KR102337717B1

KR102337717B1 - 녹용에서 분리한 신규 화합물 및 이의 약학적 용도

Info

Publication number: KR102337717B1
Application number: KR1020190004881A
Authority: KR
Inventors: 구영삼; 손기남
Original assignee: (주) 에프엔지리서치
Priority date: 2018-07-16
Filing date: 2019-01-14
Publication date: 2021-12-09
Anticipated expiration: 2038-07-16
Also published as: KR20200008490A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 합성 방법을 제공한다.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

Description

녹용에서 분리한 신규 화합물 및 이의 약학적 용도{Novel compounds isolated from Cervus nippon and pharmaceutical use thereof}

본 발명은 녹용에서 분리한 신규 화합물 및 이의 약학적 용도에 관한 것이며, 나아가 상기 신규 화합물의 화학적 합성 방법에 관한 것이다.

녹용(Cervi Parvum Cornu)은 사슴과 사슴속(Cervus)에 속한 매화록(Cervus nippon), 마록(Cervus elaphus) 또는 대록(Cervus canadensis) 등의 골질화되지 않은 사슴뿔을 잘라 말린 것이다.

녹용은 전통적으로 보약을 대표하는 한약재로 널리 이용되고 있으며, 동의보감 등에 따르면 강장작용, 보혈작용, 강정작용, 진통작용, 조혈작용, 생장발육촉진작용, 심부전증 치료작용, 기능항진작용, 피로 회복, 신체 활력증강 및 신장의 이뇨기능 강화 등 매우 다양한 효능을 가지는 것으로 알려져 있다.

녹용에는 각종 유리 아미노산과 다당류, 글리코사미노글리칸(GAGs), 히알루론산, 케라틴, 시알산, 콜레스테롤, 지방산, 인지질, 무기질 성분 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

녹용의 복용방법으로는, 녹용을 여러 종류의 생약재와 함께 열수 추출하여 그 여액을 복용하거나, 생약재들과 분쇄하여 가루로 만든 뒤 환(丸)으로 해서 복용하는 방법이 주로 이용되고 있으나, 용매추출 및 분획법을 이용하여 녹용에서 생리활성 유효성분을 추출하거나 분리하고자 하는 다양한 연구가 진행되었다.

대한민국 특허공개 제1999-0044781호는 녹용(매화록)을 클로로포름으로 추출하고, 상기 클로로포름 추출물에 대하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분획하여 5종의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 분리하고, 그 중 하기 화학식으로 표시되는 1-Palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetyl glycerol(PLAG, 이하 'PLA glycerol')의 조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식 촉진활성을 개시하고 있으며, 이후 PLA glycerol 연구와 관련하여 대한민국 특허공개 제2006-0047447호는 면역조절제 및 항암제, 특허공개 제2015-0021464호는 혈액암 또는 암전이 억제용 조성물, 특허공개 제2015-0021465호는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물, 특허공개 제2017-0005484호는 백혈구 감소증 및 혈소판 감소증 치료용 조성물을 개시하고 있다.

한편, 대한민국 특허공개 제2000-0059468호는 녹용(매화록)을 에탄올로 추출하고, 상기 에탄올 추출물에 대하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분획하여 하기 화학식의 화합물을 비롯한 4종의 포스포리피드계 신규화합물의 구조 및 이의 항진균 활성에 대해 개시하고 있다.

녹용은 상술한 바와 같이 다양한 약리활성이 있는 있고, 그 성분들도 매우 다양하여 아직까지 알려지지 않은 약리적 활성성분에 대한 지속적인 연구가 필요하다.

본 발명은 용매추출 및 분획법을 이용하여 녹용으로부터 항염증 생리활성을 가지는 신규 화합물을 분리하고, 상기 화합물의 안정적인 대량 생산이 가능하도록 화학적 합성함으로써, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명은 녹용으로부터 분리한 유효성분을 분석하여 하기 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 화학식 2로 표시되는 화합물은 서로 이성질체이고, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 화학식 4로 표시되는 화합물 역시 서로 이성질체이다.

본 발명에 따른 상기 화합물은 염증성 사이토카인(Cytokines)으로 발병하는 염증성 질환, 예컨대 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위염, 대장염, 통풍, 간직성 척추염, 섬유근통, 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염증성 질환에 이용될 수 있다.

한편, 본 발명은 (a) 팔미트산과 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 염기 조건 하에서 반응시켜 1-팔미토일 글리세롤을 합성하는 단계; (b) 상기 1-팔미토일 글리세롤과 아세틸 할라이드를 염기 조건 하에서 반응시켜 1-팔미토일-3-아세틸 글리세롤을 합성하는 단계; 및 (c) 상기 1-팔미토일-3-아세틸 글리세롤과 공액 리놀레산(Conjugated linoleic acid)를 염기 조건 하에서 반응시키는 단계를 포함하는, 1-팔미토일-2-공액 리놀레오일-3-아세틸 글리세롤(PCA glycerol)의 합성 방법을 제공한다.

다른 한편, 본 발명은 (a) 공액 리놀레산(Conjugated linoleic acid)과 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 염기 조건 하에서 반응시켜 1-공액 리놀레오일-글리세롤을 합성하는 단계; (b) 상기 1-공액 리놀레오일-글리세롤과 아세틸 할라이드를 염기 조건 하에서 반응시켜 1-공액 리놀레오일-3-아세틸 글리세롤을 합성하는 단계; 및 (c) 상기 1-공액 리놀레오일-3-아세틸 글리세롤과 팔미트산을 염기 조건 하에서 반응시키는 단계를 포함하는, 1-공액 리놀레오일-2-팔미토일-3-아세틸 글리세롤(CPA glycerol)의 합성 방법을 제공한다.

상기 합성에 이용되는 공액 리놀레산은 공액 리놀레산(cis-9,trans-11), 공액 리놀레산(trans-10,cis-12)의 단독 또는 혼합물일 수 있다.

본 발명에 따른 실시예 1 및 2의 신규 화합물은 대조구에 비해 대표적 염증성 사이토카인들인 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 생성이 현저하게 억제되고, 항암제로 야기되는 호중구 감소증 역시 현저하게 억제되었으며, 비교예의 PLA glycerol과 대비할 때에도 사이토카인 생성 억제 및 호중구 감소증 억제 효과가 유의적인 것이 확인되었다. 따라서 본 발명에 따른 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따라 녹용으로부터 3가지 유기 용매를 이용한 추출 방법을 나타내는 다이어그램이다.
도 2는 본 발명에 따라 녹용으로부터 추출한 추출물 C2의 분획 방법을 나타내는 다이어그램이다.
도 3은 본 발명에 따른 분획물 C2-2-E-a-Ms의 질량분석 데이터이다.
도 4는 본 발명에 따른 분획물 C2-2-E-a-Ms의 LC 데이터이다.
도 5의 (A)는 본 발명에 따른 분획물 C2-2-E-a-Ms의 UV분석 데이터이고, (B)는 비교예의 PLA glycerol의 UV분석 데이터이고, (C)는 공액 리놀레산(conjugated linoleic acid)의 UV분석 데이터이고, (D)는 리놀레산의 UV분석 데이터이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 신규 화합물의 MTT assay에 따른 세포 생존율(cell viability) 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 신규 화합물의 IL-6 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 신규 화합물의 IL-1β 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 신규 화합물의 TNF-α 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 신규 화합물의 NO 형성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 신규 화합물의 항암제(젬시타빈)으로 유도된 호중구 감소증의 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 신규 화합물의 항암제(타목시펜)으로 유도된 호중구 감소증의 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

본 발명자는 녹용 유래 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개발하기 위하여, 선행문헌의 용매추출법 및 분획법을 다각도로 분석하고 실시하여 하기와 같은 방법으로 염증성 질환에 우수한 생리활성을 가지는 신규 화합물을 분리하고, 상기 신규 화합물이 항암화학요법 약물로 유도되는 호중구 감소증(CIN)을 유의적인 억제하 효과를 확인하고, 상기 화합물의 신규 합성 방법을 개발하여 본 발명은 완성하였다.

녹용으로부터 생리활성 성분을 추출하기 위하여, 도 1에 도시된 바와 같이 녹용(매화록)을 헥산, 클로로포름, 70% 에탄올의 3가지 유기용매를 이용하여 순차적으로 추출을 실시하고, 도 2에 도시된 바와 같이 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 박막 액체 크로마토그래피를 실시하여 항염증 활성이 우수한 신규 화합물을 분리하였다.

유기 용매를 통한 추출

시중에서 구입한 매화록(Cervus nippon) 2㎏을 분쇄하여 비이커에 넣고 1차 추출용매로서 헥산(n-Hexane) 9L를 넣은 다음, 80℃에서 2시간 가열하는 방식으로 2회 추출하고 여과하여 헥산 추출액을 얻은 다음, 상기 헥산 추출액을 감압 하에 증류, 건조시켜 추출물 C1 30.3g을 수득하였다.

헥산 추출 후 남은 잔사에 2차 추출용매로서 클로로포름(CHCl₃) 9L를 넣은 다음, 80℃에서 2시간 동안 가열하여 2회 추출하고 여과하여 클로로포름 추출액을 얻은 다음, 클로로포름 추출액을 감압 하에 증류, 건조시켜 추출물 C2 17.9g을 수득하였다.

클로로포름 추출 후 남은 잔사에 3차 추출용매로서 70% 에탄올 9L를 넣은 다음, 80℃에서 5시간 동안 가열하여 2회 추출하고 여과하여 에탄올 추출액을 얻은 다음, 에탄올 추출액을 감압 하에 증류, 건조시켜 추출물 C3 89.2g을 수득하였다.

상기에서 수득된 추출물 C1, C2 및 C3 각각에 대하여 항염증 활성 실험한 결과 추출물 C2에서 항염증 활성 효과가 높은 것으로 확인되어 추출물 C2을 대상으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 생리활성 성분을 분획하였다.

실리카겔 컬럼 크로마토그래피

분말 실리카겔에 CHCl₃/MeOH(500:1, v/v) 혼합용액을 가하여 팽윤시킨 후, 열린 컬럼에 충진시켰다. 상기 수득한 추출물 C2 17.9g을 CHCl₃/MeOH(500:1, v/v)에 용해시켜 실리카겔이 충진된 컬럼에 적용시켰다. 컬럼에 용리액으로서 CHCl₃/MeOH(500:2, v/v)을 흘러 넣어주면서 50㎖ 씩의 용출분획을 받은 다음, TLC(전개용매: CHCl₃/MeOH=300:1)로 전개하여 요오드(I₂)로 발색시킨 후 Rf치에 따라 분리하여 7개의 주요 분획을 분리하였다. 분리된 각각의 분획을 감압증류하여 건조시켜 분획물 C2-1 내지 C2-7을 수득하였다. 상기 7가지의 분획물에 대하여 항염증 활성 실험한 결과 분획물 C2-2에서 항염증 활성 효과가 높은 것으로 확인되어 분획물 C2-2를 대상으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 생리활성 성분을 다시 분획하였다.

상기 분획물 C2-2 1.8g을 취하였다. 분말 실리카겔 20g에 헥산(n-Hx)/에틸아세테이트(EA)(50:1) 혼합용액 50㎖를 가하여 팽윤시켜 컬럼에 충진시켰다. 분획물 C2-2 1.8g을 용리액인 n-Hx/EA(50:1, v/v) 최소량에 용해시켜 실리카겔 컬럼에 적용시켰다. 상기 실리카겔 컬럼에 용리액을 흘려주면서 15㎖씩 용출분획을 받아 TLC(전개용매: n-Hx/EA=50:1, v/v)로 전개하고, 요오드로 발색시킨 후 Rf에 따라 분리하여 6개의 주요 분획을 분리하였다. 상기 분리된 각각의 분획을 감압증류시키고 건조시켜 분획물 C2-2-A 내지 C2-2-F을 수득하였다. 상기 6가지의 분획물에 대하여 항염증 활성 실험한 결과 분획물 C2-2-E에서 항염증 활성 효과가 높은 것으로 확인되어 분획물 C2-2-E를 대상으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 생리활성 성분을 다시 분획하였다.

상기 분획물 C2-2-E 212㎎을 취하였다. 분말 실리카겔 3.5g에 n-Hx/EA/AcOH(20:1:0.5, v/v/v) 혼합용액 10㎖를 가하여 팽윤시켜 컬럼에 충진시켰다. 분획물 C2-2-E 212㎎을 용리액인 n-Hx/EA/AcOH(20:1:0.5, v/v/v)에 용해시켜 실리카겔 컬럼에 적용시켰다. 상기 실리카겔 컬럼에 용리액을 흘려주면서 10㎖씩 용출분획을 받아 TLC(전개용매: n-Hx/EA/AcOH=20:1:0.5, v/v/v)로 전개하고, 요오드로 발색시킨 후 Rf에 따라 분리하여 2개의 주요 분획을 분리하였다. 상기 분리된 각각의 분획을 감압증류시키고 건조시켜 각각 분획물 C2-2-E-a 및 C2-2-E-b을 수득하였다. 상기 2가지의 분획물에 대하여 항염증 활성 실험한 결과 분획물 C2-2-E-a에서 항염증 활성 효과가 높은 것으로 확인되어 분획물 C2-2-E-a를 대상으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 생리활성 성분을 다시 분획하였다.

상기 분획물 C2-2-E-a 137㎎을 취하였다. 이 C2-2-E-a에 메탄올 5㎖을 가하여 혼합시켜 메탄올-가용성 분획물 C2-2-E-a-Ms)과 메탄올-불용성 분획물 C2-2-E-a-Mi)으로 분리하고 각각의 분획을 감압증류시키고 건조시켜 분획물 C2-2-E-a-Ms는 63㎎을 수득하였다. 상기 2가지의 분획물에 대하여 항염증 활성 실험한 결과 분획물 C2-2-E-a-Ms에서 항염증 활성 효과가 높은 것으로 확인되었다.

후술하는 실험예 2에 따른 방법을 통하여 상기 분획물의 항염증 억제 평가를 수행하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

분획물 (100㎍/ml)	IL-6 생성량 (pg/ml)	IL- 1β 생성량 (pg/ml)	TNF-α 생성량 (pg/ml)
C2-2	453	59	283
C2-2-E	402	43	233
C2-2-E-a	321	36	197
C2-2-E-a-Ms	253	34	162

상기 표 1에 보이는 바와 같이, 분획물이 소분획될수록 염증성 사이토카인들인 IL-6, IL-1β, TNF-α의 생성이 억제됨을 알 수 있다.

분획물 중 가장 염증 억제 활성이 높은 분획물 C2-2-E-a-Ms의 유효성분을 확인하기 위하여 MALDI-TOF/TOF 질량분석기(Bruker Ultraflextreme^TM, German), 액체 크로마토그래피(LC) 및 UV 분석기를 이용하여 성분 분석을 실시하였다.

도 3은 분획물 C2-2-E-a-Ms의 질량분석 데이터이고, 도 4는 분획물 C2-2-E-a-Ms의 LC 데이터이고, 도 5의 (A)는 본 발명에 따른 분획물 C2-2-E-a-Ms의 UV분석 데이터, (B)는 비교예의 PLA glycerol의 UV분석 데이터, (C)는 공액 리놀레산(conjugated linoleic acid)의 UV분석 데이터, (D)는 리놀레산의 UV분석 데이터이다.

본 발명의 분획물 C2-2-E-a-Ms의 유효성분의 질량을 분석한 결과, 질량은 녹용으로부터 분리된 공지의 PLA glycerol(특허공개 제1999-0044781호의 화합물 KJ-3)과 동일하였으나, UV분석 결과 PLA glycerol과는 전혀 다른 UV분석 패턴을 보였다. 도 5의 (C) 공액 리놀레산(Conjugated linoleic acid) UV 패턴, (D) 리놀레산(Linoleic acid)의 UV 패턴과 비교함으로써 본 발명의 분획물 C2-2-E-a-Ms의 화합물은 공액 리놀레오일(Conjugated linoleoyl)의 신규한 구조를 가지는 것이 확인되었다.

본 발명에 따른 상기 항염증 생리활성 유효성분은 글리세롤 구조에 아세틸기(acetyl), 팔미토일(palmitoyl), 공액 리놀레오일(conjugated linoleoyl)이 결합된 하기 화학식 1 내지 4로 표시되는 신규 화합물임이 본 발명에서 비로소 확인되었다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 PCA glycerol의 화학적 합성

본 발명에 따른 화학식 1, 화학식 2의 화합물(PCA glycerol)은 하기 반응식 1에 따라 고수율로 제조될 수 있다.

[반응식 1]

본 발명에 따른 PCA glycerol은,

(a) 팔미트산과 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 염기 조건 하에서 반응시켜 1-팔미토일 글리세롤을 합성하는 단계;

(b) 상기 1-팔미토일 글리세롤과 아세틸 할라이드를 염기 조건 하에서 반응시켜 1-팔미토일-3-아세틸 글리세롤을 합성하는 단계; 및

(c) 상기 1-팔미토일-3-아세틸 글리세롤과 공액 리놀레산(Conjugated linoleic acid)를 염기 조건 하에서 반응시켜 1-팔미토일-2-공액 리놀레오일-3-아세틸 글리세롤(PCA glycerol)을 합성하는 단계를 포함한다.

상기 단계 (a)에서 화학식 5의 화합물은 1,3-디올 화합물로 보호된 글리세롤 유도체이다. 상기 반응은 트리에틸아민(triethylamine)와 같은 염기 조건 하에서 실시될 수 있고, 팔미트산의 반응활성을 극대화시키기 위하여 피바로일 할라이드(Pivaloyl halide)를 첨가하여 anhydride reaction을 통해 실시될 수 있다. 반응 후 염산 등을 사용하여 탈보호시키면 1-팔미토일 글리세롤이 합성된다. 팔미트산과 화학식 5의 화합물의 당량(eq.)은 0.9:1.1 ~ 1.1:0.9가 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 (b)에서 1-팔미토일 글리세롤과 아세틸 할라이드의 당량은 1:1 ~ 1:1.6가 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 (c)에서 공액 리놀레산의 반응활성을 극대화시키기 위하여 피바로일 할라이드(Pivaloyl halide)를 첨가하여 anhydride reaction을 통해 실시될 수 있다. 1-팔미토일-3-아세틸 글리세롤과 공액 리놀레산의 당량(eq.)은 0.9:1.1 ~ 1.1:0.9가 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 본 발명에 따른 화학식 3, 화학식 4의 화합물(CPA glycerol)은 하기 반응식 2에 따라 고수율로 제조될 수 있다.

[반응식 2]

본 발명에 따른 CPA glycerol은,

(a) 공액 리놀레산(Conjugated linoleic acid)과 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 염기 조건 하에서 반응시켜 1-공액 리놀레오일-글리세롤을 합성하는 단계;

(b) 상기 1-공액 리놀레오일-글리세롤과 아세틸 할라이드를 염기 조건 하에서 반응시켜 1-공액 리놀레오일-3-아세틸 글리세롤을 합성하는 단계; 및

(c) 상기 1-공액 리놀레오일-3-아세틸 글리세롤과 팔미트산을 염기 조건 하에서 반응시켜 1-공액 리놀레오일-2-팔미토일-3-아세틸 글리세롤(CPA glycerol)을 합성하는 단계를 포함한다. 상기 단계 (a), (c)에서 anhydride reaction을 위해 피바로일 할라이드(Pivaloyl halide)를 첨가할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 신규 화합물의 합성 방법을 구체적으로 설명한다.

실시예 1: 1 -Palmitoyl-2-conjugated- linoleoyl -3-acetyl glycerol (PCA glycerol)의 제조

(1) 1-Palmitoyl glycerol의 제조

Methylene chloride(MC) 200ml에 Palmitic acid 20.0g과 triethylamine 17.0g을 첨가하고 0℃로 냉각한 후, Pivaloyl chloride 10.0g을 천천히 적가하고 2시간 동안 교반한 다음, Solketal 10.8g과 4-Dimethylaminopyridine 0.1g을 첨가한 후 실온에서 12시간 교반하고 정제수 200ml를 첨가하고 층분리 후 유기층은 진공 농축하였다. 농축 모액에 Methanol 200ml, 염산 20ml를 투입하고 실온에서 10시간 교반 후 n-hexane 300ml, 정제수 300ml를 투입하고 3시간 교반 후 여과하고 진공 건조하여 목적 화합물 21.9g (수율:85.0%)을 수득하였다.

(2) 1-Palmitoyl-3-acetyl glycerol의 제조

MC 200ml에 상기 수득된 1-Palmitoyl glycerol 20.0g과 Pyridine 33.5g, 4-Dimethylaminopyridine 0.2g을 첨가하고 1시간 동안 교반한 다음, Acetyl chloride 7.1g을 적가하고 5시간 교반하였다. 정제수 200ml를 투입하고 묽은 염산으로 중화하고 층분리 한 후 유기층을 MgSO₄로 탈수한 후 진공 농축하고 n-hexane 100ml를 투입하고 10℃ 이하에서 결정화하여 여과 후 진공 건조하여 목적 화합물 18.5g (수율: 82.0%)을 수득하였다.

(3) 1-Palmitoyl-2-C- linoleoyl -3-acetyl glycerol (PCA glycerol)의 제조

n-Hexane 180ml에 conjugated Linoleic acid(cis-9,trans-11/trans-10,cis-12) 14.0g과 triethylamine 10.8g을 첨가하고 0℃로 냉각하고 Pivaloyl chloride 7.0g을 천천히 적가하였다. 적가 완료 후 동온도에서 1시간 교반 후, 1-Palmitoyl-3-Acetyl glycerol 18.0g과 4-Dimethylaminopyridine 1.0g을 첨가하고 실온에서 10시간 교반하였다. 정제수 180ml를 투입하고 층분리 하고 유기층은 MgSO₄로 탈수한 후 진공 농축하고 실리카겔 컬럼 정제(용출액: n-Hx:EA=20:1, v/v)하여 목적화합물 26.1g (수율: 85%)을 수득하였다.

실시예 2: 1 -Conjugated- linoeoyl -2- palmitoyl -3-acetyl glycerol (CPA glycerol)의 제조

(1) 1-C- linoleoyl glycerol의 제조

n-Hexane 200ml에 conjugated Linoleic acid(cis-9,trans-11/trans-10,cis-12) 22.0g과 triethylamine 10.8g을 첨가하고 0℃로 냉각하고 Pivaloyl chloride 7.0g을 천천히 적가하고 동온도에서 1시간 동안 교반한 다음, Solketal 10.8g과 4-Dimethylaminopyridine 0.1g을 첨가한 후 실온에서 12시간 교반하고 정제수 200ml를 첨가하고 층분리 후 유기층은 진공 농축하였다. 농축 모액에 methanol 200ml, 염산 20ml를 투입하고 실온에서 교반하여 10시간 교반 후 n-hexane 300ml, 정제수 300ml를 투입하고 3시간 교반 후 여과하고 진공 건조하여 목적 화합물 22.8g (수율: 82%)을 수득하였다.

(2) 1-C- linoleoyl -3-acetyl glycerol의 제조

MC 200ml에 1-C-linoleoyl glycerol 20.0g과 pyridine 33.5g, 4-Dimethylaminopyridine 0.2g을 첨가하고 1시간 교반한 다음, Acetyl chloride 6.6g을 적가하고 5시간 교반하였다. 정제수 200ml를 투입하고 묽은 염산으로 중화하고 층분리한 후 유기층을 MgSO₄로 탈수한 후 진공 농축하고 n-hexane 100ml를 투입하고 10℃ 이하에서 결정화하여 여과 후 진공건조하여 목적 화합물 17.7g (수율: 79.0%)을 수득하였다.

(3) 1-C- linoleoyl -2- palmitoyl -3-acetyl glycerol (CPA glycerol)의 제조

n-Hexane 180ml에 Palmitic acid 12.2g과 triethylamine 10.8g을 첨가하고 0℃로 냉각하여 Pivaloyl chloride 7.0g을 천천히 적가하였다. 적가 완료 후 동온도에서 1시간 교반 후 1-C-linoleoyl-3-acetyl glycerol 18.0g과 4-Dimethylaminopyridine 1.0g을 첨가하고 실온에서 10시간 교반하였다. 정제수 180ml를 투입하고 층분리 하고 유기층은 MgSO₄로 탈수한 후 진공 농축하고 실리카겔 컬럼 정제(용출액: n-Hx:EA=20:1, v/v)하여 목적화합물 25.9g (수율: 86%)을 수득하였다.

비교예 : 1-Palmitoyl-2- linoleoyl -3-acetyl glycerol (PLA glycerol)의 제조

실시예 1와 동일한 방법으로 하되 conjugated Linoleic acid(cis-9,trans-11/trans-10,cis-12) 대신 Linoleic acid(cis-9,cis-12)를 사용하여 PLA glycerol을 합성하였다.

n-Hexane 180ml에 Linoleic acid(cis-9,cis-12) 14.0g과 triethylamine 10.8g을 첨가하고 0℃로 냉각하고 Pivaloyl chloride 7.0g을 천천히 적가하였다. 적가 완료 후 동온도에서 1시간 교반 후, 1-Palmitoyl-3-acetyl glycerol 18.0g과 4-Dimethylaminopyridine 1.0g을 첨가하고 실온에서 10시간 교반하였다. 정제수 180ml를 투입하고 층분리하고 유기층은 MgSO₄로 탈수한 후 진공 농축하고 실리카겔 컬럼 정제(용출액: n-Hx:EA=20:1, v/v)하여 목적화합물 24.9g (수율: 81%)을 수득하였다.

상기 실시예 1, 2 및 비교예에서 합성된 화합물의 항염증 활성 실험을 다음과 같은 동물실험으로 평가하였다.

A. 실험동물

실험동물로서 8주령 C57BL/6 마우스를 온도 22±2℃, 상대습도 65±5%로, 명암 12시간 주기의 환경에서 7일 동안 사육하여 실험실 환경에 적응시킨 뒤 실험에 사용하였다. 고형사료(삼양사료)와 물을 충분히 공급하였다.

B. 복강대식세포의 분리 배양

마우스에 HBSS를 복강 주사하여 대식세포(macrophage)를 추출하고, 3,000rpm에 5분간 원심분리 후 10% 소태아혈청(FBS)을 첨가한 DMEM배지에 100units/mL의 penicillin/streptomycin을 넣어 복강대식세포를 분리하였으며, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양후 실험에 사용하였다.

실험예 1: MTT assay를 통한 세포 독성 평가

상기 배양된 복강대식세포를 3×10⁵ cells/well로 96웰 플레이트에 100uL씩 분주하여 밤새 배양하였다. 배지를 제거한 후 상기 실시예 1(PCA glycerol), 실시예 2(CPA glycerol)의 화합물을 농도별(각각 10㎍/ml, 100㎍/ml 및 200㎍/ml)로 복강대식세포에 처리한 다음, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 MTT(5mg/mL) 시약을 40uL씩 분주하고 CO₂ 배양기에서 4시간 배양한 뒤, MTT 시약을 제거하고 DMSO 시약을 600uL씩 분주한 다음 30분간 상온에서 방치하였다. 이후 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)로 540 nm에서 흡광도(OD)를 측정하였다.

실시예 1 및 실시예 2의 화합물의 MTT assay에 따른 세포 생존율(cell viability)을 측정하여 하기 표 2와 도 6의 그래프로 나타내었다. 표 2 및 도 6에 보이는 바와 같이 세포 생존율은 최고 200㎍/ml 처리시에도 유의적인 차이가 없음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 신규 화합물은 세포 독성이 없음이 확인되었다.

	정상군	실시예1 (㎍/ml)			실시예2 (㎍/ml)
	정상군	10	100	200	10	100	200
세포 생존율(%)	100±1.2	100±2.1	98.3±1.9	98.1±1.2	100±0.9	98.3±1.7	98.0±2.8

실험예 2: 항염증 활성 실험(IL-6, IL- 1β 및 TNF-α 생성 억제 평가)

염증 반응 유도인자인 지질다당류(lipopolysaccharides, LPS)로 유도된 마우스 복강대식세포로부터 분비된 IL-6, IL-1β 및 TNF-α 분비량을 ELISA assay(Millipore사, USA)를 이용하여 측정함으로써 항염증 활성을 평가하였다.

세포 배양액을 얻기 위해 마우스 복강대식세포를 3×10⁵ cells/mL로 조절하여 96웰 플레이트에 접종하고 24시간 배양 후 상기 실시예 1(PCA glycerol), 실시예 2(CPA glycerol) 및 비교예(PLA glycerol)의 화합물을 농도별(각각 10㎍/ml, 100㎍/ml 및 200㎍/ml)로 처리하고, LPS(1㎍/ml)를 처리하였다. 정상군는 무처리, 대조군은 LPS(1㎍/ml)만을 복강대식세포에 처리하였다. 12시간 배양 후 원심분리를 통해 상층액을 얻었다. ELISA는 마이크로플레이트에 포획 항체(capture antibody)로 항-마우스 IL-6, IL-1β 및 TNF-α를 분주하였다. 이후 0.05% Tween 20이 포함된 인산완충식염수(PBST)로 세척하고 10% FBS으로 차단한 뒤 PBST로 세척하고 웰에 세포 배양 상층액을 분주하고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 PBST로 세척하고 희석한 비오티닐된(biotinylated) 항-마우스 IL-6, IL-1β 및 TNF-α 검출 항체(detection antibody)와 스트렙타비딘-HRP 접합체(streptavidin-horseradish peroxydase conjugate)를 분주하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 다시 PBST로 세척하고 OPD 용액을 첨가하여 실온에서 30분 동안 암반응시켰다. 2 N H₂SO₄로 반응을 종료시킨 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 1 및 실시예 2의 화합물의 IL-6 생성량을 측정하여 하기 표 3에 도시하고, 도 7의 그래프로 나타내었다. 표 3 및 도 7에 보이는 바와 같이 실시예 1 및 2에서 제조된 화합물은 대조군에 비해 IL-6 생성량이 현저하게 감소되었으며, 비교예와 대비할 때도 유의적인 IL-6 생성 억제 효과를 가지는 것을 알 수 있다.

		LPS (1㎍/ml)
	정상군	대조군	실시예1 (㎍/ml)			실시예2 (㎍/ml)			비교예 (㎍/ml)
	정상군	대조군	10	100	200	10	100	200	10	100	200
IL-6 생성량 (pg/ml)	150±18	834±32	321±22	225±23	180±25	325±13	234±20	179±17	364±16	251±24	203±25

실시예 1 및 실시예 2의 화합물의 IL-1β 생성량을 측정하여 하기 표 4에 도시하고, 도 8의 그래프로 나타내었다. 표 4 및 도 8에 보이는 바와 같이 실시예 1 및 2에서 제조된 화합물은 대조군에 비해 IL-1β 생성량이 현저하게 감소되었으며, 비교예와 대비할 때도 유의적인 IL-1β 생성 억제 효과를 가지는 것을 알 수 있다.

		LPS (1㎍/ml)
	정상군	대조군	실시예1 (㎍/ml)			실시예2 (㎍/ml)			비교예 (㎍/ml)
	정상군	대조군	10	100	200	10	100	200	10	100	200
IL-1β 생성량 (pg/ml)	25±1.8	72±3.5	40±2.9	28±2.3	26±2.8	40±1.7	32±2.4	28±1.7	43±2.2	31±2.4	31±3.1

실시예 1 및 실시예 2의 화합물의 TNF-α 생성량을 측정하여 하기 표 5에 도시하고, 도 9의 그래프로 나타내었다. 표 5 및 도 9에 보이는 바와 같이 실시예 1 및 2에서 제조된 화합물은 대조군에 비해 TNF-α 생성량이 현저하게 감소되었으며, 비교예와 대비할 때도 유의적인 TNF-α 생성 억제 효과를 가지는 것을 알 수 있다.

		LPS(1㎍/ml)
	정상군	대조군	실시예1 (㎍/ml)			실시예2 (㎍/ml)			비교예 (㎍/ml)
	정상군	대조군	10	100	200	10	100	200	10	100	200
TNF-α 생성량 (pg/ml)	113±11	375±16	170±8	153±11	121±10	175±7	151±10	123±7	184±21	155±12	137±7

실험예 3: 항염증 활성 실험(NO 형성 억제 평가)

상기 배양된 복강대식세포를 10% FBS가 포함된 DMEM에 현탁시킨 후, 96웰 플레이트에 5×10⁵ cells/well로 분주하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하고, 새로운 DMEM배지로 교환한 후, 실시예 1, 2 및 비교예의 화합물 각각을 농도별(각각 10㎍/ml, 100㎍/ml 및 200㎍/ml)로 복강대식세포에 처리하고 LPS(1㎍/ml)를 처리한 다음, 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 상층액을 분리하여 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 분리된 상층액을 새로운 마이크로플레이트(microplate)에 분주하였다. 정상군는 무처리, 대조군은 LPS(1㎍/ml)만을 복강대식세포에 처리하였다.

동일한 양의 Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.1% naphthyl-ethylenediamine dihydrochloride, 2% phosphoric acid)을 처리하여 상온에서 10분 반응시켰다. 배양액과 Griess 용액을 5분 동안 반응시킨 후 540nm에서 흡광도(OD)를 측정하였다.

도 10은 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2의 신규 화합물의 NO 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

실시예 1 및 실시예 2의 화합물의 일산화질소(NO) 생성율을 측정하여 하기 표 6에 도시하고, 도 10의 그래프로 나타내었다. 표 6 및 도 10에 보이는 바와 같이 실시예 1 및 2에서 제조된 화합물은 대조군에 비해 NO 생성율이 현저하게 감소되었으며, 비교예와 대비할 때도 유의적인 NO 생성 억제 효과를 가지는 것을 알 수 있다.

		LPS (㎍/ml)
	정상군	대조군	실시예1 (㎍/ml)			실시예2 (㎍/ml)			비교예 (㎍/ml)
	정상군	대조군	10	100	200	10	100	200	10	100	200
NO 생성율 (%)	25±2	100±4	52±3	43±3	37±4	50±2	44±3	34±1	56±3	45±2	41±3

본 발명에 따른 화합물은 염증성 사이토카인으로 발병하는 염증성 질환, 예컨대 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위염, 대장염, 통풍, 간직성 척추염, 섬유근통, 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

비교예의 PLA glycerol은 항암화학요법 약물로 유도되는 호중구 감소증(CIN)의 후보 물질 EC-18로서 최근 FDA의 임상 2상이 완료된 것으로 알려져 있으며, 종래 치료제인 G-CSF(filgrastim) 또는 이의 유도체들(pegfilgrastim)과는 다른 작용기전으로 호중구 감소증을 억제시키는 것으로 보고되어 있다.

이하에서는 본 발명의 실시예 1, 2의 화합물과 비교예의 화합물의 항암화학요법 약물로 유도되는 호중구 감소증 억제 효과를 마우스 실험을 통해 검증한다.

실험예 4: 항암화학요법으로 유도된 호중구 감소증의 마우스 실험

항암제로 사용되는 젬시타빈(Gemcitabine) 50 mg/kg를 C57BL/6 마우스에 매일 3주 동안 복강내 주사하여 대조군으로 하고, 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1의 화합물 50 mg/kg를 매일 3주 동안 경구 투여하여 3주 경과후 자동 혈액 샘플 분석기(Auto Hematology Analyzer BC-5900, Mindray사)를 이용하여 혈액 1㎕ 내 호중구 수를 측정하여 그 결과를 하기 표 7 및 도 11에 나타내었다.

	-	젬시타빈 (50mg/kg)
	정상군	대조군	실시예1	실시예2	비교예
호중구 수(/㎕)	1224±45	678±54	1198±43	1142±62	1047±42

상기 표 7 및 도 11에 나타나는 바와 같이, 젬시타빈을 투여한 마우스에서 호중구 수는 약 45%의 감소를 보인 반면, 비교예의 화합물(PLA glycerol)에서는 14.5% 호중구 수 감소를 보인 반면, 실시예 1의 화합물(PCA glycerol)에서는 약 2% 감소, 실시예 2의 화합물(CPA glycerol)에서는 약 6.7% 감소로, 대조군은 물론, 비교예와 비교할 때에도 유의적인 효과가 있음이 확인되었다.

항암제로 사용되는 타목시펜(Tamoxifen) 50 mg/kg를 C57BL/6 마우스에 매일 3주 동안 복강내 주사하여 대조군으로 하고, 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1의 화합물 50 mg/kg를 매일 3주 동안 경구 투여하여 3주 경과후 자동 혈액 샘플 분석기(Auto Hematology Analyzer BC-5900, Mindray사)를 이용하여 혈액 1㎕ 내 호중구 수를 측정하여 그 결과를 하기 표 8 및 도 12에 나타내었다.

	-	타목시펜 (50mg/kg)
	정상군	대조군	실시예1	실시예2	비교예
호중구 수(/㎕)	1224±45	774±49	1146±63	1124±57	1066±88

상기 표 8 및 도 12에 나타나는 바와 같이, 타목시펜을 투여한 마우스에서 호중구 수는 약 37%의 감소를 보인 반면, 비교예의 화합물(PLA glycerol)에서는 12.9% 호중구 수 감소를 보인 반면, 실시예 1의 화합물(PCA glycerol)에서는 약 6.3% 감소, 실시예 2의 화합물(CPA glycerol)에서는 약 8.2% 감소로, 대조군은 물론, 비교예와 비교할 때에도 유의적인 효과가 있음이 확인되었다.

본 발명의 화합물은 상기 항암화학요법 약물 외에도 공지된 상기 항암화학요법 약물은 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide), 이마티닙(Imatinib), 레날리도마이드(Lenalidomide), 보르테조밉(Bortezomib), 페메트렉시드(Pemetrexed), 메토트렉세이트(Methotrexate), 파클리탁셀(Paclitaxel), 에토포시드(Etoposide), 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 메클로레타니메(Mechlorethanime), 클로람부실(Chlorambucil), 멜팔란(Melphalan), 카무스틴(Carmustine, BCNU), 로무스틴(Lomustine, CCNU), 이포스파마이드(Ifosfamide), 프로카르바진(Procarbazine), 다카르바진(Dacarbazine, DTIC), 알트레타민(Altretamine), 메스나(Mesna), 시스플라틴(Cisplatin), 카르보플라틴(Carboplatin), 악티노마이신 D(Actinomycin D), 독소루비신(Doxorubicin), 다우노루비신(Daunorubicin), 6-메르캅토푸린(6-Mercaptopurine), 6-티오구아닌(6-Thioguanine), 아이다루비신(Idarubicin), 에피루비신(Epirubicin), 미토산트론(Mitoxantrone), 아자티오프린(Azathioprine), 2-클로로디옥시아데노신(2-Chloro deoxyadenosine), 히드록시유레아(Hydroxyurea), 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil), 사이토신 아라비노사이드(Cytosine arabinoside), 아자시티딘(Azacytidine), 플루다라빈 인산염(Fludarabine phosphate), 빈크리스틴(Vincristine), 빈블라스틴(Vinblastine), 비노렐빈(Vinorelbine), 도세탁셀(Docetaxel), Nab-파클리탁셀(Nab-paclitaxel), 다사티닙(Dasatinib), 수니티닙(Sunitinib) 등으로 야기되는 호중구 감소증의 억제 약물로서 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]
제1항에 있어서,
상기 유효성분은 화학식 1로 표시되는 화합물 및 화학식 2로 표시되는 화합물의 혼합물인, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 유효성분은 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 화학식 4로 표시되는 화합물의 혼합물인, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 유효성분은 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 염증성 질환은 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위염, 대장염, 통풍, 간직성 척추염, 섬유근통, 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
하기 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]
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