CN117586214B - 乌药烷型倍半萜二聚体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物化学和药物领域，涉及乌药烷型倍半萜二聚体及其制备方法和用途，还涉及含有乌药烷型倍半萜二聚体的药物或药物组合物。本发明的乌药烷型倍半萜二聚体chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E具有显著的NLRP3炎症小体抑制活性，可以用于治疗NLRP3炎症小体介导的慢性炎症性疾病。
Description
技术领域
本发明属于植物化学和药物技术领域,具体而言，涉及乌药烷型倍半萜二聚体chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E,含有乌药烷型倍半萜二聚体的药物或药物组合物，还涉及乌药烷型倍半萜二聚体的制备方法及其在制备用于治疗慢性炎症性疾病的药物或药物组合物中的应用。
背景技术
炎症小体是一类在免疫调节和炎症过程中发挥重要作用的蛋白质复合物。炎症小体作为细胞内信号平台，能够感知并响应细胞内外的刺激，包括微生物感染、细胞损伤以及环境压力。其中，NLRP3炎症小体是NOD样受体(NOD-like receptor,NLR)家族中的一员，该家族的成员在感知和调节宿主细胞内的内源性和外源性信号方面发挥着重要的作用。NLRP3炎症小体由多个组分构成，包括NLRP3蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)和半胱天冬酶-1前体(pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1,pro-caspase-1)组成。NLRP3炎症小体在受到微生物感染、细胞损伤或其他应激刺激时被激活。激活NLRP3炎症小体的信号通常涉及细胞内外环境的紊乱，例如细胞内K+离子流失、Ca2+信号、活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)的积累、线粒体功能失调和溶酶体破裂等。NLRP3炎症小体激活后对胱天蛋白酶前体-1(pro-caspase-1)进行剪切，生成有生物活性的胱天蛋白酶-1(caspase-1)进一步促进IL-1β(白介素-1β)和IL-18(白介素-18)等促炎细胞因子的成熟和释放，从而引发炎症效应。
NLRP3炎症小体的异常激活与多种炎症相关疾病的发生和发展有关，包括风湿性关节炎、炎症性肠病、II型糖尿病等。因此，针对NLRP3炎症小体的调控成为治疗这些慢性炎症性疾病的潜在治疗策略。开发NLRP3炎症小体激活组装的抑制剂为相关疾病提供了新的治疗手段。MCC950作为NLRP3炎症小体特异性小分子抑制剂受到广泛研究，其在治疗类风湿性关节炎等炎症性疾病上的潜在应用曾引起广泛关注，甚至进入了II期临床试验阶段。然而，由于其产生肝脏毒性的问题，最终未能通过临床试验。
天然产物作为药物先导化合物开发的重要源泉，在药物研发中占有不可或缺的地位。从天然产物中寻找兼具低毒性与高活性的NLRP3炎症小体小分子抑制剂具有重要意义。金粟兰属(Chloranthus)中多种植物被称作“四块瓦”，民间常用于治疗跌打损伤、毒蛇咬伤和风湿性关节疼痛等，是具有重要临床价值的中草药，从中寻找具有慢性炎症性疾病治疗作用的天然产物有着巨大的潜力。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于，提供具有NLRP3炎症小体抑制活性的乌药烷型倍半萜二聚体，即化合物chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E；含有这些化合物的药物或药物组合物；这些化合物在制备用于治疗慢性炎症性疾病的药物或药物组合物中的应用，以及这些化合物的制备方法，从而为NLRP3炎症小体抑制剂的开发提供新选项。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。
在第一方面，本发明提供了下述结构式I、II、Ⅲ和IV所示的乌药烷型倍半萜二聚体或其药学上可接受的衍生物，
在第二方面，本发明提供了用于治疗慢性炎症性疾病的药物或药物组合物，包含式I、II、Ⅲ和IV所示乌药烷型倍半萜二聚体或其药学上可接受的衍生物中的至少一种。
在第三方面，本发明涉及，乌药烷型倍半萜二聚体chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E或其药学上可接受的衍生物，在制备用于治疗慢性炎症性疾病的药物或药物组合物中的应用。
在本发明的实施方案中，慢性炎症性疾病是NLRP3炎症小体介导的慢性炎症性疾病，包括但不限于关节炎，例如风湿性关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎；II型糖尿病；非酒精性脂肪肝炎；炎症性肠病；神经性疾病及脑损伤，包括多发性硬化症、阿尔茨海默病等。
在第四方面，本发明提供了制备乌药烷型倍半萜二聚体chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E的方法，包括以下步骤：
1)将金粟兰属(Chloranthus)植物材料干燥、粉碎，采用有机溶剂提取后脱溶，得到金粟兰属植物材料提取物；和
2)对所述金粟兰属植物材料提取物进行柱层析，得到乌药烷型倍半萜二聚体chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E。
在本发明方法的实施方案中，步骤1)中所用有机溶剂可以为石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇和乙腈中的至少一种；优选，所述有机溶剂为乙酸乙酯、甲醇、95％乙醇或其混合物。
与现有技术相比，本发明具有明显的有益效果。具体而言，本发明的乌药烷型倍半萜二聚体chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E，具有显著的NLRP3炎症小体抑制活性，可以用于治疗慢性炎症性疾病。
附图说明
图1为本发明乌药烷型倍半萜二聚体chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E的化学结构式。
图2为chlorajaponilide E抑制单核巨噬细胞J774A.1焦亡图。
图3为chlorajaponilide E抑制单核巨噬细胞J774A.1焦亡量化图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的优选实施方案。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方案。相反，提供这些实施方案的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所用的术语只是为了描述具体的实施方案的目的，并非旨在限制本发明的范围。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
根据第一方面，本发明提供了具有NLRP3炎症小体抑制活性的乌药烷型倍半萜二聚体chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E或其药学上可接受的衍生物，例如药学上可接受的盐、酯化物或前药，该乌药烷型倍半萜二聚体的结构式分别如下式I、II、Ⅲ和IV所示：
根据本发明的第二方面，本发明提供了用于治疗慢性炎症性疾病的药物或药物组合物，包含作为活性药物成分的乌药烷型倍半萜二聚体chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E或其药学上可接受的衍生物中的至少一种。本领域技术人员应当理解，本文发明的用于治疗慢性炎症性疾病的药物或药物组合物还可以包含药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。因此，在更具体的实施方案中，用于治疗慢性炎症性疾病的药物或药物组合物包含作为活性药物成分的乌药烷型倍半萜二聚体chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E或其药学上可接受的衍生物中的至少一种以及药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。
在本发明药物或药物组合物的实施方案中，作为活性成分的乌药烷型倍半萜二聚体可以是chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E中的任一种或其任意组合。
本领域技术人员应当理解，本发明的化合物chlorahololides H、J、L或chlorajaponilide E的药学上可接受的衍生物，例如这些化合物的药学上可接受的盐、酯化物、溶剂化物或水合物或前药，也可以作为活性成分用于本发明的药物或药物组合物中。因此，在本发明的药物或药物组合物的又一实施方案中，活性成分可以是chlorahololidesH、J、L或chlorajaponilide E的药学上可接受的衍生物，例如这些化合物的药学上可接受的盐、酯化物、溶剂化物或水合物或前药。
本领域技术人员众所周知，药学上可接受的盐可以是例如药学上可接受的碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括衍生自诸如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝等无机碱的盐。衍生自药学上可接受的无毒有机碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺的盐，包括天然存在的取代胺、环胺和碱性离子交换树脂，例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺以及乙醇胺和三乙醇胺。
药学上可接受的酯化物可以是本发明的乌药烷型倍半萜二聚体与药学上可接受的无毒有机酸形成的酯，例如乙酸、丙酸、苹果酸、柠檬酸、草酸和棕榈酸。
因此，在本发明药物组合物的实施方案中，活性药物成分可以是chlorahololidesH、J、L或chlorajaponilide E中的任意一种、两种、三种或四种的混合物，或其酯化物、溶剂化物、水合物等衍生物。
药学上可接受载体、佐剂或赋形剂是本领域技术人员众所周知的。药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂，包括但不仅限于填充剂(稀释剂)、润滑剂(助流剂或抗粘着剂)、分散剂、湿润剂、粘合剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、崩解剂等。粘合剂包括糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素及其衍生物(如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素或羟丙甲基纤维素等)、明胶浆、糖浆、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂包括乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、沉降碳酸钙等)、山梨醇或甘氨酸等；润滑剂包括微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油、聚乙二醇等；崩解剂包含淀粉及其衍生物(如羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉、玉米淀粉等)、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素等；湿润剂包括十二烷基硫酸钠、水或醇等；抗氧剂包括亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酸等；抑菌剂包括0.5％苯酚、0.3％甲酚、0.5％三氯叔丁醇等；乳化剂包括聚山梨酯-80、没酸山梨坦、卵磷酯、豆磷脂等；增溶剂包括吐温-80、胆汁、甘油等。
本发明的乌药烷型倍半萜二聚体用作药物时，可以直接施用，或者以药物组合物的形式施用。在本发明的药物组合物中，按药物组合物总重量计，药物组合物可以含有0.1–99％的chlorahololides H、J、L或chlorajaponilide E，优选为0.5–50％。
乌药烷型倍半萜二聚体chlorahololides H、J、L或chlorajaponilide E或其药学上可接受的衍生物例如酯化物的“有效量”是指，足以实现所需生物学效果的量。应当理解，有效剂量会取决于接受者的年龄、性别、健康状况和体重。通常，有效量由施用治疗的人例如治疗医师来决定。
本发明的药物组合物可以以单位体重服用量的形式施用。所有以乌药烷型倍半萜二聚体chlorahololides H、J、L或chlorajaponilide E或其药学上可接受的衍生物例如酯化物为有效成分的药物组合物采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型，例如液体制剂(注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等)、固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂等)、喷剂、气雾剂等。本发明的药物组合物可经注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下给药、粘膜透析等给药途径进行炎性疾病的治疗。
根据第三方面，本发明提供了乌药烷型倍半萜二聚体chlorahololides H、J、L或chlorajaponilide E或其药学上可接受的衍生物在制备用于治疗慢性炎症性疾病的药物或药物组合物中的用途。
在本发明的实施方案中，慢性炎症性疾病是NLRP3炎症小体介导的慢性炎症性疾病，包括但不限于关节炎，例如风湿性关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎；II型糖尿病；非酒精性脂肪肝炎；炎症性肠病；神经性疾病及脑损伤，包括多发性硬化症、阿尔茨海默病等。
根据第四方面，本发明提供了制备乌药烷型倍半萜二聚体chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E的方法，包括以下步骤：
1)将金粟兰属植物材料干燥、粉碎，采用有机溶剂浸提后脱溶，得到金粟兰属植物提取物；和
2)对所述金粟兰属植物提取物进行柱层析，得到chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E。
在本发明的实施方案中，金粟兰属植物材料可以是金粟兰属植物的各部位，例如根、茎、枝叶或全株。在本发明的实施方案中，金粟兰属植物为金粟兰属中的植物，优选全缘金粟兰(C.holostegius)、宽叶金粟兰(C.henryi)或全缘金粟兰石棉变种(C.holostegiusvar.shimianensis)。
在本发明的实施方案中，在步骤1)中，有机溶剂可以为石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇和乙腈中的至少一种；优选，有机溶剂为乙酸乙酯、甲醇、95％乙醇或其混合物。
在本发明的实施方案中，在步骤1)中，提取方法可以是有机溶剂冷浸提取、加热回流提取或有机溶剂超声提取等。
在本发明的实施方案中，用有机溶剂对金粟兰属植物材料提取至少1次，例如2、3、4次，优选3次。
在本发明的实施方案中，有机溶剂与干燥的金粟兰属植物材料的体积比可以为1:1到5:1，例如1:1、2:1、3:1、4:1、5:1，以及上述任意两个比例之间的比例，例如1.5:1、2.5:1、3.5:1、4.5:1等，优选为3:1。
在本发明的具体实施方案中，在步骤2)中，柱层析包括正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析(例如RP-18柱层析)、树脂柱层析(例如D101大孔树脂)、凝胶柱层析(例如SephadexLH-20)、中压色谱分离凝胶(例如MCI凝胶)和半制备高效液相色谱(下文简称半制备HPLC)。
在本发明的具体实施方案中，在步骤2)中，柱层析所用洗脱剂为石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇、乙腈、水和甲酸中的至少一种，例如上述有机溶剂中任意两种的组合，任意三种的组合、任意四种的组合等。在本发明更具体的实施方案中，对于正相硅胶柱层析，可以采用石油醚和丙酮按体积比从1:0到0:1梯度洗脱，例如1:0、50:1、20:1、10:1、5:1、1:1、1:5、0:1。在本发明更具体的实施方案中，对于正相硅胶柱层析，还可以采用二氯甲烷和甲醇按体积比从1:0到1:1梯度洗脱，例如1:0、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、1:1。在本发明更具体的实施方案中，对于反相硅胶柱层析，例如反相RP-18柱层析，可以采用甲醇和水按体积比从2:8到10:0梯度洗脱，例如，甲醇与水的体积比可以为2:8、5:5、8:2、10:0。在本发明更具体的实施方案中，对于树脂柱层析，例如D101大孔树脂柱层析，可以采用甲醇和水按体积比从2:8到10:0梯度洗脱，例如，甲醇与水的体积比可以为2:8、5:5、8:2、10:0。在本发明更具体的实施方案中，对于凝胶柱层析，例如Sephadex LH-20凝胶柱层析，可以采用甲醇或氯仿-甲醇(1:1，v:v)洗脱。在本发明更具体的实施方案中，对于中压色谱分离凝胶，例如MCI凝胶，可以采用乙醇和水按体积比从2:8到10:0梯度洗脱，例如，乙醇与水的体积比可以为2:8、5:5、8:2、10:0。在本发明更具体的实施方案中，对于半制备HPLC，可以采用乙腈和水等度洗脱，例如以50％乙腈-水为流动相进行洗脱。在本发明更具体的实施方案中，对于半制备HPLC，还可以采用乙腈和水梯度洗脱，例如采用乙腈和水按体积比从2:8到8:2梯度洗脱。
下面结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用来限制本发明的保护范围。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换，所有这些修改和替换都落入了本发明权利要求书请求保护的范围内。
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
在下述实施例中，光学旋光度使用Autopol VI旋光仪测量。电子圆二色谱(ECD)使用Applied Photophysics圆二色光谱仪测量。紫外光谱(UV)使用Shimadzu UV2700紫外光谱仪测量。1H NMR,13C NMR和2DNMR谱使用Bruker AM-500或AM-600核磁共振仪记录。高分辨质谱(HR-ESI-MS)使用Agilent 1290UPLC/6540Q-TOF质谱仪测定。半制备HPLC使用Agilent1260液相，色谱柱为Zorbax SB-C18制备柱，流速均为3.0mL/min。柱层析涉及使用硅胶(200-300目，青岛海洋化工公司，中国)、RP-18(40-60μm，Merk)、D101大孔树脂(上海麦克林生化科技股份有限公司，中国)、MCI凝胶(75-150μm，三菱化学株式会社，日本)和SephadexLH-20(GE Healthcare，美国)。薄层色谱(TLC)是在硅胶GF254板(青岛海洋化工公司，中国)上进行的，通过10％硫酸-乙醇溶液观察其斑点。吸光度值使用Biotek ELX800多功能酶标仪测定。荧光图片使用倒置显微镜(Axio Observer3,Zeiss；Oberkochen，德国)进行拍摄。
实施例1：化合物chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E的制备方法一
将全缘金粟兰石棉变种全株(20kg)干燥后粉碎，加入60L甲醇(有机溶剂和植物材料的体积比为3:1)，65℃加热回流提取3次，3h/次，合并提取液后减压蒸馏得到甲醇提取物(1.8kg)。甲醇提取物通过D101大孔树脂柱，用甲醇-水梯度洗脱(2:8、5:5、8:2、10:0，v/v)，每个梯度4～6个柱体积，取甲醇与水体积比8:2洗脱下来的部位(162.4g)通过正相硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(1:0、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、1:1，v/v)，每个梯度4～6个柱体积，根据薄层色谱，10％硫酸-乙醇溶液显色后合并得到7个组分，分别为Fr.1–Fr.7。Fr.5(22.6g)经过RP-18反相硅胶柱层析，用甲醇-水梯度洗脱(2:8、3:7、5:5、7:3、8:2、10:0，v/v)，每个梯度4～6个柱体积，得到6个组分，分别为Fr.5.1–Fr.5.6。Fr.5.3(2.9g)通过正相硅胶柱层析，用石油醚-丙酮梯度洗脱(20:1、10:1、5:1、1:1、1:5，v/v)，每个梯度4～6个柱体积，得到5个组分，分别为Fr.5.3.1–Fr.5.3.5。Fr.5.3.2(675.2mg)通过半制备HPLC，采用等度洗脱的方法，以50％乙腈-水为流动相进行制备可得到7.8mgchlorahololide H(得率：0.000039％)和4.0mg chlorajaponilide E(得率：0.00002％)。Fr.5.4(3.6g)采用正相硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇(100:1,v/v)进行等度洗脱，得到6个组分，分别为Fr.5.4.1–Fr.5.4.6。Fr.5.4.3(573.3mg)通过半制备HPLC，采用等度洗脱的方法，以60％乙腈-水为流动相进行制备得到10.0mg chlorahololide J(得率：0.00005％)和14.0mg chlorahololide L(得率：0.00007％)。
Chlorahololide H的物理常数和波谱数据：白色粉末；(c0.14,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)223(3.18)nm；CD(MeOH)λmax(Δε)208(-14.1),251(+9.75),335(-1.33)nm；1HNMR(500MHz)δ1.59(1H,m,H-1),0.93(1H,td,J＝7.6,4.5Hz,H-2α),0.34(1H,q,J＝4.2Hz,H-2β),1.86(1H,m,H-3),3.88(1H,d,J＝3.4Hz,H-6),2.69(1H,d,J＝19.1Hz,H-9α),2.53(1H,m,H-9β),1.83(3H,s,H3-13),1.17(3H,s,H3-14),2.74(1H,dd,J＝16.1,1.5Hz,H-15α),2.53(1H,m,H-15β),1.39(1H,td,J＝8.4,3.9Hz,H-1′),0.71(1H,td,J＝8.4,5.6Hz,H-2′α),1.78(1H,m,H-2′β),1.19(1H,m,H-3′),1.62(1H,m,H-5′),2.38(2H,m,H-6),1.92(1H,dd,J＝5.9,1.8Hz,H-9′),4.35(2H,m,H-13′),0.62(3H,s,H3-14′),3.53(1H,dd,J＝11.4,6.1Hz,H-15′a),3.57(1H,dd,J＝11.4,5.0Hz,H-15′b),3.72(3H,s,MeO-12)；13CNMR(CDCl3,125MHz)δ28.4(C-1,d),16.2(C-2,t),24.9(C-3,d),138.8(C-4,s),134.1(C-5,s),41.2(C-6,d),137.3(C-7,s),204.9(C-8,s),52.2(C-9,t),45.2(C-10,s),142.9(C-11,s),170.8(C-12,s),19.4(C-13,q),22.8(C-14,q),25.5(C-15,t),24.1(C-1′,d),16.7(C-2′,t),21.3(C-3′,d),47.2(C-4′,d),57.8(C-5′,d),24.9(C-6′,t),169.3(C-7′,s),93.3(C-8′,s),54.4(C-9′,d),44.0(C-10′,s),126.1(C-11′,s),172.8(C-12′,s),55.1(C-13′,t),24.4(C-14′,q),63.2(C-15′,t),52.8(MeO-12,q).HRESIMS m/z 543.2360[M+Na]+(calcd forC31H36NaO7 +,543.2359)。
Chlorahololide J的物理常数和波谱数据：黄色胶状物；(c 0.14,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)219(3.42)nm；CD(MeOH)λmax(Δε)209(-21.9),253(+18.6),333(-3.02)nm；1HNMR(CDCl3,600MHz)δ1.60(1H,o,H-1),0.95(1H,td,J＝7.7,4.7Hz,H-2α),0.36(1H,q,J＝4.1Hz,H-2β),1.84(1H,o,H-3),3.88(1H,d,J＝3.7Hz,H-6),2.36(1H,d,J＝18.5Hz,H-9α),2.56(1H,d,J＝18.5Hz,H-9β),1.81(3H,s,H3-13),1.15(3H,s,H3-14),2.75(1H,d,J＝16.6Hz,H-15α),2.55(1H,o,H-15β),1.60(1H,o,H-1′),0.71(1H,td,J＝8.7,5.8Hz,H-2′α),1.31(1H,qJ＝4.0Hz,H-2′β),1.39(1H,td,J＝8.8,3.5Hz,H-3′),1.70(1H,dd,J＝13.6,6.2Hz,H-5′),2.46(1H,dd,J＝18.5,6.1Hz,H-6′α),2.73(1H,dd,J＝18.5,13.6Hz,H-6′β),1.84(1H,m,H-9′),4.65(1H,d,J＝12.4Hz,H-13′a),4.98(1H,d,J＝12.5Hz,H-13′b),0.82(3H,s,H3-14′),3.69(1H,d,J＝11.6Hz,H-15′a),4.53(1H,d,J＝11.7,Hz,H-15′b),6.89(1H,m,H-3″),4.35(1H,m,H-4″a),4.42(1H,dd,J＝15.7,4.8Hz,H-4″b),1.87(3H,s,H3-5″),2.12(3H,s,H-2″′),3.65(3H,s,MeO-12)；13C NMR(CDCl3,150MHz)δ28.6(C-1,d),16.3(C-2,t),24.8(C-3,d),138.5(C-4,s),134.7(C-5,s),41.2(C-6,d),136.5(C-7,s),201.0(C-8,s),52.2(C-9,t),45.2(C-10,s),143.0(C-11,s),171.0(C-12,s),19.1(C-13,q),22.8(C-14,q),25.3(C-15,t),25.3(C-1′,d),11.7(C-2′,t),27.9(C-3′,d),77.7(C-4′,s),61.2(C-5′,d),23.1(C-6′,t),173.3(C-7′,s),93.2(C-8′,s),55.6(C-9′,d),45.0(C-10′,s),123.0(C-11′,s),171.9(C-12′,s),54.7(C-13′,t),26.5(C-14′,q),71.8(C-15′,t),168.1(C-1″,s),127.2(C-2″,d),142.5(C-3″,d),60.1(C-4″,t),12.8(C-5″,q),171.4(C-1″′,s),20.7(Me-2″′,q),53.0(MeO-12,q).HRESIMS m/z699.2781[M+Na]+(calcd for C38H44NaO11 +,699.2781)。
Chlorahololide L的物理常数和波谱数据：黄色胶状物；(c 0.11,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)220(3.29)nm；CD(MeOH)λmax(Δε)209(-21.5),259(+34.2),330(-6.69)nm；1H NMR(CDCl3,600MHz)δ1.56(1H,o,H-1),0.92(1H,m,H-2α),1.33(1H,m,H-2β),1.87(1H,o,H-3),2.25(1H,d,J＝17.8Hz,H-9α),2.55(1H,d,J＝17.8Hz,H-9β),1.70(3H,s,H3-13),1.23(3H,s,H3-14),3.00(1H,dd,J＝14.1,7.1Hz,H-15α),1.52(1H,o,H-15β),1.52(1H,o,H-1′),0.58(1H,td,J＝8.9,5.6Hz,H-2′α),1.18(1H,m,H-2′β),1.59(1H,m,H-3′),1.44(1H,dd,J＝13.0,6.7Hz,H-5′),2.31(1H,dd,J＝17.5,6.5Hz,H-6′α),2.83(1H,dd,J＝17.5,13.1Hz,H-6′β),2.57(1H,d,J＝17.2Hz,H-9′),4.38(1H,d,J＝13.8Hz,H-13′a),4.44(1H,d,J＝13.6Hz,H-13′b),0.97(3H,s,H3-14′),3.89(1H,d,J＝11.6Hz,H-15′a),4.25(1H,d,J＝11.5,Hz,H-15′b),6.90(1H,m,H-3″),1.83(3H,d,J＝7.2Hz,H-4″),1.86(3H,s,H3-5″),3.70(3H,s,MeO-12)；13C NMR(CDCl3,150MHz)δ28.7(C-1,d),8.4(C-2,t),29.4(C-3,d),90.4(C-4,s),160.7(C-5,s),126.6(C-6,s),136.5(C-7,s),201.4(C-8,s),48.6(C-9,t),44.5(C-10,s),135.2(C-11,s),169.6(C-12,s),20.0(C-13,q),22.1(C-14,q),37.1(C-15,t),27.2(C-1′,d),10.5(C-2′,t),29.4(C-3′,d),77.8(C-4′,s),54.6(C-5′,d),21.7(C-6′,t),166.4(C-7′,s),87.6(C-8′,s),51.8(C-9′,d),45.2(C-10′,s),127.8(C-11′,s),173.0(C-12′,s),55.4(C-13′,t),24.3(C-14′,q),70.8(C-15′,t),168.4(C-1″,s),128.4(C-2″,d),138.6(C-3″,d),14.7(C-4″,q),12.3(C-5″,q),52.7(MeO-12,q).HRESIMS m/z 673.2626[M+Na]+(calcd for C36H42NaO11 +,673.2625)。
Chlorajaponilide E的物理常数和波谱数据：白色粉末；1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ2.00(1H,m,H-1),1.23(1H,m,H-2α),0.95(1H,m,H-2β),1.85(1H,m,H-3),3.75(1H,s,H-9),1.78(3H,s,H3-13),1.02(3H,s,H3-14),3.07(1H,dd,J＝14.3,7.1Hz,H-15α),1.60(1H,m,H-15β),1.58(1H,m,H-1′),1.18(1H,m,H-2′α),0.60(1H,td,J＝9.0,5.5Hz,,H-2′β),1.60(1H,m,H-3′),1.60(1H,m,H-5′),2.88(1H,dd,J＝17.5,13.1Hz,H-6′α),2.25(1H,dd,J＝17.5,6.7Hz,H-6′β),2.59(1H,dd,J＝10.0,7.1Hz,H-9′),4.43(1H,d,J＝13.7Hz,H-13′a),4.36(1H,d,J＝13.9Hz,H-13′b),0.98(3H,s,H3-14′),4.15(1H,d,J＝11.4Hz,H-15′a),3.93(1H,d,J＝11.5Hz,H-15′b),6.84(1H,m,H-3″),1.84(3H,s,H-4″),1.85(3H,s,H3-5″),3.78(3H,s,MeO-12)；13C NMR(125MHz,Chloroform-d)δ26.1(C-1,d),8.4(C-2,t),27.8(C-3,d),90.6(C-4,s),158.7(C-5,s),127.1(C-6,s),143.0(C-7,s),198.9(C-8,s),77.9(C-9,d),50.3(C-10,d),129.2(C-11,s),170.3(C-12,s),21.3(C-13,q),15.4(C-14.q),36.8(C-15,t),27.4(C-1′,d),10.5(C-2′,t),29.3(C-3′,d),77.7(C-4′,s),54.8(C-5′,d),21.9(C-6′,t),166.5(C-7′,s),87.6(C-8′,s),52.5(C-9′,d),45.2(C-10′,s),128.5(C-11′,s),173.1(C-12′,s),55.1(C-13′,t),24.4(C-14′,q),70.6(C-15′,t),168.3(C-1″,s),128.2(C-2″,s),139.0(C-3″,d),14.7(C-4″,q),12.3(C-5″,q),52.9(MeO-12,q)。
实施例2：化合物chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E的制备方法二
将全缘金粟兰石棉变种的干燥根(20kg)粉碎，加入100L乙酸乙酯(有机溶剂和植物材料的体积比为5:1)，冷浸提取4次，3天/次，合并提取液后减压蒸馏得到膏状提取物(1.1kg)。膏状提取物经正相硅胶柱层析，用石油醚-丙酮梯度洗脱(1:0、50:1、10:1、1:1、1:5、0:1，v/v)，每个梯度4～6个柱体积，得到6个组分，分别为Fr.1–Fr.6。Fr.4(88.2g)经过MCI凝胶柱层析，用乙醇-水梯度洗脱(2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、10:0，v/v)，每个梯度4～6个柱体积，得到8个组分，分别为Fr.4.1–Fr.4.8。Fr.4.3(7.8g)采用正相硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱(200:1、50:1、20:1、10:1、1:1，v/v)，每个梯度4～6个柱体积，得到5个组分，分别为Fr.4.3.1–Fr.4.3.5。Fr.4.3.3(267.9mg)通过半制备HPLC，采用等度洗脱的方法，以55％乙腈-水为流动相进行制备可得到12.0mg chlorahololide H(得率：0.00006％)和6.0mg chlorajaponilide E(得率：0.00003％)。Fr.4.3.4(437.2mg)通过半制备HPLC，采用梯度洗脱的方法(0～30min，乙腈浓度从30％→80％，v/v)进行制备得到16.0mg chlorahololide J(得率：0.00008％)和4.0mg chlorahololide L(得率：0.00002％)。
实施例3：化合物chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E的制备方法三
将全缘金粟兰全株(15kg)干燥后粉碎，用45L 95％乙醇(有机溶剂和植物材料的体积比为3:1)，70℃加热回流提取2次，3h/次，合并提取液后减压蒸馏得到乙醇提取物(1.4kg)。乙醇提取物加入6L纯净水混悬后，再加入6L乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液后回收溶剂得到乙酸乙酯浸膏(763.5g)。乙酸乙酯浸膏通过中MCI凝胶柱层析，用甲醇-水梯度洗脱(2:8、3:7、5:5、7:3、8:2、10:0，v/v)，每个梯度4～6个柱体积，得到6个组分，分别为Fr.1–Fr.6。Fr.3(146.7g)采用正相硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱(200:1、100:1、50:1、10:1、1:1，v/v)，每个梯度4～6个柱体积，得到5个组分，分别为Fr.3.1–Fr.3.5。Fr.3.2(24.3g)采用Sephadex LH-20凝胶柱层析，以甲醇为洗脱剂，然后通过半制备HPLC，以乙腈-水为流动相，采用等度洗脱的方法(乙腈浓度55％)进行制备，得到4.5mgchlorahololide H(得率：0.00003％)和15.0mg chlorajaponilide E(得率：0.0001％)。Fr.3.3(16.4g)采用Sephadex LH-20凝胶柱层析，以氯仿-甲醇(1:1,v:v)为洗脱剂，然后通过半制备HPLC，以乙腈-水为流动相，采用等度洗脱的方法(乙腈浓度60％)进行制备，得到18mg chlorahololide J(得率：0.00012％)和13.5mg chlorahololide L(得率：0.00009％)。
实施例4：化合物chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E的制备方法四
将宽叶金粟兰全株(20kg)干燥后粉碎，用20L甲醇(有机溶剂和植物材料的体积比为1:1)，在室温下超声波提取3次，合并提取液后减压蒸馏得到膏状提取物(1.3kg)。膏状提取物经正相硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(1:0、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、1:1，v/v)，每个梯度4～6个柱体积，得到7个组分，分别为Fr.1–Fr.7。Fr.5(127.4g)经过RP-18反相硅胶柱层析，用甲醇-水梯度洗脱(2:8，5:5，8:2，10:0，v/v)，每个梯度4～6个柱体积，得到4个组分，分别为Fr.5.1–Fr.5.4。将Fr.5.3(16.4g)采用经正相硅胶柱层析，用石油醚-丙酮梯度洗脱(10:1、1:1、1:5、0:1，v/v)，每个梯度4～6个柱体积，得到4个组分，分别为Fr.5.3.1–Fr.5.3.4。Fr.5.3.2(478.6mg)通过半制备HPLC，采用等度洗脱的方法，以50％乙腈-水为流动相进行制备，可得到10.0mg chlorahololide H(得率：0.00005％)和16.0mgchlorajaponilide E(得率：0.00008％)。Fr.5.4(23.3g)采用正相硅胶柱层析，以石油醚-丙酮梯度洗脱(20:1、10:1、1:1、1:5、0:1，v/v)，每个梯度4～6个柱体积，得到5个组分，分别为Fr.5.4.1–Fr.5.4.5。Fr.5.4.2(898.4mg)通过半制备HPLC，采用梯度洗脱的方法(0～30min，乙腈浓度从30％→70％，v/v)进行制备可得到8.0mg chlorahololide J(得率：0.00004％)和12.0mg chlorahololide L(得率：0.00006％)。
实施例5：chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E的NLRP3炎症小体抑制活性
乳酸脱氢酶(LDH)是一种稳定的胞浆酶，存在所有的细胞中，当细胞膜损伤时快速释放到细胞培养液中。NLRP3炎症小体激活后最终会导致细胞焦亡，细胞膜破裂，导致LDH释放到细胞培养液中，可以通过测定细胞培养液中LDH含量来监测细胞内NLRP3炎症小体激活水平。因此，在本实施例中，使用小鼠单核巨噬细胞J774A.1构建NLRP3炎症小体激活模型，通过脂多糖(LPS)和尼日利亚菌素(Nigericin)共同诱导NLRP3炎症小体激活。具体方法可以参见Xing,Jie Zhang,et al.,2021,Leojaponin inhibits NLRP3 inflammasomeactivation through restoration of autophagy via upregulating RAPTORphosphorylation,Journal of Ethnopharmacology 278(2021)114322。
具体实验如下，将小鼠单核巨噬细胞J774A.1(购自中国科学院昆明动物研究所)以2×105个细胞每孔的密度接种在24孔板中，每个孔含500μL添加了8％热灭活胎牛血清(FBS,Gibco)的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM,Gibco)，并置于含有5％CO2、温度恒定37℃条件下的CO2培养箱(Thermo Scientific)中培养过夜。经过一夜的培养后，移除培养基。随后，每个孔加入500μL溶于Opti-MEM培养基(Thermo Scientific,Eugene,OR,USA)中的200ng/mL LPS(上海碧云天生物技术有限公司)，刺激细胞3.5小时。然后，吸去培养基，分别再加入500μL溶于Opti-MEM培养基中的10μM的化合物chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E，添加500μL溶于Opti-MEM培养基中的0.1μMMCC950(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)作为阳性对照，添加500μL溶于Opti-MEM培养基中的1μL/mL的DMSO作为阴性对照，CO2培养箱中孵育细胞30min。最后，吸去培养基，每个孔加入500μL溶于Opti-MEM培养基中的10μM尼日利亚菌素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)刺激细胞1小时。在炎症小体激活和化合物处理后，将细胞培养上清液(120μL)收集于96孔板中，再加入60μL LDH检测工作液(上海碧云天生物技术有限公司)，混匀，室温避光孵育30min。在490nm处测定吸光度，按照下述公式计算LDH释放抑制率，即LDH释放抑制率(％)＝(DMSO处理组OD490 nm–样品组OD490 nm)/DMSO处理组OD490 nm×100％。化合物chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E对NLRP3炎症小体激活半抑制浓度(Halfmaximal inhibitoryconcentration,IC50)的测试方法如下：每一个化合物设置不同的浓度梯度(10μM、5μM、2.5μM、1.25μM和0.625μM)，分别测试该化合物在不同浓度下的LDH释放抑制率，再用GraphPadPrism7.0软件进行非线性回归分析计算化合物的IC50值。利用MTT法检测细胞存活率，排除化合物chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E对细胞的毒性影响，具体实验方法可以参见Xing,Jie Zhang 2021(同上)。所有实验至少重复3次，实验数据采用GraphPadPrism7.0进行分析计算。
实验结果如表1和表2所示，chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E在浓度为10μM时具有显著的NLRP3炎症小体抑制活性，进一步测试这些化合物的IC50值，分别为8.73μM、6.15μM、3.03μM和2.99μM。
表1.Chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E对NLRP3炎症小体抑制率(％)
aMCC950为阳性对照药
表2.Chlorahololides H、J、L和chlorajaponilide E对NLRP3炎症小体抑制的IC50值
aCC50值表示化合物诱导50％细胞毒性的浓度
实施例6：chlorajaponilide E显著减少J774A.1巨噬细胞的焦亡
本实施例探讨对NLRP3炎症小体具有显著抑制活性的乌药烷型倍半萜二聚体chlorajaponilide E对J774A.1巨噬细胞焦亡的影响。具体方法可以参见，Xing,JieZhang,et al.,2021,Leojaponin inhibits NLRP3inflammasome activation throughrestoration of autophagy via upregulating RAPTOR phosphorylation,Journal ofEthnopharmacology 278(2021)114322。
具体实验如下，将小鼠单核巨噬细胞J774A.1(购自中国科学院昆明动物研究所)以4×104个细胞每孔的密度接种在96孔板中，每个孔含200μL添加了8％热灭活胎牛血清(FBS,Gibco)的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM,Gibco)，并置于含有5％CO2、温度恒定37℃条件下的CO2培养箱(Thermo Scientific)中培养过夜。经过一夜的培养后，设置三组不同实验。LPS和尼日利亚菌素处理组操作如下：移除培养基，每个孔加入200μL溶于Opti-MEM培养基中的200ng/mL LPS，刺激细胞3.5小时，然后吸去培养基，每个孔再加入200μL溶于Opti-MEM培养基的化合物chlorajaponilide E(1μM、3μM和9μM)，以及DMSO(阴性对照，1μL/mL)，将细胞在CO2培养箱中孵育30min。最后，移除培养基，每个孔重新加入200μL溶于Opti-MEM培养基中的10μM尼日利亚菌素，刺激细胞1小时。未处理组操作如下：移除培养基，每孔加入200μL Opti-MEM培养基。仅用chlorajaponilide E(9μM)处理组操作如下：移除培养基，每孔加入200μL Opti-MEM培养基。3.5小时后，吸去培养基，每个孔再加入200μL溶于Opti-MEM培养基中的9μM化合物chlorajaponilide E。
LPS和尼日利亚菌素处理组细胞在NLRP3炎症小体激活后，移去上清液，加入100μL3μg/mL的PBS配制的碘化丙啶(Propidium iodide,PI，上海碧云天生物技术有限公司)和0.5μg/mL的Hoechst 33342(上海碧云天生物技术有限公司)作为染料对巨噬细胞J774A.1进行染色，室温染色15min，用荧光倒置显微镜(Axio Observer3,Zeiss；Oberkochen,德国)进行拍照。PI使焦亡细胞染成红色，Hoechst 33342将细胞核染成蓝色。其他两组实验细胞采用相同操作。所有实验至少重复3次。实验数据采用GraphPad Prism7.0进行分析计算。采用单因素方差分析(One-wayANOVA)对各组间的差异进行分析。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，当P<0.05为有统计学意义，具有显著性差异。
结果如图2和3所示。从图2中可以看出与未处理组相比，LPS和尼日利亚菌素处理组可以明显增加PI染色的比例，表明焦亡的细胞数量明显增多。而仅用chlorajaponilideE(9μM)处理组的细胞与未处理组没有区别，表明化合物chlorajaponilide E不会引起J774A.1细胞发生焦亡。另外，在LPS和尼日利亚菌素处理组中，与阴性对照DMSO相比，chlorajaponilide E可以以浓度依赖性的方式减少J774A.1细胞焦亡比例，表明该化合物能有效抑制NLRP3炎症小体激活引发的细胞焦亡。图3是chlorajaponilide E抑制J774A.1细胞焦亡量化图，在LPS和尼日利亚菌素处理组中，与阴性对照DMSO相比，chlorajaponilide E(1μM、3μM和9μM)给药后J774A.1细胞焦亡受到抑制，P<0.001，表明chlorajaponilide E可以显著抑制J774A.1细胞由LPS和尼日利亚菌素诱导的焦亡。
Claims (11)
1.乌药烷型倍半萜二聚体或其药学上可接受的盐，其特征在于所述乌药烷型倍半萜二聚体具有以下结构式中的任意一种：
2.用于治疗慢性炎症性疾病的药物或药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述乌药烷型倍半萜二聚体或其药学上可接受的盐中的至少一种。
3.乌药烷型倍半萜二聚体或其药学上可接受的盐在制备用于治疗慢性炎症性疾病的药物中的应用，所述乌药烷型倍半萜二聚体具有以下结构式I～IV中的任意一种：
4.制备权利要求1所述乌药烷型倍半萜二聚体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将金粟兰属(Chloranthus)植物材料干燥粉碎，采用有机溶剂提取后脱溶，得到金粟兰属植物材料提取物；和
2)对所述金粟兰属植物材料提取物进行柱层析，得到chlorahololides H、J和L，
其中所述有机溶剂乙酸乙酯、乙醇、甲醇中的至少一种，
并且其中所述金粟兰属植物是全缘金粟兰(C.holostegius)、宽叶金粟兰(C.henryi)或全缘金粟兰石棉变种(C.holostegius var.shimianensis)。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙酸乙酯、甲醇、95％乙醇或其混合物。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述金粟兰属植物材料是金粟兰属植物的根、茎、枝叶、全株或其混合物。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂与所述金粟兰属植物材料的体积比为1:1到5:1。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂与所述金粟兰属植物材料的体积比为3:1。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述柱层析包括正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、树脂柱层析、凝胶柱层析、中压色谱分离凝胶和半制备HPLC。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述柱层析所用洗脱剂为石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、正丁醇、乙腈、水和甲酸中的至少一种。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述正相硅胶柱层析采用石油醚和丙酮按体积比从1:0到0:1梯度洗脱，或所述正相硅胶柱层析采用二氯甲烷和甲醇按体积比从1:0到1:1梯度洗脱；所述反相硅胶柱层析采用甲醇和水按体积比从2:8到10:0梯度洗脱；所述树脂柱层析采用甲醇和水按体积比从2:8到10:0梯度洗脱；所述凝胶柱层析采用甲醇或甲醇和氯仿按体积比1:1洗脱；所述中压色谱分离凝胶采用甲醇或乙醇和水按体积比从2:8到10:0梯度洗脱；所述半制备HPLC采用乙腈和水等度洗脱，或所述半制备HPLC采用乙腈和水按体积比从2:8到8:2梯度洗脱。
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