[go: up one dir, main page]

KR102337932B1 - 단백질의 분비 생산법 - Google Patents

단백질의 분비 생산법 Download PDF

Info

Publication number
KR102337932B1
KR102337932B1 KR1020197014491A KR20197014491A KR102337932B1 KR 102337932 B1 KR102337932 B1 KR 102337932B1 KR 1020197014491 A KR1020197014491 A KR 1020197014491A KR 20197014491 A KR20197014491 A KR 20197014491A KR 102337932 B1 KR102337932 B1 KR 102337932B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
gene
ala
leu
glu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020197014491A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190068610A (ko
Inventor
유미 이토
요시히코 마츠다
Original Assignee
아지노모토 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아지노모토 가부시키가이샤 filed Critical 아지노모토 가부시키가이샤
Publication of KR20190068610A publication Critical patent/KR20190068610A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102337932B1 publication Critical patent/KR102337932B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/13—Protein-histidine kinases (2.7.13)
    • C12Y207/13003—Histidine kinase (2.7.13.3)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

코리네형 세균에 의한 이종 단백질의 분비 생산을 향상시키는 신규의 기술을 개발하고, 이종 단백질의 분비 생산법을 제공한다. 이종 단백질을 분비 생산하는 능력을 갖고, 또한, HrrSA 시스템의 활성이 저하되도록 개변된 코리네형 세균을 배양하고, 이종 단백질을 분비 생산한다.

Description

단백질의 분비 생산법
본 발명은 이종 단백질의 분비 생산법에 관한 것이다.
미생물에 의한 이종 단백질의 분비 생산으로서는, 지금까지 바실루스속 세균(비특허문헌 1), 메탄올 자화성 효모 Pichia pastoris(비특허문헌 2), 및 Aspergillus속 사상균(비특허문헌 3, 4) 등에 의한 이종 단백질의 분비 생산이 보고되어 있다.
또한, 코리네형 세균에 의해 이종 단백질을 분비 생산하는 시도도 이루어지고 있다. 코리네형 세균에 의한 이종 단백질의 분비 생산에 대해서는, 코리네박테리움·글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)(이후, 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum)으로 생략하는 경우가 있음)에 의한 뉴클레아제(nuclease)나 리파아제(lipase)의 분비(특허문헌 1, 비특허문헌 5), 서브틸리신 등의 프로테아제의 분비(비특허문헌 6), 코리네형 세균의 세포 표층 단백질 PS1이나 PS2(CspB라고도 함)의 시그널 펩타이드를 이용한 단백질의 분비(특허문헌 2), PS2(CspB)의 시그널 펩타이드를 이용한 피브로넥틴 결합 단백질의 분비(비특허문헌 7), PS2(CspB)나 SlpA(CspA라고도 함)의 시그널 펩타이드를 이용한 프로트란스글루타미나제의 분비(특허문헌 3), 변이형 분비 장치를 이용한 단백질의 분비(특허문헌 4), 변이주에 의한 프로트란스글루타미나제의 분비(특허문헌 5) 등의 보고가 있다. 또한, 코리네형 세균에 의한 이종 단백질의 분비 생산량을 높이는 기술로서, 세포 표층 단백질의 활성을 저하시키는 것(특허문헌 6, 7), 페니실린 결합 단백질의 활성을 저하시키는 것(특허문헌 6), 메탈로펩티다아제를 코드하는 유전자의 발현을 증강하는 것(특허문헌 7), 리보솜 단백질 S1 유전자에 변이를 도입하는 것(특허문헌 8), 시그널 펩타이드와 이종 단백질 사이에 Gln-Glu-Thr을 포함하는 아미노산 서열을 삽입하여 이종 단백질을 발현시키는 것(특허문헌 9) 등이 알려져 있다.
일반적인 단백질 분비 경로는 원핵생물에서 진핵생물까지 널리 존재하는 Sec계라고 불리는 경로이지만, 최근, Sec계와는 전혀 다른 단백질 분비 경로가 식물 세포의 엽록체의 틸라코이드막에서 발견되었다(비특허문헌 8). 이 신규의 분비 경로는, 그에 의해 분비되는 단백질의 시그널 서열에 아르기닌-아르기닌의 서열이 공통으로 존재하고 있기 때문에(비특허문헌 8), Tat계(Twin-Arginine Translocation system)라고 명명되었다. Sec계에서는 단백질이 고차 구조를 형성하기 전의 상태로 분비되는 반면, Tat계에서는 단백질은 세포 내에서 고차 구조를 형성한 후에 세포막을 통과하여 분비되는 것이 알려져 있다(비특허문헌 9). 코리네형 세균에서도 Tat계 의존 시그널 펩타이드를 이용한 단백질의 분비 생산의 보고가 있다(특허문헌 8, 10).
세균이 세포 내외의 다양한 환경 변화에 응답하는 시스템으로서, 2성분 제어계라고 불리는 시그널 전달 경로가 알려져 있다. 2성분 제어계는, 환경 변화의 자극을 감지하는 역할의 센서 키나아제와, 센서 키나아제로부터 시그널을 받고, 또한 하류의 유전자의 발현을 제어하는 역할의 반응 조절인자의 2개의 성분으로 이루어지는 제어 시스템이다. 구체적으로는, 센서 키나아제가 자극을 감지하면 특정한 히스티딘 잔기가 자기 인산화되고, 그 인산기가 반응 조절인자의 특정한 아스파라긴산 잔기로 전이함으로써 시그널이 전달되어, 인산화에 의해 활성화된 반응 조절인자가 전사 인자로서 하류의 유전자 발현을 조절한다.
씨. 글루타미쿰의 2성분 제어계에 관한 지견은 비특허문헌 10 등에 자세하다. 씨. 글루타미쿰에 있어서는, 2성분 제어계로서 지금까지 적어도 13종류의 시스템이 알려져 있다. 2성분 제어계로서, 구체적으로는, PhoRS 시스템이나 HrrSA 시스템을 들 수 있다.
PhoRS 시스템은 센서 키나아제의 PhoS 단백질과, 반응 조절인자의 PhoR 단백질로 이루어진다. PhoRS 결손주의 해석에 의해, PhoRS 시스템은 환경 중의 인산 결핍을 감지하여 시그널 전달을 행하는 제어계인 것이 밝혀져 있다(비특허문헌 11).
HrrSA 시스템은 센서 키나아제의 HrrS 단백질과, 반응 조절인자의 HrrA 단백질로 이루어진다. HrrSA 결손주의 해석에 의해, HrrSA 시스템은 헴(haem)의 존재 하에서, 헴의 분해에 관여하는 유전자나 호흡쇄 중의 헴 함유 단백질을 코드하는 유전자의 발현을 유도하고, 헴의 생합성에 관여하는 유전자의 발현을 억제하는 것이 밝혀져 있고, 헴의 항상성 유지에 관여하고 있다고 생각되고 있다(비특허문헌 12).
그러나, HrrSA 시스템과, 이종 단백질의 분비 생산과의 관계는 지금까지 알려져 있지 않다.
특허문헌 1: 미국특허 제4965197호 특허문헌 2: 일본 공개특허공보 특표평6-502548 특허문헌 3: 특허 제4320769호 특허문헌 4: 일본 공개특허공보 특개평11-169182 특허문헌 5: 특허 제4362651호 특허문헌 6: WO2013/065869 특허문헌 7: WO2013/065772 특허문헌 8: WO2013/118544 특허문헌 9: WO2013/062029 특허문헌 10: 특허 제4730302호
비특허문헌 1: Microbiol. rev., 57, 109-137(1993) 비특허문헌 2: Biotechnol., 11, 905-910(1993) 비특허문헌 3: Biotechnol., 6, 1419-1422(1988) 비특허문헌 4: Biotechnol., 9, 976-981(1991) 비특허문헌 5: J. Bacteriol., 174, 1854-1861(1992) 비특허문헌 6: Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613(1995) 비특허문헌 7: Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400(1997) 비특허문헌 8: EMBO J., 14, 2715-2722(1995) 비특허문헌 9: J. Biol. Chem., 25; 273(52), 34868-74(1998) 비특허문헌 10: Appl. Microbiol. Biotechnol., 94, 1131-1150(2012) 비특허문헌 11: J. Bacteriol., 188, 724-732(2006) 비특허문헌 12: J. Bacteriol., 193, 1212-1221(2011)
본 발명은, 코리네형 세균에 의한 이종 단백질의 분비 생산을 향상시키는 신규의 기술을 개발하고, 코리네형 세균에 의한 이종 단백질의 분비 생산법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 행한 결과, HrrSA 시스템의 활성이 저하되도록 코리네형 세균을 개변함으로써, 코리네형 세균의 이종 단백질의 분비 생산능이 향상되는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하와 같이 예시할 수 있다.
[1]
이종 단백질의 분비 발현용의 유전자 구축물을 갖는 코리네형 세균을 배양하는 것, 및 분비 생산된 이종 단백질을 회수하는 것을 포함하는, 이종 단백질의 제조 방법으로서,
상기 코리네형 세균이, HrrSA 시스템의 세포당 분자수가 비개변주와 비교하여 저하되도록 개변되어 있고,
상기 유전자 구축물이, 5'에서 3'방향으로, 코리네형 세균에서 기능하는 프로모터 서열, 코리네형 세균에서 기능하는 시그널 펩타이드를 코드하는 핵산 서열, 및 이종 단백질을 코드하는 핵산 서열을 포함하고,
상기 이종 단백질이, 상기 시그널 펩타이드와의 융합 단백질로서 발현되는, 방법.
[2]
HrrSA 시스템의 세포당 분자수가, HrrS 단백질 및 HrrA 단백질의 한쪽 또는 양쪽의 세포당 분자수를 저하시킴으로써 저하된, 상기 방법.
[3]
적어도 HrrA 단백질의 세포당 분자수가 저하된, 상기 방법.
[4]
상기 HrrS 단백질이 하기 (a), (b), 또는 (c)에 기재된 단백질인, 상기 방법:
(a) 서열번호 63에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b) 서열번호 63에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, HrrSA 시스템의 센서 키나아제로서의 기능을 갖는 단백질;
(c) 서열번호 63에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, HrrSA 시스템의 센서 키나아제로서의 기능을 갖는 단백질.
[5]
상기 HrrA 단백질이 하기 (a), (b), 또는 (c)에 기재된 단백질인, 상기 방법:
(a) 서열번호 65에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b) 서열번호 65에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, HrrSA 시스템의 반응 조절인자로서의 기능을 갖는 단백질;
(c) 서열번호 65에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, HrrSA 시스템의 반응 조절인자로서의 기능을 갖는 단백질.
[6]
hrrS 유전자 및/또는 hrrA 유전자의 발현을 저하시킴으로써, 또는 hrrS 유전자 및/또는 hrrA 유전자를 파괴함으로써, HrrS 단백질 및/또는 HrrA 단백질의 세포당 분자수가 저하된, 상기 방법.
[7]
hrrS 유전자 및/또는 hrrA 유전자를 결손시킴으로써, HrrS 단백질 및/또는 HrrA 단백질의 세포당 분자수가 저하된, 상기 방법.
[8]
상기 코리네형 세균이, 추가로 변이형 PhoS 단백질을 코드하는 phoS 유전자를 유지하도록 개변되어 있는, 상기 방법.
[9]
상기 변이가 야생형 PhoS 단백질에 있어서, 서열번호 4의 302 위치의 트립토판 잔기에 상응하는 아미노산 잔기가 방향족 아미노산 및 히스티딘 이외의 아미노산 잔기로 치환되는 변이인, 상기 방법.
[10]
상기 방향족 아미노산 및 히스티딘 이외의 아미노산 잔기가, 리신 잔기, 알라닌 잔기, 발린 잔기, 세린 잔기, 시스테인 잔기, 메티오닌 잔기, 아스파라긴산 잔기, 또는 아스파라긴 잔기인, 상기 방법.
[11]
상기 야생형 PhoS 단백질이 하기 (a), (b), 또는 (c)에 기재된 단백질인, 상기 방법:
(a) 서열번호 4, 26, 27, 28, 29, 또는 30에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b) 서열번호 4, 26, 27, 28, 29, 또는 30에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, PhoRS 시스템의 센서 키나아제로서의 기능을 갖는 단백질;
(c) 서열번호 4, 26, 27, 28, 29, 또는 30에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, PhoRS 시스템의 센서 키나아제로서의 기능을 갖는 단백질.
[12]
상기 시그널 펩타이드가 Tat계 의존 시그널 펩타이드인, 상기 방법.
[13]
상기 Tat계 의존 시그널 펩타이드가 TorA 시그널 펩타이드, SufI 시그널 펩타이드, PhoD 시그널 펩타이드, LipA 시그널 펩타이드, 및 IMD 시그널 펩타이드로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 시그널 펩타이드인, 상기 방법.
[14]
상기 코리네형 세균이, 추가로, Tat계 분비 장치를 코드하는 유전자로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 유전자의 발현이 비개변주와 비교하여 상승하도록 개변되어 있는, 상기 방법.
[15]
상기 Tat계 분비 장치를 코드하는 유전자가 tatA 유전자, tatB 유전자, tatC 유전자, 및 tatE 유전자로 이루어지는, 상기 방법.
[16]
상기 시그널 펩타이드가 Sec계 의존 시그널 펩타이드인, 상기 방법.
[17]
상기 Sec계 의존 시그널 펩타이드가 PS1 시그널 펩타이드, PS2 시그널 펩타이드, 및 SlpA 시그널 펩타이드로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 시그널 펩타이드인, 상기 방법.
[18]
상기 유전자 구축물이, 코리네형 세균에서 기능하는 시그널 펩타이드를 코드하는 핵산 서열과 이종 단백질을 코드하는 핵산 서열 사이에, 추가로, Gln-Glu-Thr을 포함하는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함하는, 상기 방법.
[19]
상기 유전자 구축물이, Gln-Glu-Thr을 포함하는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열과 이종 단백질을 코드하는 핵산 서열 사이에, 추가로, 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함하는, 상기 방법.
[20]
상기 코리네형 세균이 코리네박테리움(Corynebacterium)속 세균인, 상기 방법.
[21]
상기 코리네형 세균이 코리네박테리움·글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 상기 방법.
[22]
상기 코리네형 세균이, 코리네박테리움·글루타미쿰 AJ12036(FERM BP-734)에 유래하는 개변주 또는 코리네박테리움·글루타미쿰 ATCC 13869에 유래하는 개변주인, 상기 방법.
[23]
상기 코리네형 세균이, 세포 표층 단백질의 세포당 분자수가 저하되고 있는 코리네형 세균인, 상기 방법.
도 1은 씨. 글루타미쿰 YDK010주 및 그 hrrA 유전자 결손주에서 단백질 L(CspA의 시그널 펩타이드를 융합한 단백질 L의 항체 결합 도메인)을 발현시켰을 때의 SDS-PAGE의 결과를 나타낸 사진.
도 2는 씨. 글루타미쿰 YDK010::phoS(W302C)주 및 그 hrrA 유전자 결손주에서 CspB6Xa-LFABP(CspB의 시그널 펩타이드, 성숙 CspB의 N 말단 서열, 및 인자 Xa 프로테아제 인식 서열을 융합한 LFABP)를 발현시켰을 때의 SDS-PAGE의 결과를 나타낸 사진.
도 3은 씨. 글루타미쿰 YDK010::phoS(W302C)주 및 그 hrrA 유전자 결손주에서 GFP(TorA 시그널 펩타이드를 융합한 GFP)를 발현시켰을 때의 SDS-PAGE의 결과를 나타낸 사진.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 방법은, 이종 단백질의 분비 발현용의 유전자 구축물을 갖는 코리네형 세균을 배양하는 것, 및 분비 생산된 이종 단백질을 회수하는 것을 포함하는, 이종 단백질의 제조 방법으로서, 상기 코리네형 세균이 HrrSA 시스템의 활성이 저하되도록 개변되어 있는, 방법이다.
<1> 본 발명의 방법에 사용되는 코리네형 세균
본 발명의 방법에 사용되는 코리네형 세균은, 이종 단백질의 분비 발현용의 유전자 구축물을 갖는 코리네형 세균이며, 또한, HrrSA 시스템의 활성이 저하되도록 개변된 코리네형 세균이다. 또한, 본 발명의 방법에 사용되는 코리네형 세균을 「본 발명의 세균」 또는 「본 발명의 코리네형 세균」이라고도 한다. 또한, 본 발명의 세균이 갖는 이종 단백질의 분비 발현용의 유전자 구축물을 「본 발명에 사용되는 유전자 구축물」이라고도 한다.
<1-1> 이종 단백질을 분비 생산하는 능력을 갖는 코리네형 세균
본 발명의 코리네형 세균은, 이종 단백질의 분비 발현용의 유전자 구축물(본 발명에 사용되는 유전자 구축물)을 가짐으로써, 이종 단백질을 분비 생산하는 능력을 갖는다.
본 발명에 있어서, 단백질이 「분비」된다는 것은 단백질이 세균 균체 외(세포 외)로 이송되는 것을 말한다. 세균 균체 외(세포 외)로서는, 배지 중이나 균체 표층을 들 수 있다. 즉, 분비된 단백질 분자는, 예를 들면, 배지 중에 존재하고 있어도 좋고, 균체 표층에 존재하고 있어도 좋고, 배지 중과 균체 표층의 양쪽에 존재하고 있어도 좋다. 즉, 단백질이 「분비」되는 것에는, 최종적으로 그 단백질의 전체 분자가 배지 중에 완전하게 유리(遊離) 상태에 놓이는 경우에 한정되지 않고, 예를 들면, 그 단백질의 전체 분자가 균체 표층에 존재하고 있는 경우나, 그 단백질의 일부의 분자가 배지 중에 존재하고, 나머지 분자가 균체 표층에 존재하고 있는 경우도 포함된다.
즉, 본 발명에 있어서, 「이종 단백질을 분비 생산하는 능력」이란, 본 발명의 세균을 배지 중에서 배양했을 때에, 배지 중 및/또는 균체 표층에 이종 단백질을 분비하고, 배지 중 및/또는 균체 표층으로부터 회수할 수 있을 정도로 축적하는 능력을 말한다. 축적량은, 예를 들면, 배지 중에서의 축적량으로서, 바람직하게는 10㎍/L 이상, 보다 바람직하게는 1mg/L 이상, 특히 바람직하게는 100mg/L 이상, 더 바람직하게는 1g/L 이상이라도 좋다. 또한, 축적량은, 예를 들면, 균체 표층에서의 축적량으로서, 균체 표층의 이종 단백질을 회수하여 배지와 동(同)량의 액체에 현탁한 경우에 현탁액 중에서의 이종 단백질 농도가 바람직하게는 10㎍/L 이상, 보다 바람직하게는 1mg/L 이상, 특히 바람직하게는 100mg/L 이상이 되는 양이라도 좋다. 또한, 본 발명에 있어서 분비 생산되는 「단백질」이란, 올리고 펩타이드나 폴리펩타이드 등 펩타이드로 불리는 형태도 포함하는 개념이다.
본 발명에 있어서, 「이종 단백질」(heterologous protein)이란, 이 단백질을 발현 및 분비시키는 코리네형 세균에 있어서 외래성(exogenous)인 단백질을 말한다. 이종 단백질은, 예를 들면, 미생물 유래의 단백질이라도 좋고, 식물 유래의 단백질이라도 좋고, 동물 유래의 단백질이라도 좋고, 바이러스 유래의 단백질이라도 좋고, 또한 인공적으로 아미노산 서열을 디자인한 단백질이라도 좋다. 이종 단백질은, 특히, 인간 유래의 단백질이라도 좋다. 이종 단백질은 단량체 단백질(monomeric protein)이라도 좋고, 다량체 단백질(multimeric protein)이라도 좋다. 다량체 단백질이란, 2 또는 그 이상의 서브유닛으로 이루어지는 다량체로서 존재할 수 있는 단백질을 말한다. 다량체에 있어서, 각 서브유닛은, 디술피드 결합 등의 공유 결합으로 연결되어 있어도 좋고, 수소 결합이나 소수성 상호 작용 등의 비공유 결합으로 연결되어 있어도 좋고, 이들의 조합에 의해 연결되어 있어도 좋다. 다량체에 있어서는, 1 또는 그 이상의 분자간 디술피드 결합이 포함되는 것이 바람직하다. 다량체는, 단일 종류의 서브유닛으로 이루어지는 호모 다량체라도 좋고, 2 또는 그 이상의 종류의 서브유닛으로 이루어지는 헤테로 다량체라도 좋다. 또한, 다량체 단백질이 헤테로 다량체인 경우에는, 다량체를 구성하는 서브유닛 중, 적어도 1개의 서브유닛이 이종 단백질이면 좋다. 즉, 모든 서브유닛이 이종 유래라도 좋고, 일부의 서브유닛만이 이종 유래라도 좋다. 이종 단백질은 천연이고 분비성인 단백질이라도 좋고, 천연이고 비분비성인 단백질이라도 좋고, 천연이고 분비성인 단백질인 것이 바람직하다. 또한, 이종 단백질은 천연이고 Tat계 의존의 분비성 단백질이라도 좋고, 천연이고 Sec계 의존의 분비성 단백질이라도 좋다. 「이종 단백질」의 구체적인 예는 후술한다.
생산되는 이종 단백질은 1종류뿐이라도 좋고, 2 또는 그 이상의 종류라도 좋다. 또한, 이종 단백질이 헤테로 다량체인 경우에는, 1종류의 서브유닛만 생산되어도 좋고, 2 또는 그 이상의 종류의 서브유닛이 생산되어도 좋다. 즉, 「이종 단백질을 분비 생산한다」는 것에는, 목적의 이종 단백질을 구성하는 서브유닛 중, 모든 서브유닛을 분비 생산하는 경우에 더하여, 일부의 서브유닛만을 분비 생산하는 경우도 포함된다.
코리네형 세균은 호기성의 그램양성 간균이다. 코리네형 세균으로서는, 코리네박테리움(Corynebacterium)속 세균, 브레비박테리움(Brevibacterium)속 세균, 및 마이크로박테리움(Microbacterium)속 세균 등을 들 수 있다. 코리네형 세균을 사용하는 것의 이점으로서는, 종래 이종 단백질의 분비 생산에 이용되고 있는 사상균, 효모, Bacillus속 세균 등에 비해, 원래 균체 외에 분비되는 단백질이 매우 적고, 이종 단백질을 분비 생산했을 경우의 정제 과정의 간략화나 생략화를 기대할 수 있는 것, 또한, 당, 암모니아, 및 무기염 등을 함유하는 심플한 배지에서 잘 생육하고, 배지값이나 배양 방법, 배양 생산성에서 우수하다는 것 등을 들 수 있다.
코리네형 세균으로서는, 구체적으로는 하기와 같은 종을 들 수 있다.
코리네박테리움·아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum)
코리네박테리움·아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum)
코리네박테리움·알카노리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum)
코리네박테리움·칼루나에(Corynebacterium callunae)
코리네박테리움·크레나튬(Corynebacterium crenatum)
코리네박테리움·글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)
코리네박테리움·릴륨(Corynebacterium lilium)
코리네박테리움·멜라쎄콜라(Corynebacterium melassecola)
코리네박테리움·써모아미노게네스(코리네박테리움·에피시엔스)(Corynebacterium thermoaminogenes(Corynebacterium efficiens))
코리네박테리움·헤르쿨리스(Corynebacterium herculis)
브레비박테리움·디바리카룸(코리네박테리움·글루타미쿰)(Brevibacterium divaricatum(Corynebacterium glutamicum))
브레비박테리움·플라붐(코리네박테리움·글루타미쿰)(Brevibacterium flavum(Corynebacterium glutamicum))
브레비박테리움·이마리오필룸(Brevibacterium immariophilum)
브레비박테리움·락토페르멘툼(코리네박테리움·글루타미쿰)(Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum))
브레비박테리움·로세움(Brevibacterium roseum)
브레비박테리움·사카롤리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum)
브레비박테리움·티오게니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis)
코리네박테리움·암모니아게네스(코리네박테리움·스타티오니스)(Corynebacterium ammoniagenes(Corynebacterium stationis))
브레비박테리움·앨범(Brevibacterium album)
브레비박테리움·세리눔(Brevibacterium cerinum)
마이크로박테리움·암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum)
코리네형 세균으로서는, 구체적으로는 하기와 같은 균주를 들 수 있다.
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium allkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens(Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340(FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum(Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes(Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium allbum ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
또한, 코리네박테리움속 세균에는, 종래 브레비박테리움속으로 분류되어 있었지만, 현재 코리네박테리움속으로 통합된 세균(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991))도 포함된다. 또한, 코리네박테리움·스타티오니스에는, 종래 코리네박테리움·암모니아게네스로 분류되어 있었지만, 16S rRNA의 염기서열 해석 등에 의해 코리네박테리움·스타티오니스로 재분류된 세균도 포함된다(Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)).
이들 균주는, 예를 들면, 아메리칸·타입·컬처·콜렉션(주소 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)에서 분양을 받을 수 있다. 즉 각 균주에 대응하는 등록번호가 부여되어 있고, 이 등록번호를 이용하여 분양을 받을 수 있다(http://www.atcc.org/참조). 각 균주에 대응하는 등록번호는 아메리칸·타입·컬처·콜렉션의 카탈로그에 기재되어 있다. 또한, 이들 균주는, 예를 들면, 각 균주가 기탁된 기탁 기관에서 입수할 수 있다.
특히, 야생주 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869에서 스트렙토마이신(Sm) 내성 변이주로서 분리한 씨. 글루타미쿰 AJ12036(FERM BP-734)은 그 친주(야생주)에 비해, 단백질의 분비에 관한 기능을 담당하는 유전자에 변이가 존재하는 것이 예측되고, 단백질의 분비 생산능이 최적 배양 조건 하에서의 축적량으로서 약 2 내지 3배로 매우 높고, 숙주균으로서 적합하다(WO02/081694). AJ12036은, 1984년 3월 26일에 공업기술원 미생물공업기술연구소(현재, 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허생물기탁센터, 우편번호: 292-0818, 주소: 니혼 치바켄 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8 120호실)에 국제기탁으로서 원기탁되어, 수탁번호 FERM BP-734가 부여되어 있다.
또한, Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)은, 1987년 3월 13일에 공업기술원 미생물공업기술연구소(현재, 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허생물기탁센터, 우편번호: 292-0818, 주소: 니혼 치바켄 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8 120호실)에 국제기탁으로서 원기탁되어, 수탁번호 FERM BP-1539가 부여되어 있다. 또한, Brevibacterium flavum AJ12418(FERM BP-2205)은, 1988년 12월 24일에 공업기술원 미생물공업기술연구소(현재, 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허생물기탁센터, 우편번호: 292-0818, 주소: 니혼 치바켄 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8 120호실)에 국제기탁으로서 원기탁되어, 수탁번호 FERM BP-2205가 부여되어 있다.
또한, 상술한 바와 같은 코리네형 세균을 친주로서, 돌연변이법이나 유전자 재조합법을 이용하여 단백질의 분비 생산능이 높아진 주(株)를 선발하여, 숙주로서 이용해도 좋다. 예를 들면, 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로소구아니딘 등의 화학 변이제에 의한 처리를 행한 후, 단백질의 분비 생산능이 높아진 주를 선발할 수 있다.
또한, 이러한 균주에서 세포 표층 단백질을 생산하지 않도록 개변한 균주를 숙주로서 사용하면, 배지 중 또는 균체 표층에 분비된 이종 단백질의 정제가 용이해져, 특히 바람직하다. 이러한 개변은, 돌연변이법 또는 유전자 재조합법에 의해 염색체상의 세포 표층 단백질의 코드 영역 또는 그 발현 조절 영역에 변이를 도입함으로써 행할 수 있다. 세포 표층 단백질을 생산하지 않도록 개변된 코리네형 세균으로서는, 씨. 글루타미쿰 AJ12036(FERM BP-734)의 세포 표층 단백질 PS2의 결손주인 씨. 글루타미쿰 YDK010주(WO2004/029254)를 들 수 있다.
이종 단백질을 분비 생산하는 능력을 갖는 코리네형 세균은, 상술한 바와 같은 코리네형 세균에, 본 발명에 사용되는 유전자 구축물을 도입하여 유지시킴으로써 얻을 수 있다. 즉, 본 발명의 세균은, 예를 들면, 상술한 바와 같은 코리네형 세균에 유래하는 개변주라도 좋다. 본 발명의 세균은, 구체적으로는, 예를 들면, 씨. 글루타미쿰 AJ12036(FERM BP-734)에 유래하는 개변주 또는 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869에 유래하는 개변주라도 좋다. 또한, 씨. 글루타미쿰 AJ12036(FERM BP-734)에 유래하는 개변주는, 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869에 유래하는 개변주에도 해당된다. 본 발명에 사용되는 유전자 구축물이나 그 도입법에 대해서는 후술한다.
<1-2> HrrSA 시스템의 활성 저하
본 발명의 세균은 HrrSA 시스템의 활성이 저하되도록 개변되어 있다. 본 발명의 세균은, 구체적으로는, HrrSA 시스템의 활성이 비개변주와 비교하여 저하되도록 개변되어 있다. HrrSA 시스템의 활성이 저하되도록 코리네형 세균을 개변함으로써, 이 세균의 이종 단백질을 분비 생산하는 능력을 향상시킬 수 있는, 즉, 이 세균에 의한 이종 단백질의 분비 생산을 증대시킬 수 있다.
본 발명의 세균은, 이종 단백질을 분비 생산하는 능력을 갖는 코리네형 세균을, HrrSA 시스템의 활성이 저하되도록 개변함으로써 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 세균은, HrrSA 시스템의 활성이 저하되도록 코리네형 세균을 개변한 후에, 이종 단백질을 분비 생산하는 능력을 부여함으로써도 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, 본 발명의 세균을 구축하기 위한 개변은 임의의 순서로 행할 수 있다. 또한, 본 발명의 세균의 구축에 사용되는, HrrSA 시스템의 활성이 저하되도록 개변되기 전의 주는, 이종 단백질의 분비 발현용의 유전자 구축물을 갖는다고 가정한 경우에, 이종 단백질을 분비 생산할 수 있어도 좋고, 할 수 없어도 좋다. 즉, 본 발명의 세균은, 예를 들면, HrrSA 시스템의 활성이 저하되도록 개변됨으로써 이종 단백질을 분비 생산하는 능력을 획득한 것이라도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면, 본 발명의 세균은, HrrSA 시스템의 활성이 저하되도록 개변되기 전에는 이종 단백질의 분비 발현용의 유전자 구축물을 갖고 있어도 이종 단백질을 분비 생산할 수 없었던 주에서 얻어진 것으로서, HrrSA 시스템의 활성이 저하되도록 개변됨으로써 이종 단백질을 분비 생산할 수 있도록 된 것이라도 좋다.
이하, HrrSA 시스템 및 이를 코드하는 유전자에 대하여 설명한다. HrrSA 시스템은 2성분 제어계 중 하나이며, 환경 중의 자극(예를 들면 헴(haem)의 존재)에 대한 응답을 야기한다. HrrSA 시스템은, hrrS 유전자에 코드되는 센서 키나아제 HrrS와, hrrA 유전자에 코드되는 반응 조절인자 HrrA로 이루어진다. hrrS 유전자 및 hrrA 유전자를 총칭하여 「hrrSA 유전자」라고도 한다. HrrS (HrrS 단백질) 및 HrrA(HrrA 단백질)를 총칭하여 「HrrSA 단백질」이라고도 한다.
코리네형 세균이 갖는 hrrSA 유전자의 염기서열 및 이들에 코드되는 HrrSA 단백질의 아미노산 서열은, 예를 들면, NCBI(National Center for Biotechnology Information) 등의 공개 데이터 베이스로부터 취득할 수 있다. 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 hrrS 유전자의 염기서열, 및 이 유전자가 코드하는 HrrS 단백질의 아미노산 서열을, 각각 서열번호 62 및 63에 나타낸다. 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 hrrA 유전자의 염기서열, 및 이 유전자가 코드하는 HrrA 단백질의 아미노산 서열을, 각각 서열번호 64 및 65에 나타낸다. 즉, hrrSA 유전자는, 예를 들면, 각각 서열번호 62 및 64에 나타낸 염기서열을 갖는 유전자라도 좋다. 또한, HrrSA 단백질은, 예를 들면, 각각 서열번호 63 및 65에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질이라도 좋다. 또한, 「(아미노산 또는 염기)서열을 갖는다」라는 표현은 특별히 기재하지 않는 한, 당해 「(아미노산 또는 염기)서열을 포함한다」는 것을 의미하고, 당해 「(아미노산 또는 염기)서열로 이루어진다」는 경우도 포함한다.
hrrSA 유전자는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 hrrSA 유전자 (예를 들면 서열번호 62 또는 64에 나타낸 염기서열을 갖는 유전자)의 변이체라도 좋다. 마찬가지로, HrrSA 단백질은 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 HrrSA 단백질(예를 들면 서열번호 63 또는 65에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질)의 변이체라도 좋다. 이러한 원래의 기능이 유지된 변이체를 「보존적 변이체」라고 하는 경우가 있다. 본 발명에 있어서, 「hrrSA 유전자」라는 용어는 상기 예시한 hrrSA 유전자에 한정되지 않고, 그 보존적 변이체를 포함하는 것으로 한다. 마찬가지로, 「HrrSA 단백질」이라는 용어는 상기 예시한 HrrSA 단백질에 한정되지 않고, 그 보존적 변이체를 포함하는 것으로 한다. 보존적 변이체로서는, 예를 들면, 상기 예시한 hrrSA 유전자나 HrrSA 단백질의 동족체나 인위적인 개변체를 들 수 있다.
「원래의 기능이 유지되고 있다」란, 유전자 또는 단백질의 변이체가, 원래의 유전자 또는 단백질의 기능(활성이나 성질)에 대응하는 기능(활성이나 성질)을 갖는 것을 말한다. 즉, 「원래의 기능이 유지되고 있다」란, hrrSA 유전자에 있어서는, 유전자의 변이체가, 원래의 기능이 유지된 단백질(즉 HrrSA 단백질)을 코드하는 것이라도 좋다. 또한, 「원래의 기능이 유지되고 있다」란, HrrSA 단백질에 있어서는, 단백질의 변이체가, HrrSA 단백질로서의 기능(예를 들면, 서열번호 63 또는 65에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 기능)을 갖는 것이라도 좋다. 또한, 「원래의 기능이 유지되고 있다」란, HrrS 단백질에 있어서는, 단백질의 변이체가, HrrSA 시스템의 센서 키나아제로서의 기능을 갖는 것이라도 좋다. 또한, 「원래의 기능이 유지되고 있다」란, HrrA 단백질에 있어서는, 단백질의 변이체가, HrrSA 시스템의 반응 조절인자로서의 기능을 갖는 것이라도 좋다. 즉, 「HrrSA 단백질로서의 기능」이란, 구체적으로는, 각각, HrrSA 시스템의 센서 키나아제로서의 기능 및 HrrSA 시스템의 반응 조절인자로서의 기능이라도 좋다. 「HrrSA 시스템의 센서 키나아제로서의 기능」이란, 구체적으로는, 반응 조절인자인 HrrA 단백질과 공액하여 환경 중의 자극에 대한 응답을 야기하는 기능이라도 좋다. 「HrrSA 시스템의 센서 키나아제로서의 기능」이란, 더 구체적으로는, 환경 중의 자극을 감지하여 자기 인산화되고, 인산기 전이에 의해 HrrA 단백질을 활성화시키는 기능이라도 좋다. 「HrrSA 시스템의 반응 조절인자로서의 기능」이란, 구체적으로는, 센서 키나아제인 HrrS 단백질과 공액하여 환경 중의 자극에 대한 응답을 야기하는 기능이라도 좋다. 「HrrSA 시스템의 반응 조절인자로서의 기능」이란, 더 구체적으로는, 환경 중의 자극을 감지하여 자기 인산화된 HrrS 단백질에서의 인산기 전이에 의해 활성화되고, 유전자의 발현을 제어(예를 들면, 유도 또는 억제)하는 기능이라도 좋다. HrrSA 시스템에 의해 발현이 유도되는 유전자로서는, 헴의 분해에 관여하는 유전자(예를 들면, hmuO 유전자)나 호흡쇄 중의 헴 함유 단백질을 코드하는 유전자(예를 들면, ctaE-qcrCAB 오페론 유전자나 ctaD 유전자)를 들 수 있다. HrrSA 시스템에 의해 발현이 억제되는 유전자로서는, 헴의 생합성에 관여하는 유전자(예를 들면, hemE-hemY-hemL-cg0519-ccsX-ccdA-resB-resC 오페론 유전자, hemA-hemC 오페론 유전자, 및 hemH유전자)를 들 수 있다.
HrrSA 단백질의 변이체가 HrrSA 시스템의 센서 키나아제 또는 반응 조절인자로서의 기능을 갖는지 여부는, 예를 들면, 이 변이체의 활성을 코리네형 세균에서 저하시켜, HrrSA 시스템에 의해 발현이 유도 또는 억제되는 유전자의 발현이 헴의 존재 하에서 저하 또는 증대하는지 여부를 확인함으로써 확인할 수 있다. 또한, HrrS 단백질의 변이체가 HrrSA 시스템의 센서 키나아제로서의 기능을 갖는지 여부는, 예를 들면, 이 변이체를 코드하는 유전자를 코리네형 세균의 hrrS 유전자의 결손주에 도입하고, HrrSA 시스템에 의해 발현이 유도 또는 억제되는 유전자의 발현이 헴의 존재 하에서 증대 또는 저하되는지 여부를 확인함으로써 확인할 수 있다. 또한, HrrA 단백질의 변이체가 HrrSA 시스템의 반응 조절인자로서의 기능을 갖는지 여부는, 예를 들면, 이 변이체를 코드하는 유전자를 코리네형 세균의 hrrA 유전자의 결손주에 도입하고, HrrSA 시스템에 의해 발현이 유도 또는 억제되는 유전자의 발현이 헴의 존재 하에서 증대 또는 저하되는지 여부를 확인함으로써 확인할 수 있다. 코리네형 세균의 hrrS 유전자 또는 hrrA 유전자의 결손주로서는, 예를 들면, 씨. 글루타미쿰 YDK010주의 hrrS 유전자 또는 hrrA 유전자의 결손주나, 씨. 글루타미쿰 ATCC13032주의 hrrS 유전자 또는 hrrA 유전자의 결손주를 사용할 수 있다.
이하, 보존적 변이체에 대하여 예시한다.
hrrSA 유전자의 동족체 또는 HrrSA 단백질의 동족체는, 예를 들면, 상기 예시한 hrrSA 유전자의 염기서열 또는 상기 예시한 HrrSA 단백질의 아미노산 서열을 문의 서열로서 사용한 BLAST 검색이나 FASTA 검색에 의해 공개 데이터 베이스로부터 용이하게 취득할 수 있다. 또한, HrrSA 유전자의 동족체는, 예를 들면, 코리네형 세균의 염색체를 주형으로 하여, 이들 공지된 hrrSA 유전자의 염기서열에 기초하여 제작한 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용한 PCR에 의해 취득할 수 있다.
hrrSA 유전자는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 HrrSA 단백질의 아미노산 서열(예를 들면, 서열번호 63 또는 65에 나타낸 아미노산 서열)에 있어서, 1 또는 여러 개의 위치에서의 1 또는 여러 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 유전자라도 좋다. 또한 상기 「1 또는 여러 개」란, 아미노산 잔기의 단백질의 입체 구조에서의 위치나 아미노산 잔기의 종류에 따라서도 다르지만, 구체적으로는, 예를 들면, 1 내지 50개, 1 내지 40개, 1 내지 30개, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개를 의미한다.
상기의 1 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가는, 단백질의 기능이 정상적으로 유지되는 보존적 변이이다. 보존적 변이의 대표적인 것은 보존적 치환이다. 보존적 치환이란, 치환 부위가 방향족 아미노산인 경우에는 Phe, Trp, Tyr 사이에서, 치환 부위가 소수성 아미노산인 경우에는 Leu, Ile, Val 사이에서, 극성 아미노산인 경우에는 Gln, Asn 사이에서, 염기성 아미노산인 경우에는 Lys, Arg, His 사이에서, 산성 아미노산인 경우에는 Asp, Glu 사이에서, 하이드록실기를 갖는 아미노산인 경우에는 Ser, Thr 사이에서 서로 치환하는 변이이다. 보존적 치환으로 간주되는 치환으로서는, 구체적으로는, Ala로부터 Ser 또는 Thr로의 치환, Arg로부터 Gln, His 또는 Lys로의 치환, Asn으로부터 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환, Asp로부터 Asn, Glu 또는 Gln으로의 치환, Cys로부터 Ser 또는 Ala로의 치환, Gln으로부터 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg로의 치환, Glu로부터 Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환, Gly로부터 Pro로의 치환, His로부터 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr로의 치환, Ile로부터 Leu, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Leu로부터 Ile, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Lys로부터 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg로의 치환, Met로부터 Ile, Leu, Val 또는 Phe로의 치환, Phe로부터 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu로의 치환, Ser로부터 Thr 또는 Ala로의 치환, Thr로부터 Ser 또는 Ala로의 치환, Trp로부터 Phe 또는 Tyr로의 치환, Tyr로부터 His, Phe 또는 Trp로의 치환, 및, Val로부터 Met, Ile 또는 Leu로의 치환을 들 수 있다. 또한, 상기한 바와 같은 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가에는, 유전자가 유래하는 세균의 개체 차이, 종류의 차이에 근거한 경우 등 천연에서 발생하는 변이(mutant 또는 variant)에 의해 발생하는 것도 포함된다.
또한, HrrSA 유전자는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 HrrSA 단백질의 아미노산 서열(예를 들면, 서열번호 63 또는 65에 나타낸 아미노산 서열) 전체에 대하여, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 유전자라도 좋다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「상동성」 (homology)은 「동일성」(identity)을 의미한다.
또한, HrrSA 유전자는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 hrrSA 유전자의 염기서열(예를 들면, 서열번호 62 또는 64에 나타낸 염기서열)의 상보 서열 또는 이 상보 서열로 조제될 수 있는 프로브와 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 테리파라타이드라도 좋다. 「엄격한 조건」이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 일례를 게시하면, 상동성이 높은 테리파라타이드끼리, 예를 들면, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 테리파라타이드끼리가 하이브리다이즈하고, 이보다 상동성이 낮은 테리파라타이드끼리 하이브리다이즈하지 않는 조건, 또는 통상의 서던 하이브리다이제이션의 세정 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 바람직하게는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상응하는 염 농도 및 온도에서 1회, 바람직하게는 2 내지 3회 세정하는 조건을 들 수 있다.
상기 프로브는, 예를 들면, 유전자의 상보 서열의 일부라도 좋다. 이러한 프로브는, 공지된 유전자의 염기서열에 기초하여 제작한 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하고, 이들 염기서열을 포함하는 테리파라타이드 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 제작할 수 있다. 프로브로서는, 예를 들면, 300bp 정도 길이의 테리파라타이드 단편을 사용할 수 있다. 이 경우, 하이브리다이제이션의 세정 조건으로서는 50℃, 2×SSC, 0.1% SDS를 들 수 있다.
또한, HrrSA 유전자는, 상기 예시한 hrrSA 유전자 또는 그 보존적 변이체의 염기서열에 있어서, 임의의 코돈을 그것과 등가의 코돈으로 치환한 염기서열을 갖는 것이라도 좋다.
2개의 서열간의 서열 동일성의 퍼센티지는, 예를 들면, 수학적 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 수학적 알고리즘의 한정되지 않는 예로서는, Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17의 알고리즘, Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482의 국소 호몰로지 알고리즘, Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453의 호몰로지 얼라인먼트 알고리즘, Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448의 유사성을 검색하는 방법, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877에 기재되어 있는 바와 같은 개량된, Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264의 알고리즘을 들 수 있다.
이들의 수학적 알고리즘에 기초한 프로그램을 이용하여, 서열 동일성을 결정하기 위한 서열 비교(얼라인먼트)를 행할 수 있다. 프로그램은 적절히 컴퓨터에 의해 실행할 수 있다. 이러한 프로그램으로서는 특별히 한정되지 않지만, PC/Gene 프로그램의 CLUSTAL(Intelligenetics, Mountain View, Calif.에서 입수 가능), ALIGN 프로그램(Version 2.0), 및 Wisconsin Genetics Software Package, Version 8(Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USA에서 입수 가능)의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA를 들 수 있다. 이들 프로그램을 사용한 얼라인먼트는, 예를 들면, 초기 파라미터를 사용하여 행할 수 있다. CLUSTAL 프로그램에 대해서는, Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244, Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153, Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90, Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65, 및 Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331에 잘 기재되어 있다.
대상의 단백질을 코드하는 뉴클레오티드 서열과 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해서, 구체적으로는, 예를 들면, BLAST 뉴클레오티드 검색을 BLASTN 프로그램, 스코어=100, 워드 길이=12로 행할 수 있다. 대상의 단백질과 상동성이 있는 아미노산 서열을 얻기 위해서, 구체적으로는, 예를 들면, BLAST 단백질 검색을 BLASTX 프로그램, 스코어=50, 워드 길이=3으로 행할 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색이나 BLAST 단백질 검색에 대해서는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조하기 바란다. 또한, 비교를 목적으로서 갭을 가한 얼라인먼트를 얻기 위해서, Gapped BLAST(BLAST 2.0)를 이용할 수 있다. 또한, PSI-BLAST(BLAST 2.0)를, 서열간의 이간된 관계를 검출하는 반복 검색을 행하는데도 이용할 수 있다. Gapped BLAST 및 PSI-BLAST에 대해서는 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389를 참조하기 바란다. BLAST, Gapped BLAST, 또는 PSI-BLAST를 이용할 경우, 예를 들면, 각 프로그램(예를 들면, 뉴클레오티드 서열에 대하여 BLASTN, 아미노산 서열에 대하여 BLASTX)의 초기 파라미터가 사용될 수 있다. 얼라인먼트는 수동으로 행하여져도 좋다.
2개의 서열간의 서열 동일성은, 2개의 서열을 최대 일치가 되도록 정렬했을 때에 2개의 서열간에서 일치하는 잔기의 비율로서 산출된다.
또한, 상기의 유전자나 단백질의 변이체에 관한 기재는 PhoRS 단백질, 세포 표층 단백질, Tat계 분비 장치, 본 발명에 있어서 분비 생산되는 이종 단백질 등의 임의의 단백질, 및 이들을 코드하는 유전자에도 준용할 수 있다.
「HrrSA 시스템의 활성이 저하된다」란, 환경 중의 자극에 대한 HrrSA 시스템을 통하여 야기되는 응답의 정도가 저하되는 것을 의미해도 좋다. HrrSA 시스템의 활성은, 예를 들면, HrrS 단백질 및/또는 HrrA 단백질(즉 HrrS 단백질 및 HrrA 단백질의 한쪽 또는 양쪽)의 활성을 저하시킴으로써, 저하시킬 수 있다. 즉, 「HrrSA 시스템의 활성이 저하된다」란, HrrS 단백질 및/또는 HrrA 단백질의 활성이 저하되는 것을 의미해도 좋다. 본 발명에 있어서는, 예를 들면, 적어도 HrrA 단백질의 활성이 저하되어도 좋다. 「HrrS 단백질의 활성이 저하된다」란, HrrSA 시스템의 센서 키나아제의 기능이 저하되는 것을 의미해도 좋다. 「HrrA 단백질의 활성이 저하된다」란, HrrSA 시스템의 반응 조절인자의 기능이 저하되는 것을 의미해도 좋다. 따라서, HrrSA 시스템, HrrS 단백질, 또는 HrrA 단백질의 활성의 저하는, 구체적으로는, 예를 들면, 헴의 존재 하에서의, HrrSA 시스템에 의해 발현이 유도 또는 억제되는 유전자의 발현의 저하 또는 증대를 지표로서 측정할 수 있다. 또한, 「HrrSA 시스템의 활성이 저하된다」란, 특히, HrrSA 시스템의 세포당 분자수가 저하되는 것을 의미해도 좋다. 마찬가지로, 「HrrS 단백질 및/또는 HrrA 단백질의 활성이 저하된다」란, 특히, HrrS 단백질 및/또는 HrrA 단백질의 세포당 분자수가 저하되는 것을 의미해도 좋다. HrrSA 단백질 등의 단백질의 활성을 저하시키는 방법에 대해서는 후술한다. HrrSA 단백질의 활성은, 예를 들면, 이 단백질을 코드하는 유전자(hrrSA 유전자)의 발현을 저하시킴으로써, 또는 hrrSA 유전자를 파괴함으로써 저하시킬 수 있다. 또한, 2성분 제어계에 있어서는, 센서 키나아제가 자극을 감지하면 특정한 히스티딘 잔기가 자기 인산화되고, 그 인산기가 반응 조절인자의 특정한 아스파라긴산 잔기로 전이함으로써 시그널이 전달된다. 따라서, HrrSA 시스템의 활성은, 구체적으로는 HrrS 단백질의 활성은, 예를 들면, HrrS 단백질의 자기 인산화되는 히스티딘 잔기를 치환 또는 결실함으로써도 저하시킬 수 있다. 또한, HrrSA 시스템의 활성은, 구체적으로는 HrrA 단백질의 활성은, 예를 들면, HrrS 단백질의 자기 인산화된 히스티딘 잔기로부터 인산기가 전이하는, HrrA 단백질의 아스파라긴산 잔기를 치환 또는 결실함으로써도 저하시킬 수 있다. 당해 히스티딘 잔기는, HrrS 단백질의 217 위치의 히스티딘 잔기(H217)이다. 「HrrS 단백질의 H217」이란, 구체적으로는, 서열번호 63의 H217에 상응하는 히스티딘 잔기를 의미한다. 당해 아스파라긴산 잔기는, HrrA 단백질의 54 위치의 아스파라긴산 잔기(D54)이다. 「HrrA 단백질의 D54」란, 구체적으로는, 서열번호 65의 D54에 상응하는 아스파라긴산 잔기를 의미한다. 임의의 HrrSA 단백질에서의 「HrrS 단백질의 H217」 또는 「HrrA 단백질의 D54」의 위치에 대해서는, 후술하는 「야생형 PhoS 단백질의 X 위치의 아미노산 잔기」의 위치에 관한 설명을 준용할 수 있다. 당해 히스티딘 잔기 또는 아스파라긴산 잔기는, 예를 들면, 단독으로, 또는 그 주변의 영역과 함께 치환 또는 결실되어도 좋다. 즉, 예를 들면, 당해 히스티딘 잔기 또는 아스파라긴산 잔기만 치환 또는 결실되어도 좋고, 당해 히스티딘 잔기 또는 아스파라긴산 잔기를 포함하는 영역이 치환 또는 결실되어도 좋다.
<1-3> 그 외의 성질
본 발명의 세균은 이종 단백질을 분비 생산할 수 있는 한, 원하는 성질을 갖고 있어도 좋다. 예를 들면, 본 발명의 세균은 세포 표층 단백질의 활성이 저하되고 있어서 좋다(WO2013/065869, WO2013/065772, WO2013/118544, WO2013/062029). 또한, 본 발명의 세균은, 페니실린 결합 단백질의 활성이 저하되도록 개변되어 있어도 좋다(WO2013/065869). 또한, 본 발명의 세균은, 메탈로펩티다아제를 코드하는 유전자의 발현이 상승하도록 개변되어 있어도 좋다(WO2013/065772). 또한, 본 발명의 세균은, 변이형 리보솜 단백질 S1 유전자(변이형 rpsA 유전자)를 갖도록 개변되어 있어도 좋다(WO2013/118544). 또한, 본 발명의 세균은, 변이형 phoS 유전자를 갖도록 개변되어 있어도 좋다(WO2016/171224). 또한, 본 발명의 세균은, Tat계 분비 장치가 증강되어 있어도 좋다. 이들의 성질 또는 개변은 단독으로, 또는 적절히 조합하여 이용할 수 있다.
<1-3-1> 변이형 phoS 유전자의 도입
본 발명의 세균은, 변이형 phoS 유전자를 유지하도록 개변되어 있어도 좋다. 「변이형 phoS 유전자를 유지한다」는 것을, 「변이형 phoS 유전자를 갖는다」 또는 「phoS 유전자에 변이를 갖는다」라고도 한다. 또한, 「변이형 phoS 유전자를 유지한다」는 것을, 「변이형 PhoS 단백질을 갖는다」 또는 「PhoS 단백질에 변이를 갖는다」라고도 한다.
이하, phoS 유전자 및 PhoS 단백질에 대하여 설명한다. phoS 유전자는, PhoRS 시스템의 센서 키나아제인 PhoS 단백질을 코드하는 유전자이다. PhoRS 시스템은 2성분 제어계 중 하나이며, 환경 중의 인산 결핍에 대한 응답을 야기한다. PhoRS 시스템은, phoS 유전자에 코드되는 센서 키나아제 PhoS와, phoR 유전자에 코드되는 반응 조절인자 PhoR로 이루어진다.
본 발명에 있어서, 「특정한 변이」를 갖는 PhoS 단백질을 「변이형 PhoS 단백질」, 이를 코드하는 유전자를 「변이형 phoS 유전자」라고도 한다. 「변이형 phoS 유전자」는, 바꿔 말하면, 「특정한 변이」를 갖는 phoS 유전자이다. 또한, 본 발명에 있어서, 「특정한 변이」를 갖지 않는 PhoS 단백질을 「야생형 PhoS 단백질」, 이를 코드하는 유전자를 「야생형 phoS 유전자」라고도 한다. 「야생형 phoS 유전자」는, 바꿔 말하면, 「특정한 변이」를 갖지 않는 phoS 유전자이다. 또한, 여기서 말하는 「야생형」이란, 「변이형」과 구별하기 위한 편의상의 기재이며, 「특정한 변이」를 갖지 않는 한, 천연으로 얻어지는 것에 한정되지 않는다. 「특정한 변이」에 대해서는 후술한다.
야생형 phoS 유전자로서는, 예를 들면, 코리네형 세균의 phoS 유전자를 들 수 있다. 코리네형 세균의 phoS 유전자로서, 구체적으로는, 예를 들면, 씨. 글루타미쿰 YDK010주, 씨. 글루타미쿰 ATCC13032주, 씨. 글루타미쿰 ATCC14067주, C. callunae, C. crenatum, 및 C. efficiens의 phoS 유전자를 들 수 있다. 씨. 글루타미쿰 YDK010주의 phoS 유전자의 염기서열을 서열번호 3에 나타낸다. 또한, 이들 phoS 유전자가 코드하는 야생형 PhoS 단백질의 아미노산 서열을, 각각 서열번호 4, 26, 27, 28, 29, 및 30에 나타낸다.
야생형 phoS 유전자는 「특정한 변이」를 갖지 않으며, 또한, 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 야생형 phoS 유전자의 변이체라도 좋다. 마찬가지로, 야생형 PhoS 단백질은 「특정한 변이」를 갖지 않으며, 또한, 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 야생형 PhoS 단백질의 변이체라도 좋다. 즉, 「야생형 phoS 유전자」라는 용어는 상기 예시한 야생형 phoS 유전자에 한정되지 않고, 그 보존적 변이체로서 「특정한 변이」를 갖지 않는 것을 포함하는 것으로 한다. 마찬가지로, 「야생형 PhoS 단백질」이라는 용어는 상기 예시한 야생형 PhoS 단백질에 한정되지 않고, 그 보존적 변이체로서 「특정한 변이」를 갖지 않는 것을 포함하는 것으로 한다. 야생형 PhoS 단백질 및 야생형 phoS 유전자의 변이체에 대해서는, 상기한 HrrSA 단백질 및 hrrSA 유전자의 보존적 변이체에 관한 기재를 준용할 수 있다. 예를 들면, 야생형 phoS 유전자는 「특정한 변이」를 갖지 않으며, 또한, 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 위치에서의 1 또는 여러 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 유전자라도 좋다.
또한, 「원래의 기능이 유지되고 있다」란, 야생형 PhoS 단백질에 있어서는, 단백질의 변이체가, PhoS 단백질로서의 기능(예를 들면, 서열번호 4, 26, 27, 28, 29, 또는 30에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 기능)을 갖는 것이라도 좋다. 또한, 「원래의 기능이 유지되고 있다」란, 야생형 PhoS 단백질에 있어서는, 단백질의 변이체가, PhoRS 시스템의 센서 키나아제로서의 기능을 갖는 것이라도 좋다. 즉, 「PhoS 단백질로서의 기능」이란, 구체적으로는, PhoRS 시스템의 센서 키나아제로서의 기능이라도 좋다. 「PhoRS 시스템의 센서 키나아제로서의 기능」이란, 구체적으로는, 반응 조절인자인 PhoR 단백질과 공액하여 환경 중의 인산 결핍에 대한 응답을 야기하는 기능이라도 좋다. 「PhoRS 시스템의 센서 키나아제로서의 기능」이란, 더 구체적으로는, 환경 중의 인산 결핍을 감지하여 자기 인산화되고, 인산기 전이에 의해 PhoR 단백질을 활성화시키는 기능이라도 좋다.
PhoS 단백질의 변이체가 PhoRS 시스템의 센서 키나아제로서의 기능을 갖는지 여부는, 예를 들면, 이 변이체를 코드하는 유전자를 코리네형 세균의 phoS 유전자의 결손주에 도입하고, 인산 결핍에 대한 응답성이 상보되는지 여부를 확인함으로써 확인할 수 있다. 인산 결핍에 대한 응답성의 상보는, 예를 들면, 인산 결핍 조건에서의 생육의 향상으로서, 또는 인산 결핍 조건에서 발현이 유도되는 것으로 알려져 있는 유전자의 발현의 유도로서 검출할 수 있다(J. Bacteriol., 188, 724-732(2006)). 코리네형 세균의 phoS 유전자의 결손주로서는, 예를 들면, 씨. 글루타미쿰 YDK010주의 phoS 유전자 결손주나, 씨. 글루타미쿰 ATCC13032주의 phoS 유전자 결손주를 사용할 수 있다.
야생형 PhoS 단백질에 있어서는, 자기 인산화되는 히스티딘 잔기가 보존되어 있는 것이 바람직하다. 즉, 보존적 변이는, 자기 인산화되는 히스티딘 잔기 이외의 아미노산 잔기에서 발생하는 것이 바람직하다. 「자기 인산화되는 히스티딘 잔기」란, 야생형 PhoS 단백질의 276 위치의 히스티딘 잔기를 가리킨다. 또한, 야생형 PhoS 단백질은, 예를 들면, 상기 예시한 야생형 PhoS 단백질의 보존 서열을 갖는 것이 바람직하다. 즉, 보존적 변이는, 예를 들면, 상기 예시한 야생형 PhoS 단백질에 있어서 보존되고 있지 않은 아미노산 잔기에서 발생하는 것이 바람직하다.
변이형 PhoS 단백질은 상술한 바와 같은 야생형 PhoS 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 「특정한 변이」를 갖는다.
즉, 바꿔 말하면, 변이형 PhoS 단백질은 「특정한 변이」를 갖는 것 이외에는, 상기 예시한 야생형 PhoS 단백질이나 그 보존적 변이체와 동일해도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면, 변이형 PhoS 단백질은 「특정한 변이」를 갖는 것 이외에는, 서열번호 4, 26, 27, 28, 29, 또는 30에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질이라도 좋다. 또한, 구체적으로는, 예를 들면, 변이형 PhoS 단백질은 「특정한 변이」를 갖는 것 이외에는, 서열번호 4, 26, 27, 28, 29, 또는 30에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이라도 좋다. 또한, 구체적으로는, 예를 들면, 변이형 PhoS 단백질은 「특정한 변이」를 갖는 것 이외에는, 서열번호 4, 26, 27, 28, 29, 또는 30에 나타낸 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질이라도 좋다.
또한, 바꿔 말하면, 변이형 PhoS 단백질은 상기 예시한 야생형 PhoS 단백질에 있어서, 「특정한 변이」를 갖고, 또한, 당해 「특정한 변이」 이외의 개소에 추가로 보존적 변이를 포함하는 변이체라도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면, 변이형 PhoS 단백질은 서열번호 4, 26, 27, 28, 29, 또는 30에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 「특정한 변이」를 갖고, 또한, 당해 「특정한 변이」 이외의 개소에 추가로 1 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이라도 좋다.
변이형 phoS 유전자는, 상기와 같은 변이형 PhoS 단백질을 코드하는 한, 특별히 제한되지 않는다.
이하, 변이형 PhoS 단백질이 갖는 「특정한 변이」에 대하여 설명한다.
「특정한 변이」는, 상술한 바와 같은 야생형 PhoS 단백질의 아미노산 서열이 변화되는 것이며, 또한, 이종 단백질의 분비 생산에 유효한 것이면 특별히 제한되지 않는다.
「특정한 변이」는, 이종 단백질의 분비 생산량을 향상시키는 변이인 것이 바람직하다. 「이종 단백질의 분비 생산량을 향상시킨다」란, 변이형 phoS 유전자를 갖도록 개변된 코리네형 세균(개변주)이, 비개변주보다도 많은 양의 이종 단백질을 분비 생산할 수 있는 것을 말한다. 「비개변주」란, phoS 유전자에 변이를 갖지 않는 대조주, 즉 변이형 phoS 유전자를 갖지 않는 대조주를 말하고, 예를 들면, 야생주 또는 친주라도 좋다. 「비개변주보다도 많은 양의 이종 단백질을 분비 생산한다」란, 이종 단백질의 분비 생산량이 비개변주와 비교하여 증대하는 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 배지 중 및/또는 균체 표층에서의 축적량으로서, 비개변주의, 바람직하게는 1.1배 이상, 보다 바람직하게는 1.2배 이상, 더 바람직하게는 1.3배 이상, 더 바람직하게는 2배 이상, 특히 바람직하게는 5배 이상의 양의 이종 단백질을 분비 생산하는 것이라도 좋다. 또한, 「비개변주보다도 많은 양의 이종 단백질을 분비 생산한다」란, 농축되어 있지 않은 비개변주의 배양 상청을 SDS-PAGE에 제공하여 CBB로 염색했을 때에는 이종 단백질을 검출할 수 없지만, 농축되어 있지 않은 개변주의 배양 상청을 SDS-PAGE에 제공하여 CBB로 염색했을 때에는 이종 단백질을 검출할 수 있는 것이라도 좋다. 또한, 「이종 단백질의 분비 생산량을 향상시킨다」란, 모든 이종 단백질의 분비 생산량이 향상될 필요는 없고, 분비 생산의 타겟으로서 설정한 이종 단백질의 분비 생산량이 향상되면 충분한다. 「이종 단백질의 분비 생산량을 향상시킨다」란, 구체적으로는, 예를 들면, 실시예에 기재된 이종 단백질의 분비 생산량을 향상시키는 것을 의미해도 좋다.
어떤 변이가 이종 단백질의 분비 생산량을 향상시키는 변이인지 여부는, 예를 들면, 코리네형 세균에 속하는 균주를 기초로 당해 변이를 갖는 PhoS 단백질을 코드하는 유전자를 갖도록 개변된 주를 제작하고, 당해 개변주를 배지에서 배양했을 때에 분비 생산되는 이종 단백질의 양을 정량하여, 개변 전의 주(비개변주)를 배지에서 배양했을 때에 분비 생산되는 이종 단백질의 양과 비교함으로써 확인할 수 있다.
아미노산 서열의 변화로서는, 아미노산 잔기의 치환이 바람직하다. 즉, 「특정한 변이」는, 야생형 PhoS 단백질 중 어느 하나의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것인 것이 바람직하다. 「특정한 변이」에 의해 치환이 발생하는 아미노산 잔기는 1잔기라도 좋고, 2잔기 또는 그 이상의 조합이라도 좋다. 「특정한 변이」에 의해 치환이 발생하는 아미노산 잔기는, 바람직하게는 자기 인산화되는 히스티딘 잔기 이외의 아미노산 잔기라도 좋다. 「특정한 변이」에 의해 치환이 발생하는 아미노산 잔기는, 보다 바람직하게는 자기 인산화되는 히스티딘 잔기 이외의 HisKA 도메인의 아미노산 잔기라도 좋다. 「자기 인산화되는 히스티딘 잔기」란, 야생형 PhoS 단백질의 276 위치의 히스티딘 잔기를 가리킨다. 「HisKA 도메인」이란, 야생형 PhoS 단백질의 266 내지 330 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 영역을 가리킨다. 「특정한 변이」에 의해 치환이 발생하는 아미노산 잔기는, 특히 바람직하게는, 야생형 PhoS 단백질의 302 위치의 트립토판 잔기(W302)라도 좋다.
상기 변이에 있어서, 치환 후의 아미노산 잔기로서는, K(Lys), R(Arg), H(His), A(Ala), V(Val), L(Leu), I(Ile), G(Gly), S(Ser), T(Thr), P(Pro), F(Phe), W(Trp), Y(Tyr), C(Cys), M(Met), D(Asp), E(Glu), N(Asn), Q(Gln) 중, 원래의 아미노산 잔기 이외의 것을 들 수 있다. 치환 후의 아미노산 잔기로서는, 예를 들면, 이종 단백질의 분비 생산량이 향상되는 것을 선택할 수 있다.
W302가 치환될 경우, 치환 후의 아미노산 잔기로서는, 방향족 아미노산 및 히스티딘 이외의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 「방향족 아미노산 및 히스티딘 이외의 아미노산 잔기」로서, 구체적으로는, K(Lys), R(Arg), A(Ala), V(Val), L(Leu), I(Ile), G(Gly), S(Ser), T(Thr), P(Pro), C(Cys), M(Met), D(Asp), E(Glu), N(Asn), Q(Gln)을 들 수 있다. 「방향족 아미노산 및 히스티딘 이외의 아미노산 잔기」로서, 더 구체적으로는, K(Lys), A(Ala), V(Val), S(Ser), C(Cys), M(Met), D(Asp), N(Asn)을 들 수 있다.
또한, phoS 유전자에서의 「특정한 변이」란, 코드하는 PhoS 단백질에 상기와 같은 「특정한 변이」를 발생시키는 염기서열상의 변이를 의미한다.
본 발명에 있어서, 「야생형 PhoS 단백질의 X 위치의 아미노산 잔기」란, 서열번호 4의 X 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기를 의미한다. 예를 들면, 「W302」란, 서열번호 4의 302 위치의 트립토판 잔기에 상응하는 아미노산 잔기를 의미한다. 상기 아미노산 잔기의 위치는 상대적인 위치를 나타내는 것으로서, 아미노산의 결실, 삽입, 부가 등에 의해 그 절대적인 위치는 전후(前後)하는 경우가 있다. 예를 들면, 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 PhoS 단백질에 있어서, X 위치보다도 N 말단측의 위치에서 1 아미노산 잔기가 결실된, 또는 삽입된 경우, 원래의 X 위치의 아미노산 잔기는, 각각, N 말단으로부터 세어 X-1번째 또는 X+1번째의 아미노산 잔기가 되지만, 「야생형 PhoS 단백질의 X 위치의 아미노산 잔기」로 간주된다. 구체적으로는, 예를 들면, 서열번호 4, 26, 27, 28, 29, 및 30에 나타낸 야생형 PhoS 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 「W302」는 각각 302 위치, 302 위치, 302 위치, 321 위치, 275 위치, 및 286 위치의 트립토판 잔기를 가리킨다. 또한, 서열번호 4, 26, 27, 28, 29, 및 30에 나타낸 야생형 PhoS 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 「야생형 PhoS 단백질의 276 위치의 히스티딘 잔기(자기 인산화되는 히스티딘 잔기)」는 각각 276 위치, 276 위치, 276 위치, 295 위치, 249 위치, 및 260 위치의 히스티딘 잔기를 가리킨다. 또한, 서열번호 4, 26, 27, 28, 29, 및 30에 나타낸 야생형 PhoS 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 「야생형 PhoS 단백질의 266 내지 330 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 영역(HisKA 도메인)」은 각각 266 내지 330 위치, 266 내지 330 위치, 266 내지 330 위치, 285 내지 349 위치, 239 내지 303 위치, 및 250 내지 314 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 영역을 가리킨다.
또한, 여기서 말하는 「Ｗ302」는 통상 트립토판 잔기이지만, 트립토판 잔기가 아니어도 좋다. 즉, 야생형 PhoS 단백질이 서열번호 4, 26, 27, 28, 29, 또는 30에 나타낸 아미노산 서열 이외의 아미노산 서열을 갖는 경우에는, 「W302」는 트립토판 잔기가 아닌 경우가 있을 수 있다. 따라서, 예를 들면, 「W302가 시스테인 잔기로 치환되는 변이」에는, 「W302」가 트립토판 잔기인 경우에 당해 트립토판 잔기가 시스테인 잔기로 치환되는 변이에 한정되지 않고, 「W302」가 K(Lys), R(Arg), H(His), A(Ala), V(Val), L(Leu), I(Ile), G(Gly), S(Ser), T(Thr), P(Pro), F(Phe), Y(Tyr), M(Met), D(Asp), E (Glu), N(Asn), 또는 Q(Gln)인 경우에 당해 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 치환되는 변이도 포함된다. 다른 변이에 대해서도 마찬가지이다.
임의의 PhoS 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 어느 아미노산 잔기가 「서열번호 4에서의 X 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기」인지는, 당해 임의의 PhoS 단백질의 아미노산 서열과 서열번호 4의 아미노산 서열과 얼라인먼트를 행함으로써 결정할 수 있다. 얼라인먼트는, 예를 들면, 공지된 유전자 해석 소프트웨어를 이용하여 행할 수 있다. 구체적인 소프트웨어로서는, 히타치 솔루션즈 제조의 테리파라타이드SIS나, 제네틱스 제조의 GENETYX 등을 들 수 있다(Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991; Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987).
변이형 phoS 유전자는, 예를 들면, 야생형 phoS 유전자를, 코드되는 PhoS 단백질이 상기한 「특정한 변이」를 갖도록 개변함으로써 취득할 수 있다. 개변의 바탕이 되는 야생형 phoS 유전자는, 예를 들면, 야생형 phoS 유전자를 갖는 생물로부터의 클로닝에 의해, 또는 화학 합성에 의해 취득할 수 있다. 또한, 변이형 phoS 유전자는 야생형 phoS 유전자를 통하지 않고 취득할 수도 있다. 예를 들면, 화학 합성에 의해 변이형 phoS 유전자를 직접 취득해도 좋다. 취득한 변이형 phoS 유전자는 또한 개변하여 이용해도 좋다.
유전자의 개변은 공지된 수법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 의해, 테리파라타이드의 목적의 부위에 목적의 변이를 도입할 수 있다. 부위 특이적 변이법으로서는, PCR를 사용하는 방법(Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press(1989); Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382(1987))이나, 파지(phage)를 사용하는 방법(Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367(1987))을 들 수 있다.
이하, 변이형 phoS 유전자를 갖도록 코리네형 세균을 개변하는 수법에 대하여 설명한다.
변이형 phoS 유전자를 갖도록 코리네형 세균을 개변하는 것은, 변이형 phoS 유전자를 코리네형 세균에 도입함으로써 달성할 수 있다. 또한, 변이형 phoS 유전자를 갖도록 코리네형 세균을 개변하는 것은, 코리네형 세균의 염색체상의 phoS 유전자에 상기한 「특정한 변이」를 도입함으로써도 달성할 수 있다. 염색체상의 유전자로의 변이 도입은 자연 변이, 변이원 처리, 또는 유전자 공학적 수법에 의해 달성할 수 있다.
변이형 phoS 유전자를 코리네형 세균에 도입하는 수법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 세균에 있어서, 변이형 phoS 유전자는, 코리네형 세균에서 기능하는 프로모터의 제어 하에서 발현 가능하게 유지되어 있으면 좋다. 프로모터는 숙주 유래의 프로모터라도 좋고, 이종 유래의 프로모터라도 좋다. 프로모터는 phoS 유전자의 고유한 프로모터라도 좋고, 다른 유전자의 프로모터라도 좋다. 본 발명의 세균에 있어서, 변이형 phoS 유전자는, 플라스미드와 같이 염색체 외에서 자율 증식하는 벡터 위에 존재하고 있어도 좋고, 염색체 위에 포함되어 있어도 좋다. 본 발명의 세균은, 변이형 phoS 유전자를 1카피만 갖고 있어도 좋고, 2 또는 그 이상의 카피를 갖고 있어도 좋다. 본 발명의 세균은 1종류의 변이형 phoS 유전자만을 갖고 있어도 좋고, 2 또는 그 이상의 종류의 변이형 phoS 유전자를 갖고 있어도 좋다. 변이형 phoS 유전자의 도입은, 예를 들면, 후술하는, 유전자의 발현을 상승시키는 수법에서의 유전자의 도입이나, 본 발명에 사용되는 유전자 구축물의 도입과 마찬가지로 행할 수 있다.
본 발명의 세균은 야생형 phoS 유전자를 갖고 있어도 좋고, 갖고 있지 않아도 좋지만, 갖고 있지 않은 것이 바람직하다.
야생형 phoS 유전자를 갖지 않은 코리네형 세균은, 염색체상의 야생형 phoS 유전자를 파괴함으로써 취득할 수 있다. 야생형 phoS 유전자의 파괴는 공지된 수법에 의해 행할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 야생형 phoS 유전자의 프로모터 영역 및/또는 코드 영역의 일부 또는 전부를 결손시킴으로써 야생형 phoS 유전자를 파괴할 수 있다.
또한, 염색체상의 야생형 phoS 유전자를 변이형 phoS 유전자로 치환함으로써, 야생형 phoS 유전자를 갖지 않고, 또한, 변이형 phoS 유전자를 갖도록 개변된 코리네형 세균을 취득할 수 있다. 이러한 유전자 치환을 행하는 방법으로서는, 예를 들면, 「Red 구동된 통합(Red-driven integration)」이라고 불리는 방법(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97: 6640-6645(2000)), Red 구동된 통합법과 λ파지 유래의 절제 시스템(Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203(2002))을 조합한 방법(WO2005/010175호 참조) 등의 직쇄상 테리파라타이드를 사용하는 방법이나, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드를 사용하는 방법, 접합 전달 가능한 플라스미드를 사용하는 방법, 숙주 내에서 기능하는 복제 기점을 갖지 않는 수이사이드(suicide) 벡터를 사용하는 방법 등을 들 수 있다(미국특허 제6303383호, 일본 공개특허공보 특개평05-007491호).
PhoS 단백질은 반응 조절인자인 PhoR 단백질과 공액하여 기능하는, 즉 환경 중의 인산 결핍에 대한 응답을 야기한다. 따라서, 본 발명의 세균은, 변이형 PhoS 단백질이 기능하도록 phoR 유전자를 갖는다. phoR 유전자는, PhoRS 시스템의 반응 조절인자인 PhoR 단백질을 코드하는 유전자이다. 「phoR 유전자를 갖는다」는 것을, 「PhoR 단백질을 갖는다」라고도 한다. 통상, 본 발명의 세균이 본래적으로 갖는 PhoR 단백질이 변이형 PhoS 단백질과 공액하여 기능하면 충분한다. 한편, 본 발명의 세균에는, 본 발명의 세균이 본래적으로 갖는 phoR 유전자에 더하여, 또는 대신하여, 적당한 phoR 유전자가 도입되어 있어도 좋다. 도입되는 phoR 유전자는, 변이형 PhoS 단백질과 공액하여 기능하는 PhoR 단백질을 코드하는 것이면 특별히 제한되지 않는다.
phoR 유전자로서는, 예를 들면, 코리네형 세균의 phoR 유전자를 들 수 있다. 코리네형 세균의 phoR 유전자로서, 구체적으로는, 예를 들면, 씨. 글루타미쿰 YDK010주, 씨. 글루타미쿰 ATCC13032주, 씨. 글루타미쿰 ATCC14067주, C. callunae, C. crenatum, 및 C. efficiens의 phoR 유전자를 들 수 있다. 씨. 글루타미쿰 ATCC13032주의 phoR 유전자의 염기서열 및 PhoR 단백질의 아미노산 서열을, 각각, 서열번호 31 및 32에 나타낸다.
phoR 유전자는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 phoR 유전자의 변이체라도 좋다. 마찬가지로, PhoR 단백질은 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 PhoR 단백질의 변이체라도 좋다. 즉, 「phoR 유전자」라는 용어에는 상기 예시한 phoR 유전자에 더하여, 그 보존적 변이체가 포함되는 것으로 한다. 마찬가지로, 「PhoR 단백질」이라는 용어에는 상기 예시한 PhoR 단백질에 더하여, 그 보존적 변이체가 포함되는 것으로 한다. PhoR 단백질 및 phoR 유전자의 변이체에 대해서는, 상기한 HrrSA 단백질 및 hrrSA 유전자의 보존적 변이체에 관한 기재를 준용할 수 있다. 예를 들면, phoR 유전자는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 위치에서의 1 또는 여러 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 유전자라도 좋다. 또한, 「원래의 기능이 유지되고 있다」란, PhoR 단백질에 있어서는, 단백질의 변이체가, PhoR 단백질로서의 기능(예를 들면, 서열번호 32에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 기능)을 갖는 것이라도 좋다. 또한, 「원래의 기능이 유지되고 있다」란, PhoR 단백질에 있어서는, 단백질의 변이체가, PhoRS 시스템의 반응 조절인자로서의 기능을 갖는 것이라도 좋다. 즉, 「PhoR 단백질로서의 기능」이란, 구체적으로는, PhoRS 시스템의 반응 조절인자로서의 기능이라도 좋다. 「PhoRS 시스템의 반응 조절인자로서의 기능」이란, 구체적으로는, 센서 키나아제인 PhoS 단백질과 공액하여 환경 중의 인산 결핍에 대한 응답을 야기하는 기능이라도 좋다. 「PhoRS 시스템의 반응 조절인자로서의 기능」이란, 더 구체적으로는, 환경 중의 인산 결핍을 감지하여 자기 인산화된 PhoS 단백질에서의 인산기 전이에 의해 활성화되고, 환경 중의 인산 결핍에 응답하는 유전자의 발현을 제어하는 기능이라도 좋다.
PhoR 단백질의 변이체가 PhoRS 시스템의 반응 조절인자로서의 기능을 갖는지 여부는, 예를 들면, 이 변이체를 코드하는 유전자를 코리네형 세균의 phoR 유전자의 결손주에 도입하고, 인산 결핍에 대한 응답성이 상보되는지 여부를 확인함으로써 확인할 수 있다. 인산 결핍에 대한 응답성의 상보는, 예를 들면, 인산 결핍 조건에서의 생육의 향상으로서, 또는 인산 결핍 조건에서 발현이 유도되는 것으로 알려져 있는 유전자의 발현의 유도로서 검출할 수 있다(J. Bacteriol., 188, 724-732(2006)). 코리네형 세균의 phoR 유전자의 결손주로서는, 예를 들면, 씨. 글루타미쿰 YDK010주의 phoR 유전자 결손주나, 씨. 글루타미쿰 ATCC13032주의 phoR 유전자 결손주를 사용할 수 있다.
<1-3-2> 세포 표층 단백질의 활성 저하
본 발명의 세균은 세포 표층 단백질의 활성이 저하되고 있는 것이라도 좋다. 본 발명의 세균은, 구체적으로는, 세포 표층 단백질의 활성이 비개변주와 비교하여 저하되고 있는 것이라도 좋다. 「세포 표층 단백질의 활성이 저하된다」란, 특히, 세포 표층 단백질의 세포당 분자수가 저하되는 것을 의미해도 좋다. 이하에, 세포 표층 단백질 및 이를 코드하는 유전자에 대하여 설명한다.
세포 표층 단백질은, 세균이나 고세균의 세포 표층(S층)을 구성하는 단백질이다. 코리네형 세균의 세포 표층 단백질로서는, 씨. 글루타미쿰의 PS1 및 PS2(CspB)(일본 공개특허공보 특표평6-502548), 및 C. stationis의 SlpA(CspA)(일본 공개특허공보 특개평10-108675)를 들 수 있다. 이들 중에서는, PS2 단백질의 활성을 저하시키는 것이 바람직하다.
씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 cspB 유전자의 염기서열 및 이 유전자가 코드하는 PS2 단백질(CspB 단백질)의 아미노산 서열을 각각 서열번호 33 및 34에 나타낸다.
또한, 예를 들면, 28주의 씨. 글루타미쿰에 대하여, CspB 동족체의 아미노산 서열이 보고되어 있다(J Biotechnol., 112, 177-193(2004)). 이들 28주의 씨. 글루타미쿰과 cspB 유전자 동족체의 NCBI 데이터 베이스의 GenBank accession 넘버를 이하에 예시한다(괄호 안이 GenBank accession 넘버를 나타냄).
씨. 글루타미쿰 ATCC13058(AY524990)
씨. 글루타미쿰 ATCC13744(AY524991)
씨. 글루타미쿰 ATCC13745(AY524992)
씨. 글루타미쿰 ATCC14017(AY524993)
씨. 글루타미쿰 ATCC14020(AY525009)
씨. 글루타미쿰 ATCC14067(AY524994)
씨. 글루타미쿰 ATCC14068(AY525010)
씨. 글루타미쿰 ATCC14747(AY525011)
씨. 글루타미쿰 ATCC14751(AY524995)
씨. 글루타미쿰 ATCC14752(AY524996)
씨. 글루타미쿰 ATCC14915(AY524997)
씨. 글루타미쿰 ATCC15243(AY524998)
씨. 글루타미쿰 ATCC15354(AY524999)
씨. 글루타미쿰 ATCC17965(AY525000)
씨. 글루타미쿰 ATCC17966(AY525001)
씨. 글루타미쿰 ATCC19223(AY525002)
씨. 글루타미쿰 ATCC19240(AY525012)
씨. 글루타미쿰 ATCC21341(AY525003)
씨. 글루타미쿰 ATCC21645(AY525004)
씨. 글루타미쿰 ATCC31808(AY525013)
씨. 글루타미쿰 ATCC31830(AY525007)
씨. 글루타미쿰 ATCC31832(AY525008)
씨. 글루타미쿰 LP-6(AY525014)
씨. 글루타미쿰 DSM20137(AY525015)
씨. 글루타미쿰 DSM20598(AY525016)
씨. 글루타미쿰 DSM46307(AY525017)
씨. 글루타미쿰 22220(AY525005)
씨. 글루타미쿰 22243(AY525006)
코리네형 세균이 속하는 종 또는 균주에 의해, 세포 표층 단백질을 코드하는 유전자의 염기서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 세포 표층 단백질을 코드하는 유전자는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 세포 표층 단백질을 코드하는 유전자의 변이체라도 좋다. 마찬가지로, 세포 표층 단백질은 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 세포 표층 단백질의 변이체라도 좋다. 즉, 예를 들면, 「cspB 유전자」라는 용어에는 상기 예시한 cspB 유전자에 더하여, 그 보존적 변이체가 포함되는 것으로 한다. 마찬가지로, 「CspB 단백질」이라는 용어에는 상기 예시한 CspB 단백질에 더하여, 그 보존적 변이체가 포함되는 것으로 한다. 세포 표층 단백질 및 이를 코드하는 유전자의 변이체에 대해서는, 상기한 HrrSA 단백질 및 hrrSA 유전자의 보존적 변이체에 관한 기재를 준용할 수 있다. 예를 들면, 세포 표층 단백질을 코드하는 유전자는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 위치에서의 1 또는 여러 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 유전자라도 좋다. 또한, 「원래의 기능이 유지되고 있다」란, 세포 표층 단백질에 있어서는, 예를 들면, 코리네형 세균에서 활성을 저하시켰을 때에 이종 단백질의 분비 생산량을 비개변주와 비교하여 상승시키는 성질을 갖는 것이라도 좋다.
「코리네형 세균에서 활성을 저하시켰을 때에 이종 단백질의 분비 생산량을 비개변주와 비교하여 상승시키는 성질」이란, 코리네형 세균에서 활성을 저하시켰을 때에 비개변주보다도 많은 양의 이종 단백질을 분비 생산하는 능력을 코리네형 세균에 부여하는 성질을 말한다. 「비개변주」란, 세포 표층 단백질의 활성이 저하되고 있지 않은 대조주를 말하고, 예를 들면, 야생주 또는 친주라도 좋다. 「비개변주보다도 많은 양의 이종 단백질을 분비 생산한다」란, 이종 단백질의 분비 생산량이 비개변주와 비교하여 증대하는 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 배지 중 및/또는 균체 표층에서의 축적량으로서, 비개변주의, 바람직하게는 1.1배 이상, 보다 바람직하게는 1.2배 이상, 더 바람직하게는 1.3배 이상, 특히 바람직하게는 2배 이상의 양의 이종 단백질을 분비 생산하는 것이라도 좋다. 또한, 「비개변주보다도 많은 양의 이종 단백질을 분비 생산한다」란, 농축되어 있지 않은 비개변주의 배양 상청을 SDS-PAGE에 제공하여 CBB로 염색했을 때에는 이종 단백질을 검출할 수 없지만, 농축되어 있지 않은 개변주의 배양 상청을 SDS-PAGE에 제공하여 CBB로 염색했을 때에는 이종 단백질을 검출할 수 있는 것이라도 좋다.
어떤 단백질이 코리네형 세균에서 활성을 저하시켰을 때에 이종 단백질의 분비 생산량을 비개변주와 비교하여 상승시키는 성질을 갖는지 여부는, 코리네형 세균에 속하는 균주를 기초로 그 단백질의 활성이 저하되도록 개변된 주를 제작하고, 당해 개변주를 배지에서 배양했을 때에 분비 생산되는 이종 단백질의 양을 정량하여, 개변 전의 주(비개변주)를 배지에서 배양했을 때에 분비 생산되는 이종 단백질의 양과 비교함으로써 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「세포 표층 단백질의 활성이 저하되고 있다」는 것에는, 세포 표층 단백질의 활성이 저하되도록 코리네형 세균이 개변된 경우, 및, 코리네형 세균에 있어서 원래 세포 표층 단백질의 활성이 저하되고 있는 경우가 포함된다. 「코리네형 세균에 있어서 원래 세포 표층 단백질의 활성이 저하되고 있는 경우」에는, 코리네형 세균이 원래 세포 표층 단백질을 갖지 않는 경우가 포함된다. 즉, 세포 표층 단백질의 활성이 저하되고 있는 코리네형 세균으로서는, 예를 들면, 원래 세포 표층 단백질을 갖지 않은 코리네형 세균을 들 수 있다. 「코리네형 세균이 원래 세포 표층 단백질을 갖지 않는 경우」로서는, 예를 들면, 코리네형 세균이 원래 세포 표층 단백질을 코드하는 유전자를 갖지 않는 경우를 들 수 있다. 또한, 「코리네형 세균이 원래 세포 표층 단백질을 갖지 않는다」란, 코리네형 세균이, 당해 코리네형 세균이 속하는 종의 다른 주에 발견되는 세포 표층 단백질로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 단백질을 원래 갖지 않는 것이라도 좋다. 예를 들면, 「씨. 글루타미쿰이 원래 세포 표층 단백질을 갖지 않는다」란, 씨. 글루타미쿰주가, 다른 씨. 글루타미쿰주에 발견되는 세포 표층 단백질로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 단백질, 즉, 예를 들면 PS1 및/또는 PS2(CspB)를 원래 갖지 않는 것이라도 좋다. 원래 세포 표층 단백질을 갖지 않은 코리네형 세균으로서는, 예를 들면, 원래 cspB 유전자를 갖지 않는 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032를 들 수 있다.
<1-3-3> 단백질의 분비계
본 발명의 세균은 단백질의 분비계를 갖는다. 단백질의 분비계는 목적의 이종 단백질을 분비할 수 있는 것이면, 특별히 제한되지 않는다. 단백질의 분비계로서는, Sec계(Sec계 분비 장치)나 Tat계(Tat계 분비 장치)를 들 수 있다. 본 발명의 세균은 단백질의 분비계가 증강되어 있어도 좋다. 예를 들면, 본 발명의 세균은, Tat계 분비 장치를 코드하는 유전자로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 유전자의 발현이 상승하도록 개변되어 있어도 좋다. 본 발명에 있어서, 이러한 개변을 「Tat계 분비 장치의 증강」이라고도 한다. Tat계 분비 장치의 증강은, 특히, Tat계 의존 시그널 펩타이드를 이용하여 이종 단백질을 분비 생산할 경우에 적합하다. Tat계 분비 장치를 코드하는 유전자의 발현을 상승시키는 수법에 대해서는 특허 제4730302호에 기재되어 있다.
Tat계 분비 장치를 코드하는 유전자로서는, tatA 유전자, tatB 유전자, tatC 유전자, 및 tatE 유전자를 들 수 있다.
Tat계 분비 장치를 코드하는 유전자로서, 구체적으로는, 씨. 글루타미쿰의 tatA 유전자, tatB 유전자, 및 tatC 유전자를 들 수 있다. 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 tatA 유전자, tatB 유전자, 및 tatC 유전자는, 각각, NCBI 데이터 베이스에 GenBank accession NC_003450(VERSION NC_003450.3 GI:58036263)으로서 등록되어 있는 게놈 서열 중, 1571065 내지 1571382 위치의 서열의 상보 서열, 1167110 내지 1167580 위치의 서열, 및 1569929 내지 1570873 위치의 서열의 상보 서열에 상당한다. 또한, 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 TatA 단백질, TatB 단백질, 및 TatC 단백질은, 각각, GenBank accession NP_600707(version NP_600707.1 GI:19552705, locus_tag=”NCgl1434”), GenBank accession NP_600350(version NP_600350.1 GI:19552348, locus_tag=”NCgl1077”), 및 GenBank accession NP_600706(version NP_600706.1 GI:19552704, locus_tag=”NCgl1433”)으로서 등록되어 있다. 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 tatA 유전자, tatB 유전자, 및 tatC 유전자의 염기서열 및 TatA 단백질, TatB 단백질, 및 TatC 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 35 내지 40에 나타낸다.
또한, Tat계 분비 장치를 코드하는 유전자로서, 구체적으로는, E. coli의 tatA 유전자, tatB 유전자, tatC 유전자, 및 tatE 유전자를 들 수 있다. E.coli K-12 MG1655의 tatA 유전자, tatB 유전자, tatC 유전자, 및 tatE 유전자는, 각각, NCBI 데이터 베이스에 GenBank accession NC_000913(VERSION NC_000913.2gI:49175990)으로서 등록되어 있는 게놈 서열 중, 4019968 내지 4020237 위치의 서열, 4020241 내지 4020756 위치의 서열, 4020759 내지 4021535 위치의 서열, 658170 내지 658373 위치의 서열에 상당한다. 또한, E.coli K-12 MG1655의 TatA 단백질, TatB 단백질, TatC 단백질, 및 TatE 단백질은, 각각, GenBank accession NP_418280(version NP_418280.4 GI:90111653, locus_tag=”b3836”), GenBank accession YP_026270(version YP_026270.1 GI:49176428, locus_tag=”b3838”), GenBank accession NP_418282(versionNP_418282.1 GI:16131687, locus_tag=”b3839”), 및 GenBank accession NP_415160(versionNP_415160.1 GI:16128610, locus_tag=”b0627”)으로서 등록되어 있다.
Tat계 분비 장치를 코드하는 유전자는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 Tat계 분비 장치를 코드하는 유전자의 변이체라도 좋다. 마찬가지로, Tat계 분비 장치는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 Tat계 분비 장치의 변이체라도 좋다. 즉, 예를 들면, 「tatA 유전자」, 「tatB 유전자」, 「tatC 유전자」, 및 「tatE 유전자」라는 용어에는, 각각, 상기 예시한 tatA 유전자, tatB 유전자, tatC 유전자, 및 tatE 유전자에 더하여, 그 보존적 변이체가 포함되는 것으로 한다. 마찬가지로, 「TatA 단백질」, 「TatB 단백질」, 「TatC 단백질」, 및 「TatE 단백질」이라는 용어에는, 각각, 상기 예시한 TatA 단백질, TatB 단백질, TatC 단백질, 및 TatE 단백질에 더하여, 그 보존적 변이체가 포함되는 것으로 한다. Tat계 분비 장치 및 이를 코드하는 유전자의 변이체에 대해서는, 상기한 HrrSA 단백질 및 hrrSA 유전자의 보존적 변이체에 관한 기재를 준용할 수 있다. 예를 들면, Tat계 분비 장치를 코드하는 유전자는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 위치에서의 1 또는 여러 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 유전자라도 좋다. 또한, 「원래의 기능이 유지되고 있다」란, Tat계 분비 장치에 있어서는, Tat계 의존 시그널 펩타이드가 N 말단에 부가된 단백질을 세포 외로 분비하는 기능을 갖는 것이라도 좋다.
<1-4> 단백질의 활성을 저하시키는 수법
이하에, HrrSA 단백질 등의 단백질의 활성을 저하시키는 수법에 대하여 설명한다. 또한, 이하에 기재하는 단백질의 활성을 저하시키는 수법은, 야생형 PhoS 단백질의 파괴에도 이용할 수 있다.
「단백질의 활성이 저하된다」란, 이 단백질의 활성이 비개변주와 비교하여 저하되는 것을 의미한다. 「단백질의 활성이 저하된다」란, 구체적으로는, 이 단백질의 세포당 활성이 비개변주와 비교하여 저하되는 것을 의미한다. 여기서 말하는 「비개변주」란, 표적의 단백질의 활성이 저하되도록 개변되어 있지 않은 대조주를 의미한다. 비개변주로서는 야생주나 친주를 들 수 있다. 비개변주로서, 구체적으로는, 각 세균종의 기준주(type strain)를 들 수 있다. 또한, 비개변주로서, 구체적으로는, 코리네형 세균의 설명에서 예시한 균주도 들 수 있다. 즉, 일 형태에 있어서, 단백질의 활성은 기준주(즉 본 발명의 세균이 속하는 종의 기준주)와 비교하여 저하되어도 좋다. 또한, 다른 형태에 있어서, 단백질의 활성은 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032와 비교하여 저하되어도 좋다. 또한, 다른 형태에 있어서, 단백질의 활성은 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869와 비교하여 저하되어도 좋다. 또한, 다른 형태에 있어서, 단백질의 활성은 씨. 글루타미쿰 AJ12036(FERM BP-734)과 비교하여 저하되어도 좋다. 또한, 다른 형태에 있어서, 단백질의 활성은 씨. 글루타미쿰 YDK010주와 비교하여 저하되어도 좋다. 또한, 「단백질의 활성이 저하된다」는 것에는, 이 단백질의 활성이 완전하게 소실되어 있는 경우도 포함된다. 「단백질의 활성이 저하된다」란, 더 구체적으로는, 비개변주와 비교하여, 이 단백질의 세포당 분자수가 저하되고 있는 것, 및/또는, 이 단백질의 분자당 기능이 저하되고 있는 것을 의미해도 좋다. 즉, 「단백질의 활성이 저하된다」고 하는 경우의 「활성」이란, 단백질의 촉매 활성에 한정되지 않고, 단백질을 코드하는 유전자의 전사량(mRNA량) 또는 번역량(단백질의 양)을 의미해도 좋다. 또한, 「단백질의 세포당 분자수가 저하되고 있다」는 것에는, 이 단백질이 전혀 존재하고 있지 않은 경우도 포함된다. 또한, 「단백질의 분자당 기능이 저하되고 있다」는 것에는, 이 단백질의 분자당 기능이 완전하게 소실되어 있는 경우도 포함된다. 단백질의 활성의 저하의 정도는, 단백질의 활성이 비개변주와 비교하여 저하되고 있으면 특별히 제한되지 않는다. 단백질의 활성은, 예를 들면, 비개변주의, 50% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 0%로 저하되어도 좋다.
단백질의 활성이 저하되는 개변은, 예를 들면, 이 단백질을 코드하는 유전자의 발현을 저하시킴으로써 달성할 수 있다. 「유전자의 발현이 저하된다」란, 이 유전자의 발현이 비개변주와 비교하여 저하되는 것을 의미한다. 「유전자의 발현이 저하된다」란, 구체적으로는, 이 유전자의 세포당 발현량이 비개변주와 비교하여 저하되는 것을 의미한다. 「유전자의 발현이 저하된다」란, 더 구체적으로는, 유전자의 전사량(mRNA량)이 저하되는 것, 및/또는, 유전자의 번역량(단백질의 양)이 저하되는 것을 의미해도 좋다. 「유전자의 발현이 저하된다」는 것에는, 이 유전자가 전혀 발현되고 있지 않은 경우도 포함된다. 또한, 「유전자의 발현이 저하된다」는 것을, 「유전자의 발현이 약화된다」고도 한다. 유전자의 발현은, 예를 들면, 비개변주의, 50% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 0%로 저하되어도 좋다.
유전자의 발현의 저하는, 예를 들면, 전사 효율의 저하에 의한 것이라도 좋고, 번역 효율의 저하에 의한 것이라도 좋고, 이들의 조합에 의한 것이라도 좋다. 유전자의 발현의 저하는, 예를 들면, 유전자의 프로모터, 샤인달가노(SD) 서열(리보솜 결합 부위(RBS)라고도 함), RBS와 개시 코돈 사이의 스페이서 영역 등의 발현 조절 서열을 개변함으로써 달성할 수 있다. 발현 조절 서열을 개변할 경우에는, 발현 조절 서열은, 바람직하게는 1염기 이상, 보다 바람직하게는 2염기 이상, 특히 바람직하게는 3염기 이상이 개변된다. 유전자의 전사 효율의 저하는, 예를 들면, 염색체상의 유전자의 프로모터를 보다 약한 프로모터로 치환함으로써 달성할 수 있다. 「보다 약한 프로모터」란, 유전자의 전사가, 원래 존재하고 있는 야생형의 프로모터보다도 약화되는 프로모터를 의미한다. 보다 약한 프로모터로서는, 예를 들면, 유도형의 프로모터를 들 수 있다. 즉, 유도형의 프로모터는, 비유도 조건 하(예를 들면, 유도 물질의 비존재 하)에서 보다 약한 프로모터로서 기능할 수 있다. 또한, 발현 조절 서열의 일부 또는 전부의 영역을 결실(결손)시켜도 좋다. 또한, 유전자의 발현의 저하는, 예를 들면, 발현 제어에 관한 인자를 조작함으로써도 달성할 수 있다. 발현 제어에 관한 인자로서는, 전사나 번역 제어에 관한 저분자(유도 물질, 저해 물질 등), 단백질(전사 인자 등), 핵산(siRNA 등) 등을 들 수 있다. 또한, 유전자의 발현의 저하는, 예를 들면, 유전자의 코드 영역에 유전자의 발현이 저하되는 변이를 도입함으로써도 달성할 수 있다. 예를 들면, 유전자의 코드 영역의 코돈을, 숙주에서 보다 저빈도로 이용되는 동의(同義) 코돈으로 치환함으로써, 유전자의 발현을 저하시킬 수 있다. 또한, 예를 들면, 후술하는 바와 같은 유전자의 파괴에 의해 유전자의 발현 자체가 저하될 수 있다.
또한, 단백질의 활성이 저하되는 개변은, 예를 들면, 이 단백질을 코드하는 유전자를 파괴함으로써 달성할 수 있다. 「유전자가 파괴된다」란, 정상적으로 기능하는 단백질을 생산하지 않도록 이 유전자가 개변되는 것을 의미한다. 「정상적으로 기능하는 단백질을 생산하지 않는다」는 것에는, 이 유전자로부터 단백질이 전혀 생산되지 않는 경우나, 이 유전자로부터 분자당 기능(활성이나 성질)이 저하 또는 소실된 단백질이 생산되는 경우가 포함된다.
유전자의 파괴는, 예를 들면, 염색체상의 유전자를 결실(결손)시킴으로써 달성할 수 있다. 「유전자의 결실」이란, 유전자의 코드 영역의 일부 또는 전부의 영역의 결실을 말한다. 또한, 염색체상의 유전자의 코드 영역의 전후의 서열을 포함하여, 유전자 전체를 결실시켜도 좋다. 유전자의 코드 영역의 전후의 서열에는, 예를 들면, 유전자의 발현 조절 서열이 포함되어도 좋다. 단백질의 활성의 저하가 달성 가능한 한, 결실시키는 영역은 N 말단 영역(단백질의 N 말단측을 코드하는 영역), 내부 영역, C 말단 영역(단백질의 C 말단측을 코드하는 영역) 등 중 어느 영역이라도 좋다. 통상, 결실시키는 영역은 긴 것이 확실하게 유전자를 불활화할 수 있다. 결실시키는 영역은, 예를 들면, 유전자의 코드 영역 전체 길이의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 길이 영역이라도 좋다. 또한, 결실시키는 영역의 전후의 서열은 리딩 프레임이 일치하지 않는 것이 바람직하다. 리딩 프레임의 불일치에 의해, 결실시키는 영역의 하류에서 프레임 시프트가 발생할 수 있다.
또한, 유전자의 파괴는, 예를 들면, 염색체상의 유전자의 코드 영역에 아미노산 치환(미스센스 변이)을 도입하는 것, 종지 코돈(넌센스 변이)을 도입하는 것, 또는 1 내지 2염기의 부가 또는 결실(프레임 시프트 변이)을 도입하는 것 등에 의해서도 달성할 수 있다(Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 955511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26116, 20833-20839(1991)).
또한, 유전자의 파괴는, 예를 들면, 염색체상의 유전자의 코드 영역에 다른 염기서열을 삽입함으로써도 달성할 수 있다. 삽입 부위는 유전자 중 어느 영역이라도 좋지만, 삽입하는 염기서열은 긴 것이 확실하게 유전자를 불활화할 수 있다. 또한, 삽입 부위의 전후의 서열은 리딩 프레임이 일치하지 않는 것이 바람직하다. 리딩 프레임의 불일치에 의해, 삽입 부위의 하류에서 프레임 시프트가 발생할 수 있다. 다른 염기서열로서는, 코드되는 단백질의 활성을 저하 또는 소실시키는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 항생 물질 내성 유전자 등의 마커 유전자나 목적 물질의 생산에 유용한 유전자를 들 수 있다.
유전자의 파괴는, 특히, 코드되는 단백질의 아미노산 서열이 결실(결손)되도록 실시해도 좋다. 바꿔 말하면, 단백질의 활성이 저하되는 개변은, 예를 들면, 단백질의 아미노산 서열(아미노산 서열의 일부 또는 전부의 영역)을 결실시킴으로써, 구체적으로는, 아미노산 서열(아미노산 서열의 일부 또는 전부의 영역)이 결실된 단백질을 코드하도록 유전자를 개변함으로써 달성할 수 있다. 또한, 「단백질의 아미노산 서열의 결실」이란, 단백질의 아미노산 서열의 일부 또는 전부의 영역의 결실을 말한다. 또한, 「단백질의 아미노산 서열의 결실」이란, 단백질에 있어서 원래의 아미노산 서열이 존재하지 않게 되는 것을 말하고, 원래의 아미노산 서열이 다른 아미노산 서열로 변화하는 경우도 포함된다. 즉, 예를 들면, 프레임 시프트에 의해 다른 아미노산 서열로 변화한 영역은 결실된 영역으로 간주해도 좋다. 아미노산 서열의 결실에 의해, 전형적으로는 단백질의 전체 길이가 단축되지만, 단백질의 전체 길이가 변화하지 않거나, 또는 연장되는 경우도 있을 수 있다. 예를 들면, 유전자의 코드 영역의 일부 또는 전부의 영역의 결실에 의해, 코드되는 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 당해 결실된 영역이 코드하는 영역을 결실시킬 수 있다. 또한, 예를 들면, 유전자의 코드 영역에의 종지 코돈의 도입에 의해, 코드되는 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 당해 도입 부위보다 하류의 영역이 코드하는 영역을 결실시킬 수 있다. 또한, 예를 들면, 유전자의 코드 영역에서의 프레임 시프트에 의해, 당해 프레임 시프트 부위가 코드하는 영역을 결실시킬 수 있다. 아미노산 서열의 결실에서의 결실시키는 영역의 위치 및 길이에 대해서는, 유전자의 결실에서의 결실시키는 영역의 위치 및 길이의 설명을 준용할 수 있다.
염색체상의 유전자를 상기한 바와 같이 개변하는 것은, 예를 들면, 정상적으로 기능하는 단백질을 생산하지 않도록 개변한 파괴형 유전자를 제작하고, 당해 파괴형 유전자를 포함하는 재조합 테리파라타이드로 숙주를 형질 전환하여, 파괴형 유전자와 염색체상의 야생형 유전자로 상동 재조합을 일으키게 함으로써, 염색체상의 야생형 유전자를 파괴형 유전자로 치환하여 달성할 수 있다. 이때, 재조합 DNA에는 숙주의 영양 요구성 등의 형질에 따라, 마커 유전자를 포함시켜 두면 조작하기 쉽다. 파괴형 유전자로서는, 유전자의 코드 영역의 일부 또는 전부의 영역을 결실한 유전자, 미스센스 변이를 도입한 유전자, 넌센스 변이를 도입한 유전자, 프레임 시프트 변이를 도입한 유전자, 트랜스포존이나 마커 유전자 등의 삽입 서열을 삽입한 유전자를 들 수 있다. 상동 재조합에 사용하는 재조합 DNA의 구조는, 원하는 형태로 상동 재조합이 일어나는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 파괴형 유전자를 포함하는 선상 DNA로서, 양단에 염색체상의 야생형 유전자의 상류 및 하류의 서열을 각각 구비한 선상 DNA로 숙주를 형질 전환하여, 야생형 유전자의 상류 및 하류에서 각각 상동 재조합을 일으키게 함으로써, 1 스텝에서 야생형 유전자를 파괴형 유전자로 치환할 수 있다. 파괴형 유전자에 의해 코드되는 단백질은 생성했다 하더라도 야생형 단백질과는 다른 입체 구조를 갖고, 기능이 저하 또는 소실된다. 이러한 상동 재조합을 이용한 유전자 치환에 의한 유전자 파괴는 이미 확립되어 있고, 「Red 구동된 통합(Red-driven integration)」이라고 불리는 방법(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97: 6640-6645(2000)), Red 구동된 통합법과 λ파지 유래의 절제 시스템(Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203(2002))을 조합한 방법(WO2005/010175호 참조) 등의 직쇄상 DNA를 사용하는 방법이나, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드를 사용하는 방법, 접합 전달 가능한 플라스미드를 사용하는 방법, 숙주 내에서 기능하는 복제 기점을 갖지 않는 수이사이드 벡터를 사용하는 방법 등이 있다(미국특허 제6303383호, 일본 공개특허공보 특개평05-007491호).
또한, 단백질의 활성이 저하되는 개변은, 예를 들면, 돌연 변이 처리에 의해 행해도 좋다. 돌연 변이 처리로서는 X선의 조사, 자외선의 조사, 및 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), 메틸메탄설포네이트(EMS), 및 메틸메탄설포네이트(MMS) 등의 변이제에 의한 처리를 들 수 있다.
상기와 같은 단백질의 활성을 저하시키는 수법은 단독으로 사용해도 좋고, 임의의 조합으로 사용해도 좋다.
단백질의 활성이 저하된 것은, 이 단백질의 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다.
단백질의 활성이 저하된 것은, 이 단백질을 코드하는 유전자의 발현이 저하된 것을 확인함으로써도 확인할 수 있다. 유전자의 발현이 저하된 것은, 이 유전자의 전사량이 저하된 것을 확인하는 것이나, 이 유전자에서 발현되는 단백질의 양이 저하된 것을 확인함으로써 확인할 수 있다.
유전자의 전사량이 저하된 것의 확인은, 이 유전자에서 전사되는 mRNA의 양을 비개변주와 비교함으로써 행할 수 있다. mRNA의 양을 평가하는 방법으로서는, 노던 하이브리다이제이션, RT-PCR 등을 들 수 있다(Molecular cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(USA), 2001)). mRNA의 양은, 예를 들면, 비개변주의, 50% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 0%로 저하되어도 좋다.
단백질의 양이 저하된 것의 확인은, SDS-PAGE를 행하여 분리된 단백질 밴드의 강도를 확인함으로써 행할 수 있다. 또한, 단백질의 양이 저하된 것의 확인은, 항체를 사용하여 웨스턴 블로트에 의해 행할 수 있다(Molecular cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(USA), 2001)). 단백질의 양(예를 들면, 세포당의 분자수)은, 예를 들면, 비개변주의, 50% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 0%로 저하되어도 좋다.
유전자가 파괴된 것은, 파괴에 사용한 수단에 따라 이 유전자의 일부 또는 전부의 염기서열, 제한 효소 지도, 또는 전체 길이 등을 결정함으로써 확인할 수 있다.
<1-5> 유전자의 발현을 상승시키는 수법
이하에, Tat계 분비 장치를 코드하는 유전자 등의 유전자의 발현을 상승시키는 수법에 대하여 설명한다.
「유전자의 발현이 상승한다」란, 이 유전자의 발현이 비개변주와 비교하여 상승하고 있는 것을 의미한다. 「유전자의 발현이 상승한다」란, 구체적으로는, 이 유전자의 세포당 발현량이 비개변주와 비교하여 상승하고 있는 것을 의미한다. 여기서 말하는 「비개변주」란, 표적의 유전자의 발현이 상승하도록 개변되어 있지 않은 대조주를 의미한다. 비개변주로서는 야생주나 친주를 들 수 있다. 비개변주로서, 구체적으로는, 각 세균종의 기준주(type strain)를 들 수 있다. 또한, 비개변주로서, 구체적으로는, 코리네형 세균의 설명에서 예시한 균주도 들 수 있다. 즉, 일 형태에 있어서, 유전자의 발현은 기준주(즉 본 발명의 세균이 속하는 종의 기준주)와 비교하여 상승해도 좋다. 또한, 다른 형태에 있어서, 유전자의 발현은 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032와 비교하여 상승해도 좋다. 또한, 다른 형태에 있어서, 유전자의 발현은 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869와 비교하여 상승해도 좋다. 또한, 다른 형태에 있어서, 유전자의 발현은 씨. 글루타미쿰 AJ12036(FERM BP-734)과 비교하여 상승해도 좋다. 또한, 다른 형태에 있어서, 유전자의 발현은 씨. 글루타미쿰 YDK010주와 비교하여 상승해도 좋다. 「유전자의 발현이 상승한다」란, 더 구체적으로는, 유전자의 전사량(mRNA량)이 증대하는 것, 및/또는, 유전자의 번역량(단백질의 양)이 증대하는 것을 의미해도 좋다. 또한, 「유전자의 발현이 상승한다」는 것을, 「유전자의 발현이 증강된다」라고도 한다. 유전자의 발현의 상승의 정도는, 유전자의 발현이 비개변주와 비교하여 상승하고 있으면 특별히 제한되지 않는다. 유전자의 발현은, 비개변주의, 바람직하게는 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 2배 이상, 더 바람직하게는 3배 이상으로 상승해도 좋다. 또한, 「유전자의 발현이 상승한다」는 것에는, 원래 표적의 유전자가 발현되고 있는 균주에 있어서 이 유전자의 발현량을 상승시키는 것뿐만 아니라, 원래 표적의 유전자가 발현되고 있지 있은 균주에 있어서 이 유전자를 발현시키는 것도 포함된다. 즉, 「유전자의 발현이 상승한다」는 것에는, 예를 들면, 표적의 유전자를 유지하지 않은 균주에 이 유전자를 도입하고, 이 유전자를 발현시키는 것도 포함된다.
유전자의 발현의 상승은, 예를 들면, 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 달성할 수 있다.
유전자의 카피수의 증가는, 숙주의 염색체에 이 유전자를 도입함으로써 달성할 수 있다. 염색체로의 유전자의 도입은, 예를 들면, 상동 재조합을 이용하여 행할 수 있다(MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory). 상동 재조합을 이용하는 유전자 도입법으로서는, 예를 들면, Red 구동된 통합(Red-driven integration)법(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97: 6640-6645(2000)) 등의 직쇄상 DNA를 사용하는 방법, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드를 사용하는 방법, 접합 전달 가능한 플라스미드를 사용하는 방법, 숙주 내에서 기능하는 복제 기점을 갖지 않는 수이사이드 벡터를 사용하는 방법, 파지를 사용한 transduction법을 들 수 있다. 상동 재조합에 사용하는 재조합 DNA의 구조는, 원하는 형태로 상동 재조합이 일어나는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로는, 예를 들면, 표적 유전자를 포함하는 선상 DNA로서, 양단에 염색체상의 치환 대상 부위의 상류 및 하류의 서열을 각각 구비한 선상 DNA로 코리네형 세균을 형질 전환하여, 치환 대상 부위의 상류 및 하류에서 각각 상동 재조합을 일으키게 함으로써, 치환 대상 부위를 표적 유전자로 치환할 수 있다. 상동 재조합에 사용하는 재조합 DNA는, 형질 전환체를 선택하기 위한 마커 유전자를 구비하고 있어도 좋다. 유전자는 1카피만 도입되어도 좋고, 2카피 또는 그 이상 도입되어도 좋다. 예를 들면, 염색체 위에 다수의 카피가 존재하는 서열을 표적으로서 상동 재조합을 행함으로써 염색체에 유전자의 다수의 카피를 도입할 수 있다. 염색체 위에 다수의 카피가 존재하는 서열로서는, 반복 DNA 서열(repetitive DNA), 트랜스포존의 양단에 존재하는 인버티드·리피트를 들 수 있다. 또한, 목적 물질의 생산에 불필요한 유전자 등의 염색체상의 적당한 서열을 표적으로서 상동 재조합을 행해도 좋다. 또한, 유전자는, 트랜스포존이나 Mini-Mu를 사용하여 염색체 위에 랜덤으로 도입할 수도 있다(일본 공개특허공보 특개평2-109985호, US5,882,888, EP0805867B1). 트랜스포존으로서는, 인공 트랜스포존을 이용해도 좋다(일본 공개특허공보 특개평9-70291).
염색체 위에 표적 유전자가 도입된 것의 확인은, 이 유전자의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 갖는 프로브를 사용한 서던 하이브리다이제이션, 또는 이 유전자의 서열에 기초하여 작성한 프라이머를 사용한 PCR 등에 의해 확인할 수 있다.
또한, 유전자의 카피수의 증가는, 이 유전자를 포함하는 벡터를 숙주에 도입함으로써도 달성할 수 있다. 예를 들면, 표적 유전자를 포함하는 DNA 단편을, 숙주에서 기능하는 벡터와 연결하여 이 유전자의 발현 벡터를 구축하고, 당해 발현 벡터로 숙주를 형질 전환함으로써, 이 유전자의 카피수를 증가시킬 수 있다. 표적 유전자를 포함하는 DNA 단편은, 예를 들면, 표적 유전자를 갖는 미생물의 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR에 의해 취득할 수 있다. 벡터로서는, 숙주의 세포 내에서 자율 복제 가능한 벡터를 사용할 수 있다. 벡터는 멀티 카피 벡터인 것이 바람직하다. 또한, 형질 전환체를 선택하기 위해서, 벡터는 항생 물질 내성 유전자 등의 마커를 갖는 것이 바람직하다. 또한, 벡터는, 삽입된 유전자를 발현하기 위한 프로모터나 터미네이터를 구비하고 있어도 좋다. 벡터는, 예를 들면, 세균 플라스미드 유래의 벡터, 효모 플라스미드 유래의 벡터, 박테리오파지 유래의 벡터, 코스미드, 또는 파스미드 등이라도 좋다. 코리네형 세균에서 자율 복제 가능한 벡터로서, 구체적으로는, 예를 들면, pHM1519(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)); pAM330(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)); 이들을 개량한 약제 내성 유전자를 갖는 플라스미드; pCRY30(일본 공개특허공보 특개평3-210184); pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, 및 pCRY3KX(일본 공개특허공보 특개평2-72876, 미국특허 제5,185,262호); pCRY2 및 pCRY3(일본 공개특허공보 특개평 1-191686); pAJ655, pAJ611, 및 pAJ1844(일본 공개특허공보 특개소58-192900); pCG1(일본 공개특허공보 특개소57-134500); pCG2(일본 공개특허공보 특개소58-35197); pCG4 및 pCG11(일본 공개특허공보 특개소57-183799); pVK7(일본 공개특허공보 특개평10-215883); pVK9(US2006-0141588); pVC7(일본 공개특허공보 특개평9-070291); pVS7(WO2013/069634)을 들 수 있다.
유전자를 도입할 경우, 유전자는 발현 가능하게 숙주에 유지되어 있으면 좋다. 구체적으로는, 유전자는, 숙주에서 기능하는 프로모터 서열에 의한 제어를 받아 발현하도록 유지되어 있으면 좋다. 프로모터는 숙주에서 기능하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 「숙주에서 기능하는 프로모터」란, 숙주에서 프로모터 활성을 갖는 프로모터를 말한다. 프로모터는 숙주 유래의 프로모터라도 좋고, 이종 유래의 프로모터라도 좋다. 프로모터는, 도입하는 유전자의 고유한 프로모터라도 좋고, 다른 유전자의 프로모터라도 좋다. 프로모터로서는, 후술하는 바와 같은 코리네형 세균에서 기능하는 프로모터를 이용할 수 있다.
유전자의 하류에는, 전사 종결용의 터미네이터를 배치할 수 있다. 터미네이터는 숙주에서 기능하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 터미네이터는 숙주 유래의 터미네이터라도 좋고, 이종 유래의 터미네이터라도 좋다. 터미네이터는 도입하는 유전자의 고유한 터미네이터라도 좋고, 다른 유전자의 터미네이터라도 좋다.
각종 미생물에 있어서 이용 가능한 벡터, 프로모터, 터미네이터에 관해서는, 예를 들면 「미생물학 기초강좌 8 유전자공학, 공립 출판, 1987년」에 상세하게 기재되어 있고, 이들을 이용하는 것이 가능하다.
또한, 2 또는 그 이상의 유전자를 도입할 경우, 각 유전자가, 발현 가능하게 숙주에 유지되어 있으면 좋다. 예를 들면, 각 유전자는 전부가 단일의 발현 벡터 위에 유지되어 있어도 좋고, 전부가 염색체 위에 유지되어 있어도 좋다. 또한, 각 유전자는 복수의 발현 벡터 위에 각각 유지되어 있어도 좋고, 단일 또는 복수의 발현 벡터 위와 염색체 위에 각각 유지되어 있어도 좋다. 또한, 2 또는 그 이상의 유전자로 오페론을 구성하여 도입해도 좋다.
도입되는 유전자는, 숙주에서 기능하는 단백질을 코드하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 도입되는 유전자는 숙주 유래의 유전자라도 좋고, 이종 유래의 유전자라도 좋다. 도입되는 유전자는, 예를 들면, 이 유전자의 염기서열에 기초하여 설계한 프라이머를 사용하고, 이 유전자를 갖는 생물의 게놈 DNA나 이 유전자를 탑재하는 플라스미드 등을 주형으로서, PCR에 의해 취득할 수 있다. 또한, 도입되는 유전자는, 예를 들면, 이 유전자의 염기서열에 기초하여 전체 합성해도 좋다(Gene, 60(1), 115-127(1987)). 취득한 유전자는 그대로, 또는 적절히 개변하여 이용할 수 있다. 유전자의 개변은 공지된 수법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 의해, DNA의 목적의 부위에 목적의 변이를 도입할 수 있다. 즉, 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 의해, 코드되는 단백질이 특정한 부위에서 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가를 포함하도록, 유전자의 코드 영역을 개변할 수 있다.
또한, 유전자의 발현의 상승은, 유전자의 전사 효율을 향상시킴으로써 달성할 수 있다. 또한, 유전자의 발현의 상승은, 유전자의 번역 효율을 향상시킴으로써 달성할 수 있다. 유전자의 전사 효율이나 번역 효율의 향상은, 예를 들면, 발현 조절 서열의 개변에 의해 달성할 수 있다. 「발현 조절 서열」이란, 유전자의 발현에 영향을 주는 부위의 총칭이다. 발현 조절 서열로서는, 예를 들면, 프로모터, 샤인달가노(SD) 서열(리보솜 결합 부위(RBS)라고도 함), 및 RBS와 개시 코돈 사이의 스페이서 영역을 들 수 있다. 발현 조절 서열은, 프로모터 검색 벡터나 GENETYX 등의 유전자 해석 소프트를 사용하여 결정할 수 있다. 이들 발현 조절 서열의 개변은, 예를 들면, 상동 재조합을 이용하여 행할 수 있다. 상동 재조합을 이용한 개변 수법으로서는, 온도 감수성 벡터를 사용한 방법이나, Red 구동된 통합법(WO2005/010175)을 들 수 있다.
유전자의 전사 효율의 향상은, 예를 들면, 염색체상의 유전자의 프로모터를 보다 강력한 프로모터로 치환함으로써 달성할 수 있다. 「보다 강력한 프로모터」란, 유전자의 전사가, 원래 존재하고 있는 야생형의 프로모터보다도 향상되는 프로모터를 의미한다. 코리네형 세균에서 이용할 수 있는 보다 강력한 프로모터로서는, 인위적으로 설계 변경된 P54-6 프로모터(Appl. Microbiol. Biotechnolo., 53, 674-679(2000)), 코리네형 세균 내에서 아세트산, 에탄올, 피루브산 등으로 유도할 수 있는 pta, aceA, aceB, adh, amyE 프로모터, 코리네형 세균 내에서 발현량이 많은 강력한 프로모터인 cspB, SOD, tuf(EF-Tu) 프로모터(Journal of Biotechnology 104(2003)311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec; 71(12): 8587-96.), lac 프로모터, tac 프로모터, trc 프로모터를 들 수 있다. 또한, 보다 강력한 프로모터로서는, 각종 리포터 유전자를 사용함으로써 재래의 프로모터의 고활성형인 것을 취득해도 좋다. 예를 들면, 프로모터 영역 내의 -35, -10 영역을 콘센서스 서열에 가까이 함으로써, 프로모터의 활성을 높일 수 있다(국제공개 제00/18935호). 프로모터의 강도의 평가법 및 강력한 프로모터의 예는, Goldstein 등의 논문(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128(1995)) 등에 기재되어 있다.
유전자의 번역 효율의 향상은, 예를 들면, 염색체상의 유전자의 샤인달가노(SD) 서열(리보솜 결합 부위(RBS)라고도 함)을 보다 강력한 SD 서열로 치환함으로써 달성할 수 있다. 「보다 강력한 SD 서열」이란, mRNA의 번역이, 원래 존재하고 있는 야생형의 SD 서열보다도 향상되는 SD 서열을 의미한다. 보다 강력한 SD 서열로서는, 예를 들면, 파지 T7 유래의 유전자 10의 RBS를 들 수 있다(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235). 또한, RBS와 개시 코돈 사이의 스페이서 영역, 특히 개시 코돈의 바로 상류의 서열(5'-UTR)에서의 여러 개의 뉴클레오티드의 치환, 또는 삽입, 또는 결실이 mRNA의 안정성 및 번역 효율에 매우 영향을 끼치는 것으로 알려져 있고, 이들을 개변함으로써도 유전자의 번역 효율을 향상시킬 수 있다.
유전자의 번역 효율의 향상은, 예를 들면, 코돈의 개변에 의해도 달성할 수 있다. 예를 들면, 유전자 중에 존재하는 레어 코돈을, 보다 고빈도로 이용되는 동의 코돈으로 치환함으로써, 유전자의 번역 효율을 향상시킬 수 있다. 즉, 도입되는 유전자는, 예를 들면, 사용하는 숙주의 코돈 사용 빈도에 따라 최적인 코돈을 갖도록 개변되어도 좋다. 코돈의 치환은, 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 의해 행할 수 있다. 또한, 코돈이 치환된 유전자 단편을 전체 합성해도 좋다. 다양한 생물에서의 코돈의 사용 빈도는, 「코돈 사용 데이터 베이스」 (http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292(2000))에 개시되어 있다.
또한, 유전자의 발현의 상승은, 표적 유전자의 발현을 상승시키는 조절인자를 증폭하는 것, 또는, 표적 유전자의 발현을 저하시키는 조절인자를 결실 또는 약화시킴으로써도 달성할 수 있다.
상기와 같은 유전자의 발현을 상승시키는 수법은 단독으로 사용해도 좋고, 임의의 조합으로 사용해도 좋다.
형질 전환의 방법은 특별히 한정되지 않고, 종래 알려진 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 에쉐리히아·콜리 K-12에 대하여 보고되어 있는 바와 같은, 수용균 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA의 투과성을 증대시키는 방법(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162)이나, 바실루스·서브틸리스에 대하여 보고되어 있는 바와 같은, 증식 단계의 세포로부터 컴피턴트 셀을 조제하여 DNA를 도입하는 방법(Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167)을 사용할 수 있다. 또는, 바실루스·서브틸리스, 방선균류, 및 효모에 대하여 알려져 있는 바와 같은, DNA 수용균의 세포를, 재조합 DNA를 용이하게 받아들이는 프로토플라스트 또는 스페로플라스트의 상태로 하여 재조합 DNA를 DNA 수용균에 도입하는 방법(Chang, S. and Choen, S. N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A.1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R.1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933)도 응용할 수 있다. 코리네형 세균의 형질 전환은, 구체적으로는, 예를 들면, 프로토플라스트법(Gene, 39, 281-286(1985)), 일렉트로포레이션법(Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989)), 전기 펄스법(일본 공개특허공보 특개평2-207791호) 등에 의해 행할 수 있다.
유전자의 발현이 상승한 것은, 예를 들면, 이 유전자에서 발현되는 단백질의 활성이 상승한 것을 확인함으로써 확인할 수 있다. 단백질의 활성이 상승한 것은 이 단백질의 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다. 예를 들면, Tat계 분비 장치의 활성이 상승한 것은, 예를 들면, Tat계 의존 시그널 펩타이드가 N 말단에 부가된 단백질의 분비 생산량이 증대한 것을 확인함으로써 확인할 수 있다. 이 경우, Tat계 의존 시그널 펩타이드가 N 말단에 부가된 단백질의 분비 생산량은, 예를 들면, 비개변주의, 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 3배 이상으로 상승하고 있는 것이 바람직하다.
또한, 유전자의 발현이 상승한 것은, 예를 들면, 이 유전자의 전사량이 상승한 것을 확인하는 것이나, 이 유전자에서 발현되는 단백질의 양이 상승한 것을 확인함으로써 확인할 수 있다.
유전자의 전사량이 상승한 것의 확인은, 이 유전자에서 전사되는 mRNA의 양을 야생주 또는 친주 등의 비개변주와 비교함으로써 행할 수 있다. mRNA의 양을 평가하는 방법으로서는 노던 하이브리다이제이션, RT-PCR 등을 들 수 있다(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(USA), 2001). mRNA의 양은, 예를 들면, 비개변주의, 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 3배 이상으로 상승해도 좋다.
단백질의 양이 상승한 것의 확인은, SDS-PAGE를 행하여 분리된 단백질 밴드의 강도를 확인함으로써 행할 수 있다. 또한, 단백질의 양이 상승한 것의 확인은, 항체를 사용하여 웨스턴 블로트에 의해 행할 수 있다(Molecular cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(USA), 2001)). 단백질의 양(예를 들면, 세포당의 분자수)은, 예를 들면, 비개변주의, 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 3배 이상으로 상승해도 좋다.
<1-6> 이종 단백질의 분비 발현용의 유전자 구축물과 그 도입
분비성 단백질(secretory protein)은, 일반적으로, 프레단백질(프레펩타이드라고도 함) 또는 프레프로단백질(프레프로펩타이드라고도 함)로서 번역되고, 그 후, 프로세싱에 의해 성숙 단백질(mature protein)이 되는 것으로 알려져 있다. 구체적으로는, 분비성 단백질은, 일반적으로, 프레단백질 또는 프레프로단백질로서 번역된 후, 프레 부분인 시그널 펩타이드가 프로테아제(일반적으로 시그널 펩티다아제라고 불림)에 의해 절단되어 성숙 단백질 또는 프로단백질로 변환되고, 프로단백질은 프로테아제에 의해 더욱 프로 부분이 절단되어 성숙 단백질이 된다. 따라서, 본 발명의 방법에서는, 이종 단백질의 분비 생산에 시그널 펩타이드를 이용한다. 또한, 본 발명에 있어서, 분비형 단백질의 프레단백질 및 프레프로단백질을 총칭하여 「분비형 단백질 전구체」라고 하는 경우가 있다. 본 발명에 있어서, 「시그널 펩타이드」(「시그널 서열」이라고도 함)란, 분비성 단백질 전구체의 N 말단에 존재하며, 또한 통상, 천연의 성숙 단백질에는 존재하지 않는 아미노산 서열을 말한다.
본 발명에 사용되는 유전자 구축물은, 5'에서 3'방향으로, 코리네형 세균에서 기능하는 프로모터 서열, 코리네형 세균에서 기능하는 시그널 펩타이드를 코드하는 핵산 서열, 및 이종 단백질을 코드하는 핵산 서열을 포함한다. 시그널 펩타이드를 코드하는 핵산 서열은, 프로모터 서열의 하류에, 이 프로모터에 의한 제어를 받아 시그널 펩타이드가 발현되도록 연결되어 있으면 좋다. 이종 단백질을 코드하는 핵산 서열은, 시그널 펩타이드를 코드하는 핵산 서열의 하류에, 이 시그널 펩타이드와의 융합 단백질로서 이종 단백질이 발현되도록 연결되어 있으면 좋다. 당해 융합 단백질을 「본 발명의 융합 단백질」이라고도 한다. 또한, 본 발명의 융합 단백질에 있어서, 시그널 펩타이드와 이종 단백질은 인접하고 있어도 좋고, 인접하고 있지 않아도 좋다. 즉, 「이종 단백질이 시그널 펩타이드와의 융합 단백질로서 발현된다」란, 이종 단백질이 시그널 펩타이드에 인접하여 이 시그널 펩타이드와의 융합 단백질로서 발현되는 경우에 한정되지 않고, 이종 단백질이 다른 아미노산 서열을 통하여 시그널 펩타이드와의 융합 단백질로서 발현되는 경우도 포함된다. 예를 들면, 후술하는 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질에 있어서, 시그널 펩타이드와 이종 단백질 사이에는, Gln-Glu-Thr을 포함하는 아미노산 서열이나 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열 등의 삽입 서열이 포함될 수 있다. 또한, 후술하는 바와 같이, 최종적으로 얻어지는 이종 단백질은 시그널 펩타이드를 갖고 있지 않아도 좋다. 즉, 「이종 단백질이 시그널 펩타이드와의 융합 단백질로서 발현된다」란, 이종 단백질이 발현시에 시그널 펩타이드와의 융합 단백질을 구성하고 있으면 충분하고, 최종적으로 얻어지는 이종 단백질이 시그널 펩타이드와의 융합 단백질을 구성하고 있는 것을 필요로 하지 않는다. 핵산 서열은 「유전자」라고 읽어도 좋다. 예를 들면, 이종 단백질을 코드하는 핵산 서열을 「이종 단백질을 코드하는 유전자」 또는 「이종 단백질 유전자」라고도 한다.　핵산 서열로서는 DNA를 들 수 있다.　또한, 본 발명에 사용되는 유전자 구축물은, 코리네형 세균에서 본 발명의 융합 단백질을 발현시키기 위해서 유효한 제어 서열(오퍼레이터, SD 서열, 터미네이터 등)을, 이들이 기능할 수 있도록 적절한 위치에 갖고 있어도 좋다.
본 발명에서 사용되는 프로모터는, 코리네형 세균에서 기능하는 프로모터인 한 특별히 제한되지 않는다.　프로모터는 코리네형 세균 유래(예를 들면 숙주 유래)의 프로모터라도 좋고, 이종 유래의 프로모터라도 좋다.　프로모터는 이종 단백질 유전자의 고유한 프로모터라도 좋고, 다른 유전자의 프로모터라도 좋다.　「코리네형 세균에서 기능하는 프로모터」란, 코리네형 세균에서 프로모터 활성을 갖는 프로모터를 말한다.
이종 유래의 프로모터로서, 구체적으로는, 예를 들면, tac 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, 및 araBAD 프로모터 등의 E.coli 유래의 프로모터를 들 수 있다.　그　중에서도, tac 프로모터 등의 강력한 프로모터나, araBAD 프로모터 등의 유도형의 프로모터가 바람직하다.
코리네형 세균 유래의 프로모터로서는, 예를 들면, 세포 표층 단백질인 PS1, PS2(CspB라고도 함), SlpA(CspA라고도 함)의 유전자의 프로모터, 각종 아미노산 생합성계 유전자의 프로모터를 들 수 있다.　각종 아미노산 생합성계 유전자의 프로모터로서, 구체적으로는, 예를 들면, 글루타민산 생합성계의 글루타민산 탈수소효소 유전자, 글루타민 합성계의 글루타민 합성효소 유전자, 라이신 생합성계의 아스파르토키나아제 유전자, 트레오닌 생합성계의 호모세린 탈수소효소 유전자, 이소류신 및 발린 생합성계의 아세토하이드록시산 합성효소 유전자, 류신 생합성계의 2-이소프로필말산 합성효소 유전자, 프롤린 및 아르기닌 생합성계의 글루타민산 키나아제 유전자, 히스티딘 생합성계의 포스포리보실-ATP 피로포스포릴라아제 유전자, 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌 등의 방향족 아미노산 생합성계의 데옥시아라비노헵투론산 인산(DAHP) 합성효소 유전자, 이노신산 및 구아닐산과 같은 핵산 생합성계에서의 포스포리보실 피로포스페이트(PRPP) 아미도트랜스퍼라제 유전자, 이노신산 탈수소효소 유전자, 및 구아닐산 합성효소 유전자의 프로모터를 들 수 있다.
또한, 코리네형 세균에서 기능하는 프로모터로서는, 상술한 바와 같은, 코리네형 세균에서 이용할 수 있는 보다 강력한 프로모터를 들 수 있다.　또한, 프로모터로서는, 각종 리포터 유전자를 사용함으로써 재래의 프로모터의 고활성형인 것을 취득하여 이용해도 좋다.　예를 들면, 프로모터 영역 내의 -35, -10 영역을 콘센서스 서열에 가까이 함으로써, 프로모터의 활성을 높일 수 있다(국제공개 제00/18935호).　프로모터의 강도의 평가법 및 강력한 프로모터의 예는, Goldstein 등의 논문(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128(1995)) 등에 기재되어 있다.　또한, 리보솜 결합 부위(RBS)와 개시 코돈 사이의 스페이서 영역, 특히 개시 코돈의 바로 상류의 서열(5'-UTR)에서의 여러 개의 뉴클레오티드의 치환, 또는 삽입, 또는 결실이 mRNA의 안정성 및 번역 효율에 매우 영향을 끼치는 것으로 알려져 있고, 이들을 개변하는 것도 가능하다.
본 발명에서 사용되는 시그널 펩타이드는, 코리네형 세균에서 기능하는 시그널 펩타이드인 한 특별히 제한되지 않는다.　시그널 펩타이드는 코리네형 세균 유래(예를 들면 숙주 유래)의 시그널 펩타이드라도 좋고, 이종 유래의 시그널 펩타이드라도 좋다.　시그널 펩타이드는 이종 단백질의 고유한 시그널 펩타이드라도 좋고, 다른 단백질의 시그널 펩타이드라도 좋다.　「코리네형 세균에서 기능하는 시그널 펩타이드」란, 목적의 단백질의 N 말단에 연결했을 때에, 코리네형 세균이 당해 단백질을 분비할 수 있는 펩타이드를 말한다.　어떤 시그널 펩타이드가 코리네형 세균에서 기능하는지의 여부는, 예를 들면, 목적의 단백질을 당해 시그널 펩타이드와 융합시켜 발현시키고, 당해 단백질이 분비되는지를 확인함으로써 확인할 수 있다.
시그널 펩타이드로서는, Tat계 의존 시그널 펩타이드나 Sec계 의존 시그널 펩타이드를 들 수 있다.
「Tat계 의존 시그널 펩타이드」란, Tat계에 의해 인식되는 시그널 펩타이드를 말한다. 「Tat계 의존 시그널 펩타이드」란, 구체적으로는, 목적의 단백질의 N 말단에 연결했을 때에, Tat계 분비 장치에 의해 당해 단백질이 분비되는 펩타이드라도 좋다.
Tat계 의존 시그널 펩타이드로서는, 예를 들면, E. coli의 TorA 단백질(트리메틸아민-N-산화환원효소)의 시그널 펩타이드, E. coli의 SufI 단백질(ftsI의 서프레서)의 시그널 펩타이드, Bacillus subtilis의 PhoD 단백질(포스포디에스테라아제)의 시그널 펩타이드, Bacillus subtilis의 LipA 단백질(리포산 신타아제)의 시그널 펩타이드, Arthrobacter globiformis의 IMD 단백질(이소말토덱스트라나아제)의 시그널 펩타이드를 들 수 있다. 이들 시그널 펩타이드의 아미노산 서열은 이하와 같다.
TorA 시그널 펩타이드: MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA(서열번호 41)
SufI 시그널 펩타이드: MSLSRRQFIQASGIALCAGAVPLKASA(서열번호 42)
PhoD 시그널 펩타이드: MAYDSRFDEWVQKLKEESFQNNTFDRRKFIQGAGKIAGLSLGLTIAQS(서열번호 43)
LipA 시그널 펩타이드: MKFVKRRTTALVTTLMLSVTSLFALQPSAKAAEH(서열번호 44)
IMD 시그널 펩타이드: MMNLSRRTLLTTGSAATLAYALGMAGSAQA(서열번호 45)
Tat계 의존 시그널 펩타이드는 트윈·아르기닌 모티프를 갖는다. 트윈·아르기닌 모티프로서는, 예를 들면, S/T-R-R-X-F-L-K(서열번호 46)나 R-R-X-#-#(#: 소수성 잔기)(서열번호 47)을 들 수 있다.
「Sec계 의존 시그널 펩타이드」란, Sec계에 의해 인식되는 시그널 펩타이드를 말한다. 「Sec계 의존 시그널 펩타이드」란, 구체적으로는, 목적의 단백질의 N 말단에 연결했을 때에, Sec계 분비 장치에 의해 당해 단백질이 분비되는 펩타이드라도 좋다.
Sec계 의존 시그널 펩타이드로서는, 예를 들면, 코리네형 세균의 세포 표층 단백질의 시그널 펩타이드를 들 수 있다. 코리네형 세균의 세포 표층 단백질에 대해서는 상술한 바와 같다. 코리네형 세균의 세포 표층 단백질로서는, 씨. 글루타미쿰에 유래하는 PS1 및 PS2(CspB)(일본 공개특허공보 특표평6-502548), 및C. stationis에 유래하는 SlpA(CspA)(일본 공개특허공보 특개평10-108675)를 들 수 있다. 씨. 글루타미쿰의 PS1의 시그널 펩타이드(PS1 시그널 펩타이드)의 아미노산 서열을 서열번호 48에, 씨. 글루타미쿰의 PS2(CspB)의 시그널 펩타이드(PS2 시그널 펩타이드)의 아미노산 서열을 서열번호 49에, C. stationis의 SlpA(CspA)의 시그널 펩타이드(SlpA 시그널 펩타이드)의 아미노산 서열을 서열번호 50에 나타낸다.
Tat계 의존 시그널 펩타이드는 트윈·아르기닌 모티프를 갖고, 또한, 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 Tat계 의존 시그널 펩타이드의 변이체라도 좋다. 또한, Sec계 의존 시그널 펩타이드는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 Sec계 의존 시그널 펩타이드의 변이체라도 좋다. 시그널 펩타이드 및 이를 코드하는 유전자의 변이체에 대해서는, 상기한 HrrSA 단백질 및 hrrSA 유전자의 보존적 변이체에 관한 기재를 준용할 수 있다. 예를 들면, 시그널 펩타이드는, 상기 예시한 시그널 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 위치에서의 1 또는 여러 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드라도 좋다. 또한, 시그널 펩타이드의 변이체에서의 상기 「1 또는 여러 개」란, 구체적으로는 바람직하게는 1 내지 7개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개, 더 바람직하게는 1 내지 3개, 특히 바람직하게는 1 내지 2개를 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서, 「TorA 시그널 펩타이드」, 「SufI 시그널 펩타이드」, 「PhoD 시그널 펩타이드」, 「LipA 시그널 펩타이드」, 「IMD 시그널 펩타이드」, 「PS1 시그널 펩타이드」, 「PS2 시그널 펩타이드」, 및 「SlpA 시그널 펩타이드」라는 용어에는, 각각, 서열번호 41 내지 50에 기재된 펩타이드에 더하여, 그 보존적 변이체가 포함되는 것으로 한다.
Tat계 의존 시그널 펩타이드에 대한 「원래의 기능이 유지되고 있다」란, Tat계에 의해 인식되는 것을 말하고, 구체적으로는, 목적의 단백질의 N 말단에 연결했을 때에, Tat계 분비 장치에 의해 당해 단백질이 분비되는 기능을 갖는 것이라도 좋다. 어떤 펩타이드가 Tat계 의존 시그널 펩타이드로서의 기능을 갖는지 여부는, 예를 들면, 당해 펩타이드를 N 말단에 부가한 단백질의 분비 생산량이 Tat계 분비 장치의 증강에 의해 증대하는 것을 확인하는 것이나, 당해 펩타이드를 N 말단에 부가한 단백질의 분비 생산량이 Tat계 분비 장치의 결손에 의해 감소하는 것을 확인함으로써 확인할 수 있다.
Sec계 의존 시그널 펩타이드에 대한 「원래의 기능이 유지되고 있다」란, Sec계에 의해 인식되는 것을 말하고, 구체적으로는, 목적의 단백질의 N 말단에 연결했을 때에, Sec계 분비 장치에 의해 당해 단백질이 분비되는 기능을 갖는 것이라도 좋다. 어떤 펩타이드가 Sec계 의존 시그널 펩타이드로서의 기능을 갖는지 여부는, 예를 들면, 당해 펩타이드를 N 말단에 부가한 단백질의 분비 생산량이 Sec계 분비 장치의 증강에 의해 증대하는 것을 확인하는 것이나, 당해 펩타이드를 N 말단에 부가한 단백질의 분비 생산량이 Sec계 분비 장치의 결손에 의해 감소하는 것을 확인함으로써 확인할 수 있다.
시그널 펩타이드는, 일반적으로, 번역 산물이 균체 외에 분비될 때에 시그널 펩티다아제에 의해 절단된다. 즉, 최종적으로 얻어지는 이종 단백질은 시그널 펩타이드를 갖고 있지 않아도 좋다. 또한, 시그널 펩타이드를 코드하는 유전자는 천연형인채로도 사용할 수 있지만, 사용하는 숙주의 코돈 사용 빈도에 따라 최적인 코돈을 갖도록 개변해도 좋다.
본 발명에서 사용되는 유전자 구축물에 있어서는, 시그널 펩타이드를 코드하는 핵산 서열과 이종 단백질을 코드하는 핵산 서열 사이에, Gln-Glu-Thr을 포함하는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열이 삽입되어 있어도 좋다(WO2013/062029). 또한, 당해 「Gln-Glu-Thr을 포함하는 아미노산 서열」을 「본 발명에서 사용되는 삽입 서열」이라고도 한다. 본 발명에서 사용되는 삽입 서열로서는, WO2013/062029에 기재된 Gln-Glu-Thr을 포함하는 아미노산 서열을 들 수 있다. 본 발명에서 사용되는 삽입 서열은, 특히, Sec계 의존 시그널 펩타이드와 조합하여 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 삽입 서열은, 코리네형 세균의 세포 표층 단백질 CspB의 성숙 단백질(이하, 「성숙 CspB」 또는 「CspB 성숙 단백질」이라고도 함)의 N 말단으로부터의 3 아미노산 잔기 또는 그 이상으로 이루어지는 서열인 것이 바람직하다. 「N 말단으로부터의 3 아미노산 잔기 또는 그 이상으로 이루어지는 서열」이란, N 말단의 1 위치의 아미노산 잔기로부터, 3 위치 또는 그 이상의 아미노산 잔기까지의 아미노산 서열을 말한다.
코리네형 세균의 세포 표층 단백질 CspB에 대해서는 상술한 바와 같다. CspB로서, 구체적으로는, 예를 들면, 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 CspB나 상기 예시한 28주의 씨. 글루타미쿰의 CspB, 및 이들의 변이체를 들 수 있다. 서열번호 34에 나타낸 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 CspB의 아미노산 서열 중, 1 내지 30 위치의 아미노산 잔기가 시그널 펩타이드에 상당하고, 31 내지 499 위치의 아미노산 잔기가 CspB 성숙 단백질에 상당한다. 시그널 펩타이드 부분 30 아미노산 잔기를 제외한, 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 CspB 성숙 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 51에 나타낸다. 또한, 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 성숙 CspB에 있어서, N 말단의 1 내지 3 위치의 아미노산 잔기가 Gln-Glu-Thr에 상당한다.
본 발명에서 사용되는 삽입 서열은 성숙 CspB의 1 위치의 아미노산 잔기로부터, 3 내지 50 위치 중 어느 하나의 아미노산 잔기까지의 아미노산 서열인 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 삽입 서열은 성숙 CspB의 1 위치의 아미노산 잔기로부터, 3 내지 8, 17, 50 위치 중 어느 하나의 아미노산 잔기까지의 아미노산 서열인 것이 보다 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 삽입 서열은 성숙 CspB의 1 위치의 아미노산 잔기로부터, 4, 6, 17, 50 위치 중 어느 하나의 아미노산 잔기까지의 아미노산 서열인 것이 특히 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 삽입 서열은, 예를 들면, 하기 A 내지 H의 아미노산 서열로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것이 바람직하다.
(A) Gln-Glu-Thr
(B) Gln-Glu-Thr-Xaa1(서열번호 52)
(C) Gln-Glu-Thr-Xaa1-Xaa2(서열번호 53)
(D) Gln-Glu-Thr-Xaa1-Xaa2-Xaa3(서열번호 54)
(E) Gln-Glu-Thr에 성숙 CspB의 4 내지 7 위치의 아미노산 잔기가 부가된 아미노산 서열
(F) Gln-Glu-Thr에 성숙 CspB의 4 내지 8 위치의 아미노산 잔기가 부가된 아미노산 서열
(G) Gln-Glu-Thr에 성숙 CspB의 4 내지 17 위치의 아미노산 잔기가 부가된 아미노산 서열
(H) Gln-Glu-Thr에 성숙 CspB의 4 내지 50 위치의 아미노산 잔기가 부가된 아미노산 서열
A 내지 H의 아미노산 서열에 있어서, Xaa1은 Asn, Gly, Thr, Pro, 또는 Ala이며, Xaa2는 Pro, Thr, 또는 Val이며, Xaa3은 Thr 또는 Tyr이다. 또한, A 내지 H의 아미노산 서열에 있어서, 「Gln-Glu-Thr에 성숙 CspB의 4 내지 X 위치의 아미노산 잔기가 부가된」이란, Gln-Glu-Thr의 Thr에 성숙 CspB의 N 말단의 4 위치로부터 X 위치까지의 아미노산 잔기가 부가되어 있는 것을 의미한다. 또한, 통상, 성숙 CspB의 N 말단의 1 내지 3번째의 아미노산 잔기는 Gln-Glu-Thr이며, 이 경우, 「Gln-Glu-Thr에 성숙 CspB의 4 내지 X 위치의 아미노산 잔기가 부가된 아미노산 서열」이란, 성숙 CspB의 1 내지 X 위치의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열과 같은 뜻이다.
또한, 본 발명에서 사용되는 삽입 서열은, 구체적으로는, 예를 들면, Gln-Glu-Thr-Asn-Pro-Thr(서열번호 55), Gln-Glu-Thr-Gly-Thr-Tyr(서열번호 56), Gln-Glu-Thr-Thr-Val-Thr(서열번호 57), Gln-Glu-Thr-Pro-Val-Thr(서열번호 58), 및 Gln-Glu-Thr-Ala-Val-Thr(서열번호 59)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 「성숙 CspB의 X 위치의 아미노산 잔기」란, 서열번호 51에서의 X 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기를 의미한다. 임의의 성숙 CspB의 아미노산 서열에 있어서, 어느 아미노산 잔기가 「서열번호 51에서의 X 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기」인지는, 당해 임의의 성숙 CspB의 아미노산 서열과 서열번호 51의 아미노산 서열과 얼라인먼트를 행함으로써 결정할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 분비 생산되는 이종 단백질로서는, 예를 들면, 생리활성 단백질, 리셉터 단백질, 백신으로서 사용되는 항원 단백질, 효소, 그 외 임의의 단백질을 들 수 있다.
효소로서는, 예를 들면, 트랜스글루타미나아제, 프로테인 글루타미나아제, 이소말토덱스트라나아제, 프로테아제, 엔도펩티다아제, 엑소펩티다아제, 아미노펩티다아제, 카르복시펩티다아제, 콜라게나아제, 및 키티나아제 등을 들 수 있다. 트랜스글루타미나아제로서는, 예를 들면, Streptoverticillium mobaraense IFO 13819(WO01/23591), Streptoverticillium cinnamoneum IFO 12852, Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776, Streptomyces lydicus(WO9606931) 등의 방선균이나, Oomycetes(WO9622366) 등의 사상균의 분비형 트랜스글루타미나아제를 들 수 있다. 프로테인 글루타미나아제로서는, 예를 들면, Chryseobacterium proteolyticum의 프로테인 글루타미나아제를 들 수 있다(WO2005/103278). 이소말토덱스트라나아제로서는, 예를 들면, Arthrobacter globiformis의 이소말토덱스트라나아제를 들 수 있다(WO2005/103278).
생리활성 단백질로서는, 예를 들면, 성장 인자(증식 인자), 호르몬, 사이토카인, 항체 관련 분자를 들 수 있다.
성장 인자(증식 인자)로서, 구체적으로는, 예를 들면, 표피 성장 인자(Epidermal growth factor; EGF), 인슐린 성장 인자-1(Insulin-like growth factor-1; IGF-1), 형질전환 성장 인자(Transforming growth factor; TGF), 신경 성장 인자(Nerve growth factor; NGF), 뇌 유래 신경영양 인자(Brain-derived neurotrophic factor; BDNF), 혈관 내피세포 성장 인자(Vesicular endothelial growth factor; VEGF), 과립구 콜로니 자극 인자(Granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자(Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor; GM-CSF), 혈소판 유래 성장 인자(Platelet-derived growth factor; PDGF), 에리트로포이에틴(Erythropoietin; EPO), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin; TPO), 산성 섬유아세포 성장 인자(acidic fibroblast growth factor; aFGF 또는 FGF1), 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF 또는 FGF2), 각질세포 성장 인자(keratinocyto growth factor; KGF-1 또는 FGF7, KGF-2 또는 FGF10), 간세포 성장 인자(Hepatocyte growth factor; HGF)를 들 수 있다.
호르몬으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴(somatostatin), 인간 성장 호르몬(human growth hormone; hGH), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone; PTH), 칼시토닌(calcitonin), 엑세나타이드(exenatide)를 들 수 있다.
사이토카인으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 인터루킨, 인터페론, 종양 괴사 인자(Tumor Necrosis Factor; TNF)를 들 수 있다.
또한, 성장 인자(증식 인자), 호르몬, 및 사이토카인은 서로 엄밀하게 구별되지 않아도 좋다. 예를 들면, 생리활성 단백질은 성장 인자(증식 인자), 호르몬, 및 사이토카인으로부터 선택되는 어느 하나의 그룹에 속하는 것이라도 좋고, 이들로부터 선택되는 복수의 그룹에 속하는 것이라도 좋다.
또한, 생리활성 단백질은 단백질 전체라도 좋고, 그 일부라도 좋다. 단백질의 일부로서는, 예를 들면, 생리활성을 갖는 부분을 들 수 있다. 생리활성을 갖는 부분으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone; PTH)의 성숙체의 N 말단 34 아미노산 잔기로 이루어지는 생리활성 펩타이드 테리파라타이드(Teriparatide)를 들 수 있다.
항체 관련 분자란, 완전 항체를 구성하는 도메인으로부터 선택되는 단일의 도메인 또는 2 혹은 그 이상의 도메인의 조합으로 이루어지는 분자종을 포함하는 단백질을 말한다. 완전 항체를 구성하는 도메인으로서는, 중쇄의 도메인인 VH, CH1, CH2, 및 CH3, 및 경쇄의 도메인인 VL 및 CL을 들 수 있다. 항체 관련 분자는 상기의 분자종을 포함하는 한, 단량체 단백질이라도 좋고, 다량체 단백질이라도 좋다. 또한, 항체 관련 분자가 다량체 단백질인 경우에는, 단일 종류의 서브유닛으로 이루어지는 호모 다량체라도 좋고, 2 또는 그 이상의 종류의 서브유닛으로 이루어지는 헤테로 다량체라도 좋다. 항체 관련 분자로서, 구체적으로는, 예를 들면, 완전 항체, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fc, 중쇄(H쇄)와 경쇄(L쇄)로 이루어지는 2량체, Fc 융합 단백질, 중쇄(H쇄), 경쇄(L쇄), 단쇄 Fv(scFv), sc(Fv)2, 디술피드 결합 Fv(sdFv), Diabody, VHH 프래그먼트(Nanobody(등록상표))를 들 수 있다. 항체 관련 분자로서, 더 구체적으로는, 예를 들면, 트라스투주맙을 들 수 있다.
리셉터 단백질은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 생리활성 단백질이나 그 밖의 생리활성 물질에 대한 리셉터 단백질이라도 좋다. 그 밖의 생리활성 물질로서는, 예를 들면, 도파민 등의 신경전달물질을 들 수 있다. 또한, 리셉터 단백질은, 대응하는 리간드가 알려져 있지 않은 희귀 수용체라도 좋다.
백신으로서 사용되는 항원 단백질은 면역 응답을 야기할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고, 상정하는 면역 응답의 대상에 따라 적절히 선택하면 좋다.
또한, 그 밖의 단백질로서, 간-유형 지방산-결합 단백질(LFABP), 형광 단백질, 면역글로블린 결합 단백질, 알부민, 세포 외 단백질을 들 수 있다. 형광 단백질로서는, 녹색 형광 단백질(GFP)을 들 수 있다. 면역글로블린 결합 단백질로서는, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L을 들 수 있다. 알부민으로서는, 인간 혈청 알부민을 들 수 있다.
세포 외 단백질로서는, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐, 오스테오폰틴, 라미닌, 이들의 부분 서열을 들 수 있다. 라미닌은 α쇄, β쇄, 및 γ쇄로 이루어지는 헤테로 3량체 구조를 갖는 단백질이다. 라미닌으로서는, 포유류의 라미닌을 들 수 있다. 포유류로서는, 인간, 원숭이, 침팬지 등의 영장류, 마우스, 쥐, 햄스터, 모르모트 등의 설치류, 토끼, 말, 소, 양, 염소, 돼지, 개, 고양이 등 그 밖의 각종 포유류를 들 수 있다. 포유류로서는, 특히 인간을 들 수 있다. 라미닌의 서브유닛쇄(즉, α쇄, β쇄, 및 γ쇄)로서는, 5종의 α쇄(α1 내지 α5), 3종의 β쇄(β1 내지 β3), 3종의 γ쇄(γ1 내지 γ3)를 들 수 있다. 라미닌은 이들 서브유닛쇄의 조합에 의해 다양한 아이소포름을 구성한다. 라미닌으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 라미닌 111, 라미닌 121, 라미닌 211, 라미닌 213, 라미닌 221, 라미닌 311, 라미닌 321, 라미닌 332, 라미닌 411, 라미닌 421, 라미닌 423, 라미닌 511, 라미닌 521, 라미닌 523을 들 수 있다. 라미닌의 부분 서열로서는, 라미닌의 E8 단편인 라미닌 E8을 들 수 있다. 라미닌 E8은, 구체적으로는, α쇄의 E8 단편(α쇄 E8), β쇄의 E8 단편(β쇄 E8), 및 γ쇄의 E8 단편(γ쇄 E8)으로 이루어지는 헤테로 3량체 구조를 갖는 단백질이다. 라미닌 E8의 서브유닛쇄(즉, α쇄 E8, β쇄 E8, 및 γ쇄 E8)를 총칭하여 「E8 서브유닛쇄」이라고도 한다. E8 서브유닛쇄로서는, 상기 예시한 라미닌 서브유닛쇄의 E8 단편을 들 수 있다. 라미닌 E8은 이들 E8 서브유닛쇄의 조합에 의해 다양한 아이소포름을 구성한다. 라미닌 E8로서, 구체적으로는, 예를 들면, 라미닌 111E8, 라미닌 121E8, 라미닌 211E8, 라미닌 221E8, 라미닌 332E8, 라미닌 421E8, 라미닌 411E8, 라미닌 511E8, 라미닌 521E8을 들 수 있다.
이들 단백질 등의 이종 단백질을 코드하는 유전자는 그대로, 또는 적절히 개변하여 이용할 수 있다. 이종 단백질을 코드하는 유전자는, 예를 들면, 사용하는 숙주에 따라, 및/또는 원하는 활성을 얻기 위해 개변할 수 있다. 예를 들면, 이종 단백질을 코드하는 유전자는, 코드되는 이종 단백질의 아미노산 서열에 1 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가가 포함되도록 개변되어도 좋다. 상기한 HrrSA 단백질 및 hrrSA 유전자의 변이체에 관한 기재는, 본 발명의 방법에 의해 분비 생산되는 이종 단백질 및 이를 코드하는 유전자에도 준용할 수 있다. 또한, 유래하는 생물종으로 특정되는 단백질은, 당해 생물종에서 발견되는 단백질 자체에 한정되지 않고, 당해 생물종에서 발견되는 단백질의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이들의 변이체를 포함하는 것으로 한다. 이들 변이체는 당해 생물종에서 발견되어도 좋고, 발견되지 않아도 좋다. 즉, 예를 들면, 「인간 유래 단백질」이란, 인간에게서 발견되는 단백질 자체에 한정되지 않고, 인간에게서 발견되는 단백질의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이들의 변이체를 포함하는 것으로 한다. 또한, 이종 단백질을 코드하는 유전자는, 임의의 코돈을 그것과 등가의 코돈으로 치환한 것이라도 좋다. 예를 들면, 이종 단백질을 코드하는 유전자는, 사용하는 숙주의 코돈 사용 빈도에 따라 최적인 코돈을 갖도록 개변되어도 좋다.
본 발명의 유전자 구축물은, Gln-Glu-Thr을 포함하는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열과 이종 단백질을 코드하는 핵산 서열 사이에, 또한, 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함하고 있어도 좋다. 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열을 본 발명의 융합 단백질에 삽입함으로써, 발현된 융합 단백질을 효소적으로 절단하여 목적의 이종 단백질을 얻을 수 있다.
효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열은, 펩타이드 결합을 가수분해하는 효소에 의해 인식되어 절단되는 서열이면 특별히 제한되지 않고, 목적의 이종 단백질의 아미노산 서열에 따라 사용 가능한 서열을 적절히 선택하면 좋다. 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열은, 이 아미노산 서열에 기초하여 적절히 설계할 수 있다. 예를 들면, 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열은, 숙주의 코돈 사용 빈도에 따라 최적인 코돈을 갖도록 설계할 수 있다.
효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열은, 기질 특이성이 높은 프로테아제의 인식 서열인 것이 바람직하다. 이러한 아미노산 서열로서, 구체적으로는, 예를 들면, 인자 Xa 프로테아제의 인식 서열이나 proTEV 프로테아제의 인식 서열을 들 수 있다. 인자 Xa 프로테아제는 단백질 중의 Ile-Glu-Gly-Arg(=IEGR)(서열번호 60)의 아미노산 서열을, proTEV 프로테아제는 단백질 중의 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln(=ENLYFQ)(서열번호 61)의 아미노산 서열을 인식하고, 각 서열의 C 말단측을 특이적으로 절단한다.
본 발명의 방법에 의해 최종적으로 얻어지는 이종 단백질의 N 말단 영역은 천연의 단백질과 동일해도 좋고, 천연의 단백질과 동일하지 않아도 좋다. 예를 들면, 최종적으로 얻어지는 이종 단백질의 N 말단 영역은 천연의 단백질과 비교하여, 1 또는 여러 개의 아미노산을 여분으로 부가된, 또는 결실된 것이라도 좋다. 또한 상기 「1 또는 여러 개」란, 목적의 이종 단백질의 전체 길이나 구조 등에 따라서도 다르지만, 구체적으로는 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개를 의미한다.
또한, 분비 생산되는 이종 단백질은 프로 구조부가 부가된 단백질(프로단백질)이라도 좋다. 분비 생산되는 이종 단백질이 프로단백질인 경우, 최종적으로 얻어지는 이종 단백질은 프로단백질이라도 좋고, 그렇지 않아도 좋다. 즉, 프로단백질은 프로 구조부를 절단하여 성숙 단백질이 되어도 좋다. 절단은, 예를 들면, 프로테아제에 의해 행할 수 있다. 프로테아제를 사용하는 경우에는, 최종적으로 얻어지는 단백질의 활성이라는 관점에서, 프로단백질은 일반적으로는 천연의 단백질과 거의 같은 위치에서 절단되는 것이 바람직하고, 천연의 단백질과 완전하게 같은 위치에서 절단되어 천연의 것과 동일한 성숙 단백질이 얻어지는 것이 보다 바람직하다. 따라서, 일반적으로는, 천연에서 생기는 성숙 단백질과 동일한 단백질이 생기는 위치에서 프로단백질을 절단하는 특이적 프로테아제가 가장 바람직하다. 그러나, 상술한 바와 같이, 최종적으로 얻어지는 이종 단백질의 N 말단 영역은 천연의 단백질과 동일하지 않아도 좋다. 예를 들면, 생산되는 이종 단백질의 종류나 사용 목적 등에 따라서는, 천연의 단백질에 비해 N 말단이 아미노산 1 내지 여러 개분의 긴 또는 짧은 단백질이 보다 적절한 활성을 갖는 경우가 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 프로테아제에는, 디스파제(베링커 만하임사 제조)와 같은 상업적으로 입수할 수 있는 것 이외에, 미생물의 배양액, 예를 들면 방선균의 배양액 등으로부터 얻어지는 것이 포함된다. 이러한 프로테아제는 미정제 상태에서 사용할 수도 있고, 필요에 따라 적당한 순도까지 정제한 후에 사용해도 좋다. 또한, 프로 구조부를 절단하여 성숙 단백질을 얻을 경우에는, 삽입한 Gln-Glu-Thr을 포함하는 아미노산 서열은 프로 구조부와 함께 절단 제거되기 때문에, Gln-Glu-Thr을 포함하는 아미노산 서열 후에 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열을 배위하지 않더라도 목적의 단백질을 얻을 수 있다.
본 발명에 사용되는 유전자 구축물을 코리네형 세균에 도입하는 수법은 특별히 제한되지 않는다. 「본 발명에 사용되는 유전자 구축물의 도입」이란, 이 유전자 구축물을 숙주에 유지시키는 것을 말한다. 「본 발명에 사용되는 유전자 구축물의 도입」에는, 미리 구축한 이 유전자 구축물을 숙주에 일괄하여 도입하는 경우에 한정되지 않고, 적어도 이종 단백질 유전자가 숙주에 도입되고, 또한 숙주 내에서 이 유전자 구축물이 구축되는 경우도 포함된다. 본 발명의 세균에 있어서, 본 발명에 사용되는 유전자 구축물은, 플라스미드와 같이 염색체 외에서 자율 증식하는 벡터 위에 존재하고 있어도 좋고, 염색체 위에 포함되어 있어도 좋다. 본 발명에 사용되는 유전자 구축물의 도입은, 예를 들면, 상기한 유전자의 발현을 상승시키는 수법에서의 유전자의 도입과 마찬가지로 행할 수 있다. 또한, 본 발명의 세균을 구축함에 있어서, 본 발명에 사용되는 유전적 구축물의 도입, HrrSA 시스템의 활성 저하, 및 그 외의 개변은 임의의 순서로 행할 수 있다.
본 발명에 사용되는 유전자 구축물은, 예를 들면, 이 유전자 구축물을 포함하는 벡터를 사용하여 숙주에 도입할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 사용되는 유전자 구축물을 벡터와 연결하여 이 유전자 구축물의 발현 벡터를 구축하고, 당해 발현 벡터로 숙주를 형질 전환함으로써, 이 유전자 구축물을 숙주에 도입할 수 있다. 또한, 예를 들면, 벡터가 코리네형 세균에서 기능하는 프로모터를 구비할 경우, 당해 프로모터의 하류에 본 발명의 융합 단백질을 코드하는 염기서열을 연결 함으로써도, 본 발명에 사용되는 유전자 구축물의 발현 벡터를 구축할 수 있다. 벡터는, 코리네형 세균에서 자율 복제 가능한 것이면 특별히 제한되지 않는다. 코리네형 세균에서 이용할 수 있는 벡터에 대해서는 상술한 바와 같다.
또한, 본 발명에 사용되는 유전자 구축물은, 예를 들면, 인공 트랜스포존 등의 트랜스포존을 사용하여 숙주의 염색체 위에 도입할 수 있다. 트랜스포존이 사용되는 경우에는, 상동 재조합 또는 그 자신의 전이능에 의해 본 발명에 사용되는 유전자 구축물이 염색체 위에 도입된다. 또한, 본 발명에 사용되는 유전자 구축물은 그 외에, 상동 재조합을 이용하는 도입법에 의해 숙주의 염색체 위에 도입할 수 있다. 상동 재조합을 이용하는 도입법으로서는, 예를 들면, 직쇄상 DNA, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드, 접합 전달 가능한 플라스미드, 또는 숙주 내에서 기능하는 복제 기점을 갖지 않는 수이사이드 벡터 등을 사용하는 방법을 들 수 있다. 또한, 적어도 이종 단백질 유전자를 염색체 위에 도입하고, 본 발명에 사용되는 유전자 구축물을 염색체 위에 구축해도 좋다. 이 경우, 이종 단백질 유전자 이외의, 본 발명에 사용되는 유전자 구축물의 구성 요소의 일부 또는 전부는 숙주의 염색체 위에 원래 존재하는 것이라도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면, 숙주의 염색체 위에 원래 존재하는 프로모터 서열과 이 프로모터 서열의 하류에 접속된 시그널 펩타이드를 코드하는 핵산 서열을 그대로 이용하고, 이 시그널 펩타이드를 코드하는 핵산 서열의 하류에 접속된 유전자만을 목적의 이종 단백질 유전자로 치환함으로써도, 염색체 위에 본 발명에 사용되는 유전자 구축물이 구축되어, 본 발명의 세균을 구축할 수 있다. 이종 단백질 유전자 등의, 본 발명에 사용되는 유전자 구축물의 일부의 염색체로의 도입은, 본 발명에 사용되는 유전자 구축물의 염색체로의 도입과 마찬가지로 행할 수 있다.
본 발명에 사용되는 유전자 구축물이나 그 구성 요소(프로모터 서열, 시그널 펩타이드를 코드하는 핵산 서열, 이종 단백질을 코드하는 핵산 서열 등)는, 예를 들면, 클로닝에 의해 취득할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 목적의 이종 단백질을 갖는 생물로부터의 클로닝에 의해 이종 단백질 유전자를 취득하고, 시그널 펩타이드를 코드하는 염기서열의 도입이나 프로모터 서열의 도입 등의 개변을 행하여, 본 발명에 사용되는 유전자 구축물을 취득할 수 있다. 또한, 본 발명에 사용되는 유전자 구축물이나 그 구성 요소는, 화학 합성에 의해도 취득할 수 있다(Gene, 60(1), 115-127(1987)). 취득한 유전자 구축물이나 그 구성 요소는 그대로, 또는 적절히 개변하여 이용할 수 있다.
또한, 2 또는 그 이상의 종류의 단백질을 발현할 경우, 각 단백질의 분비 발현용의 유전자 구축물은, 목적의 이종 단백질의 분비 발현이 달성할 수 있도록 본 발명의 세균에 유지되어 있으면 좋다. 구체적으로는, 예를 들면, 각 단백질의 분비 발현용의 유전자 구축물은, 전부가 단일의 발현 벡터 위에 유지되어 있어도 좋고, 전부가 염색체 위에 유지되어 있어도 좋다. 또한, 각 단백질의 분비 발현용의 유전자 구축물은, 복수의 발현 벡터 위에 각각 유지되어 있어도 좋고, 단일 또는 복수의 발현 벡터 위와 염색체 위에 각각 유지되어 있어도 좋다. 「2 또는 그 이상의 종류의 단백질을 발현할 경우」란, 예를 들면, 2 또는 그 이상의 종류의 이종 단백질이 분비 생산되는 경우나, 헤테로 다량체 단백질이 분비 생산되는 경우를 말한다.
본 발명에 사용되는 유전자 구축물의 코리네형 세균으로의 도입 방법은 특별히 한정되지 않고, 일반적으로 사용되는 방법, 예를 들면, 프로토플라스트법(Gene, 39, 281-286(1985)), 일렉트로포레이션법(Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989)), 전기 펄스법(일본 공개특허공보 특개평2-207791호) 등을 사용할 수 있다.
<2> 이종 단백질의 제조 방법
상기한 바와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 세균을 배양하고, 이종 단백질을 발현시킴으로써, 균체 외에 분비된 다량의 이종 단백질이 얻어진다.
본 발명의 세균은 통상 사용되는 방법 및 조건에 따라 배양할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 세균은 탄소원, 질소원, 무기 이온을 함유하는 통상의 배지에서 배양할 수 있다. 또한 높은 증식을 얻기 위해서, 비타민, 아미노산 등의 유기미량 영양소를 필요에 따라 첨가할 수도 있다.
탄소원으로서는 글루코스 및 수크로스와 같은 탄수화물, 아세트산과 같은 유기산, 알코올류, 그 외를 사용할 수 있다. 질소원으로서는, 암모니아 가스, 암모니아수, 암모늄염, 그 외를 사용할 수 있다. 무기 이온으로서는, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 인산 이온, 칼륨 이온, 철 이온 등을 필요에 따라 적절히 사용한다. 배양은 pH5.0 내지 8.5, 15℃ 내지 37℃의 적절한 범위로 호기적 조건 하에서 행하고, 1 내지 7일간 정도 배양한다. 또한, 코리네형 세균의 L-아미노산 생산에서의 배양 조건이나, 그 외 Sec계 의존, Tat계 의존의 시그널 펩타이드를 사용한 단백질의 제조법에 기재된 조건을 사용할 수 있다(WO01/23591, WO2005/103278 참조). 또한, 이종 단백질의 발현을 위해 유도형 프로모터를 사용한 경우에는, 배지에 프로모터 유도제를 첨가하여 배양을 행할 수도 있다. 이러한 조건 하에서 본 발명의 세균을 배양함으로써, 목적 단백질은 균체 내에서 다량으로 생산되어 효율적으로 균체 외에 분비된다. 또한, 본 발명의 방법에 의하면, 생산된 이종 단백질은 균체 외에 분비되기 때문에, 예를 들면 트랜스글루타미나아제 등의 미생물의 균체 내에서 다량으로 축적하면 일반적으로 치사적인 단백질도, 치사적 영향을 받지 않고 연속적으로 생산할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 배지 중에 분비된 단백질은, 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 배양 후의 배지로부터 분리 정제할 수 있다. 예를 들면, 균체를 원심분리 등에 의해 제거한 후, 염석, 에탄올 침전, 한외 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 아피니티 크로마토그래피, 중고압 액체 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피 등의 알려진 적절한 방법, 또는 이들을 조합함으로써 분리 정제할 수 있다. 또한, 어떤 경우에는, 배양물이나 배양 상청을 그대로 사용해도 좋다. 본 발명의 방법에 의해 균체 표층에 분비된 단백질도 당업자에게 잘 알려진 방법, 예를 들면 염 농도의 상승, 계면활성제의 사용 등에 의해 가용화한 후에, 배지 중에 분비된 경우와 마찬가지로 하여 분리 정제할 수 있다. 또한, 어떤 경우에는, 균체 표층에 분비된 단백질을 가용화하지 않고, 예를 들면 고정화 효소로서 사용해도 좋다.
목적의 이종 단백질이 분비 생산된 것은, 배양 상청 및/또는 균체 표층을 포함하는 분획을 시료로 하여 SDS-PAGE를 행하고, 분리된 단백질 밴드의 분자량을 확인함으로써 확인할 수 있다. 또한, 목적의 이종 단백질이 분비 생산된 것은, 배양 상청 및/또는 균체 표층을 포함하는 분획을 시료로 하여, 항체를 사용한 웨스턴 블로트에 의해 확인할 수 있다(Molecular cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(USA), 2001)). 또한, 목적의 이종 단백질이 분비 생산된 것은, 프로테인 시퀀서(protein sequencer)를 사용하여 목적 단백질의 N 말단 아미노산 서열을 검출함으로써 확인할 수 있다. 또한, 목적의 이종 단백질이 분비 생산된 것은, 질량 분석계를 사용하여 목적 단백질의 질량을 결정함으로써 확인할 수 있다. 또한, 목적의 이종 단백질이 효소나 어떤 측정 가능한 생리활성을 갖는 것인 경우에는, 목적의 이종 단백질이 분비 생산된 것은, 배양 상청 및/또는 균체 표층을 포함하는 분획을 시료로 하여, 목적의 이종 단백질의 효소활성 또는 생리활성을 측정함으로써 확인할 수 있다.
실시예
본 발명은 이하의 실시예에 의해 더 구체적으로 설명되지만, 이들은 어떤 의미에서도 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
참고예 1: 씨. 글루타미쿰 YDK010주 유래의 PhoS 변이주의 취득
(1) phoS 유전자에 변이를 갖는 자연 변이주의 취득
WO2014/126260에 기재된, 생리활성 펩타이드인 테리파라타이드의 분비 발현 플라스미드 pPKK50TEV-Teri를 사용하여, WO2002/081694에 기재된 씨. 글루타미쿰 YDK010주를 형질 전환하였다. 또한, pPKK50TEV-Teri는 생리활성 펩타이드인 테리파라타이드의 분비 발현용 벡터로서, 씨. 글루타미쿰 ATCC13869주의 cspB 유전자의 프로모터 영역, 이 프로모터의 하류에 발현 가능하게 연결된 이 주(株)의 CspB시그널 펩타이드, 이 주(株)의 성숙 CspB의 N 말단 50 아미노산 잔기, ProTEV 프로테아제의 인식 서열 ENLYFQ, 및 테리파라타이드의 융합 단백질(이하, CspB50TEV-Teri라고 표기함)을 코드하는 염기서열을 갖는 플라스미드가다(WO2014/126260). 씨. 글루타미쿰 YDK010주는, 씨. 글루타미쿰 AJ12036(FERM BP-734)의 세포 표층 단백질 CspB의 결손주이다(WO2002/081694). 얻어지는 형질 전환체를, 25mg/L의 카나마이신을 포함하는 CM-Dex 한천 배지(글루코스 5g, 황산마그네슘 7수화물 0.4g, 황산철 7수화물 0.01g, 황산망간 5수화물 0.01g, 인산 2수소칼륨 1g, 비오틴 10㎍, Difco TM Select Soytone(Becton Dickinson) 10g, BactoTM Yeast Extract(Becton Dickinson) 10g, 요소 3g, 대두염산 가수분해액(전체 질소량 1.2g), 한천분말 20g, 물로 1L로 하여 pH6.5로 조정) 위에서 30℃로 배양하여 콜로니를 형성시켰다.
배양 후, phoS 유전자에 변이가 도입된 자연 변이주를 선택하고, YDK0107주라고 명명하였다. YDK0107주가 갖는 변이형 phoS 유전자의 염기서열, 및 이 유전자가 코드하는 변이형 PhoS 단백질의 아미노산 서열을, <서열번호 01> 및 <서열번호 02>에 나타낸다. YDK0107주의 변이형 phoS 유전자에서는, YDK010주의 야생형 phoS 유전자의 염기서열<서열번호 03>에서의 906 위치의 G가 T로 변이하고 있다. 이 변이에 의해, YDK0107주의 변이형 PhoS 단백질에서는, YDK010주의 phoS 유전자에 의해 코드되는 야생형 PhoS 단백질의 아미노산 서열<서열번호 04>에서의 302 위치의 트립토판 잔기가 시스테인 잔기로 치환되어 있다. 이 변이를 PhoS(W302C) 변이라고 명명하였다. 한편, 게놈 DNA의 조제는 PurEluteTM 게놈 DNA 키트(EdgeBio)를 사용하고, 염기서열의 결정은 BigDye(R) 터미네이터 3.1 사이클 서열분석 키트(Applied Biosystems)와 3130 유전학적 분석기(Applied Biosystems)를 사용하여 행하였다.
(2) 변이형 PhoS(W302C)를 코드하는 phoS 유전자 치환용 벡터의 구축
<서열번호 05> 및 <서열번호 06>에 기재된 프라이머를 사용하여, PurEluteTM 게놈 DNA 키트(EdgeBio)를 사용하여 조제한 씨. 글루타미쿰 YDK0107주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 변이형 PhoS(W302C)를 코드하는 phoS 유전자(변이형 phoS 유전자 또는 변이형 phoS(W302C) 유전자라고도 함)를 포함하는 약 1.5kbp의 영역을 PCR법에 의해 증폭하였다. PCR 반응에는 Pyrobest(R) DNA 폴리머라제(Takara Bio)를 사용하고, 반응 조건은 업자가 권장하는 프로토콜에 따랐다.
다음에, 증폭한 약 1.5kbp의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동 후, 목적의 밴드를 잘라내고, Wizard(R) SV Gel 및 PCR Clean-Up System(Promega)을 사용하여 겔에서 회수하였다. 회수한 DNA 단편을 WO2006/057450에 기재된 pBS5T의 SmaI 부위에 삽입한 후, E. coli JM109(Takara Bio)의 컴피턴트 셀에 도입하였다. 변이형 phoS 유전자를 포함하는 DNA 단편이 클론화된 플라스미드를 유지하는 균주를 취득하고, 이것에서 플라스미드를 회수하고, 변이형 phoS 유전자가 클론화된 플라스미드 pBS5T-phoS(W302C)를 얻었다. 삽입 단편의 염기서열 결정의 결과, 예상대로의 유전자가 클론화되어 있는 것을 확인하였다. 염기서열의 결정은 BigDye(R) 터미네이터 3.1 사이클 서열분석 키트(Applied Biosystems)와 3130 유전학적 분석기(Applied Biosystems)를 사용하여 행하였다.
(3) YDK010주에서의 PhoS(W302C) 변이 치환주의 구축
참고예 1(2)에서 구축한 플라스미드 pBS5T-phoS(W302C)로 WO2002/081694에 기재된 씨. 글루타미쿰 YDK010주를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환체로부터 WO2006/057450에 기재된 방법에 따라 균주의 선택을 행하고, 염색체상의 야생형 phoS 유전자가 변이형 phoS 유전자로 치환된 YDK010::phoS(W302C)주를 얻었다. 또한, YDK010::phoS(W302C)주는 YDK0107주의 염색체 DNA를 사용하지 않더라도, 예를 들면 유전자 공학적으로 취득한 변이형 phoS 유전자 단편 등을 이용하여 재현적으로 구축할 수 있다.
실시예 1: 2성분 제어계 반응 조절인자 유전자 hrrA를 결손시킨 Corynebacterium glutamicum의 구축
(1) hrrA 유전자 결손용 벡터 pBS5TΔhrrA의 구축
씨. 글루타미쿰 ATCC13869주의 게놈 서열 및 2성분 제어계 HrrSA의 반응 조절인자 HrrA를 코드하는 hrrA 유전자의 염기서열은 이미 결정되어 있다(GenBank Accession No. AP017557, NCBI locus_tag CGBL_0128750).
PurEluteTM 게놈 DNA 키트(EdgeBio)를 사용하여 조제한 씨. 글루타미쿰 ATCC13869주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, <서열번호 07>과 <서열번호 08>의 프라이머를 사용하여 hrrA 유전자의 5'측 상류 약 1kbp를, <서열번호 09>와 <서열번호 10>의 프라이머를 사용하여 hrrA 유전자의 3'측 하류 약 1kbp의 영역을, 각각 PCR법에 의해 증폭하였다. PCR에는 Pyrobest(R) DNA 폴리머라제(Takara Bio)를 사용하고, 반응 조건은 업자가 권장하는 프로토콜에 따랐다. 증폭한 각각 약 1kbp의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동 후, 목적의 밴드를 잘라내고, Wizard(R) SV Gel 및 PCR Clean-Up System(Promega)을 사용하여 겔에서 회수하였다. 회수한 2개의DNA 단편을, 인퓨젼 반응에 의해 WO2006/057450에 기재된 pBS5T의 SmaI 부위에 삽입함으로써, hrrA 유전자 결손용 벡터 pBS5TΔhrrA를 얻었다. 인퓨젼 반응에는 In-Fusion(R) HD Cloning Kit(Takara Bio)를 사용하고, 반응 조건은 업자가 권장하는 프로토콜에 따랐다.
(2) YDK010주 및 YDK010::phoS(W302C)주의 hrrA 유전자 결손주의 구축
실시예 1(1)에서 구축한 pBS5TΔhrrA로, WO2002/081694에 기재된 씨. 글루타미쿰 YDK010주 및 참고예 1(3)에서 구축한 YDK010::phoS(W302C)주의 각각을 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환체로부터 WO2006/057450에 기재된 방법에 따라 균주의 선택을 행하고, hrrA 유전자가 결손된 YDK010ΔhrrA주 및 YDK010::phoS(W302C)ΔhrrA주를 얻었다.
실시예 2: 2성분 제어계 반응 조절인자 유전자 hrrA를 결손시킨 Corynebacterium glutamicum을 사용한 단백질 L의 분비 발현
(1) 단백질 L의 분비 발현 플라스미드의 구축
Finegoldia magna 유래 면역글로블린 결합 단백질인 단백질 L의 아미노 서열은 이미 결정되어 있다(GenBank Accession No. AAA25612). 단백질 L은, 시그널 펩타이드(N 말단측 1잔기째부터 18잔기째)와 성숙 펩타이드(19잔기째부터 719잔기째)로 이루어지고, 성숙 펩타이드의 N 말단측에는 5개의 항체 결합 도메인이 존재한다. 단백질 L의 성숙 펩타이드 중 5개의 항체 결합 도메인(19잔기째부터 463잔기째)의 아미노산 서열을 <서열번호 11>에 나타낸다. 씨. 글루타미쿰의 코돈 사용 빈도를 고려하여, 단백질 L의 항체 결합 도메인을 코드하는 염기서열을 디자인하였다. 디자인한 염기서열을 <서열번호 12>에 나타낸다.
다음에, 씨. 글루타미쿰 ATCC13869주 유래의 cspB 유전자의 프로모터의 하류에 C. ammoniagenes ATCC6872주 유래의 CspA(SlpA라고도 함) <GenBank Accession No. BAB62413>의 시그널 펩타이드 25 아미노산 잔기를 코드하는 DNA 및 <서열번호 12>에 기재된 DNA를 연결하고, 또한 5'-측에 KpnI 사이트를, 3'-측에 BamHI 사이트를 부가한 시그널 펩타이드와 단백질 L의 항체 결합 도메인과의 융합 단백질(이하, 단지 단백질 L로 표기함)의 발현 카세트를 전부 합성하였다. 전부 합성한 DNA 단편을 제한 효소 KpnI 및 BamHI로 처리한 후에, 일본 공개특허공보 특개평9-322774에 기재된 pPK4의 KpnI-BamHI 부위에 삽입함으로써, 단백질 L의 분비 발현 플라스미드인 pPK4_CspAss_단백질 L을 구축하였다. 삽입 단편의 염기서열 결정의 결과, 예상대로의 단백질 L을 코드하는 유전자가 구축되어 있는 것을 확인하였다. 염기서열의 결정은 BigDye(R) 터미네이터 3.1 사이클 서열분석 키트(Applied Biosystems)와 3130 유전학적 분석기(Applied Biosystems)를 사용하여 행하였다.
(2) 2성분 제어계 반응 조절인자 유전자 hrrA의 결손주를 사용한 단백질 L의 분비 발현
실시예 2(1)에서 얻어진 단백질 L의 분비 발현 플라스미드 pPK4_CspAss_단백질L을 사용하여, WO2002/081694에 기재된 씨. 글루타미쿰 YDK010주 및 실시예 1(2)에서 얻어진 YDK010ΔhrrA주의 각각을 형질 전환하고, YDK010/pPK4_CspAss_단백질L주 및 YDK010ΔhrrA/pPK4_CspAss_단백질L주를 얻었다. 얻어진 각 형질 전환체를, 25mg/L의 카나마이신을 포함하는 MMTG 액체 배양지(글루코스 120g, 황산마그네슘 7수화물 3g, 황산암모늄 30g, 인산 2수소칼륨 1.5g, 황산철 7수화물 0.03g, 황산망간 5수화물 0.03g, 티아민염산염 0.45mg, 비오틴 0.45mg, DL-메티오닌 0.15g, 대두염산 가수분해액(전체 질소량 0.2g), 탄산칼슘 50g, 물로 1L로 하여 pH7.0으로 조정)에서 각각 30℃, 72시간 배양하였다. 배양 종료 후, 각 배양액을 원심분리하여 얻어진 배양 상청 3.0μL을 환원 SDS-PAGE에 제공하고나서 SYPRO Ruby(Life technologies)로 염색을 행하였다. 그 결과, YDK010ΔhrrA주에서는 YDK010주와 비교하여, 단백질 L 분비량이 현저하게 향상되어 있었다(도 1). 염색 후, 화상 해석 소프트 Multi Gauge(FUJIFILM)를 사용하여 단백질 L의 밴드 강도의 수치화를 행하고, YDK010ΔhrrA주에서 단백질 L을 발현시켰을 때의 밴드 강도의 평균값을, YDK010주에서 단백질 L을 발현시켰을 때의 밴드 강도의 평균값을 1로 했을 때의 상대값으로서 산출하였다. 그 결과, YDK010ΔhrrA주에서는 YDK010주와 비교하여, 단백질 L 분비량이 약 2.0배로 향상되고 있는 것이 확인되었다(표 1). 이러한 사실로, ΔhrrA 변이(hrrA 유전자의 결손)는, Sec계의 CspA 분비 시그널을 사용한 단백질 L 분비 생산에 있어서, 분비량 향상을 초래하는 유효 변이인 것이 명확해졌다.
[표 1]
Figure 112019051567828-pct00001
실시예 3: 2성분 제어계 반응 조절인자 유전자 hrrA를 결손시킨 Corynebacterium glutamicum을 사용한 간-유형 지방산-결합 단백질(LFABP)의 분비 발현
(1) CspB의 성숙 단백질의 N 말단 6 아미노산 잔기를 융합한 간-유형 지방산-결합 단백질(LFABP)의 분비 발현 플라스미드의 구축
인간의 간-유형 지방산-결합 단백질(이하, LFABP로 표기함)의 아미노산 서열은 이미 결정되어 있다(RefSeq Accession No. NP_001434). 이 아미노산 서열을 <서열번호 13>에 나타내었다. 씨. 글루타미쿰의 코돈 사용 빈도를 고려하여, LFABP를 코드하는 염기서열을 디자인하였다. 또한, 씨. 글루타미쿰 ATCC13869주 유래의 CspB의 시그널 펩타이드 30 아미노산 잔기, 이 주(株) 유래의 CspB 성숙 단백질의 N 말단 6 아미노산 잔기, 인자 Xa 프로테아제의 인식 서열IEGR, 및 LFABP의 융합 단백질(이하, CspB6Xa-LFABP로 표기함)과, 그 융합 단백질을 코드하는 염기서열을 디자인하였다. 디자인한 융합 단백질을 코드하는 염기서열을 <서열번호 14>에, 융합 단백질의 아미노산 서열을 <서열번호 15>에 나타내었다.
다음에, <서열번호 14>에 기재된 DNA의 상류에 씨. 글루타미쿰 ATCC13869주 유래의 cspB 유전자의 프로모터를 연결하고, 또한 5'-측과 3'-측의 양단에 KpnI 사이트를 부가한 CspB6Xa-LFABP의 발현 카세트를 전부 합성하였다. 전부 합성한 DNA 단편을 제한 효소 KpnI 처리 후에, 일본 공개특허공보 특개평9-322774에 기재된 pPK4의 KpnI 부위에 삽입함으로써, CspB6Xa-LFABP의 분비 발현 플라스미드인 pPK4_CspB6Xa-LFABP를 구축하였다. 삽입 단편의 염기서열 결정의 결과, 예상대로의 CspB6Xa-LFABP를 코드하는 유전자가 구축되어 있는 것을 확인하였다. 염기서열의 결정은 BigDye(R) 터미네이터 3.1 사이클 서열분석 키트(Applied Biosystems)와 3130 유전학적 분석기(Applied Biosystems)를 사용하여 행하였다.
(2) 2성분 제어계 반응 조절인자 유전자 hrrA의 결손주를 사용한 간-유형 지방산-결합 단백질(LFABP)의 분비 발현
실시예 3(1)에서 얻어진 CspB6Xa-LFABP의 분비 발현 플라스미드 pPK4_CspB6Xa-LFABP를 사용하여, 참고예 1(3)에서 얻어진 YDK010::phoS(W302C)주 및 실시예 1(2)에서 얻어진 YDK010::phoS(W302C)ΔhrrA주의 각각을 형질 전환하고, YDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspB6Xa-LFABP주 및 YDK010::phoS(W302C)ΔhrrA/pPK4_CspB6Xa-LFABP주를 얻었다. 얻어진 각 형질 전환체를, 25mg/L의 카나마이신을 포함하는 MMTG 액체 배양지(글루코스 120g, 황산마그네슘 7수화물 3g, 황산암모늄 30g, 인산 2수소칼륨 1.5g, 황산철 7수화물 0.03g, 황산망간 5수화물 0.03g, 티아민염산염 0.45mg, 비오틴 0.45mg, DL-메티오닌 0.15g, 대두염산 가수분해액(전체 질소량 0.2g), 탄산칼슘 50g, 물로 1L로 하여 pH7.0으로 조정)에서 각각 30℃, 72시간 배양하였다. 배양 종료 후, 각 배양액을 원심분리하여 얻어진 배양 상청 2.0μL을 환원 SDS-PAGE에 제공하고나서 SYPRO Ruby(Life technologies)로 염색을 행하였다. 그 결과, YDK010::phoS(W302C)ΔhrrA주에서는 YDK010::phoS(W302C)주와 비교하여, CspB6Xa-LFABP 분비량이 현저하게 향상되어 있었다(도 2). 염색 후, 화상 해석 소프트 Multi Gauge(FUJIFILM)를 사용하여 CspB6Xa-LFABP의 밴드 강도의 수치화를 행하고, YDK010::phoS(W302C)ΔhrrA주에서 CspB6Xa-LFABP를 발현시켰을 때의 밴드 강도의 평균값을, YDK010::phoS(W302C)주에서 CspB6Xa-LFABP를 발현시켰을 때의 밴드 강도의 평균값을 1로 했을 때의 상대값으로서 산출하였다. 그 결과, YDK010::phoS(W302C)ΔhrrA주에서는 YDK010::phoS(W302C)주와 비교하여, CspB6Xa-LFABP 분비량이 약 1.3배로 향상되고 있는 것이 확인되었다(표 2). 이러한 사실로, ΔhrrA 변이(hrrA 유전자의 결손)는, Sec계의 CspB 분비 시그널을 사용한, YDK010::phoS(W302C)주에서의 CspB6Xa-LFABP 분비 생산에 있어서도, 분비량 향상을 초래하는 유효 변이인 것이 명확해졌다.
[표 2]
Figure 112019051567828-pct00002
실시예 4: 2성분 제어계 반응 조절인자 유전자 hrrA를 결손시킨 Corynebacterium glutamicum을 사용한 녹색 형광 단백질(GFP)의 분비 발현
(1) Tat계 분비 장치를 코드하는 tatABC 유전자와 TorA 시그널 서열이 부가된 녹색 형광 단백질(GFP)을 코드하는 유전자의 공발현 플라스미드의 구축
(a) pPK4 벡터 중의 NaeI 인식 사이트를 개변한 벡터(pPK5)의 구축
일본 공개특허공보 특개평9-322774에 기재된 pPK4 중에는, 제한 효소 NaeI의 인식 서열이 1군데 존재한다. 이 서열을 개변하기 위해서, NaeI 인식 서열 gccggc를 gcaggc로 개변한 서열과 pPK4에서의 그 주변 서열을 포함하는 <서열번호 16> 및 <서열번호 17>에 기재된 프라이머를 합성하였다. 다음에, pPK4를 주형으로 하여, <서열번호 16>과 <서열번호 17>의 프라이머를 사용하여, 약 5.6kbp의 플라스미드 전체 길이를 PCR법에 의해 증폭하였다. PCR 반응에는 Pyrobest(R) DNA 폴리머라제(Takara Bio)를 사용하고, 반응 조건은 95℃ 5분, (95℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 12분)×12사이클로 행하였다.
다음에, 얻어진 PCR 산물을 제한 효소 DpnI로 처리하고, 메틸화되어 있는 주형 DNA를 소화(消化)하였다. DpnI 소화 후에 얻어진 비메틸화 플라스미드를, E. coli JM109(Takara Bio)의 컴피턴트 셀에 도입하여 플라스미드를 취득하였다. 염기서열 결정의 결과, 예상대로 NaeI 인식 사이트가 개변된 플라스미드가 구축되어 있는 것을 확인하였다. 염기서열의 결정은 BigDye(R) 터미네이터 3.1 사이클 서열분석 키트(Applied Biosystems)와 3130 유전학적 분석기(Applied Biosystems)를 사용하여 행하였다. 이렇게 하여 얻어진, pPK4 벡터 중의 NaeI 인식 사이트를 개변한 벡터를 pPK5라고 명명하였다.
(b) pPK5 벡터에 tatABC 유전자를 탑재한 벡터(pPK5-tatABC)의 구축
다음에, WO2005/103278에 기재된 Tat계 분비 장치의 증폭 플라스미드인 pVtatABC을 주형으로 하여, <서열번호 18>과 <서열번호 19>의 프라이머를 사용하여, tatABC 유전자를 코드하는 서열을 포함하는 약 3.7kbp의 DNA 단편을 PCR법에 의해 증폭하였다. <서열번호 19>의 프라이머에는 제한 효소 KpnI와 ApaI의 인식 서열이 디자인되어 있다. PCR에는 Pyrobest(R) DNA 폴리머라제(Takara Bio)를 사용하고, 반응 조건은 업자가 권장하는 프로토콜에 따랐다. 이 DNA 단편의 말단을 BKL Kit(Takara Bio)를 사용하여 인산화하고, 별도 KpnI 처리하고, 또한 BKL Kit(Takara Bio)를 사용하여 평활 말단화하고, 또한 CIAP(Takara Bio)를 사용하여 말단을 탈인산화 처리한 pPK5 벡터에 삽입함으로써, tatABC 유전자 탑재 벡터인 pPK5-tatABC을 구축하였다. 라이게이션 반응에는 DNA Ligation Kit Ver.2.1(Takara Bio)을 사용하고, 반응 조건은 업자가 권장하는 프로토콜에 따랐다. 삽입 단편의 염기서열 결정의 결과, 예상대로의 유전자가 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 염기서열의 결정은 BigDye(R) 터미네이터 3.1 사이클 서열분석 키트(Applied Biosystems)와 3130 유전학적 분석기(Applied Biosystems)를 사용하여 행하였다.
(c) pPK5-tatABC 벡터 중의 tatABC 유전자 내의 KpnI 및 XbaI 인식 사이트를 개변한 벡터(pPK6)의 구축
(b)에서 구축한 pPK5-tatABC 플라스미드 중의 tatABC 유전자 영역 중에는, 제한 효소 KpnI 및 XbaI의 인식 서열이 1군데씩 존재한다. 이들의 서열을 개변하기 위해서, KpnI 인식 서열 ggtacc를 ggaacc로 개변한 서열과 pPK5-tatABC에서의 그 주변 서열을 포함하는 <서열번호 20> 및 <서열번호 21>에 기재된 프라이머와, XbaI 인식 서열 tctaga를 tgtaga로 개변한 서열과 pPK5-tatABC에서의 그 주변 서열을 포함하는 <서열번호 22> 및 <서열번호 23>에 기재된 프라이머를 합성하였다.
우선, pPK5-tatABC을 주형으로 하여, <서열번호 20>과 <서열번호 21>의 프라이머를 사용하여, tatABC 유전자 영역 내의 KpnI 인식 사이트를 개변하도록 약 9.4kbp의 플라스미드 전체 길이를 PCR법에 의해 증폭하였다. PCR 반응에는 Pyrobest(R) DNA 폴리머라제(Takara Bio)를 사용하고, 반응 조건은 95℃ 5분, (95℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 12분)×12사이클로 행하였다.
다음에, 얻어진 PCR 산물을 제한 효소 DpnI로 처리하고, 메틸화되어 있는 주형 DNA를 소화하였다. DpnI 소화 후에 얻어진 비메틸화 플라스미드를, E. coli JM109(Takara Bio)의 컴피턴트 셀에 도입하여 플라스미드를 취득하였다. 이렇게 하여 tatABC 유전자 영역 내의 KpnI 인식 사이트를 개변한 벡터인 pPK5-tatABCΔKpnI를 구축하였다.
다음에, pPK5-tatABCΔKpnI를 주형으로 하여, <서열번호 22>와 <서열번호 23>의 프라이머를 사용하여, tatABC 유전자 영역 내의 XbaI 인식 사이트를 개변하도록 약 9.4kbp의 플라스미드 전체 길이를 PCR법에 의해 증폭하였다. PCR 반응에는 Pyrobest(R) DNA 폴리머라제(Takara Bio)를 사용하고, 반응 조건은 95℃ 5분, (95℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 12분)×12사이클로 행하였다.
다음에, 얻어진 PCR 산물을 제한 효소 DpnI로 처리하고, 메틸화되어 있는 주형 DNA를 소화하였다. DpnI 소화 후에 얻어진 비메틸화 플라스미드를, E. coli JM109(Takara Bio)의 컴피턴트 셀에 도입하여 플라스미드를 취득하였다. 이렇게 하여 tatABC 유전자 영역 내의 XbaI 인식 서열을 개변한 벡터인 pPK5-tatABCΔKpnIΔXbaI를 취득하였다. 염기서열 결정의 결과, 예상대로의 유전자가 구축되어 있는 것을 확인하였다. 염기서열의 결정은 BigDye(R) 터미네이터 3.1 사이클 서열분석 키트(Applied Biosystems)와 3130 유전학적 분석기(Applied Biosystems)를 사용하여 행하였다.
이렇게 하여 얻어진, pPK4 벡터를 기초로 한 tatABC 유전자 탑재 벡터를 pPK6이라고 명명하였다.
(d) pPK6 벡터를 사용한 녹색 형광 단백질(GFP)의 분비 발현 플라스미드의 구축
Appl. Environ. Microbiol., 72, 7183-7192(2006)에 기재된 pPTGFP를 주형으로 하여, <서열번호 24>와 <서열번호 25>의 프라이머를 사용하여, 씨. 글루타미쿰 ATCC13869주 유래의 cspB 유전자의 프로모터 영역, E. coli 유래의 TorA 시그널 서열을 코드하는 염기서열, GFP를 코드하는 염기서열을 포함하는 약 1.4kbp의 DNA 단편을 PCR법에 의해 증폭하였다. PCR에는 Pyrobest(R) DNA 폴리머라제(Takara Bio)를 사용하고, 반응 조건은 업자가 권장하는 프로토콜에 따랐다. 증폭한 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동 후, 목적의 밴드를 잘라내고, Wizard(R) SV Gel 및 PCR Clean-Up System(Promega)을 사용하여 겔에서 회수하였다. 회수한 DNA 단편을, 인퓨젼 반응에 의해 실시예 3(1)(c)에 기재된 pPK6의 KpnI 부위에 삽입함으로써 녹색 형광 단백질(GFP)의 분비 발현 플라스미드 pPK6_T_GFP를 얻었다. 인퓨젼 반응에는 In-Fusion(R) HD Cloning Kit(Takara Bio)를 사용하고, 반응 조건은 업자가 권장하는 프로토콜에 따랐다. 삽입 단편의 염기서열 결정의 결과, 예상대로의 GFP를 코드하는 유전자가 구축되어 있는 것을 확인하였다. 염기서열의 결정은 BigDye(R) 터미네이터 3.1 사이클 서열분석 키트(Applied Biosystems)와 3130 유전학적 분석기(Applied Biosystems)를 사용하여 행하였다.
(2) 2성분 제어계 반응 조절인자 유전자 hrrA의 결손주를 사용한 녹색 형광 단백질(GFP)의 분비 발현
실시예 4(1)에서 얻어진 GFP의 분비 발현 플라스미드 pPK6_T_GFP를 사용하여, 참고예 1(3)에서 얻어진 YDK010::phoS(W302C)주 및 실시예 1(2)에서 얻어진 YDK010::phoS(W302C)ΔhrrA주의 각각을 형질 전환하고, YDK010::phoS(W302C)/pPK6_T_GFP주 및 YDK010::phoS(W302C)ΔhrrA/pPK6_T_GFP주를 얻었다. 얻어진 각 형질 전환체를, 25mg/L의 카나마이신을 포함하는 MMTG 액체 배양지(글루코스 120g, 황산마그네슘 7수화물 3g, 황산암모늄 30g, 인산 2수소칼륨 1.5g, 황산철 7수화물 0.03g, 황산망간 5수화물 0.03g, 티아민염산염 0.45mg, 비오틴 0.45mg, DL-메티오닌 0.15g, 대두염산 가수분해액(전체 질소량 0.2g), 탄산칼슘 50g, 물로 1L로 하여 pH7.0으로 조정)에서 각각 30℃, 72시간 배양하였다. 배양 종료 후, 각 배양액을 원심분리하여 얻어진 배양 상청 5.0μL을 환원 SDS-PAGE에 제공하고나서 SYPRO Orange(Life technologies)로 염색을 행하였다. 그 결과, YDK010::phoS(W302C)ΔhrrA주에서는 YDK010::phoS(W302C)주와 비교하여, GFP 분비량이 향상되어 있었다(도 3). 염색 후, 화상 해석 소프트 Multi Gauge(FUJIFILM)를 사용하여 GFP의 밴드 강도의 수치화를 행하고, YDK010::phoS(W302C)ΔhrrA주에서 GFP를 발현시켰을 때의 밴드 강도의 평균값을, YDK010::phoS(W302C)주에서 GFP를 발현시켰을 때의 밴드 강도의 평균값을 1로 했을 때의 상대값으로서 산출하였다. 그 결과, YDK010::phoS(W302C)ΔhrrA주에서는 YDK010::phoS(W302C)주와 비교하여, GFP 분비량이 약 1.6배로 향상되고 있는 것이 확인되었다(표 3). 이러한 사실로, ΔhrrA 변이(hrrA 유전자의 결손)는, Tat계의 TorA 분비 시그널을 사용한, YDK010::phoS(W302C)주에서의 GFP 분비 생산에 있어서도, 분비량 향상을 초래하는 유효 변이인 것이 명확해졌다.
여기까지의 결과로, ΔhrrA 변이는 Sec계 분비 경로에 한정되지 않고, Tat계 분비 경로에서도 이종 단백질 분비량을 유의적으로 향상시킬 수 있는 변이인 것을 알았다.
[표 3]
Figure 112019051567828-pct00003
[산업상의 이용 가능성]
본 발명에 의해 이종 단백질을 효율적으로 분비 생산할 수 있다.
〔서열표의 설명〕
서열번호 1: 씨. 글루타미쿰 YDK0107의 변이형 phoS 유전자의 염기서열
서열번호 2: 씨. 글루타미쿰 YDK0107의 변이형 PhoS 단백질의 아미노산 서열
서열번호 3: 씨. 글루타미쿰 YDK010의 야생형 phoS 유전자의 염기서열
서열번호 4: 씨. 글루타미쿰 YDK010의 야생형 PhoS 단백질의 아미노산 서열
서열번호 5 내지 10: 프라이머
서열번호 11: 단백질 L의 항체 결합 도메인의 아미노산 서열
서열번호 12: 단백질 L의 항체 결합 도메인을 코드하는 염기서열
서열번호 13: LFABP의 아미노산 서열
서열번호 14: CspB6Xa-LFABP를 코드하는 염기서열
서열번호 15: CspB6Xa-LFABP의 아미노산 서열
서열번호 16 내지 25: 프라이머
서열번호 26: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 PhoS 단백질의 아미노산 서열
서열번호 27: 씨. 글루타미쿰 ATCC 14067의 PhoS 단백질의 아미노산 서열
서열번호 28: C. callunae의 PhoS 단백질의 아미노산 서열
서열번호 29: C. crenatum의 PhoS 단백질의 아미노산 서열
서열번호 30: C. efficiens의 PhoS 단백질의 아미노산 서열
서열번호 31: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 phoR 유전자의 염기서열
서열번호 32: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 PhoR 단백질의 아미노산 서열
서열번호 33: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 cspB 유전자의 염기서열
서열번호 34: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 CspB 단백질의 아미노산 서열
서열번호 35: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 tatA 유전자의 염기서열
서열번호 36: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 TatA 단백질의 아미노산 서열
서열번호 37: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 tatB 유전자의 염기서열
서열번호 38: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 TatB 단백질의 아미노산 서열
서열번호 39: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 tatC 유전자의 염기서열
서열번호 40: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032의 TatC 단백질의 아미노산 서열
서열번호 41: TorA 시그널 펩타이드의 아미노산 서열
서열번호 42: SufI 시그널 펩타이드의 아미노산 서열
서열번호 43: PhoD 시그널 펩타이드의 아미노산 서열
서열번호 44: LipA 시그널 펩타이드의 아미노산 서열
서열번호 45: IMD 시그널 펩타이드의 아미노산 서열
서열번호 46, 47: 트윈·아르기닌 모티프의 아미노산 서열
서열번호 48: PS1 시그널 펩타이드의 아미노산 서열
서열번호 49: PS2 시그널 펩타이드의 아미노산 서열
서열번호 50: SlpA 시그널 펩타이드의 아미노산 서열
서열번호 51: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 CspB 성숙 단백질의 아미노산 서열
서열번호 52 내지 59: 본 발명에서 사용되는 삽입 서열의 일 형태의 아미노산 서열
서열번호 60: 인자 Xa 프로테아제의 인식 서열
서열번호 61: ProTEV 프로테아제의 인식 서열
서열번호 62: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 hrrS 유전자의 염기서열
서열번호 63: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 HrrS 단백질의 아미노산 서열
서열번호 64: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 hrrA 유전자의 염기서열
서열번호 65: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 HrrA 단백질의 아미노산 서열
기탁기관명 : 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허 생물기탁센터
수탁번호 : FERM BP-734
수탁일자 : 19840326
<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> PROTEIN SECRETORY PRODUCTION METHOD <130> D923-17324 <150> JP2016-206728 <151> 2016-10-21 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1458 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 atggaaaacc cttatgtcgc tgcgctcgat gacgataaaa aagaagtcgg cgcaataaaa 60 gaagcagaaa aagaacctga aataggtccc atcagagctg ccggacgagc cataccgctg 120 cgcacccgca tcattttgat cgtggtgggt atcgccgggc ttggtttgct ggtcaacgcg 180 attgctgttt ccagcctcat gcgtgaagtt tcctataccc gcatggatca agagctagag 240 acctcgatgg ggacgtgggc gcataacgtt gagctgttta atttcgatgg cgtccgccaa 300 gggccaccca gcgattatta tgtggccaag gtttttcctg atggatccag cattattttc 360 aacgatgcac aatcggcacc caatctagct gaaaccacca tcggtactgg tccacacact 420 gtggatgctg ctagcggttc tgcctccaac actccgtggc gtgtgatggc ggaaaagaac 480 ggtgacatta tcaccgtggt gggtaaaagc atggggcgtg aaacaaacct gctgtaccga 540 ttggtgatgg tgcagatgat catcggcgcg ctgattctgg ttgctatttt gattacttca 600 ctcttcctag tcagacgctc gttgcggccg ttgagagaag ttgaagagac cgccaccagg 660 attgcgggcg gtgatttgga tcgacgtgtc ccgcagtggc caatgaccac agaagtcgga 720 cagctgtcga atgccctcaa tatcatgttg gagcagctcc aagcctcaat tctgaccgcc 780 cagcaaaaag aagctcagat gcgccgattc gttggcgacg cctcccacga gctccgcaca 840 ccactgacct ctgtgaaggg cttcaccgag ctgtattcat caggtgcaac agatgatgcc 900 aactgtgtca tgtccaagat cggtggcgaa gcccaacgca tgagtgtgct tgtggaagac 960 ctcctgtcac tgacgcgtgc cgaaggccag caaatggaga agcaccgcgt tgacgtgctg 1020 gaactcgcat tggcagtacg cggatccatg cgagcagcct ggccagatcg caccgtcaac 1080 gtgtccaata aagccgagtc cattccagtt gttgaaggcg acccaacccg cctccaccaa 1140 gttctcacca acctggttgc caacggactc aaccacggcg gaccggacgc ggaagtcagc 1200 attgagatca acaccgatgg gcaaaacgtg aggattctcg tggcagacaa cggtgtcgga 1260 atgtctgaag aagatgccca gcatatcttc gagcgtttct accgcgccga ttcctcccgc 1320 tcacgcgcat ccggcggatc gggcctcggc cttgcgatca cgaaatccct ggtcgaaggc 1380 cacggcggca cagtcaccgt cgacagcgtg caaggcgaag gcacggtgtt cacgatcacc 1440 ttgccggcgg tttcttaa 1458 <210> 2 <211> 485 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Glu Asn Pro Tyr Val Ala Ala Leu Asp Asp Asp Lys Lys Glu Val 1 5 10 15 Gly Ala Ile Lys Glu Ala Glu Lys Glu Pro Glu Ile Gly Pro Ile Arg 20 25 30 Ala Ala Gly Arg Ala Ile Pro Leu Arg Thr Arg Ile Ile Leu Ile Val 35 40 45 Val Gly Ile Ala Gly Leu Gly Leu Leu Val Asn Ala Ile Ala Val Ser 50 55 60 Ser Leu Met Arg Glu Val Ser Tyr Thr Arg Met Asp Gln Glu Leu Glu 65 70 75 80 Thr Ser Met Gly Thr Trp Ala His Asn Val Glu Leu Phe Asn Phe Asp 85 90 95 Gly Val Arg Gln Gly Pro Pro Ser Asp Tyr Tyr Val Ala Lys Val Phe 100 105 110 Pro Asp Gly Ser Ser Ile Ile Phe Asn Asp Ala Gln Ser Ala Pro Asn 115 120 125 Leu Ala Glu Thr Thr Ile Gly Thr Gly Pro His Thr Val Asp Ala Ala 130 135 140 Ser Gly Ser Ala Ser Asn Thr Pro Trp Arg Val Met Ala Glu Lys Asn 145 150 155 160 Gly Asp Ile Ile Thr Val Val Gly Lys Ser Met Gly Arg Glu Thr Asn 165 170 175 Leu Leu Tyr Arg Leu Val Met Val Gln Met Ile Ile Gly Ala Leu Ile 180 185 190 Leu Val Ala Ile Leu Ile Thr Ser Leu Phe Leu Val Arg Arg Ser Leu 195 200 205 Arg Pro Leu Arg Glu Val Glu Glu Thr Ala Thr Arg Ile Ala Gly Gly 210 215 220 Asp Leu Asp Arg Arg Val Pro Gln Trp Pro Met Thr Thr Glu Val Gly 225 230 235 240 Gln Leu Ser Asn Ala Leu Asn Ile Met Leu Glu Gln Leu Gln Ala Ser 245 250 255 Ile Leu Thr Ala Gln Gln Lys Glu Ala Gln Met Arg Arg Phe Val Gly 260 265 270 Asp Ala Ser His Glu Leu Arg Thr Pro Leu Thr Ser Val Lys Gly Phe 275 280 285 Thr Glu Leu Tyr Ser Ser Gly Ala Thr Asp Asp Ala Asn Cys Val Met 290 295 300 Ser Lys Ile Gly Gly Glu Ala Gln Arg Met Ser Val Leu Val Glu Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ser Leu Thr Arg Ala Glu Gly Gln Gln Met Glu Lys His Arg 325 330 335 Val Asp Val Leu Glu Leu Ala Leu Ala Val Arg Gly Ser Met Arg Ala 340 345 350 Ala Trp Pro Asp Arg Thr Val Asn Val Ser Asn Lys Ala Glu Ser Ile 355 360 365 Pro Val Val Glu Gly Asp Pro Thr Arg Leu His Gln Val Leu Thr Asn 370 375 380 Leu Val Ala Asn Gly Leu Asn His Gly Gly Pro Asp Ala Glu Val Ser 385 390 395 400 Ile Glu Ile Asn Thr Asp Gly Gln Asn Val Arg Ile Leu Val Ala Asp 405 410 415 Asn Gly Val Gly Met Ser Glu Glu Asp Ala Gln His Ile Phe Glu Arg 420 425 430 Phe Tyr Arg Ala Asp Ser Ser Arg Ser Arg Ala Ser Gly Gly Ser Gly 435 440 445 Leu Gly Leu Ala Ile Thr Lys Ser Leu Val Glu Gly His Gly Gly Thr 450 455 460 Val Thr Val Asp Ser Val Gln Gly Glu Gly Thr Val Phe Thr Ile Thr 465 470 475 480 Leu Pro Ala Val Ser 485 <210> 3 <211> 1458 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 atggaaaacc cttatgtcgc tgcgctcgat gacgataaaa aagaagtcgg cgcaataaaa 60 gaagcagaaa aagaacctga aataggtccc atcagagctg ccggacgagc cataccgctg 120 cgcacccgca tcattttgat cgtggtgggt atcgccgggc ttggtttgct ggtcaacgcg 180 attgctgttt ccagcctcat gcgtgaagtt tcctataccc gcatggatca agagctagag 240 acctcgatgg ggacgtgggc gcataacgtt gagctgttta atttcgatgg cgtccgccaa 300 gggccaccca gcgattatta tgtggccaag gtttttcctg atggatccag cattattttc 360 aacgatgcac aatcggcacc caatctagct gaaaccacca tcggtactgg tccacacact 420 gtggatgctg ctagcggttc tgcctccaac actccgtggc gtgtgatggc ggaaaagaac 480 ggtgacatta tcaccgtggt gggtaaaagc atggggcgtg aaacaaacct gctgtaccga 540 ttggtgatgg tgcagatgat catcggcgcg ctgattctgg ttgctatttt gattacttca 600 ctcttcctag tcagacgctc gttgcggccg ttgagagaag ttgaagagac cgccaccagg 660 attgcgggcg gtgatttgga tcgacgtgtc ccgcagtggc caatgaccac agaagtcgga 720 cagctgtcga atgccctcaa tatcatgttg gagcagctcc aagcctcaat tctgaccgcc 780 cagcaaaaag aagctcagat gcgccgattc gttggcgacg cctcccacga gctccgcaca 840 ccactgacct ctgtgaaggg cttcaccgag ctgtattcat caggtgcaac agatgatgcc 900 aactgggtca tgtccaagat cggtggcgaa gcccaacgca tgagtgtgct tgtggaagac 960 ctcctgtcac tgacgcgtgc cgaaggccag caaatggaga agcaccgcgt tgacgtgctg 1020 gaactcgcat tggcagtacg cggatccatg cgagcagcct ggccagatcg caccgtcaac 1080 gtgtccaata aagccgagtc cattccagtt gttgaaggcg acccaacccg cctccaccaa 1140 gttctcacca acctggttgc caacggactc aaccacggcg gaccggacgc ggaagtcagc 1200 attgagatca acaccgatgg gcaaaacgtg aggattctcg tggcagacaa cggtgtcgga 1260 atgtctgaag aagatgccca gcatatcttc gagcgtttct accgcgccga ttcctcccgc 1320 tcacgcgcat ccggcggatc gggcctcggc cttgcgatca cgaaatccct ggtcgaaggc 1380 cacggcggca cagtcaccgt cgacagcgtg caaggcgaag gcacggtgtt cacgatcacc 1440 ttgccggcgg tttcttaa 1458 <210> 4 <211> 485 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 Met Glu Asn Pro Tyr Val Ala Ala Leu Asp Asp Asp Lys Lys Glu Val 1 5 10 15 Gly Ala Ile Lys Glu Ala Glu Lys Glu Pro Glu Ile Gly Pro Ile Arg 20 25 30 Ala Ala Gly Arg Ala Ile Pro Leu Arg Thr Arg Ile Ile Leu Ile Val 35 40 45 Val Gly Ile Ala Gly Leu Gly Leu Leu Val Asn Ala Ile Ala Val Ser 50 55 60 Ser Leu Met Arg Glu Val Ser Tyr Thr Arg Met Asp Gln Glu Leu Glu 65 70 75 80 Thr Ser Met Gly Thr Trp Ala His Asn Val Glu Leu Phe Asn Phe Asp 85 90 95 Gly Val Arg Gln Gly Pro Pro Ser Asp Tyr Tyr Val Ala Lys Val Phe 100 105 110 Pro Asp Gly Ser Ser Ile Ile Phe Asn Asp Ala Gln Ser Ala Pro Asn 115 120 125 Leu Ala Glu Thr Thr Ile Gly Thr Gly Pro His Thr Val Asp Ala Ala 130 135 140 Ser Gly Ser Ala Ser Asn Thr Pro Trp Arg Val Met Ala Glu Lys Asn 145 150 155 160 Gly Asp Ile Ile Thr Val Val Gly Lys Ser Met Gly Arg Glu Thr Asn 165 170 175 Leu Leu Tyr Arg Leu Val Met Val Gln Met Ile Ile Gly Ala Leu Ile 180 185 190 Leu Val Ala Ile Leu Ile Thr Ser Leu Phe Leu Val Arg Arg Ser Leu 195 200 205 Arg Pro Leu Arg Glu Val Glu Glu Thr Ala Thr Arg Ile Ala Gly Gly 210 215 220 Asp Leu Asp Arg Arg Val Pro Gln Trp Pro Met Thr Thr Glu Val Gly 225 230 235 240 Gln Leu Ser Asn Ala Leu Asn Ile Met Leu Glu Gln Leu Gln Ala Ser 245 250 255 Ile Leu Thr Ala Gln Gln Lys Glu Ala Gln Met Arg Arg Phe Val Gly 260 265 270 Asp Ala Ser His Glu Leu Arg Thr Pro Leu Thr Ser Val Lys Gly Phe 275 280 285 Thr Glu Leu Tyr Ser Ser Gly Ala Thr Asp Asp Ala Asn Trp Val Met 290 295 300 Ser Lys Ile Gly Gly Glu Ala Gln Arg Met Ser Val Leu Val Glu Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ser Leu Thr Arg Ala Glu Gly Gln Gln Met Glu Lys His Arg 325 330 335 Val Asp Val Leu Glu Leu Ala Leu Ala Val Arg Gly Ser Met Arg Ala 340 345 350 Ala Trp Pro Asp Arg Thr Val Asn Val Ser Asn Lys Ala Glu Ser Ile 355 360 365 Pro Val Val Glu Gly Asp Pro Thr Arg Leu His Gln Val Leu Thr Asn 370 375 380 Leu Val Ala Asn Gly Leu Asn His Gly Gly Pro Asp Ala Glu Val Ser 385 390 395 400 Ile Glu Ile Asn Thr Asp Gly Gln Asn Val Arg Ile Leu Val Ala Asp 405 410 415 Asn Gly Val Gly Met Ser Glu Glu Asp Ala Gln His Ile Phe Glu Arg 420 425 430 Phe Tyr Arg Ala Asp Ser Ser Arg Ser Arg Ala Ser Gly Gly Ser Gly 435 440 445 Leu Gly Leu Ala Ile Thr Lys Ser Leu Val Glu Gly His Gly Gly Thr 450 455 460 Val Thr Val Asp Ser Val Gln Gly Glu Gly Thr Val Phe Thr Ile Thr 465 470 475 480 Leu Pro Ala Val Ser 485 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aggcagcaaa acaccgagga ctcaa 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgggcttggt ttgctggtca acgcg 25 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gaattgggca tcgtccacga aa 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 caacgatcag gattgtcgtc atg 23 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 catgacgaca atcctgatcg ttggcgtgga ttgggctaca aattc 45 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gctaattatg ggcatccaag gg 22 <210> 11 <211> 445 <212> PRT <213> Finegoldia magna <400> 11 Ala Asp Glu Pro Ile Asp Leu Glu Lys Leu Glu Glu Lys Arg Asp Lys 1 5 10 15 Glu Asn Val Gly Asn Leu Pro Lys Phe Asp Asn Glu Val Lys Asp Gly 20 25 30 Ser Glu Asn Pro Met Ala Lys Tyr Pro Asp Phe Asp Asp Glu Ala Ser 35 40 45 Thr Arg Phe Glu Thr Glu Asn Asn Glu Phe Glu Glu Lys Lys Val Val 50 55 60 Ser Asp Asn Phe Phe Asp Gln Ser Glu His Pro Phe Val Glu Asn Lys 65 70 75 80 Glu Glu Thr Pro Glu Thr Pro Glu Thr Asp Ser Glu Glu Glu Val Thr 85 90 95 Ile Lys Ala Asn Leu Ile Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gln Thr Ala Glu 100 105 110 Phe Lys Gly Thr Phe Glu Lys Ala Thr Ser Glu Ala Tyr Ala Tyr Ala 115 120 125 Asp Thr Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp 130 135 140 Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Lys Glu Lys Thr Pro 145 150 155 160 Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala 165 170 175 Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala 180 185 190 Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Ala Leu Lys Lys Asp Asn Gly 195 200 205 Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys 210 215 220 Phe Ala Gly Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr 225 230 235 240 Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu 245 250 255 Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala 260 265 270 Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp 275 280 285 Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Lys Glu Lys Thr Pro 290 295 300 Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala 305 310 315 320 Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Ala Glu Ala 325 330 335 Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly 340 345 350 Lys Tyr Thr Ala Asp Leu Glu Asp Gly Gly Tyr Thr Ile Asn Ile Arg 355 360 365 Phe Ala Gly Lys Lys Val Asp Glu Lys Pro Glu Glu Lys Glu Gln Val 370 375 380 Thr Ile Lys Glu Asn Ile Tyr Phe Glu Asp Gly Thr Val Gln Thr Ala 385 390 395 400 Thr Phe Lys Gly Thr Phe Ala Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr 405 410 415 Ala Asp Leu Leu Ser Lys Glu His Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Leu Glu 420 425 430 Asp Gly Gly Tyr Thr Ile Asn Ile Arg Phe Ala Gly Lys 435 440 445 <210> 12 <211> 1338 <212> DNA <213> Finegoldia magna <400> 12 gcggacgagc ctattgatct ggagaagttg gaggagaagc gtgataaaga gaacgtgggc 60 aacctgccta agttcgataa cgaggtcaag gatggctccg aaaacccgat ggcgaagtac 120 ccagacttcg atgacgaggc atctacccgc ttcgagaccg aaaacaacga attcgaagag 180 aagaaagtgg tctccgataa cttcttcgac cagtctgagc accctttcgt cgaaaacaag 240 gaagagaccc cagagacccc tgaaaccgat tccgaagagg aagttaccat caaggcgaac 300 ctgattttcg caaacggctc cacccagacc gctgagttca agggcacctt cgagaaagcc 360 acctctgaag catacgctta cgccgatacc cttaagaaag acaacggcga atacaccgtt 420 gatgtggcgg acaagggcta caccttgaac atcaaattcg caggcaagga gaaaaccccg 480 gaggaaccaa aggaggaagt gaccatcaaa gctaacctca tctacgccga cggcaagacc 540 cagaccgcag agttcaaagg caccttcgag gaagcgaccg cagaagctta ccgctacgcc 600 gatgcgctga agaaagacaa cggtgaatac accgtcgatg ttgctgacaa gggctacacc 660 ctcaacatca agttcgccgg caaggagaaa acccctgagg aaccgaagga ggaagtcacc 720 atcaaagcga accttatcta cgcagatggc aagactcaaa ctgctgagtt caagggcacc 780 tttgaggaag caaccgctga agcctaccgt tacgcggacc tgctcgcaaa ggagaacggc 840 aaatacaccg tggatgtcgc agataagggc tacaccctta acatcaagtt cgctggcaag 900 gaaaagaccc cagaggaacc taaggaggaa gttaccatca aagctaactt gatctacgcc 960 gatggcaaga cccagaccgc cgagttcaag ggcacctttg cggaggctac cgcagaagcc 1020 taccgctacg ctgacctttt ggccaaagaa aacggcaaat acaccgccga tctggaagac 1080 ggcggttaca ccatcaacat ccgcttcgca ggcaagaagg ttgatgagaa gccagaggaa 1140 aaagaacagg tgaccatcaa ggagaacatc tacttcgaag acggcaccgt ccagaccgct 1200 accttcaagg gcaccttcgc ggaggctacc gccgaagcct accgttacgc agatctgctc 1260 tccaaggaac acggcaaata caccgctgac ctggaagacg gcggctacac catcaacatt 1320 cgtttcgctg gcaagtga 1338 <210> 13 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Ser Phe Ser Gly Lys Tyr Gln Leu Gln Ser Gln Glu Asn Phe Glu 1 5 10 15 Ala Phe Met Lys Ala Ile Gly Leu Pro Glu Glu Leu Ile Gln Lys Gly 20 25 30 Lys Asp Ile Lys Gly Val Ser Glu Ile Val Gln Asn Gly Lys His Phe 35 40 45 Lys Phe Thr Ile Thr Ala Gly Ser Lys Val Ile Gln Asn Glu Phe Thr 50 55 60 Val Gly Glu Glu Cys Glu Leu Glu Thr Met Thr Gly Glu Lys Val Lys 65 70 75 80 Thr Val Val Gln Leu Glu Gly Asp Asn Lys Leu Val Thr Thr Phe Lys 85 90 95 Asn Ile Lys Ser Val Thr Glu Leu Asn Gly Asp Ile Ile Thr Asn Thr 100 105 110 Met Thr Leu Gly Asp Ile Val Phe Lys Arg Ile Ser Lys Arg Ile 115 120 125 <210> 14 <211> 504 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60 gcttccggcg tagctatccc agcattcgct caggagacca acccaaccat cgagggccgc 120 atgtccttct ccggcaagta ccagctgcag tcccaggaaa acttcgaggc attcatgaag 180 gctatcggtc tgccagaaga gctcatccag aagggcaagg atatcaaggg tgtttccgaa 240 atcgtgcaga acggcaagca cttcaagttc accatcaccg caggttccaa ggtcatccag 300 aacgagttca ccgttggcga agagtgcgaa ctcgagacca tgaccggtga aaaggttaag 360 accgtggtcc agctggaggg cgacaacaag ctcgtgacca ccttcaagaa catcaagtcc 420 gtcaccgaac tgaacggcga tatcatcacc aacaccatga ccctcggtga catcgtgttc 480 aagcgcatct ccaagcgtat ctaa 504 <210> 15 <211> 167 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu 20 25 30 Thr Asn Pro Thr Ile Glu Gly Arg Met Ser Phe Ser Gly Lys Tyr Gln 35 40 45 Leu Gln Ser Gln Glu Asn Phe Glu Ala Phe Met Lys Ala Ile Gly Leu 50 55 60 Pro Glu Glu Leu Ile Gln Lys Gly Lys Asp Ile Lys Gly Val Ser Glu 65 70 75 80 Ile Val Gln Asn Gly Lys His Phe Lys Phe Thr Ile Thr Ala Gly Ser 85 90 95 Lys Val Ile Gln Asn Glu Phe Thr Val Gly Glu Glu Cys Glu Leu Glu 100 105 110 Thr Met Thr Gly Glu Lys Val Lys Thr Val Val Gln Leu Glu Gly Asp 115 120 125 Asn Lys Leu Val Thr Thr Phe Lys Asn Ile Lys Ser Val Thr Glu Leu 130 135 140 Asn Gly Asp Ile Ile Thr Asn Thr Met Thr Leu Gly Asp Ile Val Phe 145 150 155 160 Lys Arg Ile Ser Lys Arg Ile 165 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cgagccacca ggcaggcggg aaaatcg 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cgattttccc gcctgcctgg tggctcg 27 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cccgcttgat cattccttta agg 23 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 aatgggccct ttggtacccc taaataatat cggtcc 36 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cgtgctctag gggaaccgtg cgttccc 27 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gggaacgcac ggttccccta gagcacg 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cgacgctgaa gttgtagaga tcatccg 27 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cggatgatct ctacaacttc agcgtcg 27 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cgatattatt tagggaaatt cctgtgaatt agctga 36 <210> 25 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ggaatgggcc ctttgttatt tgtatagttc atccatg 37 <210> 26 <211> 485 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 26 Met Glu Asn Pro Tyr Val Ala Ala Leu Asp Asp Glu Asn Gln Glu Val 1 5 10 15 Gly Val Lys Lys Glu Ala Glu Lys Glu Pro Glu Ile Gly Pro Ile Arg 20 25 30 Ala Ala Gly Arg Ala Ile Pro Leu Arg Thr Arg Ile Ile Leu Ile Val 35 40 45 Val Gly Ile Ala Gly Leu Gly Leu Leu Val Asn Ala Ile Ala Val Ser 50 55 60 Ser Leu Met Arg Glu Val Ser Tyr Thr Arg Met Asp Gln Glu Leu Glu 65 70 75 80 Thr Ser Met Gly Thr Trp Ala His Asn Val Glu Leu Phe Asn Phe Asp 85 90 95 Gly Val Arg Gln Gly Pro Pro Ser Asp Tyr Tyr Val Ala Lys Val Phe 100 105 110 Pro Asp Gly Ser Ser Ile Ile Phe Asn Asp Ala Gln Ser Ala Pro Asp 115 120 125 Leu Ala Glu Thr Thr Ile Gly Thr Gly Pro His Thr Val Asp Ala Ala 130 135 140 Ser Gly Ser Ala Ser Asn Thr Pro Trp Arg Val Met Ala Glu Lys Asn 145 150 155 160 Gly Asp Ile Ile Thr Val Val Gly Lys Ser Met Gly Arg Glu Thr Asn 165 170 175 Leu Leu Tyr Arg Leu Val Met Val Gln Met Ile Ile Gly Ala Leu Ile 180 185 190 Leu Val Ala Ile Leu Ile Thr Ser Leu Phe Leu Val Arg Arg Ser Leu 195 200 205 Arg Pro Leu Arg Glu Val Glu Glu Thr Ala Thr Arg Ile Ala Gly Gly 210 215 220 Asp Leu Asp Arg Arg Val Pro Gln Trp Pro Met Thr Thr Glu Val Gly 225 230 235 240 Gln Leu Ser Asn Ala Leu Asn Ile Met Leu Glu Gln Leu Gln Ala Ser 245 250 255 Ile Leu Thr Ala Gln Gln Lys Glu Ala Gln Met Arg Arg Phe Val Gly 260 265 270 Asp Ala Ser His Glu Leu Arg Thr Pro Leu Thr Ser Val Lys Gly Phe 275 280 285 Thr Glu Leu Tyr Ser Ser Gly Ala Thr Asp Asp Ala Asn Trp Val Met 290 295 300 Ser Lys Ile Gly Gly Glu Ala Gln Arg Met Ser Val Leu Val Glu Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ser Leu Thr Arg Ala Glu Gly Gln Gln Met Glu Lys His Arg 325 330 335 Val Asp Val Leu Glu Leu Ala Leu Ala Val Arg Gly Ser Met Arg Ala 340 345 350 Ala Trp Pro Asp Arg Thr Val Asn Val Ser Asn Lys Ala Glu Ser Ile 355 360 365 Pro Val Val Lys Gly Asp Pro Thr Arg Leu His Gln Val Leu Thr Asn 370 375 380 Leu Val Ala Asn Gly Leu Asn His Gly Gly Pro Asp Ala Glu Val Ser 385 390 395 400 Ile Glu Ile Asn Thr Asp Gly Gln Asn Val Arg Ile Leu Val Ala Asp 405 410 415 Asn Gly Val Gly Met Ser Glu Glu Asp Ala Gln His Ile Phe Glu Arg 420 425 430 Phe Tyr Arg Ala Asp Ser Ser Arg Ser Arg Ala Ser Gly Gly Ser Gly 435 440 445 Leu Gly Leu Ala Ile Thr Lys Ser Leu Val Glu Gly His Gly Gly Thr 450 455 460 Val Thr Val Asp Ser Val Gln Gly Glu Gly Thr Val Phe Thr Ile Thr 465 470 475 480 Leu Pro Ala Val Ser 485 <210> 27 <211> 485 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 27 Met Glu Asn Pro Tyr Val Ala Ala Leu Asp Asp Glu Asn Gln Glu Val 1 5 10 15 Gly Val Lys Lys Glu Ala Glu Lys Glu Pro Glu Ile Gly Pro Ile Arg 20 25 30 Ala Ala Gly Arg Ala Ile Pro Leu Arg Thr Arg Ile Ile Leu Ile Val 35 40 45 Val Gly Ile Ala Gly Leu Gly Leu Leu Val Asn Ala Ile Ala Val Ser 50 55 60 Ser Leu Met Arg Glu Val Ser Tyr Thr Arg Met Asp Gln Glu Leu Glu 65 70 75 80 Thr Ser Met Gly Thr Trp Ala His Asn Val Glu Leu Phe Asn Phe Asp 85 90 95 Gly Val Arg Gln Gly Pro Pro Ser Asp Tyr Tyr Val Ala Lys Val Phe 100 105 110 Pro Asp Gly Ser Ser Ile Ile Phe Asn Asp Ala Gln Ser Ala Pro Asp 115 120 125 Leu Ala Glu Thr Thr Ile Gly Thr Gly Pro His Thr Val Asp Ala Ala 130 135 140 Ser Gly Ser Ala Ser Asn Thr Pro Trp Arg Val Met Ala Glu Lys Asn 145 150 155 160 Gly Asp Ile Ile Thr Val Val Gly Lys Ser Met Gly Arg Glu Thr Asn 165 170 175 Leu Leu Tyr Arg Leu Val Val Val Gln Met Ile Ile Gly Ala Leu Ile 180 185 190 Leu Val Ala Ile Leu Ile Thr Ser Leu Phe Leu Val Arg Arg Ser Leu 195 200 205 Arg Pro Leu Arg Glu Val Glu Glu Thr Ala Thr Arg Ile Ala Gly Gly 210 215 220 Asp Leu Asp Arg Arg Val Pro Gln Trp Pro Met Thr Thr Glu Val Gly 225 230 235 240 Gln Leu Ser Asn Ala Leu Asn Ile Met Leu Glu Gln Leu Gln Ala Ser 245 250 255 Ile Leu Thr Ala Gln Gln Lys Glu Ala Gln Met Arg Arg Phe Val Gly 260 265 270 Asp Ala Ser His Glu Leu Arg Thr Pro Leu Thr Ser Val Lys Gly Phe 275 280 285 Thr Glu Leu Tyr Ser Ser Gly Ala Thr Asp Asp Ala Asn Trp Val Met 290 295 300 Ser Lys Ile Gly Gly Glu Ala Gln Arg Met Ser Val Leu Val Glu Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ser Leu Thr Arg Ala Glu Gly Gln Gln Met Glu Lys His Arg 325 330 335 Val Asp Val Leu Glu Leu Ala Leu Ala Val Arg Gly Ser Met Arg Ala 340 345 350 Ala Trp Pro Asp Arg Thr Val Asn Val Ser Asn Lys Ala Glu Ser Ile 355 360 365 Pro Val Val Glu Gly Asp Pro Thr Arg Leu His Gln Val Leu Thr Asn 370 375 380 Leu Val Ala Asn Gly Leu Asn His Gly Gly Pro Asp Ala Glu Val Ser 385 390 395 400 Ile Glu Ile Asn Thr Asp Gly Gln Asn Val Arg Ile Leu Val Ala Asp 405 410 415 Asn Gly Val Gly Met Ser Glu Glu Asp Ala Gln His Ile Phe Glu Arg 420 425 430 Phe Tyr Arg Ala Asp Ser Ser Arg Ser Arg Ala Ser Gly Gly Ser Gly 435 440 445 Leu Gly Leu Ala Ile Thr Lys Ser Leu Val Glu Gly His Gly Gly Thr 450 455 460 Val Thr Val Asp Ser Val Gln Gly Glu Gly Thr Val Phe Thr Ile Thr 465 470 475 480 Leu Pro Ala Val Ser 485 <210> 28 <211> 504 <212> PRT <213> Corynebacterium callunae <400> 28 Met Glu Asn Pro Tyr Val Ala Ala Leu Asp Lys Asn Ser Asn Phe Gly 1 5 10 15 Ala Lys Asp Thr Asp Ser Ala Val Ser Asp Ser Thr Glu Val Ser Gln 20 25 30 Asn Asn Asp Gly Ile Gly Thr Pro Ala Thr Ala Glu Pro Lys Val Gly 35 40 45 Pro Ile Arg Thr Ala Gly Arg Ala Met Pro Leu Arg Thr Arg Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Val Val Gly Ile Ala Gly Leu Gly Leu Leu Val Asn Ala Val 65 70 75 80 Ala Val Ser Ser Leu Met Arg Glu Val Ser Tyr Thr Arg Met Asp Gln 85 90 95 Asp Leu Glu Ser Ala Met Gly Thr Trp Val Arg Asn Val Glu Leu Phe 100 105 110 Asn Phe Asp Gly Val Arg Gln Gly Pro Pro Ser Asp Tyr Tyr Val Ala 115 120 125 Lys Val Phe Pro Asp Gly Ser Ser Ile Ile Phe Asn Asp Ala Glu Ser 130 135 140 Ala Pro Asp Leu Gly Gln Thr Thr Ile Gly Thr Gly Pro His Thr Val 145 150 155 160 Glu Ala Ala Glu Gly Ser Ala Ser Ser Thr His Trp Arg Val Met Ala 165 170 175 Ala Lys Asn Gly Asp Val Ile Thr Val Val Gly Lys Ser Met Gly Arg 180 185 190 Glu Ser Thr Leu Leu Tyr Arg Leu Val Val Val Gln Met Val Ile Gly 195 200 205 Val Leu Ile Leu Ile Ala Ile Leu Ile Gly Ser Phe Phe Leu Val Arg 210 215 220 Arg Ser Leu Lys Pro Leu Arg Glu Val Glu Glu Thr Ala Ser Arg Ile 225 230 235 240 Ala Gly Gly Glu Leu Asp Arg Arg Val Pro Gln Trp Pro Met Thr Thr 245 250 255 Glu Val Gly Gln Leu Ala Asn Ala Leu Asn Ile Met Leu Glu Gln Leu 260 265 270 Gln Thr Ser Ile Met Asn Ala Gln Gln Lys Glu Ala Gln Met Arg Arg 275 280 285 Phe Val Gly Asp Ala Ser His Glu Leu Arg Thr Pro Leu Thr Ser Val 290 295 300 Lys Gly Phe Thr Glu Leu Tyr Ser Ser Gly Ala Thr Gln Asp Ala Asp 305 310 315 320 Trp Val Leu Ser Lys Ile Gly Gly Glu Ala Gln Arg Met Ser Val Leu 325 330 335 Val Glu Asp Leu Leu Ser Leu Thr Arg Ala Glu Gly Gln Gln Met Glu 340 345 350 Lys His Arg Val Asp Met Leu Glu Leu Ala Leu Ala Val Arg Gly Ser 355 360 365 Leu Lys Ala Ala Trp Pro Asp Arg Thr Val Asn Val Ala Asn Arg Ser 370 375 380 Glu Asn Ile Pro Val Val Glu Gly Asp Pro Thr Arg Leu His Gln Val 385 390 395 400 Leu Thr Asn Leu Val Ala Asn Gly Leu Asn His Gly Gly Pro Glu Ala 405 410 415 Glu Val Asn Ile Gln Val Glu Thr Ala Asp Asp Lys Val Lys Ile Leu 420 425 430 Val Ile Asp Asn Gly Val Gly Met Ser Lys Glu Asp Ala Glu His Ile 435 440 445 Phe Glu Arg Phe Tyr Arg Ala Asp Thr Ser Arg Ser Arg Ala Ser Gly 450 455 460 Gly Ser Gly Leu Gly Leu Ala Ile Thr Lys Ser Leu Val Glu Gly His 465 470 475 480 Gly Gly Thr Ile Thr Val Asp Ser Glu Leu Gly Lys Gly Thr Val Phe 485 490 495 Ser Ile Ile Leu Pro Ala Ala Glu 500 <210> 29 <211> 458 <212> PRT <213> Corynebacterium crenatum <400> 29 Ile Gly Pro Ile Arg Ala Ala Gly Arg Ala Ile Pro Leu Arg Thr Arg 1 5 10 15 Ile Ile Leu Ile Val Val Gly Ile Ala Gly Leu Gly Leu Leu Val Asn 20 25 30 Ala Ile Ala Val Ser Ser Leu Met Arg Glu Val Ser Tyr Thr Arg Met 35 40 45 Asp Gln Glu Leu Glu Thr Ser Met Gly Thr Trp Ala His Asn Val Glu 50 55 60 Leu Phe Asn Phe Asp Gly Val Arg Gln Gly Pro Pro Ser Asp Tyr Tyr 65 70 75 80 Val Ala Lys Val Phe Pro Asp Gly Ser Ser Ile Ile Phe Asn Asp Ala 85 90 95 Gln Ser Ala Pro Asp Leu Ala Glu Thr Thr Ile Gly Thr Gly Pro His 100 105 110 Thr Val Asp Ala Ala Ser Gly Ser Ala Ser Asn Thr Pro Trp Arg Val 115 120 125 Met Ala Glu Lys Asn Gly Asp Ile Ile Thr Val Val Gly Lys Ser Met 130 135 140 Gly Arg Glu Thr Asn Leu Leu Tyr Arg Leu Val Met Val Gln Met Ile 145 150 155 160 Ile Gly Ala Leu Ile Leu Val Ala Ile Leu Ile Thr Ser Leu Phe Leu 165 170 175 Val Arg Arg Ser Leu Arg Pro Leu Arg Glu Val Glu Glu Thr Ala Thr 180 185 190 Arg Ile Ala Gly Gly Asp Leu Asp Arg Arg Val Pro Gln Trp Pro Met 195 200 205 Thr Thr Glu Val Gly Gln Leu Ser Asn Ala Leu Asn Ile Met Leu Glu 210 215 220 Gln Leu Gln Ala Ser Ile Leu Ser Ala Gln Gln Lys Glu Ala Gln Met 225 230 235 240 Arg Arg Phe Val Gly Asp Ala Ser His Glu Leu Arg Thr Pro Leu Thr 245 250 255 Ser Val Lys Gly Phe Thr Glu Leu Tyr Ser Ser Gly Ala Thr Asp Asp 260 265 270 Ala Asn Trp Val Met Ser Lys Ile Gly Gly Glu Ala Gln Arg Met Ser 275 280 285 Val Leu Val Glu Asp Leu Leu Ser Leu Thr Arg Ala Glu Gly Gln Gln 290 295 300 Met Glu Lys His Arg Val Asp Val Leu Glu Leu Ala Leu Ala Val Arg 305 310 315 320 Gly Ser Met Arg Ala Ala Trp Pro Asp Arg Thr Val Asn Val Ser Asn 325 330 335 Lys Ala Ala Ser Ile Pro Val Val Glu Gly Asp Pro Thr Arg Leu His 340 345 350 Gln Val Leu Thr Asn Leu Val Ala Asn Gly Leu Asn His Gly Gly Pro 355 360 365 Asp Ala Glu Val Ser Ile Glu Ile Asn Thr Asp Gly Gln Asn Val Arg 370 375 380 Ile Leu Val Ala Asp Asn Gly Val Gly Met Ser Glu Glu Asp Ala Gln 385 390 395 400 His Ile Phe Glu Arg Phe Tyr Arg Ala Asp Ser Ser Arg Ser Arg Ala 405 410 415 Ser Gly Gly Ser Gly Leu Gly Leu Ala Ile Thr Lys Ser Leu Val Glu 420 425 430 Gly His Gly Gly Thr Val Thr Val Asp Ser Val Gln Gly Glu Gly Thr 435 440 445 Val Phe Thr Ile Thr Leu Pro Ala Val Ser 450 455 <210> 30 <211> 471 <212> PRT <213> Corynebacterium efficiens <400> 30 Met Thr Ala Pro Glu Asn Pro His Ala Gln Val Thr Pro Val Gly Arg 1 5 10 15 Phe Arg Gln Ala Ala Arg Gly Val Pro Leu Arg Thr Arg Ile Ile Leu 20 25 30 Leu Val Val Gly Ile Ala Gly Leu Gly Leu Leu Val Asn Ala Ile Ala 35 40 45 Val Ser Ser Leu Met Arg Glu Val Ser Tyr Ser Arg Met Asp Gln Glu 50 55 60 Leu Glu Ser Ala Met Asn Ser Trp Ala Gln Thr Ala Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Thr Leu Gly Pro Pro Ser Asp Tyr Tyr Val Val Arg Ile Phe 85 90 95 Pro Asp Gly Ser His Met Val Phe Asn Gln Ser Asp Ser Ala Pro Asp 100 105 110 Leu Gly Glu Thr Thr Ile Gly Ile Gly Pro His Thr Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Gly Ser Ser Ser Ser Val Pro Trp Arg Val Ile Ala Ile Ser Asp 130 135 140 Asn Gly Thr Ile Thr Val Val Gly Lys Ser Leu Ala Pro Glu Ser Met 145 150 155 160 Leu Leu Tyr Arg Leu Val Ile Val Gln Leu Val Ile Gly Met Leu Ile 165 170 175 Val Val Ala Ile Leu Leu Ser Ser Leu Tyr Leu Val Asn Arg Ser Leu 180 185 190 Arg Pro Leu Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Lys Ser Ile Ala Gly Gly 195 200 205 Asp Leu Asp Arg Arg Val Pro Gln Trp Pro Met Thr Thr Glu Val Gly 210 215 220 Gln Leu Ala Asn Ala Leu Asn Ile Met Leu Glu Gln Leu Gln Ala Ser 225 230 235 240 Ile Leu Ser Ala Gln Glu Lys Glu Ser Gln Met Arg Arg Phe Val Gly 245 250 255 Asp Ala Ser His Glu Leu Arg Thr Pro Leu Thr Ser Val Lys Gly Tyr 260 265 270 Ser Glu Leu Tyr His Ser Gly Ala Thr Arg Asp Ala Asp Trp Val Leu 275 280 285 Ser Lys Ile Ser Gly Glu Ala Gln Arg Met Ser Val Leu Val Glu Asp 290 295 300 Leu Leu Ser Leu Thr Arg Ala Glu Gly Gln Gln Met Glu Lys Arg Pro 305 310 315 320 Val Asp Val Leu Glu Leu Ser Leu Ser Val Ala Ser Ser Met Arg Ala 325 330 335 Ala Trp Pro Glu Arg Ser Ile Thr Val Val Asn Lys Thr Gly Ser Leu 340 345 350 Pro Val Val Glu Gly Asp Ala Thr Arg Leu His Gln Val Leu Thr Asn 355 360 365 Leu Val Asn Asn Gly Leu Asn His Gly Gly Pro Asp Ala Ser Val Glu 370 375 380 Ile Glu Ile Ser Ala Glu Gly Gly Ser Val Leu Val Arg Val Val Asp 385 390 395 400 Asp Gly Val Gly Met Thr Ala Glu Asp Ala Gln His Ile Phe Glu Arg 405 410 415 Phe Tyr Arg Thr Asp Thr Ser Arg Ser Arg Ala Ser Gly Gly Ser Gly 420 425 430 Leu Gly Leu Ala Ile Thr Lys Ser Leu Val Glu Gly His Arg Gly Thr 435 440 445 Ile Thr Val Asp Ser Glu Val Gly Glu Gly Thr Val Phe Thr Ile Thr 450 455 460 Leu Pro Ser Arg Met Glu Asp 465 470 <210> 31 <211> 708 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 31 atggacaacc agtctgacgg acaaatccgc gtactcgtcg ttgatgacga gccaaacatc 60 gtcgagctgc tcaccgtaag ccttaaattc caaggcttcg cagtgatgac cgccaacgat 120 ggcaatgaag ccctgaagat tgctcgtgag ttccgtccag acgcatacat cctcgatgtc 180 atgatgccag gaatggacgg cttcgagctg ctgaccaagc tgcgcggcga aggccttgac 240 agcccagttc tgtacctcac cgcaaaggat gccgtggagc accgcatcca cggcctgacc 300 atcggcgctg acgactacgt gaccaagcct ttctccctgg aagaagtaat cacccgcctg 360 cgcgtgattc ttcgtcgcgg tggagcagtt gaagaagaca cctcaacttc cctgcagtac 420 gcagacctca ccctcaacga tgaaacccac gaggtcacca aggctggcga actgatcgat 480 ctttccccaa ctgaattcaa cctcctgcgc tacctcatgc tcaacgctga agtggtgctg 540 tccaaggcaa agatcctgga taacgtgtgg cactacgatt ttggtggcga cggcaacgtc 600 gtggaatcct acatctccta cctgcgccgc aaggtggaca cccaggatcc gcagctaatt 660 cagactgttc gtggcgttgg atatgttctg cgcaccccac gtagctaa 708 <210> 32 <211> 235 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 32 Met Asp Asn Gln Ser Asp Gly Gln Ile Arg Val Leu Val Val Asp Asp 1 5 10 15 Glu Pro Asn Ile Val Glu Leu Leu Thr Val Ser Leu Lys Phe Gln Gly 20 25 30 Phe Ala Val Met Thr Ala Asn Asp Gly Asn Glu Ala Leu Lys Ile Ala 35 40 45 Arg Glu Phe Arg Pro Asp Ala Tyr Ile Leu Asp Val Met Met Pro Gly 50 55 60 Met Asp Gly Phe Glu Leu Leu Thr Lys Leu Arg Gly Glu Gly Leu Asp 65 70 75 80 Ser Pro Val Leu Tyr Leu Thr Ala Lys Asp Ala Val Glu His Arg Ile 85 90 95 His Gly Leu Thr Ile Gly Ala Asp Asp Tyr Val Thr Lys Pro Phe Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Val Ile Thr Arg Leu Arg Val Ile Leu Arg Arg Gly Gly 115 120 125 Ala Val Glu Glu Asp Thr Ser Thr Ser Leu Gln Tyr Ala Asp Leu Thr 130 135 140 Leu Asn Asp Glu Thr His Glu Val Thr Lys Ala Gly Glu Leu Ile Asp 145 150 155 160 Leu Ser Pro Thr Glu Phe Asn Leu Leu Arg Tyr Leu Met Leu Asn Ala 165 170 175 Glu Val Val Leu Ser Lys Ala Lys Ile Leu Asp Asn Val Trp His Tyr 180 185 190 Asp Phe Gly Gly Asp Gly Asn Val Val Glu Ser Tyr Ile Ser Tyr Leu 195 200 205 Arg Arg Lys Val Asp Thr Gln Asp Pro Gln Leu Ile Gln Thr Val Arg 210 215 220 Gly Val Gly Tyr Val Leu Arg Thr Pro Arg Ser 225 230 235 <210> 33 <211> 1500 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 33 atgtttaaca accgtatccg cactgcagct ctcgctggtg caatcgcaat ctccaccgca 60 gcttccggcg tagctatccc agcattcgct caggagacca acccaacctt caacatcaac 120 aacggcttca acgatgctga tggatccacc atccagccag ttgagccagt taaccacacc 180 gaggaaaccc tccgcgacct gactgactcc accggcgctt acctggaaga gttccagtac 240 ggcaacgttg aggaaatcgt tgaagcatac ctgcaggttc aggcttccgc agacggattc 300 gatccttctg agcaggctgc ttacgaggct ttcgaggctg ctcgcgttcg tgcatcccag 360 gagctcgcgg cttccgctga gaccatcact aagacccgcg agtccgttgc ttacgcactc 420 aaggctgacc gcgaagctac cgcagctttc gaggcttacc tcagcgctct tcgtcaggtt 480 tcagtcatca acgatctgat cgctgatgct aacgccaaga acaagactga ctttgcagag 540 atcgagctct acgatgttct ttacaccgac gccgacatct ctggcgatgc tccacttctt 600 gctcctgcat acaaggagct gaaggacctt caggctgagg ttgacgcaga cttcgagtgg 660 ttgggcgagt tcgcaattga taacaatgaa gacaactacg tcattcgtac tcacatccct 720 gctgtagagg cactcaaggc agcgatcgat tcactggtcg acaccgttga gccacttcgt 780 gcagacgcta tcgctaagaa catcgaggct cagaagtctg acgttctggt tccccagctc 840 ttcctcgagc gtgcaactgc acagcgcgac accctgcgtg ttgtagaggc aatcttctct 900 acctctgctc gttacgttga actctacgag aacgtcgaga acgttaacgt tgagaacaag 960 acccttcgcc agcactactc ttccctgatc cctaacctct tcatcgcagc ggttggcaac 1020 atcaacgagc tcaacaatgc agatcaggct gcacgtgagc tcttcctcga ttgggacacc 1080 gacctcacca ccaacgatga ggacgaagct tactaccagg ctaagctcga cttcgctatc 1140 gagacctacg caaagatcct gatcaacggt gaagtttggc aggagccact cgcttacgtc 1200 cagaacctgg atgcaggcgc acgtcaggaa gcagctgacc gcgaagcaga gcgcgcagct 1260 gacgcagcat accgcgctga gcagctccgc atcgctcagg aagcagctga cgctcagaag 1320 gctctcgctg aggctcttgc taatgcaggc aacaacgaca acggtggcga caactcctcc 1380 gacgacaagg gaaccggttc ttccgacatc ggaacctggg gacctttcgc agcaattgca 1440 gctatcatcg cagcaatcgc agctatcttc ccattcctct ccggtatcgt taagttctaa 1500 <210> 34 <211> 499 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 34 Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu 20 25 30 Thr Asn Pro Thr Phe Asn Ile Asn Asn Gly Phe Asn Asp Ala Asp Gly 35 40 45 Ser Thr Ile Gln Pro Val Glu Pro Val Asn His Thr Glu Glu Thr Leu 50 55 60 Arg Asp Leu Thr Asp Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Glu Glu Phe Gln Tyr 65 70 75 80 Gly Asn Val Glu Glu Ile Val Glu Ala Tyr Leu Gln Val Gln Ala Ser 85 90 95 Ala Asp Gly Phe Asp Pro Ser Glu Gln Ala Ala Tyr Glu Ala Phe Glu 100 105 110 Ala Ala Arg Val Arg Ala Ser Gln Glu Leu Ala Ala Ser Ala Glu Thr 115 120 125 Ile Thr Lys Thr Arg Glu Ser Val Ala Tyr Ala Leu Lys Ala Asp Arg 130 135 140 Glu Ala Thr Ala Ala Phe Glu Ala Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Gln Val 145 150 155 160 Ser Val Ile Asn Asp Leu Ile Ala Asp Ala Asn Ala Lys Asn Lys Thr 165 170 175 Asp Phe Ala Glu Ile Glu Leu Tyr Asp Val Leu Tyr Thr Asp Ala Asp 180 185 190 Ile Ser Gly Asp Ala Pro Leu Leu Ala Pro Ala Tyr Lys Glu Leu Lys 195 200 205 Asp Leu Gln Ala Glu Val Asp Ala Asp Phe Glu Trp Leu Gly Glu Phe 210 215 220 Ala Ile Asp Asn Asn Glu Asp Asn Tyr Val Ile Arg Thr His Ile Pro 225 230 235 240 Ala Val Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ile Asp Ser Leu Val Asp Thr Val 245 250 255 Glu Pro Leu Arg Ala Asp Ala Ile Ala Lys Asn Ile Glu Ala Gln Lys 260 265 270 Ser Asp Val Leu Val Pro Gln Leu Phe Leu Glu Arg Ala Thr Ala Gln 275 280 285 Arg Asp Thr Leu Arg Val Val Glu Ala Ile Phe Ser Thr Ser Ala Arg 290 295 300 Tyr Val Glu Leu Tyr Glu Asn Val Glu Asn Val Asn Val Glu Asn Lys 305 310 315 320 Thr Leu Arg Gln His Tyr Ser Ser Leu Ile Pro Asn Leu Phe Ile Ala 325 330 335 Ala Val Gly Asn Ile Asn Glu Leu Asn Asn Ala Asp Gln Ala Ala Arg 340 345 350 Glu Leu Phe Leu Asp Trp Asp Thr Asp Leu Thr Thr Asn Asp Glu Asp 355 360 365 Glu Ala Tyr Tyr Gln Ala Lys Leu Asp Phe Ala Ile Glu Thr Tyr Ala 370 375 380 Lys Ile Leu Ile Asn Gly Glu Val Trp Gln Glu Pro Leu Ala Tyr Val 385 390 395 400 Gln Asn Leu Asp Ala Gly Ala Arg Gln Glu Ala Ala Asp Arg Glu Ala 405 410 415 Glu Arg Ala Ala Asp Ala Ala Tyr Arg Ala Glu Gln Leu Arg Ile Ala 420 425 430 Gln Glu Ala Ala Asp Ala Gln Lys Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Asn 435 440 445 Ala Gly Asn Asn Asp Asn Gly Gly Asp Asn Ser Ser Asp Asp Lys Gly 450 455 460 Thr Gly Ser Ser Asp Ile Gly Thr Trp Gly Pro Phe Ala Ala Ile Ala 465 470 475 480 Ala Ile Ile Ala Ala Ile Ala Ala Ile Phe Pro Phe Leu Ser Gly Ile 485 490 495 Val Lys Phe <210> 35 <211> 318 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 35 atgtccctcg gaccatggga aattggaatc attgtcctgc tgatcatcgt gctgttcggc 60 gcgaagaagc tgcctgatgc agctcgttcc atcggccgtt ccatgcgcat cttcaagtct 120 gaagtcaaag aaatgaacaa ggacggcgat accccagaac aacagcagca gcctcagcag 180 cagattgcgc ccaaccagat cgaggctcct cagccaaact ttgagcagca ctaccaggga 240 cagcaggttc agcagcctca gaaccctcag acccctgact accgtcagaa ctacgaggat 300 ccaaaccgca cctcttaa 318 <210> 36 <211> 105 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 36 Met Ser Leu Gly Pro Trp Glu Ile Gly Ile Ile Val Leu Leu Ile Ile 1 5 10 15 Val Leu Phe Gly Ala Lys Lys Leu Pro Asp Ala Ala Arg Ser Ile Gly 20 25 30 Arg Ser Met Arg Ile Phe Lys Ser Glu Val Lys Glu Met Asn Lys Asp 35 40 45 Gly Asp Thr Pro Glu Gln Gln Gln Gln Pro Gln Gln Gln Ile Ala Pro 50 55 60 Asn Gln Ile Glu Ala Pro Gln Pro Asn Phe Glu Gln His Tyr Gln Gly 65 70 75 80 Gln Gln Val Gln Gln Pro Gln Asn Pro Gln Thr Pro Asp Tyr Arg Gln 85 90 95 Asn Tyr Glu Asp Pro Asn Arg Thr Ser 100 105 <210> 37 <211> 471 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 37 atgttttcta gcgtgggttg gggagagatc ttcctcttag tcgttgtggg ccttgttgtc 60 atcggcccgg aacggttgcc tcgtttgatc caggacgcac gcgctgcgct gctcgctgca 120 cgtaccgcta tcgacaatgc aaagcagtcg ttggacagtg attttggttc ggaatttgat 180 gaaatccgaa agccactaac ccaggttgca cagtacagcc ggatgagccc caagacggcc 240 atcactaagg cgttatttga taatgattcc tcgttcctgg atgactttga tccaaagaag 300 atcatggccg aaggaacaga aggcgaagct cagcgcaaca agcaggcagc tgacaacaat 360 gcgaatgtgg tggaacgtcc agctgatggt tccaccgcac gcccaacgca aaacgatcca 420 aaagacggcc cgaattactc aggtggcgtc tcttggaccg atattattta g 471 <210> 38 <211> 156 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 38 Met Phe Ser Ser Val Gly Trp Gly Glu Ile Phe Leu Leu Val Val Val 1 5 10 15 Gly Leu Val Val Ile Gly Pro Glu Arg Leu Pro Arg Leu Ile Gln Asp 20 25 30 Ala Arg Ala Ala Leu Leu Ala Ala Arg Thr Ala Ile Asp Asn Ala Lys 35 40 45 Gln Ser Leu Asp Ser Asp Phe Gly Ser Glu Phe Asp Glu Ile Arg Lys 50 55 60 Pro Leu Thr Gln Val Ala Gln Tyr Ser Arg Met Ser Pro Lys Thr Ala 65 70 75 80 Ile Thr Lys Ala Leu Phe Asp Asn Asp Ser Ser Phe Leu Asp Asp Phe 85 90 95 Asp Pro Lys Lys Ile Met Ala Glu Gly Thr Glu Gly Glu Ala Gln Arg 100 105 110 Asn Lys Gln Ala Ala Asp Asn Asn Ala Asn Val Val Glu Arg Pro Ala 115 120 125 Asp Gly Ser Thr Ala Arg Pro Thr Gln Asn Asp Pro Lys Asp Gly Pro 130 135 140 Asn Tyr Ser Gly Gly Val Ser Trp Thr Asp Ile Ile 145 150 155 <210> 39 <211> 945 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 39 atgtccattg ttgagcacat caaagagttt cgacgccgac ttcttatcgc tctggcgggc 60 atcctcgtgg gcaccattat cggctttatt tggtacgatt tctcattttg gcagatcccc 120 actttgggcg agctgctgag ggatccgtac tgttctctgc ctgctgaatc ccgctgggcc 180 atgagcgact cagaggaatg tcgactgctc gcaaccggcc cgtttgatcc attcatgctt 240 cgccttaaag tagcggcgtt ggtgggtatg gttcttggct cacccgtgtg gctgagccag 300 ctgtggggct ttatcacccc aggtttgatg aagaatgagc gccgttacac cgcaatcttc 360 gtcacgattg ctgttgtgct gtttgtcggc ggtgctgttc ttgcgtactt cgtcgttgca 420 tatggtttgg agttcctcct taccattggt ggagacaccc aggcagcggc cctgactggt 480 gataagtact tcggattctt gctcgcgttg ttggcgattt tcggcgtgag cttcgaagtt 540 ccactggtga tcggcatgct caacattgtg ggtatcttgc cttacgatgc cattaaagat 600 aagcgacgca tgatcatcat gattttgttc gtgttcgctg ctttcatgac acccggccag 660 gatcctttca ccatgttggt gttggcgctt tcactcaccg ttctggtaga gcttgccctg 720 cagttctgtc gtttcaacga caaacgccgg gacaagaagc gcccagaatg gcttgatggc 780 gatgacctct ctgcatcacc actggatact tctgctggtg gagaagatgc tccaagccca 840 gtcgaaaccc cagaggcggt ggagccttcg cggatgctga acccaagtgg ggaggcgtcg 900 ataagctata aacccgggcg cgccgacttc ggtgacgtgc tctag 945 <210> 40 <211> 314 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 40 Met Ser Ile Val Glu His Ile Lys Glu Phe Arg Arg Arg Leu Leu Ile 1 5 10 15 Ala Leu Ala Gly Ile Leu Val Gly Thr Ile Ile Gly Phe Ile Trp Tyr 20 25 30 Asp Phe Ser Phe Trp Gln Ile Pro Thr Leu Gly Glu Leu Leu Arg Asp 35 40 45 Pro Tyr Cys Ser Leu Pro Ala Glu Ser Arg Trp Ala Met Ser Asp Ser 50 55 60 Glu Glu Cys Arg Leu Leu Ala Thr Gly Pro Phe Asp Pro Phe Met Leu 65 70 75 80 Arg Leu Lys Val Ala Ala Leu Val Gly Met Val Leu Gly Ser Pro Val 85 90 95 Trp Leu Ser Gln Leu Trp Gly Phe Ile Thr Pro Gly Leu Met Lys Asn 100 105 110 Glu Arg Arg Tyr Thr Ala Ile Phe Val Thr Ile Ala Val Val Leu Phe 115 120 125 Val Gly Gly Ala Val Leu Ala Tyr Phe Val Val Ala Tyr Gly Leu Glu 130 135 140 Phe Leu Leu Thr Ile Gly Gly Asp Thr Gln Ala Ala Ala Leu Thr Gly 145 150 155 160 Asp Lys Tyr Phe Gly Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ala Ile Phe Gly Val 165 170 175 Ser Phe Glu Val Pro Leu Val Ile Gly Met Leu Asn Ile Val Gly Ile 180 185 190 Leu Pro Tyr Asp Ala Ile Lys Asp Lys Arg Arg Met Ile Ile Met Ile 195 200 205 Leu Phe Val Phe Ala Ala Phe Met Thr Pro Gly Gln Asp Pro Phe Thr 210 215 220 Met Leu Val Leu Ala Leu Ser Leu Thr Val Leu Val Glu Leu Ala Leu 225 230 235 240 Gln Phe Cys Arg Phe Asn Asp Lys Arg Arg Asp Lys Lys Arg Pro Glu 245 250 255 Trp Leu Asp Gly Asp Asp Leu Ser Ala Ser Pro Leu Asp Thr Ser Ala 260 265 270 Gly Gly Glu Asp Ala Pro Ser Pro Val Glu Thr Pro Glu Ala Val Glu 275 280 285 Pro Ser Arg Met Leu Asn Pro Ser Gly Glu Ala Ser Ile Ser Tyr Lys 290 295 300 Pro Gly Arg Ala Asp Phe Gly Asp Val Leu 305 310 <210> 41 <211> 39 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 41 Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala 1 5 10 15 Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu 20 25 30 Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala 35 <210> 42 <211> 27 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 42 Met Ser Leu Ser Arg Arg Gln Phe Ile Gln Ala Ser Gly Ile Ala Leu 1 5 10 15 Cys Ala Gly Ala Val Pro Leu Lys Ala Ser Ala 20 25 <210> 43 <211> 48 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 43 Met Ala Tyr Asp Ser Arg Phe Asp Glu Trp Val Gln Lys Leu Lys Glu 1 5 10 15 Glu Ser Phe Gln Asn Asn Thr Phe Asp Arg Arg Lys Phe Ile Gln Gly 20 25 30 Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu Ser Leu Gly Leu Thr Ile Ala Gln Ser 35 40 45 <210> 44 <211> 34 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 44 Met Lys Phe Val Lys Arg Arg Thr Thr Ala Leu Val Thr Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Ser Val Thr Ser Leu Phe Ala Leu Gln Pro Ser Ala Lys Ala Ala 20 25 30 Glu His <210> 45 <211> 30 <212> PRT <213> Arthrobacter globiformis <400> 45 Met Met Asn Leu Ser Arg Arg Thr Leu Leu Thr Thr Gly Ser Ala Ala 1 5 10 15 Thr Leu Ala Tyr Ala Leu Gly Met Ala Gly Ser Ala Gln Ala 20 25 30 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Twin-Arginine Motif <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 46 Xaa Arg Arg Xaa Phe Leu Lys 1 5 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Twin-Arginine Motif <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(5) <223> Xaa can be any hydrophobic amino acid <400> 47 Arg Arg Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 48 <211> 43 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 48 Met Arg Asp Thr Ala Phe Arg Ser Ile Lys Ala Lys Ala Gln Ala Lys 1 5 10 15 Arg Arg Ser Leu Trp Ile Ala Ala Gly Ala Val Pro Thr Ala Ile Ala 20 25 30 Leu Thr Met Ser Leu Ala Pro Met Ala Ser Ala 35 40 <210> 49 <211> 30 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 49 Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala 20 25 30 <210> 50 <211> 25 <212> PRT <213> Corynebacterium stationis <400> 50 Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala 1 5 10 15 Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala 20 25 <210> 51 <211> 469 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 51 Gln Glu Thr Asn Pro Thr Phe Asn Ile Asn Asn Gly Phe Asn Asp Ala 1 5 10 15 Asp Gly Ser Thr Ile Gln Pro Val Glu Pro Val Asn His Thr Glu Glu 20 25 30 Thr Leu Arg Asp Leu Thr Asp Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Glu Glu Phe 35 40 45 Gln Tyr Gly Asn Val Glu Glu Ile Val Glu Ala Tyr Leu Gln Val Gln 50 55 60 Ala Ser Ala Asp Gly Phe Asp Pro Ser Glu Gln Ala Ala Tyr Glu Ala 65 70 75 80 Phe Glu Ala Ala Arg Val Arg Ala Ser Gln Glu Leu Ala Ala Ser Ala 85 90 95 Glu Thr Ile Thr Lys Thr Arg Glu Ser Val Ala Tyr Ala Leu Lys Ala 100 105 110 Asp Arg Glu Ala Thr Ala Ala Phe Glu Ala Tyr Leu Ser Ala Leu Arg 115 120 125 Gln Val Ser Val Ile Asn Asp Leu Ile Ala Asp Ala Asn Ala Lys Asn 130 135 140 Lys Thr Asp Phe Ala Glu Ile Glu Leu Tyr Asp Val Leu Tyr Thr Asp 145 150 155 160 Ala Asp Ile Ser Gly Asp Ala Pro Leu Leu Ala Pro Ala Tyr Lys Glu 165 170 175 Leu Lys Asp Leu Gln Ala Glu Val Asp Ala Asp Phe Glu Trp Leu Gly 180 185 190 Glu Phe Ala Ile Asp Asn Asn Glu Asp Asn Tyr Val Ile Arg Thr His 195 200 205 Ile Pro Ala Val Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ile Asp Ser Leu Val Asp 210 215 220 Thr Val Glu Pro Leu Arg Ala Asp Ala Ile Ala Lys Asn Ile Glu Ala 225 230 235 240 Gln Lys Ser Asp Val Leu Val Pro Gln Leu Phe Leu Glu Arg Ala Thr 245 250 255 Ala Gln Arg Asp Thr Leu Arg Val Val Glu Ala Ile Phe Ser Thr Ser 260 265 270 Ala Arg Tyr Val Glu Leu Tyr Glu Asn Val Glu Asn Val Asn Val Glu 275 280 285 Asn Lys Thr Leu Arg Gln His Tyr Ser Ser Leu Ile Pro Asn Leu Phe 290 295 300 Ile Ala Ala Val Gly Asn Ile Asn Glu Leu Asn Asn Ala Asp Gln Ala 305 310 315 320 Ala Arg Glu Leu Phe Leu Asp Trp Asp Thr Asp Leu Thr Thr Asn Asp 325 330 335 Glu Asp Glu Ala Tyr Tyr Gln Ala Lys Leu Asp Phe Ala Ile Glu Thr 340 345 350 Tyr Ala Lys Ile Leu Ile Asn Gly Glu Val Trp Gln Glu Pro Leu Ala 355 360 365 Tyr Val Gln Asn Leu Asp Ala Gly Ala Arg Gln Glu Ala Ala Asp Arg 370 375 380 Glu Ala Glu Arg Ala Ala Asp Ala Ala Tyr Arg Ala Glu Gln Leu Arg 385 390 395 400 Ile Ala Gln Glu Ala Ala Asp Ala Gln Lys Ala Leu Ala Glu Ala Leu 405 410 415 Ala Asn Ala Gly Asn Asn Asp Asn Gly Gly Asp Asn Ser Ser Asp Asp 420 425 430 Lys Gly Thr Gly Ser Ser Asp Ile Gly Thr Trp Gly Pro Phe Ala Ala 435 440 445 Ile Ala Ala Ile Ile Ala Ala Ile Ala Ala Ile Phe Pro Phe Leu Ser 450 455 460 Gly Ile Val Lys Phe 465 <210> 52 <211> 4 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Asn, Gly, Thr, Pro, or Ala <400> 52 Gln Glu Thr Xaa 1 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Asn, Gly, Thr, Pro, or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Pro, Thr, or Val <400> 53 Gln Glu Thr Xaa Xaa 1 5 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is Asn, Gly, Thr, Pro, or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is Pro, Thr, or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Thr or Tyr <400> 54 Gln Glu Thr Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 55 <211> 6 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 55 Gln Glu Thr Asn Pro Thr 1 5 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 56 Gln Glu Thr Gly Thr Tyr 1 5 <210> 57 <211> 6 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 57 Gln Glu Thr Thr Val Thr 1 5 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 58 Gln Glu Thr Pro Val Thr 1 5 <210> 59 <211> 6 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 59 Gln Glu Thr Ala Val Thr 1 5 <210> 60 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor Xa <400> 60 Ile Glu Gly Arg 1 <210> 61 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ProTEV <400> 61 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 <210> 62 <211> 1335 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 62 atgcagtcaa gcctagatcg tgtgtcggaa accggacgca atgagctcga tgttgaaacc 60 cttgtgaaga aggggaatca accgggcgcg atgagctatc gcaacagtat ccacattttg 120 acagcctcgc tgctggtcgt ggggttggga gcttccgccc gcctgacgct gccgatgttt 180 gcgctgtcgt gcgtgctgtt gtttgtgtgg ggttttctgt acttctatgg atcaaccaaa 240 cgcgtagatt tgagccacgg catgcagctg ggctggctgt ttgtgctgac gctggtgtgg 300 atttttatgg tgccgatcgt gcccgtgtcc atttatctgc tgttcccgct gtttttcctc 360 tatctacagg tgatgcctga cgtgagaggc attattgcga ttttgggtgc gacagcgatt 420 gcgattgcca gccagtattc cgtggggttg acctttggtg gtgtgatggg tccggtggtc 480 tctgcgatcg tgaccgtggc tattgattac gcgttccgca cgttgtggcg ggtgaataat 540 gaaaagcagg aattgattga tcagttgatt gaaactcgct cccagctggc ggtgacggaa 600 cgaaatgcgg gtatcgctgc ggaacgtcaa cgtattgcgc atgaaattca cgacacggtc 660 gcccagggac tctcctccat tcaaatgctg ctgcatgtct ctgaacagga gattctcgtt 720 gctgagatgg aagagaagcc aaaggaggcg atcgtgaaga agatgcgcct tgcccgacaa 780 acagcctccg acaatctcag tgaggctcgc gcgatgattg cggcgttgca accagcagcg 840 ctgtctaaaa cctccttgga agcagcactt caccgcgtca cagaaccgtt gttgggtatt 900 aattttgtga tttctgtcga cggtgatgtt cgccaactgc ccatgaaaac tgaagccacc 960 cttctgcgaa ttgctcaagg tgcgatcgga aatgtggcga aacattcaga ggcgaaaaac 1020 tgccacgtga cactaaccta cgaagacaca gaagtacgcc ttgatgtggt tgatgacggt 1080 gtgggttttg agccttcgga agtgtccagt acccccgctg gccttggcca tatcggctta 1140 accgcattgc agcagcgcgc gatggaattg cacggcgaag ttatagtgga atctgcatat 1200 gggcagggta ctgcggtatc tgcagcattg ccggtggagc caccagaggg gtttgtcggg 1260 gcgccggttt tggcagattc ggactcaagt gctacaggcg aggttgaact aagttctcca 1320 actgacgatg agtaa 1335 <210> 63 <211> 444 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 63 Met Gln Ser Ser Leu Asp Arg Val Ser Glu Thr Gly Arg Asn Glu Leu 1 5 10 15 Asp Val Glu Thr Leu Val Lys Lys Gly Asn Gln Pro Gly Ala Met Ser 20 25 30 Tyr Arg Asn Ser Ile His Ile Leu Thr Ala Ser Leu Leu Val Val Gly 35 40 45 Leu Gly Ala Ser Ala Arg Leu Thr Leu Pro Met Phe Ala Leu Ser Cys 50 55 60 Val Leu Leu Phe Val Trp Gly Phe Leu Tyr Phe Tyr Gly Ser Thr Lys 65 70 75 80 Arg Val Asp Leu Ser His Gly Met Gln Leu Gly Trp Leu Phe Val Leu 85 90 95 Thr Leu Val Trp Ile Phe Met Val Pro Ile Val Pro Val Ser Ile Tyr 100 105 110 Leu Leu Phe Pro Leu Phe Phe Leu Tyr Leu Gln Val Met Pro Asp Val 115 120 125 Arg Gly Ile Ile Ala Ile Leu Gly Ala Thr Ala Ile Ala Ile Ala Ser 130 135 140 Gln Tyr Ser Val Gly Leu Thr Phe Gly Gly Val Met Gly Pro Val Val 145 150 155 160 Ser Ala Ile Val Thr Val Ala Ile Asp Tyr Ala Phe Arg Thr Leu Trp 165 170 175 Arg Val Asn Asn Glu Lys Gln Glu Leu Ile Asp Gln Leu Ile Glu Thr 180 185 190 Arg Ser Gln Leu Ala Val Thr Glu Arg Asn Ala Gly Ile Ala Ala Glu 195 200 205 Arg Gln Arg Ile Ala His Glu Ile His Asp Thr Val Ala Gln Gly Leu 210 215 220 Ser Ser Ile Gln Met Leu Leu His Val Ser Glu Gln Glu Ile Leu Val 225 230 235 240 Ala Glu Met Glu Glu Lys Pro Lys Glu Ala Ile Val Lys Lys Met Arg 245 250 255 Leu Ala Arg Gln Thr Ala Ser Asp Asn Leu Ser Glu Ala Arg Ala Met 260 265 270 Ile Ala Ala Leu Gln Pro Ala Ala Leu Ser Lys Thr Ser Leu Glu Ala 275 280 285 Ala Leu His Arg Val Thr Glu Pro Leu Leu Gly Ile Asn Phe Val Ile 290 295 300 Ser Val Asp Gly Asp Val Arg Gln Leu Pro Met Lys Thr Glu Ala Thr 305 310 315 320 Leu Leu Arg Ile Ala Gln Gly Ala Ile Gly Asn Val Ala Lys His Ser 325 330 335 Glu Ala Lys Asn Cys His Val Thr Leu Thr Tyr Glu Asp Thr Glu Val 340 345 350 Arg Leu Asp Val Val Asp Asp Gly Val Gly Phe Glu Pro Ser Glu Val 355 360 365 Ser Ser Thr Pro Ala Gly Leu Gly His Ile Gly Leu Thr Ala Leu Gln 370 375 380 Gln Arg Ala Met Glu Leu His Gly Glu Val Ile Val Glu Ser Ala Tyr 385 390 395 400 Gly Gln Gly Thr Ala Val Ser Ala Ala Leu Pro Val Glu Pro Pro Glu 405 410 415 Gly Phe Val Gly Ala Pro Val Leu Ala Asp Ser Asp Ser Ser Ala Thr 420 425 430 Gly Glu Val Glu Leu Ser Ser Pro Thr Asp Asp Glu 435 440 <210> 64 <211> 639 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 64 atgattcgcg tgctgcttgc tgatgaccac gaaatcgtga ggctcggact ccgggctgtg 60 ctggaaagcg ccgaggacat tgaagtggtg ggcgaagtct ccaccgccga aggtgcggtg 120 caggcagccc gagaaggcgg aatcgacgtc atcttgatgg acctccgatt cggccccggc 180 gtccaaggaa cccaggtatc caccggcgca gacgccaccg cagccatcaa gcgaaacatc 240 gataacccgc caaaagtcct ggttgtgacc aactacgaca ccgacacaga catcctcggc 300 gcaatcgaag ccggcgcact gggctacctg ctcaaagacg ccccaccgag cgaactcctg 360 gcagcagtac gatccgcagc agaaggtgac tccacactgt cacccatggt tgctaaccgc 420 ctgatgactc gcgtgcgaac ccccaaaacc tcactcaccc cacgcgagct ggaggttctc 480 aaactggtcg ccggcggttc ctccaaccgc gacattggcc gtatcctctt cctctcagaa 540 gccacggtga aatcccacct cgtgcacatc tacgacaagc tcggcgtgcg gtcacgtacc 600 tccgctgtcg cagccgcacg tgagcagggg ctgctgtag 639 <210> 65 <211> 212 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 65 Met Ile Arg Val Leu Leu Ala Asp Asp His Glu Ile Val Arg Leu Gly 1 5 10 15 Leu Arg Ala Val Leu Glu Ser Ala Glu Asp Ile Glu Val Val Gly Glu 20 25 30 Val Ser Thr Ala Glu Gly Ala Val Gln Ala Ala Arg Glu Gly Gly Ile 35 40 45 Asp Val Ile Leu Met Asp Leu Arg Phe Gly Pro Gly Val Gln Gly Thr 50 55 60 Gln Val Ser Thr Gly Ala Asp Ala Thr Ala Ala Ile Lys Arg Asn Ile 65 70 75 80 Asp Asn Pro Pro Lys Val Leu Val Val Thr Asn Tyr Asp Thr Asp Thr 85 90 95 Asp Ile Leu Gly Ala Ile Glu Ala Gly Ala Leu Gly Tyr Leu Leu Lys 100 105 110 Asp Ala Pro Pro Ser Glu Leu Leu Ala Ala Val Arg Ser Ala Ala Glu 115 120 125 Gly Asp Ser Thr Leu Ser Pro Met Val Ala Asn Arg Leu Met Thr Arg 130 135 140 Val Arg Thr Pro Lys Thr Ser Leu Thr Pro Arg Glu Leu Glu Val Leu 145 150 155 160 Lys Leu Val Ala Gly Gly Ser Ser Asn Arg Asp Ile Gly Arg Ile Leu 165 170 175 Phe Leu Ser Glu Ala Thr Val Lys Ser His Leu Val His Ile Tyr Asp 180 185 190 Lys Leu Gly Val Arg Ser Arg Thr Ser Ala Val Ala Ala Ala Arg Glu 195 200 205 Gln Gly Leu Leu 210

Claims (23)

  1. 이종 단백질의 분비 발현용의 유전자 구축물을 갖는 코리네형 세균을 배양하는 것, 및 분비 생산된 이종 단백질을 회수하는 것을 포함하는, 이종 단백질의 제조 방법으로서,
    상기 코리네형 세균이, HrrSA 시스템의 세포당 분자수가 비개변주와 비교하여 저하되도록 개변되어 있고,
    상기 유전자 구축물이, 5'에서 3'방향으로, 코리네형 세균에서 기능하는 프로모터 서열, 코리네형 세균에서 기능하는 시그널 펩타이드를 코드하는 핵산 서열, 및 이종 단백질을 코드하는 핵산 서열을 포함하고,
    상기 이종 단백질이, 상기 시그널 펩타이드와의 융합 단백질로서 발현되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, HrrSA 시스템의 세포당 분자수가, HrrS 단백질 및 HrrA 단백질의 한쪽 또는 양쪽의 세포당 분자수를 저하시킴으로써 저하된, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 적어도 HrrA 단백질의 세포당 분자수가 저하된, 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 HrrS 단백질이 하기 (a), (b), 또는 (c)에 기재된 단백질인, 방법:
    (a) 서열번호 63에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 63에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, HrrSA 시스템의 센서 키나아제로서의 기능을 갖는 단백질;
    (c) 서열번호 63에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, HrrSA 시스템의 센서 키나아제로서의 기능을 갖는 단백질.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 HrrA 단백질이 하기 (a), (b), 또는 (c)에 기재된 단백질인, 방법:
    (a) 서열번호 65에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 65에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, HrrSA 시스템의 반응 조절인자로서의 기능을 갖는 단백질;
    (c) 서열번호 65에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, HrrSA 시스템의 반응 조절인자로서의 기능을 갖는 단백질.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서, hrrS 유전자 및/또는 hrrA 유전자의 발현을 저하시킴으로써, 또는 hrrS 유전자 및/또는 hrrA 유전자를 파괴함으로써, HrrS 단백질 및/또는 HrrA 단백질의 세포당 분자수가 저하된, 방법.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서, hrrS 유전자 및/또는 hrrA 유전자를 결손시킴으로써, HrrS 단백질 및/또는 HrrA 단백질의 세포당 분자수가 저하된, 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코리네형 세균이, 추가로 변이형 PhoS 단백질을 코드하는 phoS 유전자를 유지하도록 개변되어 있는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 변이가 야생형 PhoS 단백질에 있어서, 서열번호 4의 302 위치의 트립토판 잔기에 상응하는 아미노산 잔기가 방향족 아미노산 및 히스티딘 이외의 아미노산 잔기로 치환되는 변이인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 방향족 아미노산 및 히스티딘 이외의 아미노산 잔기가, 리신 잔기, 알라닌 잔기, 발린 잔기, 세린 잔기, 시스테인 잔기, 메티오닌 잔기, 아스파라긴산 잔기, 또는 아스파라긴 잔기인, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 야생형 PhoS 단백질이 하기 (a), (b), 또는 (c)에 기재된 단백질인, 방법:
    (a) 서열번호 4, 26, 27, 28, 29, 또는 30에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (b) 서열번호 4, 26, 27, 28, 29, 또는 30에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, PhoRS 시스템의 센서 키나아제로서의 기능을 갖는 단백질;
    (c) 서열번호 4, 26, 27, 28, 29, 또는 30에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, PhoRS 시스템의 센서 키나아제로서의 기능을 갖는 단백질.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시그널 펩타이드가 Tat계 의존 시그널 펩타이드인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 Tat계 의존 시그널 펩타이드가 TorA 시그널 펩타이드, SufI 시그널 펩타이드, PhoD 시그널 펩타이드, LipA 시그널 펩타이드, 및 IMD 시그널 펩타이드로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 시그널 펩타이드인, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 코리네형 세균이, 추가로, Tat계 분비 장치를 코드하는 유전자로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 유전자의 발현이 비개변주와 비교하여 상승하도록 개변되어 있는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 Tat계 분비 장치를 코드하는 유전자가 tatA 유전자, tatB 유전자, tatC 유전자, 및 tatE 유전자로 이루어지는, 방법.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시그널 펩타이드가 Sec계 의존 시그널 펩타이드인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 Sec계 의존 시그널 펩타이드가 PS1 시그널 펩타이드, PS2 시그널 펩타이드, 및 SlpA 시그널 펩타이드로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 시그널 펩타이드인, 방법.
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 구축물이, 코리네형 세균에서 기능하는 시그널 펩타이드를 코드하는 핵산 서열과 이종 단백질을 코드하는 핵산 서열 사이에, 추가로, Gln-Glu-Thr을 포함하는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 유전자 구축물이, Gln-Glu-Thr을 포함하는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열과 이종 단백질을 코드하는 핵산 서열 사이에, 추가로, 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코리네형 세균이 코리네박테리움(Corynebacterium)속 세균인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 코리네형 세균이 코리네박테리움·글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 코리네형 세균이, 코리네박테리움·글루타미쿰 AJ 12036(FERM BP-734)에 유래하는 개변주 또는 코리네박테리움·글루타미쿰 ATCC 13869에 유래하는 개변주인, 방법.
  23. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코리네형 세균이, 세포 표층 단백질의 세포당 분자수가 저하되고 있는 코리네형 세균인, 방법.
KR1020197014491A 2016-10-21 2017-10-20 단백질의 분비 생산법 Active KR102337932B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016206728 2016-10-21
JPJP-P-2016-206728 2016-10-21
PCT/JP2017/037956 WO2018074579A1 (ja) 2016-10-21 2017-10-20 タンパク質の分泌生産法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190068610A KR20190068610A (ko) 2019-06-18
KR102337932B1 true KR102337932B1 (ko) 2021-12-13

Family

ID=62019447

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197014491A Active KR102337932B1 (ko) 2016-10-21 2017-10-20 단백질의 분비 생산법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10894810B2 (ko)
EP (1) EP3530747A4 (ko)
JP (1) JP7159867B2 (ko)
KR (1) KR102337932B1 (ko)
CN (1) CN109937258B (ko)
AU (1) AU2017347017B2 (ko)
WO (1) WO2018074579A1 (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102744950B1 (ko) * 2018-04-20 2024-12-20 아지노모토 가부시키가이샤 단백질의 분비 생산법
WO2020071538A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
JP7375767B2 (ja) * 2018-10-25 2023-11-08 味の素株式会社 タンパク質の分泌生産法
BR112021019284A2 (pt) 2019-03-29 2022-02-01 Ajinomoto Kk Métodos para produzir alolactose e para produzir um indutor de expressão gênica
CN114450411A (zh) 2019-04-01 2022-05-06 特纳亚治疗股份有限公司 具有工程化衣壳的腺相关病毒
CN111909879B (zh) * 2020-08-24 2023-04-28 江南大学 一种高效表达外源蛋白的谷氨酸棒杆菌诱变菌株及应用
US11781156B2 (en) 2020-10-09 2023-10-10 Tenaya Therapeutics, Inc. Plakophillin-2 gene therapy methods and compositions
EP4368722A1 (en) 2021-07-07 2024-05-15 Ajinomoto Co., Inc. Method for secretory production of unnatural-amino-acid-containing protein
CN113755526A (zh) * 2021-09-29 2021-12-07 中国科学院武汉病毒研究所 HSV-2包膜糖蛋白gJ在提高外源基因在哺乳动物细胞中表达量的应用
JPWO2023200008A1 (ko) 2022-04-15 2023-10-19

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013065772A1 (ja) 2011-11-02 2013-05-10 味の素株式会社 タンパク質の分泌生産法
WO2013118544A1 (ja) 2012-02-08 2013-08-15 味の素株式会社 タンパク質の分泌生産法
JP2014532424A (ja) 2011-11-02 2014-12-08 味の素株式会社 タンパク質の分泌生産法

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4320769A (en) 1978-05-19 1982-03-23 Becton, Dickinson And Company Universal holder for blood collecting tubes
US4362651A (en) 1979-03-22 1982-12-07 Schwarzenbek Eugene F High porosity catalysts
JPS57134500A (en) 1981-02-12 1982-08-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Plasmid pcg1
JPS57183799A (en) 1981-04-17 1982-11-12 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Novel plasmid
JPS5835197A (ja) 1981-08-26 1983-03-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd プラスミドｐｃｇ２
JPS58192900A (ja) 1982-05-04 1983-11-10 Ajinomoto Co Inc 複合プラスミド
US4965197A (en) 1987-06-12 1990-10-23 Massachusetts Institute Of Technology Coryneform expression and secretion system
JPH01191686A (ja) 1988-01-26 1989-08-01 Mitsubishi Petrochem Co Ltd 複合プラスミド
FR2627508B1 (fr) 1988-02-22 1990-10-05 Eurolysine Procede pour l'integration d'un gene choisi sur le chromosome d'une bacterie et bacterie obtenue par ledit procede
JP2678995B2 (ja) 1988-09-08 1997-11-19 三菱化学株式会社 トリプトフアンシンターゼの製造法
US5185262A (en) 1988-07-27 1993-02-09 Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd. DNA fragment containing gene which encodes the function of stabilizing plasmid in host microorganism
JPH02207791A (ja) 1989-02-07 1990-08-17 Ajinomoto Co Inc 微生物の形質転換法
JP2973446B2 (ja) 1990-01-11 1999-11-08 三菱化学株式会社 新規プラスミドベクター
JPH07108228B2 (ja) 1990-10-15 1995-11-22 味の素株式会社 温度感受性プラスミド
JPH06502548A (ja) 1991-07-30 1994-03-24 オルサン 特にコリネバクテリア中で用いることのできる蛋白質の発現および分泌系
NZ291414A (en) 1994-08-26 1998-05-27 Novo Nordisk As Microbial transglutaminases and methods of production using fungi and dna constructs
DE69629719T2 (de) 1995-01-19 2004-07-08 Novozymes A/S Transglutaminasen aus oomyzeten
ATE256749T1 (de) 1995-01-23 2004-01-15 Novozymes As Dna-integration durch transposition
JPH0970291A (ja) 1995-06-30 1997-03-18 Ajinomoto Co Inc 人工トランスポゾンを用いた遺伝子増幅方法
JP4035855B2 (ja) 1996-06-05 2008-01-23 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
JP3711658B2 (ja) 1996-10-07 2005-11-02 味の素株式会社 コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来の新規な細胞表層蛋白質
JP4168463B2 (ja) 1996-12-05 2008-10-22 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
JPH11169182A (ja) 1997-12-10 1999-06-29 Mitsubishi Chemical Corp コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく培地中へ分泌させる変異型分泌装置遺伝子
JP2000262288A (ja) 1999-03-16 2000-09-26 Ajinomoto Co Inc コリネ型細菌の温度感受性プラスミド
EP1219713B1 (en) 1999-09-30 2011-11-09 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing transglutaminase
AU2002242986A1 (en) 2001-03-30 2002-10-21 Ajinomoto Co., Inc. Method for the sectetion and production of protein
JPWO2004029254A1 (ja) 2002-09-30 2006-01-26 味の素株式会社 安定同位体標識タンパク質の製造方法
ZA200510144B (en) 2003-07-29 2007-03-28 Ajinomoto Kk Method for producing L-Lysine or L-Threonine using escherichia bacteria having attenuated malic enzyme acitivity
EP1748077B1 (en) 2004-04-20 2013-02-27 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing protein
JP4595506B2 (ja) 2004-11-25 2010-12-08 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法
US7794989B2 (en) 2004-12-28 2010-09-14 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
EP2772546B1 (en) 2011-10-25 2019-05-15 Ajinomoto Co., Inc. Secretion production method for protein
CN103930557A (zh) 2011-11-11 2014-07-16 味之素株式会社 利用发酵法制造目标物质的方法
EP2860259B1 (en) 2013-02-18 2016-11-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing protein by precipitation
CN104730302B (zh) 2015-04-20 2017-07-14 乐雷光电技术（上海）有限公司 一种防止炸机电路
JP6741000B2 (ja) 2015-04-24 2020-08-19 味の素株式会社 タンパク質の分泌生産法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013065772A1 (ja) 2011-11-02 2013-05-10 味の素株式会社 タンパク質の分泌生産法
JP2014532424A (ja) 2011-11-02 2014-12-08 味の素株式会社 タンパク質の分泌生産法
WO2013118544A1 (ja) 2012-02-08 2013-08-15 味の素株式会社 タンパク質の分泌生産法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017347017A1 (en) 2019-05-30
WO2018074579A1 (ja) 2018-04-26
CN109937258B (zh) 2023-06-23
EP3530747A1 (en) 2019-08-28
AU2017347017B2 (en) 2021-10-28
JP7159867B2 (ja) 2022-10-25
US20190241622A1 (en) 2019-08-08
CN109937258A (zh) 2019-06-25
JPWO2018074579A1 (ja) 2019-08-08
EP3530747A4 (en) 2020-07-22
US10894810B2 (en) 2021-01-19
KR20190068610A (ko) 2019-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102337932B1 (ko) 단백질의 분비 생산법
KR102619848B1 (ko) 단백질의 분비 생산법
KR102335301B1 (ko) 단백질의 분비 생산법
WO2013118544A1 (ja) タンパク質の分泌生産法
JP2023184699A (ja) タンパク質の分泌生産法
US20210246479A1 (en) Method for Secretory Production of Protein

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20190520

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20200910

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20210426

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20211014

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20211207

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20211208

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20241121

Start annual number: 4

End annual number: 4