CN103134889B - 在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统及其联用方法和一种在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统及其联用方法。本发明的在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统，包括两两互相连接的在线富集装置、分步聚焦进样装置和超高效液相色谱装置，通过分步聚焦进样的策略解决了洗脱液造成超高效液相色谱体积过载的问题，实现了富集方法与超高效液相色谱的在线联用分析。本发明能在获得尖锐谱带的前提下进行在线富集和快速分离分析，提高了分析灵敏度、速度以及自动化程度。

Description

在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统及应用

技术领域

本发明属于分析化学样品前处理领域，具体涉及一种在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统的设计、分析及应用，适用于环境、食品、医药、生物等复杂样品中痕量有机物的在线预处理、萃取、解吸、分离和检测。

背景技术

超高效液相色谱（UHPLC）分离速度快、灵敏度高，是一种强大的分析工具。但应用在复杂样品超痕量分析时，通常需要采用高效的前处理技术进行净化和富集，如固相萃取(SPE)和固相微萃取（SPME）。目前富集技术与UHPLC通常以离线的方式结合使用，这是由于UHPLC色谱柱比常规液相色谱柱短小，其填料粒径较小，进样体积受到限制。SPE或SPME富集后的洗脱液往往体积较大、强度较高，在线洗脱进样容易造成UHPLC色谱峰展宽和变形，影响分离度和灵敏度。此外，UHPLC工作压力较高，使不耐高压的萃取材料难以与UHPLC在线联用。目前仍缺乏有效的策略实现UHPLC的在线富集分析，例如，仍未出现SPME与UHPLC在线联用的报道。

发明内容

本发明旨在针对在线富集的洗脱液容易造成超高效液相色谱峰展宽和变形的问题，设计一种在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统，通过分步聚焦的策略解决了洗脱液体积过载问题，实现富集技术与超高效液相色谱在线联用，放宽了UHPLC对萃取材料耐压性能以及萃取相体积的限制，提高了分离度、分析效率和灵敏度。

本发明的第二个目的是填补目前无SPME与UHPLC在线联用的空白，SPME-UHPLC在线联用系统结合了SPME操作简易、绿色低耗的优势以及UHPLC快速高效的特点。

本发明的第三个目的是通过分步聚焦实现强溶剂样品的大体积进样UHPLC分析，避免溶剂效应造成的谱峰变形，省去蒸干重溶或者采用大量水稀释样品的操作，提高自动化程度，减少人为误差，提高了准确度，并使大体积进样方法适用于分析物或基体水溶性差的液体样品。

本发明的目的是通过采用以下技术方案来实现的：

一种分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统，其特征在于包括：

互相连接的分步聚焦进样装置和超高效液相色谱装置，所述超高效液相色谱装置包括色谱柱；所述分步聚焦进样装置包括第二高压六通切换阀和第二定量环，第二定量环的两端通过不锈钢管道连接于第二高压六通切换阀，所述分步聚焦装置的第二定量环通过所述第二高压六通切换阀与所述超高效液相色谱装置的色谱柱连接，所述第二高压六通切换阀包括两个状态，分别是载样档（a）和进样档（b），所述第二高压六通切换阀位于载样档（a）状态时，所述第二定量环与所述色谱柱相隔离；所述第二高压六通切换阀位于进样档（b）状态时，所述第二定量环与所述色谱柱连通。

上述的分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统的联用方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步，反复切换第二高压六通切换阀的状态为载样档（a）或进样档（b），所述第二定量环通过所述第二高压六通切换阀向所述超高效液相色谱装置进行分步聚焦进样；

第二步，所述第二高压六通切换阀位于载样档（a）状态时，改变超高效液相色谱装置的流动相的洗脱强度进行梯度分离。

一种在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统，其特征在于，包括两两互相连接的在线富集装置、分步聚焦进样装置和超高效液相色谱装置，

所述在线富集装置包括萃取柱；

所述超高效液相色谱装置包括色谱柱、高压六通进样阀和第一定量环，所述第一定量环的两端连接于高压六通进样阀；

所述分步聚焦装置包括第二高压六通切换阀和第二定量环，第二定量环的两端通过不锈钢管道连接于第二高压六通切换阀，所述分步聚焦装置的第二定量环通过所述第二高压六通切换阀与所述超高效液相色谱装置的色谱柱连接，所述第二高压六通切换阀包括两个状态，分别是载样档（a）和进样档（b），所述第二高压六通切换阀位于载样档（a）状态时，所述第二定量环与所述色谱柱相隔离；所述第二高压六通切换阀位于进样档（b）状态时，所述第二定量环与所述色谱柱连通。

进一步地，所述在线富集装置还包括与所述高压六通进样阀连接的第一高压六通切换阀，所述萃取柱一端连接于所述第一高压六通切换阀，另一端与所述分步聚焦进样装置连接，所述第一高压六通切换阀包括两个状态，分别是载样档（a）和进样档（b），所述第一高压六通切换阀位于载样档（a）状态时，所述萃取柱与所述第一定量环相隔离；所述第一高压六通切换阀位于进样档（b）状态且所述高压六通进样阀位于进样档（inject）时，所述萃取柱与所述第一定量环连通。

进一步地，所述在线富集装置还包括注射泵，所述注射泵与所述第一高压六通切换阀连接，所述第一高压六通切换阀位于载样档（a）状态时，所述注射泵与所述萃取柱连通。

进一步地，所述超高效液相色谱装置还包括进样针、检测器和高压液相泵，所述高压液相泵与所述高压六通进样阀连接，所述高压六通进样阀处于载样档（load）时，所述第一定量环与所述高压液相泵相隔离；所述高压六通进样阀处于进样档（inject）时，所述第一定量环与所述高压液相泵连通。

进一步地，所述分步聚焦进样装置的第二定量环容积大于萃取柱的洗脱液体积。

上述的在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统的联用方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步，所述第一高压六通切换阀位于进样档（b）、所述第二高压六通切换阀位于进样档（b），且所述高压六通进样阀位于进样档（inject）时，通过所述第一定量环向所述萃取柱通入样品溶液进行萃取；

第二步，所述第一高压六通切换阀位于载样档（a）、所述第二高压六通切换阀位于进样档（b），且所述高压六通进样阀位于载样档（load）时，净化萃取柱，同时向所述第一定量环中注入洗脱溶剂；

第三步，所述第一高压六通切换阀位于进样档（b）、所述第二高压六通切换阀位于载样档（a），且所述高压六通进样阀位于进样档（inject）时，洗脱溶剂从所述第一定量环流过所述萃取柱并进入所述第二定量环；

第四步，所述第一高压六通切换阀位于载样档（a），同时所述高压六通进样阀位于载样档（load），通过反复切换第二高压六通切换阀的状态为载样档（a）或进样档（b），向所述超高效液相色谱装置进行分步聚焦进样。

进一步地，还包括以下步骤：

第五步，所述第一高压六通切换阀位于载样档（a）、所述第二高压六通切换阀位于进载样档（a），同时所述高压六通进样阀位于载样档（load）时，改变超高效液相色谱装置的流动相的洗脱强度进行梯度分离。

再进一步，所述的在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统的联用方法，其特征在于：通过控制第二高压六通切换阀的切换次数和频率来控制分步聚焦进样的次数和每步进样体积，在一定流速下，通过控制第二高压六通切换阀位于进样档的停留时间来控制每步进样体积，通过控制第二高压六通切换阀位于载样档的停留时间来控制介于相邻两份分步进样的样品之间的流动相体积，每步进样时间和相邻两步之间的间隔时间由总的样品体积以及分析物的保留强弱来确定。

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术方案来实现。

依据本发明提出的一种在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统，其包括以下步骤：1）超高效液相色谱柱采用洗脱强度较低的初始流动相平衡色谱柱；2）高压六通进样阀处于载样档（load），样品溶液注入第一定量环中；3）高压六通进样阀处于进样档（Inject），在高压液相泵驱动下样品溶液流经萃取柱进行富集；4）重复2）与3）的步骤，注入净化溶剂并流经萃取柱进行净化；5）重复2）与3）的步骤，注入洗脱溶剂并流经萃取柱进行洗脱，通过切换分步聚焦进样装置（B）的第二高压六通切换阀使洗脱液流入第二定量环；6）通过切换三个高压六通阀使得第一定量环、第二定量环及萃取柱与UHPLC流路相隔离；7）反复多次切换装置（B）的第二高压六通切换阀，进行分步聚焦进样；8）所有洗脱液进入柱头聚焦后，提高流动相的洗脱强度进行梯度分离检测。

借由上述技术方案，本发明在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统至少具有以下优点：

1）分步聚焦进样具有较强的谱峰压缩能力，能实现在线富集技术与UHPLC在线联用，提高系统的分离度和灵敏度。

2）系统简单，容易实现，只需在UHPLC仪器基础上添加高压六通切换阀、定量环和萃取柱。

3）联用系统的设计避免萃取材料与UHPLC色谱柱直接相连，使其在洗脱过程免受高压损毁，扩大了萃取材料的选择范围。

4）系统简化后能通过分步聚焦实现强溶剂样品的大体积进样分析，避免了峰展宽和变形，省去蒸干重溶、高倍数稀释等离线操作，提高了灵敏度、分离度，减少人工操作。使大体积进样技术能应用于分析物或基质水溶性差的液体样品，此类样品难以用水重溶或稀释降低溶剂的洗脱强度。

5）分步聚焦进样装置有良好的通用性，较高的推广价值。可用于解决常规反相液相色谱、毛细管色谱体积过载问题，也可作为接口用于多维液相色谱中，减少灵敏度损失。

以上说明为本发明技术方案的概述，为了能够更清楚的了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，现特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。

附图说明

图1为本发明提供的在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统装置（Ⅰ）和分步聚焦进样装置及其第二高压六通切换阀的反复切换示意图（Ⅱ），其中：

A-在线富集装置；

B-分步聚焦进样装置；

C-超高效液相色谱；

1-高压六通进样阀（含第一定量环）；2-第一高压六通切换阀；3-第二高压六通切换阀；4-萃取柱；5-第二定量环；6-色谱柱；7-检测器；8-高压液相泵；9-注射泵；10-初始流动相；11-洗脱液样品。

图2为在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统分析三嗪类除草剂加标自来水样的色谱图，其中：

a为采用在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统分析的色谱图；

b为采用在线富集-超高效液相色谱联用系统分析色谱图；

c为超高效液相色谱直接进样50μL加标水样色谱图；

1-西玛津；2-氰草净；3-西草净；4-莠灭净；5-扑灭净；6-特丁津；7-扑草净；8-特丁净；加标浓度1μg/L，样品体积4mL。

图3为超高效液相色谱一次性进样320μL乙腈样品与分步聚焦进样对比色谱图，其中，

a为常规一次性进样色谱图；

b为分步聚焦进样色谱图；

1-硝基苯；2-甲苯；3-邻二氯苯；4-邻苯二甲酸丁酯；5-苯并荧蒽；6-邻苯二甲酸辛酯；六种化合物浓度均为1mg/L。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明以达成预定发明目的所采取的技术手段及其技术效果，以下结合实施例和附图，对本发明提出的在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统的结构、特征及其具体实施方式，详细说明如下。

如图1（Ⅰ）所示，为本发明提供的在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统装置，其包括：在线富集装置A、分步聚焦进样装置B和超高效液相色谱装置C。将第一高压六通切换阀2和第二高压六通切换阀3按实线位置的连通状态记为载样档a，按虚线位置的连通状态记为进样档b。

在线富集装置A包括萃取柱4、第一高压六通切换阀2和注射泵9。当第一高压六通切换阀2处于a档时，萃取柱4与高压液相泵8相隔离，此时可由注射泵9驱动进行清洗、平衡萃取柱的操作；当第一高压六通切换阀2处于b档时，萃取柱4与高压液相泵8相连，可在该泵驱动下进行萃取、洗脱操作。

分步聚焦进样装置B包括第二高压六通切换阀3和第二定量环5。当第二高压六通切换阀3处于a档时，第二定量环5与色谱柱6相隔离，此时可进行载样操作，即洗脱液流入第二定量环；当第二高压六通切换阀3处于b档时，第二定量环5与色谱柱6相连接，此时样品流入色谱柱6，属进样状态；当第二高压六通切换阀3反复多次地切换于a档和b档之间，定量环5中的样品会分段地进入色谱柱6，进行分步聚焦。

超高效液相色谱装置C包括高压液相泵8、高压六通进样阀1（含第一定量环）、色谱柱6和检测器7。当高压六通进样阀1处于Load档（载样档）时，其第一定量环与高压液相泵8相隔离，此时可用进样针注入样品溶液、洗脱溶剂或净化溶剂；当高压六通进样阀1处于Inject档（进样档）时，第一定量环与高压液相泵8相连，在该泵驱动下，环中溶液（样品溶液、洗脱容积或净化溶剂）流经萃取柱进行萃取、洗脱或净化操作。

实施例1：采用在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统分析水样中的三嗪类除草剂。

实验药品、仪器及条件：样品为8种三嗪类除草剂的加标自来水，使用超高效液相色谱仪及C18反相色谱柱（规格3.0×100mm，粒径2.2μm），初始流动相为5％乙腈，进样后保持0.5min，然后在11.5min内提高至38％，最后提高到100％保持3min；流速1mL/min，萃取柱（Inertsil ODS-SP column，4.0×10.0mm，5μm）。

在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统如图1所示，操作步骤及相应阀的位置如表1所示，每步具体操作如下：1）4mL自来水样品通过进样针注入高压六通进样阀1的第一定量环，同时5％乙腈平衡色谱柱；2）在高压液相泵8驱动下，样品从高压六通进样阀1的第一定量环被流动相以1mL/min流速推入萃取柱4进行萃取；3）注射泵9将蒸馏水泵入萃取柱4净化，同时洗脱溶剂（400μL乙腈）通过进样针注入高压六通进样阀1的第一定量环；4）在高压液相泵8驱动下，洗脱溶剂从六通进样阀1的第一定量环被流动相以1mL/min的流速流过萃取柱4后进入第二定量环5；5）反复切换第二高压六通切换阀3进行分步聚焦进样，共50次，每次在a档停留2s，b档停留1s；6）提高流动相的乙腈比例进行梯度分离和检测。

表1在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统的分析步骤和相应高压六通阀状态

图2为加标自来水样分析色谱图，完全、快速洗脱需要400μL乙腈作为洗脱溶剂，容易造成超高效液相色谱柱的体积过载。由于分步聚焦进样的作用，在线联用分析能获得良好峰形（a）。如果采用常规的联用方式，即洗脱液不经过分步聚焦而直接进入色谱柱，会出现严重的谱带变形（b），说明分步聚焦接口装置具有强大的谱带压缩功能，能有效解决在线联用的体积过载问题。（a）与（c）相比，说明在线富集能极大提高UHPLC分析灵敏度。在线联用方法分析8种三嗪类除草剂，检出限不高于0.011μg/L，在0.08-20.0μg/L之间线性良好，RSD小于4.0％，回收率介于84.3-107.9％之间，说明使用分步聚焦进样接口的在线系统快速、灵敏、稳定和可靠。

实施例2：超高效液相色谱分步聚焦大体积进样方法分析六种含苯环污染物。

实验药品、仪器及条件：样品为含有硝基苯、甲苯、邻二氯苯、邻苯二甲酸丁酯、苯并荧蒽和邻苯二甲酸辛酯的乙腈溶液，使用超高效液相色谱仪及C18反相色谱柱（规格3.0×100mm，粒径2.2μm），采用高压六通进样阀、1mL不锈钢定量环实现多步聚焦进样，初始流动相为5％乙腈，流速1mL/min。

超高效液相色谱分步聚焦大体积进样装置是在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统的简化，如图1（Ⅰ）所示，卸去在线富集装置A，使分步聚焦进样装置B与超高效液相色谱装置C直接相连即可。具体操作是：使用进样针从第二高压六通切换阀3注入320μL样品于第二定量环5中。分步聚焦进样条件是反复切换第二高压六通进样阀3共32次，每次在载样档停留2s，在进样档停留1s；常规一次性进样条件是切换第二高压六通切换阀3至进样档停留30s后切回载样档。进样结束后提高流动相中乙腈比例进行梯度分离检测。

图3中，常规进样（a）和分步聚焦进样（b）的色谱图对比，由于进样体积较大，超高效液相色谱柱比较细和短，常规进样会出现严重的峰展宽和变形（见a），采用多步聚焦进样能得到尖锐谱带（见b），这是因为分步聚焦避免强溶剂（乙腈）持续大量地进入色谱柱，从而降低样品的溶剂效应。本发明的进样方法显著提高了分离度和灵敏度。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例说明如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出更动或修饰等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统的联用方法，其特征在于，所述分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统包括： 

互相连接的分步聚焦进样装置和超高效液相色谱装置， 

所述超高效液相色谱装置包括色谱柱； 

所述分步聚焦进样装置包括第二高压六通切换阀和第二定量环，第二定量环的两端通过不锈钢管道连接于第二高压六通切换阀，所述分步聚焦装置的第二定量环通过所述第二高压六通切换阀与所述超高效液相色谱装置的色谱柱连接，所述第二高压六通切换阀包括两个状态，分别是载样档(a)和进样档(b)，所述第二高压六通切换阀位于载样档(a)状态时，所述第二定量环与所述色谱柱相隔离；所述第二高压六通切换阀位于进样档(b)状态时，所述第二定量环与所述色谱柱连通；

所述联用方法包括以下步骤： 

第一步，反复多次切换第二高压六通切换阀的状态为载样档(a)或进样档(b)，所述第二定量环通过所述第二高压六通切换阀向所述超高效液相色谱装置进行分步聚焦进样； 

第二步，所述第二高压六通切换阀位于载样档(a)状态时，改变超高效液相色谱装置的流动相的洗脱强度进行梯度分离。 

2.一种在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统，其特征在于，包括两两互相连接的在线富集装置、分步聚焦进样装置和超高效液相色谱装置， 

所述在线富集装置包括萃取柱、第一高压六通切换阀； 

所述超高效液相色谱装置包括色谱柱、高压六通进样阀和第一定量环，所述第一定量环的两端连接于高压六通进样阀； 

所述分步聚焦装置包括第二高压六通切换阀和第二定量环，第二定量环的两端通过不锈钢管道连接于第二高压六通切换阀，所述分步聚焦装置的第二定量环通过所述第二高压六通切换阀与所述超高效液相色谱装置的色谱柱连接，所述第二高压六通切换阀包括两个状态，分别是载样档(a)和进样档(b)，所述第二高压六通切换阀位于载样档(a)状态时，所述第二定量环与所述色谱柱相隔离；所述第二高压六通切换阀位于进样档(b)状态时，所述第二定量环与所述色谱柱连通；

所述高压六通进样阀与第一高压六通切换阀连接；所述萃取柱一端连接于所述第一高压六通切换阀，另一端与分步聚焦进样装置的第二高压流通切换阀连接；所述第一高压六通切换阀包括两个状态，分别是载样档(a)和进样档(b)，所述第一高压六通切换阀位于载样档(a)状态时，所述萃取柱与所述第一定量环相隔离；所述第一高压六通切换阀位于进样档(b)状态且所述高压六通进样阀位于进样档(inject)时，所述萃取柱与所述第一定量环连通。 

3.根据权利要求2所述的在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统，其特征在于，所述在线富集装置还包括注射泵，所述注射泵与所述第一高压六通切换阀连接，所述第一高压六通切换阀位于载样档(a)状态时，所述注射泵与所述萃取柱连通。 

4.根据权利要求2所述的在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统，其特征在于，所述超高效液相色谱装置还包括进样针、检测器和高压液相泵，所述高压液相泵与所述高压六通进样阀连接，所述高压六通进样阀处于载样档(load)时，所述第一定量环与所述高压液相泵相隔离；所述高压六通进样阀处于进样档(inject)时，所述第一定量环与所述高压液相泵连通。 

5.根据权利要求2所述的在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统，其特征在于：所述分步聚焦进样装置的第二定量环容积大于萃取柱的洗脱液体积。 

6.根据权利要求2～5任一所述的在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统的联用方法，其特征在于包括以下步骤： 

第一步，所述第一高压六通切换阀位于进样档(b)、所述第二高压六通切换阀位于进样档(b)，且所述高压六通进样阀位于进样档(inject)时，通过所述第一定量环向所述萃取柱通入样品溶液进行萃取； 

第二步，所述第一高压六通切换阀位于载样档(a)、所述第二高压六通切换阀位于进样档(b)，且所述高压六通进样阀位于载样档(load)时，净化萃取柱，同时向所述第一定量环中注入洗脱溶剂； 

第三步，所述第一高压六通切换阀位于进样档(b)、所述第二高压六通切换阀位于载样档(a)，且所述高压六通进样阀位于进样档(inject)时，洗脱溶剂从所述第一定量环流过所述萃取柱进行洗脱，洗脱液进入所述第二定量环； 

第四步，所述第一高压六通切换阀位于载样档(a)，同时所述高压六通进样阀位于载样档(load)，通过反复多次切换第二高压六通切换阀的状态为载样档(a)或进样档(b)，向所述超高效液相色谱装置进行分步聚焦进样。 

7.根据权利要求6所述的在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统的联用方法，其特征在于还包括以下步骤： 

第五步，所述第一高压六通切换阀位于载样档(a)、所述第二高压六通切换阀位于进载样档(a)，同时所述高压六通进样阀位于载样档(load)时，改变超高效液相色谱装置的流动相的洗脱强度进行梯度分离。 

8.根据权利要求7所述的在线富集-分步聚焦进样-超高效液相色谱联用系统的联用方法，其特征在于：通过控制第二高压六通切换阀的切换次数和频率来控制分步聚焦进样的次 数和每步进样体积，在一定流速下，通过控制第二高压六通切换阀位于进样档的停留时间来控制每步进样体积，通过控制第二高压六通切换阀位于载样档的停留时间来控制介于相邻两份分步进样的样品之间的流动相体积，每步进样时间和相邻两步之间的间隔时间由总的样品体积以及分析物的保留强弱来确定。