CN113817007B - 龙胆苦苷衍生物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了坚龙胆来源的龙胆苦苷的制备方法和以此为基础合成的龙胆苦苷衍生物及其合成方法。本发明通过PC12细胞生物活性系统的评价发现这些化合物拟神经生长因子活性较好，可在制备抗阿尔茨海默症药物和保健品中应用。本发明为抗阿尔茨海默症的新药研发和基础性研究提供依据，具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一类龙胆苦苷衍生物及其制备和应用。
背景技术
随着现代社会医疗卫生水平的提高，人类平均寿命延长，社会老龄化现象日益严重。相关统计报告预计，至2050年，60岁以上人口将达20亿，约占世界总人口22％。随着老龄化加剧，老年性相关疾病发病率也逐年攀升，阿尔茨海默症(Alzheimer’sdisease，AD)，俗称老年痴呆症，是发病率最高的疾病之一。相关报告显示，60岁及以上患病老人中11.2％是由老年痴呆症引起，高于中风、心血管疾病和癌症发病人群。因此，对AD的发病机制深入研究，并研发相关药物已经引起科学界的高度关注，对于推动社会科学进步和人类生命健康有重大意义。
一般而言，AD是一种慢性神经退行性疾病，主要是因为β-淀粉样蛋白(Aβ)和磷酸化的Tau蛋白在神经系统积聚，导致突触功能障碍，引发认知功能损伤。AD的精确分子机制尚未完全了解，目前科学上存在基于致病因素的各种理论和假设，如Aβ淀粉样肽学说、Tau蛋白异常磷酸化学说、胆碱能系统损伤学说、自由基氧化应激学说、其他疾病如糖尿病或高血压的影响、免疫系统功能障碍和基因突变等。综合所有这些假说可以得出这样的结论：AD是一种多因素疾病。
目前科学家根据不同的病理机制，现已研究出几大类相应的治疗药物。当今市场上抗AD的一线治疗药，包括乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)，如他克林、卡巴拉汀、加兰他敏、多奈哌齐和我国自主研发并上市的石杉碱甲，已经通过美国FDA认证，目前已广泛投入市场。但这些药物只能在一定程度上缓解病人的早期症状，而无法根治疾病。另外还有一种典型代表药物美金刚(memantine)，主要是通过阻断谷氨酸NMDA受体(N-methyl-D-asparticacid receptor)，延缓对神经细胞有毒性作用的兴奋性神经递质谷氨酸的释放速度。目前，美金刚是唯一用于中度和重度阶段AD的药物。美金刚的作用机制与AChEI有所不同，二者可以合用，以增加疗效。
而其他对AD有效的药物，如大脑代谢调节剂吡咯烷酮衍生物吡拉西坦，是促进脑部代谢的代表性药物，或者磷酸二酯酶抑制剂如丙戊茶碱，是一种能舒张血管舒张，促进脑部循环，改善脑能量代谢。相似药物还有吡硫醇和脑活素等。另外，钙拮抗剂尼莫地平对脑循环损伤有一定的保护作用，扩张脑部血管，提高大脑血液循环，从而改善AD患者认知功能障碍。
另外抗氧化剂和自由基清除剂，可以一定程度上保护神经细胞免受损伤，对AD有一定的治疗作用。实验研究用银杏叶(Ginkgo biloba L.)提取物治疗AD患者，发现其能明显改善神经细胞由于氧化应激损伤造成的患者认知功能障碍。积雪草(Centellaasiatica(L.)Urban)提取物白藜芦醇可以缓解痴呆雄性大鼠模型的认知损伤，清除大鼠脑内多余自由基，保护神经系统免受其影响。维生素C和维生素E有良好的抗氧化效果，提高细胞膜的稳定性，保护中枢神经系统的海马区细胞，还能抑制和清除脑内沉积的Aβ，改善AD症状。
神经生长因子(NGF)由中枢神经系统前额叶脑组织产生，经胆碱能神经元摄取后运输到胞体，是维持机体神经元的生长和分化最有效的成分，同时对于神经元损伤的修复和再生效果显著。实验研究探讨NGF对老年痴呆鼠学习记忆能力的影响，通过Morris水迷宫实验和Y迷宫测试发现NGF对中枢胆碱能神经元有营养作用，能提高中枢神经系统突触间隙ACh的释放，激活AChE的活性，能有效防止神经元变性和死亡，改善AD鼠认知功能障碍，逆转痴呆症状，提高学习记忆能力。但由于NGF极性高，难以透过血脑屏障，限制了它在治疗AD中的应用。因此，寻找具有拟NGF的具有促神经元再生活性的，容易通过血脑屏障的小分子化合物，具有较高的研究价值和广泛的应用前景。
天然产物作为大自然经过漫长的筛选和进化选择出来的结果，其结构与功能研究对新药发现、生命科学的认识、探索药物作用机制具有重要科学意义。从天然产物中开发可作为药物先导化合物、具有生物活性的小分子，为药物研发提供了新的思路。在抗AD药物开发领域，目前科学已发现天然产物中的有效成分如萜类、酯类、生物碱、糖苷类甾体化合物等具有显著的神经保护功能方面的药理活性。
坚龙胆为龙胆科植物，多年生草本，分布于广西、四川、贵州、云南等地。已有研究表明坚龙胆具有抗氧化、抗炎镇痛、抗糖尿病、提高认知能力等效果。目前研究已从坚龙胆中发现了大量的化合物，主要包括环烯醚萜类、三萜类、黄酮类、木质素类和苯甲酸酯类等化学结构。发明人于2010年从坚龙胆(Gentiana rigescens Franch)提取物低极性部分中发现了一类具有新化学结构的苯甲酸酯类化合物(n-GS)，能显著促进PC12细胞神经突起分化，具有拟神经因子活性，并证明n-GS可以缓解东莨宕碱诱导的痴呆模型鼠的记忆缺失等症状。在此基础上通过构效关系研究发现以ABG-001为代表的化合物活性最显著，开发为抗AD药物的潜力巨大。此外，环烯醚萜苷类化合物是龙胆中主要的药用成分之一，也是龙胆的特征性成分。其中主要药效成分之一的龙胆苦苷是本次研究的主要内容。
PC12细胞(pheochromocytoma cells)作为本研究的细胞模型，由大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞系克隆得到，未分化的PC12细胞胞体明亮，形态不规则。在神经生长因子(NGF)作用下，该细胞有明显的神经突起伸长，是典型的神经元分化和NGF作用分子机制研究模型。因此，PC12细胞常用作筛选具有拟NGF活性化合物的细胞模型，即筛选抗AD的先导化合物的细胞模型。PC12细胞与神经细胞结构、功能类似，与神经元相比，PC12细胞培养条件简单，可传代培养。作为神经元细胞模型，在神经生理生化等领域研究得到广泛应用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一类龙胆苦苷衍生物，具有下式(I)或(II)所示结构：
式(I)中，R1为-CH2CH3，R2为H或-COOCH2CH3，依次记为化合物2、3；
式(II)中，R3为-COOCH2CH3或-COCH3，依次记为化合物4、5。
本发明另一目的是提供龙胆苦苷(本发明中记为化合物1)以及上述龙胆苦苷衍生物(即化合物2～5)的制备方法。
龙胆苦苷的制备方法，包括：将中药龙胆在室温下于甲醇中浸泡提取，过滤所得滤液浓缩，用水溶解后，依次用正己烷、乙酸乙酯和正丁醇分配，得到活性正丁醇层，用ODS开放式色谱柱分离正丁醇馏分，并用体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、70:30、90:10和100:0的MeOH/H2O洗脱得到七个组分，其中第三个组分通过HPLC纯化，得到龙胆苦苷；
所述HPLC纯化的条件包括：色谱柱Cosmosil 5C30-UG-5Φ10×250mm，流动相MeOH/H2O体积比30:70，流速3mL/min，检测波长210nm，保留时间44min。
化合物2的制备方法包括：
在室温下，向龙胆苦苷的无水甲醇溶液中加入三苯基膦氯化铑，在H2氛围下反应后过滤，真空浓缩，然后通过ODS柱色谱分离，洗脱剂MeOH/H2O体积比20:80，然后通过HPLC纯化，得到化合物2；
所述HPLC纯化的条件包括：色谱柱SP-ODS-AΦ20×250mm，流动相MeOH/H2O体积比15:85～50:50梯度洗脱60min，流速10mL/min，检测波长210nm，保留时间24.0min。
化合物3的制备方法包括：
在室温下，向焦碳酸二乙酯和三氟甲基磺酸钪的无水甲苯/乙醇混合溶液中加入化合物2；所得混合物在50～60℃加热搅拌反应后，冷却至室温，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应，过滤、真空浓缩，浓缩物用EtOAc萃取，有机相经Na2SO4干燥、过滤和浓缩，所得粗样通过硅胶柱色谱分离，洗脱剂DCM(二氯甲烷)/MeOH体积比90:10，然后通过HPLC纯化，得到化合物3；
所述HPLC纯化的条件包括：色谱柱5C18-MS-IIΦ10×250mm，流动相MeOH/H2O体积比30:70～70:30梯度洗脱45min，流速3mL/min，检测波长210nm，保留时间36.0min。
化合物4的制备方法包括：
在室温下，向化合物3的无水吡啶溶液中加入乙酸酐，搅拌反应后用饱和NaHCO3溶液淬灭反应，真空浓缩，浓缩物用EtOAc萃取，有机相经Na2SO4干燥、过滤和浓缩，所得粗样通过硅胶柱色谱分离，洗脱剂DCM/MeOH体积比70:30，然后通过HPLC纯化，得到化合物4；
所述HPLC纯化的条件包括：色谱柱5C18-MS-IIΦ10×250mm，流动相MeOH/H2O体积比20:80～50:50梯度洗脱45min，流速3mL/min，检测波长210nm，保留时间38.3min。
化合物5的制备方法包括：
在室温下，向化合物2的无水吡啶溶液中加入乙酸酐，搅拌反应后用饱和NaHCO3溶液淬灭反应，真空浓缩，浓缩物用EtOAc萃取，有机相经Na2SO4干燥、过滤和浓缩，所得粗样通过硅胶柱色谱分离，洗脱剂DCM/MeOH体积比75:25，然后通过HPLC纯化，得到化合物5；
所述HPLC纯化的条件包括：色谱柱5C18-MS-IIΦ10×250mm，流动相MeOH/H2O体积比30:70～70:30梯度洗脱50min，流速3mL/min，检测波长210nm，保留时间42.5min。
本发明又一目的在于提供龙胆苦苷、所述的龙胆苦苷衍生物(即化合物2～5)在制备用于促进细胞神经突起伸长、防治包括阿尔茨海默症在内的神经退行性疾病的药物中的应用。
本发明再一目的在于提供一种药物，其组成中含有有效量的龙胆苦苷、所述的龙胆苦苷衍生物(即化合物2～5)中的至少一种，可用于促进细胞神经突起伸长、防治包括阿尔茨海默症在内的神经退行性疾病。
所述药物可为固体制剂或液体制剂，包括片剂、胶囊剂、口服液、小针、输液、软膏、冻干粉针、搽剂或栓剂等。
所述药物可为经胃肠道给药剂型药物或非经胃肠道给药剂型药物。给药途径可为静脉给药。注射包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、穴位注射和皮下注射等。
所述药物还可包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如稀释剂等，填充剂如蔗糖、淀粉等；粘合剂如羟丙纤维素、淀粉浆等；湿润剂如硬脂酸镁、微粉硅胶等；吸收促进剂聚山梨脂、卵磷脂等，表面活性剂脂肪酸山梨坦、伯洛沙姆等，另外还可以在组合物中加入其它辅剂如甜味剂、香味剂等。
本发明与现有技术相比，主要优点包括：
1)本发明采用PC12细胞作为有效的活性鉴定系统，发现坚龙胆甲醇提取物分离得到的活性化合物1，能诱导PC12细胞神经突起伸长，具有显著的拟神经生长因子活性。
2)在该类化合物的基础上进行结构修饰，合成了4个新的环烯醚萜苷类化合物，同样具有显著的拟神经生长因子的活性。但两类基团的引入可能增加药物在体内代谢过程，是提高生物利用度的候选化合物。
3)上述活性化合物1～5可用于制备预防阿尔茨海默症等神经退行性疾病的药物。
附图说明
图1为化合物1～5的结构(A)和在不同浓度下对PC12细胞作用48h后神经突起伸长的影响(B)；
图2为加入化合物1～5 48h后PC12细胞显微照片，均为相同尺度，其中(a)0.5％DMSO(二甲基亚砜)，Control(阴性对照，本发明中也以缩写C表示)；(b)40ng/mL NGF(阳性对照)；(c)化合物1，10μM；(d)化合物2，10μM；(e)化合物3，3μM；(f)化合物4，10μM；(g)化合物5，1μM；
图3为化合物1～5对PC12细胞神经突起伸长的影响的数字化结果，**P<0.01，***P<0.001。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
将干燥和粉状的中药龙胆(100g)在室温下在甲醇(龙胆/甲醇＝1/10，w/v，g/mL)中提取24小时。过滤甲醇萃取液，并将滤液浓缩，用水溶解后，依次用正己烷，乙酸乙酯和正丁醇分配，得到活性正丁醇层(7.5g)。用ODS开放式色谱柱分离正丁醇馏分，并用MeOH/H2O(体积比20:80、30:70、40:60、50:50、70:30、90:10和100:0)洗脱得到七个组分。第三部分(30mg)通过HPLC(色谱柱Cosmosil 5C30-UG-5Φ10×250mm，流动相MeOH/H2O体积比30:70，流速3mL/min，检测波长210nm)纯化，得到化合物1(23mg，保留时间tR＝44min)。
通过分析HR ESI-MS和1H NMR数据确定化合物1的结构，化合物1：白色固体，HRESI-TOF-MS m/z 379.0977,calcd.for C16H20NaO9(M+Na)+379.1000.1H NMR(500MHz,methanol-d4):δ＝7.44(1H,s),5.75(1H,m),5.66(1H,d,J＝2.9Hz),5.61(1H,m),5.23(1H,m),5.20(1H,m),5.05～4.95(2H,m),4.64(1H,d,J＝7.9Hz),3.89～3.64(2H,m),3.21～3.36(4H,m),3.10～3.14(1H,m)。
在室温下，向龙胆苦苷(1eq.800mg)的无水甲醇溶液(15mL)中加入三苯基膦氯化铑(0.2eq.416mg)，在H2氛围反应48h，反应停止后过滤，将混合物在真空下浓缩。粗样通过ODS柱色谱分离(洗脱剂MeOH：H2O体积比＝20：80)，然后通过HPLC(色谱柱SP-ODS-AΦ20×250mm，流动相MeOH/H2O体积比15:85～50:50梯度洗脱60min，流速10mL/min，检测波长210nm)纯化，得到化合物2(442.0mg，55％，tR＝24.0min)。
在室温下，向焦碳酸二乙酯(DEPC)(1.2eq.21.7mg)和三氟甲基磺酸钪(Sc(OTf)3)(0.05eq.2.8mg)的无水甲苯：乙醇体积比＝4:1混合溶液中加入化合物2(1eq.40mg)。将混合物在55℃加热搅拌5h后，反应停止，冷却至室温，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应，过滤，然后将混合物在真空下浓缩。浓缩物用EtOAc萃取。有机相经Na2SO4干燥，过滤和浓缩。粗样通过硅胶柱色谱分离(洗脱剂DCM：MeOH体积比＝90：10)，然后通过HPLC(色谱柱5C18-MS-IIΦ10×250mm，流动相MeOH/H2O体积比30:70～70:30梯度洗脱45min，流速3mL/min，检测波长210nm)纯化，得到化合物3(19.2mg，40％，tR＝36.0min)。
在室温下，向化合物3(20mg)的无水吡啶(2mL)溶液中加入乙酸酐(50μL)。将混合物常温搅拌15min，反应停止，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应，然后将混合物在真空下浓缩。浓缩物用EtOAc萃取。有机相经Na2SO4干燥，过滤和浓缩。粗样通过硅胶柱色谱分离(洗脱剂DCM：MeOH体积比＝70：30)，然后通过HPLC(色谱柱5C18-MS-IIΦ10×250mm，流动相MeOH/H2O体积比20:80～50:50梯度洗脱45min，流速3mL/min，检测波长210nm)纯化，得到化合物4(8.2mg，31％，tR＝38.3min)。
在室温下，向化合物2(20mg)的无水吡啶(2mL)溶液中加入乙酸酐(50μL)。将混合物常温搅拌15min，反应停止，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应，然后将混合物在真空下浓缩。浓缩物用EtOAc萃取。有机相经Na2SO4干燥，过滤和浓缩。粗样通过硅胶柱色谱分离(洗脱剂DCM：MeOH体积比＝75：25)，然后通过HPLC(色谱柱5C18-MS-IIΦ10×250mm，流动相MeOH/H2O体积比30:70～70:30梯度洗脱50min，流速3mL/min，检测波长210nm)纯化，得到化合物5(18.2mg，62％，tR＝42.5min)。
通过分析HR ESI-MS和1H NMR数据确定化合物2的结构，化合物2：白色固体，HRESI-TOF-MS m/z 381.1126,calcd.for C16H22NaO9(M+Na)+381.1156.1H NMR(500MHz,methanol-d4):δ＝7.40(1H,s),5.66(1H,d,J＝2.9Hz),5.56(1H,m)，5.06～4.98(2H,m),4.62(2H,d,J＝7.9Hz),3.90～3.65(2H,m),3.34(1H,m),3.25(1H,m),3.13(1H,m),2.48(1H,m),1.60(1H,m),1.32(1H,m),0.97(3H,t,J＝7.4Hz)。
通过分析HR ESI-MS和1H NMR数据确定化合物3的结构，化合物3：白色固体，HRESI-TOF-MS m/z 431.1521,calcd.for C19H27O11(M+H)+431.1548.1H NMR(500MHz,methanol-d4):δ＝7.40(1H,s),5.57(1H,m),5.52(1H,d,J＝2.9Hz)，5.06(1H,m),4.97(1H,m),4.64(1H,d,J＝7.9Hz),4.46～4.26(2H,m),4.20(1H,m),3.52(1H,m),3.36(2H,m),3.28(1H,m),3.14(1H,m),2.49(1H,m),1.61(1H,m),1.34(1H,m),1.29(3H,t,J＝7.1Hz),0.97(3H,t,J＝7.4Hz)。
通过分析HR ESI-MS和1H NMR数据确定化合物4的结构，化合物4：白色固体，HRESI-TOF-MS m/z 579.1684,calcd.for C25H32NaO14(M+Na)+579.1690.1H NMR(500MHz,methanol-d4):δ＝7.38(1H,s),5.60(1H,m),5.52(1H,d,J＝1.6Hz)，5.28(1H,t,J＝9.5Hz),5.04(2H,m),4.97(2H,m),4.82(1H,m),4.27(2H,m),4.18(2H,m),3.96(1H,m),2.49(1H,m),2.01(3H,s),1.96(3H,s),1.90(3H,s),1.57(1H,m),1.33(1H,m),1.29(3H,t,J＝7.1Hz),0.97(3H,t,J＝7.4Hz)。
通过分析HR ESI-MS和1H NMR数据确定化合物5的结构，化合物5：白色固体，HRESI-TOF-MS m/z 549.1552,calcd.for C24H30NaO13(M+Na)+549.1584.1H NMR(500MHz,methanol-d4):δ＝7.39(1H,s),5.61(1H,m),5.52(1H,d,J＝1.5Hz)，5.28(1H,t,J＝9.6Hz),5.05(2H,m),4.99(2H,m),4.82(1H,m),4.30(1H,m),4.16(1H,m),3.95(1H,m),2.49(1H,m),2.07(3H,s),2.01(3H,s),1.96(3H,s),1.90(3H,s),1.57(1H,m),1.32(1H,m),0.97(3H,t,J＝7.4Hz)。
化合物1～5的生物活性测试：
(1)PC12细胞复苏过程：将实验所需的CM培养基(含10％(v/v)马血清(HS)，5％胎牛血清(FBS)和1％双抗(青霉素-链霉素))的DMEM高糖培养基)在37℃水浴锅中预热10min。从液氮罐中取出细胞冻存管并迅速的放入37℃的水浴锅中不停的搅动一定时间，待冻存管中有少量液体时，加入4mL CM，将其转移至离心管中，放入离心机中离心，800r/min，离心3min，同时在培养皿中加入10mL CM培养基，并标注细胞代数，培养时间，操作者等信息，放在37℃，5％CO2的培养箱中待用。细胞离心结束后，倒去上层液，加入1-2mL CM，吹打均匀，用血球计数板计数。在每个已加好10mL CM培养基的培养皿中加入5×104个细胞，然后放入培养箱中培养，复苏后第一天更换CM培养基，第三天后再次更换培养基，六至七天后进行继代和冻存细胞。
(2)PC12细胞继代过程：将实验所需的PBS，CM培养基在37℃水浴锅中预热10min。用5mL移液管分两次将PC12细胞培养皿内中的CM培养基移除，加入5mLPBS，轻摇培养皿，移除PBS后，再加入5mL PBS，轻摇培养皿，移除培养皿后，加入10mL PBS，放入37℃，5％CO2培养箱内静置10min。同时在24孔细胞培养板每孔加入1mL已预热的CM，放入培养箱中待用。取出培养皿，将培养皿一侧抬起，充分吹洗其底部，将细胞悬浮液转移至离心管内，800r/min离心3min。原培养皿中加入10mLCM，放入培养箱中待用。离心后倾去上层清液，加入1-2mL已预热的CM，吹打混匀。用血球计数板计数，在24孔细胞培养板的每个孔中加入2.5×104个细胞，混匀，标注继代时间，操作者等信息，在37℃，5％CO2培养箱培养保存，用于24h后加样。原培养皿中接入2×105个细胞，用于下一代细胞培养。48h后更换CM培养基，在第五天继代，如此往返循环。
(3)生物活性测试方法：以0.5％DMSO作为阴性对照，NGF(40ng/mL)作为阳性对照，将待测样品用DMSO配置成所测浓度。将DMSO、NGF与待测样品分别加入EM培养基(含1％的双抗(青霉素-链霉素)的DMEM高糖培养基)配成总体积为1mL的液体，替换原24孔细胞板每孔的CM培养基，将24孔细胞板放入37℃，5％CO2的培养箱中培养。24h后观察细胞的形态变化，记录PC12细胞神经突起的分化率(细胞神经突起分化率＝神经突起长于胞体最长直径一倍的细胞数/所选视野下细胞总数目×100％)。48h后再次观察。每个视野下约100个细胞，随机选取3处，取平均值。实验中的数据应用SPSSl6.0统计软件中t-test进行数据处理，统计结果用平均值±标准偏差(X+SD)表示。
(4)实验结果：
图1中，(A)为化合物1～5的结构；(B)为化合物1～5在不同浓度下作用48h后对PC12细胞的神经突起分化率的影响。其中，0.5％DMSO为阴性对照Control，NGF(40ng/mL)为阳性对照。***P<0.001。结果显示化合物1～5均能显著延长PC12细胞神经突起分化率。
图2为加入化合物1～5作用48h后的PC12细胞显微照片。结果显示化合物1～5在不同浓度下能显著延长PC12细胞神经突起分化率。
图3为化合物1～5对PC12细胞神经突起伸长的影响的数字化结果，**P<0.01，***P<0.001。结果显示化合物1、2、4在10μM浓度下效果最显著，化合物3在3μM浓度下效果最显著，化合物5在1μM浓度下效果最显著。
本发明提供了坚龙胆来源的龙胆苦苷(化合物1)的制备方法和以此为基础合成的新型化合物2～5的合成方法。通过PC12细胞生物活性系统的评价发现拟神经生长因子活性较好，可在制备抗阿尔茨海默症药物中应用。该研究为抗阿尔茨海默症的新药研发和基础性研究提供依据，具有重要的现实意义。
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (9)
1.一类龙胆苦苷衍生物，其特征在于，具有下式(I)或(II)所示结构：
式(I)中，R1为-CH2CH3，R2为H或-COOCH2CH3，依次记为化合物2、3；
式(II)中，R3为-COOCH2CH3，记为化合物4。
2.一种根据权利要求1所述的龙胆苦苷衍生物的制备方法，其特征在于，所述龙胆苦苷衍生物为化合物2，其制备方法包括：
在室温下，向龙胆苦苷的无水甲醇溶液中加入三苯基膦氯化铑，在H2氛围下反应后过滤，真空浓缩，然后通过ODS柱色谱分离，洗脱剂MeOH/H2O体积比20:80，然后通过HPLC纯化，得到化合物2；
所述HPLC纯化的条件包括：色谱柱SP-ODS-AΦ20×250mm，流动相MeOH/H2O体积比15:85～50:50梯度洗脱60min，流速10mL/min，检测波长210nm，保留时间24.0min。
3.一种根据权利要求1所述的龙胆苦苷衍生物的制备方法，其特征在于，所述龙胆苦苷衍生物为化合物3，其制备方法包括：
在室温下，向焦碳酸二乙酯和三氟甲基磺酸钪的无水甲苯/乙醇混合溶液中加入化合物2；所得混合物在50～60℃加热搅拌反应后，冷却至室温，用饱和NaHCO3溶液淬灭反应，过滤、真空浓缩，浓缩物用EtOAc萃取，有机相经Na2SO4干燥、过滤和浓缩，所得粗样通过硅胶柱色谱分离，洗脱剂DCM/MeOH体积比90:10，然后通过HPLC纯化，得到化合物3；
所述HPLC纯化的条件包括：色谱柱5C18-MS-IIΦ10×250mm，流动相MeOH/H2O体积比30:70～70:30梯度洗脱45min，流速3mL/min，检测波长210nm，保留时间36.0min。
4.一种根据权利要求1所述的龙胆苦苷衍生物的制备方法，其特征在于，所述龙胆苦苷衍生物为化合物4，其制备方法包括：
在室温下，向化合物3的无水吡啶溶液中加入乙酸酐，搅拌反应后用饱和NaHCO3溶液淬灭反应，真空浓缩，浓缩物用EtOAc萃取，有机相经Na2SO4干燥、过滤和浓缩，所得粗样通过硅胶柱色谱分离，洗脱剂DCM/MeOH体积比70:30，然后通过HPLC纯化，得到化合物4；
所述HPLC纯化的条件包括：色谱柱5C18-MS-IIΦ10×250mm，流动相MeOH/H2O体积比20:80～50:50梯度洗脱45min，流速3mL/min，检测波长210nm，保留时间38.3min。
5.一种龙胆苦苷衍生物的制备方法，其特征在于，所述龙胆苦苷衍生物为化合物5，其制备方法包括：
在室温下，向化合物2的无水吡啶溶液中加入乙酸酐，搅拌反应后用饱和NaHCO3溶液淬灭反应，真空浓缩，浓缩物用EtOAc萃取，有机相经Na2SO4干燥、过滤和浓缩，所得粗样通过硅胶柱色谱分离，洗脱剂DCM/MeOH体积比75:25，然后通过HPLC纯化，得到化合物5；
所述HPLC纯化的条件包括：色谱柱5C18-MS-IIΦ10×250mm，流动相MeOH/H2O体积比30:70～70:30梯度洗脱50min，流速3mL/min，检测波长210nm，保留时间42.5min；
化合物2具有如下式(I)所示结构：
式(I)中，R1为-CH2CH3，R2为H；
化合物5具有如下式(II)所示结构：
式(II)中，R3为-COCH3。
6.龙胆苦苷、根据权利要求1所述的龙胆苦苷衍生物、具有如下式(II)所示结构的化合物5在制备用于促进细胞神经突起伸长、防治包括阿尔茨海默症在内的神经退行性疾病的药物中的应用；
式(II)中，R3为-COCH3。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物为固体制剂或液体制剂。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物为经胃肠道给药剂型药物或非经胃肠道给药剂型药物。
9.一种药物，其特征在于，其组成中含有有效量的龙胆苦苷、如权利要求1所述的龙胆苦苷衍生物中的至少一种，可用于促进细胞神经突起伸长、防治包括阿尔茨海默症在内的神经退行性疾病。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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