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KR102346988B1 - 항 b7-h4 항체 - Google Patents

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KR102346988B1
KR102346988B1 KR1020197004781A KR20197004781A KR102346988B1 KR 102346988 B1 KR102346988 B1 KR 102346988B1 KR 1020197004781 A KR1020197004781 A KR 1020197004781A KR 20197004781 A KR20197004781 A KR 20197004781A KR 102346988 B1 KR102346988 B1 KR 102346988B1
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acid sequence
seq
ser
nucleic acid
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야스토 아키야마
아키라 이이즈카
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시즈오카켄
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Abstract

높은 특이성·친화성을 갖는 새로운 항 B7-H4 항체를 제조하고, 그것을 이용한 암치료용 조성물을 제공하는 것을 과제로 하고, 인간 B7-H4 단백질의 세포외 도메인 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 새롭게 제조하고, 또한 그 모노클로날 항체의 항체 의존성 세포 상해 활성을 증강시키기 위해, 그 모노클로날 항체와 이펙터 세포를 결합시킨 「항 B7-H4 항체-이펙터 세포 복합체」 나, 그 모노클로날 항체의 항원 인식 영역과 이펙터 세포 항원 인식 영역을 포함하는 이중 특이성 항체를 제조하여, 암치료용 조성물로서 사용한다.

Description

항 B7-H4 항체
본 발명은 인간 B7-H4 단백질의 세포외 도메인을 인식하는 항체나, 상기 항체와 이펙터 세포가 결합한 연결 항체-세포 복합체나, 상기 항체의 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역을 포함하는 이중 특이성 항체 등에 관한 것이다.
B7-H4 는, B7 패밀리에 속하는 막단백질이고, 면역 체크 포인트 분자로서 알려져 있다 (비특허문헌 1). 폐, 간장, 난소 등의 여러 가지 정상 조직에 있어서, 저레벨의 B7-H4 mRNA 발현이 관찰되는 것이 분명해져 있지만, 이들 정상 조직에 있어서의 B7-H4 단백질의 발현은 확인되지 않았다. 한편, 난소암, 자궁암, 자궁 내막암 등의 여러 가지 암조직에 있어서는, 스테이지에 상관없이, B7-H4 단백질이 고발현하는 것이 분명해져 있다 (비특허문헌 2). 이러한 점에서, B7-H4 는, 새로운 암의 분자 마커나 암치료의 표적 분자로서 기대되고 있지만, B7-H4 의 발현이나 그 작용에 대해서는, 여전히 분명하지 않은 점이 많이 남아 있다.
최근의 항체 공학의 진보에 의해, 인간형 키메라 항체나 인간화 항체와 같이 인간에 대한 항원성이 낮고, 임상 응용 가능한 유전자 재조합 항체의 제조가 가능해졌으므로, 특히 암치료 분야를 중심으로 항체 의약품이 차례차례로 개발·인가되어오고 있다. 의약으로서 개발되고 있는 항체의 대부분은 분자량 약 150 kDa 의 인간 IgG 이고, 그 Fc 영역에 2 개의 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 결합하는 당 단백질이다. Fc 영역은 Fc 수용체나 보체 등이 결합하는 영역이고, 이 부분을 통하여 항체 의존성 세포 상해 활성 (antibody-dependent cellular cytotoxicity ; ADCC) 이나 보체 의존성 세포 상해 활성 (complement-dependent cytotoxicity ; CDC) 과 같은 이펙터 활성이 발휘되는 것으로 생각되고 있다.
실제로 암환자 Fc 수용체의 다형 해석으로부터, 비호지킨 림프종 치료약 항 CD20 항체 Rituxan(R) (리투시맵) 나 유방암 치료약 항 Her2 항체 Herceptin(R) (트라스투주맙) 의 주된 항종양 메커니즘의 하나는 ADCC 활성인 것이 분명해져 있으며 (비특허문헌 3 - 7), 의약 개발에 응용 가능한 ADCC 활성 증강 기술의 개발이 차세대 항체 기술로서 주목받고 있다.
B7-H4 를 특이적으로 인식하는 항체로는, 이미 몇 개의 모노클로날 항체가 개시되어 있다 (예를 들어, 특허문헌 1 및 2). 특히, 특허문헌 1 에는, 인비트로에 있어서 B7-H4 를 발현하는 암세포에 대해 ADCC 활성을 발휘하는 항 B7-H4 항체가 개시되어 있지만, 이러한 항체가 인비보에 있어서 ADCC 활성을 발휘할 가능성에 대해서는 분명하지 않다. 또, 특허문헌 1 에는, 상기 항 B7-H4 항체 또는 그 단편을 포함하는 이중 특이성 분자가 개시되어 있고, 구체예로서, B7-H4 와 Fc 수용체를 인식하는 이중 특이성 분자나 그 이중 특이성 분자에 의해, B7-H4 발현 세포를 이펙터 세포를 향하게 하여, Fc 수용체를 통한 이펙터 세포 활성 (항체 의존성 세포 매개성 세포 상해 작용 등) 을 유도할 수 있을 가능성이 기재되어 있지만, 그 효과는 실제로는 확인되지 않았다.
일본 공표특허공보 2011-505372호 일본 공표특허공보 2016-509582호
Immunity, 18, 849 (2003) Gynecol Oncol., 134, 181 (2014) Blood 99, 754 (2002) Cancer Res., 64, 4664 (2004) Arthritis Rheum., 48, 455 (2003) J. Clin. Oncol., 21, 3940 (2003) Clin. Cancer Res., 10, 5650 (2004)
본 발명의 과제는, 높은 특이성·친화성을 갖는 새로운 항 B7-H4 항체를 제조하고, 또한 그 항체의 ADCC 활성을 증강시킨 「연결 항체-세포 복합체」 나 「이중 특이성 항체」 등을 제조함으로써, 효과적인 암치료용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 인간 B7-H4 단백질의 세포외 도메인 단백질을 항원으로 하여 마우스를 면역하고, B7-H4 에 대한 결합능을 갖는 항체를 산생하는 복수의 하이브리도마주를 제조하였다. 그리고, ELISA 법 및 샌드위치 ELISA 법에 의해, 얻어진 하이브리도마주 유래의 항체 중에서, 유리형 B7-H4 에 대해 높은 특이성과 친화성을 갖는 8 종의 항 B7-H4 항체 (H4.018, H4.025, H4.051, H4.079, H4.113, H4.140, H4.160, 및 H4.209) 를 선정하고, 또한 B7-H4 단백질을 일과성으로 과잉 발현시킨 배양 세포를 사용한 면역 염색 실험에 의해, 상기 항 B7-H4 항체 중, 적어도 H4.018, H4.025, H4.113, H4.121, 및 H4.209 는 세포 표면 상에 발현하는 B7-H4 를 인식할 수 있는 것을 분명하게 하였다.
계속해서, 본 발명자들은, 상기 항 B7-H4 항체 (H4.018, H4.025, H4.113, H4.209) 를 사용하여, 인간 B7-H4 단백질을 발현하는 배양 암세포의 면역 염색을 실시하였다. 그러나, 얻어진 결과는, 실험에 사용한 어느 항 B7-H4 항체도, 암세포와 안정적인 결합을 유지할 수 없는 것을 시사하는 것이었다. 이 때문에, 본 발명자들은, 암치료를 위해서 상기 항 B7-H4 항체를 단독으로 사용한 경우에는, 충분한 ADCC 활성을 발휘할 수 없을 것으로 생각하였다.
그래서, 본 발명자들은, 상기 항 B7-H4 항체의 ADCC 활성을 증강시키는 방법을 예의 검토하여, 상기 항 B7-H4 항체와 이펙터 세포를 미리 결합시켜 표적 세포에 작용시키면, 간접적인 항체 의존성 세포 상해 (indirect ADCC ; iADCC) 를 유도할 수 있는 것은 아닐까라는 독창적인 아이디어를 생각해 내고, 실제로 「항 B7-H4 항체-이펙터 세포 복합체」 를 제조하여 그 효과를 확인하였다. 즉, 본 발명자들은, 인간 말초혈로부터 단리한 이펙터 세포에, 항 CD3 항체, 래빗 항 마우스 이뮤노글로블린 폴리클로날 항체, 및 항 B7-H4 항체 (H4.018, H4.025, H4.113, 또는 H4.209) 를 순서대로 결합시켜 4 종류의 항 B7-H4 항체-이펙터 세포 복합체 (항 B7-H4 항체-이펙터 세포 복합체, H4.018-이펙터 세포 복합체, H4.025-이펙터 세포 복합체, H4.113-이펙터 세포 복합체, 및 H4.209-이펙터 세포 복합체) 를 제조하고, 이들 항 B7-H4 항체-이펙터 세포 복합체를 사용한 세포 상해성 어세이를 실시한 결과, 적어도 H4.025-이펙터 세포 복합체는, 표적 암세포에 대한 세포 상해 활성을 발휘하는 것이 분명해졌다.
또한 본 발명자들은, 상기 항 B7-H4 항체 중 7 종의 항체 (H4.018, H4.025, H4.051, H4.113, H4.121, H4.140, 및 H4.209) 의 중사슬 및 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열 및 유전자 서열을 해석하고, 얻어진 서열 정보에 기초하여, B7-H4 와 CD3 항원 (T 세포 항원) 의 양방을 인식하는 2 종류의 이중 특이성 항체 (scFv-scFv 및 Fab-scFv) 를 제조하고, 그들의 효과를 in vitro 및 in vivo 에 있어서 확인하였다. 그 결과, 상기 scFv-scFv 및 Fab-scFv 는 모두, B7-H4 를 발현하는 암세포에 대해 농도 의존적인 세포 상해 활성을 나타내는 것, 또, 담암 마우스에 상기 Fab-scFv 를 투여하면, 종양 사이즈의 퇴축, 종양 조직 내에의 Fab-scFv 의 집적 및 CD8 양성 킬러 T 세포의 침윤, 종양 조직에 있어서의 B7-H4 양성의 암세포의 감소·소멸 등, 우수한 항종양 작용이 관찰되는 것을 분명하게 하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, (1) (a) 서열 번호 2 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역 ; (b) 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열 또는 서열 번호 4 의 제 3 번째 ∼ 제 111 번째에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 6 에 나타나는 아미노산 서열 혹은 서열 번호 6 의 제 4 번째 ∼ 제 104 번째에 나타나는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 8 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (c) 서열 번호 10 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 12 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (d) 서열 번호 14 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 16또는 18 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (e) 서열 번호 20 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 22 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (f) 서열 번호 24 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 26 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (g) 서열 번호 28 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 30 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; 의 (a) ∼ (g) 중 어느 영역을 포함하는, 인간 B7-H4 단백질의 세포외 도메인을 인식하는 항체나, (2) (A') 서열 번호 2 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역을 코드하는 핵산 서열 ; (B') 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열 또는 서열 번호 4 의 제 3 번째 ∼ 제 111 번째에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 6 에 나타나는 아미노산 서열 혹은 서열 번호 6 의 제 4 번째 ∼ 제 104 번째에 나타나는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 8 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 핵산 서열 ; (C') 서열 번호 10 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 12 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 핵산 서열 ; (D') 서열 번호 14 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 16 또는 18 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 핵산 서열 ; (E') 서열 번호 20 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 22 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 핵산 서열 ; (F') 서열 번호 24 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 26 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 핵산 서열 ; (G') 서열 번호 28 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 30 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 핵산 서열 ; 의 (A') ∼ (G') 중 어느 핵산 서열을 포함하는, 인간 B7-H4 단백질의 세포외 도메인을 인식하는 항체를 코드하는 핵산에 관한 것이다.
또, 본 발명은, (3) (A) 서열 번호 1 에 나타나는 핵산 서열 ; (B) 서열 번호 3 에 나타나는 핵산 서열 또는 서열 번호 38 의 제 64 번째 ∼ 제 390 번째에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 5 에 나타나는 핵산 서열, 혹은 서열 번호 36 의 제 76 번째 ∼ 제 378 번째에 나타나는 핵산 서열, 또는 서열 번호 7 에 나타나는 핵산 서열 ; (C) 서열 번호 9 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 11 에 나타나는 핵산 서열 ; (D) 서열 번호 13 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 15 또는 17 에 나타나는 핵산 서열 ; (E) 서열 번호 19 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 21 에 나타나는 핵산 서열 ; (F) 서열 번호 23 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 25 에 나타나는 핵산 서열 ; (G) 서열 번호 27 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 29 에 나타나는 핵산 서열 ; 의 (A) ∼ (G) 중 어느 핵산 서열을 포함하는, 상기 (2) 에 기재된 핵산이나, (4) 상기 (2) 또는 (3) 에 기재된 핵산을 함유하는 벡터나, (5) 상기 (4) 에 기재된 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체에 관한 것이다.
또한 본 발명은, (6) 모노클로날 항체인, 상기 (1) 에 기재된 항체나, (7) 상기 (6) 에 기재된 항체를 산생하는 하이브리도마나, (8) 상기 (1) 또는 (6) 에 기재된 항체를 구비한, 암세포 검출용 키트나, (9) 상기 (1) 또는 (6) 에 기재된 항체로 이루어지는 제 1 항체와, 이펙터 세포 항원을 인식하는 제 2 항체가 결합한, 항체 연결체나, (10) 제 2 항체가 CD3 항원을 인식하는 항체인, 상기 (9) 에 기재된 항체 연결체나, (11) 상기 (9) 또는 (10) 에 기재된 항체 연결체를 포함하는 암치료용 조성물로서, 상기 항체 연결체에 의해 이펙터 세포가 암세포에 송달되는, 암치료용 조성물이나, (12) 상기 (1) 또는 (6) 에 기재된 항체로 이루어지는 제 1 항체와, 이펙터 세포 항원을 인식하는 제 2 항체가 결합한 항체 연결체에, 이펙터 세포가 결합한 연결 항체-세포 복합체나, (13) 제 1 항체와 제 2 항체가, 상기 제 1 항체 및 상기 제 2 항체의 쌍방을 인식하는 제 3 항체를 통하여 결합한, 상기 (12) 에 기재된 연결 항체-세포 복합체나, (14) 제 1 항체 및 제 2 항체가 동일한 동물종 유래의 IgG 항체이고, 또한 제 3 항체가 상기 동물종의 IgG 항체를 인식하는 항체인, 상기 (12) 또는 (13) 에 기재된 연결 항체-세포 복합체나, (15) 제 1 항체 및 제 2 항체가 마우스 유래의 IgG 항체이고, 또한 제 3 항체가 마우스 유래의 IgG 항체를 인식하는 항체인, 상기 (12) ∼ (14) 중 어느 하나에 기재된 연결 항체-세포 복합체나, (16) 이펙터 세포가, 치료 대상이 되는 암환자로부터 채취된 이펙터 세포인, 상기 (12) ∼ (15) 중 어느 하나에 기재된 연결 항체-세포 복합체나, (17) 상기 (12) ∼ (16) 중 어느 하나에 기재된 연결 항체-세포 복합체를 유효 성분으로서 함유하는 암치료용 조성물에 관한 것이다.
또, 본 발명은, (18) (a) 서열 번호 2 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역 ; (b) 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열 또는 서열 번호 4 의 제 3 번째 ∼ 제 111 번째에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 6 에 나타나는 아미노산 서열 혹은 서열 번호 6 의 제 4 번째 ∼ 제 104 번째에 나타나는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 8 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (c) 서열 번호 10 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 12 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (d) 서열 번호 14 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 16 또는 18 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (e) 서열 번호 20 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 22 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (f) 서열 번호 24 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 26 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (g) 서열 번호 28 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 30 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; 의 (a) ∼ (g) 중 어느 영역과, 이펙터 세포 항원을 인식하는 영역을 포함하는, 이중 특이성 항체나, (19) 이펙터 세포 항원을 인식하는 영역이, CD3 항원을 인식하는 항체의 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역인, 상기 (18) 에 기재된 이중 특이성 항체나, (20) 1 본쇄 항체인 상기 (18) 또는 (19) 에 기재된 이중 특이성 항체나, (21) 서열 번호 32 또는 37 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는, 상기 (18) ∼ (20) 중 어느 하나에 기재된 이중 특이성 항체나, (22) Fab-scFv 융합체인 상기 (18) 또는 (19) 에 기재된 이중 특이성 항체나, (23) 서열 번호 39 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 장사슬과, 서열 번호 41 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 단사슬로 이루어지는, 상기 (18), (19), 및 (22) 중 어느 하나에 기재된 이중 특이성 항체나, (24) 상기 (18) ∼ (23) 중 어느 하나에 기재된 이중 특이성 항체를 코드하는 핵산에 관한 것이다.
또한 본 발명은, (25) (A) 서열 번호 1 에 나타나는 핵산 서열 ; (B) 서열 번호 3 에 나타나는 핵산 서열 또는 서열 번호 38 의 제 64 번째 ∼ 제 390 번째에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 5 에 나타나는 핵산 서열, 혹은 서열 번호 36 의 제 76 번째 ∼ 제 378 번째에 나타나는 핵산 서열, 또는 서열 번호 7 에 나타나는 핵산 서열 ; (C) 서열 번호 9 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 11 에 나타나는 핵산 서열 ; (D) 서열 번호 13 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 15 또는 17 에 나타나는 핵산 서열 ; (E) 서열 번호 19 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 21 에 나타나는 핵산 서열 ; (F) 서열 번호 23 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 25 에 나타나는 핵산 서열 ; (G) 서열 번호 27 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 29 에 나타나는 핵산 서열 ; 의 (A) ∼ (G) 중 어느 서열을 포함하는, 상기 (24) 에 기재된 핵산이나, (26) 서열 번호 31 또는 36 에 나타나는 핵산 서열을 포함하는, 상기 (24) 또는 (25) 에 기재된 핵산이나, (27) 서열 번호 38 에 나타나는 핵산 서열을 포함하는 핵산과, 서열 번호 40 에 나타나는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, 상기 (24) 또는 (25) 에 기재된 핵산이나, (28) 상기 (24) ∼ (27) 중 어느 하나에 기재된 핵산을 함유하는 벡터나, (29) 상기 (28) 에 기재된 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체나, (30) 상기 (18) ∼ (23) 중 어느 하나에 기재된 이중 특이성 항체를 포함하는 암치료용 조성물로서, 상기 이중 특이성 항체에 의해 이펙터 세포가 암세포에 송달되는, 암치료용 조성물이나, (31) 상기 (18) ∼ (23) 중 어느 하나에 기재된 이중 특이성 항체와, 이펙터 세포가 결합한, 이중 특이성 항체-세포 복합체나, (32) 이펙터 세포가, 치료 대상이 되는 암환자로부터 채취된 이펙터 세포인, 상기 (31) 에 기재된 이중 특이성 항체-세포 복합체나, (33) 상기 (31) 또는 (32) 에 기재된 이중 특이성 항체-세포 복합체를 유효 성분으로서 함유하는 암치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 유리형 인간 B7-H4 단백질 및/또는 세포 표면 상에 존재하는 인간 B7-H4 단백질을, 특이적 또한 고감도로 검출 가능한 항 B7-H4 항체를 제조할 수 있다. 또, 본 발명의 항 B7-H4 항체와 이펙터 세포를 인식하는 항체를 연결시킨 「항체 연결체」 나, 그 항체 연결체에 추가로 이펙터 세포를 연결시킨 「연결 항체-세포 복합체」 는, 본 발명의 항 B7-H4 항체의 ADCC 활성을 증강시켜, 인간 B7-H4 단백질을 발현하는 암세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있다. 또한 본 발명에 의하면, 상기 항 B7-H4 항체의 중사슬 및 경사슬 가변 영역의 서열 정보에 기초하여, 인간 B7-H4 단백질과 이펙터 세포 항원의 양방을 인식하는 이중 특이성 항체를 제조할 수 있다. 이러한 이중 특이성 항체는, 이펙터 세포를 암세포에 특이적으로 송달하여 효율적인 ADCC 를 유도할 수 있는 것이어서, 암치료용 의약 조성물로서 이용할 수 있을 가능성이 있다.
도 1 은, 인간 B7-H4, 인간 B7-H1, 및 인간 B7-DC 단백질에 대한 본 발명의 항 B7-H4 항체 (H4.018, H4.025, H4.051, H4.079, H4.113, H4.140, H4.160, 및 H4.209) 의 결합능을 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2 는, 상이한 농도의 인간 B7-H4 에 대한 본 발명의 항 B7-H4 항체 (H4.018, H4.025, H4.051, H4.113, H4.140, 및 H4.209) 의 결합능을 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3 은, 본 발명의 항 B7-H4 항체 (H4.018, H4.025, H4.051, H4.079, H4.113, H4.121, H4.140, H4.160, 및 H4.209) 및 시판되는 항체 (H74 클론) 에 의해, 인간 B7-H4 발현 293F 세포를 면역 염색한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 는, 복수의 암세포주에 있어서의 B7-H4 의 발현을, 시판되는 항 B7-H4 항체 (H74 클론) 를 사용하여 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는, 본 발명의 항 B7-H4 항체 (H4.018, H4.025, H4.113, H4.209) 의 MDA-MB-468 세포에 대한 결합을, 4 개의 상이한 조건하에 있어서 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6(a) 는, 본 발명의 연결 항체-세포 복합체의 모식도를 나타내는 도면이다. (b) 는, 본 발명의 연결 항체-세포 복합체에 의한 간접적인 항체 의존성 세포 상해 활성을 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중의 「H4.018」, 「H4.025」, 「H4.113」, 및 「H4.209」 는, 본 발명의 「H4.018-이펙터 세포 복합체」, 「H4.025-이펙터 세포 복합체」, 「H4.113-이펙터 세포 복합체」, 및 「H4.209-이펙터 세포 복합체」 를 각각 나타낸다.
도 7 은, H4.018 의 중사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 1) 및 아미노산 서열 (서열 번호 2) 을 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
도 8 은, H4.025 의 중사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 3) 및 아미노산 서열 (서열 번호 4) 을 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
도 9 는, H4.025 의 경사슬 가변 영역 (κ 사슬) 의 핵산 서열 (서열 번호 5) 및 아미노산 서열 (서열 번호 6) 을 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
도 10 은, H4.025 의 경사슬 가변 영역 (λ 사슬) 의 핵산 서열 (서열 번호 7) 및 아미노산 서열 (서열 번호 8) 을 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
도 11 은, H4.051 의 중사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 9) 및 아미노산 서열 (서열 번호 10) 을 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
도 12 는, H4.051 의 경사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 11) 및 아미노산 서열 (서열 번호 12) 을 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
도 13 은, H4.113 의 중사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 13) 및 아미노산 서열 (서열 번호 14) 을 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
도 14 는, H4.113 의 경사슬 가변 영역 (κ 사슬) 의 핵산 서열 (서열 번호 15) 및 아미노산 서열 (서열 번호 16) 을 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
도 15 는, H4.113 의 경사슬 가변 영역 (λ 사슬) 의 핵산 서열 (서열 번호 17) 및 아미노산 서열 (서열 번호 18) 을 나타내는 도면이다.
도 16 은, H4.121 의 중사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 19) 및 아미노산 서열 (서열 번호 20) 을 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
도 17 은, H4.121 의 경사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 21) 및 아미노산 서열 (서열 번호 22) 을 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
도 18 은, H4.140 의 중사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 23) 및 아미노산 서열 (서열 번호 24) 을 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
도 19 는, H4.140 의 경사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 25) 및 아미노산 서열 (서열 번호 26) 을 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
도 20 은, H4.209 의 중사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 27) 및 아미노산 서열 (서열 번호 28) 을 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
도 21 은, H4.209 의 경사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 29) 및 아미노산 서열 (서열 번호 30) 을 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
도 22 는, 본 발명의 이중 특이성 항체 (BsAb) 의 구조를 나타내는 도면이다.
도 23a 은, 본 발명의 BsAb 의 핵산 서열 (서열 번호 31 의 제 1 ∼ 제 495 번째까지의 핵산 서열) 및 아미노산 서열 (서열 번호 32 의 제 1 ∼ 제 165 번째까지의 아미노산 서열) 을 나타내는 도면이다.
도 23b 는, 본 발명의 BsAb 의 핵산 서열 (서열 번호 31 의 제 496 ∼ 제 1035 번째까지의 핵산 서열) 및 아미노산 서열 (서열 번호 32 의 제 166 ∼ 제 345 번째까지의 아미노산 서열) 을 나타내는 도면이다.
도 23c 은, 본 발명의 BsAb 의 핵산 서열 (서열 번호 31 의 제 1036 ∼ 제 1500 번째까지의 핵산 서열) 및 아미노산 서열 (서열 번호 32 의 제 346 ∼ 제 500 번째까지의 아미노산 서열) 을 나타내는 도면이다.
도 24 는, 본 발명의 scFv-scFv 의 구조를 나타내는 도면이다.
도 25a 은, 본 발명의 scFv-scFv 의 핵산 서열 (서열 번호 36 의 제 1 ∼ 제 540 번째까지의 핵산 서열) 및 아미노산 서열 (서열 번호 37 의 제 1 ∼ 제 180 번째까지의 아미노산 서열) 을 나타내는 도면이다.
도 25b 는, 본 발명의 scFv-scFv 의 핵산 서열 (서열 번호 36 의 제 541 ∼ 제 1080 번째까지의 핵산 서열) 및 아미노산 서열 (서열 번호 37 의 제 181 ∼ 제 360 번째까지의 아미노산 서열) 을 나타내는 도면이다.
도 25c 은, 본 발명의 scFv-scFv 의 핵산 서열 (서열 번호 36 의 제 1081 ∼ 제 1602 번째까지의 핵산 서열) 및 아미노산 서열 (서열 번호 37 의 제 361 ∼ 제 533 번째까지의 아미노산 서열) 을 나타내는 도면이다.
도 26 은, 본 발명의 Fab-scFv 의 구조를 나타내는 도면이다.
도 27a 은, 본 발명의 Fab-scFv 의 장사슬의 핵산 서열 (서열 번호 38 의 제 1 ∼ 제 540 번째까지의 핵산 서열) 및 아미노산 서열 (서열 번호 39 의 제 1 ∼ 제 180 번째까지의 아미노산 서열) 을 나타내는 도면이다.
도 27b 는, 본 발명의 Fab-scFv 의 장사슬의 핵산 서열 (서열 번호 38 의 제 541 ∼ 제 1080 번째까지의 핵산 서열) 및 아미노산 서열 (서열 번호 39 의 제 181 ∼ 제 360 번째까지의 아미노산 서열) 을 나타내는 도면이다.
도 27c 은, 본 발명의 Fab-scFv 의 장사슬의 핵산 서열 (서열 번호 38 의 제 1081 ∼ 제 1521 번째까지의 핵산 서열) 및 아미노산 서열 (서열 번호 39 의 제 361 ∼ 제 506 번째까지의 아미노산 서열) 을 나타내는 도면이다.
도 28a 은, 본 발명의 Fab-scFv 의 단사슬의 핵산 서열 (서열 번호 40 의 제 1 ∼ 제 540 번째까지의 핵산 서열) 및 아미노산 서열 (서열 번호 41 의 제 1 ∼ 제 180 번째까지의 아미노산 서열) 을 나타내는 도면이다.
도 28b 는, 본 발명의 Fab-scFv 의 단사슬의 핵산 서열 (서열 번호 40 의 제 541 ∼ 제 726 번째까지의 핵산 서열) 및 아미노산 서열 (서열 번호 41 의 제 181 ∼ 제 241 번째까지의 아미노산 서열) 을 나타내는 도면이다.
도 29 는, 항 B7-H4 항체 (H4.025) 및 본 발명의 Fab-scFv 를 사용하여, 4 종의 유방암 세포 (MDA-MB-468 세포, MDA-MB-231 세포, SKBR3 세포, 및 ZR75 세포) 의 면역 염색을 실시한 결과를 나타내는 도면이다.
도 30 은, 유방암 세포 (MDA-MB-468 세포) 에 대한 본 발명의 scFv-scFv 및 Fab-scFv 의 세포 상해 활성을 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중, 「％Lysis」 는, 측정 시그널과 계면 활성제에 의해 가용화된 세포에 의한 총시그널의 비율을 나타내고, 「ng/㎖」 는, 본 발명의 Fab-scFv 의 첨가 농도를 나타낸다.
도 31 은, 4 종의 암세포에 대한 본 발명의 scFv-scFv 및 Fab-scFv 의 세포 상해 활성을 조사한 결과를 나타내는 도면이다. MDA-MB-231 세포, ZR75 세포, 및 SKBR3 세포는 유방암 유래의, NCI-H2170 세포는 폐편평 상피암 유래의 세포주이다.
도 32 는, 담암 마우스의 종양 사이즈에 미치는 본 발명의 Fab-scFv 의 영향을 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 담암 마우스는, 인간 말초혈 단핵구 및 인간 암세포 (MDA-MB-468 세포 또는 NCI-H2170 세포) 를 MHC 녹아웃 NOG 마우스에 이식함으로써 제조하였다.
도 33 은, 담암 마우스의 종양 조직에 미치는 본 발명의 Fab-scFv 의 영향을, 헤마톡실린에오신 염색에 의해 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중, 「Control」 은 미처리된 담암 마우스 유래의 종양 조직을, 「antibody treated」 는 본 발명의 Fab-scFv 를 투여한 담암 마우스 유래의 종양 조직을 각각 나타낸다.
도 34 는, 담암 마우스의 종양 조직에 미치는 본 발명의 Fab-scFv 의 영향을, 항 CD8 항체 및 항 B7-H4 항체 (H4.025) 를 사용한 면역 염색에 의해 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중, 「Control」 은 미처리된 담암 마우스 유래의 종양 조직을, 「antibody treated」 는 본 발명의 Fab-scFv 를 투여한 담암 마우스 유래의 종양 조직을 각각 나타낸다.
도 35 는,담암 마우스에 있어서의 본 발명의 Fab-scFv 의 국재를 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명의 항체로는, 인간 B7-H4 단백질의 세포외 도메인을 인식하는 항체로서, (a) 서열 번호 2 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역 ; (b) 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열 또는 서열 번호 4 의 제 3 번째 ∼ 제 111 번째에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 6 에 나타나는 아미노산 서열 혹은 서열 번호 6 의 제 4 번째 ∼ 제 104 번째에 나타나는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 8 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (c) 서열 번호 10 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 12 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (d) 서열 번호 14 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 16 또는 18 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (e) 서열 번호 20 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 22 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (f) 서열 번호 24 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 26 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (g) 서열 번호 28 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 30 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; 의 (a) ∼ (g) 중 어느 영역을 포함하는 항체이면 특별히 제한되지 않지만, 상기 (a), (b), (d), (e), 및 (g) 중 어느 영역을 포함하는 항체인 것이 바람직하고, 상기 (b) 의 영역을 포함하는 항체인 것이 보다 바람직하다. 여기서 「항체」 란, 완전 길이의 항체 또는 그 단편을 의미하고, 생물로부터의 천연 항체, 개변 항체, 및 유전자 재조합에 의해 제조된 항체 중 어느 것이어도 된다. 또, 본 발명의 항체의 형태로는, 예를 들어, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 폴리클로날 항체, 단사슬 항체, 항이디오타이프 (항 Id) 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFV (1 본쇄 항체) 등을 바람직하게 들 수 있지만, 특히 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.
상기 본 발명의 항체 중, 상기 (b) 또는 (d) 의 영역을 포함하는 항체는 각각, 2 종류의 경사슬 가변 영역 (카파 (κ) 및 람다 (λ)) 중 일방, 또는 양방의 경사슬 가변 영역을 포함하고 있어도 된다. 보다 구체적으로는, 상기 (b) 의 영역을 포함하는 항체로는, i) 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역과 서열 번호 6 (κ 사슬) 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 항체 ; ii) 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역과 서열 번호 8 (λ 사슬) 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 항체 ; iii) 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역과, 서열 번호 6 (κ 사슬) 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 8 (λ 사슬) 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 항체 ; 의 i) ∼ iii) 중 어느 항체를 들 수 있고, 상기 (d) 의 영역을 포함하는 항체로는, iv) 서열 번호 14 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역과 서열 번호 16 (κ 사슬) 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 항체 ; v) 서열 번호 14 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역과 서열 번호 18 (λ 사슬) 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 항체 ; vi) 서열 번호 14 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역과, 서열 번호 16 (κ 사슬) 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 18 (λ 사슬) 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 항체 ; 의 iv) ∼ vi) 중 어느 항체를 들 수 있다.
또, 본 발명의 핵산으로는, 인간 B7-H4 단백질의 세포외 도메인을 인식하는 항체를 코드하는 핵산으로서, (A') 서열 번호 2 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역을 코드하는 핵산 서열 ; (B') 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열 또는 서열 번호 4 의 제 3 번째 ∼ 제 111 번째에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 6 에 나타나는 아미노산 서열 혹은 서열 번호 6 의 제 4 번째 ∼ 제 104 번째에 나타나는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 8 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 핵산 서열 ; (C') 서열 번호 10 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 12 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 핵산 서열 ; (D') 서열 번호 14 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 16 또는 18 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 핵산 서열 ; (E') 서열 번호 20 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 22 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 핵산 서열 ; (F') 서열 번호 24 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 26 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 핵산 서열 ; (G') 서열 번호 28 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 30 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 핵산 서열 ; 중 어느 것을 포함하는 핵산이면 특별히 제한되지 않고, 상기 핵산 서열은 발현시키는 숙주 세포에 맞추어 코돈 서열의 최적화가 되어 있어도 된다. 보다 구체적으로는, 상기 핵산 서열로는, (A) 서열 번호 1 에 나타나는 핵산 서열 ; (B) 서열 번호 3 에 나타나는 핵산 서열 또는 서열 번호 38 의 제 64 번째 ∼ 제 390 번째에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 5 에 나타나는 핵산 서열, 혹은 서열 번호 36 의 제 76 번째 ∼ 제 378 번째에 나타나는 핵산 서열, 또는 서열 번호 7 에 나타나는 핵산 서열 ; (C) 서열 번호 9 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 11 에 나타나는 핵산 서열 ; (D) 서열 번호 13 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 15 또는 17 에 나타나는 핵산 서열 ; (E) 서열 번호 19 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 21 에 나타나는 핵산 서열 ; (F) 서열 번호 23 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 25 에 나타나는 핵산 서열 ; (G) 서열 번호 27 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 29 에 나타나는 핵산 서열 ; 중 어느 핵산 서열을 포함하는 핵산을 바람직하게 예시할 수 있다.
본 발명의 벡터로는, 상기 본 발명의 핵산을 포함하는 것이면 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 핵산을 발현 벡터에 적절히 인터그레이트함으로써 구축할 수 있다. 상기 발현 벡터로는, 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능한 것이나, 혹은 숙주 세포의 염색체 중에 삽입 가능한 것이 바람직하고, 본 발명의 핵산에 의해 코드되는 중사슬 또는 경사슬 가변 영역의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 위치에 프로모터, 엔핸서, 터미네이터 등의 제어 서열을 함유하고 있는 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 발현 벡터로는, 동물 세포용 발현 벡터, 효모용 발현 벡터, 세균용 발현 벡터 등을 사용할 수 있지만, 동물 세포용 발현 벡터를 사용한 재조합 벡터가 바람직하다.
상기 동물 세포용 발현 벡터로는, 예를 들어, pcDNA3 (Stratagene 사 제조), pCMV-FLAG6a (Sigma 사 제조), pEGFP-C3 (Clontech 사 제조), pcDM8 (후나코시사에서 시판), pAGE107 [일본 공개특허공보 평3-22979 ; Cytotechnology, 3, 133, (1990)], pAS3-3 (일본 공개특허공보 평2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)], pcDNAI/Amp (Invitrogen 사 제조), pREP4 (Invitrogen 사 제조), pAGE103 [J. Blochem., 101, 1307 (1987)], pAGE210 등을 예시할 수 있다. 동물 세포용의 프로모터로는, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 (인간 CMV) 의 IE (immediateearly) 유전자의 프로모터, SV40 의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα 프로모터 등을 들 수 있다. 또, 상기 효모용 발현 벡터로는, 예를 들어, YEp13(ATCC37115), YEp24(ATCC37051), Ycp5O(ATCC37419), pHS19, pHS15 등을 예시할 수 있다. 효모용의 프로모터로는, 예를 들어, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal1 프로모터, gal10 프로모터, 히트 쇼크 단백질 프로모터, MFα1 프로모터, CUP1 프로모터 등의 프로모터를 들 수 있다. 또한 상기 세균용 발현 벡터로는, 예를 들어, pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (모두 베링거만하임사에서 시판), pGEX4T (Amersham Bioscience 사 제조), pKK233-2 (Pharmacia 사 제조), pSE280 (Invitrogen 사 제조), pGEMEX-1 (Promega 사 제조), pQE-8 (QIAGEN 사 제조), pQE-30 (QIAGEN 사 제조), pKYP10 (일본 공개특허공보 소58-110600), pKYP200 [Agrc. Biol. Chem., 48, 669(1984)], PLSA1 [Agrc. Blo1. Chem., 53, 277(1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)], pBluescriptII SK(+), pBluescriptII SK(-) (Stratagene 사 제조), pTrS30 (FERMBP-5407), pTrS32 (FERM BP-5408), pGEX (Pharmacia 사 제조), pET-3 (Novagen 사 제조), pTerm2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pUC18 [Gene, 33, 103(1985)], pUC19 [Gene, 33, 103(1985)], pSTV28 (타카라 주조사 제조), pSTV29 (타카라 주조사 제조), pUC118 (타카라 주조사 제조), pQE-30 (QIAGEN 사 제조) 등을 들 수 있다. 세균용의 프로모터로는, 예를 들어, trp 프로모터 (P trp), lac 프로모터 (P lac), PL 프로모터, PR 프로모터, PSE 프로모터 등의 대장균이나 파지 등에서 유래하는 프로모터, SP01 프로모터, SP02 프로모터, penP 프로모터 등을 들 수 있다.
본 발명의 형질 전환체로는, 상기 본 발명의 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체이면 특별히 제한되지 않고, 여기서 사용되는 숙주 세포로는, 예를 들어, L 세포, CHO 세포, COS 세포, HeLa 세포, C127 세포, BALB/c3T3 세포 (디하이드로 엽산 리덕타아제나 티미딘키나아제 등을 결손한 변이주를 포함한다), BHK21 세포, HEK293 세포, Bowes 악성 흑색종 세포 등의 동물 세포나, 효모, 아스페르길루스 등의 진균 세포나, 대장균, 스트렙토마이세스, 고초균, 스트렙토코쿠스, 스타필로코쿠스 등의 세균 원핵 세포나, 드로소필라 S2, 스포돕테라 Sf9 등의 곤충 세포나, 애기장대 등의 식물 세포 등을 들 수 있다. 또, 본 발명의 재조합 벡터의 숙주 세포로의 도입 방법은, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 방법을 사용할 수 있다. 그 도입 방법으로서 구체적으로는, Davis 들 (BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986) 및 Sambrook 들 (MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) 등의 많은 표준적인 실험실 매뉴얼에 기재되는 방법, 예를 들어, 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 트랜스벡션 (transvection), 마이크로인젝션, 카티온성 지질 매개 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 형질 도입, 감염 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체로는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 이하의 실시예에 기재된 H4.018, H4.025, H4.051, H4.113, H4.121, H4.140, 및 H4.209 등을 바람직하게 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 (a) 의 영역 (서열 번호 2 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역) 을 포함하는 모노클로날 항체로는 H4.018 을, 상기 (b) 의 영역 (서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 6 또는 8 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역) 을 포함하는 모노클로날 항체로는 H4.025 를, 상기 (c) 의 영역 (서열 번호 10 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 12 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역) 을 포함하는 모노클로날 항체로는 H4.051 을, 상기 (d) 의 영역 (서열 번호 14 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 16 또는 18 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역) 을 포함하는 모노클로날 항체로는 H4.113 을, 상기 (e) 의 영역 (서열 번호 20 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 22 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역) 을 포함하는 모노클로날 항체로는 H4.121 을, 상기 (f) 의 영역 (서열 번호 24 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 26 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역) 을 포함하는 모노클로날 항체로는 H4.140 을, 상기 (g) 의 영역 (서열 번호 28 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 30 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역) 을 포함하는 모노클로날 항체로는 H4.209 를, 각각 바람직하게 예시할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체로는, 유리형 인간 B7-H4 단백질과 세포 표면 상에 존재하는 인간 B7-H4 단백질의 양방을 인식할 수 있다는 점에서, H4.018, H4.025, H4.113, H4.121, 및 H4.209 가 바람직하고, 그 중에서도, H4.025 가 특히 바람직하다.
상기 본 발명의 모노클로날 항체 중, 상기 (b) 또는 (d) 의 영역을 포함하는 모노클로날 항체는 각각, 2 종류의 경사슬 가변 영역 (카파 (κ) 및 람다 (λ)) 중 일방, 또는 양방의 경사슬 가변 영역을 포함하고 있어도 된다. 보다 구체적으로는, 상기 (b) 의 영역을 포함하는 모노클로날 항체는, I) 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역과 서열 번호 6 (κ 사슬) 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체 ; II) 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역과 서열 번호 8 (λ 사슬) 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체 ; III) 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역과, 서열 번호 6 (κ 사슬) 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 8 (λ 사슬) 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체 ; 의 I) ∼ III) 중 어느 모노클로날 항체, 혹은 상기 I) 및 II) 의 모노클로날 항체가 혼합한 항체이어도 되고, 또, 상기 (d) 의 영역을 포함하는 모노클로날 항체는, IV) 서열 번호 14 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역과 서열 번호 16 (κ 사슬) 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체 ; V) 서열 번호 14 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역과 서열 번호 18 (λ 사슬) 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체 ; VI) 서열 번호 14 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역과, 서열 번호 16 (κ 사슬) 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 18 (λ 사슬) 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체 ; 의 IV) ∼ VI) 중 어느 모노클로날 항체, 혹은 상기 IV) 및 V) 의 모노클로날 항체가 혼합한 항체이어도 된다.
본 발명의 모노클로날 항체는, 예를 들어, 하이브리도마법 (Nature 256, 495-497, 1975), 트리오마법, 인간 B 세포 하이브리도마법 (Immunology Today 4, 72, 1983) 및 EBV-하이브리도마법 (MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985) 등의 임의의 방법을 사용하여 제조할 수 있지만, 특히 하이브리도마법에 의해 제조하는 것이 바람직하다. 또, 본 발명의 하이브리도마로는, 상기 본 발명의 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마이면 특별히 제한되지 않지만, 보다 구체적으로는, 이하의 실시예에 기재된 하이브리도마 클론 #18, #25, #51, #113, #121, #140, 및 #209 (각각, 본 발명의 모노클로날 항체 H4.018, H4.025, H4.051, H4.113, H4.121, H4.140, 및 H4.209 를 산생하는 하이브리도마 클론) 를 바람직하게 예시할 수 있고, 그 중에서도, 하이브리도마 클론 #18, #25, #113, #121, 및 #209 를 바람직하게 예시할 수 있고, 하이브리도마 클론 #25 를 특히 바람직하게 예시할 수 있다.
본 발명의 암세포 검출용 키트로는, 상기 본 발명의 항체를 구비한 것이면 특별히 제한되지 않지만, 특히, 상기 본 발명의 모노클로날 항체를 구비한 것을 바람직하게 예시할 수 있다. 본 발명의 암세포 검출용 키트에 포함되는 항체는, 검출 방법에 따라, 플루오레세인이소시아네이트, 테트라메틸로다민이소시아네이트 등의 형광 물질이나, 125I, 32P, 14C, 35S, 3H 등의 라디오아이소토프나, 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 피코에리트린 등의 효소로 표식되어 있어도 되고, 그린 형광 단백질 (GFP) 등의 형광 발광 단백질 등과 융합시킨 융합 단백질이어도 된다. 또, 본 발명의 암세포 검출용 키트는, 상기 본 발명의 항체에 더하여, ELISA 법, 샌드위치 ELISA 법, 면역 염색법, RIA 법 등의 공지된 단백질 검출 및/또는 측정 방법을 위한 시약, 용액, 희석제, 세정용 완충액, 표준 물질, 상기 본 발명의 항체에 대해 특이적으로 면역학적 반응을 하는 표식 항체 (2 차 항체), 발색·발광 또는 형광을 발생시키는 기질 시약, 순서와 평가 방법을 기재한 순서서 등을 추가로 포함하고 있어도 되고, 간편하게 검사할 수 있도록 구성된 것이 바람직하다. 상기 본 발명의 암세포 검출용 키트는, 인간 B7-H4 단백질을 발현하는 암세포나 암조직이면, 어떠한 종류의 암에 대해서도 사용할 수 있지만, 특히, B7-H4 단백질이 고발현하는 것이 알려져 있는 난소암, 자궁암, 자궁 내막암, 폐암, 유방암 등의 검출에 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 본 발명의 항체와, 이펙터 세포 항원을 인식하는 항체가 결합한 「항체 연결체」 나, 그 항체 연결체와 이펙터 세포가 결합한 「연결 항체-세포 복합체」 에 관한 것이다. 상기 본 발명의 항체 연결체로는, 상기 본 발명의 항체로 이루어지는 제 1 항체와, 이펙터 세포 항원을 인식하는 제 2 항체가 결합한 것이면 특별히 제한되지 않지만, 제 2 항체가 CD3 항원을 인식하는 항체인 것이 바람직하고, 또, 상기 본 발명의 연결 항체-세포 복합체로는, 상기 본 발명의 항체로 이루어지는 제 1 항체와, 이펙터 세포 항원을 인식하는 제 2 항체가 결합한 항체 연결체에, 이펙터 세포가 결합한 것이면 특별히 제한되지 않지만, 제 1 항체와 제 2 항체가, 상기 제 1 항체 및 상기 제 2 항체의 쌍방을 인식하는 제 3 항체를 통하여 결합하고 있는 것이 바람직하고, 제 1 항체 및 제 2 항체가 동일한 동물종 유래의 IgG 항체이고, 또한, 제 3 항체가 상기 동물종의 IgG 항체를 인식하는 항체인 것이 보다 바람직하고, 제 1 항체 및 제 2 항체가 마우스 유래의 IgG 항체이고, 또한, 제 3 항체가 마우스 유래의 IgG 항체를 인식하는 항체인 것이 특히 바람직하다. 여기서 「이펙터 세포」 란, Fc 수용체를 발현하는 면역계의 세포로서, 표적 세포의 세포 표면 상에 결합한 항체의 Fc 영역과 결합하여 그 표적 세포를 사멸시키는 활성을 갖는 세포를 의미하고, 구체적으로는, T 세포, 단구, 매크로파지, 호중구, 수상 (樹狀) 세포, 호산구, 마스트 세포, 혈소판, B 세포, 대형 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 내추럴 킬러 (NK) 세포 등을 바람직하게 예시할 수 있지만, 특히, T 세포인 것이 바람직하다. 또, 상기 이펙터 세포는 어떠한 동물종에서 유래하는 것이어도 되고, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이 등에서 유래하는 이펙터 세포를 바람직하게 예시할 수 있지만, 인간 유래의 이펙터 세포인 것이 바람직하고, 치료 대상이 되는 암환자로부터 채취된 이펙터 세포인 것이 특히 바람직하다.
상기 본 발명의 「항체 연결체」 및 「연결 항체-세포 복합체」 는, 인간 B7-H4 단백질에 대한 결합능을 유지하면서, 증강된 ADCC 활성을 발휘한다 (또한, 본 명세서에 있어서는, 「항체 연결체」 및 「연결 항체-세포 복합체」 에 의해 유도되는 ADCC 를, 「간접적인 ADCC (iADCC)」 라고 칭하는 경우가 있다). 즉, 이펙터 세포의 존재하에서, 본 발명의 항체를 단독으로 표적 세포 (인간 B7-H4 단백질을 발현하는 암세포) 에 작용시켜도 ADCC 활성이 불충분하거나, 또는 완전히 관찰되지 않는 경우에도, 이러한 본 발명의 항체를 사용하여 상기 「항체 연결체」 또는 「연결 항체-세포 복합체」 를 제조함으로써, 이펙터 세포를 효율적으로 표적 세포에 송달하여 표적 세포의 용해를 일으킬 수 있다. 따라서, 상기 본 발명의 「항체 연결체」 및 「연결 항체-세포 복합체」 는, 암치료용 조성물의 성분으로서 이용할 수 있다. 본 발명의 「항체 연결체를 포함하는 암치료용 조성물」 로는, 본 발명의 항체 연결체를 포함하고, 또한 그 항체 연결체에 의해 이펙터 세포가 암세포에 송달되는 것이면 특별히 제한되지 않고, 또, 본 발명의 「연결 항체-세포 복합체를 포함하는 암치료용 조성물」 로는, 본 발명의 연결 항체-세포 복합체를 유효 성분으로서 포함하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 여기서, 치료의 대상이 되는 「암」 으로는, 인간 B7-H4 단백질을 발현하는 암이면 어떠한 종류의 암이어도 되지만, B7-H4 단백질을 고발현하는 난소암, 자궁암, 자궁 내막암, 폐암, 유방암 등을 특히 바람직하게 예시할 수 있다.
또, 본 발명은, 인간 B7-H4 단백질과, 이펙터 세포 항원을 인식하는 이중 특이성 항체에 관한 것이다. 상기 본 발명의 이중 특이성 항체로는, (a) 서열 번호 2 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역 ; (b) 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열 또는 서열 번호 4 의 제 3 번째 ∼ 제 111 번째에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 6 에 나타나는 아미노산 서열 혹은 서열 번호 6 의 제 4 번째 ∼ 제 104 번째에 나타나는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 8 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (c) 서열 번호 10 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 12 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (d) 서열 번호 14 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 16 또는 18 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (e) 서열 번호 20 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 22 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (f) 서열 번호 24 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 26 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; (g) 서열 번호 28 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 30 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ; 의 (a) ∼ (g) 중 어느 영역과, 이펙터 세포 항원을 인식하는 영역을 포함하는 것이면 특별히 제한되지 않고, 상기 「이펙터 세포 항원」 으로는, T 세포, 단구, 매크로파지, 호중구, 수상 세포, 호산구, 마스트 세포, 혈소판, B 세포, 대형 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 내추럴 킬러 (NK) 세포 등의 이펙터 세포의 세포 표면 상에 특이적 또는 고레벨로 존재하는 항원이면 어떠한 항원이어도 되고, 구체적으로는, CD3, CD2, CD28, CD44, C69, A13, G1 등의 T 세포 항원이나, 3G8, B73.1, LEUL1, VEP13, AT10 등의 내추럴 킬러 (NK) 세포 항원을 바람직하게 예시할 수 있지만, T 세포 항원인 CD3 을 특히 바람직하게 예시할 수 있다.
상기 본 발명의 이중 특이성 항체는, 당 기술 분야에서 공지된 여러 가지 방법에 의해 제조할 수 있고, 구체적으로는, 예를 들어, 상기 본 발명의 항체에 있어서의 항원 결합 영역과, 이펙터 세포 항원을 인식하는 영역을 유전자 조작에 의해 융합시켜 1 본쇄 항체를 제조하는 방법이나, 하이브리드 하이브리도마, 즉 쿠아드로마 (quadroma) 라고 불리는 2 종류의 상이한 모노클로날 항체 산생 세포의 융합체를 사용하여 산생하는 방법이나 (미국 특허 제4,474,893호), 2 종류의 모노클로날 항체의 Fab 단편 또는 Fab' 단편을 화학적으로 결합시켜 제조하는 방법이나 (M. Brennan et al., Science 1985, 229(1708) : 81-3), 2 개의 완전한 모노클로날 항체를 공유 결합함으로써 제조하는 방법 (B. Karpovsky et al., J. Exp. Med. 1984, 160(6) :1686-701) 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 본 발명의 이중 특이성 항체로는, 상기 본 발명의 항체에 있어서의 항원 결합 영역을 포함하는 scFv 와, 이펙터 세포 항원을 인식하는 영역을 포함하는 scFv 를 유전자 조작에 의해 융합시켜 제조된 1 본쇄 항체 (scFv-scFv) 나, 상기 본 발명의 항체에 있어서의 항원 결합 영역을 포함하는 Fab 와 이펙터 세포 항원을 인식하는 영역을 포함하는 scFv 를 융합시킨 Fab-scFv 인 것이 바람직하다. 본 발명의 1 본쇄 항체 (scFv-scFv) 로는, 본 발명의 항 B7-H4 유래의 중사슬 및 경사슬 가변 영역과, 이펙터 세포 항원을 인식하는 항체 유래의 중사슬 및 경사슬 가변 영역이, 단일 단백질 사슬로서 제조되는 것을 가능하게 하는 합성 링커를 통하여 조합되어 있는 2 가 항체이면 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는, 서열 번호 32 또는 37 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 1 본쇄 항체를 바람직하게 예시할 수 있다. 또, 본 발명의 Fab-scFv 로는, 본 발명의 항 B7-H4 유래의 중사슬 및 경사슬 가변 영역을 포함하는 Fab 와, 이펙터 세포 항원을 인식하는 항체 유래의 중사슬 및 경사슬 가변 영역을 포함하는 scFv 가 조합된 Fab-scFv 나, 혹은 반대로, 본 발명의 항 B7-H4 유래의 중사슬 및 경사슬 가변 영역을 포함하는 scFv 와, 이펙터 세포 항원을 인식하는 항체 유래의 중사슬 및 경사슬 가변 영역을 포함하는 Fab 가 조합된 Fab-scFv 이면 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는, 서열 번호 39 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 장사슬과, 서열 번호 41 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 단사슬로 이루어지는 Fab-scFv 를 바람직하게 예시할 수 있다.
또, 본 발명은, 상기 본 발명의 이중 특이성 항체를 코드하는 핵산에 관한 것이다. 상기 「본 발명의 이중 특이성 항체를 코드하는 핵산」 으로는, (A) 서열 번호 1 에 나타나는 핵산 서열 ; (B) 서열 번호 3 에 나타나는 핵산 서열 또는 서열 번호 38 의 제 64 번째 ∼ 제 390 번째에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 5 에 나타나는 핵산 서열, 혹은 서열 번호 36 의 제 76 번째 ∼ 제 378 번째에 나타나는 핵산 서열, 또는 서열 번호 7 에 나타나는 핵산 서열 ; (C) 서열 번호 9 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 11 에 나타나는 핵산 서열 ; (D) 서열 번호 13 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 15 또는 17 에 나타나는 핵산 서열 ; (E) 서열 번호 19 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 21 에 나타나는 핵산 서열 ; (F) 서열 번호 23 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 25 에 나타나는 핵산 서열 ; (G) 서열 번호 27 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 29 에 나타나는 핵산 서열 ; 의 (A) ∼ (G) 중 어느 서열을 포함하는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 서열 번호 31 또는 36 에 나타나는 핵산 서열을 포함하는 것, 혹은 서열 번호 38 에 나타나는 핵산 서열을 포함하는 핵산과, 서열 번호 40 에 나타나는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 것을 특히 바람직하게 예시할 수 있다. 상기 「본 발명의 이중 특이성 항체를 코드하는 핵산」 을 함유하는 벡터 및 그 벡터를 도입하여 얻어지는 형질 전환체는, 상기 서술한 방법에 의해 적절히 제조할 수 있다.
상기 본 발명의 이중 특이성 항체, 및 그 이중 특이성 항체와 이펙터 세포를 결합시켜 제조한 이중 특이성 항체-세포 복합체는, 상기 본 발명의 「항체 연결체」 및 「연결 항체-세포 복합체」 와 동일하게, 인간 B7-H4 단백질을 발현하는 암세포에 대해 iADCC 활성을 발휘한다고 생각할 수 있기 때문에, 암치료용 조성물의 성분으로서 이용할 수 있다. 그 암치료용 조성물로는, 본 발명의 이중 특이성 항체를 포함하고, 또한 그 이중 특이성 항체에 의해 이펙터 세포가 암세포에 송달되는 암치료용 조성물이나, 본 발명의 이중 특이성 항체-세포 복합체를 포함하는 암치료용 조성물이면 특별히 제한되지 않는다. 여기서, 치료의 대상이 되는 「암」 으로는, B7-H4 단백질을 발현하는 암이면 어떠한 종류의 암이어도 되지만, B7-H4 단백질을 고발현하는 난소암, 자궁암, 자궁 내막암, 폐암, 유방암 등을 특히 바람직하게 예시할 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이들 예시에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
[인간 B7-H4 항원 단백질 및 그 발현 세포의 제조]
모노클로날 항체의 제조와 평가에 사용하기 위해, (1) B7-H4 가용형 재조합 단백질, 및 (2) B7-H4 막 발현형 유전자 도입 세포를 제조하였다.
(1) B7-H4 가용형 재조합 단백질 (유리형 항원)
인간 B7-H4 아이소폼 1 단백질 (NCBI 액세션 번호 ; NP_078902, 서열 번호 33) 의 세포외 도메인은, 제 25 번째의 류신 (Leu25) 내지 제 259 번째의 세린 (Ser259) 까지의 영역에 의해 구성되된다. 본 연구에서는, 이 세포외 도메인 (Leu25 내지 Ser259 까지의 영역) 의 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열의 N 말단 상당측에 이뮤노글로블린 유래의 시그널 펩티드를 코드하는 핵산 서열을, C 말단 상당측에 6 연 (連) 히스티딘 태그를 코드하는 핵산 서열 및 종지 코돈을 각각 부가한 핵산 단편을 제조하고, 그 핵산 단편을 pcDNA3.3 발현 벡터에 삽입하여 B7-H4 가용형 단백질 발현 벡터를 제조하였다. 그 발현 벡터를 293F 세포 (라이프 테크놀로지사) 에 유전자 도입하여 배양하고, 배양 상청을 회수하였다. 히스티딘 태그 친화성 칼럼을 사용한 일반적인 방법에 의해, 얻어진 배양 상청으로부터 인간 B7-H4 가용형 재조합 단백질을 정제하였다.
또, 음성 컨트롤로서 사용하기 위해, 인간 B7-H1 단백질 (NCBI 액세션 번호 ; AAF25807, 서열 번호 34), 및 인간 B7-DC 단백질 (NCBI 액세션 번호 ; NP_079515, 서열 번호 35) 에 대해서도, 상기 동일한 방법에서의 세포외 도메인에 대응하는 단백질의 제조 및 정제를 실시하였다 (또한, 인간 B7-H1 에서는 제 19 번째의 페닐알라닌 ∼ 제 238 번째의 아르기닌, 인간 B7-DC 에서는 제 20 번째의 류신 ∼ 제 220 번째의 트레오닌의 영역이 세포외 도메인이다).
이하, 여기서 제조한 인간 B7-H4, 인간 B7-H1, 및 인간 B7-DC 단백질의 세포외 도메인 영역을 포함하는 재조합 단백질을, 각각 「유리형 B7-H4」, 「유리형 B7-H1」, 및 「유리형 B7-DC」 라고 칭하는 경우가 있다.
(2) B7-H4 막 발현형 유전자 도입 세포
인간 B7-H4 아이소폼 1 단백질의 전체 길이 (Met1 내지 Lys282 ; 서열 번호 33) 를 코드하는 핵산 서열을 pcDNA3.3 발현 벡터에 삽입하여, B7-H4 전체 길이 단백질 발현 벡터를 제조하였다. 그 발현 벡터를 293F 세포에 유전자 도입하여 48 시간 배양하고, 세포막 상에 인간 B7-H4 를 일과성으로 발현하는 인간 B7-H4 막 발현형 유전자 도입 세포를 제조하였다 (이하, 이러한 세포를 「B7-H4 발현 293F 세포」 라고 칭하는 경우가 있다). 또, B7-H4 유전자가 들어있지 않은 pcDNA3.3 벡터를 293F 세포에 도입하여 48 시간 배양하여, 인간 B7-H4 를 발현하지 않는 「컨트롤 293F 세포」 를 제조하였다.
실시예 2
[하이브리도마의 제조]
실시예 1 에서 제조한 유리형 B7-H4 와 프로인트 아쥬반트를 혼합하여 BALB/cA 마우스의 배부 (背部) 에 접종하여, B7-H4 특이적 항체 산생 세포를 유도하였다. 항원 (B7-H4) 감작 후의 마우스로부터 채취한 비장 세포와, 미엘로마 세포주 P3X63ag8.653 (ATCC ; 미국 배양 세포 계통 보존 기관으로부터 입수) 을, 관용적인 방법을 사용하여 융합시켜 하이브리도마를 제조하여 단리하였다.
실시예 3
[항 B7-H4 항체 산생 하이브리도마의 선별]
실시예 2 에 의해 얻어진 복수의 하이브리도마주의 항체 산생능을, ELISA 법에 의해 조사하였다.
구체적으로는, 96 공 이모빌라이저 아미노 플레이트 (서모 피셔 사이언티픽사) 에 유리형 B7-H4 를 첨가하고 실온에서 2 시간 인큐베이트하여, 플레이트 표면에 유리형 B7-H4 를 고정화시켰다. 동시에, 유리형 B7-H4 를 고정화시키지 않은 웰을 음성 컨트롤로서 형성하였다. 인큐베이트 후에, 고정되어 있지 않은 항원을 제거하고, 3 ％ 의 BSA 를 포함하는 PBS 로 웰을 채우고 4 ℃ 에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 이 공정에 의해 플레이트 표면의 비특이적 결합능을 블록하여, ELISA 용 플레이트를 제조하였다.
실시예 2 에 의해 얻어진 복수의 하이브리도마주의 배양 상청을, 각각 0.05 ％ 의 Tween20 을 포함하는 PBS 로 2 배로 희석시켜 상청 샘플을 조제하였다. 상기 ELISA 용 플레이트의 웰로부터 버퍼를 제거한 후에, 상청 샘플을 첨가하고, 실온에서 2 시간 인큐베이트하였다. 플레이트를 세정하여 비결합의 항체를 제거한 후에, 호스래디시 퍼옥시다아제 (HRP) 표식 항마우스 이뮤노글로블린 항체 (GE 헬스 케어사) 를 첨가하고 1 시간 인큐베이트하였다. 웰을 세정한 후에, 퍼옥시다아제 기질 (BD 바이오사이언스사) 을 첨가하고 30 분간 인큐베이트하고, 추가로 0.1 M 이상의 농도의 황산 용액을 첨가하여 발색 반응을 정지시켰다. 각 웰 내의 용액의 450 ㎚ 파장의 흡수를 측정함으로써, 상청 샘플 중에 B7-H4 를 인식하는 항체가 포함되는지의 여부를 조사하였다.
상기 ELISA 법의 결과를 표 1 에 나타낸다. 본 연구에서는, 상청 샘플 중의 항 B7-H4 항체가 포함되어 있다고 판단하는 지표로서, B7-H4 고정화 웰에 있어서의 흡광도가 1.0 이상이고, 또한 음성 컨트롤 웰에 있어서의 흡광도가 0.1 이하라는 조건을 형성하였다. 실험 결과를 표 1 에 나타낸다. 하이브리도마 클론 #18, #21, #25, #51, #77, #79, #113, #121, #140, #160, #167, 및 #209 유래의 상청 샘플은 상기 조건을 만족시키고 있으므로, 항 B7-H4 항체가 포함되어 있다고 판단하였다. 즉, 이상의 결과로부터, 항 B7-H4 항체 산생능을 갖는 12 주의 하이브리도마가 얻어진 것이 분명해졌다 (표 1). 이들 하이브리도마 클론은 계속해서 2 차 단리를 실시하고, 동일한 방법 (ELISA 법) 으로 항체 산생능을 다시 확인한 후에, -150 ℃ 환경하에서 보존하였다.
또한, 본 발명자들은, 하이브리도마 클론 #18, #21, #25, #51, #77, #79, #113, #121, #140, #160, #167, 및 #209 로부터 산생되는 항 B7-H4 모노클로날 항체를, 각각 H4.018, H4.021, H4.025, H4.051, H4.077, H4.079, H4.113, H4.121, H4.140, H4.160, H4.167, H4.209 로 명명하였다. 또, 이하, 이들 항체를 「본 발명의 항 B7-H4 항체」 라고 칭하는 경우가 있다.
Figure 112019016976003-pct00001
실시예 4
[항체의 결합능에 대한 1 차 선별]
상기 본 발명의 항 B7-H4 항체 중, 충분한 양의 정제가 된 8 종의 항체 (H4.018, H4.025, H4.051, H4.079, H4.113, H4.140, H4.160, 및 H4.209) 에 대해, 샌드위치 ELISA 법에 의해 특이성 및 결합능을 조사하였다.
구체적으로는, H4.018, H4.025, H4.051, H4.079, H4.113, H4.140, H4.160, 및 H4.209 를 각각 5 ㎍/㎖ 의 농도가 되도록 PBS 로 희석시키고, 96 공 이모빌라이저 아미노 플레이트 (서모 피셔 사이언티픽사) 의 웰에 첨가하고, 실온에서 1 시간 인큐베이트함으로써 고정화시켰다. 비고정의 항체를 제거한 후, 3 ％ BSA 를 포함하는 PBS 로 웰을 채우고 실온에서 2 시간 인큐베이트함으로써 플레이트 표면의 비특이적 결합능을 블록하여, 샌드위치 ELISA 용 플레이트를 제조하였다.
다음으로, 실시예 1 에서 제조한 유리형 항원 단백질 (유리형 B7-H4, 유리형 B7-H1, 또는 유리형 B7-DC) 을, 0.05 ％ Tween20 을 포함하는 PBS 로 희석시키고, 각 항원 단백질을 0.01 ∼ 10 ㎍/㎖ 의 농도로 포함하는 희석 용액을 제조하였다. 샌드위치 ELISA 용 플레이트로부터 버퍼를 제거한 후에, 각 항원 단백질의 희석 용액을 웰에 첨가하고, 실온에서 1 시간 인큐베이트하였다. 비결합의 항원을 제거한 후, 모든 웰에 비오틴화한 H4.025 (2 ㎍/㎖) 를 첨가하고, 실온에서 30 분 인큐베이트하였다. 비결합의 비오틴화 H4.025 를 제거한 후에, 희석시킨 스트렙토아비딘 결합 HRP (서모 피셔 사이언티픽사) 를 웰에 넣고 비오틴화 항체와 결합시켰다. 웰을 세정한 후, 퍼옥시다아제 기질 (BD 바이오사이언스) 을 웰에 넣고 30 분 인큐베이트하고, 0.1 M 이상의 황산 용액을 첨가하여 발색 반응을 정지시킨 후, 450 ㎚ 파장의 흡수를 측정하였다.
상기 샌드위치 ELISA 법의 결과를 도 1 및 2 에 나타낸다. B7-H4, B7-H1, 및 B7-DC 에 대한 본 발명의 항체의 결합능을 조사한 결과, 실험에 사용한 8 종의 항체 (H4.018, H4.025, H4.051, H4.079, H4.113, H4.140, H4.160, 및 H4.209) 는 모두 B7-H4 와 특이적으로 결합하고, B7-H1 또는 B7-DC 에는 결합하지 않는 것이 분명해졌다 (도 1). 또, 상이한 농도의 B7-H4 에 대한 본 발명의 항체의 결합능을 조사한 결과, 실험에 사용한 6 종의 항체 (H4.018, H4.025, H4.051, H4.113, H4.140, 및 H4.209) 는 모두 B7-H4 농도 의존적으로 결합이 증가하는 것이 분명해졌다 (도 2).
실시예 5
[항체의 결합능에 대한 2 차 선별]
실시예 4 에 의해, 본 발명의 항 B7-H4 항체가 유리형 B7-H4 를 특이적으로 인식할 수 있는 것이 분명해졌다. 그래서 다음의 실험에서는, 세포 표면 상에 발현하는 B7-H4 에 대한 본 발명의 항 B7-H4 항체의 결합능을, 면역 염색에 의해 조사하였다.
구체적으로는, 본 발명의 항 B7-H4 항체 중, 9 종의 항체 (H4.018, H4.025, H4.051, H4.079, H4.113, H4.121, H4.140, H4.160, 및 H4.209) 를, 각각 8 ㎍/㎖ 의 농도로 조제하여 1 차 항체 용액을 제조하고, 실시예 1 에서 제조한 「B7-H4 발현 293F 세포」 또는 「컨트롤 293F 세포」 와 혼합하였다. 또, 포지티브 컨트롤로서, 시판되는 항 B7-H4 항체 (H74 클론, LifeSpan BioSciences, Inc.) 를 동일하게 「B7-H4 발현 293F 세포」 또는 「컨트롤 293F 세포」 와 혼합하였다. 4 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트한 후에, R-피코에리트린 (PE) 표식 폴리클로날 항마우스 이뮤노글로블린 항체 (4 ㎍/㎖) 를 첨가하고, 추가로 4 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트하고, 각 세포의 염색 강도를 플로우 사이토미터 FACSTMCanto (BD Biosciences) 를 사용하여 측정하였다.
도 3 에 결과를 나타내는 바와 같이, H4.018, H4.025, H4.113, H4.121, 및 H4.209 에 의해, B7-H4 발현 293F 세포가 염색되는 것이 분명해졌다. 특히, H4.018 및 H4.025 를 사용한 경우에는, 강한 시그널이 얻어지는 것이 분명해졌다.
실시예 6
[암세포에 대한 항체의 결합능]
다음으로, 본 발명의 항 B7-H4 항체가, B7-H4 를 발현하는 암세포에 대한 결합능을 갖는지를 조사하였다.
복수의 암세포주에 있어서의 B7-H4 의 발현을, 시판되는 항 B7-H4 항체 (H74 클론) 를 사용하여 확인하였다 (또한, 이 실험에 사용한 암세포주는, 모두 미국 배양 세포 계통 보존 기관 (ATCC), 또는 국립 연구 개발 법인 의약 기반·건강·영양 연구소 JCRB 세포 뱅크로부터 구입하였다). 구체적으로는, MDA-MB-468 세포 (유방암 세포주), NCI-H2170 세포 (폐편평 상피암 세포주) CAL27 세포 (두경암 세포주), MKN74 세포 (위암 세포주), 및 COLO201 세포 (대장암 세포주) 를, 10 ％ FBS 를 포함하는 RPMI1640 배양액을 사용하여 36 시간 이상 배양한 후, 시판되는 피코에리트린 (PE) 표식 항 B7-H4 항체 (H74 클론, eBioscienceInc.) 를 첨가하고 4 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트하였다. 세포의 염색 강도는, 플로우 사이토미터 FACSCantoTM (BD Biosciences) 을 사용하여 측정하였다.
도 4 에 결과를 나타내는 바와 같이, MDA-MB-468 세포는 항 B7-H4 항체 (H74 클론) 에 의해 염색되었지만, NCI-H2170 세포, CAL27 세포, MKN74 세포, 및 COLO201 세포에서는 항 B7-H4 항체 (H74 클론) 에 의한 염색은 관찰되지 않았다. 이상의 결과로부터, MDA-MB-468 세포는 세포 표면 상에 B7-H4 를 발현하는 것이 분명해졌다. 또, 이 결과는, 정량 PCR 의 결과와도 일치하고 있었다.
다음으로, MDA-MB-468 세포와 본 발명의 항 B7-H4 항체의 결합을 조사하였다. 구체적으로는, 본 발명의 항 B7-H4 항체 중, 4 종의 항체 (H4.018, H4.025, H4.113, H4.209) 를 10 ㎍/㎖ 의 농도로 MDA-MB-468 세포에 첨가하고, 다음의 i) ∼ iv) 의 조건으로 인큐베이트하였다.
i) 4 ℃ 에서 30 분간, 0.1 ％ 아지화나트륨을 첨가한 조건 ;
ii) 실온에서 30 분간, 0.1 ％ 아지화나트륨을 첨가한 조건 ;
iii) 실온에서 30 분간, 아지화나트륨을 첨가하지 않는 조건 ;
iv) 37 도에서 18 시간, 5 ％ CO2 배양 조건 ;
인큐베이트 후에, 2 차 항체로서 PE 표식 폴리클로날 항마우스 이뮤노글로블린 항체를 4 ㎍/㎖ 의 농도로 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트하고, 플로우 사이토미터 FACSTMCanto (BD Biosciences) 를 사용하여 세포의 염색 강도를 측정하였다.
결과를 도 5 에 나타낸다. H4.113 및 H4.209 를 사용한 경우, 상기 i) ∼ iv) 중 어느 인큐베이트 조건에서도, 염색 시그널은 얻어지지 않았다. 한편, H4.018 및 H4.025 를 사용한 경우, 상기 i) 및 ii) 의 인큐베이트 조건에서는 염색 시그널이 관찰되었지만, 상기 iii) 및 iv) 의 인큐베이트 조건에서는 염색 시그널은 거의 관찰되지 않았다. 이상의 결과로부터, 본 발명의 항 B7-H4 항체 (H4.018 및 H4.025) 는, 암세포의 막표면 상에 발현하는 B7-H4 와는 결합하지만, 그 결합은 불안정하다는 것이 시사되었다. 특히 생체 내에 가까운 조건인 인큐베이트 조건 iv) 에서는, H4.018 및 H4.025 중 어느 항체에서도 결합이 관찰되지 않았다.
이상의 실시예 3 ∼ 6 의 결과에 의해, 본 발명의 항 B7-H4 항체 중에서도, 특히 H4.025 는 유리형 B7-H4 에 대해 우수한 결합능을 갖지만, 암세포의 막표면 상에 발현하는 B7-H4 에 대해서는 안정적인 결합을 유지하는 것이 곤란할 가능성이 시사되었다. 이들의 결과로부터, 본 발명의 항 B7-H4 항체는, 단독으로는, 충분한 항체 의존성 세포 상해 (ADCC ; Antibody-Dependent-Cellular-Cytotoxicity) 활성을 갖지 않을 가능성이 생각되었다.
실시예 7
[항 B7-H4 항체와 이펙터 세포의 복합체의 제조]
그래서 본 발명자들은, 본 발명의 항 B7-H4 항체와, 이펙터 세포를 미리 결합시킴으로써, 항체 의존성의 세포 상해 (ADCC) 를 유도할 수 있는 것은 아닐까 생각하여, 항 B7-H4 항체를 붙인 이펙터 세포를 제조하였다 (이하, 이러한 세포를 「항 B7-H4 항체-이펙터 세포 복합체」 라고 칭하는 경우가 있다).
구체적으로는, Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare UK Ltd) 를 사용하여, 통상적인 방법에 따라, 인간 말초혈로부터 단핵구 획분을 비중 분리하였다. 다음으로, 항 CD14 마이크로 비드 및 항 CD19 마이크로 비드 (Miltenyi Biotec K. K.) 를 사용한 네거티브 셀렉션을 실시하고, 상기 단핵구 획분으로부터 T 세포를 농축하여, 이펙터 세포를 조제하였다. 또한, 상기 네거티브 셀렉션은, 사용한 비드에 첨부된 설명서에 기재된 수법에 따라 실시하였다.
얻어진 이펙터 세포와, 고농도 (0.2 ㎎/㎖) 의 항 CD3 항체 (OKT3 클론 ; ATCC 로부터 구입하였다) 를 빙수 중에서 10 분간 반응시킨 후에, 미결합의 항체를 세정하고, 0.5 ㎎/㎖ 의 래빗 항마우스 이뮤노글로블린 폴리클로날 항체 (DakoCytomation) 를 추가로 첨가하고 빙수 중에서 10 분간 반응시켰다. 반응 후에 미결합의 항체를 세정하고, 0.5 ㎎/㎖ 의 항 B7-H4 항체 (H4.018, H4.025, H4.113, 또는 H4.209) 를 첨가하고 빙수 중에서 10 분간 반응시켰다. 마지막으로, 미결합의 항체를 세정함으로써, 항 B7-H4 항체가 달라붙은 이펙터 세포를 제조하였다. 즉, 도 6(a) 에 나타내는 바와 같이, 여기서 제조된 「항 B7-H4 항체-이펙터 세포 복합체」 는, 항 CD3 항체 및 항마우스 IgG 항체를 통하여, 이펙터 세포와 항 B7-H4 항체를 간접적으로 결합시킨 세포이다.
또한, 이하, H4.018, H4.025, H4.113, 또는 H4.209 를 사용하여 제조한 「항 B7-H4 항체-이펙터 세포 복합체」 를, 각각 「H4.018-이펙터 세포 복합체」, 「H4.025-이펙터 세포 복합체」, 「H4.113-이펙터 세포 복합체」, 「H4.209-이펙터 세포 복합체」 라고 칭하는 경우가 있다.
실시예 8
[세포 상해성 어세이]
실시예 7 에 의해 제조한 「항 B7-H4 항체-이펙터 세포 복합체」 의 간접적인 항체 의존성 세포 상해 (indirect ADCC : iADCC) 활성을 조사하였다.
구체적으로는, DELFIA EuTDA 비방사성 세포 독성 검출 키트 (퍼킨엘머사 제조, 제조 번호 AD0116) 를 사용하여, MDA-MB-468 세포 (B7-H4 를 발현하는 암세포) 를 형광 킬레이트제 (TDA) 로 표식하였다 (이하, 이러한 세포를 「TDA 표식 암세포」 라고 기재하는 경우가 있다). TDA 표식 암세포의 세포 내에 존재하는 TDA 는, 세포 용해에 의해 상청 중에 방출된다. 이 상청에 유로퓸 (Eu) 용액을 반응시키면 강한 형광을 나타내는 안정적인 킬레이트 (EuTDA) 가 형성되므로, 형광 강도를 측정함으로써, 세포 상해성의 정도를 평가할 수 있다.
4 ℃ 조건하에서, TDA 표식 암세포를 96 웰 U 바닥 플레이트에 파종하고 (10000 세포/웰), 추가로 실시예 7 에서 제조한 항 B7-H4 항체-이펙터 세포 복합체를 첨가하고 혼합하였다. 플레이트를 4 ℃, 200 G 로 1 분간 원심함으로써 세포를 침전시키고, 그 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 환경하에서 3 시간 반응시켰다. 반응 후의 상청을 회수하고, 플레이트 리더 (Wallac 1420 ARVOsx 멀티 라벨 카운터 ; PerkinElmer 사 제조) 를 사용하여 형광 강도를 측정하였다. 또한, 측정은 플레이트 리더에 첨부된 지시서에 따라, 통상적인 수법에 의해 실시하였다. 얻어진 시그널로부터, TDA 표식 암세포의 상해의 정도 (용해가 일어난 세포의 비율) 를 산출하였다.
결과를 도 6(b) 에 나타낸다. 어세이에 사용한 항 B7-H4 항체-이펙터 세포 복합체 중, H4.025-이펙터 세포 복합체에서는, 표적 세포 (TDA 표식 암세포) 에 대한 그 비율이 증가하는 데에 의존하여, 상청 중의 형광 발광이 유의하게 증가하는 것이 분명해졌다. 한편, H4.018-이펙터 세포 복합체, H4.113-이펙터 세포 복합체, 및 H4.209-이펙터 세포 복합체에서는, 표적 세포에 대한 그 비율이 증가해도, 형광 발광의 유의한 증가는 관찰되지 않았다. 이상의 결과로부터, 적어도 H4.025-이펙터 세포 복합체는, 표적 암세포에 대해 세포 상해 활성을 갖는 것이 분명해졌다.
실시예 9
[항체의 아미노산 서열 및 핵산 서열]
본 발명의 항 B7-H4 항체 중, 실시예 3 ∼ 5 의 결과로부터 우수한 친화성 및 특이성이 관찰된 7 종의 항체 (H4.018, H4.025, H4.051, H4.113, H4.121, H4.140, H4.209) 에 대해, 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역의 핵산 서열 및 아미노산 서열을 해석하였다.
(1) H4.018
H4.018 의 중사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 1) 및 아미노산 서열 (서열 번호 2) 을 도 7 에 나타낸다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
(2) H4.025
H4.025 의 중사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 3) 및 아미노산 서열 (서열 번호 4) 을 도 8 에 나타낸다. 또, H4.025 의 경사슬은 κ 사슬과 λ 사슬의 2 종류가 존재하고 있었다. H4.025 의 경사슬 가변 영역 (κ 사슬) 의 핵산 서열 (서열 번호 5) 및 아미노산 서열 (서열 번호 6) 을 도 9 에, H4.025 의 경사슬 가변 영역 (λ 사슬) 의 핵산 서열 (서열 번호 7) 및 아미노산 서열 (서열 번호 8) 을 도 10 에 각각 나타낸다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
(3) H4.051
H4.051 의 중사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 9) 및 아미노산 서열 (서열 번호 10) 을 도 11 에 나타낸다. 또, H4.051 의 경사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 11) 및 아미노산 서열 (서열 번호 12) 을 도 12 에 나타낸다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
(4) H4.113
H4.113 의 중사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 13) 및 아미노산 서열 (서열 번호 14) 을 도 13 에 나타낸다. 또, H4.113 의 경사슬은 κ 사슬과 λ 사슬의 2 종류가 존재하고 있었다. H4.113 의 경사슬 가변 영역 (κ 사슬) 의 핵산 서열 (서열 번호 15) 및 아미노산 서열 (서열 번호 16) 을 도 14 에, H4.113 의 경사슬 가변 영역 (λ 사슬) 의 핵산 서열 (서열 번호 17) 및 아미노산 서열 (서열 번호 18) 을 도 15 에 각각 나타낸다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
(5) H4.121
H4.121 의 중사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 19) 및 아미노산 서열 (서열 번호 20) 을 도 16 에 나타낸다. 또, H4.121 의 경사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 21) 및 아미노산 서열 (서열 번호 22) 을 도 17 에 나타낸다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
(6) H4.140
H4.140 의 중사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 23) 및 아미노산 서열 (서열 번호 24) 을 도 18 에 나타낸다. 또, H4.140 의 경사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 25) 및 아미노산 서열 (서열 번호 26) 을 도 19 에 나타낸다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
(7) H4.209
H4.209 의 중사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 27) 및 아미노산 서열 (서열 번호 28) 을 도 20 에 나타낸다. 또, H4.209 의 경사슬 가변 영역의 핵산 서열 (서열 번호 29) 및 아미노산 서열 (서열 번호 30) 을 도 21 에 나타낸다. 또한, 도면 중의 망점을 넣은 부분은 CDR3 영역을 나타낸다.
실시예 10
[이중 특이성 항체의 제조]
본 발명의 항 B7-H4 항체의 아미노산 서열 정보를 기초로, B7-H4 항원과 T 세포의 CD3 항원의 양방에 결합하는 이중 특이성 항체 (BsAb) 를 제조할 수 있다 (이하, 이러한 항체를 「본 발명의 BsAb」 라고 칭하는 경우가 있다).
본 발명의 BsAb 는, 예를 들어, 본 발명의 항 B7-H4 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열, 본 발명의 항 B7-H4 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열, 항 CD3 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열, 및 항 CD3 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을, 각각 링커를 사이에 끼우고, 혹은 직접 연결시킴으로써 제조할 수 있다. 도 22 에, H4.025 의 경사슬 κ 사슬 가변 영역 및 H4.025 의 중사슬 가변 영역을 사용한 BsAb 의 구조를 나타낸다. 또, 이러한 BsAb 의 핵산 서열 (서열 번호 31) 및 아미노산 서열 (서열 번호 32) 을, 도 23a ∼ 도 23c 에 나타낸다. 본 발명자들이 제조한 2 종류의 본 발명의 BsAb 에 대해, 이하의 실시예 12 및 13 에 있어서 상세하게 서술한다.
실시예 11
[BsAb-이펙터 세포 복합체에 의한 세포 상해성 어세이]
본 발명의 BsAb 와 이펙터 세포를 결합시켜, BsAb-이펙터 세포 복합체를 제조한다. 구체적으로는, 실시예 7 과 동일한 방법에 의해 이펙터 세포를 조제하고, 본 발명의 BsAb 를 4 ℃ 또는 실온 또는 37 ℃ 의 환경하에서 결합시킴으로써, BsAb-이펙터 세포 복합체를 형성시킨다. 또한 BsAb-이펙터 세포 복합체를 사용하여 ADCC 의 유도를 시도한다.
실시예 12
[BsAb 의 제조 : scFv-scFv]
발명자들은, 본 발명의 항 B7-H4 항체의 아미노산 서열을 포함하는 1 본쇄 항체와, 항 CD3 항체의 아미노산 서열을 포함하는 1 본쇄 항체를 연결시킨 BsAb (single chain fragment variable-single chain fragment variable 항체 ; scFv-scFv) 를 제조하였다 (이하, 이러한 항체를 「본 발명의 scFv-scFv」 라고 칭하는 경우가 있다).
구체적으로는, 본 발명의 scFv-scFv 는, 본 발명의 항 B7-H4 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열, 본 발명의 항 B7-H4 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열, 항 CD3 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열, 및 항 CD3 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을, 각각 링커를 사이에 끼우고 연결시킴으로써 제조하였다. 도 24 에, H4.025 의 경사슬 가변 영역 및 H4.025 의 중사슬 가변 영역을 사용한 본 발명의 scFv-scFv 의 구조를 나타낸다. 또, 이러한 scFv-scFv 의 핵산 서열 (서열 번호 36) 및 아미노산 서열 (서열 번호 37) 을, 도 25 에 나타낸다. 또한, 서열 번호 36 은, H4.025 의 경사슬 및 중사슬 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하지만, 이러한 염기 서열은 대장균 발현계를 사용하는 것을 상정하여 코돈 최적화를 실시하고 있기 때문에, 서열 번호 3, 5, 및 7 과는 상이하다. 서열 번호 36 및 37 에 있어서, H4.025 의 경사슬 및 중사슬 가변 영역에 대응하는 영역은 다음과 같다 (표 2).
<경사슬 가변 영역>
서열 번호 36 의 제 76 번째 (a) 내지 제 378 번째 (t) 까지의 영역은, 서열 번호 5 의 제 10 번째 (a) 내지 제 312 번째 (t) 까지의 영역에 대응한다.
서열 번호 37 의 제 26 번째 (Met) 내지 제 126 번째 (Gly) 까지의 영역은, 서열 번호 6 의 제 4 번째 (Met) 내지 제 104 번째 (Gly) 까지의 영역에 대응한다.
<중사슬 가변 영역>
서열 번호 36 의 제 448 번째 (g) 내지 제 780 번째 (t) 까지의 영역은, 서열 번호 3 의 전체 길이에 대응한다.
서열 번호 37 의 제 150 번째 (Glu) 내지 제 260 번째 (Gly) 까지의 영역은, 서열 번호 4 의 전체 길이에 대응한다.
Figure 112019016976003-pct00002
실시예 13
[BsAb 의 제조 : Fab-scFv]
또한 발명자들은, 본 발명의 항 B7-H4 항체의 아미노산 서열을 포함하는 Fab 항체와, 항 CD3 항체의 아미노산 서열을 포함하는 1 본쇄 항체와 조합한 BsAb (fraction antigen binding-single chain fragment variable ; Fab-scFv) 를 제조하였다 (이하, 이러한 항체를 「본 발명의 Fab-scFv」 라고 칭하는 경우가 있다).
구체적으로는, 본 발명의 Fab-scFv 는, 본 발명의 항 B7-H4 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열, 및 인간 이뮤노글로블린의 정상 영역 (CL) 의 아미노산 서열을 포함하는 단사슬과, 항 CD3 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열, 인간 이뮤노글로블린의 정상 영역 (CH1) 의 아미노산 서열, 항 CD3 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열, 및 항 CD3 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 장사슬을, 디술파이드 결합에 의해 결합시킴으로써 제조하였다. 도 26 에, H4.025 의 경사슬 가변 영역 및 H4.025 의 중사슬 가변 영역을 사용한 Fab-scFv 의 구조를 나타낸다. 또, 도 27 ∼ 28 에, 이러한 Fab-scFv 의 장사슬의 핵산 서열 및 아미노산 서열 (각각 서열 번호 38 및 39) 과, 단사슬의 핵산 서열 및 아미노산 서열 (각각 서열 번호 40 및 41) 을 나타낸다. 또한, 서열 번호 38 및 40 은, H4.025 의 경사슬 및 중사슬 가변 영역을 코드하는 염기 서열을 포함하지만, 이러한 염기 서열은 대장균 발현계를 사용하는 것을 상정하여 코돈 최적화를 실시하고 있기 때문에, 서열 번호 3, 5, 및 7 과는 상이하다. 서열 번호 38 ∼ 41 에 있어서, H4.025 의 경사슬 및 중사슬 가변 영역에 대응하는 영역은 다음과 같다 (표 3).
<경사슬 가변 영역>
서열 번호 40 의 제 76 번째 (a) 내지 제 378 번째 (t) 까지의 영역은, 서열 번호 5 의 제 10 번째 (a) 내지 제 312 번째 (t) 까지의 영역에 대응한다.
서열 번호 41 의 제 26 번째 (Met) 내지 제 126 번째 (Gly) 까지의 영역은, 서열 번호 6 의 제 4 번째 (Met) 내지 제 104 번째 (Gly) 까지의 영역에 대응한다.
<중사슬 가변 영역>
서열 번호 38 의 제 64 번째 (c) 내지 제 390 번째 (t) 까지의 영역은, 서열 번호 3 의 제 7 번째 (c) 내지 제 333 번째 (t) 까지의 영역에 대응한다.
서열 번호 39 의 제 22 번째 (Gln) 내지 제 130 번째 (Gly) 까지의 영역은, 서열 번호 4 의 제 3 번째 (Gln) 내지 제 111 번째 (Gly) 까지의 영역에 대응한다.
Figure 112019016976003-pct00003
실시예 14
[암세포에 대한 이중 특이성 항체의 결합능]
다음으로, 본 발명의 Fab-scFv 가, B7-H4 를 발현하는 암세포에 대한 결합능을 갖는가를 실시예 6 과 동일한 방법으로 조사하였다.
구체적으로는, 4 종의 유방암 세포주 (MDA-MB-468 세포, MDA-MB-231 세포, SKBR3 세포, ZR75 세포) 를, 10 ％ FBS 를 포함하는 RPMI1640 배양액을 사용하여 36 시간 이상 배양하였다. 계속해서, 형광 색소 Cy5.5 로 표식한 본 발명의 Fab-scFv, 또는 무표식 항 B7-H4 항체 (H4.025) 를 상기 배양 세포에 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트하였다. 항 B7-H4 항체 (H4.025) 를 첨가한 세포는, 인큐베이트 후에 세정하여 항 R-피코에리트린 (PE) 표식 폴리클로날 항마우스 이뮤노글로블린 항체 (4 ㎍/㎖) 를 첨가하고, 추가로 4 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트하였다. 세포의 염색 강도는, 플로우 사이토미터 FACSCantoTM (BD Biosciences) 을 사용하여 측정하였다. 도 29 에 나타내는 바와 같이, MDA-MB-468 세포 및 ZR75 세포는, 항 B7-H4 항체 (H4.025) 및 본 발명의 Fab-scFv 에 의해 염색되었지만, MDA-MB-231 세포 및 SKBR3 세포는 어느 항체에서도 염색되지 않았다. 이상의 결과로부터, MDA-MB-468 세포 및 ZR75 세포는 B7-H4 를 발현하지만, MDA-MB-231 세포는 B7-H4 를 발현하지 않는 것이 분명해졌다.
실시예 15
[본 발명의 BsAb 에 의한 세포 상해성 어세이]
암세포주에 대한 본 발명의 BsAb (본 발명의 scFv-scFv 및 Fab-scFv) 의 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성을 조사하였다.
구체적으로는, 실시예 7 에 기재된 방법 의해 조제한 인간 말초혈 단핵구 획분에, 암세포 (MDA-MB-468 세포) 와 본 발명의 BsAb 를 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 환경하에서 16 시간 반응시켰다. 배양 상청을 회수하고, TAKARA LDH Cytotoxicity Detection Kit (다카라 바이오 주식회사) 를 사용하여 사세포수를 측정하고, 암세포에 대한 상해능 (％Lysis) 및 50 ％ 최대 작용 농도 (EC50) 를 산출하였다. 도 30 에 나타내는 바와 같이, MDA-MB-468 세포에 대한 50 ％ 최대 작용 농도 (EC50) 는, 본 발명의 scFv-scFv 에서는 68 ng/㎖ 이고, 본 발명의 Fab-scFv 에서는 13 ng/㎖ 이었다. 또, 도 31 에 나타내는 바와 같이, ZR-75 세포 (B7-H4 발현 양성 ; 도 29 참조할 것) 에 대해서는, 본 발명의 BsAb 의존성의 세포 상해가 관찰되었지만, MDA-MB-231 세포 (B7-H4 발현 음성 ; 도 29 참조할 것), SKBR3 세포 (B7-H4 발현 음성 ; 도 29 참조할 것), 및 NCI-H2170 세포 (폐편평 상피암 세포) 에 대해서는, 본 발명의 BsAb 의존성의 세포 상해 활성은 관찰되지 않았다.
실시예 16
[담암 마우스에 미치는 본 발명의 Fab-scFv 의 영향]
다음으로, 마우스에 이식한 인간 종양에 대해, 본 발명의 Fab-scFv 가 항종양 효과를 나타낼 수 있는지의 여부를 검토하였다.
구체적으로는, MHC 녹아웃 NOG 마우스 (NOD/Shi-scid, IL-2RγKO, IaβKO, β2mKO, 실험 동물 중앙 연구소) 에 인간 말초혈 단핵구를 이식하고, 다음날, 유방암 세포주 (MDA-MB-468 세포주) 또는 폐암 세포주 (NCI-H2170 세포주) 를 이식하였다. 암세포주의 이식으로부터 2 주째 이후에, 본 발명의 Fab-scFv 를 마우스 1 마리당 0.2 ㎍ 내지 200 ㎍ 의 범위에서 투여하였다. 구체적으로는, 종양 사이즈의 확인 실험에 사용한 마우스 (도 32) 에는, 본 발명의 Fab-scFv 를 1 회당 5 ㎍/20 g 체중으로 투여하고, 염색 실험에 사용한 마우스 (도 33 및 34) 에는, 0.2 ㎍, 2 ㎍, 20 ㎍, 및 200 ㎍ 의 본 발명의 Fab-scFv 를 3 ∼ 4 일 간격으로, 4 회의 점증 투여를 실시하였다.
도 32 에 나타내는 바와 같이, MDA-MB-468 세포의 이식에 의해 형성된 종양의 사이즈는, 본 발명의 Fab-scFv 의 투여에 의해 축소되는 것이 분명해졌다. 한편, NCI-H2170 세포의 이식에 의해 형성된 종양의 사이즈는, 본 발명의 Fab-scFv 의 투여에 의한 영향을 받지 않았다. 또, 도 33 에 나타내는 바와 같이, 종양 조직 절편의 헤마톡실린에오신 염색을 실시한 결과, 본 발명의 Fab-scFv 를 투여한 담암 마우스에 있어서는, 종양 내의 암세포가 소멸되는 것이 분명해졌다. 또한 도 34 에 나타내는 바와 같이, 종양 조직 절편의 면역 조직 염색의 결과, 본 발명의 Fab-scFv 를 투여한 담암 마우스에 있어서는, 종양 내로의 CD8 양성 킬러 T 세포의 침윤을 확인할 수 있음과 함께, B7-H4 양성의 암세포의 소멸도 확인할 수 있었다.
실시예 17
[담암 마우스에 있어서의 본 발명의 Fab-scFv 의 국재]
마우스에 투여한 본 발명의 Fab-scFv 가 마우스 이종 이식 종양에 집적하는지의 여부를 확인하였다.
구체적으로는, MHC 녹아웃 NOG 마우스 (실험 동물 중앙 연구소) 에, 암세포주 (MDA-MB-468) 를 이식하고, 2 주째 이후에, 형광 색소 Cy5.5 로 라벨한 본 발명의 Fab-scFv 를 마우스 1 마리당 0.5 마이크로그램 내지 200 마이크로그램의 범위에서 투여하였다. 도 35 에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 Fab-scFv 는, 투여 후 28 일째까지의 동안, 이식 종양 조직에 집적하는 것이 확인되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Shizuoka prefecture <120> Anti-B7-H4 antibody <130> SCC1602PCT <150> JP2016-145902 <151> 2016-07-26 <160> 41 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Inventor: AKIYAMA, Yasuto; IIZUKA Akira <400> 1 gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtaatta cacctactat 180 ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagacatcgg 300 tacgataata actacgatta ctatgctatg gactactggg gt 342 <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Asn Tyr Thr 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sequence <400> 39 Met Glu Leu Gly Leu Cys Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Val Val His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Ser 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Val Tyr Gly Tyr His Ala Met Asp Cys 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val 210 215 220 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 225 230 235 240 Tyr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 245 250 255 Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly 260 265 270 Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg 275 280 285 Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 290 295 300 Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys 305 310 315 320 Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 325 330 335 Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 340 345 350 Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 355 360 365 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 370 375 380 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 385 390 395 400 Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala 405 410 415 Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr 420 425 430 Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val 435 440 445 Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 450 455 460 Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 465 470 475 480 Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 485 490 495 Lys Gly Gly Gly His His His His His His 500 505 <210> 40 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence <400> 40 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctccttc tgctttggtt cccaggcgcc 60 agatgtaata ttcagatgac ccagtcaccg agctcactgg cagttagtgc cggcgaaaaa 120 gttaccatga gctgtaaaag cagccatgca gttctgtata gcagcaacca gaaaaactat 180 ctggcatggt accagcagaa gccgggtcag agcccgaaac tgctgattta ttgggccagc 240 acccgcgata gcggtgttcc ggatcgcttt accggtggtg gtagcggcac cgattttacc 300 ctgaccatta ccaatattca gccggaagat ctggcagtgt attattgtca tcagtattta 360 agcagctgga cctttggtgg tggcaccaaa gttgaaatca agcgaactgt ggctgcacca 420 tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 480 tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 540 ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagggcagg acagcaagga cagcacctac 600 agcctcagca gcactctggc gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 660 tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag 720 tgttga 726 <210> 41 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial sequence <400> 41 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser 35 40 45 His Ala Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr 50 55 60 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser 65 70 75 80 Thr Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Ile Gln Pro Glu Asp Leu Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Trp Thr Phe Gly Gly Gly 115 120 125 Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 130 135 140 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 145 150 155 160 Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys 165 170 175 Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Gly 180 185 190 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr 210 215 220 His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 225 230 235 240 Cys

Claims (33)

  1. 이하의 (a) 영역을 포함하는, 인간 B7-H4 단백질의 세포외 도메인을 인식하는, 항체.
    (a) 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 6 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ;
  2. 이하의 (A') 핵산 서열을 포함하는, 인간 B7-H4 단백질의 세포외 도메인을 인식하는 항체를 코드하는, 핵산.
    (A') 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 6 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역을 코드하는 핵산 서열 ;
  3. 제 2 항에 있어서,
    이하의 (A) 핵산 서열을 포함하는, 핵산.
    (A) 서열 번호 3 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 5 에 나타나는 핵산 서열 ;
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 기재된 핵산을 함유하는, 벡터.
  5. 제 4 항에 기재된 벡터를 분리된 숙주 세포에 도입하여 얻어지는, 형질 전환체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    모노클로날 항체인, 항체.
  7. 제 6 항에 기재된 항체를 산생하는, 하이브리도마.
  8. 제 1 항 또는 제 6 항에 기재된 항체를 구비한, 암세포 검출용 키트.
  9. 제 1 항 또는 제 6 항에 기재된 항체로 이루어지는 제 1 항체와, 이펙터 세포 항원을 인식하는 제 2 항체가 결합한, 항체 연결체.
  10. 제 9 항에 있어서,
    제 2 항체가 CD3 항원을 인식하는 항체인, 항체 연결체.
  11. 제 9 항에 기재된 항체 연결체를 포함하는 암치료용 조성물로서, 상기 항체 연결체에 의해 이펙터 세포가 암세포에 송달되는, 암치료용 조성물.
  12. 제 1 항 또는 제 6 항에 기재된 항체로 이루어지는 제 1 항체와, 이펙터 세포 항원을 인식하는 제 2 항체가 결합한 항체 연결체에, 이펙터 세포가 결합한, 연결 항체-세포 복합체.
  13. 제 12 항에 있어서,
    제 1 항체와 제 2 항체가, 상기 제 1 항체 및 상기 제 2 항체의 쌍방을 인식하는 제 3 항체를 통하여 결합한, 연결 항체-세포 복합체.
  14. 제 12 항에 있어서,
    제 1 항체 및 제 2 항체가 동일한 동물종 유래의 IgG 항체이고, 또한 제 3 항체가 상기 동물종의 IgG 항체를 인식하는 항체인, 연결 항체-세포 복합체.
  15. 제 12 항에 있어서,
    제 1 항체 및 제 2 항체가 마우스 유래의 IgG 항체이고, 또한 제 3 항체가 마우스 유래의 IgG 항체를 인식하는 항체인, 연결 항체-세포 복합체.
  16. 제 12 항에 있어서,
    이펙터 세포가, 치료 대상이 되는 암환자로부터 채취된 이펙터 세포인, 연결 항체-세포 복합체.
  17. 제 12 항에 기재된 연결 항체-세포 복합체를 유효 성분으로서 함유하는, 암치료용 조성물.
  18. 이하의 (a) ∼ (c) 중 어느 영역과, 이펙터 세포 항원을 인식하는 영역을 포함하는, 이중 특이성 항체.
    (a) 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 6 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ;
    (b) 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 6 의 제 4 번째 ∼ 제 104 번째에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ;
    (c) 서열 번호 4 의 제 3 번째 ∼ 제 111 번째에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 6 의 제 4 번째 ∼ 제 104 번째에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역 ;
  19. 제 18 항에 있어서,
    이펙터 세포 항원을 인식하는 영역이, CD3 항원을 인식하는 항체의 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역인, 이중 특이성 항체.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    1 본쇄 항체인, 이중 특이성 항체.
  21. 제 18 항에 있어서,
    서열 번호 32 또는 37 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 항체.
  22. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    Fab-scFv 융합체인, 이중 특이성 항체.
  23. 제 18 항에 있어서,
    서열 번호 39 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 장사슬과, 서열 번호 41 에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 단사슬을 포함하는, 이중 특이성 항체.
  24. 제 18 항에 기재된 이중 특이성 항체를 코드하는, 핵산.
  25. 제 24 항에 있어서,
    이하의 (A) ∼ (C) 중 어느 서열을 포함하는, 핵산.
    (A) 서열 번호 3 에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 5 에 나타나는 핵산 서열 ;
    (B) 서열 번호 36 의 제 448 번째 ∼ 제 780 번째에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 36 의 제 76 번째 ∼ 제 378 번째에 나타나는 핵산 서열 ;
    (C) 서열 번호 38 의 제 64 번째 ∼ 제 390 번째에 나타나는 핵산 서열, 및 서열 번호 40 의 제 76 번째 ∼ 제 378 번째에 나타나는 핵산 서열 ;
  26. 제 24 항에 있어서,
    서열 번호 31 또는 36 에 나타나는 핵산 서열을 포함하는, 핵산.
  27. 제 24 항에 있어서,
    서열 번호 38 에 나타나는 핵산 서열을 포함하는 핵산과, 서열 번호 40 에 나타나는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, 핵산.
  28. 제 24 항에 기재된 핵산을 함유하는, 벡터.
  29. 제 28 항에 기재된 벡터를 분리된 숙주 세포에 도입하여 얻어지는, 형질 전환체.
  30. 제 18 항에 기재된 이중 특이성 항체를 포함하는 암치료용 조성물로서, 상기 이중 특이성 항체에 의해 이펙터 세포가 암세포에 송달되는, 암치료용 조성물.
  31. 제 18 항에 기재된 이중 특이성 항체와, 이펙터 세포가 결합한, 이중 특이성 항체-세포 복합체.
  32. 제 31 항에 있어서,
    이펙터 세포가, 치료 대상이 되는 암환자로부터 채취된 이펙터 세포인, 이중 특이성 항체-세포 복합체.
  33. 제 31 항에 기재된 이중 특이성 항체-세포 복합체를 유효 성분으로서 함유하는, 암치료용 조성물.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3089246A1 (en) * 2018-02-11 2019-08-15 Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Co., Ltd. Anti-b7-h4 antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof
CN108948204B (zh) * 2018-06-15 2023-01-13 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司 抗人b7-h4单克隆抗体、鉴定方法、应用和试剂盒
EP3880713A4 (en) * 2019-03-21 2022-01-05 Suzhou Kanova Biopharmaceutical Co., Ltd. ANTI-B7S1 POLYPEPTIDES AND THEIR USE
BR112021022682A2 (pt) 2019-05-14 2022-02-22 Provention Bio Inc Métodos e composições para prevenir diabetes do tipo 1
AU2020359928B2 (en) * 2019-09-30 2025-01-09 Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd. CD3-targeting antibody, bispecific antibody and use thereof
CN115038718B (zh) * 2019-11-08 2024-07-02 山东先声生物制药有限公司 抗人程序性死亡配体-1（pd-l1）的抗体及其用途
CN110981961B (zh) * 2019-11-28 2022-07-29 青岛大学 一种特异结合癌细胞蛋白b7-h4的纳米抗体h6的序列和应用
WO2021185934A1 (en) * 2020-03-18 2021-09-23 Genmab A/S Antibodies binding to b7h4
BR112022025381A2 (pt) 2020-06-11 2023-01-24 Provention Bio Inc Métodos e composições para prevenir diabetes tipo 1
KR20230015957A (ko) * 2020-06-30 2023-01-31 하버 바이오메드 유에스, 아이엔씨. 이중특이적 항체 및 이의 용도
TWI821699B (zh) * 2020-06-30 2023-11-11 大陸商諾納生物（蘇州）有限公司 抗b7h4抗體及其雙抗和應用
PE20231565A1 (es) 2020-07-17 2023-10-04 Pfizer Anticuerpos terapeuticos y sus usos
US11964024B2 (en) 2021-01-04 2024-04-23 Mersana Therapeutics, Inc. B7H4-targeted antibody-drug conjugates and methods of use thereof
CA3214582A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 Martin SAHLIN Pharmaceutical compositions comprising bispecific antibodies binding to b7h4 and cd3

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011505372A (ja) 2007-11-30 2011-02-24 ブリストル−マイヤーズ スクウィブ カンパニー 抗ｂ７ｈ４モノクローナル抗体−薬物コンジュゲートおよび使用方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
JPS58110600A (ja) 1981-12-25 1983-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド
JP2564268B2 (ja) 1985-08-28 1996-12-18 協和醗酵工業株式会社 融合抗原ポリペプチド
JP2928287B2 (ja) 1988-09-29 1999-08-03 協和醗酵工業株式会社 新規ポリペプチド
JPH0322979A (ja) 1989-06-19 1991-01-31 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プラスミノーゲン活性化因子
KR20150100716A (ko) 2012-12-19 2015-09-02 앰플리뮨, 인크. 항 인간 b7-h4 항체 및 이의 용도
CN105189552B (zh) * 2013-03-14 2019-08-02 基因泰克公司 抗b7-h4抗体和免疫缀合物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011505372A (ja) 2007-11-30 2011-02-24 ブリストル−マイヤーズ スクウィブ カンパニー 抗ｂ７ｈ４モノクローナル抗体−薬物コンジュゲートおよび使用方法

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