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KR102244882B1 - 2 차원 rplc-sfc 크로마토그래피를 위한 시스템들 및 방법들 - Google Patents

2 차원 rplc-sfc 크로마토그래피를 위한 시스템들 및 방법들 Download PDF

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KR102244882B1
KR102244882B1 KR1020197010617A KR20197010617A KR102244882B1 KR 102244882 B1 KR102244882 B1 KR 102244882B1 KR 1020197010617 A KR1020197010617 A KR 1020197010617A KR 20197010617 A KR20197010617 A KR 20197010617A KR 102244882 B1 KR102244882 B1 KR 102244882B1
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모하마드 알-사야
카다파캄 벤카트라마니
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

유기 화합물들의 복합 혼합물들을 분리 및/또는 분석하기 위한 2 차원 크로마토그래피 시스템들 및 방법들이 제공된다. 특히, RPLC 이동상이 통과하게 하면서 제 1 차원 크로마토그래프로부터 용출된 분석물들을 수집하는 인터페이스에서 트래핑 칼럼을 포함한 2 차원 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) - 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 시스템이 설명된다. RPLC 차원 칼럼으로부터 관심 피크들은 트래핑 칼럼에서 급격한 농도 펄스들로서 효과적으로 초점이 맞추어지고, 이것은 추후에 제 2 차원 SFC 칼럼으로 주입된다. 시스템은 의약 화합물들의 동시 아키랄 및 키랄 분석에 사용될 수 있다. 제 1 차원 RPLC 분리는 아키랄 순도 결과를 제공하고, 제 2 차원 SFC 분리는 키랄 순도 결과 (거울상 이성질체 초과량) 를 제공한다.

Description

2 차원 RPLC-SFC 크로마토그래피를 위한 시스템들 및 방법들{SYSTEMS AND METHODS FOR TWO-DIMENSIONAL RPLC-SFC CHROMATOGRAPHY}
관련 출원의 상호 참조
본원은 2014 년 10 월 27 일에 출원된 미국 특허 가출원 제 62/069,219 호의 우선권을 주장하고, 가출원의 개시 내용은 본원에 참조로 전부 원용된다.
본 발명은 화합물들의 혼합물들의 직교 분리 및 분석을 위한 다차원 크로마토그래피 시스템들 및 방법들에 관한 것이다. 예시적 2 차원 역상의 액체 크로마토그래피-초임계 유체 크로마토그래피 시스템들 및 그것의 사용 방법들이 개시된다.
크로마토그래피는 화합물들의 혼합물들의 분리 및 분석에 널리 사용된다. 1 차원 크로마토그래피의 피크 용량의 제한으로 인해, 상당히 증가된 피크 용량을 갖는 다차원 크로마토그래피 시스템들이 복합 샘플들의 분석을 위해 고안되었다. 2 차원 (2D) 크로마토그래프 기술은 특히 복합 혼합물들의 분석에서 매우 대중화되었다. 1 차원 (1D) 크로마토그래피와 비교했을 때, 리텐션 기구들이 상보적이라고 가정하면 2D 크로마토그래프 기술은 더 높은 선택성과 분해능을 갖는다. 개별 분리의 선택성이 독립적일 (직교) 때 2 차원 분리 시스템에서 최대 피크 용량이 달성되어서, 제 1 차원에서 불량하게 분해되는 성분들은 제 2 차원에서 완전히 분해될 수도 있다. 직교 분리 기구들이 2 개의 차원에서 사용된다면, 시스템의 이론적 피크 용량은 개별 피크 용량들의 곱이다. Giddings, J.C. Anal. Chem. 1984, 56: 1258A; Giddings, J. C., Cortes, H. J. (Ed.), Multidimensional Chromatography: Techniques and Applications, Marcel Dekker, 뉴욕 1990, p. 1; Jandera, P. 등의, Chromatographia 2004, 60:S27 이 참조된다.
하지만, 감도 및 용매 호환성 면에서 2D 크로마토그래피에 대해 몇 가지 제한이 존재한다. 예를 들어, 제 1 차원으로부터 넘겨진 이동상은 종종 제 2 차원과 간섭을 발생시켜서, 제 2 차원의 분리 능력을 제한한다. 제 1 차원 및 제 2 차원에서 사용된 용매들의 비호환성은 심한 대역 분산 또는 확장 및 피크 열화를 유발할 수 있어서, 인터페이스 설계에 대해 큰 도전을 제기한다. Tian, H., 외, J. Chromatogr . A 2006, 1137:42. 용매 불혼화성 우려를 완화하기 위해서, 연구원들은 2 개의 차원에서 호환성 이동상들을 사용하는 여러 가지 2D 시스템들을 개발하였다. 일부 예들은 다음을 포함한다: 2D 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC x RPLC) (Venkatramani, C.J. 외, J. Sep . Sci . 2012, 35: 1748; Zhang, J. 외, J. Sep . Sci . 2009, 32: 2084; Song, C.X. 외, Anal. Chem . 2010, 82:53; Liu, Y.M. 외, J. Chromatogr . A 2008, 1206:153), 2D 친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피 (HILIC x RPLC) (Liu, Y.M. 외, J. Chromatogr . A 2008, 1208:133; Wang, Y. 외, Anal. Chem . 2008, 80:4680; Louw, S. 외, J. Chromatogr . A 2008, 1208:90), 2D 순상 액체 크로마토그래피 x 초임계 유체 크로마토그래피 (NPLC x SFC) (Gao, L. 외, J. Sep . Sci . 2010, 33:3817), 및 2D SFC x SFC (Zeng, L. 외, J. Chromatogr . A 2011, 1218:3080; Lavison, G. 외, J. Chromatogr . A 2007, 1161:300; Hirata, Y. 외, J. Sep . Sci . 2003, 26:531; Okamoto, D. 외, Anal. Sci. 2006, 22:1437; Guibal, P. 외, J. Chromatogr . A 2012, 1255:252). Anderer 외의, US 2013/0134095 는, 제 2 LC 의 상태에 대해 제 1 LC 의 출력을 제 2 LC 로 주입하는 주입 이벤트를 제어함으로써 제 1 LC 에 의한 제 2 LC 와 간섭을 추가로 감소시키려는 2D LC 시스템 및 방법들을 개시하였다.
비호환성 "순상" 차원과 "역상" 차원을 결합한 한 가지 기술은 2D SFC x RPLC (Francois, I. 외, J. Sep . Sci . 2008, 31:3473 ~ 3478; Francois, I. 및 Sandra, P. J. Chromatogr . A 2009, 1216:4005) 이다. 이 경우에, SFC 분획물들 중 무극성 초임계 이산화탄소는 (대기압에 노출될 때) 증발되어서 제 2 RPLC 차원 (통상적으로 알콜 개질제) 에 대해 호환성인 이동상을 갖는 분획물들을 생성하였다. Francois, I. 외의 SFC x RPLC 시스템은 제 1 차원 SFC 유닛과 제 2 차원 RPLC 유닛 사이 인터페이스를 위한 2-위치/10-포트 스위칭 밸브를 이용한다. 시스템은 SFC 칼럼으로부터 용출된 분석물들이 CO2 스트림에 의해 폐기물 라인으로 강제 이동되는 것을 방지하도록 인터페이스에서 패킹된 루프들을 사용하고, 물은 제 2 차원에서 잔류 CO2 가스의 간섭을 감소시키도록 루프로 도입된다.
Cortes 와 동료들 (J. Microcol . Sep . 1992, 4:239-244; 및 미국 특허 제 5,139,681 호) 은, 후에 제 2 차원 SFC 를 위해 CO2 이동상에 의해 흡수되는, 용출된 분석물들의 침전물을 남기는 질소 가스의 통과에 의해 제 1 차원 LC 로부터의 휘발성 용매들이 제거되는 샘플 유입 모세관을 포함한 2D LC x SFC 시스템을 설명하였다. 하지만, 질소 가스의 통과에 의한 용매 제거는 수성 이동상을 사용한 RPLC 에 대해 실용적이지 않다.
제 1 차원 RPLC 및 제 2 차원 SFC 분리를 수행하는 것이 유리한 복합 샘플들을 분리 및 분석하기 위한 효율적인 크로마토그래피 시스템 및 방법들의 필요성이 여전히 있다.
유기 화합물들의 복합 혼합물들을 분리 및/또는 분석하기 위한 다차원 크로마토그래피 시스템들 및 방법들이 개시되고, 예를 들어, 2 차원 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) - 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 시스템, 특히 RPLC × SFC 시스템은 RPLC 이동상을 통과시키면서 RPLC 칼럼으로부터 용출된 분석물들을 유지할 수 있는 인터페이스를 포함하여서, SFC 칼럼으로 운반된 RPLC 용매들의 양을 감소시킨다.
일 양태에서, 샘플을 분리하기 위한 크로마토그래피 시스템이 제공되고, 상기 크로마토그래피 시스템은 ⅰ) 제 1 분리 유닛으로서, a) 상기 제 1 분리 유닛을 통하여 제 1 이동상을 구동하기 위한 제 1 펌프 조립체, b) 상기 제 1 분리 유닛에 샘플을 도입하기 위한 샘플 인젝터; 및 c) 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 칼럼을 포함하는, 상기 제 1 분리 유닛; ⅱ) 제 2 분리 유닛으로서, a) 상기 제 2 분리 유닛을 통하여 제 2 이동상을 구동하기 위한 제 2 펌프 조립체, 및 b) 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 칼럼을 포함하는, 상기 제 2 분리 유닛; 및 ⅲ) 복수의 샘플 루프들을 구비한 제 1 유체 라우팅 유닛으로서, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛은 상기 제 1 분리 유닛 및 상기 제 2 분리 유닛에 연결되고, 상기 복수의 샘플 루프들 중 적어도 하나는 트래핑 칼럼을 포함하고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛을 포함하고, 상기 크로마토그래피 시스템은 먼저 상기 제 1 분리 유닛에서 상기 샘플을 분리하고 추후에 상기 RPLC 칼럼으로부터 용출된 샘플의 적어도 일부를 상기 제 2 분리 유닛에 도입하도록 구성된다. 일부 실시형태들에서, 시스템은 제 1 분리 유닛 및/또는 제 2 분리 유닛을 위한 검출기(들)를 추가로 포함한다. 시스템은 시스템 구성요소들 중 하나 이상에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 제어 기기들을 추가로 포함할 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 2D RPLC x SFC 시스템은 2 개의 샘플 루프들을 구비한 제 1 유체 라우팅 유닛을 포함하고; 2 개의 샘플 루프들 중 하나는 제 1 분리 유닛과 유체 연통하고 2 개의 샘플 루프들 중 다른 하나는 제 2 분리 유닛과 유체 연통한다. 일부 실시형태들에서, 제 1 유체 라우팅 유닛은 3 개 이상의 샘플 루프들을 포함하고, 샘플 루프들 중 하나 이상은 제 1 분리 유닛 및 제 2 분리 유닛으로부터 유동 격리된다. 일 변형예에서, 제 1 분리 유닛 및 제 2 분리 유닛으로부터 유동 격리되는 적어도 하나의 샘플 루프는 정지상 재료를 로딩한 트래핑 칼럼을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 제 1 유체 라우팅 유닛은 트래핑 칼럼에서 유지된 분석물들의 역류 용출을 허용하도록 구성된다. 일부 실시형태들에서, 제 1 유체 라우팅 유닛은 트래핑 칼럼에서 유지된 분석물들의 병류 용출을 허용하도록 구성된다.
일부 실시형태들에서, 2D RPLC x SFC 시스템은, 1 개의 SFC 칼럼, 선택적으로 SFC 칼럼의 상류에 위치결정된 포커스 칼럼을 구비한 제 2 분리 유닛을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 제 2 분리 유닛은 SFC 칼럼들의 병렬 어레이를 포함하고, 각각은 선택적으로 SFC 칼럼의 상류에 위치결정된 포커스 칼럼을 포함한다.
또한, 본원에 설명된 크로마토그래피 시스템들을 사용하는 방법들이 제공된다. 일부 실시형태들에서, 먼저 RPLC 에 의해 복합 샘플을 분획물들로 분리하고; 추가로 제 2 차원에서 SFC 에 의해 RPLC 차원으로부터 분획물들을 분리하는 것을 포함하는 본원에서 설명된 크로마토그래피 시스템을 사용해 샘플들 (예로, 복합 샘플) 을 분석하기 위한 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 본원에서 설명된 크로마토그래피 시스템을 사용해 입체 이성질체 성분들의 혼합물을 포함한 샘플의 동시 아키랄-키랄 분석을 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 샘플의 아키랄 순도를 제공하는 제 1 차원에서 RPLC 에 의한 샘플에서 하나 이상의 관심 부분 입체 이성질체 성분(들)을 분리 (또는 분해) 하고; 샘플에서 성분들의 키랄 순도를 추가로 제공하는 동일한 분석 실행에서 제 2 차원에서 SFC 에 의한 관심 거울상 이성질체 쌍(들)을 분리 (또는 분해) 하는 것을 포함한다.
다른 양태에서, 다차원 크로마토그래피 (예로, 2D RPLC x SFC) 에 의한 샘플을 분리하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 (i) 트래핑 칼럼에서 샘플의 적어도 일부를 포착하는 단계로서, 상기 일부는 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 에 의해 상기 샘플을 분리함으로써 발생되고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 트래핑 칼럼에서 샘플의 적어도 일부를 포착하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 일부에 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 에 의한 추가 분리를 부여하는 단계를 포함한다.
도 1 은 예시적 다차원 크로마토그래피 시스템 (10) 의 모식도이다.
도 2a 는 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 과 접속된 예시적 제 1 분리 유닛 (20) 의 모식도이다.
도 2b 는 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 과 접속된 예시적 제 2 분리 유닛 (40A, 40B) 의 모식도이다.
도 3a 및 도 3b 는 트래핑 칼럼 (330) 을 포함하는 예시적 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 의 모식도들이고, 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 의 구성은 상기 트래핑 칼럼 (330) 을 통한 제 1 이동상 및 제 2 이동상의 역류를 위해 구성된다.
도 3c 및 도 3d 는 트래핑 칼럼 (370) 을 포함하는 예시적 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 의 모식도들이고, 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 의 구성은 상기 트래핑 칼럼 (370) 을 통한 제 1 이동상 및 제 2 이동상의 병류를 위해 구성된다.
도 4a 및 도 4b 는 트래핑 칼럼 (430) 을 포함하는 예시적 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 의 모식도들이고, 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 의 구성은 상기 트래핑 칼럼 (430) 을 통한 제 1 이동상 및 제 2 이동상의 병류를 위해 구성된다.
도 5a 및 도 5b 는 2 개의 트래핑 칼럼들 (530, 560) 을 포함하는 예시적 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 의 모식도들이고, 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 의 구성은 트래핑 칼럼들 (530, 560) 각각을 통한 제 1 이동상 및 제 2 이동상의 역류를 위해 구성된다.
도 6a 내지 도 6d 는 2 개의 라우팅 기구들 (600, 620) 을 포함한 예시적 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 의 모식도들이다.
도 7a 및 도 7b 는 SFC 칼럼들의 어레이를 포함하는 제 2 분리 유닛 (40B) 의 예시적 하류 서브유닛의 모식도들이다.
도 8a 및 도 8b 는 1 개의 트래핑 칼럼 (병류) 을 구비한 예시적 2D RPLC x SFC 시스템의 홈/분석 위치 및 트래핑 위치를 각각 도시한다.
도 9 는 트래핑 칼럼들, 포커싱 칼럼들 및 이차 SFC 칼럼들의 어레이를 사용해 2D RPLC-SFC 의 모식 도면을 나타낸다.
도 10 은 예시적 파킹 데크 밸브의 사진 영상이다.
도 11 은 3 개의 샘플 루프 구성들 (6 ㎕, 12 ㎕, 24 ㎕) 을 갖는 시스템을 사용해 트랜스-스틸벤 산화물 (TSO) 의 다차원 분리를 위해 시간 (분) 이 경과함에 따른 흡광도 측정 (mAU) 의 오버레이 크로마토그램이다.
도 12 는 TSO 의 평가된 농도 범위 (0.005 ~ 0.25 ㎎/㎖) 의 다차원 분리를 위해 시간 (분) 이 경과함에 따른 UV 흡광도 측정 (mAU) 의 오버레이 크로마토그램이다.
도 13 은 2D RPLC-SFC 시스템으로부터 획득된 약물 물질 (A) 의 샘플의 무스파이크 분석 및 스파이크 분석의 오버레이 크로마토그램이다.
도 14a 및 도 14b 는 각각 가변 레벨들의 원하지 않는 거울상 이성질체 (0.1 ~ 2.0% 범위) 를 함유한 약물 물질 (A) 의 샘플의 종래의 SFC 및 2D RPLC-SFC 크로마토그램들이다.
도 15 는 2D RPLC-SFC 시스템을 사용해 약물 물질 (A) 의 샘플의 8 개의 입체 이성질체들의 분리를 도시한 일련의 크로마토그램들이다. 하부 크로마토그램은 제 1 RPLC 차원에서 약물 물질 (A) 의 샘플의 4 개의 부분 입체 이성질체 쌍들의 분리를 나타낸다. 4 개의 상부 크로마토그램들은, 각각의 부분 입체 이성질체 쌍이 제 2 SFC 차원에서 추가로 분리되었음을 보여준다.
도 16 은 SFC 칼럼의 상류 헤드에 위치한 포커스 칼럼을 구비하였을 때와 구비하지 않았을 때 2D RPLC-SFC 시스템을 사용해 농도 범위에 대해 TSO 의 분석들로부터 피크 높이 대 피크 면적의 플롯이다.
본 발명은 복합 샘플들을 분리 및 분석하기 위한 효율적인 크로마토그래피 시스템들 및 방법들, 특히 2 차원 RPLC x SFC 시스템들 및 그것의 사용 방법들을 제공한다.
명확히 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같은 용어, 단수는 하나 이상을 언급한다.
본원에서 "대략적" 값 또는 파라미터의 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 실시형태들을 포함 (및 설명) 한다. 예를 들어, "대략 X" 를 지칭하는 설명은 "X" 의 설명을 포함한다.
시스템들
일 양태에서, 본 발명은 샘플을 분리하기 위한 2 차원 RPLC x SFC 크로마토그래피 시스템을 제공하고, 샘플은 제 1 차원 RPLC 에서, 그 후 제 2 차원 SFC 에서 분리되고, 시스템은 역상 액체 크로마토그래피를 위한 제 1 분리 유닛, 초임계 유체 크로마토그래피를 위한 제 2 분리 유닛, 및 유체 라우팅 유닛인 인터페이스를 포함한다. 유체 라우팅 유닛은, RPLC 칼럼으로부터 용출된 분획물들을 수집하기 위해 제 1 분리 유닛의 유체 경로에 배치될 수 있는 미리 규정된 체적을 각각 가지는 다수의 샘플 루프들을 포함한다. 분획물이 수집된 샘플 루프는 추후에 샘플 루프에 수집된 분획물을 추가 분리를 위한 SFC 칼럼으로 이송하기 위해 제 2 분리 유닛의 유체 경로에 배치된다. 본 발명의 시스템에서, 샘플 루프들 중 적어도 하나는 이동상을 통과시키면서 RPLC 칼럼으로부터 용출된 분석물들을 유지하기 위해 정지상을 함유한 트래핑 칼럼을 포함한다. 새로운 인터페이스 설계는 RPLC 와 SFC 의 결합을 허용한다.
일부 실시형태들에서, 의약 화합물들의 동시 아키랄 및 키랄 분석을 달성할 수 있는, 제 1 차원에서 RPLC 를 이용하고 제 2 차원에서 SFC 를 이용한 온라인 2 차원 크로마토그래프 시스템이 제공된다. 임의의 실시형태들에서, 인터페이스는 작은 체적의 C-18 트래핑 칼럼들과 2-위치/8-포트 스위칭 밸브를 포함한다. 제 1 RPLC 차원 칼럼으로부터 관심 피크들은 작은 체적 트래핑 칼럼(들) (예컨대, C-18 트래핑 칼럼(들)) 에서 급격한 농도 펄스들로서 효과적으로 포커싱되고 그 후 제 2 차원 SFC 칼럼으로 주입되었다. 제 1 차원 RPLC 분리는 아키랄 순도 결과를 제공하고, 제 2 차원 SFC 분리는 키랄 순도 결과 (거울상 이성질체 초과량) 를 제공한다.
도면들을 참조하면, 도 1 은 예시적 다차원 크로마토그래피 시스템 (10) 의 개략 모식도를 도시한다. 제 1 분리 유닛 (20) 과 제 2 분리 유닛 (40A, 40B) 은 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 과 접속된다. 제 1 분리 유닛 (20) 을 통하여 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 으로 제 1 이동상의 방향성 유동은 화살표 (50) 로 나타낸다. 제 2 이동상, 즉 화살표 (60) 로 나타낸 방향성 유동은 제 2 분리 유닛의 상류 서브유닛 (40A) 을 통하여 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 으로 이동하고 추후에 화살표 (70) 로 나타낸 방향으로 제 2 분리 유닛의 하류 서브유닛 (40B) 을 통하여 향하게 된다.
일부 실시형태들에서, 시스템은 시스템의 작동을 제어하기 위한 시스템의 하나 이상의 구성요소들, 예를 들어, 존재하는 펌프 조립체들, 샘플 인젝터, 제 1 유체 라우팅 유닛 (인터페이스), 및 검출기들에 작동가능하게 연결되는 하나 이상의 제어 기기를 포함한다. 제어 기기는 개별 기기들 각각의 작동을 제어하고 자동 샘플 분석을 위한 적절한 소프트웨어를 갖춘 컴퓨터 시스템을 포함할 수도 있다 (예컨대 Agilent 의 Instrument Control Software 또는 Automation Studio software). 도 1 을 참조하면, 제어 기기 (80) 는 다음, 제 1 분리 유닛 (20), 제 1 라우팅 유닛 (30), 및 제 2 분리 유닛 (40A, 40B) 중 적어도 하나에 작동가능하게 연결된다.
크로마토그래피에서 이동상의 조성은 시간이 경과함에 따라 일정하게 유지될 수도 있고, 이것은 본 기술분야에서 등용매 모드로서 공지되어 있다. 대안적으로, 이동상의 조성은 시간이 경과함에 따라 달라질 수도 있고, 이것은 본 기술분야에서 구배 모드로서 공지되어 있다.
2D RPLC x SFC 크로마토그래피 시스템의 제 1 분리 유닛은 제 1 분리 유닛을 통하여 이동상을 구동하기 위한 제 1 펌프 조립체, 제 1 분리 유닛으로 샘플을 도입하기 위한 샘플 인젝터, 및 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 칼럼을 포함한다. RPLC 를 위한 이동상은 2-용매 시스템 (예컨대, 물-아세토니트릴 및 물-메탄올 혼합물들) 및 선택적으로 임의의 첨가제들 (예컨대, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 포름산, 수산화암모늄, 아세트산 암모늄, 아세트산 나트륨 등) 을 포함할 수도 있다. 펌프 조립체는 RPLC 를 위한 이동상을 구동하기 위한 하나 이상의 펌프들을 포함한다. 액체 크로마토그래피에 적합한 펌프들은 본 기술분야에 잘 알려져 있지만, 일부 실시형태들에서, 펌프는 왕복 펌프, 용적형 펌프, 공압 펌프 및/또는 상기 펌프들 중 적어도 하나의 임의의 조합체일 수도 있다. 시스템은, 수동 샘플 인젝터 또는 자동 샘플러와 같은, RPLC 를 위한 이동상으로 샘플을 주입하기 위한 임의의 적합한 샘플 인젝터를 포함할 수도 있다. RPLC 칼럼은 C-18 정지상의 비드들과 같은 역상 정지상을 포함한다. 역상 정지상은 실리카 기반 (예를 들어, 실리카 겔의 코어 구조 함유) 이거나 폴리머 기반 (예를 들어 유기 폴리머 (예컨대, 폴리스티렌) 의 코어 구조 함유) 일 수 있다. 역상 정지상에 적합한 재료들의 비제한적인 실시예들은 C-18, C-8, C-4, 페닐 및 페닐 유도체들, 극성 매립 상, 혼합 모드 상 등을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 제 1 분리 유닛은 RPLC 칼럼으로부터 용출된 분석물들의 존재를 검출하도록 RPLC 칼럼의 하류에 위치결정된 검출기를 추가로 포함한다. 샘플에서 화합물들을 검출하기에 적합한 임의의 검출기, 예로 차등 굴절계, 자외선 분광 광도계, 자외선-가시광선 분광 광도계 검출기, 대전 에어로졸 검출기, 형광 검출기 및 질량 분석계가 사용될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, RPLC 차원을 위한 검출기는 자외선-가시광선 분광 광도계 검출기, 대전 에어로졸 검출기, 형광 검출기 및 질량 분석계이다.
미리 정해진 시간에, 예를 들어, RPLC 가 프리 프로그램된 조건들 하에 실행될 때 분석물들이 용출되고 관심 분석물들을 위한 보유 시간이 미리 정해진 시스템에서 검출기는 선택적일 수도 있다.
도면들을 참조하면, 도 2a 는 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 과 접속된 예시적 제 1 분리 유닛 (20) 의 모식도를 도시한다. 제 1 분리 유닛 (20) 은 화살표 (110) 에 의해 나타낸 방향으로 제 1 분리 유닛을 통하여 제 1 이동상을 구동하기 위한 제 1 펌프 (100) 를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 제 1 이동상은 단 하나의 용매로 이루어질 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 제 1 이동상은 복수의 혼합 용매들로 이루어질 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 펌프 (100) 가 제 1 이동상으로서 혼합 용매를 수용하도록 제 1 이동상의 용매들의 혼합이 펌프 (100) 의 상류에서 제공될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 제 1 이동상은 용기 (120) 에 저장된다. 일부 실시형태들에서, 펌프 (100) 는 복수의 개별 펌핑 유닛들로 이루어질 수도 있고, 펌프 (100) 의 하류에서 혼합이 발생하도록 복수의 펌핑 유닛들은 각각 다른 용매 또는 용매들의 혼합물을 수용하고 펌핑한다. 일부 실시형태들에서, 제 1 이동상은 하나 이상의 첨가제들을 추가로 포함할 수도 있다. RPLC 이동상에서 사용된 첨가제들의 비제한적인 실시예들은 인산, 포스페이트 완충제들, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 포름산, 수산화암모늄, 아세트산 암모늄, 아세트산 나트륨, 알킬 술폰산 등을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 제 1 이동상의 조성은 시간이 경과함에 따라 일정하게 유지될 수도 있다 (등용매 모드로 실행). 일부 실시형태들에서, 제 1 이동상의 조성은 시간이 경과함에 따라 달라질 수도 있다 (구배 모드로 실행). 구배 모드에서 작동은 전형적으로 2 개의 펌프들, 이동상에서 보다 극성인 용매 (예컨대, 물) 를 구동하기 위한 펌프; 덜 극성인 용매 (예컨대, 아세토니트릴 또는 메탄올) 를 구동하기 위한 펌프를 요구한다. 등용매 모드의 작동은 일정한 비로 2 개의 용매들을 전달하는 2 개의 펌프들을 구비한 시스템, 또는 예비 혼합 이동상을 구동하는 1 개의 펌프를 구비한 시스템을 이용할 수도 있다.
더욱이, 도 2a 의 모식도는 펌프 (100) 와 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 칼럼 (150) 사이에 위치한 샘플 인젝터 (130) 를 도시한다. 샘플 인젝터 (130) 는 화살표 (140) 에 의해 나타낸 방향으로 제 1 분리 유닛으로 샘플을 도입한다. 일부 실시형태들에서, 샘플 인젝터 (130) 는 제 1 분리 유닛에 샘플을 부가하도록 제공된다. 일부 실시형태들에서, 샘플 인젝터 (130) 는 샘플을 제 1 분리 유닛에 도입하기 위해 밸브 및 샘플 루프를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 샘플 인젝터 (130) 는 자동 샘플러를 포함할 수도 있다.
도 2a 의 모식도에 도시된 대로, RPLC 칼럼 (150) 은 샘플 인젝터 (130) 의 하류에 위치한다. RPLC 칼럼 (150) 은 역상 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, RPLC 칼럼 (150) 은 탄소 사슬 결합된 실리카 겔을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 18 개의 탄소가 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C18-역상 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 8 개의 탄소가 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C8-역상 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 4 개의 탄소가 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C4-역상 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 역상 정지상은 유기 폴리머 (예컨대, 폴리스티렌) 와 같은 폴리머 코어에 결합된 탄화수소 사슬을 포함할 수도 있다.
일부 실시형태들에서, RPLC 칼럼 (150) 의 온도는 선택된 온도로 유지될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, RPLC 칼럼 (150) 의 온도는 약 10 ℃ ~ 약 50 ℃ 의 범위에서 유지될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, RPLC 칼럼 (150) 의 온도는 약 40 ℃ 에서 유지될 수도 있다.
선택적으로 제 1 분리 유닛 (20) 의 RPLC 칼럼 (150) 과 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 사이에 위치하는 것은 제 1 검출기 (160) 이다 (도 2a). 제 1 검출기는 RPLC 칼럼 (150) 으로부터 용출된 샘플의 적어도 일부의 존재를 측정한다. 일부 실시형태들에서, 제 1 검출기 (150) 는 광 검출기이다. 일부 실시형태들에서, 제 1 검출기 (150) 는 분광 측광 검출기이다. 일부 실시형태들에서, 제 1 검출기 (150) 는 다음, 자외선 분광 광도계, 자외선-가시광선 분광 광도계 검출기 및 형광 검출기 중 하나 이상으로부터 선택된다.
2D RPLC x SFC 크로마토그래피 시스템의 제 2 분리 유닛은 제 2 분리 유닛을 통하여 제 2 이동상을 구동하기 위한 제 2 펌프 조립체, 및 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 칼럼을 포함한다. SFC 를 위한 이동상은 초임계 유체 (예컨대, 초임계 이산화탄소) 및 개질제 또는 조용매 (예컨대, 메탄올, 에탄올, 및 이소프로필 알콜), 선택적으로 하나 이상의 첨가제들 (예컨대, 수산화암모늄) 을 포함한다. 제 2 펌프 조립체는 초임계 유체 이동상을 구동하기 위한 하나 이상의 펌프들을 포함한다. SFC 에 적합한 임의의 정지상은 SFC 칼럼에 사용될 수도 있다. 정지상 재료의 선택은 2 차원을 위한 분리 기준에 의존할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, SFC 칼럼은 실리카 겔과 같은 순상 정지상을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 크로마토그래피 시스템은 SFC 칼럼으로부터 용출된 분석물들의 존재를 검출하기 위해 SFC 칼럼의 하류에 위치결정된 검출기를 추가로 포함한다. UV 검출기, 포토다이오드 어레이 검출기, 대전 에어로졸 검출기, 형광 검출기, 및 질량 분석계 (MS) 와 같은 SFC 에 적합한 임의의 검출기들이 사용될 수도 있다.
도면들을 참조하면, 도 2b 는 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 과 접속된, 상류 서브유닛 (40A) 및 하류 서브유닛 (40B) 을 포함하는, 예시적 제 2 분리 유닛의 모식도를 도시한다. 제 2 분리 유닛의 상류 서브유닛 (40A) 은 화살표 (210) 에 의해 나타낸 방향으로 제 2 분리 유닛 (40A, 40B) 을 통하여 제 2 이동상을 구동하기 위한 제 2 펌프 (200) 를 포함한다. 제 2 분리 유닛의 하류 서브유닛 (40B) 은 SFC 칼럼 (240), 선택적으로 포커스 칼럼 (260) 및/또는 검출기 (250) 를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 제 2 이동상은 단 하나의 용매로만 이루어질 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 제 2 이동상은 복수의 혼합 용매들로 이루어질 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 펌프 (200) 가 제 2 이동상으로서 혼합 용매들을 수용하도록 펌프 (200) 의 상류에서 제 2 이동상의 용매들의 혼합이 제공될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 제 2 이동상은 용기 (220) 에 저장된다. 일부 실시형태들에서, 펌프 (200) 는 복수의 개별 펌핑 유닛들로 이루어질 수도 있고, 펌프 (200) 의 하류에서 혼합이 발생하도록 복수의 펌핑 유닛들 각각은 다른 용매 또는 용매들의 혼합물을 수용 및 펌핑한다.
일부 실시형태들에서, 제 2 이동상의 조성은 시간이 경과함에 따라 일정하게 유지될 수도 있다 (등용매 모드로 실행). 일부 실시형태들에서, 제 2 이동상의 조성은 시간이 경과함에 따라 달라질 수도 있다 (구배 모드로 실행). 초임계 유체 크로마토그래피에 적합한 펌프들은 본 기술분야에 잘 알려져 있지만, 일부 실시형태들에서, 펌프는 왕복 펌프, 용적형 펌프, 공압 펌프, 및/또는 상기 펌프들 중 적어도 하나의 임의의 조합체일 수도 있다.
도 2b 에 도시된 대로, 제 2 분리 유닛의 상류 서브유닛 (40A) 은 펌프 (200) 의 하류에서 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 과 접속된다. 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 의 하류에서 제 2 분리 유닛의 하류 서브유닛 (40B) 을 통한 제 2 이동상의 방향성 유동은 화살표 (230) 에 의해 나타나 있다. SFC 칼럼 (240) 은 순상 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 순상 정지상은 실리카이다. 일부 실시형태들에서, 순상 정지상은 시아노프로필 관능기들로 개질된 실리카이다. 일부 실시형태들에서, 순상 정지상은 아미노프로필 관능기들로 개질된 실리카이다. 일부 실시형태들에서, 순상 정지상은 에틸 피리딘 관능기들로 개질된 실리카이다. 일부 실시형태들에서, 순상 정지상은 술폰산 및/또는 페닐 관능기들로 개질된 실리카이다. 일부 실시형태들에서, 순상 정지상은 1,2-디하이드록시프로필 프로필 에테르 관능기들로 개질된 실리카이다. 일부 실시형태들에서, 순상 정지상은, 관능기 (예컨대, 시아노프로필, 아미노프로필, 에틸 피리딘, 술폰산, 페닐, 또는 1,2-디하이드록시프로필 프로필 에테르 관능기) 로 개질된, 유기 폴리머 (예컨대, 폴리스티렌) 와 같은, 폴리머이다. SFC 를 위한 정지상에서 사용하기에 적합한 재료들의 다른 예들은 실리카, 에틸 피리딘, 시아노, 에픽 디올, 피리딜 아미드, 니트로 등을 포함한다.
일부 실시형태들에서, SFC 칼럼 (240) 의 온도는 선택된 온도에서 유지될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, SFC 칼럼 (240) 의 온도는 약 35 ℃ ~ 약 45 ℃ 의 범위에서 유지될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, SFC 칼럼 (240) 의 온도는 약 40 ℃ 에서 유지될 수도 있다.
도 2b 를 참조하면, 일부 실시형태들에서, 선택적 포커스 칼럼 (260) 은 SFC 칼럼 (240) 의 상류에 위치한다. 포커스 칼럼 (260) 은 정지상을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 정지상은 역상 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 역상 정지상은 탄소 사슬 결합된 실리카 겔을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 18 개의 탄소가 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C18-역상 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 8 개의 탄소가 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C8-역상 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 4 개의 탄소가 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C4-역상 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 역상 정지상은 유기 폴리머 (예컨대, 폴리스티렌) 와 같은 폴리머 코어에 결합된 탄소 사슬 (예로, C-18, C-8 또는 C-4 사슬) 을 포함할 수도 있다. 일반적으로, 포커스 칼럼은 일차 차원에 사용된 역상 및/또는 인터페이스에 사용된 트래핑 칼럼과 부합할 것이다.
일부 실시형태들에서, 포커스 칼럼 (260) 의 온도는 선택된 온도로 유지될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 포커스 칼럼은 SFC 칼럼과 동일한 온도로 유지될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 포커스 칼럼 (260) 의 온도는 약 35 ℃ ~ 약 45 ℃ 로 유지될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 포커스 칼럼 (260) 의 온도는 약 40 ℃ 로 유지될 수도 있다.
SFC 칼럼 (240) 의 하류에 위치하는 것은 제 2 검출기 (250) 이다 (도 2b). 검출기는 SFC 칼럼 (240) 으로부터 용출된 분석물들의 존재 및 양을 측정한다. 일부 실시형태들에서, 제 2 검출기 (250) 는 광 검출기이다. 일부 실시형태들에서, 제 2 검출기 (250) 는 분광 측광 검출기이다. 일부 실시형태들에서, 제 2 검출기 (250) 는 다음, 차등 굴절계, 자외선 분광 광도계, 자외선-가시광선 분광 광도계 검출기, 형광 검출기, 및 적외선 분광 광도계 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시형태들에서, 제 2 검출기 (250) 는 질량 분석계이다. 일부 실시형태들에서, 질량 분석계는 다음, 섹터 계기, 사중극자 질량 필터 계기, 비행 시간 계기, 이온 트랩 계기, 사중극자 이온 트랩 계기, 선형 사중극자 이온 트랩 계기, 오비트랩 계기, 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 계기, 및 열거된 계기 유형들의 임의의 조합체 또는 하이브리드 중 하나 이상으로부터 선택될 수도 있다. 본 기술분야에 잘 알려진 대로, 샘플은 이온화 기술을 통하여, 예로, 비제한적으로, 고속 원자 충격, 화학적 이온화, 대기압 화학적 이온화, 전기 분무 이온화, 및 나노-전기 분무 이온화를 통하여 질량 분석계로 도입된다. 일부 실시형태들에서, 샘플은 대기압 화학적 이온화 또는 전기 분무 이온화를 통하여 질량 분석계로 도입된다.
일부 실시형태들에서, 제 2 분리 유닛 (40B) 의 하류 부분은 제자리에서, 뒤에, 또는 제 2 검출기와 평행하게 분획물 컬렉터를 추가로 포함할 수도 있다.
선택적으로, 일부 실시형태들에서, 제어 기기 (80) 는 다음, 펌프 (100 및/또는 200), 샘플 인젝터 (130), 제 1 검출기 (160), 제 1 유체 라우팅 유닛 (30), 및 제 2 검출기 (250) 중 적어도 하나에 작동가능하게 연결된다.
2D 크로마토그래피 시스템에서 2 개의 차원들 사이 인터페이스는 추가 분리를 위해 제 1 차원으로부터 제 2 차원으로 분리 및 용출된 분석물들의 라우팅을 제어하고 작동 모드를 결정한다. 본 발명의 2D 크로마토그래피 시스템은 먼저 RPLC 에 의해 제 1 분리 유닛에서 샘플을 분리하고 추후에 SFC 에 의한 추가 분리를 위해 RPLC 칼럼으로부터 제 2 분리 유닛으로 용출된 샘플의 적어도 일부를 도입하도록 구성된다.
제 1 유체 라우팅 유닛은 복수의 샘플 루프들을 포함하고, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛은 제 1 분리 유닛 및 제 2 분리 유닛에 연결되고, 복수의 샘플 루프들 중 적어도 하나는 트래핑 칼럼을 포함하고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함한다. 트래핑 칼럼들에서 정지상 재료는 RPLC 칼럼에서 사용된 정지상 재료와 동일할 수도 있고 또는 RPLC 칼럼에서 사용된 정지상 재료와 상이할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 트래핑 칼럼에서 사용된 정지상은 역상 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 역상 정지상은 탄소 사슬 결합된 실리카 겔을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 18 개의 탄소가 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C18-역상 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 8 개의 탄소가 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C8-역상 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 4 개의 탄소가 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C4-역상 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 역상 정지상은 유기 폴리머 (예컨대, 폴리스티렌) 와 같은 폴리머 코어에 결합된 탄소 사슬 (예로, C-18, C-8 또는 C-4 사슬) 을 포함할 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 제 1 유체 라우팅 유닛은, 복수의 포트들, 액체가 포트들 사이에서 유동할 수 있도록 허용하는 채널들, 및 포트들에 연결된 샘플 루프들을 구비한 라우팅 기구 (예로, 스위치 밸브) 를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 라우팅 기구는 2-위치/8-포트 스위칭 밸브이다. 일부 실시형태들에서, 라우팅 기구는 2-위치/10-포트 스위칭 밸브이다. 일부 실시형태들에서, 라우팅 기구는 2-위치/4-포트 듀오 밸브이다. 일부 실시형태들에서, 라우팅 기구는 2-위치 8-포트 또는 10-포트 스위칭 밸브이다.
일부 실시형태들에서, 2D RPLC x SFC 시스템의 제 1 유체 라우팅 유닛은 2 개의 샘플 루프들을 포함하고; 2 개의 샘플 루프들 중 하나는 제 1 분리 유닛과 유체 연통하고 2 개의 샘플 루프들 중 다른 하나는 제 2 분리 유닛과 유체 연통한다. 일부 실시형태들에서, 2 개의 샘플 루프들 중 하나는 정지상을 갖는 트래핑 칼럼을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 양 샘플 루프들 각각은 정지상을 갖는 트래핑 칼럼을 포함한다.
도 3a 는 제 1 분리 유닛 (20) 및 제 2 분리 유닛 (40A, 40B) 과 접속된 예시적 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 의 모식도를 도시한다. 이 경우에, 인터페이스 유체 라우팅 유닛은 라우팅 기구 (300) 를 포함하고, 이것은 일 변형예에서 복수의 포트들 (305A ~ 305H), 복수의 채널들 (310A ~ 310D), 및 2 개의 샘플 루프들 (315, 320) 을 포함하는 2-위치/8-포트 스위칭 밸브이다. 도 3a 에 도시된 대로, 복수의 채널들 (310A ~ 310D) 은 2 가지 가능한 구성들 중 첫 번째 구성으로 나타나 있다.
도 3a 에 예시된 대로, 제 1 분리 유닛 (20) 은 포트 (305A) 에서 라우팅 기구 (300) 에 연결된다. 제 1 이동상은 화살표 (325) 에 의해 나타낸 방향으로 제 1 분리 유닛 (20) 을 통하여 구동되고 라우팅 기구 (300) 는 채널 (310A) 을 통해 샘플 루프 (315) 로 제 1 이동상을 향하게 한다. 샘플 루프 (315) 는 포트 (305B) 및 포트 (305F) 에서 라우팅 기구 (300) 에 연결된다. 샘플 루프 (315) 는 트래핑 칼럼 (330) 을 포함하고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함한다.
라우팅 기구 (300) 는 채널 (310C) 을 통하여 화살표 (345) 에 의해 나타낸 방향으로 하류 용기 (340) 로 제 1 이동상을 향하게 한다. 일부 실시형태들에서, 하류 용기 (340) 는 폐기물 용기이다. 일부 실시형태들에서, 하류 용기 (340) 는 분획물 컬렉터이다.
도 3a 에 도시된 대로, 제 2 분리 유닛의 상류 서브유닛 (40A) 은 포트 (305G) 에서 라우팅 기구 (300) 에 연결된다. 제 2 이동상은 화살표 (350) 에 의해 나타낸 방향으로 제 2 분리 유닛 (40A) 을 통하여 구동되고 라우팅 기구 (300) 는 채널 (310D) 을 통하여 샘플 루프 (320) 로 제 2 이동상을 향하게 한다. 샘플 루프 (320) 는 포트 (305H) 및 포트 (305D) 에서 라우팅 기구 (300) 에 연결되고, 제 1 이동상은 화살표 (355) 에 의해 나타낸 방향으로 이동한다. 라우팅 기구 (300) 는 포트 (305C) 를 통하여 제 2 분리 유닛의 하류 서브유닛 (40B) 에 연결된다. 라우팅 기구 (300) 는 화살표 (360) 에 의해 나타낸 방향으로 제 2 분리 유닛의 하류 서브유닛 (40B) 을 통하여 제 2 이동상을 향하게 한다.
도 3a 에서 라우팅 기구 (300) 의 복수의 채널들 (310A ~ 310D) 이 이제 2 가지 가능한 위치들 중 두 번째 위치에 있고, 즉, 도 3b 에 도시된 대로 채널들 (310E ~ 310H) 이라는 점을 제외하고는 도 3b 에 도시된 모식도는 도 3a 에 도시된 바와 같은 제 1 유체 라우팅 유닛의 동일한 구성을 보여준다. 도 3b 에서 라우팅 기구는, 제 1 분리 유닛 (20) 으로부터, 화살표 (325) 에 의해 나타낸 방향으로, 채널 (310H) 을 통하여 샘플 루프 (320) 까지 제 1 이동상을 향하게 한다. 샘플 루프 (320) 는 포트 (305H) 및 포트 (305D) 에서 라우팅 기구 (300) 에 연결되고 제 1 이동상은 채널 (310F) 을 통하여 화살표 (345) 에 의해 나타낸 방향으로 하류 용기 (340) 로 향하게 된다.
도 3b 에 도시된 대로, 제 2 분리 유닛의 상류 서브유닛 (40A) 은 포트 (305G) 에서 라우팅 기구 (300) 에 연결된다. 제 2 이동상은 화살표 (350) 에 의해 나타낸 방향으로 제 2 분리 유닛 (40A) 을 통하여 구동되고 라우팅 기구 (300) 는 이제 채널 (310G) 을 통하여 제 2 이동상을 샘플 루프 (315) 로 향하게 한다. 샘플 루프 (315) 는 포트 (305B) 및 포트 (305F) 에서 라우팅 기구에 연결된다. 라우팅 기구 (300) 는 화살표 (365) 에 의해 나타낸 방향으로 트래핑 칼럼 (330) 을 통하여 제 2 이동상의 유동을 향하게 한다. 도 3a 와 비교했을 때, 도 3b 에 도시된 대로 라우팅 기구 (300) 는 도 3a 에 도시된 동일한 샘플 루프 (315) 를 통한 제 1 이동상의 유동과 반대 방향으로 샘플 루프 (315) 를 통하여 제 2 이동상의 유동을 향하게 한다. 라우팅 기구 (300) 의 이런 예시된 구성은 샘플 루프 (315) 를 통한 이동상들의 유동을 향하게 하는데, 이것은 본 기술분야에서 "역류" 방식으로 알려져 있다.
도 3c 및 도 3d 에 도시된 대로, 트래핑 칼럼 (370) 이 샘플 루프 (320) 에 위치하는 것을 제외하고, 도 3c 및 도 3d 에 도시된 예시적 모식도들은 도 3a 및 도 3b 에 나타낸 제 1 유체 라우팅 유닛의 유사한 구성을 도시한다. 라우팅 기구 (300) 는 화살표 (355) 에 의해 나타낸 방향으로 트래핑 칼럼 (370) 을 포함하는 샘플 루프 (320) 를 통하여 제 1 이동상의 유동을 향하게 한다 (도 3c). 도 3d 에서, 라우팅 기구 (300) 의 복수의 채널들 (310A ~ 310D) 은 2 가지 가능한 위치들 중 두 번째 위치에 있다. 라우팅 기구 (300) 는, 화살표들 (355, 360) 에 의해 나타낸 방향으로, 트래핑 칼럼 (370) 을 포함하는 샘플 루프 (320) 를 통하여 그리고 제 2 분리 유닛 (40B) 의 하류 부분을 통하여 제 2 분리 유닛의 상류 서브유닛 (40A) 으로부터 제 2 이동상을 향하게 한다. 도 3c 및 도 3d 에 예시된 대로, 제 1 이동상 및 제 2 이동상의 유동은 동일한 방향으로 트래핑 칼럼 (370) 을 통하여 이동하고, 이것은 본 기술분야에서 "병류" 방식으로 알려져 있다.
인터페이스 유체 라우팅 유닛에서 2-위치/8-포트 스위칭 밸브 (300) 를 사용한 시스템의 경우에, 병류/역류 구성들은 샘플 루프 (315 또는 320) 에 트래핑 칼럼 (370) 을 배치함으로써 제어될 수 있다. 대안적으로, 병류/역류 구성들은 인터페이스 유체 라우팅 유닛에 제 2 분리 유닛의 상류 서브유닛 (40A) 및 하류 서브유닛 (40B) 을 위한 연결 포트를 전환함으로써 변경될 수 있다.
도 4a 는 제 1 분리 유닛 (20) 및 제 2 분리 유닛 (40A, 40B) 과 접속된 예시적 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 의 모식도를 도시한다. 이 경우에, 인터페이스 유체 라우팅 유닛은, 일 변형예에서, 복수의 포트들 (405A ~ 405J), 복수의 채널들 (410A ~ 410E), 및 2 개의 샘플 루프들 (415, 420) 을 포함하는 2-위치/10-포트 스위칭 밸브인 라우팅 기구 (400) 를 포함한다. 도 4a 에 도시된 대로, 복수의 채널들 (410A ~ 410E) 은 2 가지 가능한 구성들 중 첫 번째 구성으로 나타나 있다.
도 4a 에 예시된 대로, 제 1 분리 유닛 (20) 은 포트 (405A) 에서 라우팅 기구 (400) 에 연결된다. 라우팅 기구 (400) 는 화살표 (425) 에 의해 나타낸 방향으로 채널 (410A) 을 통하여 복수의 샘플 루프들 (415) 중 하나로 제 1 이동상을 향하게 한다. 샘플 루프 (415) 는 포트 (405B) 및 포트 (405E) 에서 라우팅 기구 (400) 에 연결된다. 샘플 루프 (415) 는 트래핑 칼럼 (430) 을 포함하고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함한다.
라우팅 기구 (400) 는 채널 (410C) 을 통하여 하류 용기 (440) 로 제 1 이동상을 향하게 한다. 일부 실시형태들에서, 하류 용기 (440) 는 폐기물 용기이다. 일부 실시형태들에서, 하류 용기 (440) 는 분획물 컬렉터이다.
도 4a 에 도시된 대로, 제 2 분리 유닛 (40) 은 포트 (405C) 에서 라우팅 기구 (400) 에 연결된다. 라우팅 기구 (400) 는 2 개의 연결된 채널들 (410D, 410E) 을 통하여 샘플 루프 (420) 로 제 2 이동상을 향하게 한다. 샘플 루프 (420) 는 포트 (405J) 및 포트 (405G) 에서 라우팅 기구 (400) 에 연결된다. 라우팅 기구 (400) 는 포트 (405H) 를 통하여 제 2 분리 유닛의 하류 서브유닛 (40B) 에 연결된다. 라우팅 기구 (400) 는 화살표 (435) 에 의해 나타낸 방향으로 제 2 유체 라우팅 유닛 (40B) 의 하류 부분을 통하여 제 2 이동상을 향하게 한다.
도 4a 에서 라우팅 기구 (400) 의 복수의 채널들 (410A ~ 410E) 이 이제 2 가지 가능한 위치들 중 두 번째 위치에 있고, 즉, 도 4b 에 도시된 대로, 채널들 (410F ~ 410J) 인 것을 제외하고, 도 4b 에 도시된 모식도는 도 4a 에 도시된 바와 같은 제 1 유체 라우팅 유닛의 동일한 구성을 나타낸다. 도 4a 및 도 4b 에 도시된 대로, 샘플 루프 (415) 를 통한 제 1 이동상의 유동 방향 (도 4a) 이 동일한 샘플 루프 (415) 를 통한 제 2 이동상의 유동 (도 4b) 과, 화살표 (425) 에 의해 나타낸 대로, 동일한 방향이도록 제 1 분리 유닛 (30) 의 라우팅 기구 (400) 가 구성될 수도 있다. 라우팅 기구 (400) 의 이런 예시된 구성은 샘플 루프 (415) 를 통한 이동상들의 유동을 병류 방식으로 향하게 한다.
인터페이스 유체 라우팅 유닛에서 2-위치/10-포트 스위칭 밸브 (400) 를 사용한 시스템의 경우에, 양 샘플 루프들은 도 4a 및 도 4b 에 도시된 대로 병류 방식으로 구성된다. 하지만, 양 샘플 루프들은 인터페이스 유체 라우팅 유닛에 제 2 분리 유닛의 상류 서브유닛 (40A) 및 하류 서브유닛 (40B) 을 위한 연결 포트를 전환함으로써 역류 방식으로 구성될 수 있다.
도 5a 는 제 1 분리 유닛 (20) 및 제 2 분리 유닛 (40A, 40B) 과 접속된 예시적 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 의 모식도를 도시한다. 이 경우에, 인터페이스 유체 라우팅 유닛은, 일 변형예에서, 복수의 포트들 (505A ~ 505H), 복수의 채널들 (510A ~ 510D), 및 2 개의 샘플 루프들 (515, 520) 을 포함하는 2-위치/4-포트 듀오 밸브인 라우팅 기구 (500) 를 포함한다. 도 5a 에 도시된 대로, 2 가지 가능한 구성들 중 첫 번째 구성으로 복수의 채널들 (510A ~ 510D) 이 도시된다.
도 5a 에서 예시된 대로, 제 1 분리 유닛 (20) 은 포트 (505G) 에서 라우팅 기구 (500) 에 연결된다. 제 1 이동상은 화살표 (525) 에 의해 나타낸 방향으로 제 1 분리 유닛 (20) 을 통하여 구동되고 라우팅 기구 (500) 는 채널 (510A) 을 경유해 샘플 루프 (520) 를 통하여 제 1 이동상을 향하게 한다. 샘플 루프 (520) 는 포트 (505H) 및 포트 (505B) 에서 라우팅 기구 (500) 에 연결된다. 라우팅 기구 (500) 는 화살표 (535) 에 의해 나타낸 방향으로 샘플 루프 (520) 를 통하여 제 1 이동상을 향하게 한다. 샘플 루프 (520) 는 트래핑 칼럼 (530) 을 포함하고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함한다.
라우팅 기구 (500) 는, 채널 (510B) 을 경유해, 화살표 (545) 에 의해 나타낸 방향으로 하류 용기 (540) 로 제 1 이동상을 향하게 한다. 일부 실시형태들에서, 하류 용기 (540) 는 폐기물 용기이다. 일부 실시형태들에서, 하류 용기 (540) 는 분획물 컬렉터이다.
도 5a 에 도시된 대로, 제 2 분리 유닛의 상류 서브유닛 (40A) 은 포트 (505E) 에서 라우팅 기구 (500) 에 연결된다. 제 2 이동상은 화살표 (550) 에 의해 나타낸 방향으로 제 2 분리 유닛 (40A) 을 통하여 구동되고 라우팅 기구 (500) 는 채널 (510C) 을 경유해 샘플 루프 (515) 로 제 2 이동상을 향하게 한다. 샘플 루프 (515) 는 포트 (505F) 및 포트 (505C) 에서 라우팅 기구 (500) 에 연결되고, 제 1 이동상은 화살표 (555) 에 의해 나타낸 방향으로 이동한다. 샘플 루프 (515) 는 트래핑 칼럼 (560) 을 포함하고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함한다. 라우팅 기구 (500) 는 포트 (505D) 를 통하여 제 2 분리 유닛의 하류 서브유닛 (40B) 에 연결된다. 라우팅 기구 (500) 는 화살표 (565) 에 의해 나타낸 방향으로 제 2 분리 유닛의 하류 서브유닛 (40B) 을 통하여 제 2 이동상을 향하게 한다.
일부 실시형태들에서, 트래핑 칼럼들 (530, 560) 은 동일한 정지상을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 정지상은 역상 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 트래핑 칼럼들 (530, 560) 은 다른 정지상을 포함한다.
도 5a 에서 라우팅 기구 (500) 의 복수의 채널들 (510A ~ 510D) 이 이제 2 가지 가능한 위치들 중 두 번째 위치에 있고, 즉, 도 5b 에 도시된 대로 채널들 (510E ~ 510G) 인 것을 제외하고는, 도 5b 에 도시된 모식도는 도 5a 에 나타낸 바와 같은 제 1 유체 라우팅 유닛의 동일한 구성을 도시한다. 도 5b 의 라우팅 기구 (500) 는 이제 제 1 분리 유닛 (20) 으로부터, 화살표 (525) 에 의해 나타낸 방향으로, 채널 (510E) 을 통하여 샘플 루프 (515) 로 제 1 이동상을 향하게 한다. 샘플 루프 (515) 는 포트 (505C) 및 포트 (505F) 에서 라우팅 기구 (500) 에 연결되고 제 1 이동상은, 채널 (510F) 을 통하여, 화살표 (545) 에 의해 나타낸 방향으로, 하류 용기 (540) 로 향하게 된다. 도 5b 에서, 라우팅 기구 (500) 는 도 5a 에서 동일한 샘플 루프 (515) 를 통한 제 2 이동상의 방향과 반대 방향으로 샘플 루프 (515) 를 통해 제 1 이동상의 유동을 향하게 한다.
도 5b 에 도시된 대로, 제 2 분리 유닛의 상류 서브유닛 (40A) 은 포트 (505E) 에서 라우팅 기구 (500) 에 연결된다. 제 2 이동상은 화살표 (550) 에 의해 나타낸 방향으로 제 2 분리 유닛 (40A) 을 통하여 구동되고 라우팅 기구 (500) 는 이제 채널 (510G) 을 통하여 샘플 루프 (520) 로 제 2 이동상을 향하게 한다. 샘플 루프 (520) 는 포트 (505B) 및 포트 (505H) 에서 라우팅 기구에 연결된다. 라우팅 기구 (500) 는 화살표 (575) 에 의해 나타낸 방향으로 트래핑 칼럼 (530) 을 통하여 제 2 이동상의 유동을 향하게 한다. 도 5b 에서, 라우팅 기구 (500) 는 도 5a 에서 동일한 샘플 루프 (520) 를 통한 제 1 이동상의 방향과 반대 방향으로 샘플 루프 (520) 를 통한 제 2 이동상의 유동을 향하게 한다.
인터페이스 유체 라우팅 유닛에서 2-위치/4-포트 듀오 밸브 (500) 를 사용한 시스템의 경우에, 양 샘플 루프들은 도 5a 및 도 5b 에 도시된 대로 역류 방식으로 구성된다. 하지만, 바람직하다면, 양 샘플 루프들은 인터페이스 유체 라우팅 유닛에 제 2 분리 유닛의 상류 서브유닛 (40A) 및 하류 서브유닛 (40B) 을 위한 연결 포트를 전환함으로써 병류 방식으로 구성될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 2D RPLC x SFC 시스템의 제 1 유체 라우팅 유닛은 적어도 3 개의 샘플 루프들을 포함하고, 샘플 루프들 중 적어도 하나는 제 1 분리 유닛 및 제 2 분리 유닛으로부터 유동 격리된다. 이러한 시스템에서, 1 개의 샘플 루프는 제 1 분리 유닛과 유체 연통하고, 1 개의 샘플 루프는 제 2 분리 유닛과 유체 연통하고, 하나 이상의 샘플 루프들은 제 1 분리 유닛 및 제 2 분리 유닛으로부터 유동 격리된다. 일부 실시형태들에서, 샘플 루프들 중 적어도 하나는 트래핑 칼럼을 포함하고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 트래핑 칼럼을 포함한 적어도 하나의 샘플 루프는 제 1 분리 유닛 및 제 2 분리 유닛으로부터 유동 격리되고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 제 1 유체 라우팅 유닛은 복수의 트래핑 칼럼들을 포함하고 각각의 칼럼은 샘플 루프에 위치결정된다. 일부 실시형태들에서, 트래핑 칼럼들 각각은 동일한 정지상 재료로 로딩된다. 다른 실시형태들에서, 정지상 재료는 유지되는 특정 분석물들에 적합화될 수도 있어서, 다른 정지상 재료들은 제 1 분리 유닛으로부터 용출된 다른 분획물들에 사용될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 정지상은 역상 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 역상 정지상은 탄소 사슬 결합된 실리카 겔을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 18 개의 탄소가 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C18-역상 실리카 겔 또는 C18 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 8 개의 탄소가 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C8-역상 실리카 겔 또는 C8 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 4 개의 탄소가 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C4-역상 실리카 겔 또는 C4 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 역상 정지상은 유기 폴리머 (예컨대, 폴리스티렌) 와 같은 폴리머 코어에 결합된 탄소 사슬 (예로, C-18, C-8 또는 C-4 탄소 사슬) 을 포함할 수도 있다.
하나 이상의 샘플 루프들이 제 1 분리 유닛 및 제 2 분리 유닛으로부터 유동 격리되게 배치될 수 있는 인터페이스 유체 라우팅 유닛을 포함한 시스템은 "피크 파킹" 특징을 제공한다. 제 1 차원 크로마토그래피로부터 분리 및 용출된 다수의 분획물들이 제 2 차원에서 추가로 분리될 필요가 있을 때, 제 1 분리 유닛으로부터 용출된 분획물들 사이 시간 간격은 제 1 분획물이 제 2 분리 유닛을 통하여 움직이기에 불충분할 수도 있다. 제 2 분리 유닛이 앞의 분획물을 분석하기 위해 사용되는 반면, 제 2 분리 유닛이 다음 분획물을 분석할 준비가 될 때까지 나중의 분획물들 (또는 유분들) 은 부가적 루프들에서 트래핑 칼럼에 수집되고 유동 격리되어 유지될 수 있다 ("파킹됨").
도면들을 참조하면, 도 6a 는 제 1 분리 유닛 (20) 및 제 2 분리 유닛 (40A, 40B) 과 접속된 예시적 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 의 모식도를 도시한다. 이 경우에, 인터페이스 유체 라우팅 유닛은, 일 변형예에서, 복수의 포트들 (605A ~ 605H), 복수의 채널들 (610A ~ 610D), 샘플 루프 (615) 를 구비한 2-위치/4-포트 듀오 밸브인 제 1 라우팅 기구 (600), 및 복수의 포트들, 예를 들어 625A ~ 625E, 복수의 샘플 루프들, 예를 들어, 630A ~ 630C, 복수의 트래핑 칼럼들 (635A ~ 635E), 및 복수의 채널들 (675A, 675B) 을 구비한 제 2 라우팅 기구 (620) 를 포함한다. 샘플 루프 (630B) 는 트래핑 칼럼 없이 바이패스 루프를 제공한다. 도 6a 에 도시된 대로, 제 1 라우팅 기구 (600) 의 복수의 채널들 (610A ~ 610D) 은 2 가지 가능한 구성들 중 첫 번째 구성으로 도시된다.
도 6a 에 예시된 대로, 제 1 분리 유닛 (20) 은 포트 (605G) 에서 라우팅 기구 (600) 에 연결된다. 제 1 이동상은 화살표 (640) 에 의해 나타낸 방향으로 제 1 분리 유닛 (20) 을 통하여 구동되고 라우팅 기구 (600) 는 채널 (610A) 을 경유해 샘플 루프 (615) 를 통하여 제 1 이동상을 향하게 한다. 샘플 루프 (615) 는 포트 (605H) 및 포트 (605B) 에서 제 1 라우팅 기구 (600) 에 연결된다. 제 1 라우팅 기구 (600) 는 화살표 (645) 에 의해 나타낸 방향으로 샘플 루프 (615) 를 통하여 제 1 이동상을 향하게 한다. 도 6a 에 도시된 대로, 라우팅 기구 (600) 는 채널 (610B) 을 경유해, 화살표 (655) 에 의해 나타낸 방향으로, 하류 용기 (650) 로 제 1 이동상을 향하게 한다. 일부 실시형태들에서, 하류 용기 (650) 는 폐기물 용기이다. 일부 실시형태들에서, 하류 용기 (650) 는 분획물 컬렉터이다.
도 6a 에 도시된 대로, 제 2 분리 유닛의 상류 서브유닛 (40A) 은 포트 (605E) 에서 라우팅 기구 (600) 에 연결된다. 제 2 이동상은 화살표 (660) 에 의해 나타낸 방향으로 제 2 분리 유닛의 상류 서브유닛 (40A) 을 통하여 구동된다. 라우팅 기구 (600) 는, 화살표 (665) 에 의해 나타낸 방향으로, 채널 (610C) 을 경유해 제 2 라우팅 기구 (620) 로 제 2 이동상을 향하게 한다. 제 1 라우팅 기구 (600) 및 제 2 라우팅 기구 (620) 는 포트 (605F) 및 포트 (625A) 를 통하여 연결된다.
도 6a 에서, 제 2 라우팅 기구 (620) 는 채널 (675A) 을 통하여 화살표 (670) 에 의해 나타낸 방향으로 샘플 루프 (630B) 를 통해 제 2 이동상을 향하게 하도록 구성된다. 샘플 루프 (630B) 는 포트 (625B) 및 포트 (625E) 를 통하여 제 2 라우팅 기구 (620) 에 연결되고, 상기 포트 (625E) 는 채널 (675B) 을 통하여 포트 (625D) 에 연결된다. 제 2 라우팅 기구 (620) 및 제 1 라우팅 기구 (600) 는 포트 (625F) 및 포트 (605C) 를 통하여 연결된다. 제 2 라우팅 기구 (620) 는 화살표 (680) 에 의해 나타낸 방향으로 다시 제 1 라우팅 기구 (600) 로 제 2 이동상의 유동을 향하게 한다. 제 1 라우팅 기구 (600) 는 화살표 (690) 에 의해 나타낸 방향으로 채널 (610D) 을 경유해 제 2 분리 유닛의 하류 서브유닛 (40B) 을 통한 제 2 이동상의 유동을 향하게 한다.
도 6a 는, 트래핑 칼럼이 제 1 분리 유닛 또는 제 2 분리 유닛 중 어느 하나와 유체 연통하지 않는 구성을 도시한다. 예를 들어, 관심 피크가 1 차원 칼럼에서 나오지 않거나 2 차원 칼럼에서 분석되지 않을 때 시스템은 이 구성으로 설정될 수 있다. 양 분리 유닛들에서 칼럼들이 유휴 상태이거나 칼럼들이 재생/평형화될 때 시스템은 또한 이 구성으로 설정될 수도 있다. 트래핑 칼럼들 (635A ~ 635E) 각각은 제 1 분리 유닛 및 제 2 분리 유닛으로부터 유동 격리된다.
도 6a 에서 제 1 라우팅 기구 (600) 의 복수의 채널들 (610A ~ 610D) 이 이제 2 가지 가능한 위치들 중 두 번째 위치에 있고, 도 6b 에 도시된 대로 610E ~ 610H 인 점을 제외하고, 도 6b 에 도시된 모식도는 도 6a 에 도시된 바와 같은 제 1 유체 라우팅 유닛의 동일한 구성을 도시한다. 도 6b 에서 라우팅 기구 (600) 는 이제 제 1 분리 유닛 (20) 으로부터, 화살표 (640) 에 의해 나타낸 방향으로, 채널 (610E) 을 통하여 제 2 라우팅 기구 (620) 로 제 1 이동상을 향하게 한다. 제 1 라우팅 기구 (600) 및 제 2 라우팅 기구 (620) 는 포트 (605C) 및 포트 (625F) 에서 연결된다. 부가적으로, 도 6b 에서, 제 2 라우팅 기구 (620) 는 이제 화살표 (705) 에 의해 나타낸 방향으로 샘플 루프 (630A) 를 통하여 제 1 이동상의 유동을 향하게 하도록 구성된다. 샘플 루프 (630A) 는 트래핑 칼럼 (635A) 을 포함한다. 샘플 루프 (630A) 는 포트 (625F) 및 포트 (625C) 를 통하여 제 2 라우팅 기구 (620) 에 연결된다. 도 6b 에 도시된 대로, 제 2 라우팅 기구 (620) 및 제 1 라우팅 기구 (600) 는 포트 (625A) 및 포트 (605F) 를 통하여 연결된다. 제 2 라우팅 기구 (620) 는 화살표 (710) 에 의해 나타낸 방향으로 다시 제 1 라우팅 기구 (600) 로 제 1 이동상의 유동을 향하게 한다. 제 1 라우팅 기구 (600) 는, 채널 (610F) 을 통하여, 화살표 (655) 에 의해 나타낸 방향으로, 하류 용기 (650) 로 제 1 이동상을 향하게 한다. 일부 실시형태들에서, 하류 용기 (650) 는 폐기물 용기이다. 일부 실시형태들에서, 하류 용기 (650) 는 분획물 컬렉터이다. 일부 실시형태들에서, Flexcube (Agilent) 가 제 2 라우팅 기구의 일부로서 사용될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 도 6b 에 도시된 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 의 구성은 트래핑 칼럼, 예를 들어, 635A 에서 선택적으로 유지되도록 제 1 분리 유닛으로부터 용출되는 샘플의 일부를 향하게 하는데 사용될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 트래핑 칼럼은 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 정지상은 역상 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 역상 정지상은 탄소 사슬 결합된 실리카 겔 (예컨대, C18 실리카 겔, C8 실리카 겔 및 C4 실리카 겔) 을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 역상 정지상은 유기 폴리머 (예컨대, 폴리스티렌) 와 같은 폴리머 코어에 결합된 탄소 사슬 (예로, C-18, C-8 또는 C-4 탄소 사슬) 을 포함할 수도 있다.
피크가 트래핑 칼럼, 예를 들어, 635A 에서 유지된 후, 라우팅 기구들 (600, 620) 은, 예를 들어 도 6c 에 도시된 대로, 용출 및 유지된 피크의 추가 분석을 허용하는 위치들로 전환되거나 설정될 수 있고; 또는 라우팅 기구들 (600, 620) 은, 도 6d 에 도시된 대로, 트래핑 칼럼 (635A) 에서 유지된 피크의 파킹 및 다른 트래핑 칼럼, 예를 들어, 635B 에서 다른 피크의 수집을 허용하는 위치들로 전환되거나 설정될 수 있다.
도 6c 에 도시된 모식도는 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 의 예시적 구성을 나타내고, 도 6a 에 도시된 대로, 제 1 라우팅 기구 (600) 는 하류 용기 (650) 로 제 1 이동상의 유동을 향하게 하도록 구성된다. 도 6c 에 도시된 대로, 제 1 이동상은 화살표 (640) 에 의해 나타낸 방향으로 제 1 분리 유닛 (20) 을 통하여 구동되고 라우팅 기구 (600) 는 채널 (610A) 을 경유해 샘플 루프 (615) 를 통하여 제 1 이동상을 향하게 한다. 샘플 루프 (615) 는 포트 (605H) 및 포트 (605B) 에서 제 1 라우팅 기구 (600) 에 연결된다. 제 1 라우팅 기구 (600) 는 화살표 (645) 에 의해 나타낸 방향으로 샘플 루프 (615) 를 통하여 제 1 이동상을 향하게 한다. 도 6a 에 도시된 대로, 라우팅 기구 (600) 는 채널 (610B) 을 경유해, 화살표 (655) 에 의해 나타낸 방향으로, 하류 용기 (650) 로 제 1 이동상을 향하게 한다. 일부 실시형태들에서, 하류 용기 (650) 는 폐기물 용기이다. 일부 실시형태들에서, 하류 용기 (650) 는 분획물 컬렉터이다.
도 6c 에서, 제 1 라우팅 기구 (600) 는 화살표 (665) 에 의해 나타낸 방향으로 제 2 유체 라우팅 기구 (620) 로 제 2 이동상의 유동을 향하게 한다. 제 2 라우팅 기구 (620) 는 화살표 (715) 에 의해 나타낸 방향으로 채널 (675D) 을 통하여 샘플 루프 (635A) 로 제 2 이동상을 향하게 하도록 구성된다. 샘플 루프 (635A) 는 포트 (625C) 및 포트 (625F) 를 통하여 제 2 유체 라우팅 기구에 연결된다. 제 2 유체 라우팅 기구 (620) 는 화살표 (680) 에 의해 나타낸 방향으로 채널 (675C) 을 통하여 제 1 유체 라우팅 기구 (600) 로 제 2 이동상의 유동을 향하게 하도록 구성된다. 제 2 유체 라우팅 기구 및 제 1 유체 라우팅 기구는 포트 (625D, 605C) 를 통하여 연결되고 제 2 이동상은 화살표 (690) 에 의해 나타낸 방향으로 채널 (610D) 을 통하여 제 2 분리 유닛의 하류 부분 (40B) 으로 향하게 된다.
도 6d 에서, 제 2 유체 라우팅 기구는 이제 화살표 (720) 에 의해 나타낸 방향으로 샘플 루프 (630C) 로 제 1 이동상의 유동을 향하게 한다는 점을 제외하고, 도 6d 에서 도시된 모식도는 도 6b 에 도시된 바와 같은 제 1 유체 라우팅 기구 (600) 및 제 2 유체 라우팅 기구 (620) 의 동일한 구성을 나타낸다. 샘플 루프 (630C) 는 포트 (625G) 및 포트 (625H) 를 통하여 제 2 유체 라우팅 기구에 연결된다. 채널 (675F) 은 포트 (625A) 와 포트 (625G) 를 연결한다. 채널 (675E) 은 포트 (625D) 와 포트 (625H) 를 연결한다. 도 6b 에 도시된 대로, 샘플 루프 (630C) 는, 본원에서 기술된 바와 같은 정지상과 같은, 정지상을 포함할 수도 있는 트래핑 칼럼 (635B) 을 포함한다.
도 6d 에 예시된 대로, 제 1 분리 유닛으로부터 용출되고 트래핑 칼럼 (635A) 에서 선택적으로 유지된 샘플의 일부는 이제 제 1 분리 유닛 (20) 및 제 2 분리 유닛 (40A, 40B) 양자로부터 이격된다.
일부 실시형태들에서, 도 6a 내지 도 6d 에 도시된 바와 같은, 복수의 트래핑 칼럼들 (635A ~ 635E) 은 동일한 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 정지상은 역상 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 도 6a 내지 도 6d 에 도시된 바와 같은, 복수의 트래핑 칼럼들 (635A ~ 635E) 중 적어도 하나는 제 1 차원 RPLC 칼럼에서 사용된 정지상 재료와 동일한 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 정지상은 역상 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 역상 정지상은 탄소 사슬 결합된 실리카 겔을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 18 개의 탄소들이 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C18-역상 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 8 개의 탄소들이 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C8-역상 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 4 개의 탄소들이 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C4-역상 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 역상 정지상은 유기 폴리머 (예컨대, 폴리스티렌) 와 같은 폴리머 코어에 결합된 탄화수소 사슬 (예컨대, C-18, C-8 또는 C-4 사슬) 을 포함할 수도 있다.
2D 크로마토그래피는 하트 커팅, 유사 포괄 또는 포괄 모드들로 수행될 수 있다. 하트 커팅은 크로마토그램의 선택된 구역의 특성화를 제공하고, 포괄 모드는 전체 크로마토그램의 특성화를 제공한다. 유사 포괄 모드는 크로마토그램의 선택된 구역들의 포괄적 분리를 제공한다. Venkatramani, C.J. 외, J. Sep . Sci. 2014, 22, 프레스가 참조된다. 2D RPLC x SFC 시스템에서 인터페이스, 즉, 제 1 유체 라우팅 유닛은 하트 커팅, 유사 포괄 또는 포괄 모드들 중 임의의 한 가지 이상으로 수행하도록 적합화될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 도 3 내지 도 6 에 도시된 바와 같은 임의의 인터페이스 유체 라우팅 유닛을 가지는 2D RPLC x SFC 시스템은 하트 커팅 모드로 사용될 수도 있다. 도 5a 및 도 5b 에 도시된 대로 2 개의 샘플 루프들 (각각 트래핑 칼럼을 가짐) 을 포함하는 인터페이스 유체 라우팅 유닛을 가지는 시스템은, 제 1 차원에서 이동상의 느린 유속과 결부된 긴 RPLC 칼럼이 제 2 차원 분리에서 1 개의 분획물의 완전 실행을 허용하고 다른 분획물이 제 2 샘플 루프에서 수집된다면 유사 포괄 모드에서 사용될 수도 있다. 제 2 분리 유닛이 이용가능할 때 제 1 차원 분리로부터 다수의 분획물들이 제 2 차원에서 추후 분석을 위해 수집 및 유지될 수 있으므로 도 6a 내지 도 6d 에 도시된 바와 같은 샘플 파킹 특징을 갖는 인터페이스 유체 라우팅 유닛을 포함한 시스템이 포괄 모드 또는 유사 포괄 모드에서 사용될 수 있다.
제 2 차원에서 분리 기준이 분리될 분석물들의 성질에 의존할 수도 있다. 제 1 차원 RPLC 칼럼으로부터 용출된 다양한 분석물들에 최적 분리를 제공하도록 SFC 칼럼에 다른 정지상 재료들이 요구될 수도 있다. 따라서, 본원에 기술된 2D RPLC x SFC 크로마토그래피 시스템이 제공되고, 제 2 분리 유닛은 SFC 칼럼들의 어레이를 포함하고, 어레이에서 SFC 칼럼들은 병렬 구성으로 배열되고; 어레이에서 원하는 (또는 미리 식별된) SFC 칼럼으로 제 2 이동상의 유동을 향하게 하기 위한 제 2 유체 라우팅 유닛을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 제 2 분리 유닛은 SFC 칼럼들의 어레이에서 각각의 SFC 칼럼의 상류에 위치한 포커스 칼럼을 추가로 포함한다. 일부 실시형태들에서, 포커스 칼럼은 정지상을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 정지상은 역상 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 역상 정지상은 탄소 사슬 결합된 실리카 겔을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 18 개의 탄소들이 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C18-역상 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 8 개의 탄소들이 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C8-역상 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 탄소 사슬 결합된 실리카 겔은 길이에 있어서 4 개의 탄소들이 있는 탄소 사슬을 포함할 수도 있다 (즉, C4-역상 실리카 겔). 일부 실시형태들에서, 역상 정지상은 유기 폴리머 (예컨대, 폴리스티렌) 와 같은 폴리머 코어에 결합된 탄화수소 사슬 (예컨대, C-18, C-8 또는 C-4 사슬) 을 포함할 수도 있다.
도면들을 참조하면, 도 7a 및 도 7b 는 제 2 유체 라우팅 유닛 (800) 및 SFC 칼럼들의 어레이를 포함하는 제 2 분리 유닛의 예시적 하류 서브유닛 (40B) 의 모식도들이다. 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 은 포트 (805A) 에서 제 2 유체 라우팅 유닛 (800) 에 연결된다. 제 1 유체 라우팅 유닛 (30) 은 화살표 (810) 에 의해 나타낸 방향으로 제 2 라우팅 유닛 (800) 으로 제 2 이동상을 향하게 한다. 제 2 라우팅 유닛 (800) 은 포트 (805A) 및 포트 (805B) 와 같은 복수의 포트들, 및 채널 (810A) 과 같은 복수의 채널들을 포함한다. 도 7a 에 도시된 대로, 제 2 유체 라우팅 유닛 (800) 은, 화살표 (825) 에 의해 나타낸 방향으로 원하는 (또는 미리 식별된) SFC 칼럼 (815A) 으로 제 2 이동상을 향하게 한다. 선택적으로, 포커스 칼럼 (820A) 은 SFC 칼럼 (815A) 의 상류에 위치한다.
일부 실시형태들에서, 라우팅 기구 (830) 는 선택적으로 SFC 칼럼의 하류에 위치한다. 도 7a 에 도시된 대로, 라우팅 기구 (830) 는 화살표 (835) 에 의해 나타낸 방향으로 채널 (810B) 을 통하여 검출기 (250) 로 제 2 이동상을 향하게 한다.
도 7b 는 도 7a 에 도시된 바와 같은 동일한 SFC 칼럼 어레이를 나타내지만, 도 7b 에서 제 2 유체 라우팅 유닛 (800) 은 제 1 유체 라우팅 유닛으로부터 원하는 제 2 SFC 크로마토그래피 칼럼 (815B) 까지 제 2 이동상을 향하게 하도록 구성된다. 도 7b 에 도시된 대로, 원하는 제 2 SFC 크로마토그래피 칼럼은 포트 (805E) 및 포트 (805F) 를 통하여 제 2 유체 라우팅 유닛 (800) 및 라우팅 기구 (830) 에 연결된다. 제 2 유체 라우팅 유닛 (800) 은 화살표 (840) 에 의해 나타낸 방향으로 제 2 이동상을 향하게 한다. 선택적으로, 포커스 칼럼 (820B) 은 SFC 칼럼 (815B) 의 상류에 위치한다.
일부 실시형태들에서, SFC 칼럼 어레이는 복수의 SFC 칼럼들을 포함하고 815A 와 같은 개별 SFC 칼럼은 815B 와 같은 어레이에서 적어도 하나의 다른 개별 SFC 칼럼과 동일한 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, SFC 칼럼 어레이는 복수의 SFC 칼럼들을 포함하고 815A 와 같은 개별 SFC 칼럼은 815B 와 같은 어레이에서 모든 다른 개별 SFC 칼럼과 상이한 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 정지상은 순상 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 순상 정지상은 실리카이다. 일부 실시형태들에서, 순상 정지상은 프로필시아노 관능기들로 개질된 실리카이다. 일부 실시형태들에서, 순상 정지상은 아미노프로필 관능기들로 개질된 실리카이다. 일부 실시형태들에서, 순상 정지상은 에틸 피리딘 관능기들로 개질된 실리카이다. 일부 실시형태들에서, 순상 정지상은 술폰산 및/또는 페닐 관능기들로 개질된 실리카이다. 일부 실시형태들에서, 순상 정지상은 1,2-디하이드록시프로필 프로필 에테르 관능기들로 개질된 실리카이다. 일부 실시형태들에서, 순상 정지상은 관능기 (예컨대, 시아노프로필, 아미노프로필, 에틸 피리딘, 술폰산, 페닐, 또는 1,2-디하이드록시프로필 프로필 에테르 관능기) 로 개질된, 유기 폴리머 (예컨대, 폴리스티렌) 와 같은, 폴리머이다.
일부 실시형태들에서, SFC 칼럼 어레이는 복수의 포커스 칼럼들을 포함하고 820A 와 같은 개별 포커스 칼럼은 820B 와 같은 어레이에서 적어도 하나의 다른 개별 포커스 칼럼과 동일한 정지상을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, SFC 칼럼 어레이는 복수의 포커스 칼럼들을 포함하고 820A 와 같은 개별 포커스 칼럼은 820B 와 같은 어레이에서 모든 다른 개별 포커스 칼럼과 상이한 정지상을 포함할 수도 있다.
도 8a 및 도 8b 는 전자적으로 제어된, 2-위치/4-포트 듀오 밸브 (V1) 및 트래핑 칼럼 (Trap 1) 을 포함한 인터페이스를 구비한 예시적 2D LC-SFC 시스템의 모식도들을 도시한다. 펌프 (1) 로부터의 이동상은 인젝터를 통하여 역상 일차 칼럼으로 유동한다. 검출 (D1) 후 용리제는 샘플링 밸브 (V1) 로 유동한다. 홈/분석 위치에서, 일차 칼럼 용리제는 샘플링 루프 (Loop 1) 를 통과하여 폐기물로 나간다. SFC 펌프로부터의 이동상은 트래핑 칼럼 (Trap 1) 을 통하여 SFC 칼럼으로 유동한다 (도 8a). 이것은 트래핑 칼럼 (Trap 1) 및 SFC 칼럼을 컨디셔닝한다. 일차 및 이차 칼럼들을 통한 이동상의 비단속 유동이 있다. 관심 성분들이 일차 칼럼으로부터 용출될 때, 밸브 (V1) 는 전환되어서 (트래핑 위치) 일차 칼럼 용리제를 트래핑 칼럼 (Trap 1) 으로 이송한다 (도 8b). 다시 홈/분석 위치로 밸브 (V1) 를 전환하면 트래핑 칼럼 (T1) 으로부터 SFC 칼럼으로 샘플 성분들을 플러싱한다. SFC 칼럼 분리는 UV 검출기 (D2) 및/또는 질량 분석계를 사용해 모니터링된다. 밸브 (V1) 에서 SFC 펌프와 칼럼의 위치들을 교환하면 밸브 전환 중 역류를 유발할 것이다.
이차 차원에서 반복 구배를 포함한 2D 크로마토그래피에서, 이차 칼럼으로 일차 칼럼 용리제를 이송 (샘플링) 하는 빈도는 재평형화 시간을 포함한 이차 칼럼의 분해 속도에 의존한다. 2D LC-SFC 에서, 이차 차원 분리는 약 2 ~ 3 분 동안 지속되어서 이차 칼럼으로 일차 칼럼 용리제를 이송하는 빈도를 제한한다. 다수의 분석물 분획물들 (예컨대, 입체 이성질체들의 혼합물을 포함한 샘플 중 부분 입체 이성질체 쌍들) 이 2 ~ 3 분 내에 일차 칼럼으로부터 용출된다면, 도 8a 및 도 8b 에 도시된 단일 트래핑 칼럼을 구비한 2D LC-SFC 인터페이스는 실용적이지 않을 수도 있다. 이차 칼럼 속도의 샘플링 필요성을 보상하도록 일차 칼럼 유속 및 구배를 느리게 하는 것은 선택 사항이다. 하지만, 이것은 불량한 피크 형상을 유발하여서 동시 아키랄/키랄 분석을 불가능하게 할 것이다. 이것은 이차 칼럼의 샘플링 필요성을 충족하도록 다수의 트래핑 칼럼들을 구비한 인터페이스를 요구할 것이다.
도 9 는 트래핑 칼럼들 및 이차 SFC 칼럼들의 어레이를 사용한 인터페이스를 구비한 예시적 2D LC-SFC 시스템의 모식도를 도시한다. 이 구성은 크로마토그램의 다수의 섹션들을 분석하는데 사용된다. 도 9 에 도시된 홈/분석 위치에서, 검출 후 일차 칼럼으로부터 용리제는 완전 자동화된, 2-위치/4-포트 듀오 밸브 (V1) 를 통과하여 폐기물을 유발한다. SFC 이동상은 다음과 같이 유동한다: 밸브 (V1) 를 통하여, 파킹 데크 밸브 (V2) 로, 다시 밸브 (V1) 로, 그 후 SFC 칼럼(들)으로 SFC 펌프를 유동한다. 밸브 (V2) 에서, SFC 이동상은 바이패스 배관 또는 트래핑 칼럼들의 어레이 중 어느 하나를 통하여 유동한다. 이것은 트래핑 및 SFC 칼럼(들)을 컨디셔닝한다. 일차 및 이차 칼럼들을 통한 이동상의 비단속 유동이 있다. 관심 성분들이 일차 칼럼으로부터 용출될 때, 밸브 (V1) 는 전환되어서 (홈 → 이송) 일차 칼럼 용리제를 파킹 데크 밸브 (V2 Out) 로 이송한다. 바이패스 모드와 트래핑 위치 사이에서 파킹 데크 밸브 (V2) 를 전후로 전환함으로써, 성분들은 다른 트래핑 칼럼들로 이송된다. 일차 칼럼 용리제의 이송 후, 밸브 (V1) 는 홈 위치로 전환되어서 일차 칼럼 용리제를 폐기물로 전환한다. 이것은 밸브 (V2) 로 유입되는 이동상의 유동을 역전시킨다 (V2-Out → V2-In). 파킹 데크 밸브 (V2) 에서 SFC 유동 방향은 역전된다. 추후에, 트래핑 칼럼들에 유지된 성분들은 용도에 따라 추가 분리를 위해 SFC 칼럼 또는 SFC 칼럼들의 어레이로 백 플러싱된다. SFC 칼럼들의 어레이는, 그것이 단일 키랄 정지상에서 상이한 성분들을 분해하기에 실용적이지 않을 수도 있으므로 시스템에 부가적 가요성을 제공한다. 이차 칼럼 분리는 UV 또는 MS 검출기를 사용해 모니터링된다. 자동 인터페이스는 단일 크로마토그래프 실행에서 샘플의 동시 아키랄, 키랄 분석을 가능하게 하는 2D LC-SFC 시스템의 핵심 성분이다.
2D 크로마토그래프 시스템에서, 모든 조합이 개별적으로 설명되는 것처럼, 본원에 기술된 제 1 분리 유닛의 모든 변형예가 본원에 기술된 제 2 분리 유닛의 모든 변형예, 및/또는 본원에 기술된 제 1 유체 라우팅 유닛의 모든 조합체와 조합될 수 있는 것으로 의도되고 이해된다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, 2D 크로마토그래피 시스템이 제공되고, 상기 시스템은:
(ⅰ) 제 1 분리 유닛으로서,
a) 상기 제 1 분리 유닛을 통하여 제 1 이동상을 구동하기 위한 제 1 펌프 조립체,
b) 상기 제 1 분리 유닛에 샘플을 도입하기 위한 샘플 인젝터;
c) 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 칼럼; 및
d) 제 1 검출기를 포함하는, 상기 제 1 분리 유닛;
(ⅱ) 제 2 분리 유닛으로서,
a) 상기 제 2 분리 유닛을 통하여 제 2 이동상을 구동하기 위한 제 2 펌프 조립체,
b) 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 칼럼; 및
c) 제 2 검출기를 포함하는, 상기 제 2 분리 유닛, 및
(ⅲ) 복수의 샘플 루프들을 구비한 제 1 유체 라우팅 유닛으로서, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛은 상기 제 1 분리 유닛 및 상기 제 2 분리 유닛에 연결되고,
상기 복수의 샘플 루프들 중 적어도 하나는 트래핑 칼럼을 포함하고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛을 포함하고,
상기 크로마토그래피 시스템은 먼저 상기 제 1 분리 유닛에서 상기 샘플을 분리하고 추후에 상기 RPLC 칼럼으로부터 용출된 샘플의 적어도 일부를 상기 제 2 분리 유닛에 도입하도록 구성된다.
일부 실시형태들에서, 2D 크로마토그래피 시스템이 제공되고, 상기 시스템은:
(ⅰ) 제 1 분리 유닛으로서,
a) 상기 제 1 분리 유닛을 통하여 제 1 이동상을 구동하기 위한 제 1 펌프 조립체,
b) 상기 제 1 분리 유닛에 샘플을 도입하기 위한 샘플 인젝터;
c) 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 칼럼; 및
d) 제 1 검출기를 포함하는, 상기 제 1 분리 유닛;
(ⅱ) 제 2 분리 유닛으로서,
a) 상기 제 2 분리 유닛을 통하여 제 2 이동상을 구동하기 위한 제 2 펌프 조립체,
b) 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 칼럼; 및
c) 제 2 검출기를 포함하는, 상기 제 2 분리 유닛, 및
(ⅲ) 2 개의 샘플 루프들을 구비한 제 1 유체 라우팅 유닛으로서, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛은 상기 제 1 분리 유닛 및 상기 제 2 분리 유닛에 연결되고,
상기 샘플 루프들 중 하나는 제 1 분리 유닛과 유체 연통하고, 상기 샘플 루프들 중 다른 하나는 제 2 분리 유닛과 유체 연통하고;
상기 샘플 루프들 중 적어도 하나는 트래핑 칼럼을 포함하고, 상기 트래핑 칼럼은 C-18 정지상 (예컨대, C-18 실리카) 을 포함하는, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛; 및
(ⅳ) a) 제 1 펌프 조립체;
b) 샘플 인젝터;
c) 제 1 검출기;
d) 제 1 유체 라우팅 유닛;
e) 제 2 펌프 조립체; 및
f) 제 2 검출기 중 하나 이상에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 제어 기기를 포함하고,
상기 크로마토그래피 시스템은 먼저 상기 제 1 분리 유닛에서 상기 샘플을 분리하고 추후에 상기 RPLC 칼럼으로부터 용출된 샘플의 적어도 일부를 상기 제 2 분리 유닛에 도입하도록 구성된다.
일 변형예에서, 2D 크로마토그래프 시스템은 a) 제 1 펌프 조립체; b) 샘플 인젝터; c) 제 1 검출기; d) 제 1 유체 라우팅 유닛; e) 제 2 펌프 조립체; 및 f) 제 2 검출기 중 하나 이상에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 제어 기기를 추가로 포함한다.
일부 실시형태들에서, 2D 크로마토그래피 시스템이 제공되고, 상기 시스템은:
(ⅰ) 제 1 분리 유닛으로서,
a) 상기 제 1 분리 유닛을 통하여 제 1 이동상을 구동하기 위한 제 1 펌프 조립체,
b) 상기 제 1 분리 유닛에 샘플을 도입하기 위한 샘플 인젝터;
c) C-18 정지상 (예컨대, C-18 실리카) 을 포함하는 RPLC 칼럼; 및
d) 제 1 검출기를 포함하는, 상기 제 1 분리 유닛;
(ⅱ) 제 2 분리 유닛으로서,
a) 상기 제 2 분리 유닛을 통하여 제 2 이동상을 구동하기 위한 제 2 펌프 조립체,
b) 순상 정지상을 포함하는 SFC 칼럼; 및
c) 제 2 검출기를 포함하는, 상기 제 2 분리 유닛, 및
(ⅲ) 적어도 3 개의 샘플 루프들을 구비한 제 1 유체 라우팅 유닛으로서, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛은 상기 제 1 분리 유닛 및 상기 제 2 분리 유닛에 연결되고,
상기 샘플 루프들 중 하나는 제 1 분리 유닛과 유체 연통하고, 상기 샘플 루프들 중 다른 하나는 제 2 분리 유닛과 유체 연통하고, 상기 샘플 루프들 중 적어도 하나는 제 1 분리 유닛 및 제 2 분리 유닛으로부터 유동 격리하고;
상기 샘플 루프들 중 적어도 하나는 트래핑 칼럼을 포함하고, 상기 트래핑 칼럼은 C-18 정지상 (예컨대, C-18 실리카) 을 포함하는, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛; 및
(ⅳ) a) 제 1 펌프 조립체;
b) 샘플 인젝터;
c) 제 1 검출기;
d) 제 1 유체 라우팅 유닛;
e) 제 2 펌프 조립체; 및
f) 제 2 검출기 중 하나 이상에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 제어 기기를 포함하고,
상기 크로마토그래피 시스템은 먼저 상기 제 1 분리 유닛에서 상기 샘플을 분리하고 추후에 상기 RPLC 칼럼으로부터 용출된 샘플의 적어도 일부를 상기 제 2 분리 유닛에 도입하도록 구성된다.
일 변형예에서, 제 2 분리 유닛은 a) SFC 칼럼들의 어레이로서, 상기 어레이에서 SFC 칼럼들은 병렬 구성으로 배열되는, 상기 SFC 칼럼들의 어레이; 및 b) 어레이에서 원하는 (또는 미리 식별된) SFC 칼럼으로 제 2 이동상의 유동을 향하게 하기 위한 제 2 유체 라우팅 유닛을 포함한다. 다른 변형예에서, 제 2 분리 유닛은 SFC 칼럼의 상류에 위치결정된 포커스 칼럼 (예컨대, C-18 정지상 재료 (예컨대, C-18 실리카) 를 포함하는 포커스 칼럼) 을 추가로 포함한다.
일부 실시형태들에서, 2D 크로마토그래프 시스템이 제공되고, 상기 시스템은:
(ⅰ) 제 1 분리 유닛으로서,
a) 상기 제 1 분리 유닛을 통하여 제 1 이동상을 구동하기 위한 제 1 펌프 조립체,
b) 상기 제 1 분리 유닛에 샘플을 도입하기 위한 샘플 인젝터;
c) RPLC 칼럼; 및
d) 제 1 검출기를 포함하는, 상기 제 1 분리 유닛;
(ⅱ) 제 2 분리 유닛으로서,
a) 상기 제 2 분리 유닛을 통하여 제 2 이동상을 구동하기 위한 제 2 펌프 조립체,
b) SFC 칼럼들의 어레이로서, 상기 어레이에서 SFC 칼럼들이 병렬 구성으로 배열되는, 상기 SFC 칼럼들의 어레이;
c) 어레이에서 원하는 (또는 미리 식별된) SFC 칼럼으로 제 2 이동상의 유동을 향하게 하기 위한 제 2 유체 라우팅 유닛; 및
c) 제 2 검출기를 포함하는, 상기 제 2 분리 유닛, 및
(ⅲ) 적어도 3 개의 샘플 루프들을 구비한 제 1 유체 라우팅 유닛으로서, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛은 상기 제 1 분리 유닛 및 상기 제 2 분리 유닛에 연결되고,
상기 샘플 루프들 중 하나는 제 1 분리 유닛과 유체 연통하고, 상기 샘플 루프들 중 다른 하나는 제 2 분리 유닛과 유체 연통하고, 상기 샘플 루프들 중 적어도 하나는 제 1 분리 유닛 및 제 2 분리 유닛으로부터 유동 격리하고;
상기 샘플 루프들 중 적어도 하나가 트래핑 칼럼을 포함하고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛을 포함하고,
상기 크로마토그래피 시스템은 먼저 상기 제 1 분리 유닛에서 상기 샘플을 분리하고 추후에 상기 RPLC 칼럼으로부터 용출된 샘플의 적어도 일부를 상기 제 2 분리 유닛에 도입하도록 구성된다.
일부 변형예들에서, RPLC 칼럼은 C-18 정지상 (예컨대, C-18 실리카) 을 포함한다. 일부 변형예들에서, SFC 칼럼은 순상 실리카 정지상을 포함한다. 일부 변형예들에서, 시스템은:
a) 제 1 펌프 조립체;
b) 샘플 인젝터;
c) 제 1 검출기;
d) 제 1 유체 라우팅 유닛;
e) 제 2 펌프 조립체; 및
f) 제 2 검출기 중 하나 이상에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 제어 기기를 추가로 포함한다.
본 발명의 2D RPLC x SFC 시스템은 트래핑 칼럼을 사용함으로써 제 1 차원 RPLC 및 제 2 차원 SFC 에 사용된 용매들의 비호환성과 연관된 문제점을 해결한다. 트래핑 칼럼에서 정지상은 RPLC 로부터의 용매들을 통과시키면서 분석물들을 유지한다. 이것은 추가 분리를 위해 SFC 로 주입하기 위해 분석물들이 작은 체적으로 농축될 수 있도록 허용한다. SFC 차원에서 보다 높은 물 함량은 보다 낮은 분해능/감도를 유발한다. 트래핑 칼럼이 없는 시스템을 사용한, 실시예 2 에서 보여주는 것처럼, SFC 분석의 분해능 및 감도에 악영향을 미치지 않으면서 단지 적은 분획물만 SFC 칼럼에 이송될 수 있다 (도 11). 12 ㎕ 의 이송 체적은 제 2 피크의 약한 확장을 유발하였다. 24 ㎕ 분획물이 이송되었을 때, 상당한 감도 손실로 바뀌는, 제 2 피크의 상당한 확장이 관찰된다. 그에 반해서, 실시예 3 에 나타난 것처럼, C-18 정지상 재료 (예컨대, C-18 실리카) 를 함유한 트래핑 칼럼을 가지는, 도 8a 및 도 8b 에 도시된 바와 같은 시스템이 사용되었을 때, 160 ㎕ 의 윈도우가 이송되었고, 우수한 분해능 및 감도가 획득되었다 (도 12). 이 시스템은 SFC 분석의 분해능 및 감도에 최소 영향을 가지며 제 1 차원 RPLC 로부터 제 2 차원 SFC 로 피크들의 주입을 허용한다. 예를 들어, 실시예 5 는 종래의 SFC 시스템 및 본 발명의 2D LC-SFC 시스템을 사용해 거울상 이성질체를 갖는 키랄 약물 물질의 분리를 비교한다. 결과는, 종래의 SFC 와 비교해 2D LC-SFC 에서 분해능 및 감도 모두 보존되는 것을 보여주었다. 2 개의 차원에서 직교 접근법, 역상 및 순상 조건들은, 다차원 시스템의 증가하는 (multiplicative) 피크 용량으로 인해 HPLC 피크 순도 평가의 신뢰 레벨을 증가시키는데 사용될 수 있다.
사용 방법들
2D 시스템들을 개발할 때 고려되는 다른 인자는 온라인 모드로 작동할 수 있는 능력이다. 이 접근법의 몇 가지 장점들은 자동화 용이성, 분석 재현성, 및 어떠한 수율 손실이나 오염도 없는 제 1 차원으로부터 제 2 차원으로 분획물들의 정확한 이송을 포함한다.
2D 시스템들의 고려되지 않은 용도는 높은 처리량 분석에 사용하는 것이다. 예를 들어 제약 산업에서, Active Pharmaceutical Ingredients (APIs) 는 ICH 가이드라인들에 대하여 충분히 특징지어야 한다. International Conference on Harmonisation (2006), Q3A(R2): Impurities in New Drug Substances 가 참조된다. 순도 분석을 위해, 2 가지 독립 분석 방법들이 개발된다. RPLC 방법은 통상적으로 아키랄 순도 (불순물 및 관련된 물질 방법), 및 키랄 순도 (원하지 않는 거울상 이성질체의 양) 를 평가할 키랄 방법을 평가한다. 동시 아키랄 및 키랄 결과를 발생시킬 수 있는 2D 시스템은 API 프로세스 개발 중 매우 큰 영향을 미칠 것이다. 샘플 제조, 크로마토그래프 분석 시간, 및 데이터 분석은 보다 높은 처리량 분석을 허용하도록 감소될 것이다.
동시 아키랄-키랄 분석을 위해 2D RPLC x RPLC 분석의 사용을 이전에 보고하였다 (J. Sep . Sci . 2012, 35:1748). 하지만, API 월드에서, 대부분의 키랄 방법들은 NPLC 방법들이고, 따라서 2D RPLC x NPLC 시스템은 동시 아키랄-키랄 분석을 달성하는데 상당한 영향을 가질 것이다. 위에서 언급한 대로, 역상 및 순상 이동상들의 비호환성은 이 접근법을 매우 어렵게 할 것이다. 초임계 유체 크로마토그래피, 순상 기술은 또한 제조 규모 뿐만 아니라 API 키랄 분석에 분석적으로 사용될 수 있었다. "그린" 기술 이외에, SFC 는 그것의 범용성, 보다 높은 효율성, 보다 높은 처리량, 및 보다 빠른 분석 시간으로 인해 NPLC 보다 더 우수하다. 초임계 유체는 보다 높은 유속 및 보다 빠른 재평형화 시간을 허용하도록 낮은 점도와 높은 확산성 (가스와 유사) 을 가지고 높은 용매화 동력을 제공하도록 높은 밀도 (액체와 유사) 를 갖는다. 제 1 온라인 2D LC x SFC 는 1992 년에 Cortes 등에 의해 보고되었다 (J. Microcol . Sep . 1992, 4:239 ~ 244). Cortes 등이 개발한 인터페이스는 다소 복잡하고 다수의 스테이지들: 임팩터 인터페이스로 분석물들을 이송하기 위해서 가압 CO2 를 사용해, 질소 가스를 통과함으로써 제 1 차원 용매를 제거하고, 그 후 CO2 이동상의 압력 프로그래밍에 의해 임팩터 인터페이스로부터 SFC 모세관 칼럼으로 분석물들을 용출하는 것을 포함한다. 종래의 2D RPLC x SFC 분리를 위한 이 인터페이스의 채택은 용매 제거 단계로 인해 제한될 것이다. 대부분의 종래의 RPLC 분리는 수성 기반이지만 Cortes 등은 LC 이동상으로서 THF (비교적 낮은 비등점, 66 ℃) 를 사용하였다.
본 발명은 RPLC 와 SFC 를 결합한 새로운 자동 인터페이스를 보여준다. 따라서, 샘플들, 예를 들어 1D 크로마토그래피 또는 다른 2D 크로마토그래피에 의해 포괄 분석을 달성하기에 어려울 수도 있는 복합 샘플 혼합물들의 분리 및 분석을 위해 본원에서 기술된 2D RPLC x SFC 크로마토그래피 시스템들을 사용한 방법들이 제공된다.
일부 실시형태들에서, 본원에서 기술된 크로마토그래피 시스템을 사용해 샘플 (예로, 복합 샘플) 을 분석하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은: 먼저 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 에 의해 복합 샘플을 분획물들로 분리하고; 또한 2 차원에서 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 에 의해 RPLC 차원으로부터 분획물들을 분리하는 것을 포함한다. 1 차원에서 분리 (예컨대, C-18 정지상에서 RPLC) 는 복합 샘플에서 성분들의 임의의 특징 또는 특성 (예컨대, 소수성) 의 차이에 의존하고; 제 2 차원에서 분리 (예컨대, 순상 실리카 겔 정지상에서 SFC) 는 성분들의 다른 특징 또는 특성 (예컨대, 분자 비대칭성) 의 차이에 의존하여서, 1 차원 크로마토그래피를 사용할 때보다 더 양호한 포괄 분석을 제공한다.
다수의 키랄 중심들을 갖는 화합물들을 위한 키랄 크로마토그래프 방법들을 개발하는 것은, 키랄 중심들의 수 증가로 잠재적 입체 이성질체들의 수가 상당히 증가함에 따라 어려울 수 있다 (입체 이성질체들의 수 = 2N, 여기에서 N 은 화합물에서 키랄 중심들의 수이다). 키랄 방법 개발은, 대부분, 광범위한 칼럼 및 이동상 스크리닝이 잠재적 타격을 식별하기 위해서 수행되는 시행 착오 프로세스이다. 하지만, 3 개 이상의 키랄 중심들을 갖는 화합물들을 위한 키랄 크로마토그래프 방법들을 개발하는 것은, 입체 이성질체들 수의 상당한 증가 때문에, 매우 어려울 수 있다. 다수의 키랄 중심들을 갖는 의약 화합물들에 대해, 한 가지 일반적인 관행은 유입되는 개시 재료들의 거울상 이성질체 순도를 제어하고 프로세스 제어 (에피머화 가능성) 를 보여주는 것이다. 이것은 최종 API 에서 잠재적 입체 이성질체들의 수를 제한할 것이다. 하지만, 이 제어 전략은 API 키랄 방법의 개발을 지시하는 일부 규제 기관들에 의해 도전받을 수 있다.
본 발명의 온라인 2D RPLC x SFC 는 약 샘플들의 동시 아키랄 및 키랄 분석 (단일 샘플 주입에 의한 또는 동일한 분석 실행에서 분석) 을 허용한다. 수성 및 유기물 함량의 혼합물에서, API 피크는 작은 체적의 C-18 트래핑 칼럼에서 유지된 후 제 2 차원 SFC 칼럼으로 백 플러싱될 것이다. 따라서, 일부 실시형태들에서, 본원에 기술된 크로마토그래피 시스템을 사용해 입체 이성질체 성분들의 혼합물을 포함하는 샘플의 아키랄-키랄 분석을 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은, 샘플의 아키랄 순도를 제공하는, 제 1 차원에서 RPLC 에 의한 샘플에서 부분 입체 이성질체 성분들을 분해하고; 샘플에서 성분들의 키랄 순도 (% 거울상 이성질체 초과량) 를 추가로 제공하는, 동일한 분석 실행에서 제 2 차원에서 SFC 에 의한 거울상 이성질체 쌍들을 분해하는 것을 포함한다. 샘플의 아키랄 순도는, 예를 들어, 제 1 분리 유닛의 UV 검출기에서 획득된 크로마토그램에서 피크들의 상대 피크 면적에 의해, RPLC 분리로부터 크로마토그램을 기반으로 결정될 수도 있다. 각각의 거울상 이성질체 쌍의 키랄 순도 또는 거울상 이성질체 초과량은, 예를 들어, 제 2 분리 유닛의 UV 검출기에서 획득된 크로마토그램 또는 제 2 분리 유닛에 부착된 MS 분광계에서 획득된 전체 이온 크로마토그램에서 피크들의 상대 피크 면적에 의해, SFC 분리로부터 크로마토그램을 기반으로 결정될 수도 있다.
모든 조합이 개별적으로 설명되는 것처럼 2D 크로마토그래프 시스템의 모든 실시형태들이 복합 샘플을 분석하기 위한 방법들 또는 동시 아키랄-키랄 분석을 위한 방법들에서 사용될 수 있는 것으로 의도되고 이해된다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, 2D 크로마토그래피 시스템을 사용해 입체 이성질체 성분들의 혼합물을 포함하는 샘플의 동시 아키랄-키랄 분석을 위한 방법이 제공되고, 상기 2D 크로마토그래피 시스템은:
(i) 제 1 분리 유닛으로서,
a) 상기 제 1 분리 유닛을 통하여 제 1 이동상을 구동하기 위한 제 1 펌프 조립체,
b) 상기 제 1 분리 유닛에 샘플을 도입하기 위한 샘플 인젝터;
c) 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 칼럼; 및
d) 제 1 검출기를 포함하는, 상기 제 1 분리 유닛;
(ⅱ) 제 2 분리 유닛으로서,
a) 상기 제 2 분리 유닛을 통하여 제 2 이동상을 구동하기 위한 제 2 펌프 조립체,
b) 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 칼럼; 및
c) 제 2 검출기를 포함하는, 상기 제 2 분리 유닛, 및
(ⅲ) 복수의 샘플 루프들을 구비한 제 1 유체 라우팅 유닛으로서, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛은 상기 제 1 분리 유닛 및 상기 제 2 분리 유닛에 연결되고,
상기 복수의 샘플 루프들 중 적어도 하나는 트래핑 칼럼을 포함하고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 구비하는, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛을 포함하고;
상기 방법은: 먼저 제 1 분리 유닛에서 RPLC 에 의해 샘플에서 부분 입체 이성질체 성분들을 분해하고, 그 후 동일한 분석 실행에서 제 2 분리 유닛에서 SFC 에 의해 거울상 이성질체 쌍들을 분해하는 것을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 2D 크로마토그래피 시스템을 사용해 입체 이성질체 성분들의 혼합물을 포함한 샘플의 동시 아키랄-키랄 분석을 위한 방법이 제공되고, 상기 2D 크로마토그래피 시스템은:
(i) 제 1 분리 유닛으로서,
a) 상기 제 1 분리 유닛을 통하여 제 1 이동상을 구동하기 위한 제 1 펌프 조립체,
b) 상기 제 1 분리 유닛에 샘플을 도입하기 위한 샘플 인젝터;
c) RPLC 칼럼; 및
d) 제 1 검출기를 포함하는, 상기 제 1 분리 유닛;
(ⅱ) 제 2 분리 유닛으로서,
a) 상기 제 2 분리 유닛을 통하여 제 2 이동상을 구동하기 위한 제 2 펌프 조립체,
b) SFC 칼럼들의 어레이로서, 상기 어레이에서 SFC 칼럼들이 병렬 구성으로 배열되는, 상기 SFC 칼럼들의 어레이;
c) 상기 어레이에서 원하는 (또는 미리 식별된) SFC 칼럼으로 제 2 이동상의 유동을 향하게 하기 위한 제 2 유체 라우팅 유닛; 및
d) 제 2 검출기를 포함하는, 상기 제 2 분리 유닛, 및
(ⅲ) 적어도 3 개의 샘플 루프들을 구비한 제 1 유체 라우팅 유닛으로서, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛은 상기 제 1 분리 유닛 및 상기 제 2 분리 유닛에 연결되고,
상기 샘플 루프들 중 하나는 상기 제 1 분리 유닛과 유체 연통하고, 상기 샘플 루프들 중 다른 하나는 상기 제 2 분리 유닛과 유체 연통하고, 상기 샘플 루프들 중 적어도 하나는 제 1 분리 유닛 및 제 2 분리 유닛으로부터 유동 격리되고;
상기 샘플 루프들 중 적어도 하나는 트래핑 칼럼을 포함하고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛을 포함하고;
상기 방법은: 먼저 제 1 분리 유닛에서 RPLC 에 의해 샘플에서 부분 입체 이성질체 성분들을 분해하고, 그 후 동일한 분석 실행에서 제 2 분리 유닛에서 SFC 에 의해 거울상 이성질체 쌍들을 분해하는 것을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 2D 크로마토그래피 시스템을 사용해 입체 이성질체 성분들의 혼합물을 포함한 샘플의 동시 아키랄-키랄 분석을 위한 방법이 제공되고, 상기 2D 크로마토그래피 시스템은:
(i) 제 1 분리 유닛으로서,
a) 상기 제 1 분리 유닛을 통하여 제 1 이동상을 구동하기 위한 제 1 펌프 조립체,
b) 상기 제 1 분리 유닛에 샘플을 도입하기 위한 샘플 인젝터;
c) RPLC 칼럼; 및
d) 제 1 검출기를 포함하는, 상기 제 1 분리 유닛;
(ⅱ) 제 2 분리 유닛으로서,
a) 상기 제 2 분리 유닛을 통하여 제 2 이동상을 구동하기 위한 제 2 펌프 조립체,
b) SFC 칼럼; 및
c) 제 2 검출기를 포함하는, 상기 제 2 분리 유닛;
(ⅲ) 적어도 3 개의 샘플 루프들을 구비한 제 1 유체 라우팅 유닛으로서, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛은 상기 제 1 분리 유닛 및 상기 제 2 분리 유닛에 연결되고,
상기 샘플 루프들 중 하나는 상기 제 1 분리 유닛과 유체 연통하고, 상기 샘플 루프들 중 다른 하나는 상기 제 2 분리 유닛과 유체 연통하고, 상기 샘플 루프들 중 적어도 하나는 제 1 분리 유닛 및 제 2 분리 유닛으로부터 유동 격리되고;
상기 샘플 루프들 중 적어도 하나는 트래핑 칼럼을 포함하고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛;
(ⅳ) a) 제 1 펌프 조립체;
b) 샘플 인젝터;
c) 제 1 검출기;
d) 제 1 유체 라우팅 유닛;
e) 제 2 펌프 조립체; 및
f) 제 2 검출기 중 하나 이상에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 제어 기기를 포함하고,
상기 방법은: 먼저 제 1 분리 유닛에서 RPLC 에 의해 샘플에서 부분 입체 이성질체 성분들을 분해하고, 그 후 동일한 분석 실행에서 제 2 분리 유닛에서 SFC 에 의해 거울상 이성질체 쌍들을 분해하는 것을 포함한다.
방법들
다른 양태에서, 다차원 크로마토그래피 (예로, 2D RPLC x SFC) 에 의해 샘플을 분리하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 트래핑 칼럼에 포착된 샘플의 일부에 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 에 의한 추가 분리를 부여하는 것을 포함하고, 상기 일부는 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 에 의해 상기 샘플을 분리함으로써 획득되고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 샘플을 분리하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 (i) 트래핑 칼럼에서 샘플의 적어도 일부를 포착하는 단계로서, 상기 일부는 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 에 의해 상기 샘플을 분리함으로써 획득되고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 트래핑 칼럼에서 샘플의 적어도 일부를 포착하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 일부에 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 에 의한 추가 분리를 부여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 방법은 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 에 의해 상기 샘플을 분리하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 단계는: (i) 상기 샘플을 제 1 이동상으로 도입하는 단계; (ⅱ) 상기 샘플을 함유한 상기 제 1 이동상을 RPLC 칼럼을 통하여 구동시키는 단계; 및 (ⅲ) 상기 RPLC 칼럼에서 상기 샘플을 분리하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 상기 방법은 RPLC 칼럼을 통과한 후 제 1 이동상에서 샘플의 성분 존재를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태들에서, 방법은 트래핑 칼럼에서 포착된 샘플의 일부를 트래핑 칼럼에서 용출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태들에서, 방법은 SFC 에 의한 추가 분리 후 샘플의 성분을 검출하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시형태들에서, 방법은 RPLC 칼럼에 의해 분리된 샘플의 적어도 일부를 포착하기 위해 RPLC 칼럼의 하류에서 제 1 이동상의 유로에 트래핑 칼럼을 위치결정하고, 그리고/또는 트래핑 칼럼에서 포착된 부분을 용출하기 위해 제 2 이동상의 유로로 포착된 부분을 운반하는 트래핑 칼럼을 전환하는 것을 추가로 포함한다. RPLC/SFC 유닛의 이동상의 유로 안으로/밖으로 트래핑 칼럼을 위치결정/전환하는 것은 2D RPLC x SFC 크로마토그래피 시스템에서 RPLC 유닛 및 SFC 유닛과 접속한 유체 라우팅 기기에서 수행될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 방법은 트래핑 칼럼에서 포착된 분석물들의 역류 용출을 위해 구성된 2D RPLC x SFC 크로마토그래피 시스템에서 수행될 수도 있다. 이런 변형예에서, 제 1 이동상은 제 1 방향으로 트래핑 칼럼을 통하여 유동하고, 트래핑 칼럼에서 포착된 샘플의 일부는 제 1 방향에 반대 방향으로 트래핑 칼럼을 통하여 제 2 이동상을 유동시킴으로써 트래핑 칼럼에서 용출된다. 일부 실시형태들에서, 방법은 트래핑 칼럼에서 포착된 분석물들의 병류 용출을 위해 구성된 2D RPLC x SFC 크로마토그래피 시스템에서 수행될 수도 있다. 이런 변형예에서, 제 1 이동상은 제 1 방향으로 트래핑 칼럼을 통하여 유동하고, 제 1 방향과 동일한 방향으로 제 2 이동상을 트래핑 칼럼을 통하여 유동시킴으로써 트래핑 칼럼에서 포착된 샘플의 일부가 트래핑 칼럼에서 용출된다.
일부 실시형태들에서, 다차원 크로마토그래피 (예컨대, 본원에 설명된 2D RPLC x SFC 크로마토그래피 시스템, 또는 그것의 임의의 변형예들) 로 샘플을 분리하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은:
(i) 샘플을 제 1 이동상으로 도입하는 단계;
(ⅱ) 상기 샘플을 함유한 상기 제 1 이동상을 RPLC 칼럼을 통하여 구동하는 단계;
(ⅲ) 상기 RPLC 칼럼에서 상기 샘플을 분리하는 단계;
(ⅳ) 상기 RPLC 칼럼을 통과한 후 상기 제 1 이동상에서 샘플의 성분의 존재를 검출하는 단계;
(ⅴ) 상기 RPLC 칼럼에서 분리된 상기 샘플의 적어도 제 1 부분을 제 1 트래핑 칼럼에서 포착하는 단계로서, 상기 제 1 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 제 1 트래핑 칼럼에서 포착하는 단계;
(ⅵ) 상기 제 1 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 상기 제 1 부분을 상기 제 1 트래핑 칼럼에서 용출하는 단계;
(ⅶ) 상기 제 1 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 상기 제 1 부분에 SFC 에 의한 추가 분리를 부여하는 단계; 및
(ⅷ) SFC 에 의한 추가 분리 후 상기 샘플의 성분을 검출하는 단계를 포함한다.
2D 크로마토그래피의 일부 예들에서, 예로 포괄 또는 유사 포괄 모드에서, 제 1 차원 RPLC 로부터 하나 초과 분획물들이 하나 이상의 트래핑 칼럼들에서 포착될 수도 있고 제 2 차원 SFC 에서 분석을 위해 방출될 수도 있다. 따라서, 일부 실시형태들에서, 방법은:
(ⅸ) RPLC 칼럼에서 분리된 샘플의 적어도 제 2 부분을 제 2 트래핑 칼럼에서 포착하는 단계로서, 상기 제 2 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 제 2 트래핑 칼럼에서 포착하는 단계;
(ⅹ) 상기 제 2 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 상기 제 2 부분을 상기 제 2 트래핑 칼럼에서 용출하는 단계;
(ⅹⅰ) 상기 제 2 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 상기 제 2 부분에 SFC 에 의한 추가 분리를 부여하는 단계를 추가로 포함한다.
이 단계들은 다수의 분획물들을 포착/방출하기 위해 여러 번 반복될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 다차원 크로마토그래피 (예컨대, 본원에 설명된 2D RPLC x SFC 크로마토그래피 시스템, 또는 그것의 임의의 변형예들) 를 사용해 샘플을 분리하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은:
(i) 샘플을 제 1 이동상으로 도입하는 단계;
(ⅱ) 상기 샘플을 함유한 상기 제 1 이동상을 RPLC 칼럼을 통하여 구동하는 단계;
(ⅲ) 상기 RPLC 칼럼에서 상기 샘플을 분리하는 단계;
(ⅳ) 상기 RPLC 칼럼을 통과한 후 상기 제 1 이동상에서 샘플의 성분의 존재를 검출하는 단계;
(ⅴ) 상기 RPLC 칼럼의 하류에서 상기 제 1 이동상의 유로에 트래핑 칼럼을 위치결정하는 단계;
(ⅵ) 상기 RPLC 칼럼에서 분리된 상기 샘플의 적어도 일부를 트래핑 칼럼에서 포착하는 단계로서, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 트래핑 칼럼에서 포착하는 단계;
(ⅶ) 제 2 이동상의 유로로 포착된 부분을 운반하는 트래핑 칼럼을 전환하는 단계;
(ⅷ) 상기 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 일부를 상기 트래핑 칼럼에서 용출하는 단계;
(ⅸ) 상기 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 일부에 SFC 에 의한 추가 분리를 부여하는 단계; 및
(ⅹ) SFC 에 의한 추가 분리 후 상기 샘플의 성분을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 단계 (i) 내지 단계 (ⅹ) 은 열거된 바와 같은 순서로 수행된다. 일부 실시형태들에서, 단계 (ⅳ) 내지 단계 (ⅹ) 은, 모든 관심 분획물들이 분석될 때까지 한 번 이상 반복된다.
이런 실시형태들 중 일부에서, RPLC 칼럼은, 예를 들어, 역상 정지상을 포함하고, 정지상은 C-18 상 (예컨대, C-18 실리카), C-8 상 (예컨대, C-8 실리카), C-4 상 (예컨대, C-4 실리카) 과 같은 역상 재료, 또는 본원에서 설명된 다른 역상 재료들을 포함한다. 이런 실시형태들 중 일부에서, 트래핑 칼럼에서 정지상은 C-18 상 (예컨대, C-18 실리카), C-8 상 (예컨대, C-8 실리카), C-4 상 (예컨대, C-4 실리카) 과 같은 역상 재료, 또는 본원에서 설명된 다른 역상 재료들을 포함한다.
이런 실시형태들 중 일부에서, SFC 분리는, 예를 들어, 순상 정지상을 포함하는 SFC 칼럼에서 수행되고, 정지상은 순상 실리카 겔 또는 본원에서 설명된 다른 순상 재료들을 포함한다. 이런 실시형태들 중 일부에서, SFC 분리는 평행하게 배열된 SFC 칼럼들의 어레이로부터 선택된 SFC 칼럼에서 수행되고, 어레이에서 각각의 SFC 칼럼은 동일하거나 상이할 수도 있는 정지상을 포함할 수도 있다. SCF 칼럼에서 정지상 재료는 샘플에서 특정 성분들을 분리하도록 적합화될 수도 있다.
이런 실시형태들 중 일부에서, 방법은 SFC 칼럼에서 추가 분리 전 포커스 칼럼에서 트래핑 칼럼에 포착된 분획물로부터 용출된 분석물들을 포커싱하는 것을 추가로 포함할 수도 있다. 포커스 칼럼은 트래핑 칼럼에서 사용된 정지상과 동일하거나 동일하지 않을 수도 있는 정지상을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 포커스 칼럼은 C-18 상, C-8 상, C-4 상과 같은 역상 재료, 또는 본원에서 설명된 다른 역상 재료들을 포함하는 정지상으로 로딩된다.
본원에서 설명된 샘플을 분리하기 위한 방법들은 본원에서 설명된 2D RPLC x SFC 크로마토그래피 시스템 또는 설명된 그것의 임의의 실시형태들 또는 변형예들의 수행을 위해 적합화될 수도 있다.
실시예들
하기 실시예들은 본 발명을 예시하고 제한하지 않도록 제공된다.
화학물질 및 시약
이산화탄소 (CO2) 는 Praxair (Danbury, CT, USA) 로부터 입수되었다. 아세토니트릴 (ACN) 은 Avantor 의 J.T. Baker (Center Valley, PA, USA) 로부터 구입되었다. 메탄올 (MeOH), 이소프로필 알콜 (IPA), 에틸 알콜 (EtOH), 98.0 % ~ 100.0 % 포름산과 28.0 % ~ 30.0 % 수산화암모늄 (NH4OH) 은 EMD chemicals (Gibbstown, NJ, USA) 로부터 구입되었다. 포름산 암모늄은 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) 로부터 구입되었다. HPLC 등급 밀리포어 물은 Purelab 울트라 밀리포어 물 디스펜서로부터 획득되었다. 트랜스-스틸벤 산화물 (TSO) 은 TCI (일본, 도쿄) 로부터 구입되었다. 이 연구에 사용된 약물 물질 A 는 Genentech, CA, USA 에서 프로세스 화학부에 의해 합성되었다.
실시예 1 - 계기 장비
분석 계기는 Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) 로부터의 질량 분석계를 구비한 맞춤형 2 차원 1260 2D-LC-SFC 시스템이다. RPLC 유닛은 Agilent 1260 쿼터너리 펌프 (G1311B), 1260 HiP ALS 자동 샘플러 (G1367E), 및 Agilent 1260 다파장 UV 검출기 (G1365C) 로 구성된다. 스테인리스 강 피팅들과 배관은 높은 압력 고려로 인해 시스템 전체에 사용된다. SFC 유닛은 3 위치 용매 제어 밸브를 구비한 1260 SFC 바이너리 펌프 (G4302A), 1260 HiP 탈가스기 (G4225A), 1290 서모스탯 칼럼 격실 (G1316C), 8-위치 Agilent 1290 무한 밸브 구동부 (G1170A), 고압 유동 셀을 갖춘 Agilent 1260 DAD (G1315C), 및 Agilent 1260 무한 SFC 제어 모듈 (G4301A) 로 구성된다. SFC 유동 일부는 Agilent 6120 사중극자 MS 를 향하였다. Agilent 1260 이소 펌프 (G1310B) 는 scCO2 의 손실을 보상하도록 0.15 ㎖/분의 보충 유동을 생성하는데 사용되었다. Agilent 1290 Flexcube (G4227A) 는 주문 제작된 12-포트 스위칭 밸브를 사용해 다른 트래핑 칼럼들에서 다수의 피크 파킹을 가능하게 하도록 설치되었다. 계기 제어 및 데이터 수집은 Agilent Chemstation software (Santa Clara, CA, USA) 로 수행되었다.
도 10 은 예시적 파킹 데크 밸브 (예컨대, 도 9 에서 특징으로 하는 밸브 (V2)) 의 사진 영상이다. 도 10 에 도시된 대로, 피크 파킹에 사용될 수도 있는 4 개의 트래핑 칼럼들이 있다. 부가적으로, 도시된 대로, 제 1 분리 유닛으로부터 비롯된 이동상 또는 제 2 분리 유닛으로부터 비롯된 이동상 중 어느 하나가 트래핑 칼럼을 통과하지 않으면서 하류로 향하도록 허용하는 바이패스 루프가 있다.
실시예 2
이 연구의 주요 목적은 제 2 차원 (SFC) 에서 분리 분해능에서 제 1 차원으로부터 제 2 차원으로 이송된 이동상의 체적 영향을 평가하는 것이었다. 여기에서, 다차원 크로마토그래피 시스템은 트랜스-스틸벤 산화물 (TSO) 의 거울상 이성질체들을 분리하는데 사용되었다. 샘플 루프가 트래핑 칼럼이 없는 밸브를 사용해 제 1 차원 (RPLC) 은 제 2 차원 (SFC) 과 접속되었다. 샘플 루프는 제 1 차원으로부터 용출된 샘플의 일부를 함유한 제 1 이동상의 선택된 체적을 저장하는데 사용되었다. 추후, 샘플 루프에 저장된 제 1 이동상의 체적은 추가 분리를 위해 제 2 차원으로 이송되었다. 6 ㎕, 12 ㎕ 및 24 ㎕ 의 이동상의 저장 및 추후 이송을 허용하는 샘플 루프들이 사용되었다.
제 1 RPLC 차원에 대해, ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 ㎛ 2.1 x 50 ㎜ 칼럼은 0.2 ㎖/분의 유속으로 90/10 의 ACN/물과 등용매 조건 하에 이용되었다. UV 검출은 225 ㎚ 에서 수행되었다.
제 2 SFC 차원에 대해, Chiralcel OD3 3.0 ㎛ 4.6 ㎜ x 50 ㎜ 칼럼은 95:5 의 scCO2 (MPA)/0.1% NH4OH 를 갖는 IPA (MPB) 의 등용매 유동과 40 ℃ 에서 이용되었다. 130 bar 의 출구 압력 및 60 ℃ 의 노즐 온도와 함께 유속이 4.0 ㎖/분이었다.
이 실험에 대한 트래핑 루프는 플렉스 모세관 (대략 29 ㎕ 의 내부 체적과 0.5 ㎜ x 150 ㎜) 이었다. 3 가지 전환 시간은 (0.2 ㎖/분의 유속을 기반으로) 6 ㎕, 12 ㎕ 및 24 ㎕ 의 이송 체적들에 각각 대응하는 0.03 분, 0.06 분 및 0.12 분이었다.
도 11 은 3 개의 샘플 루프 구성들 (6 ㎕, 12 ㎕, 24 ㎕) 을 갖는 시스템을 사용해 TSO 의 다차원 분리를 위해 시간 (분) 이 경과함에 따른 UV 흡광도 측정 (mAU) 의 컴필레이션 (compilation) 크로마토그래프이다. 도 11 에 도시된 대로, 제 1 이동상의 이송 체적을 제 2 차원으로 증가시키는 것은 제 2 차원에서 분해능 및 감도를 감소시킨다.
실시예 3
이 실시예에서, 트래핑 칼럼을 포함한 인터페이스를 사용해 제 1 차원 (RPLC) 으로부터 제 2 차원 (SFC) 으로 샘플을 이송하는 효율성이 평가되었다.
0.005 ㎎/㎖ ~ 0.25 ㎎/㎖ 범위의 TSO 표준 용액들은 도 8a 및 도 8b 에 도시된 2D LC-SFC 시스템을 사용해 분석되었다. 제 2 검출기는 UV 검출기이었다. 실시예 2 로부터의 결과들을 기반으로, 낮은 내부 체적의 C18-역상 트래핑 칼럼이 평가되었다.
제 1 차원에서 이용된 역상 크로마토그래프는 Waters Corporation (Milford, MA, USA) 으로부터의 Acquity UPLC HSS T3 칼럼 (50 x 2.1 ㎜, 1.8 ㎛) 이었다. 제 1 차원에서 분리는 0.2 ㎖/분의 유속에서 50:50 의 (물 중 0.05% 포름산):(ACN 중 0.05% 포름산) 으로 등용매 조건 하에 실행되었다. RPLC 칼럼은 40 ℃ 에서 SFC 열 칼럼 격실에 배치되었다. UV 검출은 225 ㎚ 에서 수행되었다. 제 1 차원 주입 체적은 5 ㎕ 이었다.
제 2 차원에서 사용된 초임계 유체 크로마토그래프는 Chiral Technologies (West Chester, PA, USA) 로부터의 Chiralcel OD3 칼럼 (50 x 4.6 ㎜, 3.0 ㎛) 이었다. 제 2 차원에서 분리는 95:5 의 (scCO2):(0.1% 수산화암모늄을 갖는 이소프로필 알콜) 의 등용매 유동 하에 실행되었다. 사용된 칼럼 온도는 40 ℃ 이었고 130 bar 의 출구 압력 및 60 ℃ 의 노즐 온도와 함께 유속은 4.0 ㎖/분 로 설정되었다. SFC 칼럼의 헤드에서 포커싱 칼럼을 사용하는 것은 선택적이다.
위에서 검토한 대로, 낮은 체적의 트래핑 칼럼이 2 개의 차원의 인터페이스에서 사용되었다. 구체적으로, 사용된 트래핑 칼럼은 ChromaNik Technologies (일본, 오사카) 로부터의 SunShell C18 칼럼 (5.0 x 1.0 ㎜, 5 ㎛) 이었다.
TSO 표준 용액들 (0.25, 0.1, 0.05, 0.025, 0.01, 0.005 ㎎/㎖) 은 50:50 의 ACN/물로 제조되었다. TSO 피크의 정점을 가로질러 0.8 분 (약 160 ㎕) 의 윈도우는 초기 SFC 조건들 (100% scCO2) 로 컨디셔닝된 트래핑 칼럼으로 이송되었다. 0% (0.1% NH4OH 를 갖는 IPA) 에서 초기 홀드는 전환 후 처음 0.2 분동안 유지되었고, 그 후 2.35 분 홀드로 0.1 분에 5% (0.1% NH4OH 를 갖는 IPA) 로 증가되었다. 칼럼은 0.2 분 동안 0% (0.1% NH4OH 를 갖는 IPA) 로 재평형화되었다. 샘플들은 3 회 실행되었다. 제 2 차원에서 검출은 225 ㎚ 에서 UV 검출에 의해 수행되었다.
도 12 는 가변 농도의 TSO 의 다차원 분리를 위해 시간 (분) 이 경과함에 따른 UV 흡광도 측정 (mAU) 의 컴필레이션 크로마토그래프이다. 상부 크로마토그램은 제 1 차원에서 분리 후 측정되었다. TSO 표준 거울상 이성질체들은 역상 일차 칼럼에서 공용출하도록 관찰된다. 검출 후 일차 칼럼으로부터 용출되는 피크는 트래핑 칼럼으로 전환되었고 추가 분리를 위해 이차 칼럼으로 백플러싱되었다. 도 12 에 도시된 대로, 하부 크로마토그래프는 제 2 차원에서 분리 후 측정되었다. 여기에서, TSO 표준 거울상 이성질체들은 이차 키랄 칼럼에서 분해된 베이스라인이도록 관찰된다.
더욱이, 도 12 에 도시된 대로, 오버레이 플롯들은 0.99 보다 큰 상관 계수를 갖는 평가된 농도 범위에 대한 검출기 응답의 선형성을 보여주었다 (데이터 미도시). 다른 연구에서, (타이밍 밸브 (V1) 에 의한) 10 ~ 100 ㎕ 범위의 체적들은 이차 SFC 칼럼으로 이송되었다. 이 연구 결과들은 평가된 범위에 대한 선형 응답을 보여주었다 (결과들 미도시).
실시예 4
이 실시예에서, 실시예 3 에서 설명된 2D LC-SFC 시스템은 또한 약물 물질 (A) 의 샘플의 동시 아키랄-키랄 분석 능력을 보여주도록 테스트되었다.
제 1 차원에서 이용된 역상 크로마토그램은 40 ℃ 의 온도에서 Waters Corporation (Milford, MA, USA) 으로부터의 SunFire C18 칼럼 (150 x 3.0 ㎜, 3.5 ㎛) 이었다. MPA 는 5 mM 포름산 암모늄, pH 3.3 이었고 MPB 는 ACN 에서 0.05% 포름산이었다. RPLC 칼럼을 위한 MP 프로그램은 5 분에 5% B 에서 25% B 로, 25 분에 29% B 로, 30 분에 90% B 로 되었고, 그 후 5 분 동안 5% B 에서 재평형화되었다. 유속은 1.0 ㎖/분으로 설정되었다. 제 1 차원 UV 검출은 340 ㎚ 에서 수행되었다. 제 1 차원 주입 체적은 5 ㎕ 이었다.
제 2 차원에서 사용된 초임계 유체 크로마토그램은 65:35 의 scCO2 (MPA)/0.1% 수산화암모늄을 갖는 메탄올 (MPB) 의 초기 MP 유동으로 40 ℃ 에서 Chiral Technologies (West Chester, PA, USA) 로부터의 Chiralpak IC3 칼럼 (50 x 4.6 ㎜, 3 ㎛) 이었다. 130 bar 의 출구 압력 및 60 ℃ 의 노즐 온도와 함께 유속은 4.0 ㎖/분이었다. Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) 로부터 4 개의 Zorbax Eclipse XDB-C18 칼럼들 (5.0 x 2.1 ㎜, 1.8 ㎛) 은 트래핑 칼럼으로서 사용되었다.
약물 물질 (A) 의 샘플은 25:75 의 ACN/0.05% FA 를 갖는 물에서 0.5 ㎎/㎖ 로 제조되었다. 정점을 가로질러 0.1 분 (100 ㎕) 의 윈도우는 예비 컨디셔닝된 트래핑 칼럼으로 이송되었다. SFC 칼럼은 0.5 분 동안 등용매 홀드 (35% MPB) 에서, 그 후 3 분 홀드로 2 분에 55% B 로 유지되었다. 칼럼은 0.2 분 동안 35% B 에서 재평형화되었다. 제 2 차원에서 검출은 565 m/z 에서 SIM-MS 검출에 의해 수행되었다.
도 13 에 도시된 대로, 아키랄 및 키랄 순도 결과들은, 각각, 99.0% 및 100% 거울상 이성질체 초과량 (%ee) 이었다. 거울상 이성질체가 검출되지 않는 무스파이크 샘플 (바닥), 0.1% 의 원하지 않는 거울상 이성질체를 갖는 스파이크된 샘플 (중간), 및 0.5% 의 원하지 않는 거울상 이성질체를 갖는 스파이크된 샘플 (상단) 의 오버레이 플롯은 0.1% 레벨들에서 원하지 않는 거울상 이성질체를 검출할 수 있는 이 시스템의 능력을 보여주었다.
실시예 5
본 연구는 2D LC-SFC 시스템에서 제 2 차원 SFC 와 종래의 (1D) SFC 사이 감도와 분해능 양자의 비교를 보여주도록 수행되었다.
2D LC-SFC 시스템은 실시예 4 에서 사용된 시스템과 동일하였다. 이동상 프로그램 및 전환 시간은 변경되었다. 제 1 차원에서, 이동상 프로그램은 5 분 동안 25% B 이었고, 15 분에 의해 25% 에서 90% B 로 되었고, 그 후 5 분 동안 25% B 에서 재평형화되었다. 피크의 정점에서 0.1 분 (100 ㎕) 의 윈도우는 트래핑 칼럼으로 이송되었다. 종래의 SFC 에 대한 조건들은 (실시예 4 에서 설명된) 2D LC-SFC 의 제 2 차원에서 사용된 조건들과 동일하였다.
원하지 않는 거울상 이성질체의 가변 레벨들 (0.1 ~ 2.0% 범위) 을 함유한 약물 물질 (A) 의 샘플의 표준 용액들은 두 가지 기술 (2D LC-SFC 및 SFC) 을 사용해 분석되었다. SFC 및 2D LC-SFC 기술로부터 표준 크로마토그램들의 오버레이는 도 14a 및 도 14b 에 각각 도시된다. 결과들은 두 가지 기술로 획득된 비교가능한 분리들을 도시하였다. 분해능과 감도 양자는 종래의 SFC 와 비교했을 때 2D LC-SFC 에서 보존되었다.
실시예 2 에서 보여주는 것처럼, SFC 차원으로 역상 이동상의 도입은 SFC 분리의 분해능 및 감도에 유해한 영향을 미친다. 비록 역상 이동상이 여기에서 설명된 2D LC-SFC 시스템을 이용해 SFC 차원으로 여전히 도입되지만, 트래핑 칼럼의 사용은 하류 SFC 분리를 절충하지 않은 LC-SFC 인터페이스를 허용한다.
실시예 6
이 실시예에서, 단일 분석에서 원하는 감도 및 선택성의 복합 키랄 크로마토그래프 분리를 보여준다.
약물 물질 (A) 은 3 개의 키랄 중심들을 가지고 따라서 4 쌍의 부분 입체 이성질체들 (8 개의 잠재적 입체 이성질체들) 을 갖는다. 4 쌍의 부분 입체 이성질체의 혼합물은 0.05 ㎎/㎖ 에서 30/70 의 ACN/물로 제조되었다. 각 쌍의 2 개의 거울상 이성질체들의 비 (RRS/SRR, SRS/RSR, SSS/RRR; RRS/SSR) 는 대략 2:1 이었다.
각각의 입체 이성질체의 분리는 도 9 에 도시된 2D LC-SFC 시스템을 사용해 달성되었다. 일차 칼럼에서 실험 조건들은 실시예 4 의 섹션에서 설명된 것과 동일하였다. 4 개의 트래핑 칼럼들은 4 쌍의 부분 입체 이성질체를 트랩하도록 이차 차원에서 Flexcube (Agilent) 와 함께 사용되었다. 샘플 주입 후, 65:35 의 scCO2 (MPA)/0.1% 수산화암모늄을 갖는 메탄올 (MPB) 로 컨디셔닝된 트래핑 칼럼 (2) 을 제외하고, 트래핑 칼럼들은 1 분 동안 60:40 의 scCO2 (MPA)/0.1% 수산화암모늄을 갖는 메탄올 (MPB) 로 컨디셔닝되었다. 10.55 분, 10.95 분, 11.80 분 및 13.30 분에서 부분 입체 이성질체 피크들의 정점에서 0.1 분 (100 ㎕) 윈도우에 대응하는 일차 칼럼 용리제는 순차적으로 4 개의 트래핑 칼럼들로 이송되었다. 트래핑된 성분들은 이차 차원에서 14.0 분, 18.0 분, 23.5 분 및 27.5 분에 각각 개시하여 순차적으로 크로마토그래핑되었다. 60:40 의 scCO2 (MPA)/0.1% 수산화암모늄을 갖는 메탄올 (MPB) 에서 초기 홀드는 전환 후 먼저 0.5 분 동안 유지되었고 그 후 트래핑된 성분 (2) 을 제외하고 0.3 분 홀드로 2.5 분에 40:60 의 scCO2 (MPA)/0.1% 수산화암모늄을 갖는 메탄올 (MPB) 로 증가되었다. 성분 (2) 에 대해, 65:35 의 scCO2 (MPA)/0.1% 수산화암모늄을 갖는 메탄올 (MPB) 에서 초기 홀드는 전환 후 먼저 1 분 동안 유지되었고 그 후 0.3 분 홀드로 3.0 분에 55:45 의 scCO2 (MPA)/0.1% 수산화암모늄을 갖는 메탄올 (MPB) 로 증가되었다. 제 2 차원에서 검출은 565 m/z 로 SIM-MS 검출에 의해 수행되었다.
도 15 에 도시된 대로, 일차 아키랄 RPLC 칼럼은 4 쌍의 부분 입체 이성질체 (RSS/SRR, SRS/RSR, RRR/SSS, SSR/RRS) 및 API 로부터의 다른 프로세스 관련 불순물을 분해하여서 아키랄 순도를 제공한다. 이런 부분 입체 이성질체 쌍 각각은 그 후 일차 RPLC 칼럼 (후 검출) 으로부터 밸브 (2) (V2; 도 9) 에서 4 개의 다른 트래핑 칼럼들로 순차적으로 이송된다. 트래핑된 부분 입체 이성질체 분획물들은 그 후 순차적으로 백플러싱되고 이차 SFC 키랄 칼럼에서 분석되어서 키랄 순도를 제공한다. 보다 단순한 샘플 혼합물을 이차 키랄 칼럼에 제공함으로써, 잠재적 입체 이성질체들은 보다 효율적으로 분해된다. 도 15 에 도시된 대로, 4 쌍의 부분 입체 이성질체에 대응하는 8 개의 입체 이성질체들은 MS 검출을 사용해 이차 SFC 차원에서 성공적으로 분해되었다. 파킹 데크 밸브를 사용해, 2D LC-SFC 의 적용은 종래의 키랄 크로마토그래피에 의해 분해하기에 어려운 다수의 키랄 중심들을 갖는 화합물들의 분석으로 확장된다.
실시예 7
본 연구는 2D LC-SFC 시스템을 테스트하는데 수행되었고 포커스 칼럼은 SFC 칼럼의 헤드에 배치된다.
2D LC-SFC 조건들은 실시예 3 에서 설명된 조건들과 동일하였다. 더욱이, TSO 샘플들은 실시예 3 에서 설명된 것과 동일한 방식으로 제조되었다. 요약하면, TSO 표준 용액 (0.25, 0.1, 0.05, 0.025, 0.01, 0.005 ㎎/㎖) 은 50:50 의 ACN/물에서 제조되었다. 제 1 차원 주입 체적은 5 ㎕ 이었다. 게다가, 포커싱 칼럼으로 완료된 분석들을 위해, 포커싱 칼럼은 SFC 칼럼의 헤드에 배치되었다. 사용된 포커싱 칼럼은 Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) 로부터의 Pursuit XRs C18 (20 x 2.0 ㎜, 5 ㎛) 이었다.
포커싱 칼럼을 이용할 때와 이용하지 않을 때 일련의 TSO 표준 농도의 2D LC-SFC 분리가 도 16 에 도시된다. TSO 거울상 이성질체들은 두 가지 조건들에서 분해된 베이스라인이다. 하지만, 포커싱 칼럼을 사용하는 것은 피크 높이 대 피크 면적 플롯의 기울기를 증가시켜서 제 2 차원에서 신호 대 소음 (S/N) 비를 향상시킨다 (피크 1). 유사한 결과들이 피크 2 에 대해 관찰되었다 (데이터 미도시).
예시적 실시형태들
본 발명은 하기 실시형태들에 의해 추가로 설명된다. 각각의 실시형태들의 특징들은 적절하고 실용적인 경우에 임의의 다른 실시형태들과 조합가능하다.
실시형태 1. 일 실시형태에서, 본 발명은 샘플을 분리하기 위한 크로마토그래피 시스템을 제공하고, 상기 크로마토그래피 시스템은,
제 1 분리 유닛으로서,
a) 상기 제 1 분리 유닛을 통하여 제 1 이동상을 구동하기 위한 제 1 펌프 조립체,
b) 상기 제 1 분리 유닛에 샘플을 도입하기 위한 샘플 인젝터; 및
c) 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 칼럼을 포함하는, 상기 제 1 분리 유닛;
제 2 분리 유닛으로서,
a) 상기 제 2 분리 유닛을 통하여 제 2 이동상을 구동하기 위한 제 2 펌프 조립체, 및
b) 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 칼럼을 포함하는, 상기 제 2 분리 유닛; 및
복수의 샘플 루프들을 구비한 제 1 유체 라우팅 유닛으로서, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛은 상기 제 1 분리 유닛 및 상기 제 2 분리 유닛에 연결되고,
상기 복수의 샘플 루프들 중 적어도 하나는 트래핑 칼럼을 포함하고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛을 포함하고,
상기 크로마토그래피 시스템은 먼저 상기 제 1 분리 유닛에서 상기 샘플을 분리하고 추후에 상기 RPLC 칼럼으로부터 용출된 샘플의 적어도 일부를 상기 제 2 분리 유닛에 도입하도록 구성된다.
실시형태 2. 실시형태 1 의 추가 실시형태에서, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛은 2 개의 샘플 루프들을 포함하고, 상기 2 개의 샘플 루프들 중 하나는 상기 제 1 분리 유닛과 유체 연통하고 상기 2 개의 샘플 루프들 중 다른 하나는 상기 제 2 분리 유닛과 유체 연통한다.
실시형태 3. 실시형태 1 의 추가 실시형태에서, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛은 적어도 3 개의 샘플 루프들을 포함하고, 상기 샘플 루프들 중 적어도 하나는 상기 제 1 분리 유닛 및 상기 제 2 분리 유닛으로부터 유동 격리된다.
실시형태 4. 실시형태 3 의 추가 실시형태에서, 정지상 재료를 포함하는 적어도 하나의 샘플 루프는 상기 제 1 분리 유닛 및 상기 제 2 분리 유닛으로부터 유동 격리된다.
실시형태 5. 실시형태 1 의 추가 실시형태에서, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛은 샘플 루프에 각각 위치결정되는 복수의 트래핑 칼럼들을 포함한다.
실시형태 6. 실시형태들 1 내지 5 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛은, 상기 샘플 루프가 상기 제 1 분리 유닛과 유체 연통하게 위치결정될 때 제 1 방향으로 샘플 루프를 통하여 유체 유동을 허용하고 상기 샘플 루프가 상기 제 2 분리 유닛과 유체 연통하게 위치결정될 때 상기 제 1 방향에 반대 방향으로 상기 샘플 루프를 통하여 유체 유동을 허용하도록 구성된다.
실시형태 7. 실시형태들 1 내지 5 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛은, 상기 샘플 루프가 상기 제 1 분리 유닛과 유체 연통하게 위치결정될 때 제 1 방향으로 샘플 루프를 통하여 유체 유동을 허용하고 상기 샘플 루프가 상기 제 2 분리 유닛과 유체 연통하게 위치결정될 때 상기 제 1 방향과 동일한 방향으로 상기 샘플 루프를 통하여 유체 유동을 허용하도록 구성된다.
실시형태 8. 실시형태들 1 내지 7 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, 상기 RPLC 칼럼은 역상 정지상을 포함한다.
실시형태 9. 실시형태 8 의 추가 실시형태에서, 상기 역상 정지상은 C-18 상 (예컨대, C-18 실리카) 을 포함한다.
실시형태 10. 실시형태 8 또는 9 의 추가 실시형태에서, 상기 트래핑 칼럼에서 정지상은 역상 재료를 포함한다.
실시형태 11. 실시형태 9 의 추가 실시형태에서, 상기 역상 재료는 C-18 상 (예컨대, C-18 실리카) 을 포함한다.
실시형태 12. 실시형태들 1 내지 11 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, 제 2 분리 유닛은 하나의 SFC 칼럼을 포함한다.
실시형태 13. 실시형태 12 의 추가 실시형태에서, SFC 칼럼은 순상 정지상을 포함한다.
실시형태 14. 실시형태 13 의 추가 실시형태에서, 순상 정지상은 실리카 겔을 포함한다.
실시형태 15. 실시형태들 1 내지 14 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, 상기 제 2 분리 유닛은 상기 SFC 칼럼의 상류에 위치한 포커스 칼럼을 추가로 포함한다.
실시형태 16. 실시형태 15 의 추가 실시형태에서, 포커스 칼럼은 역상 재료를 포함한다.
실시형태 17. 실시형태들 1 내지 11 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, 상기 제 2 분리 유닛은: a) SFC 칼럼들의 어레이로서, 상기 어레이에서 SFC 칼럼들은 병렬 구성으로 배치되는, 상기 SFC 칼럼들의 어레이; 및 b) 상기 어레이에서 원하는 (또는 미리 식별된) SFC 칼럼으로 상기 제 2 이동상의 유동을 향하게 하기 위한 제 2 유체 라우팅 유닛을 포함한다.
실시형태 18. 실시형태 17 의 추가 실시형태에서, 상기 제 2 분리 유닛은 SFC 칼럼들의 어레이에서 각각의 SFC 칼럼의 상류에 위치한 포커스 칼럼을 추가로 포함한다.
실시형태 19. 실시형태들 1 내지 18 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, 상기 RPLC 칼럼의 하류에 위치결정된 제 1 검출기를 추가로 포함한다.
실시형태 20. 실시형태들 1 내지 19 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, 상기 SFC 칼럼의 하류에 위치결정된 제 2 검출기를 추가로 포함한다.
실시형태 21. 실시형태들 1 내지 20 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, a) 제 1 펌프 조립체; b) 샘플 인젝터; c) 제 1 검출기; d) 제 1 유체 라우팅 유닛; e) 제 2 펌프 조립체; 및 f) 제 2 검출기 중 하나 이상에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 제어 기기를 추가로 포함한다.
실시형태 22. 일 실시형태에서, 본 발명은 샘플을 분리하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은,
(i) 트래핑 칼럼에서 샘플의 적어도 일부를 포착하는 단계로서, 상기 일부는 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 에 의해 상기 샘플을 분리함으로써 획득되고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 트래핑 칼럼에서 샘플의 적어도 일부를 포착하는 단계; 및
(ⅱ) 상기 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 일부는 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 에 의한 추가 분리를 부여받는 단계를 포함한다.
실시형태 23. 실시형태 22 의 추가 실시형태에서,
(i) 상기 샘플을 제 1 이동상으로 도입하는 단계;
(ⅱ) 상기 샘플을 함유한 상기 제 1 이동상을 RPLC 칼럼을 통하여 구동시키는 단계; 및
(ⅲ) 상기 RPLC 칼럼에서 상기 샘플을 분리하는 단계를 포함하는, 역상 액체 크로마토그래피로 상기 샘플을 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
실시형태 24. 실시형태 23 의 추가 실시형태에서, 상기 RPLC 칼럼을 통과한 후 상기 제 1 이동상에서 샘플의 성분의 존재를 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
실시형태 25. 실시형태들 22 내지 24 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, 상기 트래핑 칼럼에서 포착된 샘플의 일부를 상기 트래핑 칼럼에서 용출하는 단계를 추가로 포함한다.
실시형태 26. 실시형태들 22 내지 25 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, SFC 에 의한 추가 분리 후 상기 샘플의 성분을 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
실시형태 27. 실시형태들 22 내지 26 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, RPLC 칼럼에 의해 분리된 상기 샘플의 적어도 일부를 포착하기 위해 상기 RPLC 칼럼의 하류에서 상기 제 1 이동상의 유로에 트래핑 칼럼을 위치결정하는 단계를 추가로 포함한다.
실시형태 28. 실시형태 27 의 추가 실시형태에서, 상기 트래핑 칼럼에서 포착된 일부를 용출하기 위해 제 2 이동상의 유로로 포착된 일부를 운반하는 상기 트래핑 칼럼을 전환하는 단계를 추가로 포함한다.
실시형태 29. 실시형태 28 의 추가 실시형태에서, 상기 제 1 이동상의 유로에 상기 트래핑 칼럼을 위치결정하는 단계 또는 상기 제 2 이동상의 유로로 상기 트래핑 칼럼을 전환하는 단계는 상기 PRLC 의 유체 경로 및 상기 SFC 의 유체 경로와 접속하는 유체 라우팅 유닛에서 수행된다.
실시형태 30. 실시형태들 22 내지 29 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, SFC 에 의한 추가 분리 전 포커스 칼럼에서 트래핑 칼럼으로부터 용출된 샘플의 적어도 일부를 재포착하는 단계를 추가로 포함한다.
실시형태 31. 실시형태들 22 내지 30 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, 상기 제 1 이동상은 제 1 방향으로 상기 트래핑 칼럼을 통하여 유동하고, 상기 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 일부는, 상기 제 1 방향에 반대 방향으로 상기 제 2 이동상을 상기 트래핑 칼럼을 통하여 유동시킴으로써 상기 트래핑 칼럼에서 용출된다.
실시형태 32. 실시형태들 22 내지 30 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, 상기 제 1 이동상은 제 1 방향으로 상기 트래핑 칼럼을 통하여 유동하고, 상기 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 일부는, 상기 제 1 방향과 동일한 방향으로 상기 제 2 이동상을 상기 트래핑 칼럼을 통하여 유동시킴으로써 상기 트래핑 칼럼에서 용출된다.
실시형태 33. 실시형태 22 의 추가 실시형태에서,
(i) 샘플을 제 1 이동상으로 도입하는 단계;
(ⅱ) 상기 샘플을 함유한 상기 제 1 이동상을 RPLC 칼럼을 통하여 구동하는 단계;
(ⅲ) 상기 RPLC 칼럼에서 상기 샘플을 분리하는 단계;
(ⅳ) 상기 RPLC 칼럼을 통과한 후 상기 제 1 이동상에서 샘플의 성분의 존재를 검출하는 단계;
(ⅴ) 상기 RPLC 칼럼에서 분리된 상기 샘플의 적어도 제 1 부분을 제 1 트래핑 칼럼에서 포착하는 단계로서, 상기 제 1 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 제 1 트래핑 칼럼에서 포착하는 단계;
(ⅵ) 상기 제 1 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 상기 제 1 부분을 상기 제 1 트래핑 칼럼에서 용출하는 단계;
(ⅶ) 상기 제 1 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 상기 제 1 부분에 SFC 에 의한 추가 분리를 부여하는 단계; 및
(ⅷ) SFC 에 의한 추가 분리 후 상기 샘플의 성분을 검출하는 단계를 포함한다.
실시형태 34. 실시형태 33 의 추가 실시형태에서,
(ⅸ) 상기 RPLC 칼럼에서 분리된 상기 샘플의 적어도 제 2 부분을 제 2 트래핑 칼럼에서 포착하는 단계로서, 상기 제 2 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 제 2 트래핑 칼럼에서 포착하는 단계;
(ⅹ) 상기 제 2 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 상기 제 2 부분을 상기 제 2 트래핑 칼럼에서 용출하는 단계;
(ⅹⅰ) 상기 제 2 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 상기 제 2 부분에 SFC 에 의한 추가 분리를 부여하는 단계를 추가로 포함한다.
실시형태 35. 실시형태들 22 내지 34 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, RPLC 칼럼은 역상 정지상을 포함한다.
실시형태 36. 실시형태들 22 내지 35 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, 상기 트래핑 칼럼에서 정지상은 역상 재료를 포함한다.
실시형태 37. 실시형태들 22 내지 36 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, SFC 에 의한 추가 분리는 순상 정지상을 포함하는 SFC 칼럼에서 수행된다.
실시형태 38. 실시형태들 22 내지 36 중 어느 하나의 추가 실시형태에서, SFC 에 의한 추가 분리는 SFC 칼럼들의 어레이를 포함하는 SFC 시스템에서 수행된다.
실시형태 39. 실시형태 38 의 추가 실시형태에서, 상기 SFC 칼럼들 각각은 독립적으로 순상 정지상을 포함한다.
실시형태 40. 실시형태 39 의 추가 실시형태에서, 추가 분리를 위해 SFC 칼럼으로, 상기 트래핑 칼럼에 포착된 샘플의 부분을 라우팅하기 위한 단계를 추가로 포함하고, 상기 SFC 칼럼은 상기 샘플에서 성분들을 분리하도록 된 정지상을 포함한다.
실시형태 40A. 실시형태 22 의 추가 실시형태에서, 추가 분리를 위해 SFC 칼럼으로, 상기 트래핑 칼럼에 포착된 샘플의 부분을 라우팅하기 위한 단계를 포함하고, 상기 SFC 칼럼은 상기 샘플에서 성분들을 분리하도록 된 정지상을 포함한다.
실시형태 41. 일 실시형태에서, 본 발명은 실시형태 1 의 크로마토그래피 시스템을 사용해 샘플을 분석하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 제 1 분리 유닛에서 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 에 의해 제 1 세트의 분획물들로 복합 샘플을 분리하는 단계; 및 제 2 분리 유닛에서 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 에 의해 하나 이상의 분획물들을 추가 분리하는 단계를 포함한다.
실시형태 42. 실시형태 41 의 추가 실시형태에서, 상기 제 1 분리 유닛에서 RPLC 에 의한 분리는 부분적으로 상기 복합 샘플의 제 1 특성을 기반으로 하고, 상기 제 2 분리 유닛에서 SFC 에 의한 분리는 부분적으로 상기 복합 샘플의 제 2 특성을 기반으로 하고, 상기 복합 샘플의 상기 제 2 특성은 상기 복합 샘플의 상기 제 1 특성과 다르다.
실시형태 43. 실시형태 41 의 추가 실시형태에서, 상기 복합 샘플은 입체 이성질체 성분들의 혼합물을 포함한다.
실시형태 44. 실시형태 43 의 추가 실시형태에서, 부분 입체 이성질체 성분들은 상기 제 1 분리 유닛에서 RPLC 에 의해 하나 이상의 분획물들로 분리되고, 각각의 상기 분획물은 거울상 이성질체 쌍을 포함한다.
실시형태 45. 실시형태 44 의 추가 실시형태에서, 상기 제 1 분리 유닛에서 RPLC 에 의한 분리는 부분적으로 상기 복합 샘플의 소수성을 기반으로 한다.
실시형태 46. 실시형태 44 또는 45 의 추가 실시형태에서, 상기 거울상 이성질체 쌍은 상기 제 2 분리 유닛에서 SFC 에 의해 개별 거울상 이성질체들로 추가 분리된다.
실시형태 47. 실시형태 46 의 추가 실시형태에서, 상기 제 2 분리 유닛에서 SFC 에 의한 분리는 부분적으로 상기 복합 샘플의 분자 비대칭성을 기반으로 한다.
실시형태 48. 일 실시형태에서, 본 발명은 실시형태 1 의 크로마토그래피 시스템을 사용해 입체 이성질체 성분들의 혼합물을 포함하는 샘플의 아키랄-키랄 분석을 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은: 제 1 분리 유닛에서 RPLC 에 의해 샘플에서 하나 이상의 관심 부분 입체 이성질체 성분(들)을 분리하는 단계; 및 동일한 분석 실행에서 제 2 분리 유닛에서 SFC 에 의해 관심 거울상 이성질체 쌍(들)을 분리하는 단계를 포함한다.
실시형태 49. 실시형태 48 의 추가 실시형태에서, RPLC 분리로부터 크로마토그램을 기반으로 아키랄 순도를 결정하고 SFC 분리로부터 크로마토그램을 기반으로 키랄 순도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
공보, 특허, 특허 출원 및 공개된 특허 출원과 같은 모든 참조 문헌들은 본원에 참조로 전부 원용된다.
전술한 발명은 이해의 명확성을 위해 예시 및 실시예를 통하여 좀 더 상세히 설명되었지만, 임의의 약간의 변화 및 수정이 실시될 것이라는 점은 본 기술분야의 당업자들에게 분명하다. 따라서, 상세한 설명과 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

Claims (30)

  1. 샘플을 분리하기 위한 크로마토그래피 시스템으로서,
    상기 크로마토그래피 시스템은,
    (a) 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 분리 유닛;
    (b) 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 분리 유닛; 및
    (c) 복수의 샘플 루프들을 구비한 제 1 유체 라우팅 유닛으로서, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛은 상기 RPLC 분리 유닛 및 상기 SFC 분리 유닛에 연결되고,
    상기 복수의 샘플 루프들 중 적어도 하나는 트래핑 칼럼을 포함하고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 제 1 유체 라우팅 유닛
    을 포함하고,
    상기 크로마토그래피 시스템은 먼저 상기 RPLC 분리 유닛에서 상기 샘플을 분리하고 추후에 상기 RPLC 분리 유닛으로부터 용출된 샘플의 적어도 일부를 상기 SFC 분리 유닛에 도입하도록 구성되는, 샘플을 분리하기 위한 크로마토그래피 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 RPLC 분리 유닛은,
    (i) 상기 RPLC 분리 유닛을 통하여 제 1 이동상을 구동하기 위한 제 1 펌프 조립체;
    (ⅱ) 상기 RPLC 분리 유닛에 샘플을 도입하기 위한 샘플 인젝터; 및
    (ⅲ) 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 칼럼
    을 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 크로마토그래피 시스템.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 SFC 분리 유닛은,
    (i) 상기 SFC 분리 유닛을 통하여 제 2 이동상을 구동하기 위한 제 2 펌프 조립체; 및
    (ⅱ) 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 칼럼
    을 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 크로마토그래피 시스템.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 유체 라우팅 유닛은, 샘플 루프에 각각 위치결정되는 복수의 트래핑 칼럼들을 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 크로마토그래피 시스템.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 트래핑 칼럼에서 정지상은 역상 재료를 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 크로마토그래피 시스템.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 역상 재료는 C-18 상을 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 크로마토그래피 시스템.
  7. 제 3 항에 있어서,
    상기 SFC 분리 유닛은:
    a) SFC 칼럼들의 어레이로서, 상기 어레이에서 SFC 칼럼들은 병렬 구성으로 배치되는, 상기 SFC 칼럼들의 어레이; 및
    b) 상기 어레이에서 미리 식별된 SFC 칼럼으로 상기 제 2 이동상의 유동을 향하게 하기 위한 제 2 유체 라우팅 유닛
    을 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 크로마토그래피 시스템.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 SFC 분리 유닛은, SFC 칼럼들의 어레이에서 각각의 SFC 칼럼의 상류에 위치한 포커스 칼럼을 더 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 크로마토그래피 시스템.
  9. 제 8 항에 있어서,
    각각의 포커스 칼럼은 역상 재료를 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 크로마토그래피 시스템.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 유체 라우팅 유닛은, 상기 샘플 루프가 상기 RPLC 분리 유닛과 유체 연통하게 위치결정될 때 제 1 방향으로 샘플 루프를 통하여 유체 유동을 허용하고 상기 샘플 루프가 상기 SFC 분리 유닛과 유체 연통하게 위치결정될 때 상기 제 1 방향에 반대 방향으로 상기 샘플 루프를 통하여 유체 유동을 허용하도록 구성되는, 샘플을 분리하기 위한 크로마토그래피 시스템.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 유체 라우팅 유닛은, 상기 샘플 루프가 상기 RPLC 분리 유닛과 유체 연통하게 위치결정될 때 제 1 방향으로 샘플 루프를 통하여 유체 유동을 허용하고 상기 샘플 루프가 상기 SFC 분리 유닛과 유체 연통하게 위치결정될 때 상기 제 1 방향과 동일한 방향으로 상기 샘플 루프를 통하여 유체 유동을 허용하도록 구성되는, 샘플을 분리하기 위한 크로마토그래피 시스템.
  12. 샘플을 분리하기 위한 방법으로서,
    (i) 트래핑 칼럼에서 샘플의 적어도 일부를 포착하는 단계로서, 상기 일부는 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC) 에 의해 상기 샘플을 분리함으로써 획득되고, 상기 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 트래핑 칼럼에서 샘플의 적어도 일부를 포착하는 단계; 및
    (ⅱ) 상기 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 일부에 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 에 의한 추가 분리를 부여하는 단계
    를 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    (i) 상기 샘플을 제 1 이동상으로 도입하는 단계;
    (ⅱ) 상기 샘플을 함유한 상기 제 1 이동상을 RPLC 칼럼을 통하여 구동시키는 단계; 및
    (ⅲ) 상기 RPLC 칼럼에서 상기 샘플을 분리하는 단계
    를 포함하는, 역상 액체 크로마토그래피로 상기 샘플을 분리하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 RPLC 칼럼을 통과한 후 상기 제 1 이동상에서 샘플의 성분의 존재를 검출하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 트래핑 칼럼에서 포착된 샘플의 일부를 상기 트래핑 칼럼에서 용출하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  16. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    SFC 에 의한 추가 분리 후 상기 샘플의 성분을 검출하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  17. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    RPLC 칼럼에 의해 분리된 상기 샘플의 적어도 일부를 포착하기 위해 상기 RPLC 칼럼의 하류에서 상기 제 1 이동상의 유로에 상기 트래핑 칼럼을 위치결정하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 트래핑 칼럼에서 포착된 일부를 용출하기 위해 제 2 이동상의 유로로 포착된 일부를 운반하는 상기 트래핑 칼럼을 전환하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 제 1 이동상의 유로에 상기 트래핑 칼럼을 위치결정하는 단계 또는 상기 제 2 이동상의 유로로 상기 트래핑 칼럼을 전환하는 단계는 상기 RPLC 의 유체 경로 및 상기 SFC 의 유체 경로와 접속하는 유체 라우팅 유닛에서 수행되는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  20. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    SFC 에 의한 추가 분리 전 포커스 칼럼에서 트래핑 칼럼에서 용출된 샘플의 적어도 일부를 재포착하는 단계를 더 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  21. 제 18 항에 있어서,
    상기 제 1 이동상은 제 1 방향으로 상기 트래핑 칼럼을 통하여 유동하고, 상기 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 일부는, 상기 제 1 방향에 반대 방향으로 상기 제 2 이동상을 상기 트래핑 칼럼을 통하여 유동시킴으로써 상기 트래핑 칼럼에서 용출되는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  22. 제 18 항에 있어서,
    상기 제 1 이동상은 제 1 방향으로 상기 트래핑 칼럼을 통하여 유동하고, 상기 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 일부는, 상기 제 1 방향과 동일한 방향으로 상기 제 2 이동상을 상기 트래핑 칼럼을 통하여 유동시킴으로써 상기 트래핑 칼럼에서 용출되는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  23. 제 12 항에 있어서,
    (i) 샘플을 제 1 이동상으로 도입하는 단계;
    (ⅱ) 상기 샘플을 함유한 상기 제 1 이동상을 RPLC 칼럼을 통하여 구동하는 단계;
    (ⅲ) 상기 RPLC 칼럼에서 상기 샘플을 분리하는 단계;
    (ⅳ) 상기 RPLC 칼럼을 통과한 후 상기 제 1 이동상에서 샘플의 성분의 존재를 검출하는 단계;
    (ⅴ) 상기 RPLC 칼럼에서 분리된 상기 샘플의 적어도 제 1 부분을 상기 트래핑 칼럼에서 포착하는 단계;
    (ⅵ) 상기 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 상기 제 1 부분을 상기 트래핑 칼럼에서 용출하는 단계;
    (ⅶ) 상기 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 상기 제 1 부분에 SFC 에 의한 추가 분리를 부여하는 단계; 및
    (ⅷ) SFC 에 의한 추가 분리 후 상기 샘플의 성분을 검출하는 단계
    를 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    (ⅸ) 상기 RPLC 칼럼에서 분리된 상기 샘플의 적어도 제 2 부분을 제 2 트래핑 칼럼에서 포착하는 단계로서, 상기 제 2 트래핑 칼럼은 정지상을 포함하는, 상기 제 2 트래핑 칼럼에서 포착하는 단계;
    (ⅹ) 상기 제 2 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 상기 제 2 부분을 상기 제 2 트래핑 칼럼에서 용출하는 단계;
    (ⅹⅰ) 상기 제 2 트래핑 칼럼에서 포착된 상기 샘플의 상기 제 2 부분에 SFC 에 의한 추가 분리를 부여하는 단계
    를 더 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  25. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    상기 RPLC 칼럼은 역상 정지상을 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  26. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 트래핑 칼럼에서 정지상은 역상 재료를 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  27. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    SFC 에 의한 추가 분리는 순상 정지상을 포함하는 SFC 칼럼에서 수행되는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  28. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    SFC 에 의한 추가 분리는 SFC 칼럼들의 어레이를 포함하는 SFC 시스템에서 수행되는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 SFC 칼럼들 각각은 독립적으로 순상 정지상을 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    추가 분리를 위해 SFC 칼럼으로 상기 트래핑 칼럼에 포착된 샘플의 부분을 라우팅하는 단계를 더 포함하고, 상기 SFC 칼럼은 상기 샘플에서 성분들을 분리하도록 된 정지상을 포함하는, 샘플을 분리하기 위한 방법.
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