액 상 내에서 dsRNA의 고체 지지체에 여전히 결합된 dsRNA 또는 용액 상에서 dsRNA의 후속의 절단으로 수행될 수 있다. HPLC에 의해 dsRNA 콘쥬게이트의 정제는 통상적으로 순수한 콘쥬게이트를 감당할 수 있다.
dsRNA에 리간드를 콘쥬게이트시키면 특정한 조직에의 표적뿐만 아니라 세포 흡수 또는 간 세포와 같은 특이적인 유형의 세포들에 의한 섭취를 향상시킬 수 있다. 특정 예에 있어서, 소수성 리간드는 dsRNA에 콘쥬게이트되어 세포막의 직접 침투 및/또는 간 세포를 통과하는 섭취를 촉진시킨다. 대안적으로, dsRNA에 콘쥬게이트된 리간드는 수용체-매개 엔도시토시스에 대한 기질이다. 이러한 접근법을 이용하여 dsRNA 작용제뿐만 아니라 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포 침투를 촉진시킨다. 예를 들면, 콜레스테롤은 다양한 안티센스 올리고뉴클레오티드들에 콘쥬게이트되어, 이들의 비-콘쥬게이트된 유사체와 비교하여 실질적으로 더 활성인 화합물을 생성한다. M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103 참조. 올리고뉴클레오티드에 콘쥬게이트된 기타 친지방성 화합물은 1-피렌 부티르산, 1,3-비스-O-(헥사데실)글리세롤 및 멘톨을 포함한다. 수용체-매개 엔도시토시스에 대한 리간드의 일예는 엽산이다. 엽산은 엽산-수용체-매개 엔도시토시스에 의해 세포에 진입한다. 엽산을 보유하는 dsRNA 화합물은 엽산-수용체-매개 엔도시토시스를 통해 세포로 효율적으로 수송될 것이다. Li와 그의 동료들은 올리고뉴클레오티드의 3'-터미널에 엽산을 부착시키면 올리고뉴클레오티드의 세포 섭취가 8-배 증가한다고 보고한다. Li, S.; Deshmukh, H. M.; Huang, L. Pharm. Res. 1998, 15, 1540. 올리고뉴클레오티드에 콘쥬게이트된 기타 리간드는 폴리에틸렌 글리콜, 탄수화물 클러스터, 가교제, 포르피린 콘쥬게이트, 콜레스테롤 및 콜레스테릴아민과 같은 전달 펩티드 및 지질을 포함한다. 탄수화물 클러스터의 예로는 Chol-p-(GalNAc)3(N-아세틸 갈락토사민 콜레스테롤) 및 LCO(GalNAc)3(N-아세틸 갈락토사민 - 3' -리토콜릭-올레오일)을 포함한다.
탄수화물 콘쥬게이트
본 발명의 조성물 및 방법의 일부 실시형태들에 있어서, dsRNA 올리고뉴클레오티드는 탄수화물을 더 포함한다. 탄수화물 콘쥬게이트된 dsRNA는 본원에 기술된 바와 같이 생체내 치료용에 적합한 조성물뿐만 아니라 핵산의 생체 내 전달에 유리하다. 본원에 사용된 "탄수화물"은 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 (선형, 분지쇄 또는 환상일 수 있는) 적어도 6 개의 탄소 원자들을 갖는 하나 이상의 단당류 단위들로 이루어진 탄수화물 그 자체, 또는 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 (선형, 분지쇄 또는 환상일 수 있는) 적어도 6 개의 탄소 원자들을 각각 갖는 하나 이상의 단당류 단위들로 이루어진 탄수화물 모이어티를 그 일부로서 갖는 화합물중 하나인 화합물을 지칭한다. 대표적인 탄수화물은 당(약 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 개의 단당류 단위를 포함하는 단당류, 이당류, 삼당류 및 올리고당류) 및, 전분, 글리코겐, 셀룰로오스 및 다당류 검과 같은 다당류를 포함한다. 구체적인 단당류는 C5 및 이상(예컨대, C5, C6, C7 또는 C8) 당을 포함하며; 이당류 및 삼당류는 2 또는 3 단당류 단위들을 갖는 당(예컨대, C5, C6, C7 또는 C8)을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물 및 방법에 이용하기 위한 탄수화물 콘쥬게이트는 단당류이다. 일 실시형태에 있어서, 단당류는 하기와 같은 N-아세틸갈락토사민이다.
화학식 I
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물 및 방법에 이용하기 위한 탄수화물 콘쥬게이트는 하기 사항들로 이루어진 군으로부터 선택된다:
화학식 II
화학식 III
화학식 IV
화학식 V
화학식 VI
화학식 VII
화학식 VIII
*
화학식 IX
화학식 X
화학식 XI
화학식 XII
화학식 XIII
화학식 XIV
화학식 XV
화학식 XVI
화학식 XVII
화학식 XVIII
화학식 XIX
*
,
화학식 XX
화학식 XXI
화학식 XXII
본원에 기술된 실시형태들에 이용되기 위한 다른 대표적인 탄수화물 콘쥬게이트는 하기 사항들을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다,
(화학식 XXIII)
X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오티드인 경우, 나머지 하나는 수소이다.
일부 실시형태들에 있어서, 탄수화물 콘쥬게이트는 PK 모듈레이터 및/또는 세포 침투 펩티드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 상술한 바와 같은 하나 이상의 추가적인 리간드들을 더 포함한다.
링커
일부 실시형태들에 있어서, 본원에 기술된 콘쥬게이트 또는 리간드는 절단될 수 있거나 절단될 수 없는 다양한 링커로 본 발명의 dsRNA에 부착될 수 있다.
“링커” 또는 “연결기”라는 용어는 화합물의 두 부분들을 연결하는, 예컨대, 화합물의 두 부분들을 공유결합으로 부착하는 유기 모이어티를 의미한다. 링커는 통상적으로 NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH, 또는 예컨대 치환되거나 미치환된 알킬, 치환되거나 미치환된 알케닐, 치환되거나 미치환된 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로시클릴알킬, 헤테로시클릴알케닐, 헤테로시클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐아릴알케닐, 알케닐아릴알키닐, 알키닐아릴알킬, 알키닐아릴알케닐, 알키닐아릴알키닐, 알킬헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴알케닐, 알킬헤테로아릴알키닐, 알케닐헤테로아릴알킬, 알케닐헤테로아릴알케닐, 알케닐헤테로아릴알키닐, 알키닐헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로시클릴알킬, 알킬헤테로시클릴알케닐, 알킬헤테로시클릴알키닐, 알케닐헤테로시클릴알킬, 알케닐헤테로시클릴알케닐, 알케닐헤테로시클릴알키닐, 알키닐헤테로시클릴알킬, 알키닐헤테로시클릴알케닐, 알키닐헤테로시클릴알키닐, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알키닐헤테로아릴, 하나 이상의 메틸렌들은 O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), 치환되거나 미치환된 아릴, 치환되거나 미치환된 헤테로아릴, 치환되거나 미치환된 헤테로시클릭에 의하여 중단되거나 종결될 수 있으며; R8은 수소, 아실, 지방족 또는 치환된 지방족인, 그러나 여기에 한정되지 않는 원자들의 사슬과 같은 단위인 직접 결합 또는 산소 또는 황과 같은 원자를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 링커는 약 1 내지 24 원자들, 2 내지 24, 3 내지 24, 4 내지 24, 5 내지 24, 6 내지 24, 6 내지 18, 7 내지 18, 8 내지 18 원자들, 7 내지 17, 8 내지 17, 6 내지 16, 7 내지 17 또는 8 내지 16 원자들 사이이다.
절단 가능한 연결기는 세포 밖에서는 충분히 안정한 것이지만, 표적 세포로 들어오면 절단되어 링커가 함께 이어 놓고 있는 2 개 부분들을 방출하는 것이다. 바람직한 일 실시형태에 있어서, 절단 가능한 연결기는 피검자의 혈액 내 또는 (예컨대, 혈액 또는 혈청 내에서 발견되는 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있는) 제2 기준 조건 하보다 표적 세포 내 또는 (예컨대, 세포내 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있는) 제1 기준 조건 하에서 적어도 약 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배 이상 또는 적어도 약 100 배 더 빠르게 절단된다.
절단 가능한 연결기는 절단 작용제, 예컨대, pH, 산화환원 전위 또는 분해 분자의 존재에 민감하다. 일반적으로, 절단 작용제는 혈청 또는 혈액 내에서 보다 세포 내에서 더 우세하거나 더 높은 수준 또는 활성으로 발견된다. 그러한 분해 작용제의 예로는: 예컨대, 환원에 의하여 산화환원 절단 가능한 연결기를 분해시킬 수 있는, 세포내에 존재하는 메르캅탄과 같은 산화 또는 환원 효소 또는 환원제를 비롯하여, 특정 기질에 대하여 선택되거나 기질 특이성이 없는 산화환원 작용제; 에스테라아제; 산성 환경을 발생시킬 수 있는 엔도솜 또는 작용제, 예컨대, 5 이하의 pH를 일으키는 엔도솜 또는 작용제; 일반적인 산으로 작용함으로써 산 절단 가능한 연결기를 혼성화하거나 분해시킬 수 있는 효소, (기질 특이적일 수 있는) 펩티다아제 및 포스파타아제를 포함한다.
디설파이드 결합과 같은 절단 가능한 연결기는 pH에 민감할 수 있다. 인간 혈청의 pH는 7.4인 반면에, 평균 세포내 pH는 이보다 약간 더 낮은 약 7.1 내지 7.3에 이른다. 엔도솜은 5.5 내지 6.0의 범위에 이르는 더 산성인 pH를 가지며, 리소좀은 5.0 근처의 좀 더 산성인 pH를 갖는다. 일부 링커는 바람직한 pH에서 절단되는 절단 가능한 연결기를 가짐으로써, 세포 내부의 리간드로부터 또는 세포의 원하는 격실로 양이온성 지질을 방출하게 되다.
링커는 특정 효소에 의하여 절단될 수 있는 절단 가능한 연결기를 포함할 수 있다. 링커내로 포함되는 절단 가능한 연결기의 유형은 표적되는 세포에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 간-표적 리간드는 에스테르기를 포함하는 링커를 통해 양이온성 지질에 연결될 수 있다. 간 세포는 에스테라아제가 풍부하며, 따라서, 링커는 에스테라아제가 풍부하지 않은 세포 유형 내에서 보다 간 세포 내에서 더 효율적으로 절단될 것이다. 에스테라아제가 풍부한 기타 세포-유형은 폐, 신장 피질 및 고환의 세포를 포함한다.
펩티드 결합을 포함하는 링커는 간 세포 및 윤활막세포와 같이, 펩티다아제가 풍부한 세포 유형을 표적하는 경우에 이용될 수 있다.
일반적으로, 절단 가능한 연결기 후보의 적합성은 후보 연결기를 절단하는 분해 작용제(또는 조건)의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 또한, 절단 가능한 연결기 후보에 대하여 혈액 내에서 또는 기타 비표적 조직과 접촉하는 경우에 절단에 저항하는 능력을 시험하는 것도 바람직할 것이다. 따라서, 표적 세포 내에서 절단을 나타내도록 선택되는 제1 조건과 기타 조직 또는 생물학적 유체, 예컨대, 혈액 또는 혈청 내에서 절단을 나타내도록 선택되는 제2 조건 사이의 절단에 대한 상대적 민감도를 결정할 수 있다. 평가는 무세포 시스템, 세포 내, 세포 배양 내, 장기 또는 조직 배양 내, 또는 전체 동물 내에서 수행될 수 있다. 무세포 또는 배양 조건 내에서 초기 평가를 실시하고 전체 동물 내에서 다음 평가에 의하여 확인하는 것이 유용할 수 있다. 바람직한 실시형태들에 있어서, 유용한 후보 화합물은 혈액 또는 혈청 (또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)에서와 비교하여 세포 내 (또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 약 100 배 더 빨리 절단된다.
일 실시형태에 있어서, 절단 가능한 연결기는 환원 또는 산화시에 절단되는 산화환원 절단 가능한 연결기이다. 환원적으로 절단 가능한 연결기의 일 예는 디설파이드 연결기(-S-S-)이다. 절단 가능한 연결기 후보가 적당한 “환원적으로 절단 가능한 연결기”인지 여부 또는 예를 들면, 특정 dsRNA 모이어티 및 특정 표적 작용제와의 용도에 적당한지 여부를 결정하기 위하여, 본원에 기술된 방법을 살펴볼 수 있다. 예를 들면, 후보는 세포, 예컨대, 표적 세포 내에서 관찰될 수 있는 절단 속도를 모방하는, 업계에 알려진 시약을 이용한 기타 환원제, 또는 디티오트레이톨(DTT)을 사용한 배양에 의하여 평가될 수 있다. 후보는 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택된 조건 하에서 평가될 수도 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 후보 화합물은 혈액 내에서 최대 약 10% 정도가 절단된다. 다른 실시형태들에 있어서, 유용한 후보 화합물은 혈액 (또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)에서와 비교하여 세포 내 (또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 약 100 배 더 빨리 분해된다. 후보 화합물의 절단 속도는 세포내 매질을 모방하도록 선택된 조건 하에서 그리고 세포외 매질을 모방하도록 선택된 조건과 비교하여 표준 효소 역동학 분석법을 이용하여 결정될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 절단 가능한 링커는 포스페이트계 절단 가능한 연결기를 포함한다. 포스페이트계 절단 가능한 연결기는 포스페이트기를 분해시키거나 혼성화하는 작용제에 의하여 절단된다. 세포 내에서 포스페이트기를 절단하는 작용제의 일 예는 세포 내에서 포스파타아제와 같은 효소이다. 포스페이트계 연결기의 예는 -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, 및 -O-P(S)(Rk)-S-이다. 바람직한 실시형태들은 -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, 및 -O-P(S)(H)-S-이다. 바람직한 일 실시형태는 -O-P(O)(OH)-O-이다. 이러한 후보들은 상술한 방법과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 절단 가능한 링커는 산 절단 가능한 연결기를 포함한다. 산 절단 가능한 연결기는 산 조건 하에서 절단되는 연결기이다. 바람직한 실시형태들에 있어서, 산 절단 가능한 연결기는 약 6.5 이하(예컨대, 약 6.0, 5.75, 5.5, 5.25, 5.0 이하)의 pH를 갖는 산성 환경에서 또는 일반적인 산으로 작용할 수 있는 효소와 같은 작용제에 의하여 절단된다. 세포 내에서, 엔도솜 및 리소좀과 같은 특이적인 낮은 pH 세포 기관은 산 절단 가능한 연결기에 대하여 절단 환경을 제공할 수 있다. 산 절단 가능한 연결기의 예는 히드라존, 에스테르 및 아미노산의 에스테르를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 산 절단 가능한 기는 일반식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O)을 가질 수 있다. 바람직한 일 실시형태는 에스테르(알콕시기)의 산소에 부착된 탄소가 아릴기, 치환된 알킬기 또는 디메틸 펜틸 또는 t-부틸과 같은 삼차 알킬기인 경우이다. 이러한 후보들은 상술한 방법과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 절단 가능한 링커는 에스테르계 절단 가능한 연결기를 포함한다. 에스테르계 절단 가능한 연결기는 세포 내에서 에스테라아제 및 아미다아제와 같은 효소에 의하여 절단된다. 에스테르계 절단 가능한 연결기의 예로는 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌기의 에스테르를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 에스테르 절단 가능한 연결기는 일반식 -C(O)O-, 또는 -OC(O)-을 갖는다. 이러한 후보들은 상술한 방법과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 절단 가능한 링커는 펩티드계 절단 가능한 연결기를 포함한다. 펩티드계 절단 가능한 연결기는 세포 내에서 펩티다아제 및 프로테아제와 같은 효소에 의하여 절단된다. 펩티드계 절단 가능한 연결기는 아미노산들 사이에서 형성되어 올리고펩티드(예컨대, 디펩티드, 트리펩티드 등) 및 폴리펩티드를 수득하는 펩티드 결합이다. 펩티드계 절단 가능한 기는 아미드기(-C(O)NH-)를 포함하지 않는다. 아미드기는 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키닐렌 사이에서 형성될 수 있다. 펩티드 결합은 아미노산 사이에서 형성되어 펩티드 및 단백질을 수득하는 아미드 결합의 특별한 유형이다. 펩티드계 절단기는 일반적으로 아미노산들 사이에서 형성되어 펩티드 및 단백질을 수득하는 펩티드 결합(즉, 아미드 결합)에 한정되고 전체 아미드 기능기를 포함하지 않는다. 펩티드계 절단 가능한 연결기는 일반식 -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)- (SEQ ID NO: 13)을 가지며, 여기서 RA 및 RB는 2 개의 인접한 아미노산들의 R 기들이다. 이러한 후보들은 상술한 방법과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 dsRNA는 링커를 통해 탄수화물에 콘쥬게이트된다. 본 발명의 조성물 및 방법의 링커와의 dsRNA 탄수화물 콘쥬게이트의 비한정 예로는 하기 사항들을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다,
(화학식 XXIV)
(화학식 XXV)
(화학식 XXVI)
(화학식 XXVII)
(화학식 XXVIII)
(화학식 XXIX)
(화학식 XXX)
X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오티드인 경우, 나머지 하나는 수소이다.
본 발명의 조성물 및 방법의 특정 실시형태들에 있어서, 리간드는 2가 또는 3가 분지 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc (N-아세틸칼락토사민) 유도체이다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 dsRNA는 식 (XXXI) 내지 (XXXIV) 중 어느 하나에 보여진 구조들로 이루어진 군으로부터 선택된 2가 또는 3가 분지 링커에 콘쥬게이트되어 있다:
화학식 XXXI
화학식 XXXII
화학식 XXXIII
화학식 XXXIV
여기서: q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B 및 q5C는 독립적으로 각각의 경우에 0 내지 20을 나타내며, 반복 단위는 동일하거나 상이할 수 있다;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C는 각각 독립적으로 각각의 경우에 없음, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH 또는 CH2O이고;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C는 독립적으로 각각의 경우에 없음, 알킬렌, 치환된 알킬렌이며, 하나 이상의 메틸렌들은 O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R"), C≡C 또는 C(O) 중 하나 이상에 의하여 중단되거나 종결될 수 있다;
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C는 각각 독립적으로 각각의 경우에 없음, NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O, 
, 
, 
, 
,
또는 헤테로시클릴이고;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B 및 L5C는 리간드; 즉, 각각 독립적으로 각각의 경우에 (GalNAc와 같은) 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류 또는 폴리당류를 나타내며; 및 Ra는 H 또는 아미노산 측쇄이다. 3가 콘쥬게이팅 GalNAc 유도체는 식 (XXXV)의 것과 같이, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제와의 용도에 특히 유용하다:
식 XXXV
여기서, L5A, L5B 및 L5C는 GalNAc 유도체와 같은 단당류를 나타낸다.
GalNAc 유도체를 콘쥬게이트하는 적당한 2가 및 3가 분지쇄 링커기의 예는 상기에서 식 II_VII, XI, X, 및 XIII으로 인용된 구조들을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
*RNA 콘쥬게이트의 제제를 교시하는 대표적인 미국 특허는 그 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되어 있는 미국 특허 번호 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 및 5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 7,037,646; 8,106,022 호를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
벡터 인코딩된 dsRNA
다른 양태에 있어서, APOC3 dsRNA 분자는 DNA 또는 RNA 벡터로 삽입된 전사 단위로부터 발현된다(예컨대, Couture, A, 등, TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., 등, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/22113 호, Conrad, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/22114 호, 및 Conrad, 미국 특허 번호 6,054,299 호 참조). 이러한 이식 유전자는 호스트 게놈으로 통합된 이식 유전자로서 포함되고 유전될 수 있는 선형 컨스트럭트(construct), 원형 플라스미드 또는 바이러스성 벡터로 도입될 수 있다. 이식 유전자는 염색체외 플라스미드로서 유전될 수 있도록 구성될 수도 있다(Gassmann 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
dsRNA의 개별 가닥들은 2 개의 분리된 발현 벡터들 상의 프로모터들에 의하여 전사되고 표적 세포로 공-전달감염(co-transfected)될 수 있다. 대안적으로, dsRNA의 각 개별 가닥은 양쪽 모두가 동일한 발현 플라스미드 상에 위치되어 있는 프로모터들에 의하여 전사될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, dsRNA는 링커 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 합쳐진 역반복(inverted repeat)으로 발현되어 dsRNA는 줄기 및 루프 구조를 갖는다.
재조합 dsRNA 발현 벡터는 일반적으로 DNA 플라스미드 또는 바이러스성 벡터이다. 바이러스성 벡터를 발현하는 dsRNA는 업계에 알려진 다른 것들뿐만 아니라 아데노-연관 바이러스(검토를 위해, Muzyczka 등, Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129) 참조); 아데노바이러스(예를 들면, Berkner, 등, BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld 등. (1991, Science 252:431-434) 및 Rosenfeld 등. (1992), Cell 68:143-155) 참조); 또는 알파바이러스에 기초하지만 이에 한정되지 않게 구성될 수 있다. 레트로바이러스는 다양한 유전자를 상피 세포를 포함하여 많은 상이한 세포 유형으로 시험관 내 및/또는 생체 내로 도입하는데 이용되어 왔다(예컨대, Eglitis, 등, Science (1985) 230:1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson 등, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano 등, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber 등, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry 등, 1991, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury 등, 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-19; Kay 등, 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu 등, 1993, J. Immunol. 150:4104-4115; 미국 특허 번호 4,868,116 호; 미국 특허 번호 4,980,286 호; 국제 특허 출원 공개 번호 WO 89/07136 호; 국제 특허 출원 번호 WO 89/02468 호; 국제 특허 출원 번호 WO 89/05345 호; 및 국제 특허 출원 번호 WO 92/07573 호 참조). 세포의 게놈으로 삽입된 유전자를 변환시키고 발현할 수 있는 재조합 레트로바이러스성 벡터는 재조합 레트로바이러스 게놈을 PA317 및 Psi-CRIP와 같은 적당한 패키징 세포주(packaging cell lines)로 전달감염시킴으로써 생성될 수 있다(Comette 등, 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone 등, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349). 재조합 아데노바이러스성 벡터는 감수성 호스트(예컨대, 생쥐, 햄스터, 개 및 침팬지)에 광범위한 다종의 세포 및 조직을 감염시키는데 이용될 수 있으며(Hsu 등, 1992, J. Infectious Disease, 166:769), 또한 감염에 대한 유사분열적으로 활성인 세포(mitotically active cells)를 필요로 하지 않는 장점을 갖는다.
발현되는 dsRNA 분자(들)에 대한 코딩 서열을 수용할 수 있는 임의의 바이러스성 벡터를 이용할 수 있는데, 예를 들면, 아데노바이러스(AV); 아데노-연관 바이러스(AAV); 레트로바이러스(예컨대, 렌티바이러스(LV), 랍도바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스); 헤르페스 바이러스 등에서 유래한 벡터가 이용될 수 있다. 바이러스성 벡터의 친화성(tropism)은 벡터를 외피 단백질(envelope proteins) 또는 다른 바이러스로부터 유래한 다른 표면 항원으로 슈도타이핑(pseudotyping)하거나 적절히, 상이한 바이러스성 캡시드 단백질(viral capsid proteins)을 치환함으로써 변형될 수 있다.
예를 들면, 본 발명에서 특징된 렌티바이러스성 벡터는 수포성 구내염 바이러스(VSV), 광견병, 에볼라, 모콜라 등으로부터 유래한 표면 단백질로 슈도타이프될 수 있다. 본 발명에서 특징된 AAV 벡터는 벡터를 조작하여(engineering) 상이한 캡시드 단백질 혈청형을 발현함으로써 상이한 세포를 표적하도록 할 수 있다. 예를 들면, 혈청형 2 게놈상에 혈청형 2 캡시드를 발현하는 AAV 벡터를 AAV 2/2라고 한다. AAV 2/2 벡터 내의 이 혈청형 2 캡시드 유전자는 혈청형 5 캡시드 유전자에 의하여 대체되어 AAV 2/5 벡터를 생성할 수 있다. 상이한 캡시드 단백질 혈청형을 발현하는 AAV 벡터를 구성하는 기법은 업계의 기술 내에 있으며; 예컨대, 그 전체 개시가 본원에 참조로 포함되어 있는, Rabinowitz J E 등(2002), J Virol 76:791-801을 참조하라.
본 발명에서 이용에 적당한 재조합 바이러스성 벡터의 선정, dsRNA를 벡터로 발현시키기 위해 핵산 서열을 삽입하는 방법 및 바이러스성 벡터를 대상 세포로 전달하는 방법은 업계의 기술 내에 있다. 예를 들면, 그 전체 개시가 본원에 참조로 포함되어 있는, Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; 및 Rubinson D A 등, Nat. Genet. 33: 401-406을 참조하라.
바이러스성 벡터는 AV 및 AAV로부터 유래될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명에서 특징된 dsRNA는 예를 들면, U6 또는 H1 RNA 프로모터, 또는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터를 갖는 재조합 AAV 벡터로부터 유래한 2 개의 분리된 상보적인 단일-가닥 RNA 분자로 발현된다.
본 발명에서 특징된 dsRNA를 발현하는데 적당한 AV 벡터, 재조합 AV 벡터를 구성하는 방법 및 벡터를 표적 세포로 전달하는 방법은 Xia H 등 (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010에 기술되어 있다.
본 발명에서 특징된 dsRNA를 발현하는데 적당한 AAV 벡터, 재조합 AV 벡터를 구성하는 방법 및 벡터를 표적 세포로 전달하는 방법은 그 전체 개시가 본원에 참조로 포함되어 있는, Samulski R 등 (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J 등 (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R 등 (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; 미국 특허 번호 5,252,479 호; 미국 특허 번호 5,139,941 호; 국제 특허 출원 번호 WO 94/13788 호; 및 국제 특허 출원 번호 WO 93/24641 호에 기술되어 있다.
본 발명에서 특징된 DNA 플라스미드 또는 바이러스성 벡터에서 dsRNA 발현을 추진하는 프로모터는 진핵 RNA 중합효소 I(예컨대, 리보솜 RNA 프로모터), RNA 중합효소 II(예컨대, CMV 조기 프로모터 또는 액틴 프로모터 또는 U1 snRNA 프로모터) 또는 일반적으로 RNA 중합효소 III 프로모터(예컨대, U6 snRNA 또는 7SK RNA 프로모터) 또는 원핵 프로모터일 수 있으며, 예를 들면, 발현 플라스미드가 T7 프로모터로부터 전사에 필요한 T7 RNA 중합효소를 인코딩한다면, T7 프로모터일 수 있다. 프로모터는 췌장에 이식 유전자 발현을 지시할 수도 있다(예컨대, 췌장에 대한 인슐린 조절 서열 참조(Bucchini 등, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515)).
또한, 이식 유전자의 발현은 예를 들면, 특정한 생리학적 조절제, 예컨대, 순환하는 포도당 수준 또는 호르몬에 민감한 조절 서열과 같은 유도성 조절 서열 및 발현 시스템을 이용함으로써 정확히 조절될 수 있다(Docherty 등, 1994, FASEB J. 8:20-24). 세포 내 또는 포유류 내에서 이식 유전자 발현의 조절에 적당한 그러한 유도성 발현 시스템은 엑디손, 에스트로겐, 프로게스테론, 테트라시클린, 이합체화의 화학적 유도체 및 이소프로필-베타-D1-티오갈락토피라노시드(EPTG)에 의한 조절을 포함한다. 당업자는 dsRNA 이식 유전자의 의도된 이용을 기초로 하여 적절한 조절/프로머터 서열을 선택할 수 있게 된다.
일반적으로, dsRNA 분자를 발현할 수 있는 재조합 벡터는 하기에 기술된 바와 같이 전달되며 표적 세포 내에서 지속한다. 대안적으로, dsRNA 분자의 일시 발현을 제공하는 바이러스성 벡터가 이용될 수 있다. 그러한 벡터는 필요하다면 반복적으로 투여될 수 있다. 일단 발현되면, dsRNA는 표적 RNA에 결합되고 그 기능 또는 발현을 조정한다. 벡터를 발현하는 dsRNA의 전달은 정맥 내 또는 근육 내 투여에 의하고, 환자로부터 빼낸 표적 세포에 투여하고 이후 환자에 재도입하거나 소기의 표적 세포로 도입하도록 하는 기타 수단에 의한 것과 같이 전신적일 수 있다.
dsRNA 발현 DNA 플라스미드는 통상적으로 양이온성 지질 담체(예컨대, 올리고펙타민) 또는 비-양이온성 지질계 담체(예컨대, Transit-TKOTM)와의 복합체로서 표적 세포에 전달감염된다. 일 주일 이상의 기간에 걸쳐 단일 APOC3 유전자 또는 복수의 APOC3 유전자들의 상이한 영역을 표적하는 dsRNA-매개 녹다운(knockdowns)에 대한 복수의 지질 전달감염도 본 발명에 의하여 고려된다. 호스트 세포로 벡터를 성공적으로 도입하는 것은 다양한 알려진 방법을 이용하여 모니터링될 수 있다. 예를 들면, 일시 전달감염은 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 마커와 같은 리포터로 표시될 수 있다. 생체 외 세포의 안정적인 전달감염은 전달감염된 세포에 하이그로마이신 B 내성과 같이, 특이적인 환경 인자(예컨대, 항생제 및 약물)에 내성을 제공하는 마커를 이용하여 확보할 수 있다.
APOC3 특이적 dsRNA 분자는 벡터로 삽입되고 인간 환자에 대한 유전자 요법 벡터로 이용될 수도 있다. 유전자 요법 벡터는 예를 들면, 정맥 내 주사, 국소 투여(미국 특허 번호 5,328,470 호) 또는 정위 주사(stereotactic injection)(예컨대, Chen 등 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057 참조)에 의하여 피검자에게 전달될 수 있다. 유전자 요법 벡터의 약학적 제제는 허용 가능한 희석제 내에서 유전자 요법 벡터를 포함할 수 있거나, 유전자 전달 운반체가 심어져 있는 서방성 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 유전자 전달 벡터가 재조합 세포, 예컨대, 레트로바이러스성 벡터로부터 손상되지 않고 생성될 수 있는 경우에, 약학적 제제는 유전자 전달 시스템을 생성하는 하나 이상의 세포들을 포함할 수 있다.
dsRNA를 포함하는 약학적 조성물
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 dsRNA를 포함하는 약학적 조성물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 제공한다. dsRNA를 포함하는 약학적 조성물은 APOC3 발현에 의하여 매개되는 병적 과정과 같이, APOC3 유전자의 발현 또는 활성과 연관된 질병 또는 질환을 치료하는데 유용하다. 그러한 약학적 조성물은 전달의 방식에 기초하여 제형된다.
본원에서 특징된 약학적 조성물은 APOC3 유전자의 발현을 억제하는데 충분한 투여량으로 투여된다.
일반적으로, dsRNA의 적당한 용량은 일당 수여자의 체중 kg당 0.01 내지 200.0 밀리그램의 범위에 있으며, 일반적으로 일당 체중 kg당 1 내지 50 mg의 범위에 있다.
피검자는 치료량의dsRNA, 예컨대 약 0.01 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.55 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.65 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.75 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.85 mg/kg, 0.9 mg/kg, 0.95 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.1mg/kg, 2.2mg/kg, 2.3 mg/kg, 2.4 mg/kg, 2.5 mg/kg dsRNA, 2.6 mg/kg dsRNA, 2.7 mg/kg dsRNA, 2.8 mg/kg dsRNA, 2.9 mg/kg dsRNA, 3.0 mg/kg dsRNA, 3.1 mg/kg dsRNA, 3.2 mg/kg dsRNA, 3.3 mg/kg dsRNA, 3.4 mg/kg dsRNA, 3.5 mg/kg dsRNA, 3.6 mg/kg dsRNA, 3.7 mg/kg dsRNA, 3.8 mg/kg dsRNA, 3.9 mg/kg dsRNA, 4.0 mg/kg dsRNA, 4.1 mg/kg dsRNA, 4.2 mg/kg dsRNA, 4.3 mg/kg dsRNA, 4.4 mg/kg dsRNA, 4.5 mg/kg dsRNA, 4.6 mg/kg dsRNA, 4.7 mg/kg dsRNA, 4.8 mg/kg dsRNA, 4.9 mg/kg dsRNA, 5.0 mg/kg dsRNA, 5.1 mg/kg dsRNA, 5.2 mg/kg dsRNA, 5.3 mg/kg dsRNA, 5.4 mg/kg dsRNA, 5.5 mg/kg dsRNA, 5.6 mg/kg dsRNA, 5.7 mg/kg dsRNA, 5.8 mg/kg dsRNA, 5.9 mg/kg dsRNA, 6.0 mg/kg dsRNA, 6.1 mg/kg dsRNA, 6.2 mg/kg dsRNA, 6.3 mg/kg dsRNA, 6.4 mg/kg dsRNA, 6.5 mg/kg dsRNA, 6.6 mg/kg dsRNA, 6.7 mg/kg dsRNA, 6.8 mg/kg dsRNA, 6.9 mg/kg dsRNA, 7.0 mg/kg dsRNA, 7.1 mg/kg dsRNA, 7.2 mg/kg dsRNA, 7.3 mg/kg dsRNA, 7.4 mg/kg dsRNA, 7.5 mg/kg dsRNA, 7.6 mg/kg dsRNA, 7.7 mg/kg dsRNA, 7.8 mg/kg dsRNA, 7.9 mg/kg dsRNA, 8.0 mg/kg dsRNA, 8.1 mg/kg dsRNA, 8.2 mg/kg dsRNA, 8.3 mg/kg dsRNA, 8.4 mg/kg dsRNA, 8.5 mg/kg dsRNA, 8.6 mg/kg dsRNA, 8.7 mg/kg dsRNA, 8.8 mg/kg dsRNA, 8.9 mg/kg dsRNA, 9.0 mg/kg dsRNA, 9.1 mg/kg dsRNA, 9.2 mg/kg dsRNA, 9.3 mg/kg dsRNA, 9.4 mg/kg dsRNA, 9.5 mg/kg dsRNA, 9.6 mg/kg dsRNA, 9.7 mg/kg dsRNA, 9.8 mg/kg dsRNA, 9.9 mg/kg dsRNA, 9.0 mg/kg dsRNA, 10 mg/kg dsRNA, 15 mg/kg dsRNA, 20 mg/kg dsRNA, 25 mg/kg dsRNA, 30 mg/kg dsRNA, 35 mg/kg dsRNA, 40 mg/kg dsRNA, 45 mg/kg dsRNA, 또는 약 50 mg/kg dsRNA를 투여받을 수 있다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도될 수도 있다.
약학적 조성물은 매일 1회 투여될 수 있거나 dsRNA는 하루 전체에 걸쳐 적절한 간격으로 2, 3 또는 그 이상의 하부 용량으로 또는 심지어 제어 방출 제형(controlled release formulation)을 통해 연속 주입 또는 전달을 이용하여 투여될 수 있다. 그러한 경우, 각각의 하부-용량에 포함된 dsRNA는 총 일간 투여량을 달성하기 위하여 이에 상응하게 더 적어야 한다. 투여량 단위는 예컨대, 며칠간의 기간에 걸쳐 dsRNA의 지속 방출을 제공하는 종래 지속 방출 제형을 이용하여 며칠간에 걸쳐서 전달되기 위해 복합될 수도 있다. 지속 방출 제형은 업계에 주지되어 있으며, 본 발명의 작용제와 함께 이용될 수 있는 바와 같이, 특정 부위에서 작용제의 전달을 위해 특히 유용하다. 이 실시형태에 있어서, 투여량 단위는 일간 용량의 상응하는 배수를 포함한다.
APOC3 수준에 미치는 단일 용량의 영향은 장기적으로 지속하여, 이후 용량은 3, 4 또는 5 일 간격 이하, 또는 1, 2, 3 또는 4 주 간격 이하, 또는 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 주 간격 이하로 투여된다.
당업자는 질병 또는 질환의 중증도, 이전 치료, 피검자의 일반 건강 및/또는 연령 및 기타 현재 질병을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 특정 인자는 피검자를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 타이밍(timing)에 영향을 줄 수 있다는 것을 알 것이다. 또한, 피검자를 치료적 유효량의 조성물로 치료하는 것은 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 본 발명에 포함되는 개별 dsRNA들에 대한 효과적인 투여량 및 생체 내 반감기의 추정은 본원의 어디에선가 기술된 바와 같이, 종래 방법론을 이용하거나 적절한 동물 모델을 이용한 생체 내 시험을 기초로 하여 이루어질 수 있다.
마우스 유전학의 진보로 인하여 APOC3 발현에 의해 매개된 병적 과정과 같이, 다양한 인간 질병의 연구에 대한 수많은 마우스 모델들을 생성하였다. 그러한 모델은 치료적 유효 용량의 결정뿐만 아니라 dsRNA의 생체 내 시험을 위해 이용된다. 적당한 마우스 모델은 예를 들면, 인간 APOC3을 발현하는 플라스미드를 포함하는 마우스이다. 다른 적당한 마우스 모델은 인간 APOC3을 발현하는 이식 유전자를 보유한 유전자 이식 마우스이다.
세포 배양 분석법 및 동물 연구로부터 구한 데이터는 투여량의 범위를 인간용으로 제형하는데 이용될 수 있다. 본 발명에서 특징된 조성물의 투여량은 일반적으로 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 채용된 제형 및 활용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 발명에서 특징된 방법에 이용된 임의의 화합물에 대하여, 치료학적 유효 용량은 세포 배양 분석법으로부터 최초로 결정될 수 있다. 용량은, 상기 화합물의 순환 혈장 농도 범위, 또는 적절한 경우 세포 배양에서 결정된 바와 같이 IC50(즉, 증상의 절반-최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)를 포함하는 표적 서열의 폴리펩티드 생성물의 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록(예컨대, 감소된 농도의 폴리펩티드를 달성) 동물 모델 내에서 제형될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 더 정확하게 결정하는데 이용될 수 있다. 혈장 수준은 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의하여 측정될 수 있다.
본 발명에서 특징된 dsRNA는 표적 유전자 발현에 의해 매개된 병적 과정의 치료에 효과적인 기타 알려진 작용제와 병용하여 투여될 수 있다. 좌우간, 투여하는 의사는 업계에 알려지거나 본원에 기술된 효능의 표준 척도를 이용하여 관찰된 결과에 기초하여 dsRNA 투여의 양 및 타이밍을 조정할 수 있다.
투여
본 발명은 본 발명에 특징된 dsRNA 화합물을 포함하는 약학적 조성물 및 제형도 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 국소 또는 전신 치료를 요하는지 여부 및 치료될 부위에 따라 수많은 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 (볼 및 설하를 포함하여) 국소, 폐, 예컨대, 분무기에 의하는 것을 비롯하여 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기(insufflation)에 의하고; 기관삽관, 비강 내, 표피 및 경피, 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥 내, 동맥 내, 피하, 복막 내 또는 근육 내 주사 또는 주입; 또는 두개 내, 예컨대, 뇌실질 내, 척수강 내 또는 뇌실 내 투여를 포함한다.
dsRNA는 특정 조직을 표적하는 방식으로 전달될 수 있다.
국소 투여를 위한 약학적 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 드롭, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 종래 약학적 담체, 수용성, 분말 또는 유성 베이스(oily bases), 증점제 등은 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔, 장갑 등도 유용할 수 있다. 적당한 국소 제형으로는 본 발명에서 특징된 dsRNA가 지질, 리포솜, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트제 및 계면활성제와 같은 국소 전달 작용제와 혼합되어 있는 것들을 포함한다. 적당한 지질 및 리포솜으로는 중성(예컨대, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린), 음성(예컨대, 디피리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성(예컨대, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)를 포함한다. 본 발명에서 특징된 dsRNA는 리포솜 내에서 캡슐화될 수 있거나 리포솜에, 특히 양이온성 리포솜에 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, dsRNA는 지질, 특히 양이온성 지질에 복합될 수 있다. 적당한 지방산 및 에스테르는 아라키돈산, 올레산, 에이코산산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 C1-10 알킬 에스테르(예컨대, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 국소 제형은 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 6,747,014 호에 상세히 기술되어 있다.
리포솜 제형
약물의 제형을 위해 연구되고 이용된 마이크로에멀젼 이외에 많은 조직화된 계면활성제 구조가 있다. 여기에는 단일층, 미셸, 이중층 및 소낭을 포함한다. 리포솜과 같은 소낭은 그 특이성 및 이들이 약물 전달의 관점에서 제공하는 작용의 지속기간으로 인하여 대단한 관심을 끈다. 본 발명에서 사용된 “리포솜”이라는 용어는 구형 이중층 또는 이중층들 내에서 배열된 양친매성 지질로 구성된 소낭을 의미한다.
리포솜은 친지방성 물질로부터 형성된 막 및 수용성 내부를 갖는 단일층상 또는 다중층상 소낭이다. 수용성 부분은 전달될 조성물을 포함한다. 양이온성 리포솜은 세포벽으로 융합할 수 있는 이점을 갖는다. 비-양이온성 리포솜은 비록 세포벽과 효율적으로 융합할 수 없다고 하더라도 생체 내에서 대식세포들에 의하여 섭취된다.
상처입지 않은 온전한 포유류 피부를 교배하기 위하여, 지질 소낭은 적당한 경피 구배의 영향 하에서 각각의 직경이 50 nm 미만인 일련의 미세 기공들을 통과하여야 한다. 그러므로, 고도로 변형될 수 있고 그러한 미세 기공들을 통과할 수 있는 리포솜을 이용하는 것은 바람직하다.
리포솜의 다른 이점은 다음을 포함한다; 천연 인지질로부터 얻은 리포솜은 생물학적 적합성 및 생물분해성이 있고; 리포솜은 광범위한 물 및 지질 용해성 약물을 포함할 수 있고; 리포솜은 그 내부 격실에 있는 캡슐화된 약물을 물질 대사 및 분해로부터 보호할 수 있다(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). 리포솜 제형의 제제에 있어서 중요한 고려사항은 리포솜의 지질 표면 전하, 소낭 크기 및 수용성 부피이다.
리포솜은 작용 부위로 활성 성분의 수송 및 전달에 유용하다. 리포솜막은 생물학적 막과 구조적으로 유사하기 때문에, 리포솜이 조직에 도포되는 경우, 리포솜은 세포막과 융합하기 시작하며, 리포솜 및 세포의 융합이 진행됨에 따라, 리포솜 내용물이 활성제가 작용할 수 있는 세포로 이동하여 비워진다.
리포솜 제형은 많은 약물에 대한 전달 양식으로 광범위한 연구의 중심이 되어 왔다. 국소 투여를 위해, 리포솜은 다른 제형에 비하여 몇가지 장점을 제공한다는 증거가 증가하고 있다. 그러한 장점은 투여된 약물의 높은 전신 흡수에 관한 감소된 부작용, 소기의 표적에 투여된 약물의 증가된 축적 및 피부로 친지방성 및 소수성인 광범위한 약물을 투여할 수 있는 능력을 포함한다.
몇몇 보고서에 고분자량 DNA를 포함하는 작용제를 피부로 전달하는 리포솜의 능력을 상세히 기술하고 있다. 진통제, 항체, 호르몬 및 고분자량 DNA를 포함하는 화합물은 피부에 투여된다. 출원의 대부분은 상표피의 표적으로 귀결된다.
리포솜은 2 개의 광범위한 종류에 속한다. 양이온성 리포솜은 음으로 대전된 DNA 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성하는 양으로 대전된 리포솜이다. 양으로 대전된 DNA/리포솜 복합체는 음으로 대전된 세포 표면과 결합하고 엔도솜에 내재된다. 엔도솜 내의 산성 pH로 인하여, 리포솜은 파열되어 그 내용물을 세포 세포질로 방출한다(Wang 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
pH-민감성 또는 음으로 대전된 리포솜은 DNA와 복합되기 보다는 DNA를 트래핑한다. DNA 및 지질이 유사하게 대전되기 때문에, 복합체 형성보다는 반발력이 발생한다. 그럼에도 불구하고, 일부 DNA는 이러한 리포솜의 수용성 내부 내에서 트랩된다. pH-민감성 리포솜은 배양되는 세포 단일층들로 티미딘 키나아제 유전자를 인코딩하는 DNA를 전달하는데 이용되어 왔다. 외인성 유전자의 발현은 표적 세포에서 검출되었다(Zhou 등, Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
리포솜 조성물의 하나의 중요한 유형은 천연-유래 포스파티딜콜린이 아닌 인지질을 포함한다. 중성 리포솜 조성물은, 예를 들면, 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포솜 조성물은 일반적으로 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되는 반면에, 음이온성 융합성 리포솜(fusogenic liposomes)은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)로부터 형성된다. 다른 유형의 리포솜 조성물은 예를 들면, 대두 PC 및 계란 PC와 같이 포스파티딜콜린(PC)로부터 형성된다. 다른 유형은 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.
몇몇 연구는 피부에 리포솜 약물 제형의 국소 전달을 평가하였다. 기니 피그 피부에 인터페론을 포함하는 리포솜을 도포하면 피부 헤르페스 염이 감소되었던 반면에, 다른 수단(예컨대, 용액 또는 에멀젼으로)을 통한 인터페론의 전달은 효과적이지 않았다(Weiner 등, Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). 또한, 추가적인 연구는 수용성 시스템을 이용하여 인터페론의 투여에 대한 리포솜 제형의 일부로서 투여된 인터페론의 효능을 시험하였으며, 리포솜 제형은 수용성 투여보다 우월하다는 결론을 내렸다(du Plessis 등, Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).
비이온성 리포솜 시스템, 특히, 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템도 피부에 약물의 전달에 있어서 그 유용성을 결정하기 위해 조사되었다. NovasomeTM I (글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 NovasomeTM II (글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포솜 제형을 이용하여 마우스 피부의 표피로 시클로스포린-A를 전달하였다. 결과에 따르면 그러한 비이온성 리포솜 시스템은 시클로스포린-A를 피부의 상이한 층들로의 증착을 촉진시키는데 효과적이었다(Hu 등, S.T.P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
리포솜은 “입체적으로 안정화된” 리포솜도 포함하는데, 본원에 사용된 이 용어는 하나 이상의 특수화된 지질이 리포솜으로 포함되는 경우, 그러한 특수화된 지질이 부족한 리포솜과 비교하여 순환 수명을 향상시키는 결과를 갖는 하나 이상의 특수화된 지질을 포함하는 리포솜을 지칭한다. 입체적으로 안정화된 리포솜의 예로는 리포솜의 소낭-형성 지질 부분의 일부가 모노시알로강글리오시드 GM1 등의 하나 이상의 글리코지질을 포함하거나(A), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티와 같은 하나 이상의 친수성 중합체와 유도체화되는(B) 것들이 있다. 어느 특정한 이론에 구속되려 하지 않으면서, 적어도 강글리오시드, 스핑고미엘린 또는 PEG-유도체화 지질을 포함하는 입체적으로 안정화된 리포솜에 대하여, 이러한 입체적으로 안정화된 리포솜의 향상된 순환 반감기는 세망내피계통(RES)의 세포로의 감소된 섭취로부터 유래한다고 업계에서 간주된다(Allen 등, FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu 등, Cancer Research, 1993, 53, 3765).
하나 이상의 글리코지질을 포함하는 다양한 리포솜이 업계에 알려져 있다. Papahadjopoulos 등(Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64)은 모노시알로강글리오시드 GM1, 갈락토세레브로시드 설페이트 및 포스파티딜리노시톨이 리포솜의 혈액 반감기를 향상시키는 능력이 있음을 보고하였다. 이러한 발견은 Gabizon 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949)에 의하여 상세히 설명되었다. 양쪽 모두가 Allen 등에 속하는 미국 특허 번호 4,837,028 호 및 국제 특허 출원 번호 WO 88/04924 호는 (1) 스핑고미엘린 및 (2) 강글리오시드 GM1 또는 갈락토세레브로시드 설페이트 에스테르를 포함하는 리포솜을 개시한다. 미국 특허 번호 5,543,152 호(Webb 등)는 스핑고미엘린을 포함하는 리포솜을 개시한다. 1,2-sn-디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하는 리포솜은 국제 특허 출원 번호 WO 97/13499 호(Lim 등)에 개시되어 있다.
하나 이상의 친수성 중합체로 유도체화된 지질을 포함하는 많은 리포솜 및 그 제조법이 업계에 알려져 있다. Sunamoto 등(Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778)은 PEG 모이어티를 함유하는 비이온성 세제, 2C1215G를 포함하는 리포솜을 기술하였다. Illum 등(FEBS Lett., 1984, 167, 79)은 폴리스티렌 입자를 중합체 글리콜로 친수성 코팅하면 혈액 반감기가 현저히 향상된다는 것에 주목하였다. 폴리알킬렌 글리콜(예컨대, PEG)의 카르복실기를 부착함으로서 변형된 합성 인지질은 Sears(미국 특허 번호 4,426,330 호 및 4,534,899 호)에 의해 기술되어 있다. Klibanov 등(FEBS Lett., 1990, 268, 235)은 PEG 또는 PEG 스테아레이트로 유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PE)을 포함하는 리포솜은 혈액 순환 반감기가 현저히 증가함을 보여주는 실험을 기술하였다. Blume 등(Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91)은 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE) 및 PEG의 조합으로부터 형성된 기타 PEG-유도체화 인지질, 예컨대, DSPE-PEG로 그러한 관찰을 확장하였다. 외부 표면상에 공유결합된 PEG 모이어티를 갖는 리포솜은 Fisher에 속하는 유럽 특허 번호 EP 0 445 131 B1 호 및 국제 특허 출원 번호 WO 90/04384 호에 기술되어 있다. PEG로 유도체화된 PE 1 내지 20 몰 퍼센트를 포함하는 리포솜 조성물 및 그 이용법은 Woodle 등(미국 특허 번호 5,013,556 호 및 5,356,633 호) 및 Martin 등(미국 특허 번호 5,213,804 호 및 유럽 특허 번호 EP 0 496 813 B1 호)에 의하여 기술되어 있다. 수많은 기타 지질-중합체 콘쥬게이트를 포함하는 리포솜은 국제 특허 출원 공개 번호 WO 91/05545 호 및 미국 특허 번호 5,225,212 호(양쪽 다 Martin 등에 속함) 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 94/20073 호(Zalipsky 등)에 기술되어 있다. PEG-변형 세라미드 지질을 포함하는 리포솜은 국제 특허 출원 공개 번호 WO 96/10391 호(Choi 등)에 기술되어 있다. 미국 특허 번호 5,540,935 호(Miyazaki 등) 및 미국 특허 번호 5,556,948 호(Tagawa 등)는 그 표면상에 관능 모이어티들로 더 유도체화될 수 있는 PEG-함유 리포솜을 기술한다.
핵산을 포함하는 수많은 리포솜은 업계에 알려져 있다. Thierry 등에 속한 국제 특허 출원 공개 번호 WO 96/40062 호는 리포솜 내에서 고분자량 핵산을 캡슐화하는 방법을 개시한다. Tagawa 등에 속한 미국 특허 번호 5,264,221 호는 단백질-결합된 리포솜을 개시하고 그러한 리포솜의 내용물이 dsRNA를 포함할 수 있다는 것을 주장한다. Rahman 등에 속한 미국 특허 번호 5,665,710 호는 리포솜 내에서 올리고데옥시뉴클레오티드를 캡슐화하는 특정 방법을 기술한다. Love 등에 속한 국제 특허 출원 공개 번호 WO 97/04787 호는 raf 유전자에 표적된 dsRNA를 포함하는 리포솜을 개시한다.
트랜스퍼솜은 또 다른 유형의 리포솜이며, 약물 전달 운반체에 대한 매력적인 후보인 고도로 변형가능한 지질 응집체이다. 트랜스퍼솜은 고도로 변형가능하여 소적보다 더 작은 기공을 용이하게 침투할 수 있는 지질 소적으로 기술될 수 있다. 트랜스퍼솜은 이들이 이용되는 환경에 적응될 수 있으며, 예컨대, 이들은 자가-최적화하고(피부 내에서 기공의 형상에 적응됨), 자가-복구, 종종 단편화하지 않고 그 표적에 도달하며 자주 자가-로딩(loading)한다. 트랜스퍼솜을 제작하기 위하여, 표면단-활성화제, 통상적으로 계면활성제를 표준 리포솜 조성물에 첨가하는 것이 가능하다. 트랜스퍼솜은 피부에 혈청 알부민을 전달하는데 이용되어 왔다. 혈청 알부민의 트랜스퍼솜-매개 전달은 혈청 알부민을 포함하는 용액의 피하 주사만큼 유효하다고 밝혀져 있다.
계면활성제는 (마이크로에멀젼을 포함하는) 에멀젼 및 리포솜과 같은 제형에서 광범위한 응용을 찾는다. 천연 및 합성 양쪽의 많은 상이한 유형의 계면활성제의 특성을 분류하고 등급화하는 가장 흔한 방법은 친수성/친지방성 균형(HLB)의 이용에 의한 것이다. (“머리”로도 알려진) 친수성기의 특성은 제형에서 이용되는 상이한 계면활성제를 범주로 나누는 가장 유용한 수단을 제공한다(Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285 에서).
계면활성제 분자가 이온화되지 않으면, 이는 비이온성 계면활성제로 분류된다. 비이온성 계면활성제는 약학적 및 화장료 제품에서 광범위한 응용을 찾으며 넓은 범위의 pH 값에 걸쳐 이용할 수 있다. 일반적으로, 그 HLB 값은 그 구조에 따라 2 내지 약 18에 이른다. 비이온성 계면활성제는 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 소르비탄 에스테르, 수크로스 에스테르 및 에톡시화된 에스테르와 같은 비이온성 에스테르를 포함한다. 지방 알코올 에톡실레이트, 프로폭실화된 알코올 및 에톡실화/프로폭실화 블록 중합체와 같은 비이온성 알칸올아미드 및 에테르도 이 클래스(class)에 포함된다. 폴리옥시에틸렌 계면활성제는 비이온성 계면활성제 클래스의 가장 인기있는 요소이다.
만약 계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산되는 경우 음전하를 보유한다면, 계면활성제는 음이온성으로 분류된다. 음이온성 계면활성제는 비누와 같은 카르복실레이트, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 알킬 설페이트 및 에톡실화 알킬 설페이트와 같은 황산의 에스테르, 알킬 벤젠 설포네이트와 같은 설포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 설포석시네이트 및 포스페이트를 포함한다. 음이온성 계면활성제 클래스의 가장 중요한 요소는 알킬 설페이트 및 비누이다.
만약 계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산되는 경우 양전하를 보유한다면, 계면활성제는 양이온성으로 분류된다. 양이온성 계면활성제는 4급 암모늄 염 및 에톡실화 아민을 포함한다. 4급 암모늄 염은 이 클래스의 가장 많이 이용되는 요소이다.
만약 계면활성제 분자가 양전하 또는 음전하를 보유하는 능력을 갖는다면, 계면활성제는 양쪽성으로 분류된다. 양쪽성 계면활성제는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인 및 포스파티드를 포함한다.
계면활성제를 약물 제품, 제형 및 에멀젼에 이용하는 것을 검토하였다(Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285에서).
핵산 지질 입자
일 실시형태에 있어서, 본 발명에서 특징된 APOC3 dsRNA는 지질 제형 내에 완전히 캡슐화되어, 예컨대, SPLP, pSPLP, SNALP 또는 기타 핵산-지질 입자를 형성한다. 본원에 사용된 “SNALP”라는 용어는 SPLP를 포함하여, 안정한 핵산-지질 입자를 지칭한다. 본원에 사용된 “SPLP”라는 용어는 지질 소낭 내에서 캡슐화된 플라스미드 DNA를 포함하는 핵산-지질 입자를 지칭한다. SNALP 및 SPLP는 통상적으로 양이온성 지질, 비이온성 지질 및 입자의 응집을 방지하는 지질(예컨대, PEG-지질 콘쥬게이트)를 포함한다. SNALP 및 SPLP는 이들이 정맥 내(i.v.) 주사 이후에 순환 수명이 연장된 것을 보이며, 말초 부위들(예컨대, 투여 부위로부터 물리적으로 분리된 부위들)에서 축적되기 때문에 전신적인 응용에 극히 유용하다. SPLP는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/03683 호에서 설명된 캡슐화된 축합제-핵산 복합제를 포함하는 “pSPLP”를 포함한다. 본 발명의 입자는 통상적으로 약 50 nm 내지 약 150 nm, 더 통상적으로는 약 60 nm 내지 약 130 nm, 더 통상적으로는 약 70 nm 내지 약 110 nm, 가장 통상적으로는 약 70 nm 내지 약 90 nm의 평균 직경을 가지며, 실질적으로는 비독성이다. 또한, 핵산이 본 발명의 핵산-지질 입자 내에 존재하는 경우, 핵산은 수용액 내에서 뉴클레아제로 분해되는 것에 내성이 있다. 핵산-지질 입자 및 그 제조 방법은 예컨대, 미국 특허 번호 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432 호 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 96/40964 호에 개시되어 있다.
일 실시형태에 있어서, 지질 대 약물 비율(질량/질량 비율)(예컨대, 지질 대 dsRNA 비율)은 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위에 있을 것이다. 일부 실시형태들에 있어서, 지질 대 dsRNA 비율은 약 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 또는 11:1일 수 있다.
일반적으로, 지질-핵산 입자는 투여를 위해 완충제, 예컨대, PBS 내에서 현탁된다. 일 실시형태에 있어서, 지질 제형된 siRNA의 pH는 6.8에서 7.8 사이, 예컨대, 7.3 또는 7.4이다. 오스몰농도는 예컨대, 250에서 350 mOsm/kg 사이, 예컨대, 300 정도, 예컨대, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 또는 305 mOsm/kg일 수 있다.
양이온성 지질은 예를 들면, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(I -(2,3- 디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), N-(I -(2,3- 디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), N,N-디메틸-2,3- 디올레일옥시)프로필아민(DODMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), l,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디리놀레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레이옥시-3-(디메틸아미노)아세트옥시프로판(DLin-DAC), 1,2-디리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 또는 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올(DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오(DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), l,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA) 또는 그 유사체, (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라히드로-3aH-시클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민(ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸아자네디일)디도데칸-2-올(C12-200 또는 Tech G1), 또는 그 혼합물일 수 있다. 양이온 지질은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 20 몰% 내지 약 50 몰% 또는 약 40 몰%를 포함할 수 있다.
비양이온성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-l- 카르복실레이트(DOPE-말), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1 - 트랜스 PE, 1 - 스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE), 콜레스테롤, 또는 그 혼합물을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 음이온성 지질 또는 중성 지질일 수 있다. 비양이온성 지질은 콜레스테롤이 포함된다면, 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 90 몰%, 약 10 몰% 또는 약 58 몰%일 수 있다.
입자의 응집을 억제하는 콘쥬게이트된 지질은 예를 들면, PEG-디아실글리세롤(DAG), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer) 또는 이들의 혼합물을 포함하지만 여기에 한정되지 않는 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질일 수 있다. PEG-DAA 콘쥬게이트는 예를 들면, PEG-디라우릴옥시프로필(Ci2), a PEG-디미리스틸옥시프로필(Ci4), PEG-디팔미틸옥시프로필(C16), 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필(C18)일 수 있다. PEG 콘쥬게이트의 다른 예는 PEG-cDMA(N-[(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카르바밀]-1,2-디미리스틸옥슬프로필-3-아민), mPEG2000-DMG(mPEG-디미리스틸글리세롤(평균 분자량 2,000) 및 PEG-C-DOMG(R-3-[(ω-메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)2000)카르바모일)]-1,2-디미리스틸옥슬프로필-3-아민)을 포함한다. 입자의 응집을 방지하는 콘쥬게이트 지질은 입자 내에 존재하는 총 지질의 0 몰% 내지 약 20 몰% 또는 약 1.0, 1.1., 1.2, .13, 1.4, 1.5, 1.6,1.7, 1.8, 1.9, 또는 2 몰%일 수 있다.
일부 실시형태들에 있어서, 핵산-지질 입자는 콜레스테롤을 입자 내에 존재하는 총 지질의 예컨대, 약 10 몰% 내지 약 60 몰% 또는 약 48 몰%로 더 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 화합물 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란을 이용하여 지질-siRNA 나노입자를 제조할 수 있다. 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란의 합성은 본원에 참조로 포함된 2008년 10월 23일에 제출된 미국 특허 가출원 번호 61/107,998 호에 기술되어 있다.
예를 들면, 지질-siRNA 입자는 63.0 ± 20 nm의 입자 크기 및 0.027 siRNA/지질 비율을 갖는 40% 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란: 10% DSPC: 40% 콜레스테롤: 10% PEG-C-DOMG(몰 퍼센트)를 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1,1'-(2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸아자네디일)디도데칸-2-올(Tech G1)을 이용하여 지질-siRNA 입자를 제조할 수 있다. 예를 들면, dsRNA는 Tech-G1, 디스테아로일 포스파티딜콜린(DSPC), 콜레스테롤 및 mPEG2000-DMG를 50:10:38.5:1.5의 몰비로 7:1의 총 지질 대 siRNA 비율(wt:wt)로 포함하는 지질 제형 내에서 제형될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 리피도이드(lipidoid) ND98ㆍ4HCl (분자량 1487), 콜레스테롤(시그마-알드리치) 및 PEG-세라미드 C16(아반티 극성 지질)을 이용하여 지질-siRNA 나노입자(즉, LNP01 입자)를 제조할 수 있다. LNP01 제형은 예컨대, 본원에 참조로 포함된 국제 출원 공개 번호 WO 2008/042973 호에 기술되어 있다.
추가의 예시적인 제형들이 표 A에 기술되어 있다.
[표 A]
제형을 포함하는 SNALP(l,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA))은 본원에 참조로 포함된 2009년 4월 15일에 제출된 국제 출원 공개 번호 WO2009/127060 호에 기술되어 있다.
제형을 포함하는 XTC는 예컨대, 본원에 참조로 포함된, 2009년 1월 29일에 제출된 미국 가출원 계열 번호 61/148,366 호; 2009년 3월 2일에 제출된 미국 가출원 계열 번호 61/156,851 호; 2009년 6월 10일에 제출된 미국 가출원 계열 번호; 2009년 6월 24일에 제출된 미국 가출원 계열 번호 61/228,373 호; 2009년 9월 3일에 제출된 미국 가출원 계열 번호 61/239,686 호 및 2010년 1월 29일에 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2010/022614 호에 기술되어 있다.
제형을 포함하는 MC3은 예컨대, 본원에 참조로 포함된, 2009년 9월 22일에 제출된 미국 가출원 계열 번호 61/244,834 호, 2009년 6월 10일에 제출된 미국 가출원 계열 번호 61/185,800 호, 및 2010년 6월 10일에 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US10/28224에 기술되어 있다.
제형을 포함하는 ALNY-100은 예컨대, 본원에 참조로 포함된, 2009년 11월 10일에 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US09/63933 호에 기술되어 있다.
제형을 포함하는 C12-200은 본원에 참조로 포함된, 2009년 5월 5일에 제출된 미국 가출원 계열 번호 61/175,770 호 및 2010년 5월 5일에 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US10/33777 호에 기술되어 있다.
표준 또는 무압출(extrusion-free) 방법에 의해 제조된 제형은 유사한 방식으로 특징될 수 있다. 예를 들면, 제형은 통상적으로 육안 검사에 의해 특징된다. 이들은 응집체 또는 침전물이 없는 약간 흰색의 반투명 용액이어야 한다. 지질-나노입자의 입자 크기 및 입자 크기 분포는 예를 들면, 맬번 제타사이저 나노 ZS(맬번, 미국)을 이용하여 광산란에 의하여 측정될 수 있다. 입자는 크기가 약 20 내지 300 nm, 예컨대 40 내지 100 nm이어야 한다. 입자 크기 분포는 단봉형이어야 한다. 트랩된 분율뿐만 아니라 제형 내의 총 siRNA 농도는 염색 배제 분석법을 이용하여 추정한다. 제형된 siRNA의 표본은 예컨대, 0.5% 트리톤-X100과 같은 계면활성제를 파열시키는 제형의 존재 또는 부재 하에 리보그린(분자 탐침)과 같은 RNA-결합 염색으로 배양될 수 있다. 제형 내의 총 siRNA는 표준 곡선에 대하여 계면활성제를 포함하는 표본으로부터 나온 신호에 의하여 결정될 수 있다. 트랩된 분율은 (계면활성제의 부재 하에 신호에 의해 측정되는 바와 같이) 총 siRNA 함량으로부터“유리(free)” siRNA 함량을 차감함으로써 결정된다. 트랩된 siRNA 퍼센트는 통상적으로 85%를 초과한다. SNALP 제형에 대하여, 입자 크기는 적어도 30 nm, 적어도 40 nm, 적어도 50 nm, 적어도 60 nm, 적어도 70 nm, 적어도 80 nm, 적어도 90 nm, 적어도 100 nm, 적어도 110 nm, 및 적어도 120 nm이다. 적당한 범위는 통상적으로 약 적어도 50 nm 내지 약 적어도 110 nm, 약 적어도 60 nm 내지 약 적어도 100 nm, 또는 약 적어도 80 nm 내지 약 적어도 90 nm이다.
경구 투여용 조성물 및 제형은 분말 또는 과립, 마이크로미립자, 나노미립자, 물 또는 비수용성 매질 내의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 젤 캡슐, 향낭, 정제 또는 미니정제를 포함한다. 점증제, 풍미제, 희석제, 유화제, 분산 조제 또는 결합제는 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 경구 제형은 본 발명에서 특징된 dsRNA가 하나 이상의 침투 향상제 계면활성제 및 킬레이트화제와 함께 투여되는 경구 제형이다. 적당한 계면활성제는 지방산 및/또는 이들의 에스테르 또는 염, 이들의 담즙산 및/또는 염을 포함한다. 적당한 담즙산/염으로는 케노데옥시콜린산(CDCA) 및 우르소데옥시케노데옥시콜린산(UDCA), 콜린산, 디히드로콜린산, 데옥시콜린산, 글루콜린산, 글리콜린산, 글리코데옥시콜린산, 타우로콜린산, 타우로데옥시콜린산, 나트륨 타우로-24,25-디히드로-푸시데이트 및 나트륨 글리코디히드로푸시데이트가 있다. 적당한 지방산은 아라키돈산, 운데카노산, 올레산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염(예컨대, 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태들에 있어서, 예를 들면, 담즙산/염과 조합된 지방산/염과 같은 침투 향상제의 조합이 이용된다. 예시적인 일 조합은 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 나트륨 염이다. 다른 침투 향상제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다. 본 발명에서 특징된 dsRNA는 스프레이된 건조 입자를 포함하여 과립 형태로 경구적으로 전달되거나 복합화되어 마이크로 또는 나노입자를 형성할 수 있다. dsRNA 복합화제는 폴리아미노산; 폴리이민; 폴리아크릴레이트; 폴리알킬아크릴레이트, 폴리옥세탄, 폴리알킬시아노아크릴레이트; 양이온화 젤라틴, 알부빈, 전분, 아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 전분; 폴리알킬시아노아크릴레이트; DEAE-유도체화된 폴리이민, 풀루란, 셀룰로오스 및 전분을 포함한다. 적당한 복합화제는 키토산, N-트리메틸키토산, 폴리-L-라이신, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴, 폴리스페르민, 프로타민, 폴리비닐피리딘, 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌 P(TDAE), 폴리아미노스티렌(예컨대, p-아미노), 폴리(메틸시아노아크릴레이트), 폴리(에틸시아노아크릴레이트), 폴리(부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소헥실시아노아크릴레이트), DEAE-메타크릴레이트, DEAE-헥실아크릴레이트, DEAE-아크릴아미드, DEAE-알부민 및 DEAE-덱스트란, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리헥실아크릴레이트, 폴리(D,L-락트산), 폴리(DL-락틱-코-글리콜산(PLGA), 알기네이트, 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함한다. dsRNA용 경구 제형 및 그 제제는 그 각각이 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 번호 6,887,906 호, 미국 특허 공개 번호 20030027780 호 및 미국 특허 번호 6,747,014 호에 상세히 기술되어 있다.
비경구, (뇌로의) 실질세포 내, 척수강 내, 뇌실 내 또는 간 내 투여용 조성물 및 제형은 완충제, 희석제, 및 침투 향상제, 담체 화합물 및 기타 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 같은, 그러나 여기에 한정되지 않은 기타 적당한 첨가제도 포함할 수 있는 살균 수용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 용액, 에멀젼 및 리포솜-함유 제형을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 이 조성물은 사전형성된 액체, 자가-유화 고체 및 자가-유화 반고체를 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 다양한 성분으로부터 생성될 수 있다. 간 암종과 같은 간 질환을 치료하는 경우 간을 표적하는 제형이 특히 바람직하다.
단위 제형으로 간편하게 제시될 수 있는, 본 발명의 약학적 제형는 제약 업계에 주지된 종래 기법에 따라 제조될 수 있다. 그러한 기법으로는 활성 성분을 약학적 담체(들) 또는 부형제(들)과의 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미세 분할된 고체 담체 또는 양쪽 모두와 균일하고 밀접하게 회합시키고 이후 필요하다면, 생성물을 형상화함으로써 제조된다.
본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 젤 캡슐, 액체 시럽, 연질 젤, 좌약 및 관장제와 같은, 그러나 여기에 한정되지 않은 수많은 가능한 제형중 어느 하나로 제형될 수 있다. 본 발명의 조성물은 수용성, 비수용성 또는 혼합 매질 내의 현탁액으로 제형될 수도 있다. 수용성 현탁액은 예를 들면, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 더 포함할 수 있다. 현탁액은 안정화제를 포함할 수도 있다.
에멀젼
본 발명의 조성물은 에멀젼으로 제조 및 제형될 수 있다. 에멀젼은 통상적으로 직경이 0.1 μm를 주로 초과하는 소적의 형태로 하나의 액체를 다른 액체에 분산시킨 이종 시스템이다(Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman에서, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms에서, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman에서 Block, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi 등, Remington's Pharmaceutical Sciences에서, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). 에멀젼은 종종 서로 밀접하게 혼합되고 분산된 2 개의 혼합되지 않는 액체상을 포함하는 2상계이다. 일반적으로, 에멀젼은 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 종류일 수 있다. 수상이 크기가 큰 유상으로 미세하게 분할되고 미세한 소적으로 분산되는 경우, 이로 인한 조성물은 유중수(w/o) 에멀젼이라고 불린다. 대안적으로, 유상이 크기가 큰 수상으로 미세하게 분할되고 미세한 소적으로 분산되는 경우, 이로 인한 조성물은 수중유(o/w) 에멀젼이라고 불린다. 에멀젼은 분산된 상 및 수상, 유상의 용액으로 또는 분리상으로서 자체적으로 존재할 수 있는 활성 약물에 더하여 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 유화제, 안정화제, 염료 및 항산화제와 같은 약학적 부형제는 필요하다면 에멀젼에 존재할 수도 있다. 약학적 에멀젼은 예를 들면, 유중수중유(o/w/o) 및 수중유중수(w/o/w) 에멀젼의 경우에서와 같이 2 상을 초과하여 구성된 다중 에멀젼일 수도 있다. 그러한 복합체 제형은 종종 단순 2상 에멀젼이 제공하지 않는 특정 장점을 제공한다. o/w 에멀젼의 개별 유성 소적이 작은 물 소적을 둘러싸는 복수의 에멀젼들은 w/o/w 에멀젼을 구성한다. 마찬가지로, 유성 연속상 내에 안정화된 물의 소구체립에 둘러싸인 유성 소적의 시스템은 o/w/o 에멀젼을 제공한다.
에멀젼은 열역학적 안정성이 거의 없거나 열역학적 안정성이 전혀 없는 것에 의하여 특징된다. 종종, 에멀젼의 분산되거나 불연속적 상은 외부 또는 연속상으로 잘 분산되며, 유화제의 이용을 통하거나 제형의 점도를 통해 이 형태로 유지된다. 에멀젼의 상 중 어느 하나는 에멀젼-스타일 연고 베이스 및 크림의 경우에서처럼, 반고체 또는 고체일 수 있다. 에멀젼을 안정화시키는 다른 수단은 에멀젼의 어느 상으로 포함될 수 있는 유화제의 이용을 수반한다. 유화제는 합성 계면활성제, 자연발생적 유화제, 흡수 베이스 및 미세하게 분산된 고체의 4 개 카테고리로 넓게 분류될 수 있다(Idson, Pharmaceutical Dosage Forms에서, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
표면 활성제라고도 알려진 합성 계면활성제는 에멀젼의 제형에서 광범위한 적용가능성을 찾으며 문헌에서 검토되었다(Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms에서, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms에서, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). 계면활성제는 통상적으로 양친매성이며 친수성 및 소수성 부분을 포함한다. 계면활성제의 친수성 대 소수성의 비율은 친수성/친지방성 균형(HLB)라고 칭하며 제형의 제조에서 계면활성제를 분류하고 선택하는데 있어서 가치있는 도구이다. 계면활성제는 친수성기의 성질에 기초하여 상이한 클래스로 분류될 수 있다: 비이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성(Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms에서, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).
에멀젼 제형에 이용되는 자연발생적 유화제는 라놀린, 밀랍, 인지질, 레시틴 및 아카시아를 포함한다. 흡수 베이스는 친수성을 소지하여, 이들이 물을 흡수하여 w/o 에멀젼을 형성하지만, 무수 라놀린 및 친수성 광유(petrolatum)와 같은 이들의 반고체 연경도(consistencies)를 유지할 수 있다. 미세하게 분할된 고체는 특히 계면활성제와의 조합에서, 그리고 점성 제제에 있어서 양호한 유화제로서 이용되기도 한다. 이것은 중금속 수산화물과 같은 극성 무기 고체, 벤토나이트, 아타풀자이트, 헥토라이트, 고령토, 몬모릴로나이트, 콜로이드성 알루미늄 실리케이트 및 콜로이드성 마그네슘 알루미늄 실리케이트와 같은 비-팽윤성 점토, 안료 및 탄소 또는 글리세릴 트리스테아레이트와 같은 비극성 고체를 포함한다.
대단히 다양한 비-유화 물질들도 에멀젼 제형에 포함되며 에멀젼의 특성에 기여한다. 이들은 지방, 오일, 왁스, 지방산, 지방 알코올, 지방 에스테르, 보습제, 친수성 콜로이드, 보존제 및 항산화제를 포함한다(Block, Pharmaceutical Dosage Forms에서, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms에서, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
친수성 콜로이드 또는 수성콜로이드는 다당류(예컨대, 아카시아, 아가, 알긴산, 카라기난, 구아검, 카라야검 및 트라가칸트), 셀룰로오스 유도체(예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오스 및 카르복시프로필셀룰로오스) 및 합성 중합체(예를 들면, 카르보머, 셀룰로오스 에테르 및 카르복시비닐 중합체)와 같은 자연발생적 검 및 합성 중합체를 포함한다. 이들은 물에서 분산하거나 팽창하여, 분산된 상의 소적 주위에 강한 계면 필름을 형성하고 외부상의 점도를 증가시킴으로써 에멀젼을 안정화시키는 콜로이드성 용액을 형성한다.
에멀젼은 종종 미생물의 성장을 용이하게 지지할 수 있는 탄수화물, 단백질, 스테롤 및 인지질과 같은 많은 성분을 포함하기 때문에, 이러한 제형은 종종 보존제를 포함한다. 에멀젼 제형에 포함되는 흔히 이용되는 보존제는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 4급 암모늄 염, 염화 벤잘코늄, p-히드록시벤조산의 에스테르 및 붕산을 포함한다. 항산화제도 에멀젼 제형에 흔히 추가되어 제형의 분해를 방지한다. 이용된 항산화제는 토코페롤과 같은 유리 라디칼 스캐빈저, 알킬 갈레이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 또는 아스코르브산 및 메타중아황산 나트륨과 같은 환원제, 및 시트르산, 주석산 및 레시틴과 같은 항산화 상승제일 수 있다.
피부, 경구 및 비경구 경로를 통한 에멀젼 제형의 응용 및 그 제조법은 문헌에서 검토되었다(Idson, Pharmaceutical Dosage Forms에서, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). 경구 전달용 에멀젼 제형은 흡수 및 생물이용도 관점에서 효능뿐만 아니라 제형의 용이성으로 인하여 매우 광범위하게 이용되었다(Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms에서, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms에서, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). 광유 베이스 완하제, 유용성 비타민 및 고지방 영양 제제는 o/w 에멀젼으로 경구로 흔히 투여되는 물질들 중에 있다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, dsRNA 및 핵산의 조성물은 마이크로에멀젼으로 제형된다. 마이크로에멀젼은 단일 광학적 등방성이며 열역학적으로 안정한 액체 용액인 물, 기름 및 양친매성 물질의 시스템으로 정의될 수 있다(Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms에서, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). 통상적으로 마이크로에멀젼은 우선 오일을 수용성 계면활성제 용액에 분산시킨 후 일반적으로, 중간 사슬-길이 알코올인 제 4 성분의 충분량을 첨가하여 투명 시스템을 형성하여 제조되는 시스템이다. 그러므로, 마이크로에멀젼은 또한 표면-활성 분자의 계면 필름에 의하여 안정화된 2 개의 비혼화성 액체의 열역학적으로 안정하고 등방성으로 맑은 분산액으로 기술되었다(Leung 및 Shah, Controlled Release of Drugs에서: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). 마이크로에멀젼은 오일, 물, 계면활성제, 공계면활성제 및 전해질을 포함하는 3 내지 5 개의 성분의 조합을 통해 흔히 제조된다. 마이크로에멀젼이 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 형인지의 여부는 이용된 오일 및 계면활성제의 성질에 의존하며, 계면활성제 분자의 극성 머리 및 탄화수소 꼬리의 구조 및 기하학적인 패킹에 의존한다(Schott, Remington's Pharmaceutical Sciences에서, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
상 다이아그램을 활용하는 현상학적 접근법은 광범위하게 연구되었으며, 마이크로에멀젼을 제형하는 법의 폭넓은 지식을 당업자에게 부여하였다(Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms에서, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, Pharmaceutical Dosage Forms에서, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). 종래 에멀젼과 비교하여, 마이크로에멀젼은 자발적으로 형성되는 열역학적으로 안정한 소적의 제형에 있어서 수-불용성 약물을 가용화하는 장점을 제공한다.
마이크로에멀젼의 제조에 이용되는 계면활성제는 이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, Brij 96, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 테트라글리세롤 모노라우레이트(ML310), 테트라글리세롤 모노올리에이트(MO310), 헥사글리세롤 모노올리에이트(PO310), 헥사글리세롤 펜타올리에이트(PO500), 데카글리세롤 모노카프레이트(MCA750), 데카글리세롤 모노올리에이트(MO750), 데카글리세롤 세퀴올리에이트(SO750), 데카글리세롤 데카올리에이트(DAO750)를 단독으로 또는 공계면활성제와 조합하여 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 에탄올, 1-프로판올 및 1-부탄올과 같은 주로 단쇄 알코올인 공계면활성제는 계면활성제 분자들 사이에서 발생된 빈 공간으로 인하여 계면활성제 필름으로 침투하고 그에 따라 무질서한 필름을 생성함으로써 계면 유동성을 증가시키는 역할을 한다. 그러나, 마이크로에멀젼은 업계에 알려진 공계면활성제 및 무알코올 자가-유화 마이크로에멀젼 시스템의 이용 없이 제조될 수 있다. 수상은 통상적으로는 물, 약물의 수용액, 글리세롤, PEG300, PEG400, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜의 유도체일 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다. 유상은 Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, 지방산 에스테르, 중간 사슬 (C8-C12) 모노글리세리드, 디글리세리드, 및 트리글리세리드, 폴리옥시에틸화 글리세릴 지방산 에스테르, 지방 알코올, 폴리글리콜화 글리세리드, 포화 폴리글리콜화 C8-C10 글리세리드, 식물성유 및 실리콘유와 같은 물질을 포함할 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다.
마이크로에멀젼은 약물 용해화 및 약물의 향상된 흡수의 관점에서 특히 관심의 대상이 된다. (o/w 및 w/o)인 지질계 마이크로에멀젼은 펩티드를 포함하는, 약물의 경구 생물이용도를 향상시키는 것으로 제안되었다(Constantinides 등, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). 마이크로에멀젼은 개선된 약물 용해화, 약물을 효소적 가수분해로부터 보호, 막 유동성 및 침투성에서 계면활성제-유도된 변경으로 인한 약물 흡수의 가능한 향상, 제조의 용이성, 고체 제형에 비해 경구 투여의 용이성, 개선된 임상적 역가 및 감소된 독성의 장점을 부여한다(Constantinides 등, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho 등, J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). 종종, 마이크로에멀젼은 그 구성성분들이 주위 온도에서 함께 도입되는 경우 자발적으로 형성될 수 있다. 이는 열불안정성 약물, 펩티드 또는 dsRNA를 제형하는 경우 특히 유리할 수 있다. 마이크로에멀젼은 화장품 및 약학적 응용에 있어서 활성 성분들의 경피적 전달에서 효과적이기도 하다. 본 발명의 마이크로에멀젼 조성물 및 제형은 dsRNA 및 핵산의 국소 세포 섭취를 개선시킬뿐 아니라, 위장관으로부터 dsRNA 및 핵산의 증가된 전신 흡수를 촉진할 것이라고 기대된다.
본 발명의 마이크로에멀젼은 소르비탄 모노스테아레이트(Grill 3), 라브라졸(Labrasol), 및 침투 향상제와 같은 추가적인 구성성분 및 첨가제도 함유하여 제형의 특성을 개선시키고 본 발명의 dsRNA 및 핵산의 흡수를 향상시킬 수 있다. 본 발명의 마이크로에멀젼에 이용된 침투 향상제는 다섯 개의 광범위한 범주- 계면활성제, 지방산, 담즙산염, 킬레이트제 및 비킬레이트 비계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). 이들 클래스의 각각은 상기에서 토의되었다.
침투 향상제
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 다양한 침투 향상제를 채용하여 동물의 피부에 핵산, 특히 dsRNA를 효율적으로 전달한다. 대부분의 약물들은 이온화 및 비이온화 형태로 용액 내에 존재한다. 그러나, 주로 지질 용해성 또는 친지방성 약물은 세포막을 용이하게 관통한다. 심지어 비친지방성 약물도 관통되는 막이 침투 향상제로 처리되면 세포막을 관통할 수 있는 것을 알게 되었다. 세포막을 통과하여 비친지방성 약물의 확산을 돕는 것뿐만 아니라, 침투 향상제는 친지방성 약물의 침투성도 향상시킨다.
침투 향상제는 다섯 개의 광범위 범주, 즉, 계면활성제, 지방산, 담즙산염, 킬레이트제 및 비킬레이트 비계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). 상기 언급된 침투 향상제의 클래스들의 각각은 하기에 더 상세히 기술된다.
계면활성제: 본 발명과 관련하여, 계면활성제(또는 “표면-활성제”)는 수용액에 용해되는 경우, 점막을 통해 dsRNA의 흡수가 향상되는 결과를 갖는, 용액의 표면 장력 또는 수용액 및 다른 액체 사이의 계면 장력을 감소시키는 화학적 실체이다. 담즙산염 및 지방산에 더하여, 이러한 침투 향상제는 예를 들면, 나트륨 라우릴 설페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르(Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92); 및 FC-43과 같은 수소를 플루오르로 치환한 화합물의 에멀젼을 포함한다(Takahashi 등, J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
지방산: 침투 향상제로 작용하는 다양한 지방산 및 이들의 유도체는 예를 들면, 올레산, 라우르산, 카프르산(n-데카노산), 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인(1-모노올레오일-락-글리세롤), 디라우린, 카프릴산, 아라키돈산, 글리세롤 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 이의 C1-10 알킬 에스테르(예컨대, 메틸, 이소프로필 및 t-부틸), 및 이의 모노글리세리드 및 디글리세리드(즉, 올리에이트, 라우레이트, 카프레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 리놀리에이트 등)을 포함한다 (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri 등, J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
담즙산염: 담즙의 생리학적 역할은 지질 및 지용성 비타민의 분산 및 흡수의 촉진을 포함한다(Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman 등. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). 다양한 천연 담즙산염 및 이들의 합성 유도체는 침투 향상제로서 작용한다. 따라서, “담즙산염”이라는 용어는 담즙산의 합성 유도체 중 어느 하나뿐만 아니라 담즙의 자연발생적 구성성분중 어느 하나를 포함한다. 적당한 담즙산염은 예를 들면, 콜산(또는 그 약학적으로 허용 가능한 나트륨염, 나트륨 콜레이트), 디히드로콜린산(나트륨 디히드로콜레이트), 데옥시콜린산(나트륨 데옥시콜레이트), 글루콜산(나트륨 글루콜레이트), 글리콜산(나트륨 글리콜레이트), 글리코데옥시콜린산(나트륨 글리코데옥시콜레이트), 타우로콜린산(나트륨 타우로콜레이트), 타우로데옥시콜산(나트륨 타우로데옥시콜레이트), 케노데옥시콜린산(나트륨 케노데옥시콜레이트), 우르소데옥시콜산(UDCA), 나트륨 타우로-24,25-디히드로-푸시데이트(STDHF), 나트륨 글리코디히드로푸시데이트 및 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(POE) (Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto 등, J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita 등, J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583)를 포함한다.
킬레이트제: 본 발명과 연관하여 이용되는 바와 같이, 킬레이트제는 점막을 통해 dsRNA의 흡수가 향상되는 결과를 갖는, 이와 함께 복합체를 형성함으로써 용액으로부터 금속 이온을 제거하는 화합물로 정의될 수 있다. 본 발명에서 침투 향상제로의 이용에 대하여, 킬레이트제는 대부분의 특징이되는 DNA 뉴클레아제는 촉매작용에 대한 2가 금속 이온을 필요로 하며, 따라서 킬레이트제에 의하여 억제되므로 DNase 억제제로서도 작용하는 추가 장점을 갖는다(Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). 적당한 킬레이트제는 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA), 시트르산, 살리실레이트(예컨대, 나트륨 살리실레이트, 5-메톡시살리실레이트 및 호모바닐레이트), 콜라겐의 N-아실 유도체, 라우레스-9 및 베타-디케톤의 N-아미노 아실 유도체(엔아민)를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다(Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur 등, J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
비킬레이트 비계면활성제: 본원에 사용된 바와 같이, 비킬레이트 비계면활성제 침투 향상 화합물은 킬레이트제로서 또는 계면활성제로서 현저하지 않은 활성을 보이지만, 그럼에도 불구하고 영양 점막(alimentary mucosa)를 통해 dsRNA의 흡수를 향상시키는 화합물로 정의될 수 있다(Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). 이러한 클래스의 침투 향상제는 예를 들면, 불포화 사이클릭 요소, 1-알킬- 및 1-알케닐아자시클로-알칸온 유도체(Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92); 및 디클로페낙 나트륨, 인도메타신 및 페닐부타존과 같은 비스테로이드성 소염제(Yamashita 등, J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626)를 포함한다.
담체
본 발명의 특정 조성물은 제형에 담체 화합물도 포함한다. 본원에 사용된 “담체 화합물” 또는 “담체”는 비활성(즉, 그 자체로 생물학적 활성을 가지지 않음)이지만, 예를 들면, 생물학적으로 활성인 핵산을 분해하거나 순환으로부터 이의 제거를 촉진함으로써 생물학적 활성을 갖는 핵산의 생물이용도를 감소시키는 생체 내 공정에 의하여 핵산으로 인지되는 핵산 또는 이의 유사체를 지칭할 수 있다. 통상적으로 담체 화합물이 과잉으로 있는, 핵산 및 담체 화합물의 공-투여로 인해 아마도 공통의 수용체에 대한 담체 화합물 및 핵산 사이의 경쟁으로 인하여, 간, 신장 또는 기타 특별한 순환 조수(extracirculatory reservoirs) 내에서 회수된 핵산의 양의 실질적인 감소로 이어질 수 있다. 예를 들면, 간 조직 내에서 부분적으로 포스포로티오에이트 dsRNA의 회수는 폴리이노신산, 덱스트란 설페이트, 폴리시티드산 또는 4-아세트아미도-4'이소티오시아노-스틸벤-2,2'-디설폰산과 함께 공-투여되는 경우, 감소될 수 있다(Miyao 등, DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura 등, DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
부형제
담체 화합물과 달리, “약학적 담체” 또는 “부형제”는 약학적으로 허용 가능한 용매, 현탁제 또는 하나 이상의 핵산을 동물에게 전달하기 위한 임의의 기타 약리적 비활성 운반체이다. 부형제는 액체 또는 고체일 수 있으며, 선택되어 염두에 둔 계획된 투여 방식으로 핵산 및 주어진 약학적 조성물의 기타 구성성분들과 조합되는 경우 소기의 벌크, 연경도 등을 제공하게 된다. 통상적인 약학적 담체는 결합체(예컨대, 사전에 젤라틴화한 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 등); 충진제(예컨대, 락토오스 및 기타 당, 마이크로결정질 셀룰로오스, 펙틴, 젤라틴, 칼슘 설페이트, 에틸 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트 또는 칼슘 수소 포스페이트 등); 윤활제(예컨대, 스테아르산 마그네슘, 활석, 실리카, 콜로이드성 이산화 실리콘, 스테아르산, 금속성 스테아레이트, 수소화 식물성유, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 벤조산 나트륨, 아세트산 나트륨 등); 붕해제(예컨대, 전분, 전분 글리콜산 나트륨 등); 및 습윤제(예컨대, 황산 나트륨 라우릴 등)을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
핵산과 유해하게 반응하지 않는, 비경구가 아닌 투여에 적당한 약학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 부형제를 이용하여 본 발명의 조성물을 제형할 수도 있다. 적당한 약학적으로 허용 가능한 담체는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 스테아르산 마그네슘, 활석, 규산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
핵산의 국소 투여용 제형은 살균 및 비살균 수용액, 알코올과 같은 통상적인 용매의 비수용성 용액 또는 액체 또는 고체 오일 베이스에서의 핵산의 용액을 포함할 수 있다. 용액은 완충제, 희석제 및 기타 적당한 첨가제도 포함할 수도 있다. 핵산과 유해하게 반응하지 않는 비경구가 아닌 투여에 적당한 약학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 부형제가 이용될 수 있다.
적당한 약학적으로 허용 가능한 부형제는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 스테아르산 마그네슘, 활석, 규산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
기타 구성요소
본 발명의 조성물은 약학적 조성물에서 종래 발견되는 기타 부가 구성요소를 업계에 확립된 이용 수준에서 추가적으로 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 조성물은 예를 들면, 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 소염제와 같은 추가의 융합성인 약학적으로 활성인 물질을 포함할 수 있거나, 염료, 풍미제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 증점제 및 안정화제와 같이, 본 발명의 조성물의 다양한 제형을 물리적으로 제형하는데 유용한 추가적인 물질을 포함할 수 있다. 그러나, 그러한 물질은 첨가되는 경우, 본 발명의 조성물의 구성성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해해서는 안된다. 제형은 살균될 수 있으며, 원한다면, 제형의 핵산(들)과 유해하게 반응하지 않는, 예컨대, 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주기 위한 염, 완충제, 착색제, 풍미 및/또는 방향 물질 등과 같은 보조제와 혼합될 수 있다.
수용성 현탁액은 예를 들면, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 현탁액은 안정화제를 포함할 수도 있다.
일부 실시형태들에 있어서, 본 발명에서 특징된 약학적 조성물은 (a) 하나 이상의 dsRNA 화합물 및 (b) 비-RNAi 메커니즘에 의하여 기능하는 하나 이상의 항-시토킨 생물학적 작용제를 포함한다. 그러한 생물학적 작용제의 예는 IL1β(예컨대, 아나킨라), IL6(톡실리주맙) 또는 TNF(에타네르셉트, 인플리시맙, 아들리무맙 또는 세토리주맙)을 표적하는 생물학적 작용제를 포함한다.
그러한 화합물의 독성 및 치료학적 효능은 예컨대, LD50(개체군의 50%까지 치사하는 용량) 및 ED50(개체군의 50%에서 치료학적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해, 세포 배양 또는 실험 동물에 있어서 표준 약학적 절차에 의하여 결정될 수 있다. 독성 및 치료적 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50의 비율로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물이 바람직하다.
세포 배양 분석법 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 복용량의 범위를 인간용으로 제형하는데 이용될 수 있다. 본 발명에서 특징된 조성물의 투여량은 일반적으로 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 채용된 제형 및 활용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 발명에서 특징된 방법에 이용된 임의의 화합물에 대하여, 치료학적 유효 용량은 세포 배양 분석법으로부터 최초로 결정될 수 있다. 용량은, 상기 화합물의 순환 혈장 농도 범위, 또는 적절한 경우 세포 배양에서 결정된 바와 같이 IC50(즉, 증상의 절반-최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)를 포함하는 표적 서열의 폴리펩티드 생성물의 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록(예컨대, 감소된 농도의 폴리펩티드를 달성) 동물 모델 내에서 제형될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 더 정확하게 결정하는데 이용될 수 있다. 혈장 수준은 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의하여 측정될 수 있다.
상기에서 토의된 바와 같이, 이의 투여뿐만 아니라, 본 발명에서 특징된 dsRNA는 APOC3 발현에 의해 매개된 병적 과정의 치료에 효과적인 기타 알려진 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 좌우간, 투여하는 의사는 업계에 알려지거나 본원에 기술된 효능의 표준 척도를 이용하여 관찰된 결과에 기초하여 dsRNA 투여의 양 및 타이밍을 조정할 수 있다.
APOC3 유전자의 발현을 억제하는 방법
본 발명은 세포 내에서 APOC3 발현을 감소하고/하거나 억제하기 위해 본 발명의 dsRNA 및/또는 본 발명의 iRNA를 포함하는 조성물의 이용 방법도 제공한다. 상기 방법은 세포를 본 발명의 dsRNA와 접촉시키는 단계 및 APOC3 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 얻는데 충분한 시간 동안 세포를 유지하여, 세포 내에서 APOC3 유전자의 발현을 억제시키는 단계를 포함한다. 유전자 발현 감소는 업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 평가될 수 있다. 예를 들면, APOC3의 발현의 감소는 당업자에게 통상적인 방법, 예컨대, 노던 블랏팅, qRT-PCR을 이용하여 APOC3의 mRNA 발현 수준을 결정함으로써, 웨스턴 블랏팅, 면역학적 기법과 같은, 당업자에게 통상적인 방법을 이용하여 APOC3의 단백질 수준을 결정함으로써 및/또는 예컨대, 리포단백질리파아제(LPL) 및/또는 간 리파아제와 같이, 중성지방 수준과 연관된 하나 이상의 분자들, 또는 생체 내 세팅에서 중성지방 수준 그 자체에 영향을 주는 것과 같이, APOC3의 생물학적 활성을 결정함으로써 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 세포는 시험관 내 또는 생체 내로 접촉될 수 있다, 즉, 세포는 피검자의 내에 있을 수 있다.
본 발명의 방법을 이용한 치료에 적당한 세포는 APOC3 유전자를 발현하는 임의의 세포일 수 있다. 본 발명의 방법에서의 용도에 적당한 세포는 포유류 세포, 예컨대, (인간 세포 또는 비인간 영장류 세포, 예컨대, 원숭이 세포 또는 침팬지 세포와 같은) 영장류 세포, (소 세포, 돼지 세포, 낙타 세포, 라마 세포, 말 세포, 염소 세포, 토끼 세포, 양 세포, 햄스터, 기니 피그 세포, 고양이 세포, 개 세포, 생쥐 세포, 마우스 세포, 사자 세포, 호랑이 세포, 곰 세포 또는 버팔로 세포와 같은) 비영장류 세포, 조류 세포(예컨대, 오리 세포 또는 거위 세포) 또는 고래 세포일 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 인간 세포, 예컨대, 인간 간 세포이다.
APOC3 발현은 세포 내에서 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 약 100% 정도 억제된다.
본 발명의 생체 내 방법은 dsRNA를 포함하는 조성물을 피검자에게 투여하되, dsRNA는 치료받는 포유류의 APOC3 유전자의 RNA 전사물의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단계를 포함할 수 있다. 치료받는 유기체가 인간과 같은 포유류인 경우, 조성물을 두개 내(예컨대, 뇌실 내, 뇌실질 내 및 척수강 내), 정맥 내, 근육 내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 비강, 직장 및 (볼 및 설하를 포함하여) 국소 투여를 포함하여, 경구, 복막 내 또는 비경구 경로를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는, 업계에 알려진 임의의 수단에 의하여 투여될 수 있다. 특정 실시형태들에 있어서, 조성물은 정맥 내 주입 또는 주사 또는 피하 주사에 의하여 투여된다.
일부 실시형태들에 있어서, 투여는 데포 주사를 통한 것이다. 데포 주사는 오랜 시간에 걸쳐서 일관된 방식으로 dsRNA를 방출할 수 있다. 따라서, 데포 주사는 소기의 효과, 예컨대, APOC3의 소기의 억제 또는 치료적 또는 예방적 효과를 얻는데 필요한 용량 투입의 횟수를 감소시킬 수 있다. 데포 주사는 더 일관적인 혈청 농도를 제공할 수도 있다. 데포 주사는 피하 주사 또는 근육 내 주사를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태들에 있어서, 데포 주사는 피하 주사이다.
일부 실시형태들에 있어서, 투여는 펌프를 통한 것이다. 펌프는 외부 펌프 또는 외과적으로 이식된 펌프일 수 있다. 특정 실시형태들에 있어서, 펌프는 피하로 이식된 삼투 펌프이다. 기타 실시형태들에 있어서, 펌프는 주입 펌프이다. 주입 펌프는 정맥 내, 피하, 동맥 또는 경막외 주입용으로 이용될 수 있다. 바람직한 실시형태들에 있어서, 주입 펌프는 피하 주입 펌프이다. 기타 실시형태들에 있어서, 펌프는 dsRNA를 간에 전달하는 외과적으로 이식된 펌프이다.
투여의 방식은 국소 또는 전신 치료를 원하는지의 여부에 기초하여 그리고 치료되는 부분에 기초하여 선택될 수 있다. 투여 경로 및 부위는 표적하는 것을 향상시키기 위해 선택될 수 있다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 포유류 내에서 APOC3 유전자의 발현을 억제하는 방법도 제공한다. 상기 방법은 포유류의 세포 내에서 APOC3 유전자를 표적하는 dsRNA를 포함하는 조성물을 포유류에 투여하는 단계 및 APOC3 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 얻는데 충분한 시간 동안 포유류를 유지시켜, 세포 내에서 APOC3 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다. 유전자 발현의 감소는 업계에 알려진 임의의 방법 및 본원에 기술된 방법, 예컨대, qRT-PCR에 의하여 평가될 수 있다. 단밸질 생성의 감소는 업계에 알려진 임의의 방법 및 본원에 기술된 방법, 예컨대, ELISA에 의하여 평가될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 세공(puncture) 간 생검 표본은 APOC3 유전자 및/또는 단백질 발현 감소를 모니터링하기 위한 조직 물질로서 작용한다. 다른 실시형태들에 있어서, APOC3 유전자의 발현 억제는 예를 들면, APOC3 경로에서 유전자의 발현 및/또는 활성을 측정함으로써 간접적으로 모니터링된다. 예를 들면, 리포단백질리파아제(LPL) 또는 간 리파아제의 활성은 APOC3 유전자의 발현의 억제를 결정하기 위해 모니터링될 수 있다. 표본, 예컨대, 혈액 또는 간 표본 내에서 중성지방 수준도 측정될 수 있다. APOC3 발현의 억제는 고도 중성지방 수준의 임상적 제시에 미치는 영향, 예컨대, 조기(premature) 만성 심장 질병(CHD), 발진 황색종, 간비장비대 및 췌장염에 미치는 영향을 관찰함으로써 모니터링될 수도 있다. 적당한 분석법은 하기 실시예 섹션에 더 기술되어 있다.
본 발명은 이를 필요로 하는 피검자의 치료 방법을 더 제공한다. 본 발명의 치료 방법은 본 발명의 dsRNA를 피검자, 예컨대, APOC3 발현의 감소 및/또는 억제로 이득을 보게 되는 피검자에게 APOC3 유전자를 표적하는 dsRNA 또는 APOC3 유전자를 표적하는 dsRNA를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 dsRNA는 “드러난(naked)”형태 또는 “유리 dsRNA”로서 투여될 수 있다. 드러난 dsRNA는 약학적 조성물의 부재 하에서 투여된다. 드러난 dsRNA는 적당한 완충제 용액 내에 있을 수 있다. 완충제 용액은 아세트산염, 시트르산염, 프롤라민, 탄산염 또는 인산염, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 완충제 용액은 인산염 완충 식염수(PBS)이다. dsRNA를 포함하는 완충제 용액의 pH 및 오스몰농도는 피검자에게 투여하는 것이 적합하도록 조정될 수 있다. 추가적인 완충제는 상기에 기술되어 있다.
대안적으로, 본 발명의 dsRNA는 dsRNA 리포솜 제형과 같이 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 추가적인 리포솜 제형은 본원에 기술되어 있다.
APOC3 유전자 발현의 감소 및/또는 억제로 이득을 보게 되는 피검자는 고도 중성지방 수준, 예컨대, TG > 150 mg/dL을 갖는 피검자 또는 심각한 고중성지방혈증, 예컨대, TG > 500 mg/dL을 갖는 피검자이다. 일 실시형태에 있어서, 피검자는 기능 획득 돌연변이를 갖는 APOC3 유전자 변이체를 갖는다. 다른 실시형태들에 있어서, 환자는 혼합된 HTG(V 형) 감소된 LPL 활성 및/또는LPL 돌연변이를 비활성화하는 유전적인(familial) HTG(IV) 및/또는 유전적인 조합된 증가된 ApoB-100 수준을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 피검자는 급성 췌장염을 갖는 조절되지 않은 고중성지방혈증을 갖거나, 피검자는 치료중인 HIV 환자이거나 피검자는 높은 지방 식이요법(식이후 고중성지방혈증) 또는 대사 증후군 또는 화합물 치료(레티노이드 요법) 또는 인슐린 내성을 갖는다. APOC3 유전자 발현의 감소 및/또는 억제로 이득을 보게 되는 피검자의 치료는 치료적 및 예방적 치료를 포함한다.
본 발명은 dsRNA 또는 그 약학적 조성물을, 예컨대, APOC3 발현의 감소 및/또는 억제로 이득을 보게 되는 피검자, 예컨대, 고도 중성지방 수준을 갖는 피검자를 치료하기 위하여, 다른 치료제 및/또는 다른 치료 방법, 예를 들면, 고도 중성지방 수준을 치료하기 위해 현재 채용된 것과 같은 예컨대, 알려진 치료제 및/또는 알려진 치료 방법과 병용하는 방법을 더 제공한다. 예를 들면, 특정 실시형태들에 있어서, APOC3을 표적하는 dsRNA는 예컨대, 고도 중성지방 수준을 치료하는데 유용한 작용제와 조합하여 투여된다. 예를 들면, APOC3 발현의 감소로 이득을 보게 되는 피검자, 예컨대, 고도 중성지방 수준을 갖는 피검자를 치료하는데 적당한 추가적인 치료제 및 치료 방법은 생활습관 및 식이요법 변화, 의약품 등급 생선 오일, 피브레이트, 나이아신, ApoC3 안티센스, CETP 억제제, 담즙산 수지(bile acid sequestrants), 니코틴산, HMG CoA 환원효소 억제제, 겜피브로질, 페노피브레이트, 콜레스테롤 흡수 억제제, 네오마이신, 오메가 3 지방산 등을 포함한다. dsRNA 및 추가적인 치료제 및/또는 치료는 동시에 및/또는 동일한 조합으로, 예컨대, 비경구적으로 투여될 수 있거나, 추가적인 치료제는 개별 조성물의 일부로서 또는 개별 시간에 그리고/또는 업계에 알려지거나 본원에 기술된 다른 방법에 의하여 투여될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 표적 APOC3 유전자의 발현이 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18 또는 24 시간 또는 28, 32 또는 36 시간 동안 감소되도록 본원에 특징된 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 표적 APOC3 유전자의 발현은 장기의 기간 동안, 예컨대, 적어도 약 2, 3, 4 일 이상, 예컨대, 약 1 주, 2 주, 3 주 또는 4 주 이상 동안 감소된다.
본 발명의 방법에 따른 dsRNA의 투여로 인해 고도 중성지방 수준을 갖는 환자에게서 그러한 질병 또는 질환의 중증도, 신호, 증상 및/또는 마커가 감소할 수 있다. 이 맥락에서 “감소”라고 함은 그러한 수준에서 통계적으로 유의한 감소를 의미한다. 감소는 예를 들면, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 약 100%일 수 있다.
질병의 치료 또는 방지의 효능은 예를 들면, 질병 진행, 질병 회복, 증상 중증도, 삶의 질, 치료 효과 지속에 필요한 약제의 용량, 질병 마커의 수준 또는 치료중이거나 방지를 위해 표적된 주어진 질병에 적절한 임의의 다른 측정가능한 매개 변수를 측정함으로써 평가될 수 있다. 그러한 매개변수들 중 어느 하나 또는 매개변수들의 임의의 조합을 측정함으로써 치료 또는 방지의 효능을 모니터링하는 것은 충분히 당업자의 능력 내에 있다. 예를 들면, 고도 중성지방 수준의 치료 효능은 예를 들면, 혈청 중성지방 수준의 정기적 측정에 의하여 평가될 수 있다. 최초 값 판독과 나중 값 판독 비교는 의사에게 치료가 효과적인지의 여부에 대한 지시를 제공한다. 그러한 매개변수들 중 어느 하나 또는 매개변수들의 임의의 조합을 측정함으로써 치료 또는 방지의 효능을 모니터링하는 것은 충분히 당업자의 능력 내에 있다. APOC3을 표적하는 dsRNA 또는 그 약학적 조성물의 투여와 관련하여, 고도 중성지방 수준에 “대하여 효과적인”은 임상적으로 적절한 방식으로 투여하게 되면 증상의 개선, 치유, 질병의 감소, 생명의 연장, 삶의 질의 개선 또는 고도 중성지방 수준 및 이와 관련된 원인에 익숙한 의사에 의하여 일반적으로 긍정적이라고 인정되는 다른 효과와 같은, 적어도 통계적으로 유의한 부분의 환자에 대하여 유익한 효과가 생긴다는 것을 나타낸다.
치료 또는 방지 효과는 질병 상태의 하나 이상의 매개변수들에 있어서 통계적으로 유의한 개선이 있는 경우이거나, 달리 예상되는 증상을 악화시키거나 진전시키지 않는 것에 의해 명백해진다. 일례로, 질병의 측정가능한 매개변수에 있어서 적어도 10%의 바람직한 변화 및 바람직하게는, 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 이상은 효과적인 치료를 나타낼 수 있다. 주어진 dsRNA 약물 또는 그러한 약물의 제형에 대한 효능은 업계에 알려진 바와 같이 주어진 질병에 대하여 실험적 동물 모델을 이용하여 판단될 수도 있다. 실험적 동물 모델을 이용하는 경우, 치료의 효능은 마커 또는 증상에 있어서 통계적으로 유의한 감소가 관찰되는 경우 입증된다.
대안적으로, 효능은 임상적으로 받아들여지는 질병 중증도 등급 스케일에 기초하여 진단의 당업자에 의하여 결정된 바와 같지만, 일례로 차일드-푸(Child-Pugh) 스코어(때때로 차일드-투르콧-푸(Child-Turcotte-Pugh) 스코어)로서 질병의 중증도의 감소에 의하여 측정될 수 있다. 예컨대, 적절한 스케일을 이용하여 측정된 질병의 중증도의 경감을 일어나게 하는 임의의 긍정적인 변화는 본원에 기술된 바와 같이 dsRNA 또는 dsRNA 제형을 이용한 적절한 치료를 나타낸다.
피검자는 치료량의 dsRNA, 예컨대 약 0.01 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.55 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.65 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.75 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.85 mg/kg, 0.9 mg/kg, 0.95 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.1mg/kg, 2.2mg/kg, 2.3 mg/kg, 2.4 mg/kg, 2.5 mg/kg dsRNA, 2.6 mg/kg dsRNA, 2.7 mg/kg dsRNA, 2.8 mg/kg dsRNA, 2.9 mg/kg dsRNA, 3.0 mg/kg dsRNA, 3.1 mg/kg dsRNA, 3.2 mg/kg dsRNA, 3.3 mg/kg dsRNA, 3.4 mg/kg dsRNA, 3.5 mg/kg dsRNA, 3.6 mg/kg dsRNA, 3.7 mg/kg dsRNA, 3.8 mg/kg dsRNA, 3.9 mg/kg dsRNA, 4.0 mg/kg dsRNA, 4.1 mg/kg dsRNA, 4.2 mg/kg dsRNA, 4.3 mg/kg dsRNA, 4.4 mg/kg dsRNA, 4.5 mg/kg dsRNA, 4.6 mg/kg dsRNA, 4.7 mg/kg dsRNA, 4.8 mg/kg dsRNA, 4.9 mg/kg dsRNA, 5.0 mg/kg dsRNA, 5.1 mg/kg dsRNA, 5.2 mg/kg dsRNA, 5.3 mg/kg dsRNA, 5.4 mg/kg dsRNA, 5.5 mg/kg dsRNA, 5.6 mg/kg dsRNA, 5.7 mg/kg dsRNA, 5.8 mg/kg dsRNA, 5.9 mg/kg dsRNA, 6.0 mg/kg dsRNA, 6.1 mg/kg dsRNA, 6.2 mg/kg dsRNA, 6.3 mg/kg dsRNA, 6.4 mg/kg dsRNA, 6.5 mg/kg dsRNA, 6.6 mg/kg dsRNA, 6.7 mg/kg dsRNA, 6.8 mg/kg dsRNA, 6.9 mg/kg dsRNA, 7.0 mg/kg dsRNA, 7.1 mg/kg dsRNA, 7.2 mg/kg dsRNA, 7.3 mg/kg dsRNA, 7.4 mg/kg dsRNA, 7.5 mg/kg dsRNA, 7.6 mg/kg dsRNA, 7.7 mg/kg dsRNA, 7.8 mg/kg dsRNA, 7.9 mg/kg dsRNA, 8.0 mg/kg dsRNA, 8.1 mg/kg dsRNA, 8.2 mg/kg dsRNA, 8.3 mg/kg dsRNA, 8.4 mg/kg dsRNA, 8.5 mg/kg dsRNA, 8.6 mg/kg dsRNA, 8.7 mg/kg dsRNA, 8.8 mg/kg dsRNA, 8.9 mg/kg dsRNA, 9.0 mg/kg dsRNA, 9.1 mg/kg dsRNA, 9.2 mg/kg dsRNA, 9.3 mg/kg dsRNA, 9.4 mg/kg dsRNA, 9.5 mg/kg dsRNA, 9.6 mg/kg dsRNA, 9.7 mg/kg dsRNA, 9.8 mg/kg dsRNA, 9.9 mg/kg dsRNA, 9.0 mg/kg dsRNA, 10 mg/kg dsRNA, 15 mg/kg dsRNA, 20 mg/kg dsRNA, 25 mg/kg dsRNA, 30 mg/kg dsRNA, 35 mg/kg dsRNA, 40 mg/kg dsRNA, 45 mg/kg dsRNA, 또는 약 50 mg/kg dsRNA를 투여받을 수 있다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도될 수도 있다.
특정 실시형태들에 있어서, 예를 들면, 본 발명의 조성물이 본원에 기술된 바와 같이 dsRNA 및 지질을 포함하는 경우, 피검자는 치료량의 dsRNA, 예컨대 약 0.01 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.2 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.2 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.4 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.4 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 1.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 2.5 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 3.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 4.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 4.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 5.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 6 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 6.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 7 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 7.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 8 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 8.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 9 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 9.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg를 투여받을 수 있다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도될 수도 있다.
예를 들면, dsRNA는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 또는 약 10 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도될 수도 있다.
다른 실시형태들에 있어서, 예를 들면, 본 발명의 조성물이 본원에 기술된 바와 같이 dsRNA 및 N-아세틸갈락토사민을 포함하는 경우, 피검자는 치료량의dsRNA, 예컨대 약 0.1 내지 약 50 mg/kg, 약 0.25 내지 약 50 mg/kg, 약 0.5 내지 약 50 mg/kg, 약 0.75 내지 약 50 mg/kg, 약 1 내지 약 50 mg/mg, 약 1.5 내지 약 50 mg/kb, 약 2 내지 약 50 mg/kg, 약 2.5 내지 약 50 mg/kg, 약 3 내지 약 50 mg/kg, 약 3.5 내지 약 50 mg/kg, 약 4 내지 약 50 mg/kg, 약 4.5 내지 약 50 mg/kg, 약 5 내지 약 50 mg/kg, 약 7.5 내지 약 50 mg/kg, 약 10 내지 약 50 mg/kg, 약 15 내지 약 50 mg/kg, 약 20 내지 약 50 mg/kg, 약 20 내지 약 50 mg/kg, 약 25 내지 약 50 mg/kg, 약 25 내지 약 50 mg/kg, 약 30 내지 약 50 mg/kg, 약 35 내지 약 50 mg/kg, 약 40 내지 약 50 mg/kg, 약 45 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 내지 약 45 mg/kg, 약 0.25 내지 약 45 mg/kg, 약 0.5 내지 약 45 mg/kg, 약 0.75 내지 약 45 mg/kg, 약 1 내지 약 45 mg/mg, 약 1.5 내지 약 45 mg/kb, 약 2 내지 약 45 mg/kg, 약 2.5 내지 약 45 mg/kg, 약 3 내지 약 45 mg/kg, 약 3.5 내지 약 45 mg/kg, 약 4 내지 약 45 mg/kg, 약 4.5 내지 약 45 mg/kg, 약 5 내지 약 45 mg/kg, 약 7.5 내지 약 45 mg/kg, 약 10 내지 약 45 mg/kg, 약 15 내지 약 45 mg/kg, 약 20 내지 약 45 mg/kg, 약 20 내지 약 45 mg/kg, 약 25 내지 약 45 mg/kg, 약 25 내지 약 45 mg/kg, 약 30 내지 약 45 mg/kg, 약 35 내지 약 45 mg/kg, 약 40 내지 약 45 mg/kg, 약 0.1 내지 약 40 mg/kg, 약 0.25 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 내지 약 40 mg/kg, 약 0.75 내지 약 40 mg/kg, 약 1 내지 약 40 mg/mg, 약 1.5 내지 약 40 mg/kb, 약 2 내지 약 40 mg/kg, 약 2.5 내지 약 40 mg/kg, 약 3 내지 약 40 mg/kg, 약 3.5 내지 약 40 mg/kg, 약 4 내지 약 40 mg/kg, 약 4.5 내지 약 40 mg/kg, 약 5 내지 약 40 mg/kg, 약 7.5 내지 약 40 mg/kg, 약 10 내지 약 40 mg/kg, 약 15 내지 약 40 mg/kg, 약 20 to 약 40 mg/kg, 약 20 내지 약 40 mg/kg, 약 25 내지 약 40 mg/kg, 약 25 내지 약 40 mg/kg, 약 30 내지 약 40 mg/kg, 약 35 내지 약 40 mg/kg, 약 0.1 내지 약 30 mg/kg, 약 0.25 내지 약 30 mg/kg, 약 0.5 내지 약 30 mg/kg, 약 0.75 내지 약 30 mg/kg, 약 1 내지 약 30 mg/mg, 약 1.5 내지 약 30 mg/kb, 약 2 내지 약 30 mg/kg, 약 2.5 내지 약 30 mg/kg, 약 3 내지 약 30 mg/kg, 약 3.5 내지 약 30 mg/kg, 약 4 내지 약 30 mg/kg, 약 4.5 내지 약 30 mg/kg, 약 5 내지 약 30 mg/kg, 약 7.5 내지 약 30 mg/kg, 약 10 내지 약 30 mg/kg, 약 15 내지 약 30 mg/kg, 약 20 내지 약 30 mg/kg, 약 20 내지 약 30 mg/kg, 약 25 내지 약 30 mg/kg, 약 0.1 내지 약 20 mg/kg, 약 0.25 내지 약 20 mg/kg, 약 0.5 내지 약 20 mg/kg, 약 0.75 내지 약 20 mg/kg, 약 1 내지 약 20 mg/mg, 약 1.5 내지 약 20 mg/kb, 약 2 내지 약 20 mg/kg, 약 2.5 내지 약 20 mg/kg, 약 3 내지 약 20 mg/kg, 약 3.5 내지 약 20 mg/kg, 약 4 내지 약 20 mg/kg, 약 4.5 내지 약 20 mg/kg, 약 5 내지 약 20 mg/kg, 약 7.5 내지 약 20 mg/kg, 약 10 내지 약 20 mg/kg, 또는 약 15 내지 약 20 mg/kg의 용량을 투여받을 수 있다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도될 수도 있다.
예를 들면, 피검자는 치료량의dsRNA, 예컨대 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 약 50 mg/kg을 투여받을 수 있다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도될 수도 있다.
dsRNA는 일정 기간에 걸쳐, 예컨대 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 약 25 분에 걸쳐서 정맥 내 주입에 의해 투여될 수 있다. 투여는 규칙적으로 예를 들면, 한달, 두달, 세달, 네달 이상 동안에 격주로(즉, 매 2 주) 반복될 수 있다. 최초 치료 요양법 이후에, 치료는 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 예를 들면, 세달 동안 격주로 투여한 이후에, 투여는 여섯달 또는 1년 이상 동안 한달에 1회 반복될 수 있다. dsRNA의 투여로 인해 예컨대, 환자의 세포, 조직, 혈액, 소변 또는 다른 격실 내에서 APOC3 수준이 적어도 약 5%, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 39, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 적어도 약 99% 이상 감소할 수 있다.
dsRNA의 전체 용량을 투여하기 이전에, 환자는 5% 주입 반응과 같이 더 적은 용량을 투여받을 수 있으며, 알레르기 반응과 같은 불리한 효과에 대하여 모니터링될 수 있다. 다른 예에 있어서, 환자는 증가된 시토킨(예컨대, TNF-알파 또는 INF-알파) 수준과 같이 원하지 않는 면역자극 효과에 대하여 모니터링될 수 있다.
APOC3 발현에 미치는 억제 효과로 인하여, 본 발명에 따른 조성물 또는 이로부터 제조된 약학적 조성물은 삶의 질을 향상시킬 수 있다.
달리 정의되지 않으면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 방법 및 물질과 유사하거나 균등한 방법 및 물질이 본 발명에 특징된 dsRNA 및 방법의 실제 또는 시험에 이용될 수 있다고 하더라도, 적당한 방법 및 물질은 하기에 기술되어 있다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참조로 포함된다. 갈등이 있는 경우, 정의를 포함하여, 본 명세서가 우세할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시적인 것일 뿐이며 한정되는 의도는 아니다.
실시예
실시예 1. dsRNA 합성
시약의 원천
시약의 원천이 본원에서 구체적으로 주어지지 않은 경우에, 그러한 시약은 분자 생물학에서 응용을 위해 품질/순도 표준으로 분자 생물학에 대한 시약의 임의의 공급자로부터 얻을 수 있다.
siRNA 합성
단일 가닥 RNA는 Expedite 8909 합성기(Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, 다름스타트, 독일) 및 고체 지지체로서 제어 기공 유리(CPG, 500 Å, Proligo Biochemie GmbH, 함부르크, 독일)을 이용하여 1 μmole의 스케일로 고상(solid phase) 합성에 의하여 생성되었다. RNA 및 2'-O-메틸 뉴클레아제를 포함하는 RNA는 이에 상당하는 포스포아미다이트 및 2'-O-메틸 포스포아미다이트를 각각 채용하는 고상 합성에 의하여 생성되었다(Proligo Biochemie GmbH, 함부르크, 독일). 이러한 빌딩 블록은 핵산 화학에서 현행 프로토콜에서 기술된 바와 같이 표준 뉴클레오시드 포스포아미다이트 화학을 이용하여 올리고리보뉴클레오티드 사슬의 서열 내에서 선택된 부위에 포함되었다, Beaucage, S.L. 등(Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA. 포스포로티오에이트 연결은 요오드 산화제 용액을 아세토니트릴(1%) 내에서 Beaucage 시약(Chruachem 사, 글래스고우, 영국)의 용액으로 대체함으로써 도입되었다. 다른 보조 시약을 Mallinckrodt Baker(그리에샤임, 독일)로부터 구입하였다.
정제되지 않은 올리고리보뉴클레오티드의 음이온 교환 HPLC에 의한 탈보호 및 정제는 확립된 절차에 따라 수행되었다. 수율 및 농도는 분광 광도계(DU 640B, Beckman Coulter GmbH, 운터쉴레이스하임, 독일)을 이용하여 260 nm의 파장에서 각각의 RNA의 용액을 UV 흡수하여 결정되었다. 이중 가닥 RNA는 어닐링 완충제에 상보적 가닥의 등분자 용액을 혼합함으로써 생성되었고(20 mM 인산나트륨, pH 6.8; 100 mM 염화나트륨), 85℃ 내지 90℃의 수조 내에서 3 분 동안 가열되었으며, 3 내지 4 시간의 기간에 걸쳐서 실온으로 냉각되었다. 어닐링된 RNA 용액은 사용할 때까지 -20℃에서 저장되었다.
핵산 서열은 표준 명명법 및 구체적으로는 표 B의 약어를 이용하여 하기에 제시되어 있다.
[표 B]
약어
실시예 2: APOC3 siRNA 설계
전사물
siRNA 설계를 수행하여 NCBI 유전자 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)에 주석을 단 모든 인간 및 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스; 여기서는 “시노”) APOC3 전사물들을 표적하는 siRNA를 동정하였다. 설계에는 NCBI: 인간 - NM_000040.1; 시노 - X68359.1로부터 하기 전사물들을 이용하였다. 열거된 인간 및 시노 전사물들로 100% 동정을 공유하는 모든 siRNA 듀플렉스들을 설계하였다.
siRNA 설계, 특이성 및 효능 예측
*siRNA는 예측된 특이성, 예측된 효능 및 GC 함량에 기초하여 선택되었다.
모든 가능한 19량체들의 예측된 특이성은 각각의 서열로부터 예측되었다. 이후, 7개의 뉴클레오티드 보다 더 긴 반복이 부족한 후보 19량체를 선택하였다. 이 171 개 후보 siRNA는 인간 전사체(인간 NCBI Refeq 집합 내에서 NM_ 및 XM_ 기록들의 집합으로 정의됨)에 대한 광범위한 검색에 있어서 이용되었다.
스코어는 siRNA 및 임의의 잠재적인 '비표적(off-target)' 전사물 사이의 미스매치들의 위치 및 숫자에 기초하고 각각의 올리고의 3 개의 다른, 시드(분자의 5' 말단으로부터 2 내지 9 위치)-유래 6량체로부터 유래된 7량체 및 8량체의 횟수를 비교함으로써 계산되었다. siRNA 양쪽 가닥을 계산된 스코어들에 따라 특이성의 범주에 할당되었다: 3을 초과하는 스코어는 고도로 특이적인 것으로, 3과 동일한 스코어는 특이적인 것 및 2.2에서 2.8 사이의 스코어는 적당히 특이적인 것으로 한다. 본 발명자들은 안티센스 가닥의 특이성으로 분류하였다. 이후, 본 발명자들은 안티센스 올리고들이 전체 GC 함량의 70% 미만을 갖고, 제1 위치에서 GC가 결여되며 마우스 APOC3 전사물 NM_023114.3과 부합하지 않는 듀플렉스들을 선택하였다.
siRNA 서열 선택
총 27 개 센스 및 27 개 안티센트 유래된 siRNA 올리고들이 합성되었으며 듀플렉스들로 형성되었다.
실시예 3. APOC3 siRNA 합성
변형 및 비변형 ApoC3 서열들의 합성
APOC3라 칭하는 서열들은 MerMade 192 합성기상에서 1 또는 0.2 umol 스케일로 합성되었다.
단일 가닥 및 듀플렉스를 비변형된 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 화학 변형으로 제작하였다. 합성 조건은 단일 가닥에서 화학적 변형의 성질에 기초하여 적절히 변형되었다.
합성, 절단 및 탈보호:
APOC3 서열들(비변형, 2-O-메틸 또는 2'-플루오로)의 합성은 포스포아미다이트 화학을 이용한 고체 지지된 올리고뉴클레오티드 합성을 이용하였다.
상기 서열들의 합성은 96 웰 플레이트들에서 1 또는 0.2 um 스케일에서 수행되었다. 비변형 및 변형된 (2-O-메틸 또는 2'-플루오로) 아미다이트 용액은 0.1 M 농도에서 제조되었으며, 에틸티오 테트라졸(아세토니트릴에서 0.6 M)을 활성화제로서 이용하였다.
합성된 서열들은 제1 단계에서 수용성 암모니아 또는 수용성 메틸아민 및 제2 단계에서 플루오르화물 시약을 이용하여 96 웰 플레이트들에서 절단되고 탈보호되었다. 정제되지 않은 서열들은 아세톤:에탄올(80:20) 믹스를 이용하여 침전되었으며, 펠릿은 0.2 M 아세트산 나트륨 완충제에서 재-현탁되어 정제되지 않은 단일 가닥을 이의 나트륨 염으로 변환하였다. 각각의 서열로부터 표본을 동정, 정량화를 위한 UV를 확인하는 LC-MS에 의해 그리고 순도를 결정하는 IEX 크로마토그래피에 의하여 분석하였다.
정제 및 탈염:
APOC3라 칭하는 서열들이 침전되었고 세파덱스(Sephadex) 칼럼을 이용하여 AKTA 정제기 시스템상에서 정제되었다. 공정은 주위 온도에서 수행되었다. 표본 주사 및 수집은 96 웰(1.8 mL -깊이 웰) 플레이트들에서 수행되었다. 전장 서열에 상응하는 단일 피크는 용리제 내에서 수집되었다. 탈염된 APOC3 서열들은 농도(A260에서 UV 측정에 의함) 및 순도(이온 교환 HPLC에 의함)가 분석되었다. 이후, 상보적 단일 가닥들은 1:1 화학양론비로 조합되어 siRNA 듀플렉스들을 형성하였다.
표 1 및 2는 비변형 및 변형 서열들의 제1 집합을 제공한다.
실시예 4. APOC3 siRNA 시험관 내 스크리닝
세포 배양 및 전달감염:
Hep3B 세포(ATCC, 머내서스, 버지니아)는 트립신처리에 의하여 플레이트로부터 방출되기 전에 10% FBS, 스트렙토마이신 및 글루타민(ATCC)로 보충된 RPMI(ATCC) 내에서 5% CO2의 대기의 37℃에서 컨플루언스(confluence) 근처까지 성장되었다. 전달감염은 웰(Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150)당 리포펙타민 RNAiMax 0.2 ㎕ 더하여 Opti-MEM 14.8 ㎕을 96-웰 플레이트에 웰당 siRNA 듀플렉스 5 ㎕에 첨가하여 수행되었으며, 실온에서 15 분 동안 배양되었다. 이후, ~2 x104 Hep3B 세포를 포함하는 항생제 없는 완전 성장 배지 80 ㎕가 siRNA 혼합물에 첨가되었다. 세포는 RNA 정제를 수행하기 이전에 24 시간 또는 120 시간 동안 배양되었다. 단일 용량 실험은 10 nM 및 0.1 nM 최종 듀플렉스 농도에서 수행되었으며, 용량 응답 실험은 10, 1, 0.5, 0.1,0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 0.00001 nM 최종 듀플렉스 농도에서 수행되었다.
DYNABEADS mRNA 분리 키트(Invitrogen, 부품 번호: 610-12)를 이용한 총 RNA 분리:
세포는 용해/결합 완충제150 ㎕내에서 수거되고 용해되었으며, 이후 에펜도르프 열믹서(혼합 속도는 공정 내내 동일하였다)를 이용하여 850 rpm으로 5 분 동안 혼합되었다. 자기 비드 10 마이크로미터 및 80 ㎕ 용해/결합 완충제 혼합물은 원형 바닥 플레이트에 첨가되고 1 분 동안 혼합되었다. 자기 스탠드를 이용하여 자기 비드가 포획되고, 비드를 흐트리지 않으면서 상청액은 제거되었다. 상청액을 제거한 이후에, 용해된 세포는 남아있는 비드에 첨가되고 5 분 동안 혼합되었다. 상청액을 제거한 이후에, 자기 비드는 150 ㎕ 세척 완충제 A로 2 회 세척되었으며 1 분 동안 혼합되었다. 비드는 다시 포획되고 상청액은 제거되었다. 이후, 비드는 150 ㎕ 세척 완충제 B로 세척되고, 포획되었으며, 상청액은 제거되었다. 다음으로, 비드는 150 ㎕ 용리 완충제로 세척되고, 포획되었으며, 상청액은 제거되었다. 비드는 2 분 동안 건조되도록 하였다. 건조 이후에, 용리 완충제 50 ㎕가 첨가되고 70℃에서 5 분 동안 혼합되었다. 비드는 자석상에서 5 분 동안 포획되었다. 상청액 40 ㎕가 제거되고, 다른 96 웰 플레이트에 첨가되었다.
ABI 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, 포스터 시티, 캘리포니아, Cat #4368813)을 이용한 cDNA 합성
반응당 2 ㎕ 10X 완충제, 0.8 ㎕ 25X dNTPs, 2 ㎕ 랜덤 프라이머, 1 ㎕ 역전사효소, 1 ㎕ RNase 억제제 및 H2O 3.2 ㎕의 마스터 믹스는 10 ㎕ 총 RNA에 첨가되었다. cDNA는 하기 단계들을 통해 Bio-Rad C-1000 또는 S-1000 열 사이클러(허큘레스, 캘리포니아)를 이용하여 생성되었다: 25℃ 10 분, 37℃ 120 분, 85℃ 5 초, 4℃ 유지
실시간 PCR:
cDNA 2 ㎕는 384 웰 50 플레이트들(Roche cat # 04887301001) 내에서 웰당 0.5 ㎕ GAPDH TaqMan 탐침(Applied Biosystems Cat #4326317E), 0.5 ㎕ ApoC3 TaqMan 탐침(Applied Biosystems cat # Hs00163644_m1) 및 5 ㎕ 라이트사이클러 480 탐침 마스터 믹스(Roche Cat #04887301001)를 포함하는 마스터 믹스에 첨가되었다. 실시간 PCR은 ΔΔCt(RQ) 분석법을 이용하는 ABI 7900HT 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems) 내에서 수행되었다. 요약 표들에서 달리 표시되지 않으면, 각각의 듀플렉스는 2 가지 독립된 전달감염에서 시험되었으며, 각각의 전달감염은 2벌로 분석되었다.
상대적 배수 변화를 계산하기 위하여, 실시간 데이터는 ΔΔCt 방법을 이용하여 분석되었으며 10 nM AD-1955로 전달감염된 세포 또는 모의 전달감염된 세포로 수행된 분석법에 정규화되었다. IC50은 XLFit를 이용한 4 매개변수 피팅 모델을 이용하여 계산되었으며, 동일한 용량 범위에 걸쳐서 또는 그 자신의 최저 용량으로 AD-1955로 전달감염된 세포 또는 미접촉 세포로 정규화되었다.
생존도 스크린
세포 생존도는 100, 10, 1, 0.1, 0.01 및 0.0001 nM siRNA로 전달감염한 이후에 HeLa 및 Hep3B 세포에서 3 일 및 5 일에 측정되었다. 세포는 96 웰 플레이트들 내에서 웰당 10,000 세포의 밀도로 플레이트되었다. 각각의 siRNA는 3 벌로 분석되었으며 데이터는 평균되었다. PLK1 및 AD-19200을 표적하는 siRNA는 생존도 손실에 대한 양성 대조군으로서 포함되었으며, AD-1955는 음성 대조군으로 포함되었다. PLK1 및 AD-19200는 생존도의 용량 의존 손실로 이어진다. 생존도를 측정하기 위하여, 세포 타이터 블루(Promega) 20 ul은 3 일 및 5 일 이후에 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가되었으며, 37℃에서 2 시간 동안 배양되었다. 이후, 플레이트는 분광광도계(Molecular Devices)에서 560Ex/590Em에서 판독되었다. 생존도는 3 개 복제 전달감염 +/- 표준 편차로부터 광 단위의 평균값으로 표현되었다. 일부 경우들에 있어서, 상대 생존도는 우선 3 개 복제 전달감염을 평균하고 이후 최저 용량(0.001 nM)으로부터 얻은 값으로 정규화함으로써 분석되었다.
결과는 표 3, 4 및 5에 제공된다.
실시예 5: 쥐들에서 APOC3 생체 내 시험
APOC3을 표적하는 siRNA는 야생형(5.0 mg/kg) 및 유전자이식 과지방혈증 모델 SREBPtg/LDLR-/- KO 쥐들(1.0 mg/kg)인 쥐들에게 투여되었다. 쥐들은 투여 2 일 후에 희생되었으며, 간 표적 mRNA, 혈청 중성지방 및 혈청 총 콜레스테롤 수준이 결정되었다. LNp11 제형을 포함하는 MC3이 이용되었다.
야생형 쥐들에 대한 결과는 도 1에 나타나 있다. APOC3을 표적하는 siRNA의 투여는 야생형 쥐들에서 mRNA 수준에서 녹다운, 중성지방의 50% 감소 및 총 콜레스테롤의 감소로 이어졌다. APOC3를 표적하는 siRNA의 투여로 인해 과지방혈증 모델 쥐들에서 중성지방이 80% 감소하였다, 데이터 미도시. 결과는 APOC3은 관상 동맥성 심장 질환(CAD) 및 췌장염을 포함하는 과지방혈증의 siRNA 계 치료에 대한 입증된 표적이라는 것을 보여준다.
실시예 6: APOC3을 표적하는 변형된 siRNA의 합성 및 스크리닝(제2 집합)
추가적인 변형 APOC3 siRNA는 상술한 방법을 이용하여 표 6 및 표 7에 기술된 바와 같이 합성되었다. UMdTdsdT 변형 패턴은 각각의 가닥에 대한 dT-포스포로티오에이트-dT 첨가이다. DECAF 변형 패턴은 다음과 같다: 센스 가닥 - 모든 피리미딘들 상의 2' O-메틸, dTsdT / dTdT 오버행; 안티센스 가닥 - 위치 10-16에서 모든 'U' 상의 2' O-메틸에 더하여 마지막 3 뉴클레오티드들(위치 17-19) 상의 2' O-메틸에 더하여 시드 영역(위치 2-9) 내에서 디뉴클레오티드 모티프 UU / UA / UG 내에서 임의의 2 개 부위들에서 'U' 변형한다; dTsdT / dTdT 오버행. FOME 변형 패턴은 다음과 같다: 센스 가닥 - 2' F(5' 최초 염기) 이후 2' OMe로 교번되고, 안티센스 가닥 - 2' OMe (5' 최초 염기), 이후 2' F와 교번된다.
표 6 및 표 7에 기술된 siRNA는 기술된 바와 같이 Hep3b 세포 내에서 분석되었다. 그 결과들은 표 8에 나타나 있다.
실시예 7: APOC3을 표적하는 변형된 siRNA의 합성 및 스크리닝(제3 집합)
추가적인 변형 APOC3 siRNA는 상술한 방법을 이용하여 표 9 및 표 10에 기술된 바와 같이 합성되었다. siRNA는 상술된 바와 같이 Hep3b 세포 내에서 분석되었다. 그 결과들은 표 11에 나타나 있다.
| 듀플렉스명 | NM_000040.1에서의 위치 | SEQ ID NO: | 센스 서열 | SEQ ID NO: | 안티센스 서열 |
| AD-24548.1UM | 264-282 | 2 | ACUGGAGCACCGUUAAGGA | 83 | UCCUUAACGGUGCUCCAGU |
| AD-24549.1UM | 417-435 | 3 | GCCCCUGUAGGUUGCUUAA | 84 | UUAAGCAACCUACAGGGGC |
| AD-24550.1UM | 418-436 | 4 | CCCCUGUAGGUUGCUUAAA | 85 | UUUAAGCAACCUACAGGGG |
| AD-24551.1UM | 47-65 | 5 | AUGCAGCCCCGGGUACUCC | 86 | GGAGUACCCGGGGCUGCAU |
| AD-24552.1UM | 412-430 | 6 | GGGCUGCCCCUGUAGGUUG | 87 | CAACCUACAGGGGCAGCCC |
| AD-24553.1UM | 267-285 | 7 | GGAGCACCGUUAAGGACAA | 88 | UUGUCCUUAACGGUGCUCC |
| AD-24554.1UM | 266-284 | 8 | UGGAGCACCGUUAAGGACA | 89 | UGUCCUUAACGGUGCUCCA |
| AD-24555.1UM | 423-441 | 9 | GUAGGUUGCUUAAAAGGGA | 90 | UCCCUUUUAAGCAACCUAC |
| AD-24556.1UM | 265-283 | 10 | CUGGAGCACCGUUAAGGAC | 91 | GUCCUUAACGGUGCUCCAG |
| AD-24557.1UM | 45-63 | 11 | CCAUGCAGCCCCGGGUACU | 92 | AGUACCCGGGGCUGCAUGG |
| AD-24558.1UM | 416-434 | 12 | UGCCCCUGUAGGUUGCUUA | 93 | UAAGCAACCUACAGGGGCA |
| AD-24559.1UM | 44-62 | 13 | GCCAUGCAGCCCCGGGUAC | 94 | GUACCCGGGGCUGCAUGGC |
| AD-24560.1UM | 263-281 | 14 | UACUGGAGCACCGUUAAGG | 95 | CCUUAACGGUGCUCCAGUA |
| AD-24561.1UM | 262-280 | 15 | CUACUGGAGCACCGUUAAG | 96 | CUUAACGGUGCUCCAGUAG |
| AD-24562.1UM | 261-279 | 16 | ACUACUGGAGCACCGUUAA | 97 | UUAACGGUGCUCCAGUAGU |
| AD-24563.1UM | 260-278 | 17 | GACUACUGGAGCACCGUUA | 98 | UAACGGUGCUCCAGUAGUC |
| AD-24564.1UM | 341-359 | 18 | GCCUGAGACCUCAAUACCC | 99 | GGGUAUUGAGGUCUCAGGC |
| AD-24565.1UM | 340-358 | 19 | UGCCUGAGACCUCAAUACC | 100 | GGUAUUGAGGUCUCAGGCA |
| AD-24566.1UM | 46-64 | 20 | CAUGCAGCCCCGGGUACUC | 101 | GAGUACCCGGGGCUGCAUG |
| AD-24567.1UM | 342-360 | 21 | CCUGAGACCUCAAUACCCC | 102 | GGGGUAUUGAGGUCUCAGG |
| AD-24568.1UM | 345-363 | 22 | GAGACCUCAAUACCCCAAG | 103 | CUUGGGGUAUUGAGGUCUC |
| AD-24569.1UM | 249-267 | 23 | GUUCCCUGAAAGACUACUG | 104 | CAGUAGUCUUUCAGGGAAC |
| AD-24570.1UM | 411-429 | 24 | AGGGCUGCCCCUGUAGGUU | 105 | AACCUACAGGGGCAGCCCU |
| AD-24571.1UM | 339-357 | 25 | CUGCCUGAGACCUCAAUAC | 106 | GUAUUGAGGUCUCAGGCAG |
| AD-24572.1UM | 351-369 | 26 | UCAAUACCCCAAGUCCACC | 107 | GGUGGACUUGGGGUAUUGA |
| AD-24573.1UM | 235-253 | 27 | GACCGAUGGCUUCAGUUCC | 108 | GGAACUGAAGCCAUCGGUC |
| AD-24574.1UM | 248-266 | 28 | AGUUCCCUGAAAGACUACU | 109 | AGUAGUCUUUCAGGGAACU |
| AD-24575.1UM | 415-433 | 29 | CUGCCCCUGUAGGUUGCUU | 110 | AAGCAACCUACAGGGGCAG |
| AD-24576.1UM | 234-252 | 30 | UGACCGAUGGCUUCAGUUC | 111 | GAACUGAAGCCAUCGGUCA |
| AD-24577.1UM | 168-186 | 31 | AGACCGCCAAGGAUGCACU | 112 | AGUGCAUCCUUGGCGGUCU |
| AD-45078.1UM | 232-250 | 32 | GGUGACCGAUGGCUUCAGU | 113 | ACUGAAGCCAUCGGUCACCTT |
| AD-45084.1UM | 237-255 | 33 | CCGAUGGCUUCAGUUCCCU | 114 | AGGGAACUGAAGCCAUCGGTT |
| AD-45090.1UM | 239-257 | 34 | GAUGGCUUCAGUUCCCUGA | 115 | UCAGGGAACUGAAGCCAUCTT |
| AD-45096.1UM | 240-258 | 35 | AUGGCUUCAGUUCCCUGAA | 116 | UUCAGGGAACUGAAGCCAUTT |
| AD-45101.1UM | 48-66 | 36 | UGCAGCCCCGGGUACUCCU | 117 | AGGAGUACCCGGGGCUGCATT |
| AD-45102.1UM | 241-259 | 37 | UGGCUUCAGUUCCCUGAAA | 118 | UUUCAGGGAACUGAAGCCATT |
| AD-45107.1UM | 49-67 | 38 | GCAGCCCCGGGUACUCCUU | 119 | AAGGAGUACCCGGGGCUGCTT |
| AD-45108.1UM | 243-261 | 39 | GCUUCAGUUCCCUGAAAGA | 120 | UCUUUCAGGGAACUGAAGCTT |
| AD-45113.1UM | 166-184 | 40 | CAAGACCGCCAAGGAUGCA | 121 | UGCAUCCUUGGCGGUCUUGTT |
| AD-45114.1UM | 251-269 | 41 | UCCCUGAAAGACUACUGGA | 122 | UCCAGUAGUCUUUCAGGGATT |
| AD-45119.1UM | 230-248 | 42 | UGGGUGACCGAUGGCUUCA | 123 | UGAAGCCAUCGGUCACCCATT |
| AD-45120.1UM | 254-272 | 43 | CUGAAAGACUACUGGAGCA | 124 | UGCUCCAGUAGUCUUUCAGTT |
| AD-45121.1UM | 259-277 | 44 | AGACUACUGGAGCACCGUU | 125 | AACGGUGCUCCAGUAGUCU |
| AD-45122.1UM | 410-428 | 45 | CAGGGCUGCCCCUGUAGGU | 126 | ACCUACAGGGGCAGCCCUG |
| AD-45123.1UM | 49-67 | 46 | GCAGCCCCGGGUACUCCUU | 127 | AAGGAGUACCCGGGGCUGC |
| AD-45124.1UM | 243-261 | 47 | GCUUCAGUUCCCUGAAAGA | 128 | UCUUUCAGGGAACUGAAGC |
| AD-45125.1UM | 343-361 | 48 | CUGAGACCUCAAUACCCCA | 129 | UGGGGUAUUGAGGUCUCAG |
| AD-45126.1UM | 430-448 | 49 | GCUUAAAAGGGACAGUAUU | 130 | AAUACUGUCCCUUUUAAGC |
| AD-45127.1UM | 269-287 | 50 | AGCACCGUUAAGGACAAGU | 131 | ACUUGUCCUUAACGGUGCU |
| AD-45128.1UM | 414-432 | 51 | GCUGCCCCUGUAGGUUGCU | 132 | AGCAACCUACAGGGGCAGC |
| AD-45129.1UM | 166-184 | 52 | CAAGACCGCCAAGGAUGCA | 133 | UGCAUCCUUGGCGGUCUUG |
| AD-45130.1UM | 251-269 | 53 | UCCCUGAAAGACUACUGGA | 134 | UCCAGUAGUCUUUCAGGGA |
| AD-45131.1UM | 344-362 | 54 | UGAGACCUCAAUACCCCAA | 135 | UUGGGGUAUUGAGGUCUCA |
| AD-45132.1UM | 514-532 | 55 | CUGGACAAGAAGCUGCUAU | 136 | AUAGCAGCUUCUUGUCCAG |
| AD-45133.1UM | 270-288 | 56 | GCACCGUUAAGGACAAGUU | 137 | AACUUGUCCUUAACGGUGC |
| AD-45135.1UM | 230-248 | 57 | UGGGUGACCGAUGGCUUCA | 138 | UGAAGCCAUCGGUCACCCA |
| AD-45136.1UM | 254-272 | 58 | CUGAAAGACUACUGGAGCA | 139 | UGCUCCAGUAGUCUUUCAG |
| AD-45137.1UM | 349-367 | 59 | CCUCAAUACCCCAAGUCCA | 140 | UGGACUUGGGGUAUUGAGG |
| AD-45138.1UM | 337-355 | 60 | GGCUGCCUGAGACCUCAAU | 141 | AUUGAGGUCUCAGGCAGCC |
| AD-45139.1UM | 425-443 | 61 | AGGUUGCUUAAAAGGGACA | 142 | UGUCCCUUUUAAGCAACCU |
| AD-45140.1UM | 232-250 | 62 | GGUGACCGAUGGCUUCAGU | 143 | ACUGAAGCCAUCGGUCACC |
| AD-45141.1UM | 259-277 | 63 | AGACUACUGGAGCACCGUU | 144 | AACGGUGCUCCAGUAGUCU |
| AD-45143.1UM | 338-356 | 64 | GCUGCCUGAGACCUCAAUA | 145 | UAUUGAGGUCUCAGGCAGC |
| AD-45144.1UM | 429-447 | 65 | UGCUUAAAAGGGACAGUAU | 146 | AUACUGUCCCUUUUAAGCA |
| AD-45145.1UM | 237-255 | 66 | CCGAUGGCUUCAGUUCCCU | 147 | AGGGAACUGAAGCCAUCGG |
| AD-45146.1UM | 269-287 | 67 | AGCACCGUUAAGGACAAGU | 148 | ACUUGUCCUUAACGGUGCU |
| AD-45147.1UM | 414-432 | 68 | GCUGCCCCUGUAGGUUGCU | 149 | AGCAACCUACAGGGGCAGC |
| AD-45148.1UM | 343-361 | 69 | CUGAGACCUCAAUACCCCA | 150 | UGGGGUAUUGAGGUCUCAG |
| AD-45149.1UM | 430-448 | 70 | GCUUAAAAGGGACAGUAUU | 151 | AAUACUGUCCCUUUUAAGC |
| AD-45150.1UM | 239-257 | 71 | GAUGGCUUCAGUUCCCUGA | 152 | UCAGGGAACUGAAGCCAUC |
| AD-45151.1UM | 270-288 | 72 | GCACCGUUAAGGACAAGUU | 153 | AACUUGUCCUUAACGGUGC |
| AD-45152.1UM | 419-437 | 73 | CCCUGUAGGUUGCUUAAAA | 154 | UUUUAAGCAACCUACAGGG |
| AD-45153.1UM | 344-362 | 74 | UGAGACCUCAAUACCCCAA | 155 | UUGGGGUAUUGAGGUCUCA |
| AD-45154.1UM | 514-532 | 75 | CUGGACAAGAAGCUGCUAU | 156 | AUAGCAGCUUCUUGUCCAG |
| AD-45155.1UM | 240-258 | 76 | AUGGCUUCAGUUCCCUGAA | 157 | UUCAGGGAACUGAAGCCAU |
| AD-45157.1UM | 425-443 | 77 | AGGUUGCUUAAAAGGGACA | 158 | UGUCCCUUUUAAGCAACCU |
| AD-45158.1UM | 349-367 | 78 | CCUCAAUACCCCAAGUCCA | 159 | UGGACUUGGGGUAUUGAGG |
| AD-45159.1UM | 48-66 | 79 | UGCAGCCCCGGGUACUCCU | 160 | AGGAGUACCCGGGGCUGCA |
| AD-45160.1UM | 241-259 | 80 | UGGCUUCAGUUCCCUGAAA | 161 | UUUCAGGGAACUGAAGCCA |
| AD-45161.1UM | 338-356 | 81 | GCUGCCUGAGACCUCAAUA | 162 | UAUUGAGGUCUCAGGCAGC |
| AD-45162.1UM | 429-447 | 82 | UGCUUAAAAGGGACAGUAU | 163 | AUACUGUCCCUUUUAAGCA |
| 듀플렉스명 | SEQ ID NO: | 센스 서열 | SEQ ID NO: | 안티센스 서열 |
| AD-24548.1 | 164 | AcuGGAGcAccGuuAAGGAdTsdT | 245 | UCCUuAACGGUGCUCcAGUdTsdT |
| AD-24549.1 | 165 | GccccuGuAGGuuGcuuAAdTsdT | 246 | UuAAGcAACCuAcAGGGGCdTsdT |
| AD-24550.1 | 166 | ccccuGuAGGuuGcuuAAAdTsdT | 247 | UUuAAGcAACCuAcAGGGGdTsdT |
| AD-24551.1 | 167 | AuGcAGccccGGGuAcuccdTsdT | 248 | GGAGuACCCGGGGCUGcAUdTsdT |
| AD-24552.1 | 168 | GGGcuGccccuGuAGGuuGdTsdT | 249 | cAACCuAcAGGGGcAGCCCdTsdT |
| AD-24553.1 | 169 | GGAGcAccGuuAAGGAcAAdTsdT | 250 | UUGUCCUuAACGGUGCUCCdTsdT |
| AD-24554.1 | 170 | uGGAGcAccGuuAAGGAcAdTsdT | 251 | UGUCCUuAACGGUGCUCcAdTsdT |
| AD-24556.1 | 171 | cuGGAGcAccGuuAAGGAcdTsdT | 252 | GUCCUuAACGGUGCUCcAGdTsdT |
| AD-24557.1 | 172 | ccAuGcAGccccGGGuAcudTsdT | 253 | AGuACCCGGGGCUGcAUGGdTsdT |
| AD-24558.1 | 173 | uGccccuGuAGGuuGcuuAdTsdT | 254 | uAAGcAACCuAcAGGGGcAdTsdT |
| AD-24559.1 | 174 | GccAuGcAGccccGGGuAcdTsdT | 255 | GuACCCGGGGCUGcAUGGCdTsdT |
| AD-24560.1 | 175 | uAcuGGAGcAccGuuAAGGdTsdT | 256 | CCUuAACGGUGCUCcAGuAdTsdT |
| AD-24561.1 | 176 | cuAcuGGAGcAccGuuAAGdTsdT | 257 | CUuAACGGUGCUCcAGuAGdTsdT |
| AD-24563.1 | 177 | GAcuAcuGGAGcAccGuuAdTsdT | 258 | uAACGGUGCUCcAGuAGUCdTsdT |
| AD-24564.1 | 178 | GccuGAGAccucAAuAcccdTsdT | 259 | GGGuAUUGAGGUCUcAGGCdTsdT |
| AD-24565.1 | 179 | uGccuGAGAccucAAuAccdTsdT | 260 | GGuAUUGAGGUCUcAGGcAdTsdT |
| AD-24566.1 | 180 | cAuGcAGccccGGGuAcucdTsdT | 261 | GAGuACCCGGGGCUGcAUGdTsdT |
| AD-24567.1 | 181 | ccuGAGAccucAAuAccccdTsdT | 262 | GGGGuAUUGAGGUCUcAGGdTsdT |
| AD-24568.1 | 182 | GAGAccucAAuAccccAAGdTsdT | 263 | CUUGGGGuAUUGAGGUCUCdTsdT |
| AD-24569.1 | 183 | GuucccuGAAAGAcuAcuGdTsdT | 264 | cAGuAGUCUUUcAGGGAACdTsdT |
| AD-24570.1 | 184 | AGGGcuGccccuGuAGGuudTsdT | 265 | AACCuAcAGGGGcAGCCCUdTsdT |
| AD-24571.1 | 185 | cuGccuGAGAccucAAuAcdTsdT | 266 | GuAUUGAGGUCUcAGGcAGdTsdT |
| AD-24572.1 | 186 | ucAAuAccccAAGuccAccdTsdT | 267 | GGUGGACUUGGGGuAUUGAdTsdT |
| AD-24573.1 | 187 | GAccGAuGGcuucAGuuccdTsdT | 268 | GGAACUGAAGCcAUCGGUCdTsdT |
| AD-24574.1 | 188 | AGuucccuGAAAGAcuAcudTsdT | 269 | AGuAGUCUUUcAGGGAACUdTsdT |
| AD-24575.1 | 189 | cuGccccuGuAGGuuGcuudTsdT | 270 | AAGcAACCuAcAGGGGcAGdTsdT |
| AD-24576.1 | 190 | uGAccGAuGGcuucAGuucdTsdT | 271 | GAACUGAAGCcAUCGGUcAdTsdT |
| AD-24577.1 | 191 | AGAccGccAAGGAuGcAcudTsdT | 272 | AGUGcAUCCUUGGCGGUCUdTsdT |
| AD-24555.1 | 192 | GuAGGuuGcuuAAAAGGGAdTsdT | 273 | UCCCUUUuAAGcAACCuACdTsdT |
| AD-24562.1 | 193 | AcuAcuGGAGcAccGuuAAdTsdT | 274 | UuAACGGUGCUCcAGuAGUdTsdT |
| AD-45078.1 | 194 | GGuGAccGAuGGcuucAGudTsdT | 275 | ACUGAAGCcAUCGGUcACCdTsdT |
| AD-45084.1 | 195 | ccGAuGGcuucAGuucccudTsdT | 276 | AGGGAACUGAAGCcAUCGGdTsdT |
| AD-45090.1 | 196 | GAuGGcuucAGuucccuGAdTsdT | 277 | UcAGGGAACUGAAGCcAUCdTsdT |
| AD-45096.1 | 197 | AuGGcuucAGuucccuGAAdTsdT | 278 | UUcAGGGAACUGAAGCcAUdTsdT |
| AD-45101.1 | 198 | uGcAGccccGGGuAcuccudTsdT | 279 | AGGAGuACCCGGGGCUGcAdTsdT |
| AD-45102.1 | 199 | uGGcuucAGuucccuGAAAdTsdT | 280 | UUUcAGGGAACUGAAGCcAdTsdT |
| AD-45107.1 | 200 | GcAGccccGGGuAcuccuudTsdT | 281 | AAGGAGuACCCGGGGCUGCdTsdT |
| AD-45108.1 | 201 | GcuucAGuucccuGAAAGAdTsdT | 282 | UCUUUcAGGGAACUGAAGCdTsdT |
| AD-45113.1 | 202 | cAAGAccGccAAGGAuGcAdTsdT | 283 | UGcAUCCUUGGCGGUCUUGdTsdT |
| AD-45114.1 | 203 | ucccuGAAAGAcuAcuGGAdTsdT | 284 | UCcAGuAGUCUUUcAGGGAdTsdT |
| AD-45119.1 | 204 | uGGGuGAccGAuGGcuucAdTsdT | 285 | UGAAGCcAUCGGUcACCcAdTsdT |
| AD-45120.1 | 205 | cuGAAAGAcuAcuGGAGcAdTsdT | 286 | UGCUCcAGuAGUCUUUcAGdTsdT |
| AD-45121.1 | 206 | AGAcuAcuGGAGcAccGuudTsdT | 287 | AACGGUGCUCcAGuAGUCUdTsdT |
| AD-45122.1 | 207 | cAGGGcuGccccuGuAGGudTsdT | 288 | ACCuAcAGGGGcAGCCCUGdTsdT |
| AD-45123.1 | 208 | GCfAGCfCfCfCfGGGUfACfUfCfCfUfUfdTsdT | 289 | AAGGAGUfACCCGGGGCUGCdTsdT |
| AD-45124.1 | 209 | GCfUfUfCfAGUfUfCfCfCfUfGAAAGAdTsdT | 290 | UCUUUCfAGGGAACUGAAGCdTsdT |
| AD-45125.1 | 210 | CfUfGAGACfCfUfCfAAUfACfCfCfCfAdTsdT | 291 | UGGGGUfAUUGAGGUCUCfAGdTsdT |
| AD-45126.1 | 211 | GCfUfUfAAAAGGGACfAGUfAUfUfdTsdT | 292 | AAUfACUGUCCCUUUUfAAGCdTsdT |
| AD-45127.1 | 212 | AGcAccGuuAAGGAcAAGudTsdT | 293 | ACUUGUCCUuAACGGUGCUdTsdT |
| AD-45128.1 | 213 | GcuGccccuGuAGGuuGcudTsdT | 294 | AGcAACCuAcAGGGGcAGCdTsdT |
| AD-45129.1 | 214 | CfAAGACfCfGCfCfAAGGAUfGCfAdTsdT | 295 | UGCfAUCCUUGGCGGUCUUGdTsdT |
| AD-45130.1 | 215 | UfCfCfCfUfGAAAGACfUfACfUfGGAdTsdT | 296 | UCCfAGUfAGUCUUUCfAGGGAdTsdT |
| AD-45131.1 | 216 | UfGAGACfCfUfCfAAUfACfCfCfCfAAdTsdT | 297 | UUGGGGUfAUUGAGGUCUCfAdTsdT |
| AD-45132.1 | 217 | CfUfGGACfAAGAAGCfUfGCfUfAUfdTsdT | 298 | AUfAGCfAGCUUCUUGUCCfAGdTsdT |
| AD-45133.1 | 218 | GcAccGuuAAGGAcAAGuudTsdT | 299 | AACUUGUCCUuAACGGUGCdTsdT |
| AD-45135.1 | 219 | UfGGGUfGACfCfGAUfGGCfUfUfCfAdTsdT | 300 | UGAAGCCfAUCGGUCfACCCfAdTsdT |
| AD-45136.1 | 220 | CfUfGAAAGACfUfACfUfGGAGCfAdTsdT | 301 | UGCUCCfAGUfAGUCUUUCfAGdTsdT |
| AD-45137.1 | 221 | CfCfUfCfAAUfACfCfCfCfAAGUfCfCfAdTsdT | 302 | UGGACUUGGGGUfAUUGAGGdTsdT |
| AD-45138.1 | 222 | GGcuGccuGAGAccucAAudTsdT | 303 | AUUGAGGUCUcAGGcAGCCdTsdT |
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| AD-45147.1 | 230 | GCfUfGCfCfCfCfUfGUfAGGUfUfGCfUfdTsdT | 311 | AGCfAACCUfACfAGGGGCfAGCdTsdT |
| AD-45148.1 | 231 | cuGAGAccucAAuAccccAdTsdT | 312 | UGGGGuAUUGAGGUCUcAGdTsdT |
| AD-45149.1 | 232 | GcuuAAAAGGGAcAGuAuudTsdT | 313 | AAuACUGUCCCUUUuAAGCdTsdT |
| AD-45150.1 | 233 | GAUfGGCfUfUfCfAGUfUfCfCfCfUfGAdTsdT | 314 | UCfAGGGAACUGAAGCCfAUCdTsdT |
| AD-45151.1 | 234 | GCfACfCfGUfUfAAGGACfAAGUfUfdTsdT | 315 | AACUUGUCCUUfAACGGUGCdTsdT |
| AD-45152.1 | 235 | CfCfCfUfGUfAGGUfUfGCfUfUfAAAAdTsdT | 316 | UUUUfAAGCfAACCUfACfAGGGdTsdT |
| AD-45153.1 | 236 | uGAGAccucAAuAccccAAdTsdT | 317 | UUGGGGuAUUGAGGUCUcAdTsdT |
| AD-45154.1 | 237 | cuGGAcAAGAAGcuGcuAudTsdT | 318 | AuAGcAGCUUCUUGUCcAGdTsdT |
| AD-45155.1 | 238 | AUfGGCfUfUfCfAGUfUfCfCfCfUfGAAdTsdT | 319 | UUCfAGGGAACUGAAGCCfAUdTsdT |
| AD-45157.1 | 239 | AGGUfUfGCfUfUfAAAAGGGACfAdTsdT | 320 | UGUCCCUUUUfAAGCfAACCUdTsdT |
| AD-45158.1 | 240 | ccucAAuAccccAAGuccAdTsdT | 321 | UGGACUUGGGGuAUUGAGGdTsdT |
| AD-45159.1 | 241 | UfGCfAGCfCfCfCfGGGUfACfUfCfCfUfdTsdT | 322 | AGGAGUfACCCGGGGCUGCfAdTsdT |
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| AD-45161.1 | 243 | GCfUfGCfCfUfGAGACfCfUfCfAAUfAdTsdT | 324 | UfAUUGAGGUCUCfAGGCfAGCdTsdT |
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| 듀플렉스 ID | 10nM | 0.1nM |
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| HeLa 3 일 | 저 용량(0.0001 nM)으로 정규화된 생존가능 분율 | ||||
| 농도(nM) | 10nM | 1nM | 0.1nM | 0.01nM | 0.0001nM |
| AD-45102.1 | 0.57 | 0.72 | 0.96 | 1.06 | 1.00 |
| AD-45108.1 | 0.58 | 0.87 | 0.99 | 0.97 | 1.00 |
| AD-45120.1 | 0.16 | 0.33 | 0.75 | 0.97 | 1.00 |
| AD-45124.1 | 0.69 | 0.84 | 0.96 | 0.94 | 1.00 |
| AD-45126.1 | 0.47 | 0.46 | 0.65 | 0.95 | 1.00 |
| AD-45130.1 | 0.64 | 0.72 | 0.93 | 1.00 | 1.00 |
| AD-45133.1 | 0.22 | 0.51 | 0.94 | 0.94 | 1.00 |
| AD-45151.1 | 0.43 | 0.63 | 1.12 | 1.06 | 1.00 |
| AD-45152.1 | 0.70 | 0.96 | 1.02 | 1.06 | 1.00 |
| AD-45160.1 | 0.44 | 0.68 | 0.83 | 0.99 | 1.00 |
| AD-45162.1 | 0.62 | 0.86 | 1.01 | 1.01 | 1.00 |
| AD-24555 | 0.67 | 0.91 | 1.00 | 0.96 | 1.00 |
| AD-24562 | 0.59 | 0.74 | 0.82 | 0.92 | 1.00 |
| AD-24576 | 0.39 | 0.71 | 1.01 | 0.91 | 1.00 |
| AD-45135.1 | 0.18 | 0.43 | 0.94 | 1.02 | 1.00 |
| AD-45136.1 | 0.33 | 0.48 | 0.86 | 1.00 | 1.00 |
| AD-45137.1 | 0.65 | 0.89 | 0.96 | 0.91 | 1.00 |
| AD-45141.1 | 0.51 | 0.53 | 0.88 | 0.98 | 1.00 |
| AD-45145.1 | 0.33 | 0.58 | 0.95 | 0.92 | 1.00 |
| AD-45146.1 | 0.39 | 0.47 | 0.87 | 0.93 | 1.00 |
| AD-45149.1 | 0.57 | 0.64 | 0.96 | 0.96 | 1.00 |
| AD-1955 | 0.62 | 0.84 | 0.93 | 0.99 | 1.00 |
| PLK | 0.02 | 0.05 | 0.12 | 0.62 | 1.00 |
| AD-19200 | 0.15 | 0.34 | 0.81 | 0.93 | 1.00 |
| HeLa 5 일 | 저 용량(0.0001 nM)으로 정규화된 생존가능 분율 | ||||
| 농도(nM) | 10nM | 1nM | 0.1nM | 0.01nM | 0.0001nM |
| AD-45102.1 | 0.55 | 0.79 | 0.89 | 1.00 | 1.00 |
| AD-45108.1 | 0.77 | 0.95 | 0.99 | 1.01 | 1.00 |
| AD-45120.1 | 0.06 | 0.28 | 0.90 | 1.00 | 1.00 |
| AD-45124.1 | 1.12 | 1.13 | 1.02 | 1.08 | 1.00 |
| AD-45126.1 | 0.84 | 0.87 | 0.98 | 1.04 | 1.00 |
| AD-45130.1 | 0.50 | 0.81 | 1.04 | 1.11 | 1.00 |
| AD-45133.1 | 0.01 | 0.11 | 0.76 | 0.94 | 1.00 |
| AD-45151.1 | 0.17 | 0.41 | 0.63 | 1.00 | 1.00 |
| AD-45152.1 | 0.82 | 0.97 | 0.84 | 1.01 | 1.00 |
| AD-45160.1 | 0.47 | 0.83 | 0.94 | 1.03 | 1.00 |
| AD-45162.1 | 0.79 | 0.94 | 0.83 | 1.00 | 1.00 |
| AD-24555 | 0.92 | 1.04 | 0.99 | 0.99 | 1.00 |
| AD-24562 | 0.71 | 0.98 | 1.05 | 1.03 | 1.00 |
| AD-24576 | 0.10 | 0.59 | 0.80 | 1.00 | 1.00 |
| AD-45135.1 | 0.04 | 0.66 | 1.02 | 1.02 | 1.00 |
| AD-45136.1 | 0.23 | 0.67 | 1.06 | 0.96 | 1.00 |
| AD-45137.1 | 0.73 | 0.93 | 1.02 | 0.98 | 1.00 |
| AD-45141.1 | 0.30 | 0.51 | 0.91 | 0.97 | 1.00 |
| AD-45145.1 | 0.27 | 0.76 | 1.01 | 1.01 | 1.00 |
| AD-45146.1 | 0.29 | 0.59 | 0.98 | 1.02 | 1.00 |
| AD-45149.1 | 0.71 | 0.84 | 1.01 | 0.99 | 1.00 |
| AD-1955 | 0.67 | 0.89 | 0.92 | 0.95 | 1.00 |
| PLK | -0.03 | 0.02 | 0.06 | 0.47 | 0.88 |
| AD-19200 | 0.05 | 0.49 | 1.01 | 1.03 | 1.00 |
| Hep3B 3 일 | 저 용량(0.0001 nM)으로 정규화된 생존가능 분율 | ||||
| 농도(nM) | 10nM | 1nM | 0.1nM | 0.01nM | 0.0001nM |
| AD-45102.1 | 0.84 | 1.09 | 1.02 | 1.06 | 1.00 |
| AD-45108.1 | 0.88 | 1.02 | 0.99 | 0.96 | 1.00 |
| AD-45120.1 | 0.69 | 0.99 | 0.99 | 0.94 | 1.00 |
| AD-45124.1 | 0.86 | 1.09 | 0.95 | 0.92 | 1.00 |
| AD-45126.1 | 0.73 | 0.95 | 0.99 | 0.97 | 1.00 |
| AD-45130.1 | 0.81 | 1.00 | 1.04 | 1.00 | 1.00 |
| AD-45133.1 | 0.64 | 0.98 | 1.05 | 1.02 | 1.00 |
| AD-45151.1 | 0.53 | 0.70 | 0.91 | 0.86 | 1.00 |
| AD-45152.1 | 0.86 | 0.93 | 0.98 | 1.02 | 1.00 |
| AD-45160.1 | 1.03 | 1.11 | 1.00 | 0.95 | 1.00 |
| AD-45162.1 | 0.91 | 0.95 | 1.02 | 0.96 | 1.00 |
| AD-24555 | 0.83 | 0.82 | 0.93 | 0.81 | 1.00 |
| AD-24562 | 1.14 | 1.26 | 1.15 | 1.03 | 1.00 |
| AD-24576 | 0.84 | 1.06 | 1.11 | 1.00 | 1.00 |
| AD-45135.1 | 0.99 | 1.18 | 1.17 | 1.18 | 1.00 |
| AD-45136.1 | 0.83 | 0.98 | 1.05 | 1.12 | 1.00 |
| AD-45137.1 | 0.93 | 1.12 | 1.04 | 1.03 | 1.00 |
| AD-45141.1 | 0.71 | 0.89 | 0.93 | 1.12 | 1.00 |
| AD-45145.1 | 0.87 | 1.07 | 1.03 | 1.05 | 1.00 |
| AD-45146.1 | 0.85 | 1.01 | 1.07 | 1.09 | 1.00 |
| AD-45149.1 | 0.98 | 1.20 | 1.10 | 1.04 | 1.00 |
| AD-1955 | 0.62 | 0.92 | 0.95 | 0.93 | 1.00 |
| PLK | 0.21 | 0.32 | 0.47 | 0.82 | 1.00 |
| AD-19200 | 0.25 | 0.63 | 1.03 | 1.01 | 1.00 |
| Hep3B 5 일 | 저 용량(0.0001 nM)으로 정규화된 생존가능 분율 | ||||
| 농도(nM) | 10nM | 1nM | 0.1nM | 0.01nM | 0.0001nM |
| AD-45102.1 | 0.73 | 0.96 | 1.03 | 0.94 | 1.00 |
| AD-45108.1 | 1.01 | 0.83 | 0.96 | 0.96 | 1.00 |
| AD-45120.1 | 0.30 | 0.47 | 0.81 | 1.00 | 1.00 |
| AD-45124.1 | 1.33 | 1.24 | 0.89 | 1.04 | 1.00 |
| AD-45126.1 | 1.08 | 1.05 | 1.00 | 0.92 | 1.00 |
| AD-45130.1 | 0.86 | 0.92 | 1.09 | 0.93 | 1.00 |
| AD-45133.1 | 0.47 | 0.58 | 0.93 | 0.95 | 1.00 |
| AD-45151.1 | 0.29 | 0.57 | 0.93 | 0.91 | 1.00 |
| AD-45152.1 | 1.00 | 0.94 | 0.93 | 0.96 | 1.00 |
| AD-45160.1 | 1.46 | 1.25 | 1.20 | 0.90 | 1.00 |
| AD-45162.1 | 0.83 | 0.84 | 0.89 | 0.85 | 1.00 |
| AD-24555 | 1.13 | 1.00 | 0.99 | 0.83 | 1.00 |
| AD-24562 | 1.16 | 1.13 | 1.03 | 0.97 | 1.00 |
| AD-24576 | 0.68 | 0.92 | 1.04 | 0.90 | 1.00 |
| AD-45135.1 | 0.81 | 1.23 | 1.35 | 1.19 | 1.00 |
| AD-45136.1 | 0.37 | 0.74 | 0.92 | 1.00 | 1.00 |
| AD-45137.1 | 0.74 | 0.90 | 0.99 | 0.96 | 1.00 |
| AD-45141.1 | 0.32 | 0.43 | 0.61 | 0.96 | 1.00 |
| AD-45145.1 | 0.52 | 0.74 | 0.96 | 1.00 | 1.00 |
| AD-45146.1 | 0.60 | 0.57 | 0.86 | 1.02 | 1.00 |
| AD-45149.1 | 0.83 | 0.94 | 1.01 | 0.97 | 1.00 |
| AD-1955 | 0.63 | 0.74 | 0.93 | 0.85 | 1.00 |
| PLK | 0.03 | 0.12 | 0.29 | 0.86 | 1.00 |
| AD-19200 | -0.04 | 0.41 | 0.84 | 0.95 | 1.00 |
| 비변형 듀플렉스명 | SEQ ID NO: | 비변형 센스 | SEQ ID NO: | 비변형 안티센스 | 변형 듀플렉스명 | 변형 형태 | NM_000040.1에서의 위치 |
| AD-45101.1UM | 326 | UGCAGCCCCGGGUACUCCU | 353 | AGGAGUACCCGGGGCUGCA | AD-46822.1 | end | 48-66 |
| AD-47334.1 | FOME | 48-66 | |||||
| AD-47361.1 | DECAF | 48-66 | |||||
| AD-45107.1UM | 327 | GCAGCCCCGGGUACUCCUU | 354 | AAGGAGUACCCGGGGCUGC | AD-46825.1 | UMdTsdT | 49-67 |
| AD-47338.1 | FOME | 49-67 | |||||
| AD-47365.1 | DECAF | 49-67 | |||||
| AD-45113.1UM | 328 | CAAGACCGCCAAGGAUGCA | 355 | UGCAUCCUUGGCGGUCUUG | AD-46828.1 | UMdTsdT | 166-184 |
| AD-47342.1 | FOME | 166-184 | |||||
| AD-47369.1 | DECAF | 166-184 | |||||
| AD-45119.1UM | 329 | UGGGUGACCGAUGGCUUCA | 356 | UGAAGCCAUCGGUCACCCA | AD-46831.1 | UMdTsdT | 230-248 |
| AD-47346.1 | FOME | 230-248 | |||||
| AD-47373.1 | DECAF | 230-248 | |||||
| AD-45078.1UM | 330 | GGUGACCGAUGGCUUCAGU | 357 | ACUGAAGCCAUCGGUCACC | AD-46811.1 | UMdTsdT | 232-250 |
| AD-47349.1 | FOME | 232-250 | |||||
| AD-47376.1 | DECAF | 232-250 | |||||
| AD-45084.1UM | 331 | CCGAUGGCUUCAGUUCCCU | 358 | AGGGAACUGAAGCCAUCGG | AD-46815.1 | UMdTsdT | 237-255 |
| AD-47352.1 | FOME | 237-255 | |||||
| AD-47379.1 | DECAF | 237-255 | |||||
| AD-45090.1UM | 332 | GAUGGCUUCAGUUCCCUGA | 359 | UCAGGGAACUGAAGCCAUC | AD-46818.1 | UMdTsdT | 239-257 |
| AD-47355.1 | FOME | 239-257 | |||||
| AD-47382.1 | DECAF | 239-257 | |||||
| AD-45096.1UM | 333 | AUGGCUUCAGUUCCCUGAA | 360 | UUCAGGGAACUGAAGCCAU | AD-46820.1 | UMdTsdT | 240-258 |
| AD-47358.1 | FOME | 240-258 | |||||
| AD-47385.1 | DECAF | 240-258 | |||||
| AD-45102.1UM | 334 | UGGCUUCAGUUCCCUGAAA | 361 | UUUCAGGGAACUGAAGCCA | AD-46823.1 | UMdTsdT | 241-259 |
| AD-47335.1 | FOME | 241-259 | |||||
| AD-47362.1 | DECAF | 241-259 | |||||
| AD-45108.1UM | 335 | GCUUCAGUUCCCUGAAAGA | 362 | UCUUUCAGGGAACUGAAGC | AD-46826.1 | UMdTsdT | 243-261 |
| AD-47339.1 | FOME | 243-261 | |||||
| AD-47366.1 | DECAF | 243-261 | |||||
| AD-45120.1UM | 336 | CUGAAAGACUACUGGAGCA | 363 | UGCUCCAGUAGUCUUUCAG | AD-46829.1 | UMdTsdT | 254-272 |
| AD-47347.1 | FOME | 254-272 | |||||
| AD-47374.1 | DECAF | 254-272 | |||||
| AD-45127.1UM | 337 | AGCACCGUUAAGGACAAGU | 364 | ACUUGUCCUUAACGGUGCU | AD-46832.1 | UMdTsdT | 269-287 |
| AD-47353.1 | FOME | 269-287 | |||||
| AD-47380.1 | DECAF | 269-287 | |||||
| AD-45133.1UM | 338 | GCACCGUUAAGGACAAGUU | 365 | AACUUGUCCUUAACGGUGC | AD-46812.1 | UMdTsdT | 270-288 |
| AD-47356.1 | FOME | 270-288 | |||||
| AD-47383.1 | DECAF | 270-288 | |||||
| AD-45143.1UM | 339 | GCUGCCUGAGACCUCAAUA | 366 | UAUUGAGGUCUCAGGCAGC | AD-46816.1 | UMdTsdT | 338-356 |
| AD-47336.1 | FOME | 338-356 | |||||
| AD-47363.1 | DECAF | 338-356 | |||||
| AD-45148.1UM | 340 | CUGAGACCUCAAUACCCCA | 367 | UGGGGUAUUGAGGUCUCAG | AD-46819.1 | UMdTsdT | 343-361 |
| AD-47340.1 | FOME | 343-361 | |||||
| AD-47367.1 | DECAF | 343-361 | |||||
| AD-45153.1UM | 341 | UGAGACCUCAAUACCCCAA | 368 | UUGGGGUAUUGAGGUCUCA | AD-46821.1 | UMdTsdT | 344-362 |
| AD-47344.1 | FOME | 344-362 | |||||
| AD-47371.1 | DECAF | 344-362 | |||||
| AD-45158.1UM | 342 | CCUCAAUACCCCAAGUCCA | 369 | UGGACUUGGGGUAUUGAGG | AD-46824.1 | UMdTsdT | 349-367 |
| AD-47348.1 | FOME | 349-367 | |||||
| AD-47375.1 | DECAF | 349-367 | |||||
| AD-45128.1UM | 343 | GCUGCCCCUGUAGGUUGCU | 370 | AGCAACCUACAGGGGCAGC | AD-46827.1 | UMdTsdT | 414-432 |
| AD-47354.1 | FOME | 414-432 | |||||
| AD-45139.1UM | 344 | AGGUUGCUUAAAAGGGACA | 371 | UGUCCCUUUUAAGCAACCU | AD-46830.1 | UMdTsdT | 425-443 |
| AD-47360.1 | FOME | 425-443 | |||||
| AD-47387.1 | DECAF | 425-443 | |||||
| AD-45144.1UM | 345 | UGCUUAAAAGGGACAGUAU | 372 | AUACUGUCCCUUUUAAGCA | AD-46833.1 | UMdTsdT | 429-447 |
| AD-47337.1 | FOME | 429-447 | |||||
| AD-47364.1 | DECAF | 429-447 | |||||
| AD-45149.1UM | 346 | GCUUAAAAGGGACAGUAUU | 373 | AAUACUGUCCCUUUUAAGC | AD-46813.1 | UMdTsdT | 430-448 |
| AD-47341.1 | FOME | 430-448 | |||||
| AD-47368.1 | DECAF | 430-448 | |||||
| AD-45154.1UM | 347 | CUGGACAAGAAGCUGCUAU | 374 | AUAGCAGCUUCUUGUCCAG | AD-46817.1 | UMdTsdT | 514-532 |
| AD-47345.1 | FOME | 514-532 | |||||
| AD-47372.1 | DECAF | 514-532 | |||||
| AD-45114.1UM | 348 | UCCCUGAAAGACUACUGGA | 375 | UCCAGUAGUCUUUCAGGGA | AD-47343.1 | FOME | 251-269 |
| AD-45141.1UM | 349 | AGACUACUGGAGCACCGUU | 376 | AACGGUGCUCCAGUAGUCU | AD-47350.1 | FOME | 259-277 |
| AD-45138.1UM | 350 | GGCUGCCUGAGACCUCAAU | 377 | AUUGAGGUCUCAGGCAGCC | AD-47359.1 | FOME | 337-355 |
| AD-47386.1 | DECAF | 337-355 | |||||
| AD-45122.1UM | 351 | CAGGGCUGCCCCUGUAGGU | 378 | ACCUACAGGGGCAGCCCUG | AD-47351.1 | FOME | 410-428 |
| AD-47378.1 | DECAF | 410-428 | |||||
| AD-45152.1UM | 352 | CCCUGUAGGUUGCUUAAAA | 379 | UUUUAAGCAACCUACAGGG | AD-47357.1 | FOME | 419-437 |
| AD-47357.1 | FOME | 419-437 |
| 비변형 듀플렉스명 | SEQ ID NO: | 5'에서 3'으로의 센스 가닥 서열 | SEQ ID NO: | 5'에서 3'으로의 안티센스 가닥 서열 |
| AD-46822.1 | 380 | UGCAGCCCCGGGUACUCCUdTsdT | 453 | AGGAGUACCCGGGGCUGCAdTsdT |
| AD-47334.1 | 381 | UfgCfaGfcCfcCfgGfgUfaCfuCfcUfdTsdT | 454 | aGfgAfgUfaCfcCfgGfgGfcUfgCfadTsdT |
| AD-47361.1 | 382 | uGcAGccccGGGuAcuccudTsdT | 455 | AGGAGuACCCGGGGCugcadTsdT |
| AD-46825.1 | 383 | GCAGCCCCGGGUACUCCUUdTsdT | 456 | AAGGAGUACCCGGGGCUGCdTsdT |
| AD-47338.1 | 384 | GfcAfgCfcCfcGfgGfuAfcUfcCfuUfdTsdT | 457 | aAfgGfaGfuAfcCfcGfgGfgCfuGfcdTsdT |
| AD-47365.1 | 385 | GcAGccccGGGuAcuccuudTsdT | 458 | AAGGAGuACCCGGGGCugcdTsdT |
| AD-46828.1 | 386 | CAAGACCGCCAAGGAUGCAdTsdT | 459 | UGCAUCCUUGGCGGUCUUGdTsdT |
| AD-47342.1 | 387 | CfaAfgAfcCfgCfcAfaGfgAfuGfcAfdTsdT | 460 | uGfcAfuCfcUfuGfgCfgGfuCfuUfgdTsdT |
| AD-47369.1 | 388 | cAAGAccGccAAGGAuGcAdTsdT | 461 | UGCAUCCuUGGCGGuCuugdTsdT |
| AD-46831.1 | 389 | UGGGUGACCGAUGGCUUCAdTsdT | 462 | UGAAGCCAUCGGUCACCCAdTsdT |
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| AD-45138.1end | Endolight |
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| AD-47384.1 | DECAF |
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| AD-46813.1 | 0.02 | 0.27 | 0.00 | 0.01 |
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| AD-45154.1end | 0.14 | 0.29 | 0.00 | 0.04 |
| AD-45132.1 | 0.30 | 0.52 | 0.04 | 0.05 |
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| AD-47386.1 | 0.88 | 1.28 | 0.15 | 0.21 |
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| AD-47378.1 | 1.10 | 1.08 | 0.09 | 0.03 |
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| AD-47357.1 | 0.09 | 0.28 | 0.02 | 0.25 |
| AD-47384.1 | 0.09 | 0.35 | 0.01 | 0.17 |
SEQ ID NO:1
NCBI 참조 서열: NM_000040.1, 호모 사피엔스 아포리포단백질 C-III(APOC3), mRNA
1 tgctcagttc atccctagag gcagctgctc caggaacaga ggtgccatgc agccccgggt
61 actccttgtt gttgccctcc tggcgctcct ggcctctgcc cgagcttcag aggccgagga
121 tgcctccctt ctcagcttca tgcagggtta catgaagcac gccaccaaga ccgccaagga
181 tgcactgagc agcgtgcagg agtcccaggt ggcccagcag gccaggggct gggtgaccga
241 tggcttcagt tccctgaaag actactggag caccgttaag gacaagttct ctgagttctg
301 ggatttggac cctgaggtca gaccaacttc agccgtggct gcctgagacc tcaatacccc
361 aagtccacct gcctatccat cctgcgagct ccttgggtcc tgcaatctcc agggctgccc
421 ctgtaggttg cttaaaaggg acagtattct cagtgctctc ctaccccacc tcatgcctgg
481 cccccctcca ggcatgctgg cctcccaata aagctggaca agaagctgct atg
NCBI 참조 서열: NM_000040.1, 호모 사피엔스 아포리포단백질 C-III(APOC3), mRNA
1 tgctcagttc atccctagag gcagctgctc caggaacaga ggtgccatgc agccccgggt
61 actccttgtt gttgccctcc tggcgctcct ggcctctgcc cgagcttcag aggccgagga
121 tgcctccctt ctcagcttca tgcagggtta catgaagcac gccaccaaga ccgccaagga
181 tgcactgagc agcgtgcagg agtcccaggt ggcccagcag gccaggggct gggtgaccga
241 tggcttcagt tccctgaaag actactggag caccgttaag gacaagttct ctgagttctg
301 ggatttggac cctgaggtca gaccaacttc agccgtggct gcctgagacc tcaatacccc
361 aagtccacct gcctatccat cctgcgagct ccttgggtcc tgcaatctcc agggctgccc
421 ctgtaggttg cttaaaaggg acagtattct cagtgctctc ctaccccacc tcatgcctgg
481 cccccctcca ggcatgctgg cctcccaata aagctggaca agaagctgct atg
SEQUENCE LISTING
<110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC.
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITION OF EXPRESSION OF
APOLIPOPROTEIN C-III (APOC3) GENES
<130> IF13P245/US
<150> US 61/499,620
<151> 2011-06-21
<160> 773
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 533
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
tgctcagttc atccctagag gcagctgctc caggaacaga ggtgccatgc agccccgggt 60
actccttgtt gttgccctcc tggcgctcct ggcctctgcc cgagcttcag aggccgagga 120
tgcctccctt ctcagcttca tgcagggtta catgaagcac gccaccaaga ccgccaagga 180
tgcactgagc agcgtgcagg agtcccaggt ggcccagcag gccaggggct gggtgaccga 240
tggcttcagt tccctgaaag actactggag caccgttaag gacaagttct ctgagttctg 300
ggatttggac cctgaggtca gaccaacttc agccgtggct gcctgagacc tcaatacccc 360
aagtccacct gcctatccat cctgcgagct ccttgggtcc tgcaatctcc agggctgccc 420
ctgtaggttg cttaaaaggg acagtattct cagtgctctc ctaccccacc tcatgcctgg 480
cccccctcca ggcatgctgg cctcccaata aagctggaca agaagctgct atg 533
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 2
acuggagcac cguuaagga 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 3
gccccuguag guugcuuaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 4
ccccuguagg uugcuuaaa 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 5
augcagcccc ggguacucc 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 6
gggcugcccc uguagguug 19
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 7
ggagcaccgu uaaggacaa 19
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 8
uggagcaccg uuaaggaca 19
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 9
guagguugcu uaaaaggga 19
<210> 10
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 10
cuggagcacc guuaaggac 19
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 11
ccaugcagcc ccggguacu 19
<210> 12
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 12
ugccccugua gguugcuua 19
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 13
gccaugcagc cccggguac 19
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 14
uacuggagca ccguuaagg 19
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 15
cuacuggagc accguuaag 19
<210> 16
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 16
acuacuggag caccguuaa 19
<210> 17
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 17
gacuacugga gcaccguua 19
<210> 18
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 18
gccugagacc ucaauaccc 19
<210> 19
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 19
ugccugagac cucaauacc 19
<210> 20
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 20
caugcagccc cggguacuc 19
<210> 21
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 21
ccugagaccu caauacccc 19
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 22
gagaccucaa uaccccaag 19
<210> 23
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 23
guucccugaa agacuacug 19
<210> 24
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 24
agggcugccc cuguagguu 19
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 25
cugccugaga ccucaauac 19
<210> 26
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 26
ucaauacccc aaguccacc 19
<210> 27
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 27
gaccgauggc uucaguucc 19
<210> 28
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 28
aguucccuga aagacuacu 19
<210> 29
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 29
cugccccugu agguugcuu 19
<210> 30
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 30
ugaccgaugg cuucaguuc 19
<210> 31
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 31
agaccgccaa ggaugcacu 19
<210> 32
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 32
ggugaccgau ggcuucagu 19
<210> 33
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 33
ccgauggcuu caguucccu 19
<210> 34
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 34
gauggcuuca guucccuga 19
<210> 35
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 35
auggcuucag uucccugaa 19
<210> 36
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 36
ugcagccccg gguacuccu 19
<210> 37
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 37
uggcuucagu ucccugaaa 19
<210> 38
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 38
gcagccccgg guacuccuu 19
<210> 39
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 39
gcuucaguuc ccugaaaga 19
<210> 40
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 40
caagaccgcc aaggaugca 19
<210> 41
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 41
ucccugaaag acuacugga 19
<210> 42
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 42
ugggugaccg auggcuuca 19
<210> 43
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 43
cugaaagacu acuggagca 19
<210> 44
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 44
agacuacugg agcaccguu 19
<210> 45
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 45
cagggcugcc ccuguaggu 19
<210> 46
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 46
gcagccccgg guacuccuu 19
<210> 47
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 47
gcuucaguuc ccugaaaga 19
<210> 48
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 48
cugagaccuc aauacccca 19
<210> 49
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 49
gcuuaaaagg gacaguauu 19
<210> 50
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 50
agcaccguua aggacaagu 19
<210> 51
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 51
gcugccccug uagguugcu 19
<210> 52
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 52
caagaccgcc aaggaugca 19
<210> 53
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 53
ucccugaaag acuacugga 19
<210> 54
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 54
ugagaccuca auaccccaa 19
<210> 55
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 55
cuggacaaga agcugcuau 19
<210> 56
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 56
gcaccguuaa ggacaaguu 19
<210> 57
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 57
ugggugaccg auggcuuca 19
<210> 58
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 58
cugaaagacu acuggagca 19
<210> 59
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 59
ccucaauacc ccaagucca 19
<210> 60
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 60
ggcugccuga gaccucaau 19
<210> 61
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 61
agguugcuua aaagggaca 19
<210> 62
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 62
ggugaccgau ggcuucagu 19
<210> 63
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 63
agacuacugg agcaccguu 19
<210> 64
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 64
gcugccugag accucaaua 19
<210> 65
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 65
ugcuuaaaag ggacaguau 19
<210> 66
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 66
ccgauggcuu caguucccu 19
<210> 67
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 67
agcaccguua aggacaagu 19
<210> 68
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 68
gcugccccug uagguugcu 19
<210> 69
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 69
cugagaccuc aauacccca 19
<210> 70
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 70
gcuuaaaagg gacaguauu 19
<210> 71
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 71
gauggcuuca guucccuga 19
<210> 72
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 72
gcaccguuaa ggacaaguu 19
<210> 73
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 73
cccuguaggu ugcuuaaaa 19
<210> 74
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 74
ugagaccuca auaccccaa 19
<210> 75
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 75
cuggacaaga agcugcuau 19
<210> 76
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 76
auggcuucag uucccugaa 19
<210> 77
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 77
agguugcuua aaagggaca 19
<210> 78
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 78
ccucaauacc ccaagucca 19
<210> 79
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 79
ugcagccccg gguacuccu 19
<210> 80
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 80
uggcuucagu ucccugaaa 19
<210> 81
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 81
gcugccugag accucaaua 19
<210> 82
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 82
ugcuuaaaag ggacaguau 19
<210> 83
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 83
uccuuaacgg ugcuccagu 19
<210> 84
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 84
uuaagcaacc uacaggggc 19
<210> 85
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 85
uuuaagcaac cuacagggg 19
<210> 86
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 86
ggaguacccg gggcugcau 19
<210> 87
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 87
caaccuacag gggcagccc 19
<210> 88
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 88
uuguccuuaa cggugcucc 19
<210> 89
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 89
uguccuuaac ggugcucca 19
<210> 90
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 90
ucccuuuuaa gcaaccuac 19
<210> 91
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 91
guccuuaacg gugcuccag 19
<210> 92
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 92
aguacccggg gcugcaugg 19
<210> 93
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 93
uaagcaaccu acaggggca 19
<210> 94
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 94
guacccgggg cugcauggc 19
<210> 95
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 95
ccuuaacggu gcuccagua 19
<210> 96
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 96
cuuaacggug cuccaguag 19
<210> 97
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 97
uuaacggugc uccaguagu 19
<210> 98
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 98
uaacggugcu ccaguaguc 19
<210> 99
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 99
ggguauugag gucucaggc 19
<210> 100
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 100
gguauugagg ucucaggca 19
<210> 101
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 101
gaguacccgg ggcugcaug 19
<210> 102
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 102
gggguauuga ggucucagg 19
<210> 103
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 103
cuugggguau ugaggucuc 19
<210> 104
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 104
caguagucuu ucagggaac 19
<210> 105
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 105
aaccuacagg ggcagcccu 19
<210> 106
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 106
guauugaggu cucaggcag 19
<210> 107
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 107
gguggacuug ggguauuga 19
<210> 108
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 108
ggaacugaag ccaucgguc 19
<210> 109
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 109
aguagucuuu cagggaacu 19
<210> 110
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 110
aagcaaccua caggggcag 19
<210> 111
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 111
gaacugaagc caucgguca 19
<210> 112
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 112
agugcauccu uggcggucu 19
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 113
acugaagcca ucggucacct t 21
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 114
agggaacuga agccaucggt t 21
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 115
ucagggaacu gaagccauct t 21
<210> 116
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 116
uucagggaac ugaagccaut t 21
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 117
aggaguaccc ggggcugcat t 21
<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 118
uuucagggaa cugaagccat t 21
<210> 119
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 119
aaggaguacc cggggcugct t 21
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 120
ucuuucaggg aacugaagct t 21
<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 121
ugcauccuug gcggucuugt t 21
<210> 122
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 122
uccaguaguc uuucagggat t 21
<210> 123
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 123
ugaagccauc ggucacccat t 21
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 124
ugcuccagua gucuuucagt t 21
<210> 125
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 125
aacggugcuc caguagucu 19
<210> 126
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 126
accuacaggg gcagcccug 19
<210> 127
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 127
aaggaguacc cggggcugc 19
<210> 128
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 128
ucuuucaggg aacugaagc 19
<210> 129
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 129
ugggguauug aggucucag 19
<210> 130
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 130
aauacugucc cuuuuaagc 19
<210> 131
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 131
acuuguccuu aacggugcu 19
<210> 132
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 132
agcaaccuac aggggcagc 19
<210> 133
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 133
ugcauccuug gcggucuug 19
<210> 134
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 134
uccaguaguc uuucaggga 19
<210> 135
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 135
uugggguauu gaggucuca 19
<210> 136
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 136
auagcagcuu cuuguccag 19
<210> 137
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 137
aacuuguccu uaacggugc 19
<210> 138
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 138
ugaagccauc ggucaccca 19
<210> 139
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 139
ugcuccagua gucuuucag 19
<210> 140
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 140
uggacuuggg guauugagg 19
<210> 141
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 141
auugaggucu caggcagcc 19
<210> 142
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 142
ugucccuuuu aagcaaccu 19
<210> 143
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 143
acugaagcca ucggucacc 19
<210> 144
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 144
aacggugcuc caguagucu 19
<210> 145
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 145
uauugagguc ucaggcagc 19
<210> 146
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 146
auacuguccc uuuuaagca 19
<210> 147
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 147
agggaacuga agccaucgg 19
<210> 148
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 148
acuuguccuu aacggugcu 19
<210> 149
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 149
agcaaccuac aggggcagc 19
<210> 150
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 150
ugggguauug aggucucag 19
<210> 151
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 151
aauacugucc cuuuuaagc 19
<210> 152
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 152
ucagggaacu gaagccauc 19
<210> 153
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 153
aacuuguccu uaacggugc 19
<210> 154
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 154
uuuuaagcaa ccuacaggg 19
<210> 155
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 155
uugggguauu gaggucuca 19
<210> 156
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 156
auagcagcuu cuuguccag 19
<210> 157
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 157
uucagggaac ugaagccau 19
<210> 158
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 158
ugucccuuuu aagcaaccu 19
<210> 159
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 159
uggacuuggg guauugagg 19
<210> 160
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 160
aggaguaccc ggggcugca 19
<210> 161
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 161
uuucagggaa cugaagcca 19
<210> 162
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 162
uauugagguc ucaggcagc 19
<210> 163
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 163
auacuguccc uuuuaagca 19
<210> 164
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 164
acuggagcac cguuaaggat t 21
<210> 165
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 165
gccccuguag guugcuuaat t 21
<210> 166
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 166
ccccuguagg uugcuuaaat t 21
<210> 167
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 167
augcagcccc ggguacucct t 21
<210> 168
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 168
gggcugcccc uguagguugt t 21
<210> 169
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 169
ggagcaccgu uaaggacaat t 21
<210> 170
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 170
uggagcaccg uuaaggacat t 21
<210> 171
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 171
cuggagcacc guuaaggact t 21
<210> 172
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 172
ccaugcagcc ccggguacut t 21
<210> 173
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 173
ugccccugua gguugcuuat t 21
<210> 174
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 174
gccaugcagc cccggguact t 21
<210> 175
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 175
uacuggagca ccguuaaggt t 21
<210> 176
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 176
cuacuggagc accguuaagt t 21
<210> 177
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 177
gacuacugga gcaccguuat t 21
<210> 178
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 178
gccugagacc ucaauaccct t 21
<210> 179
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 179
ugccugagac cucaauacct t 21
<210> 180
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 180
caugcagccc cggguacuct t 21
<210> 181
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 181
ccugagaccu caauacccct t 21
<210> 182
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 182
gagaccucaa uaccccaagt t 21
<210> 183
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 183
guucccugaa agacuacugt t 21
<210> 184
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 184
agggcugccc cuguagguut t 21
<210> 185
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 185
cugccugaga ccucaauact t 21
<210> 186
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 186
ucaauacccc aaguccacct t 21
<210> 187
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 187
gaccgauggc uucaguucct t 21
<210> 188
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 188
aguucccuga aagacuacut t 21
<210> 189
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 189
cugccccugu agguugcuut t 21
<210> 190
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 190
ugaccgaugg cuucaguuct t 21
<210> 191
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 191
agaccgccaa ggaugcacut t 21
<210> 192
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 192
guagguugcu uaaaagggat t 21
<210> 193
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 193
acuacuggag caccguuaat t 21
<210> 194
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 194
ggugaccgau ggcuucagut t 21
<210> 195
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 195
ccgauggcuu caguucccut t 21
<210> 196
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 196
gauggcuuca guucccugat t 21
<210> 197
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 197
auggcuucag uucccugaat t 21
<210> 198
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 198
ugcagccccg gguacuccut t 21
<210> 199
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 199
uggcuucagu ucccugaaat t 21
<210> 200
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 200
gcagccccgg guacuccuut t 21
<210> 201
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 201
gcuucaguuc ccugaaagat t 21
<210> 202
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 202
caagaccgcc aaggaugcat t 21
<210> 203
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 203
ucccugaaag acuacuggat t 21
<210> 204
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 204
ugggugaccg auggcuucat t 21
<210> 205
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 205
cugaaagacu acuggagcat t 21
<210> 206
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 206
agacuacugg agcaccguut t 21
<210> 207
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 207
cagggcugcc ccuguaggut t 21
<210> 208
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 208
gcagccccgg guacuccuut t 21
<210> 209
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 209
gcuucaguuc ccugaaagat t 21
<210> 210
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 210
cugagaccuc aauaccccat t 21
<210> 211
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 211
gcuuaaaagg gacaguauut t 21
<210> 212
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 212
agcaccguua aggacaagut t 21
<210> 213
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 213
gcugccccug uagguugcut t 21
<210> 214
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 214
caagaccgcc aaggaugcat t 21
<210> 215
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 215
ucccugaaag acuacuggat t 21
<210> 216
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 216
ugagaccuca auaccccaat t 21
<210> 217
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 217
cuggacaaga agcugcuaut t 21
<210> 218
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 218
gcaccguuaa ggacaaguut t 21
<210> 219
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 219
ugggugaccg auggcuucat t 21
<210> 220
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 220
cugaaagacu acuggagcat t 21
<210> 221
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 221
ccucaauacc ccaaguccat t 21
<210> 222
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 222
ggcugccuga gaccucaaut t 21
<210> 223
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 223
agguugcuua aaagggacat t 21
<210> 224
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 224
ggugaccgau ggcuucagut t 21
<210> 225
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 225
agacuacugg agcaccguut t 21
<210> 226
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 226
gcugccugag accucaauat t 21
<210> 227
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 227
ugcuuaaaag ggacaguaut t 21
<210> 228
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 228
ccgauggcuu caguucccut t 21
<210> 229
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 229
agcaccguua aggacaagut t 21
<210> 230
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 230
gcugccccug uagguugcut t 21
<210> 231
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 231
cugagaccuc aauaccccat t 21
<210> 232
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 232
gcuuaaaagg gacaguauut t 21
<210> 233
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 233
gauggcuuca guucccugat t 21
<210> 234
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 234
gcaccguuaa ggacaaguut t 21
<210> 235
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 235
cccuguaggu ugcuuaaaat t 21
<210> 236
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 236
ugagaccuca auaccccaat t 21
<210> 237
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 237
cuggacaaga agcugcuaut t 21
<210> 238
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 238
auggcuucag uucccugaat t 21
<210> 239
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 239
agguugcuua aaagggacat t 21
<210> 240
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 240
ccucaauacc ccaaguccat t 21
<210> 241
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 241
ugcagccccg gguacuccut t 21
<210> 242
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 242
uggcuucagu ucccugaaat t 21
<210> 243
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 243
gcugccugag accucaauat t 21
<210> 244
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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<400> 244
ugcuuaaaag ggacaguaut t 21
<210> 245
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 245
uccuuaacgg ugcuccagut t 21
<210> 246
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 246
uuaagcaacc uacaggggct t 21
<210> 247
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 247
uuuaagcaac cuacaggggt t 21
<210> 248
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 248
ggaguacccg gggcugcaut t 21
<210> 249
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 249
caaccuacag gggcagccct t 21
<210> 250
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 250
uuguccuuaa cggugcucct t 21
<210> 251
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 251
uguccuuaac ggugcuccat t 21
<210> 252
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 252
guccuuaacg gugcuccagt t 21
<210> 253
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 253
aguacccggg gcugcauggt t 21
<210> 254
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 254
uaagcaaccu acaggggcat t 21
<210> 255
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 255
guacccgggg cugcauggct t 21
<210> 256
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 256
ccuuaacggu gcuccaguat t 21
<210> 257
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 257
cuuaacggug cuccaguagt t 21
<210> 258
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 258
uaacggugcu ccaguaguct t 21
<210> 259
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 259
ggguauugag gucucaggct t 21
<210> 260
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 260
gguauugagg ucucaggcat t 21
<210> 261
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 261
gaguacccgg ggcugcaugt t 21
<210> 262
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 262
gggguauuga ggucucaggt t 21
<210> 263
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 263
cuugggguau ugaggucuct t 21
<210> 264
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 264
caguagucuu ucagggaact t 21
<210> 265
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 265
aaccuacagg ggcagcccut t 21
<210> 266
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 266
guauugaggu cucaggcagt t 21
<210> 267
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 267
gguggacuug ggguauugat t 21
<210> 268
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 268
ggaacugaag ccaucgguct t 21
<210> 269
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 269
aguagucuuu cagggaacut t 21
<210> 270
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 270
aagcaaccua caggggcagt t 21
<210> 271
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 271
gaacugaagc caucggucat t 21
<210> 272
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 272
agugcauccu uggcggucut t 21
<210> 273
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 273
ucccuuuuaa gcaaccuact t 21
<210> 274
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 274
uuaacggugc uccaguagut t 21
<210> 275
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 275
acugaagcca ucggucacct t 21
<210> 276
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 276
agggaacuga agccaucggt t 21
<210> 277
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 277
ucagggaacu gaagccauct t 21
<210> 278
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 278
uucagggaac ugaagccaut t 21
<210> 279
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 279
aggaguaccc ggggcugcat t 21
<210> 280
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 280
uuucagggaa cugaagccat t 21
<210> 281
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 281
aaggaguacc cggggcugct t 21
<210> 282
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 282
ucuuucaggg aacugaagct t 21
<210> 283
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 283
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<210> 284
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 284
uccaguaguc uuucagggat t 21
<210> 285
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 285
ugaagccauc ggucacccat t 21
<210> 286
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 286
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 287
aacggugcuc caguagucut t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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oligonucleotide
<400> 288
accuacaggg gcagcccugt t 21
<210> 289
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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acuuguccuu aacggugcut t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ugcuccagua gucuuucagt t 21
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<211> 21
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uggacuuggg guauugaggt t 21
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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agcaaccuac aggggcagct t 21
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ugucccuuuu aagcaaccut t 21
<210> 321
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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oligonucleotide
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uggacuuggg guauugaggt t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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oligonucleotide
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oligonucleotide
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aggaguaccc ggggcugcat t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 323
uuucagggaa cugaagccat t 21
<210> 324
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 324
uauugagguc ucaggcagct t 21
<210> 325
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 325
auacuguccc uuuuaagcat t 21
<210> 326
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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oligonucleotide
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<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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oligonucleotide
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gcagccccgg guacuccuu 19
<210> 328
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 328
caagaccgcc aaggaugca 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 330
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<210> 331
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 331
ccgauggcuu caguucccu 19
<210> 332
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 332
gauggcuuca guucccuga 19
<210> 333
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 333
auggcuucag uucccugaa 19
<210> 334
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 334
uggcuucagu ucccugaaa 19
<210> 335
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 335
gcuucaguuc ccugaaaga 19
<210> 336
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 336
cugaaagacu acuggagca 19
<210> 337
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 337
agcaccguua aggacaagu 19
<210> 338
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 338
gcaccguuaa ggacaaguu 19
<210> 339
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 339
gcugccugag accucaaua 19
<210> 340
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 340
cugagaccuc aauacccca 19
<210> 341
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 341
ugagaccuca auaccccaa 19
<210> 342
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 342
ccucaauacc ccaagucca 19
<210> 343
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 343
gcugccccug uagguugcu 19
<210> 344
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 344
agguugcuua aaagggaca 19
<210> 345
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 345
ugcuuaaaag ggacaguau 19
<210> 346
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 346
gcuuaaaagg gacaguauu 19
<210> 347
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 347
cuggacaaga agcugcuau 19
<210> 348
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 348
ucccugaaag acuacugga 19
<210> 349
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 349
agacuacugg agcaccguu 19
<210> 350
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 350
ggcugccuga gaccucaau 19
<210> 351
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 351
cagggcugcc ccuguaggu 19
<210> 352
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 352
cccuguaggu ugcuuaaaa 19
<210> 353
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 353
aggaguaccc ggggcugca 19
<210> 354
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 354
aaggaguacc cggggcugc 19
<210> 355
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 355
ugcauccuug gcggucuug 19
<210> 356
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 356
ugaagccauc ggucaccca 19
<210> 357
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 357
acugaagcca ucggucacc 19
<210> 358
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 358
agggaacuga agccaucgg 19
<210> 359
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 359
ucagggaacu gaagccauc 19
<210> 360
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 360
uucagggaac ugaagccau 19
<210> 361
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 361
uuucagggaa cugaagcca 19
<210> 362
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 362
ucuuucaggg aacugaagc 19
<210> 363
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 363
ugcuccagua gucuuucag 19
<210> 364
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 364
acuuguccuu aacggugcu 19
<210> 365
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 365
aacuuguccu uaacggugc 19
<210> 366
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 366
uauugagguc ucaggcagc 19
<210> 367
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 367
ugggguauug aggucucag 19
<210> 368
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 368
uugggguauu gaggucuca 19
<210> 369
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 369
uggacuuggg guauugagg 19
<210> 370
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 370
agcaaccuac aggggcagc 19
<210> 371
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 371
ugucccuuuu aagcaaccu 19
<210> 372
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 372
auacuguccc uuuuaagca 19
<210> 373
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 373
aauacugucc cuuuuaagc 19
<210> 374
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 374
auagcagcuu cuuguccag 19
<210> 375
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 375
uccaguaguc uuucaggga 19
<210> 376
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 376
aacggugcuc caguagucu 19
<210> 377
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 377
auugaggucu caggcagcc 19
<210> 378
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 378
accuacaggg gcagcccug 19
<210> 379
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 379
uuuuaagcaa ccuacaggg 19
<210> 380
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 380
ugcagccccg gguacuccut t 21
<210> 381
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 381
ugcagccccg gguacuccut t 21
<210> 382
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 382
ugcagccccg gguacuccut t 21
<210> 383
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 383
gcagccccgg guacuccuut t 21
<210> 384
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 384
gcagccccgg guacuccuut t 21
<210> 385
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 385
gcagccccgg guacuccuut t 21
<210> 386
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 386
caagaccgcc aaggaugcat t 21
<210> 387
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 387
caagaccgcc aaggaugcat t 21
<210> 388
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 388
caagaccgcc aaggaugcat t 21
<210> 389
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 389
ugggugaccg auggcuucat t 21
<210> 390
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 390
ugggugaccg auggcuucat t 21
<210> 391
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 391
ugggugaccg auggcuucat t 21
<210> 392
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 392
ggugaccgau ggcuucagut t 21
<210> 393
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 393
ggugaccgau ggcuucagut t 21
<210> 394
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 394
ggugaccgau ggcuucagut t 21
<210> 395
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 395
ccgauggcuu caguucccut t 21
<210> 396
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 396
ccgauggcuu caguucccut t 21
<210> 397
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 397
ccgauggcuu caguucccut t 21
<210> 398
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 398
gauggcuuca guucccugat t 21
<210> 399
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 399
gauggcuuca guucccugat t 21
<210> 400
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 400
gauggcuuca guucccugat t 21
<210> 401
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 401
auggcuucag uucccugaat t 21
<210> 402
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 402
auggcuucag uucccugaat t 21
<210> 403
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 403
auggcuucag uucccugaat t 21
<210> 404
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 404
uggcuucagu ucccugaaat t 21
<210> 405
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 405
uggcuucagu ucccugaaat t 21
<210> 406
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 406
uggcuucagu ucccugaaat t 21
<210> 407
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 407
gcuucaguuc ccugaaagat t 21
<210> 408
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 408
gcuucaguuc ccugaaagat t 21
<210> 409
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 409
gcuucaguuc ccugaaagat t 21
<210> 410
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 410
cugaaagacu acuggagcat t 21
<210> 411
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 411
cugaaagacu acuggagcat t 21
<210> 412
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 412
cugaaagacu acuggagcat t 21
<210> 413
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 413
agcaccguua aggacaagut t 21
<210> 414
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 414
agcaccguua aggacaagut t 21
<210> 415
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 415
agcaccguua aggacaagut t 21
<210> 416
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 416
gcaccguuaa ggacaaguut t 21
<210> 417
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 417
gcaccguuaa ggacaaguut t 21
<210> 418
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 418
gcaccguuaa ggacaaguut t 21
<210> 419
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 419
gcugccugag accucaauat t 21
<210> 420
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 420
gcugccugag accucaauat t 21
<210> 421
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 421
gcugccugag accucaauat t 21
<210> 422
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 422
cugagaccuc aauaccccat t 21
<210> 423
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 423
cugagaccuc aauaccccat t 21
<210> 424
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 424
cugagaccuc aauaccccat t 21
<210> 425
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 425
ugagaccuca auaccccaat t 21
<210> 426
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 426
ugagaccuca auaccccaat t 21
<210> 427
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 427
ugagaccuca auaccccaat t 21
<210> 428
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 428
ccucaauacc ccaaguccat t 21
<210> 429
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 429
ccucaauacc ccaaguccat t 21
<210> 430
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 430
ccucaauacc ccaaguccat t 21
<210> 431
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 431
gcugccccug uagguugcut t 21
<210> 432
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 432
gcugccccug uagguugcut t 21
<210> 433
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 433
agguugcuua aaagggacat t 21
<210> 434
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 434
agguugcuua aaagggacat t 21
<210> 435
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 435
agguugcuua aaagggacat t 21
<210> 436
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 436
ugcuuaaaag ggacaguaut t 21
<210> 437
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 437
ugcuuaaaag ggacaguaut t 21
<210> 438
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 438
ugcuuaaaag ggacaguaut t 21
<210> 439
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 439
gcuuaaaagg gacaguauut t 21
<210> 440
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 440
gcuuaaaagg gacaguauut t 21
<210> 441
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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gcuuaaaagg gacaguauut t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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<400> 442
cuggacaaga agcugcuaut t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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cuggacaaga agcugcuaut t 21
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<212> DNA
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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uugggguauu gaggucucat t 21
<210> 501
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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uggacuuggg guauugaggt t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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uggacuuggg guauugaggt t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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<400> 503
uggacuuggg guauugaggt t 21
<210> 504
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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<400> 505
agcaaccuac aggggcagct t 21
<210> 506
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<210> 507
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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ugucccuuuu aagcaaccut t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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ugucccuuuu aagcaaccut t 21
<210> 509
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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auacuguccc uuuuaagcat t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 510
auacuguccc uuuuaagcat t 21
<210> 511
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
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auacuguccc uuuuaagcat t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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aauacugucc cuuuuaagct t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 513
aauacugucc cuuuuaagct t 21
<210> 514
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 514
aauacugucc cuuuuaagct t 21
<210> 515
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 515
auagcagcuu cuuguccagt t 21
<210> 516
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 516
auagcagcuu cuuguccagt t 21
<210> 517
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 517
auagcagcuu cuuguccagt t 21
<210> 518
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 518
uccaguaguc uuucagggat t 21
<210> 519
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 519
aacggugcuc caguagucut t 21
<210> 520
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
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oligonucleotide
<400> 520
auugaggucu caggcagcct t 21
<210> 521
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 521
auugaggucu caggcagcct t 21
<210> 522
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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oligonucleotide
<400> 522
accuacaggg gcagcccugt t 21
<210> 523
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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oligonucleotide
<400> 523
accuacaggg gcagcccugt t 21
<210> 524
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 524
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
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oligonucleotide
<400> 525
uuuuaagcaa ccuacagggt t 21
<210> 526
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ugcagccccg gguacuccut t 21
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<212> DNA
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ugcagccccg gguacuccut t 21
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<212> DNA
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 528
ugcagccccg gguacuccut t 21
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<212> DNA
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<212> DNA
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ugcagccccg gguacuccut t 21
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<212> DNA
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gcagccccgg guacuccuut t 21
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<212> DNA
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gcagccccgg guacuccuut t 21
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<211> 21
<212> DNA
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gcagccccgg guacuccuut t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gcagccccgg guacuccuut t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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gcagccccgg guacuccuut t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
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caagaccgcc aaggaugcat t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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caagaccgcc aaggaugcat t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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caagaccgcc aaggaugcat t 21
<210> 541
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ugggugaccg auggcuucat t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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ugggugaccg auggcuucat t 21
<210> 543
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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<400> 543
ugggugaccg auggcuucat t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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ugggugaccg auggcuucat t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 545
ugggugaccg auggcuucat t 21
<210> 546
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 546
ggugaccgau ggcuucagut t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
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ggugaccgau ggcuucagut t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 548
ggugaccgau ggcuucagut t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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ggugaccgau ggcuucagut t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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ggugaccgau ggcuucagut t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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ccgauggcuu caguucccut t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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<400> 552
ccgauggcuu caguucccut t 21
<210> 553
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 553
ccgauggcuu caguucccut t 21
<210> 554
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 554
ccgauggcuu caguucccut t 21
<210> 555
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 555
ccgauggcuu caguucccut t 21
<210> 556
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 556
gauggcuuca guucccugat t 21
<210> 557
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 557
gauggcuuca guucccugat t 21
<210> 558
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 558
gauggcuuca guucccugat t 21
<210> 559
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 559
gauggcuuca guucccugat t 21
<210> 560
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 560
gauggcuuca guucccugat t 21
<210> 561
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 561
auggcuucag uucccugaat t 21
<210> 562
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 562
auggcuucag uucccugaat t 21
<210> 563
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 563
auggcuucag uucccugaat t 21
<210> 564
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 564
auggcuucag uucccugaat t 21
<210> 565
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 565
auggcuucag uucccugaat t 21
<210> 566
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 566
uggcuucagu ucccugaaat t 21
<210> 567
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 567
uggcuucagu ucccugaaat t 21
<210> 568
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 568
uggcuucagu ucccugaaat t 21
<210> 569
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 569
uggcuucagu ucccugaaat t 21
<210> 570
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 570
uggcuucagu ucccugaaat t 21
<210> 571
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 571
gcuucaguuc ccugaaagat t 21
<210> 572
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 572
gcuucaguuc ccugaaagat t 21
<210> 573
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 573
gcuucaguuc ccugaaagat t 21
<210> 574
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 574
gcuucaguuc ccugaaagat t 21
<210> 575
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 575
gcuucaguuc ccugaaagat t 21
<210> 576
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 576
cugaaagacu acuggagcat t 21
<210> 577
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 577
cugaaagacu acuggagcat t 21
<210> 578
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 578
cugaaagacu acuggagcat t 21
<210> 579
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 579
cugaaagacu acuggagcat t 21
<210> 580
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 580
cugaaagacu acuggagcat t 21
<210> 581
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 581
agcaccguua aggacaagut t 21
<210> 582
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 582
agcaccguua aggacaagut t 21
<210> 583
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 583
agcaccguua aggacaagut t 21
<210> 584
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 584
agcaccguua aggacaagut t 21
<210> 585
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
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agcaccguua aggacaagut t 21
<210> 586
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 586
gcaccguuaa ggacaaguut t 21
<210> 587
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 587
gcaccguuaa ggacaaguut t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 588
gcaccguuaa ggacaaguut t 21
<210> 589
<211> 21
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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oligonucleotide
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gcaccguuaa ggacaaguut t 21
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<212> DNA
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
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gcaccguuaa ggacaaguut t 21
<210> 591
<211> 21
<212> DNA
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gcugccugag accucaauat t 21
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ccucaauacc ccaaguccat t 21
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ccucaauacc ccaaguccat t 21
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<212> DNA
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agguugcuua aaagggacat t 21
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<212> DNA
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<212> DNA
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agguugcuua aaagggacat t 21
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agguugcuua aaagggacat t 21
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agguugcuua aaagggacat t 21
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ugcuuaaaag ggacaguaut t 21
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ugcuuaaaag ggacaguaut t 21
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ugcuuaaaag ggacaguaut t 21
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ugcuuaaaag ggacaguaut t 21
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ugcuuaaaag ggacaguaut t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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gcuuaaaagg gacaguauut t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gcuuaaaagg gacaguauut t 21
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<212> DNA
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
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gcuuaaaagg gacaguauut t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
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cuggacaaga agcugcuaut t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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oligonucleotide
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cuggacaaga agcugcuaut t 21
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<212> DNA
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oligonucleotide
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oligonucleotide
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cuggacaaga agcugcuaut t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
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cuggacaaga agcugcuaut t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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ucccugaaag acuacuggat t 21
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<212> DNA
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ucccugaaag acuacuggat t 21
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oligonucleotide
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oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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oligonucleotide
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agacuacugg agcaccguut t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 640
agacuacugg agcaccguut t 21
<210> 641
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 641
ggcugccuga gaccucaaut t 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 642
ggcugccuga gaccucaaut t 21
<210> 643
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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<400> 643
ggcugccuga gaccucaaut t 21
<210> 644
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 644
cagggcugcc ccuguaggut t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 645
cagggcugcc ccuguaggut t 21
<210> 646
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 646
cagggcugcc ccuguaggut t 21
<210> 647
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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oligonucleotide
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oligonucleotide
<400> 647
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<210> 648
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 648
cccuguaggu ugcuuaaaat t 21
<210> 649
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 649
cccuguaggu ugcuuaaaat t 21
<210> 650
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 650
aggaguaccc ggggcugcat t 21
<210> 651
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 651
aggaguaccc ggggcugcat t 21
<210> 652
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 652
aggaguaccc ggggcugcat t 21
<210> 653
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 653
aggaguaccc ggggcugcat t 21
<210> 654
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 654
aggaguaccc ggggcugcat t 21
<210> 655
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 655
aaggaguacc cggggcugct t 21
<210> 656
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 656
aaggaguacc cggggcugct t 21
<210> 657
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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uauugagguc ucaggcagct t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
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uauugagguc ucaggcagct t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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ugggguauug aggucucagt t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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ugggguauug aggucucagt t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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ugggguauug aggucucagt t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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<400> 724
ugggguauug aggucucagt t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
oligonucleotide
<400> 725
uugggguauu gaggucucat t 21
<210> 726
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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<400> 726
uugggguauu gaggucucat t 21
<210> 727
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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<400> 727
uugggguauu gaggucucat t 21
<210> 728
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic
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<400> 728
uugggguauu gaggucucat t 21
<210> 729
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
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uccaguaguc uuucagggat t 21
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aacggugcuc caguagucut t 21
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auugaggucu caggcagcct t 21
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auugaggucu caggcagcct t 21
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accuacaggg gcagcccugt t 21
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uuuuaagcaa ccuacagggt t 21
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uuuuaagcaa ccuacagggt t 21
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oligonucleotide
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uuuuaagcaa ccuacagggt t 21
Claims (26)
- APOC3 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 리보핵산(dsRNA)에 있어서, 상기 dsRNA는 이중가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며,
(a) 상기 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 AcuGGAGcAccGuuAAGGAdTsdT (SEQ ID NO: 164)를 포함하고 상기 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 UCCUuAACGGUGCUCcAGUdTsdT (SEQ ID NO:245)를 포함하거나;
(b) 상기 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 uGGAGcAccGuuAAGGAcAdTsdT (SEQ ID NO:170)을 포함하고 상기 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 UGUCCUuAACGGUGCUCcAdTsdT (SEQ ID NO:251)을 포함하거나;
(c) 상기 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 cuGGAGcAccGuuAAGGAcdTsdT (SEQ ID NO:171)을 포함하고 상기 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 GUCCUuAACGGUGCUCcAGdTsdT (SEQ ID NO:252)을 포함하거나;
(d) 상기 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 uAcuGGAGcAccGuuAAGGdTsdT (SEQ ID NO:175)을 포함하고 상기 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 CCUuAACGGUGCUCcAGuAdTsdT (SEQ ID NO:256)을 포함하거나; 또는
(e) 상기 센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 cuAcuGGAGcAccGuuAAGdTsdT (SEQ ID NO:176)을 포함하고 상기 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 서열 CUuAACGGUGCUCcAGuAGdTsdT (SEQ ID NO:257)을 포함하고;
여기서, 소문자 “g”, “a”, “u” 및 “c”는 2'-O-메틸 뉴클레오티드들이며, “Gf”, “Af”, “UF” 및 “Cf”는 각각 2'-플루오로 변형된 “G”, “A”, “U” 및 “C” 뉴클레오티드이고, dTsdT는 dT-포스포로티오에이트-dT 연결인 것을 특징으로 하는 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
리간드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 dsRNA. - 제9항에 있어서,
상기 리간드는 상기 dsRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 콘쥬게이트되는 것을 특징으로 하는 dsRNA. - 제1항에 있어서,
하나 이상의 N-아세틸-갈락토사민을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 dsRNA. - 제1항, 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 dsRNA를 포함하는 분리된 세포.
- 제1항, 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 dsRNA의 하나 이상의 가닥을 인코딩하는 벡터.
- 제13항의 벡터를 포함하는 분리된 세포.
- 제1항, 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 dsRNA를 포함하는, APOC3 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물로서, 고도 중성지방 수준의 예방 또는 치료용인 약학적 조성물.
- 제15항에 있어서,
지질 제형을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물. - 삭제
- 세포 내의 APOC3 발현을 억제하는 시험관 내(in vitro) 방법에 있어서,
(a) 상기 세포를 제1항, 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 dsRNA와 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 생성된 세포를 APOC3 유전자의 mRNA 전사물이 분해되는 시간 동안 유지하여, 상기 세포 내의 상기 APOC3 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 내의 APOC3 발현을 억제하는 방법. - 삭제
- 제1항, 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 dsRNA를 유효성분으로 포함하는, APOC3 발현에 의해 매개되는 질환의 치료용 약학적 조성물로서, 상기 질환은 고도 중성지방 수준인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제20항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 리포단백질 리파아제 및 간 리파아제 중 하나 이상의 활성 증가를 유발하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물. - 제20항에 있어서,
상기 dsRNA 또는 상기 약학적 조성물은 0.01 mg/kg 내지 10 mg/kg, 또는 0.5 mg/kg 내지 50 mg/kg의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물. - 제18항에 있어서, 상기 APOC3 발현이 적어도 30% 억제되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 질환은 중성지방 수준이 150mg/dL 초과 또는 500mg/dL 초과인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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