CN101468950B - 从北青龙衣中分离的新化合物及其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

从北青龙衣中分离的新化合物及其制备方法及应用。采用乙醇提取、色谱分离纯化与细胞活性检测相结合的方法，从北青龙衣中分离了一种从未报道过的抗肿瘤作用新化合物，并采用质谱与高分辨核磁共振技术确定了该化合物的结构。所述的新化合物的结构式为：本发明应用于医学领域。

Description

从北青龙衣中分离的新化合物及其制备方法及应用

技术领域：

本发明涉及一种新的化合物，该化合物是从中药北青龙衣中提取分离得到的新物质，具有抗肿瘤活性；本发明还涉及该化合物的制备方法；本发明还涉及该化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

癌症是威胁人类生命的严重疾病，因此，抗癌药物的研究一直是世界关注的热点。中药抗肿瘤在提高免疫力和降低致突变毒性方面比之化学药物具有独到之处，因此，从祖国医药宝库中寻找疗效确切的抗肿瘤中药，明确其药效物质基础，进而开发出高效低毒的新药，成为中医药领域多年研究的焦点。

北青龙衣为胡桃科植物核桃楸(Juglans Mandshurica MAXIM.)的未成熟果实，盛产于东北城郊各县，在民间常用作治疗各种癌症和皮肤病以及各种疼痛的止痛药。2001年北青龙衣被收载于黑龙江省药材标准而成为一种中药应用于临床和生产。北青龙衣的粗提物制剂治疗胃癌、食管癌等消化道癌症，有二十多年治疗观察的病例证明(李中原.青龙衣治疗食管贲门癌120例临床观察.中医药信息，1988，(3)：3)，其抗肿瘤作用是无庸置疑的。然而其药效物质基础研究并没有深入展开，文献报道多停留在其粗提物的药理作用而缺乏其有效成分的抗肿瘤作用研究上(季宇彬，马宏图，杨波，汲晨锋.北青龙衣不同提取部位的抗肿瘤作用研究.中草药，2004，35(10)：1145-1147)，因而导致北青龙衣这一药用资源开发的严重滞后。我们在针对北青龙衣抗肿瘤有效成分的研究中，经过乙醇提取、色谱分离纯化与细胞活性检测相结合的方法，最终获得了具有抗肿瘤活性的一个新的化合物，并采用质谱与高分辨核磁共振技术，确定了该化合物的结构。该化合物具有优良的抗癌活性，可以与药物赋形剂制成适合于临床使用的抗肿瘤药物，也可作为先导化合物，对其构效关系进行进一步研究，合成一系列的抗癌药物和药物组合，更可以作为北青龙衣药材及其制剂质量控制的指标成分，实现北青龙衣药材及其制剂质量的稳定和可控，突破目前北青龙衣研究开发的瓶颈。

发明内容：

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性、从中药北青龙衣中提取分离得到的新化合物。该化合物的制备方法以及该化合物新用途。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

从北青龙衣中分离的抗肿瘤新化合物，命名为青龙衣素A，该化合物的结构式为：

所述的一种北青龙衣中抗肿瘤新化合物的制备，取新鲜的北青龙衣用乙醇浸泡提取，提取液浓缩，浓缩液加水分散，离心后取上清液，上清液通过大孔吸附树脂，将吸附树脂用乙醇洗脱，洗脱液蒸干后用甲醇溶解，过滤后注入葡聚糖凝胶，收集甲醇洗脱液，硅胶薄层定性，合并同一组分，得该化合物，纯度98％。

所述的一种北青龙衣中抗肿瘤新化合物的制备，所述的取新鲜的北青龙衣用乙醇浸泡提取，提取液浓缩，是将新鲜的北青龙衣用75％乙醇浸泡一周，提取三次，合并提取液，减压浓缩至相对密度1.10-1.14(50℃)。

所述的一种北青龙衣中抗肿瘤新化合物的制备，所述的浓缩液加水分散，离心后取上清液，上清液通过大孔吸附树脂，将吸附树脂用乙醇洗脱，是指浓缩液加10倍量水分散，离心，取上清液，注入到已处理好的大孔吸附树脂中，浓缩液与树脂的比例为1∶50，流速为10ml/min，分别以3倍柱床体积的水洗、5倍柱床体积的30％乙醇洗，收集30％乙醇洗脱液，将洗脱液减压蒸干得到残渣，残渣用少量甲醇溶解，过滤后注入葡聚糖凝胶，收集甲醇洗脱液，硅胶薄层定性，合并同一组分，得该化合物，纯度98％。

青龙衣中抗肿瘤新化合物的制备，所述的滤液注入葡聚糖凝胶，收集甲醇洗脱液，是指滤液注入葡聚糖凝胶LH-20柱上，色谱柱直径2cm，柱长2m，上样量为1g残渣/每次，以甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，硅胶薄层定性，合并同一组分，得该化合物，纯度98％。

所述的一种北青龙衣中抗肿瘤新化合物的制备，所述收集甲醇洗脱液，硅胶薄层定性，合并同一组分，是指洗脱液在硅胶板上进行薄层层析，展开剂为氯仿-甲醇，体积份数比为84∶16，合并R_f值为0.3的单一组分。

所述的一种北青龙衣中抗肿瘤新化合物的制备，合并R_f值为0.3的单一组分，用甲醇重结晶得该化合物，纯度为98％以上。

从北青龙衣中分离的新化合物在抗肿瘤药物中的应用。

这个技术方案有以下有益效果：

1.本发明提供了一种未报道过的具有抗肿瘤作用的化合物，通过对癌细胞抑制试验和药效学试验，证明了该化合物具有优良的抗癌活性，可与药物赋形剂制成适合于临床使用的抗肿瘤药物。

2采用本实验的筛选方法导致了从中药北青龙衣中分离纯化了该化合物，且纯度达到98％以上。该化合物为从天然植物中提取分离，具有结构新颖、作用独特的优点，一方面可与药物赋形剂制成适合于临床使用的抗肿瘤药物，另一方面也可作为先导化合物，对其构效关系进行进一步研究，合成一系列的抗癌药物和药物组合。

3中药及其制剂质量的稳定和可控一直是中药现代化的瓶颈，该化合物为中药北青龙衣的有效成分之一，可以作为北青龙衣药材及其制剂质量控制的指标，在此基础上建立以该成分为指标的鉴别和含量测定项目的质量控制标准，实现北青龙衣药材及其制剂质量的稳定和可控，该化合物将作为中药对照品广泛使用。

附图说明：

附图1为本发明化合物的¹H-¹H C0SY谱中观察到的结构图。

附图2为本发明化合物的HMBC谱中观察到的结构图。

本发明的具体实施方式：

实施例1：

从北青龙衣中分离的抗肿瘤新化合物，命名为青龙衣素A，该化合物的结构式为：

所述的一种北青龙衣中抗肿瘤新化合物的制备，取新鲜的北青龙衣用乙醇浸泡提取，提取液浓缩，浓缩液加水分散，离心后取上清液，上清液通过大孔吸附树脂，将吸附树脂用乙醇洗脱，洗脱液蒸干后用甲醇溶解，过滤后注入葡聚糖凝胶，收集甲醇洗脱液，硅胶薄层定性，合并同一组分，得该化合物，纯度98％。

所述的一种北青龙衣中抗肿瘤新化合物的制备，所述的取新鲜的北青龙衣用乙醇浸泡提取，提取液浓缩，是将新鲜的北青龙衣用75％乙醇浸泡一周，提取三次，合并提取液，减压浓缩至相对密度1.10-1.14(50℃)。

所述的一种北青龙衣中抗肿瘤新化合物的制备，所述的浓缩液加水分散，离心后取上清液，上清液通过大孔吸附树脂，将吸附树脂用乙醇洗脱，是指浓缩液加10倍量水分散，离心，取上清液，注入到已处理好的大孔吸附树脂中，浓缩液与树脂的比例为1∶50，流速为10ml/min，分别以3倍柱床体积的水洗、5倍柱床体积的30％乙醇洗，收集30％乙醇洗脱液，将洗脱液减压蒸干得到残渣，残渣用少量甲醇溶解，过滤后注入葡聚糖凝胶，收集甲醇洗脱液，硅胶薄层定性，合并同一组分，得该化合物，纯度98％。

青龙衣中抗肿瘤新化合物的制备，所述的滤液注入葡聚糖凝胶，收集甲醇洗脱液，是指滤液注入葡聚糖凝胶LH-20柱上，色谱柱直径2cm，柱长2m，上样量为1g残渣/每次，以甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，硅胶薄层定性，合并同一组分，得该化合物，纯度98％。

所述的一种北青龙衣中抗肿瘤新化合物的制备，所述收集甲醇洗脱液，硅胶薄层定性，合并同一组分，是指洗脱液在硅胶板上进行薄层层析，展开剂为氯仿-甲醇，体积份数比为84∶16，合并R_f值为0.3的单一组分。

所述的一种北青龙衣中抗肿瘤新化合物的制备，合并R_r值为0.3的单一组分，用甲醇重结晶得该化合物，纯度为98％以上。

从北青龙衣中分离的新化合物在抗肿瘤药物中的应用。

实施例2：

化合物的制备

材料来源北青龙衣为胡桃科植物核桃楸(Juglans MandshuricaMAXIM.)的未成熟果实，于7月中旬采于黑龙江省五常县，植物标本样本收藏于黑龙江省药品检验所中药标本馆。

提取和分离  将新鲜的北青龙衣用75％乙醇浸泡一周，共提取三次，合并提取液，减压浓缩，浓缩至相对密度1.10-1.14(50℃)的浓缩液，浓缩液加10倍量水分散，离心，取上清液，注入已处理好的Diaion HP-20大孔吸附树脂中(浓缩液与树脂的比例为1∶50)，流速10ml/min，分别以3倍柱床体积的水洗、5倍柱床体积的30％乙醇洗，收集30％乙醇洗脱液，洗脱液减压蒸干得到残渣，残渣用少量甲醇溶解，滤过，滤液注入葡聚糖凝胶LH-20柱上(色谱柱直径2cm，柱长2m，上样量为1g残渣/每次)，以甲醇洗脱，流速1.0ml/min，洗脱液在硅胶板上进行薄层层析，展开剂为氯仿-甲醇(84∶16)，合并R_f值为0.3的单一组分，用甲醇重结晶得该化合物，纯度为98％以上。

化合物的结构测定

结构测定

用Shimadzu UV-160分光光度计测定紫外光谱，用JASCOFT/IR-300E(KBr压片)分光光度计测定红外光谱，用JASCO DIP-370digital polarimeter测定旋光度，用LCQ mass analyzer测定ESI-MS，用JEOL Mstation spectrometer测定HR-FAB-MS，¹H-和¹³C-NMR谱用JEOL ECP-500 spectrometer，TMS作内标。

化合物的理化性质：

化合物为无定形粉末。IR(KBr)ν_max：3414，2924，2857，2372，1618，1456，1391，1263，1116，618。UV(MeOH)λ_max(1ogε)：209nm(3.52)，263nm(3.92)，344nm(4.41)。[α]_D ²⁵-21°(c＝0.1，MeOH)。¹H-NMR(500MHz，CD₃OD)和¹³C-NMR(125MHz，CD₃OD)谱数据见表1。ESI-MS(positive)m/z 379.1[M+Na]；HR-FAB-MS(positive)m/z 379.1002[M+Na](计算值C₁₉H₁₆O₇Na 379.1005)。

化合物的¹H-NMR谱中显示有五个芳香质子，在δ6.67(1H，dd，J＝8.2，1.1)，δ7.42(1H，dd，J＝8.2，7.8)，δ7.29(1H，dd，J＝7.8，1.1)为一套ABC偶合系统，δ6.53(1H，s)，δ7.06(1H，s)为一套对位氢取代的芳香系统，在高场区δ2.50(1H，dd，J＝12.4，4.2)，δ2.57(1H，dd，J＝12.4，1.8)为一个亚甲基和一个次甲基在δ3.15(1H，d，J＝4.2，1.8)邻位偶合，其余三个质子分别在δ3.31(1H，m)和δ2.68(2H，m)邻位偶合，这些在¹H-¹H COSY谱中得到确证(见附图1)。¹³C-NMR谱结合HMQC谱可知δ208.7为羰基碳，在δ48.9和δ36.7分别为一个亚甲基和一个次甲基，δ70.9为连有羟基的叔碳。HMBC谱中δ2.50(H-3)，δ2.57(H-3)的亚甲基与δ208.7(C-1)羰基相关，δ3.15(H-2)的次甲基与δ70.9(C-4)相关，可以推断分子中含有四氢萘酮结构。HMBC谱中δ6.67(H-5)与δ70.9(C-4)相关也证明了这一点，且表明四氢萘酮中的苯环为ABC偶合系统。另外一套芳香系统是连接在δ70.9(C-4)上，这在HMBC谱中可以观察到δ7.06(H-5’)与δ70.9(C-4)的相关峰。在HMBC谱中δ3.31(H-7’)与δ116.1(C-2’)相关，δ6.53(H-2’)与δ40.3(C-7’)相关，表明δ40.3(C-7’)和δ45.6(C-8’)连接在另一个苯环上。其中δ2.68(H-8’)和48.9(C-2)远程相关，δ3.31(H-7’)和δ208.7(C-1)远程相关，表明C-7’连接在C-2上，这可以通过δ3.31(H-7’)与δ36.7(C-3)，δ2.50(H-3)，δ2.57(H-3)与δ40.3(C-7’)的远程相关得到确证。从苯环上的取代基看，四氢萘酮上有两个羟基，分别位于C-4和C-8，另一个苯环上有两个邻位羟基，分子式中尚有两个氧原子，结合¹³C-NMR谱(δ176.9)数据，表明有一个羧基存在，它只能连接在C-8’上。因此，化合物的¹H-NMR和¹³C-NMR数据排布如表1。从HMBC谱(附图2)中，该化合物的结构得到了确证。

表1化合物的¹H-NMR和¹³C-NMR数据

No.

δH

δc

123456789101′2′3′4′5′6′7′8′9′

3.15 dd(4.2，1.8)2.50 dd(12.4，4.2)2.57 dd(12.4，1.8)6.67 dd(8.2，1.1)7.42 dd(8.2，7.8)7.29 dd(7.8，1.1)6.53s7.06s3.31m2.68(2H，m)

208.748.936.770.9116.5138.3114.0163.8115.3155.7128.2116.1146.2145.7113.1135.740.345.6176.9

实施例3：

一种上述化合物在抗癌领域的应用。

抑制人HL-60白血病细胞，人Kato-III胃癌细胞和人A₅₄₉肺癌细胞的活性实验：

细胞培养

人HL-60白血病细胞，人Kato-III胃癌细胞和人A₅₄₉肺癌细胞培养于RPMI 1640培养基，补加10％FBS、L-glutamine、100U/ml青霉素以及100μg/ml链霉素。取对数生长期的细胞计数，以3×10⁴个/ml的浓度接种于96孔板，每孔180μl，在37℃、5％CO₂的孵箱中培养24小时。

细胞毒测定

不同浓度(1-100μM)的药物以EtOH-H₂O(1∶9)为溶剂溶解至20μl，空白组加入20μl的EtOH-H₂O(1∶9)溶液，细胞继续培养72小时，然后采用MTT法进行测定，即培养后的细胞，加入10μl MTT(5mg/ml)磷酸盐缓冲液，37℃、5％CO₂培养箱中培养4小时，离心，取上清液150μl弃去，加入175μl DMSO，振摇10分钟后，用酶标仪在550nm测定吸光值。根据下面的公式计算，绘图得IC₅₀。

对照孔：仅加细胞不加药物

空白孔：仅加溶剂不加细胞和药物

实验孔：加细胞再加药物

试验结果见表2。结果表明，化合物对三种肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用。

表2.化合物抑制三种肿瘤细胞的IC₅₀(μM)值

样品	HL-60	KATO III	A549
				CDDP化合物	0.3±0.0618.0±8.4	3.3±0.8112.8±9.3	2.7±0.7132.5±16.4

注：每个数值为三次独立实验的平均值±标准偏差

药效学试验

试验动物：昆明种小鼠，体重18g-22g，雌雄兼用。

药物与试剂：注射用生理盐水(空白对照)，环磷酰胺(阳性对照)，化合物。瘤株：小鼠肝癌H₂₂。

试验方法：

1、对小鼠瘤重及免疫器官指数的影响：小鼠随机分组，雌雄各半。分别为化合物组，环磷酰胺组，生理盐水组。各组小鼠于右前腋皮下常规接种H₂₂瘤细胞悬液0.2ml(约1×10⁶-2×10⁶个细胞)，接种后各组ip给药，连续7d。末次给药后处死小鼠，称体重，称瘤块、胸腺及脾脏质量，计算抑瘤率、胸腺指数和脾指数。

2、对H₂₂小鼠生命延长率的影响：小鼠腹腔接种H₂₂瘤细胞悬液0.2ml，每天观察并记录小鼠死亡情况。

结果见下表：

组别

剂量(mg/kg)

动物只数(n)

抑瘤率(％)

胸腺指数(g/g)

脾指数(g/g)

生命延长率％

化合物环磷酰胺生理盐水

5.15004.0000

202020

76.1284.34

0.0024±0.0006·0.0021±0.0004*0.0052±0.0018

0.0045±0.0016·0.0038±0.0008*0.0081±0.0074

30.32*38.12*

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05；与环磷酰胺组比较，·P＜0.05。

本发明提供的化合物对H₂₂生长有明显的抑制作用，并可明显延长小鼠生存时间，具有良好的抗肿瘤作用。

Claims (1)

1.一种从北青龙衣中分离抗肿瘤化合物的方法，其特征是：取新鲜的北青龙衣用乙醇浸泡提取，提取液浓缩，浓缩液加水分散，离心后取上清液，上清液通过大孔吸附树脂，将吸附树脂用乙醇洗脱，洗脱液蒸干后用甲醇溶解，过滤后注入葡聚糖凝胶，收集甲醇洗脱液，硅胶薄层定性，合并同一组分，得该化合物，纯度98%；

所述的取新鲜的北青龙衣用乙醇浸泡提取，提取液浓缩，是将新鲜的北青龙衣用75%乙醇浸泡一周，提取三次，合并提取液，减压浓缩至50℃时相对密度为1.10-1.14；

所述的浓缩液加水分散，离心后取上清液，上清液通过大孔吸附树脂，将吸附树脂用乙醇洗脱，是指浓缩液加10倍量水分散，离心，取上清液，注入到已处理好的大孔吸附树脂中，浓缩液与树脂的比例为1：50，流速为10ml/min，分别以3倍柱床体积的水洗、5倍柱床体积的30%乙醇洗，收集30%乙醇洗脱液,将洗脱液减压蒸干得到残渣，残渣用少量甲醇溶解，过滤后注入葡聚糖凝胶，收集甲醇洗脱液，硅胶薄层定性，合并同一组分，得该化合物，纯度98%；

所述的抗肿瘤化合物的结构式为：

。

2．根据权利要求1的方法，其特征是：所述的过滤后注入葡聚糖凝胶，收集甲醇洗脱液，是指滤液注入葡聚糖凝胶LH-20柱上，色谱柱直径2cm，柱长2m，上样量为1g残渣/每次，以甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，硅胶薄层定性，合并同一组分，得该化合物，纯度98%。

3．根据权利要求2的方法，其特征是：所述的收集甲醇洗脱液，硅胶薄层定性，合并同一组分，是指洗脱液在硅胶板上进行薄层层析，展开剂为氯仿-甲醇，体积份数比为84：16，合并R _f 值为0.3的单一组分。

4．根据权利要求1或2或3的方法，其特征是：合并R _f 值为0.3的单一组分，用甲醇重结晶得该化合物，纯度为98%。

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