KR102133699B1 - 고순도 및 탁월한 수율의 정확하게 폴딩된 에타너셉트 - Google Patents

Abstract

소정의 단백질의 부정확하게 폴딩된 형태로부터 정확하게 폴딩된 형태를 분리하기 위한 혼합 모드 크로마토그래피 방법이 제공되어 있다. 상기 방법은, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트에 비해 정확하게 폴딩된 에타너셉트 측면에서 매우 높은 순도를 갖는 에타너셉트 제제를 제공할 수 있는 상업적으로 매력적인 수율로 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 및 응집물로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하는데 매우 효과적이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 방법을 사용하여 수득된 정확하게 폴딩된 단백질을 포함하는 단백질 제제 및 제형, 및 혼합 모드 방법으로부터 수득된 고순도 제제를 사용하는 치료방법에 관한 것이다.

Description

고순도 및 탁월한 수율의 정확하게 폴딩된 에타너셉트{CORRECTLY FOLDED ETANERCEPT IN HIGH PURITY AND EXCELLENT YIELD}

본 발명은 일반적으로, 재조합에 의해 발현된 단백질을 정제하기 위한 크로마토그래피 분리방법, 및 상기 방법으로부터 수득된 생성물에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은, 예를 들면, 제대로 폴딩된(properly folded) 단백질과 함께 바람직하지 않은 양의 부정확하게 폴딩된(incorrectly folded) 및/또는 응집된 단백질을 포함할 수 있는 융합 단백질을 포함하는 재조합 단백질 발현 생성물을 정제하기 위한 혼합 모드 크로마토그래피의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 혼합-모드 크로마토그래피 방법은, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트(본원에 정의된 바와 같음)로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하는데 특히 유용하다. 본 발명은 또한, 에타너셉트 제제 및 약제학적 제형 안에 공급된 에타너셉트가 상기한 방법을 사용하여 고 수율 및 고 순도로 제조된 것인 에타너셉트 제제 및 약제학적 제형에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 현저하게 낮은 수준의 미스폴딩된(misfolded)/응집된 단백질을 특징으로 하는 고도로 정제된 에타너셉트를 사용하는 TNF 상태에 대한 치료방법에 관한 것이다.

에타너셉트(Enbrel^®, 제조원: Immunex Corporation)는 사람 면역글로불린 G("IgG1")의 Fc 수용체[단편, 결정화 가능] 영역에 연결된 사람 75 킬로달톤(p75) 종양 괴저 인자 수용체("TNFR")의 세포외 리간드-결합 부분으로 이루어진 이량체성 융합 폴리펩타이드이다. 에타너셉트는 934개의 아미노산으로 이루어지며, 대략 150 킬로달톤의 겉보기 분자량을 갖는다(문헌 참조: Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company, Inc.). 에타너셉트의 Fc 성분은 사람 IgG1의 불변 중쇄(constant heavy) 2(CH2) 도메인, 불변 중쇄 3(CH3) 도메인 및 힌지 영역을 함유하지만, 불변 중쇄 1(CH1) 도메인은 함유하지 않는다. Fc 도메인은 상기한 도메인 중의 하나 또는 전부를 함유할 수 있다.

류마티스 관절염, 판상형 건선, 건선성 관절염, 소아 특발성 관절염, 및 강직성 척추염과 같은 몇가지 타입의 염증 질환을 앓고 있는 사람들은 종양 괴저 인자("TNF")를 과잉 생산하는 면역계를 갖는다. 에타너셉트가 유인 수용체(decoy receptor)로서 TNF에 결합함에 의해 대상체에서 TNF의 활성형의 수준을 감소시킬 수 있기 때문에, 에타너셉트의 투여가 몇몇 염증 질환의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다.

에타너셉트는 중국 햄스터 난소("CHO": Chinese hamster ovary) 포유류 세포 발현 시스템에서 재조합 DNA 기술에 의해 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 불행하게도, CHO 세포에 의해 제조되는 생성물은 다량의 부정확하게 폴딩된 또는 미스폴딩된 및/또는 응집된 에타너셉트를 함유한다. 약제학적 사용을 위해서는, 부정확하게 폴딩된/응집된 단백질은 정확하게 폴딩된 단백질과 동일한 치료 효과를 갖지 못하며, 실제로 환자에게 해로울 수 있기 때문에, 부정확하게 폴딩된 및 응집된 단백질을 비교적 함유하지 않는 에타너셉트를 제공하는 것이 바람직하다.

미스폴딩 및 응집은 재조합 단백질의 생산 동안 흔히 발생하며, 따라서, 미스폴딩되거나 응집된 단백질로부터 정확하게 폴딩된 단백질을 분리할수 있는 다운스트림 공정을 통해 해결되어야 한다. 미스폴딩은 단백질의 치료 효과를 감소시키거나 없앤다. 응집은, 일반적으로 매우 고분자량 화학종을 형성하는 둘 이상의 에타너셉트 동종이량체의 비-공유 회합을 수반하여, 치료 효과의 유사한 상실을 초래하고, 미스폴딩된 단백질을 포함한 단백질이 함께 축적되고 덩어리화될 때에 발생하는 것으로 이해된다. 상기 주지된 바와 같이, 이러한 미스폴딩된 단백질 및 단백질 응집물은 치료학적으로 비효과적일 뿐만 아니라 환자에게 해로울 수 있다. 따라서, 제대로 폴딩된 에타너셉트가 미스폴딩된 및/또는 응집된 에타너셉트로부터 분리되도록 에타너셉트 함유 단백질 발현 생성물을 정제할 수 있는 능력이 최고 가능한 정도의 약제학적 허용가능성을 제공하는 에타너셉트를 수득하는데 중요하다.

미스폴딩된 및 응집된 단백질의 생성은 에타너셉트에 특이적인 문제는 아니다. 다수의 치료 단백질에 대해 미스폴딩이 문제가 될 수 있다. 예를 들면, 에쉐리키아 콜라이 개재물들(Escherichia coli inclusion bodies)로부터의 재조합 단백질의 재폴딩(refolding) 동안 디설파이드-함유 단백질의 미스폴딩을 피하기는 어렵지만, 고 분해능을 갖는 역상 크로마토그래피에 의해 효과적으로 분리할 수 있다. 그러나, 역상 크로마토그래피에서의 낮은 pH 및 유기 용매의 사용이 단백질을 변성시킬 수 있고, 크로마토그래피 동안 정제된 단백질의 응집을 야기할 수 있다.

미스폴딩이, 예를 들면, 포유류 분비 발현의 경우에, 약제학적 단백질의 생산 동안 무시해도 될 정도라고 생각되는 경우라도, 응집 및 일부 미스폴딩이 여전히 발생할 수 있다(예를 들면, 문헌 참조: Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W. and Carpenter, J. F., Physical Stability of Proteins in Aqueous Solution: Mechanism and Driving Forces in Nonnative Protein Aggregation, Pharm. Res., 20, 1325-1336 (2003); Kiese, S., Pappenberger, A., Friess, W., and Mahler, H. C, Shaken, Not Stirred: Mechanical Stress Testing of an IgGl Antibody, J. Pharm. Sci., 97, 4347-4366 (2008)). 연구자들은 이온 교환을 이용한 수성 크로마토그래피("IEC")(예를 들면, 문헌 참조: Gagnon, P. J., Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography in the Presence of Polyethylene Glycol, Immunol. Methods, 336, 222-228 (2008); Gagnon, P., Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Validated Biosystems, Tucson, AZ, 57-87 (1996); Shukla, A. A., and Yigzaw, Y., Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceutical Industry, Shukla, A., Etzel, M., and Gadam, S., eds., 179-227, CRC Press, Boca Raton (2007); Staby, A., Jacobsen, J. H., Hansen, R. G., Bruus, U. K., Jensen, I. H., Comparison of Chromatographic Ion-exchange Resins. V. Strong and Weak Cation-Exchange Resins, J.Chromatogr. A, 1118, 168-179 (2006); Shukla, A. A., Hubbard, B., Tressel, T., Guhan, S., Low, D. J., Downstream Processing of Monoclonal Antibodies-Application of Platform Approaches, Chromatogr. B, 848, 28-39 (2007); Shihara, T., Kadoya, T. J., Accelerated Purification Process Development of Monoclonal Antibodies for Shortening Time to Clinic: Design and Case Study of Chromatography Processes, Cliromatogr. A, 1176, 149-156 (2007); Fahrner, R. L., Knudsen, H. L., Basey, C. D., Galan, W., Feuerhelm, D., Vanderlaan, M., Blank, G. S., Industrial Purification of Pharmaceutical Antibodies: Development, Operation, and Validation of Chromatography Processes, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 18, 301-27 (2001); and Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A. and Vedantham, G., Ion Exchange Chromatography of Proteins and Clearance of Aggregates, Curr. Pharm. Biotech., 10, 421-426 (2009)), 소수성 상호작용("HIC")(예를 들면, 문헌 참조: Chen, J., Tetrault, J., Ley, A., Comparison of Standard and New Generation Hydrophobic Interaction Chromatography Resins in the Monoclonal Antibody Purification Process, J. Cliromatogr. A., 1177, 272-81 (2008); Gagnon, P., and Grand, E., Large Scale Process Development for Hydrophobic Interaction Chromatography, Part 4: Controlling Selectivity, BioPharm, 9, 54-64 (1996); and Lu, Y., Williamson, B., and Gillespie, R., Recent Advancement in Application of Hydrophobic Interaction Chromatography for Aggregate Removal in Industrial Purification Process, Curr. Pharm. Biotech., 10, 427-33 (2009)) 및 하이드록시아파타이드("HA") 크로마토그래피(예를 들면, 문헌 참조: Aoyama, K., Chiba, J., Separation of Molecular Forms of Mouse IgG and IgM Monoclonal Antibodies in High Performance Liquid Chromatography on Spherical Hydroxy apatite Beads, J. Immunol. Methods, 162, 201-210 (1993); Lueilau, E., Marison, W., von Stockar, U., Ceramic Hydroxapatite: A New Tool for Separation and Analysis of IgA Monocolonal Antibodies, in Animal Cell Technology, Carondo, M., ed., Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 265-269 (1997); Lueilau, E., von Stockar, U., Vogt, S., Freitag, R., Development of a Downstream Process for the Isolation and Separation of Monoclonal Immunoglobulin A Monomer, Dimers, and Polymers from Cell Culture Supernatant, J. Chomatogr. A., 796, 165-175 (1998); Yamakawa, Y., Chiba, J., High Performance Liquid Chromatography of Mouse Monoclonal Antibodies on Spherical Hydroxyapatite Beads, J. Liquid. Chromatogr., 11, 665-681 (1998); Coppola, G., Underwood, J., Cartwright, G., Hearn, M. T., High-performance Liquid Chromatography of Amino Acids, Peptides and Proteins: XCIII. Comparison of Methods for the Purification of Mouse Monoclonal Immunoglobulin M Autoantibodies, J. Chromatogr. A., 476, 269-290 (1989); Josics, D., Loster, K., Kuhl, R., Noll, F., Reusch, J., Purification of Monoclonal Antibodies by Hydroxylapatite HPLC and Size Exclusion HPLC, Biol. Chem. Hoppe-Seylars, 372, 149-156 (1991); Gagnon, P., and Beam, K., Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography Curr. Pharm. Biotech. (2008))를 사용하여 비변성 조건하에서 비-천연 미스폴딩된 단백질을 성공적으로 분리하였다.

상기 언급한 것들과 같은 이전의 교시들은, 이들이 정성적으로 및/또는 정량적으로 적절한 샘플을 제공하지 못한다는 점에서, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터의 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 분리에 적용하기에 유용한 것으로 입증되지 못했다. 따라서, 매우 높은 순도(즉, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트가 부재하거나 존재하더라도 매우 낮은 수준으로 존재함)의 에타너셉트 제제를 상업적으로 매력적인 생산 수율로 제공할 수 있는 CHO 세포 생산 에타너셉트에 사용하기 위한 효과적이고도 효율적인 분리 기술이 당업계에서 요구된다.

본 발명은 소위 "혼합 모드" 크로마토그래피를 사용한다. 재조합에 의해 발현된 단백질을 정제하기 위한 크로마토그래피 방법은, 이것이 단백질에 결합하고, 목적하는 단백질을 바람직하지 못한 불순물과 함께 함유하는 비교적 불순한 발현 생성물에 존재할 수 있는 바람직하지 못한 물질로부터 목적하는 단백질 생성물을 분리하기 위해 적어도 두 개의 상이한 힘을 이용하는 경우, 일반적으로 "혼합 모드"라고 할 수 있다. 이러한 힘은, 예를 들면, 정전기력 및 소수성 힘을 포함할 수 있다.

혼합 모드 크로마토그래피는 정지상과 이동상이 있다는 점에서 보다 종래의 크로마토그래피 기술과 유사한 방식으로 작동한다. 정지상은 통상적으로 분리를 위한 기초를 제공하는, 전형적으로 크로마토그래피 수지라고 하는 불용성 수지 또는 겔이다. 수지는 컬럼에 함유되어, 액체가 수지를 통과하여 접촉하도록 한다. 크로마토그래피 수지가 바람직하지 않은 물질로부터 목적하는 물질을 분리할 수 있는 능력은, 수지에 공액된 선택된 화학 그룹들 또는 모이어티들의 존재에 의해 가능해진다. 전형적으로 리간드라고 불리는 이러한 공액된 그룹들은 수지에 필요한 친화성 성질들(즉, 리간드에 존재하는 이온 교환 모이어티들로부터 야기되는 정전기 인력 특성, 및 리간드에 존재하는 소수성 모이어티들로부터 야기되는 소수성 인력 특성)을 제공함으로써, 불순한 샘플을 함유하는 용액이 수지와 접촉한 채로 크로마토그래피 컬럼을 통해 유동하는 경우, 수지가 불순한 샘플 중의 단백질 물질의 일부에는 결합되지만 다른 것에는 결합되지 않도록 할 수 있다.

이러한 친화성 그룹을 갖는 수지를 함유하는 크로마토그래피 컬럼의 정지상은, 전형적으로 유체가 한쪽 말단에 도입되어 수지와 접촉한 다음, 반대쪽 말단에서 컬럼을 빠져나갈 수 있는 경질 원통형 용기인 크로마토그래피 컬럼 내에 팩킹된다. 정제하고자 하는 단백질을 함유하는 용액은, 단백질 생성물을 적절한 용액에 넣고, 이동상이라고 불리는 용액이 컬럼을 지나 이동하도록 함으로써 컬럼 내로 도입될 수 있다(따라서, 유동될 수 있다). 정제하고자 하는 단백질 생성물(분석물이라고 함)이 이동상으로 컬럼에 제공되는 경우, 이것은 컬럼과 이동상 간의 평형 상태에 도달하게 되는데, 이것은 단백질 용액 내의 물질 중의 일부는 컬럼 수지 상의 친화성 그룹에 의해 부착되거나 결합되거나 고정되거나 포획되는 반면 생성물 중의 나머지 물질은 컬럼에 부착되는 것이 아니라 대신에 컬럼을 지나 컬럼 밖으로 유동하여 분석을 위해 수집되거나 추가로 가공되거나 폐기될 수 있음을 의미한다.

일단 단백질 분석물이 상기한 방식으로 컬럼에 결합되면, 세척 단계-전형적으로 용출 단계라고 함-가 그후 컬럼으로부터 결합된 분석물을 용출하거나 배출하는데 사용된다. 분석물을 컬럼에 결합시키기 위해 수지 상에 존재하는 친화성 리간드의 타입(예를 들면, 전하 기반 모이어티들 또는 소수성 모이어티들, 또는 이의 조합 등)에 따라, 컬럼으로부터 분석물을 용출 또는 배출하는데 사용되는 용액은, 수지에 대한 분석물의 친화력 또는 인력을 극복하여 분석물이 수지(상기에 정지상이라고 언급됨)로부터 용출 배지(이동상)로 배출되도록 할 수 있는, 분석물 및/또는 리간드에 대한 친화력 또는 인력(예를 들면, 전하 성질들, 소수성 성질들, pH 성질들, 염 농도 등)을 가져야 한다. 일단 이동상으로 배출 또는 용출되면, 분석물은 그후 최종 수집, 분석 등을 위해 크로마토그래피 컬럼을 지나 컬럼 밖으로 유동하거나, 추가의 정제 방법 또는 여과 단계로 이동할 수 있다. 어떠한 인력 또는 친화력의 성질들이라도 분석물이 크로마토그래피 수지에 결합되도록 하지만(예를 들면, 전하 특성 또는 소수성 특성), 분석물을 용출 또는 배출하는데 후속적으로 사용되는 이동상 용액은 분석물이 컬럼 수지에 포획되기 보다는 용출 배지 내에 있는 것을 "선호"하도록 경쟁 세트의 성질들을 가져야 하는 것으로 이해될 수 있다.

다른 단일 모드 크로마토그래피 기술과 비교하여, 소위 혼합 모드 크로마토그래피는 다양한 결합 및 용출 인자가 상호의존적일 수 있고 서로 상반될 수 있다는 점에서 독특하다. 예를 들면, 종래의 단일 모드 이온-교환 크로마토그래피에서 이동상의 이온 강도를 증가시키는 것은, 분석물의 하전된 특성들이 컬럼 수지의 인력에 비해 용출 배지에 대해 더 강한 인력(선호도)을 갖는 경우, 수지-결합된 분석물의 용출 또는 배출을 추진할 수 있다. 그러나, 크로마토그래피 수지가 분석물을 결합시키기 위해 정전기 인력 뿐만 아니라 소수성 인력 둘 다를 사용하는 혼합 모드 크로마토그래피 방법에서, 이동(용출) 상의 이온 강도를 증가시키는 것은 물질의 전하 성질들에 기초하여 컬럼으로부터 샘플 물질의 배출을 추진하면서 동시에 분석물 중의 소수성 물질의 결합을 추진 또는 강화시킬 수 있는데, 그 이유는 이러한 소수성 단백질 물질은 - 하전된 기본 용출 배지의 존재하에서 - 용출 배지의 하전된 환경에 비해 컬럼의 소수성 리간드에 결합하는 보다 강한 인력 또는 선호도를 갖는 경향이 있기 때문이다. 따라서, 염 농도의 증가가 이동상 중의 하전된 이온이 정지상에서의 결합 부위에 대해 단백질과 경쟁하는 경우, 정지상으로부터 하전된 단백질 물질을 대체하는 경향을 정말로 추진할 수 있지만 - 고도의 소수성 특징을 나타낼 수 있는 분석물 생성물 혼합물의 이러한 부분은 혼합 모드 크로마토그래피 컬럼의 소수성 모이어티들에 결합된 채로 있는 증가된 경향을 가질 수 있다. 소정의 단백질 분리 상황에서 이러한 현상을 이용할 수 있는 능력은, 거의 예측할 수 없는 것으로 간주될 수 있다.

혼합 모드 수지의 두 가지 예는 Capto^TM MMC 및 Capto^TM Adhere(GE Healthcare로부터 구입가능함)이다. Capto^TM MMC는 (이의 카복실산 그룹과의) 양이온 교환, 수소 결합 및 소수성 상호작용에 의해 분석물과 상호작용할 수 있는 고체 지지체 매트릭스에 부착된 리간드를 사용한다. Capto^TM MMC의 리간드가 아래에 예시되어 있다:

Capto^TM Adhere는 이것 또한 고체 지지체 매트릭스에 부착된 리간드를 사용한다는 점에서 Capto^TM MMC와 유사하다. 리간드, N-벤질-N-메틸 에탄올 아민은 또한 음이온 교환, 수소 결합 및 소수성 상호작용에 의해 분석물과 상호작용한다. Capto^TM Adhere의 리간드가 아래에 예시되어 있다:

리간드 둘 다에서, 소수성 상호작용은 약할 것으로 예상된다. 따라서, 이들 리간드가 단지 소수성 모이어티들만 갖는다면(전하가 없다면), 이들은 아마도 단백질 결합을 위해 염석(단백질 침전) 조건을 필요로 할 것이다. 그러나, 정전기 상호작용을 갖는다면 이러한 약한 소수성 상호작용이 추가의 결합력을 제공하기에 충분하도록 만들 수 있다.

발명의 요약

본 발명은, 예를 들면, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 Capto^TM MMC 및 Capto^TM Adhere을 사용하는 혼합 모드 크로마토그래피를 사용하여, 예를 들면, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단백질 혼합물을 포함하는, 정확하게 폴딩된 단백질과 부정확하게 폴딩된 단백질의 혼합물을 포함하는 분석물을 정제하고, 이에 의해, 정확하게 폴딩된 단백질을 부정확하게 폴딩된 또는 미스폴딩된 단백질로부터 매우 효율적인 방식으로 그리고 탁월한 생산 수율로 효율적으로 분리하여, 목적하는 정확하게 폴딩된 단백질이 매우 대단히 풍부한 단백질 제제를 수득할 수 있다는 발견을 전제로 한다. 또한, 본 발명은, 경우에 따라, 부정확하게 폴딩된 생성물을 함유하지 않거나 본질적으로 함유하지 않을 수 있는 용출 생성물을 크로마토그래피 분리로부터 수득하도록 하는 방식으로 본원에 기재된 혼합 모드 크로마토그래피 분리를 수행할 수 있는 능력을 포함하지만, 수율과 순도의 균형을 이루기 위한 목적으로, 수율을 목적하는 정도로 최대화하기 위해 매우 낮은 수준의 부정확하게 폴딩된 생성물(예를 들면, 5wt% 이하, 바람직하게는 3wt% 이하)을 포함하는 것이 허용 가능한 것으로 이해될 수 있다.

따라서, 제1 양태에서, 본 발명은, 부정확하게 폴딩된 단백질로부터 정확하게 폴딩된 단백질을 분리하기 위한 혼합 모드 크로마토그래피 방법으로서, (a) 소정의 단백질의 정확하게 폴딩된 형태(folded conformation)와 부정확하게 폴딩된 형태 둘 다를 포함하는 제1 단백질 혼합물을, 이온 교환 모이어티(moiety)들과 소수성 모이어티들 둘 다를 갖는 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합시키는 단계; (b) 상기 혼합 모드 수지로부터 상기 정확하게 폴딩된 단백질을 용출시켜, 상기 제1 단백질 혼합물에서보다 더 높은 비율의 정확하게 폴딩된 단백질을 포함하는 제2 단백질 혼합물을 수득하는 단계를 포함한다. 용어 "더 높은 비율"은 단계(b)의 용출물 중의 정확하게 폴딩된 단백질 대 부정확하게 폴딩된 단백질의 비가 적어도 1:1 이상, 가장 바람직하게는 약 8:2 이상, 바람직하게는 약 9:1 이상임을 의미한다. 제2 단백질 혼합물은 가장 바람직하게는 정확하게 폴딩된 단백질을 제2 단백질 혼합물의 적어도 약 95wt%를 구성하는 양으로 함유한다.

제2 양태에서, 상기 방법은, 상기 혼합물에 존재하는 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하기 위해 단백질 혼합물을 정제하기 위한 혼합 모드 크로마토그래피 방법에 관한 것으로, 상기 방법은, (a) 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 둘 다가 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 부착되거나 결합되거나 포획되도록, 소수성 모이어티들과 이온 교환 모이어티들을 갖는 혼합 모드 크로마토그래피 수지를 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단백질 혼합물을 함유하는 용액과 접촉시키는 단계; 및 (b) 혼합 모드 수지를 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 에타너셉트 단백질을 용출시킬 수 있는 용액과 접촉시켜, 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양 대 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양의 비가 단계(a)에서 수지에 도입되는 단백질 혼합물보다 큰, 바람직하게는 훨씬 더 큰 용출물을 수득하는 단계를 포함한다.

제3 양태에서, 본 발명은 상기한 방법 양태에 따라 수득되는 에타너셉트-함유 단백질 혼합물, 또는 상기 혼합물을 포함하는 약제학적으로 허용되는 제형에 관한 것이며, 여기서, 상기 단백질 혼합물은 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 상기 단백질 혼합물의 약 90wt% 이상을 구성하는 양으로 포함하고; 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 상기 단백질 혼합물의 약 5wt% 이하를 구성하는 양으로 포함하며; 상기 단백질 혼합물은 에타너셉트-함유 단백질 혼합물의 적어도 약 95wt%, 바람직하게는 적어도 약 98wt%를 구성하는 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 합한 양을 갖는다. 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은 소수성 상호작용 크로마토그래피(단일 모드)를 사용하여 측정할 수 있다. 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 합한 양은 크기 배제 크로마토그래피("SEC")를 사용하여 측정할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어들 "에타너셉트계 단백질 혼합물" 또는 "에타너셉트-함유 단백질 혼합물" 또는 "에타너셉트 제제" 또는 "에타너셉트계 물질" 등은 동의어로서 이해되어야 하며, 주 성분은 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하고, 미량 성분은 클리핑된 에타너셉트, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트, 응집된 에타너셉트(이러한 응집물은 정확하게 및/또는 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로 이루어진다), 또는 에타너셉트의 단편을 포함할 수 있는 단백질 혼합물을 나타내기 위한 것이다. 본 발명은 부정확하게 폴딩된 에타너셉트(응집된 에타너셉트 포함)의 양을 최소화시키면서 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양을 이전에 달성된 것보다 높은 정도로 최대화시키는 것이 요구되는 약제학적 제형에서 활성 성분으로서 사용하기 위한 에타너셉트계 단백질 혼합물 (또는 에타너셉트 제제)을 제조할 수 있는 능력을 제공한다.

제4 양태에서, 본 발명은 TNF 매개된 상태에 대한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하기에 적합한 매우 순수한 에타너셉트를 포함하는 약제학적으로 허용되는 제형에 관한 것이며, 상기 제형은 다량(major amount)의 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 소량(minor amount)의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단백질 혼합물을 함유하고, 여기서, (i) 상기 부정확하게 폴딩된 에타너셉트는 상기 단백질 혼합물의 약 10wt% 이하, 바람직하게는 약 8wt% 이하, 가장 바람직하게는 약 5wt% 이하를 구성하고; (ii) 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트는 상기 단백질 혼합물의 90wt% 이상, 바람직하게는 약 92wt% 이상, 가장 바람직하게는 약 95wt% 이상을 구성하며; (iii) 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트(이들의 응집물은 포함하지 않음)의 총량은 상기 단백질 혼합물의 적어도 95wt%, 바람직하게는 적어도 98중량%를 구성하고; 여기서, 상기 제형은 상기 대상체에게 투여하기에 적합한 제형이 되도록 약제학적으로 허용되는 불활성 성분, 부형제 또는 담체를 추가로 포함한다.

제5 양태에서, 본 발명은 에타너셉트-함유 단백질 혼합물 안에 존재하는 부정확하게 폴딩된 에타너셉트에 비해 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양과 관련한 높은 순도를 갖는 에타너셉트-함유 단백질 혼합물을 제조하는 방법이며, 상기 방법은, (1) 포유류 발현 시스템에서 에타너셉트를 발현시켜, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 둘 다를 포함하는 에타너셉트-함유 단백질 혼합물을 함유하는 수확 세포 배양액을 수득하는 단계; (2) 단계 (1)에서 수득된 수확 세포 배양액을 정제 공정에 적용함으로써, 단계 (1)에서 생성된 수확 세포 배양액에 존재하는 바람직하지 않은 불순물(즉, 비-에타너셉트계 단백질)을 감소된 양으로 함유하거나 실질적으로 함유하지 않는 에타너셉트-함유 단백질 혼합물을 수득하는 단계; (3) 단계 (2)에서 수득된 에타너셉트-함유 단백질 혼합물을, 상기 혼합물에 함유된 단백질을 수지에 부착시키기 위해, 이온 교환 모이어티들과 소수성 상호작용 모이어티들 둘 다를 갖는 혼합 모드 크로마토그래피 수지와 1회이상 접촉시키는 단계; 및 (4) 단계 (3)으로부터의 단백질이 결합된 혼합 모드 수지를, 혼합 모드 수지로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 용출시킬 수 있는 용액과 접촉시켜, 단계 (3)에서 수지에 도입되는 에타너셉트-함유 혼합물보다 부정확하게 폴딩된 에타너셉트에 비해 더 높은 비율의 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 갖는 에타너셉트-함유 단백질 혼합물을 포함하는 용출물을 수득하는 단계를 포함하고; 여기서, (i) 단계 (2)의 정제로부터 수득된 에타너셉트-함유 단백질 혼합물에 존재하는 단백질의 양은, 단계 (1)에서 수득된 수확 세포 배양액에 존재하는 에타너셉트계 단백질 혼합물의 양의 적어도 약 80wt%, 가장 바람직하게는 적어도 약 85wt%이고; (ii) 단계 (4)에서 용출된 단백질 혼합물에 존재하는 정확하게 폴딩된 에타너셉트 단백질과 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 단백질의 합한 양은 단계 (2)로부터 수득된 단백질 혼합물에 존재하는 그들의 양의 적어도 약 60wt%이며; (iii) 단계 (4)의 용출물에 존재하는 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은, 단계 (1)에서 수득된 수확 세포 배양액에 존재하는 에타너셉트-함유 단백질 혼합물의 양의 적어도 약 30wt%, 바람직하게는 적어도 약 34wt%이고; (iv) 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트는 단계 (4)에서 수득된 용출물의 적어도 약 90wt%, 바람직하게는 적어도 약 95wt%를 구성한다.

제6 양태에서, 본 발명은, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단백질 혼합물(상기 혼합물은 상기한 방법 중 어느 하나에 의해 수득되고, 여기서, 단백질 혼합물 중의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은 상기 혼합물의 약 10wt% 이하, 바람직하게는 약 5wt% 이하이다)을 함유하는 약제학적 제형을 TNF 매개된 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, TNF 매개된 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

제7 양태에서, 본 발명은, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단백질 혼합물(여기서, 단백질 혼합물 중의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은 상기 혼합물의 약 10wt% 이하, 바람직하게는 약 5wt% 이하이다)을 함유하는 약제학적 제형을 TNF 매개된 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, TNF 매개된 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

제8 양태에서, 본 발명은, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하는 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 분리를 달성하는데 크로마토그래피 수단이 사용되며, 상기 크로마토그래피 수단은 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 혼합물을 이온 교환 모이어티들과 소수성 모이어티들을 갖는 혼합 모드 크로마토그래피 수지와 접촉시킨 다음, 이로부터 용출시켜, 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 적어도 약 85wt%, 바람직하게는 적어도 약 90wt%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95wt% 포함하는 용출물을 수득하는 혼합 모드 크로마토그래피만으로 이루어진다. 이러한 양태와 관련하여, 본원에 "크로마토그래피 수단이 혼합 크로마토그래피만으로 이루어진다"라고 명시될 때, 이것이 분석 목적만으로 사용되는 경우 이러한 어법은 다양한 크로마토그래피 수단(예를 들면, HIC, SEC, 등)의 임의 사용을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 양태는 본원에 기재된 혼합 모드 방법 이외의 부정확하게 폴딩된 단백질로부터 정확하게 폴딩된 단백질을 분해하기 위한 분리 방법의 사용을 필요로 하지 않는다는 점에서 유리하다.

추가의 측면에서, 에타너셉트에 적용되는 바와 같은 상기한 방법은 상기한, 예를 들면, 위의 양태 1 및 2에 기재된 바와 같은 단계 (a)와 단계 (b)를 수행함에 의해 1차 혼합 모드 분리(분리 #1)를 수행한 다음; 단계 (a)와 단계 (b)를 다시 수행함으로써 2차 혼합 모드 분리(분리 #2)를 수행하는 방식으로 매우 순수한 에타너셉트 제제를 수득하기 위해 2회 이상 실시될 수 있으며; 여기서, 상기 분리 #1의 단계 (b)에서 수득된 용출물이 그후 분리 #2의 단계 (a)를 위한 분석물(즉, 단백질 혼합물을 함유하는 용액)로서 사용된다. 분리 #1 및 분리 #2에 사용되는 혼합 모드 수지는 동일하거나 상이할 수 있다. 이러한 측면의 특히 바람직한 실시에서, 분리 #1은 CAPTO MMC 혼합 모드 수지를 사용하여 수행되고, 분리 #2는 CAPTO ADHERE 혼합 모드 수지를 사용하여 수행된다.

임의로, 본 발명의 방법으로부터 야기되거나 상기한 제제, 제형 또는 치료 양태에서 제공되는 에타너셉트 제제는, 경우에 따라, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 함유하지 않거나 본질적으로 함유하지 않을 수 있지만, 본원에서 약물 제형에 존재하는 에타너셉트계 단백질 혼합물의 총량의 바람직하게는 약 10wt% 이하, 가장 바람직하게는 약 5wt% 이하의 현저하게 낮은 수준의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 갖는 에타너셉트 제제를 제공할 수 있는 능력은 에타너셉트계 혼합물을 함유하는 시판용으로 현재 이용 가능한 약제학적 제형(여기서, 이러한 혼합물 중의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은, HIC 분석을 기준으로 하여, 이러한 제형에서 발견되는 에타너셉트계 단백질의 약 10% 이상일 수 있다)을 능가하는 상당한 진전을 나타내는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명에서 사용하기에 바람직한 혼합 모드 수지는 CAPTO MMC 및 CAPTO ADHERE이다; 그러나, 이온 교환 모이어티들과 소수성 모이어티들 둘 다로 기능화되는 어떠한 혼합 모드 수지라도 본 발명에서 사용하기 위해 고려되는 것으로 이해되어야 한다.

특정 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 전혀 예측할 수 없다면, 부정확하게 폴딩된 및/또는 응집된 화학종으로부터 제대로 폴딩된 단백질 화학종의 매우 효율적인 분리를 전개하기 위해, 두 가지 친화도 타입을 사용하는 혼합 모드 크로마토그래피에서 전하 특징과 소수성 특징 간의 상호의존 및 대립 작용을 이용할 수 있다는 것이 가능하게 고려된다. 놀랍게도, 본 발명의 혼합 모드 방법은 부정확하게 폴딩된 단백질로부터 정확하게 폴딩된 단백질을 탁월한 수율 및 고순도로 분해하기 위해 다른 분리 전략과 조합하거나 보충할 필요가 없다. 예를 들면, 부정확하게 폴딩된 단백질로부터 정확하게 폴딩된 단백질의 이러한 분리를 추가로 달성하기 위해 추가의 HIC 단계를 사용하는 것이 필요하지 않다.

에타너셉트에 적용되는 바와 같이, 본 발명에 따르는 혼합 모드 크로마토그래피 방법은 다음의 일반적인 순서의 현상의 발생을 포함한다: 첫째, 예를 들면, 에타너셉트의 CHO 발현으로부터 수득된 것과 같은 불순한 에타너셉트-함유 샘플(즉, 정확하게 폴딩된, 부정확하게 폴딩된 및 기타의 불순물을 포함하는 샘플)의 혼합 모드 수지로의 도입시, 본 발명의 방법은 에타너셉트(정확하게 폴딩된 에타너셉트 및 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 둘 다)가 혼합 모드 수지에 결합되도록 한다. 둘째, (예를 들면, 바람직하게는 증가하는 농도 구배로 적용되는 염 구배를 사용하는) 후속적인 용출 또는 세척 단계 동안, 본 발명은 에타너셉트계 혼합물(여기서, 에타너셉트계 혼합물 안에 함유된 에타너셉트는 대부분 정확하게 폴딩되어 있다)은 수지로부터 배출(즉, 용출)되도록 하면서, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트는 실질적으로 혼합 모드 수지에 결합되거나 포획되도록 함으로써; 수지로부터 용출된 물질에서 (수지에 초기에 도입되고 결합된 에타너셉트-함유 단백질 샘플에 존재하는 이의 보다 낮은 비율과 비교하여) 매우 높은 비율의 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 수득할 수 있다. 본 발명의 혼합 모드 크로마토그래피의 물리적 작동 측면에서, 혼합 모드 수지는, 수지를 함유할 수 있고, 유체 용액이 컬럼의 한쪽 말단으로 들어와 유동하여 수지와 접촉한 다음, 용기의 반대쪽 말단으로 빠져나가 추가의 분석 또는 가공을 위해 수집되거나 폐기되도록 하는 입구 및 출구 수단을 갖는, 경질 원주형 용기 수단(containment mean) 또는 용기(vessel)에 함유(즉, 팩킹)될 수 있다.

상기한 방법의 단계 (a)에 사용된 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 단백질 혼합물을 함유하는 용액은, 포유류 세포 배양물, 예를 들면, CHO 세포에서의 에타너셉트 단백질의 발현으로부터 공지된 방식으로 수득될 수 있다. 본 발명에서 혼합 모드 크로마토그래피 정제 전에, 포유류 발현으로부터 수확된 단백질(수확 세포 배양액)을 단백질 A 친화성 정제와 같은 초기 정제 단계에 적용하여 불순물을 제거할 수 있다. 이러한 단계가 비-에타너셉트계 불순물을 제거하는데 바람직할 수 있지만, 이러한 정제는 일반적으로 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 인지 가능한 정도로 분리(즉, 분해)하지는 못할 것이다. 따라서, 그후 단백질 A 풀(pool)을 본 발명의 혼합 모드 방법에 적용하여 이러한 분리를 달성한다.

본 발명의 방법은 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 상업적으로 유용한 회수(수율)를 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 방법의 단계 (a)에서 사용되는 정확하게 및 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 에타너셉트계 단백질 용액이 바람직하게는 단백질 A 컬럼에서 에타너셉트의 포유류 발현 생성물을 정제함에 의해 수득되는 단백질 A 크로마토그래피 산출물(output)의 형태로 제공되는 경우에, 단백질 A 정제 단계에서 회수되는 물질의 양은 바람직하게는 단백질 A 컬럼에 도입되는 수확 세포 배양물에 존재하는 에타너셉트계 발현 생성물의 적어도 약 80wt%, 바람직하게는 적어도 약 85wt%이다(여기서, 수확 세포 배양물에 존재하는 에타너셉트계 단백질의 양은 Fc Elisa에 의해 구할 수 있고, 단백질 A 용출 풀에서 수득되는 에타너셉트계 단백질의 양은 A280nm에서 UV 흡광도에 의해 구할 수 있다). 후속적으로, 본 발명의 혼합 모드 크로마토그래피가 상기한 단백질 A-정제된 물질을 사용하여 수행되는 경우, 본 발명의 단계 (b)의 용출에서 수득되는 에타너셉트계 단백질 물질의 양은 바람직하게는 본 발명의 단계 (a)에서 혼합 모드 수지에 도입된 에타너셉트계 물질의 양의 적어도 약 60wt%, 바람직하게는 적어도 약 70wt%이다.

따라서, 정확하게 폴딩된 에타너셉트가 매우 풍부한(즉, 용출물의 10wt% 이하, 바람직하게는 약 5wt% 이하의 미스폴딩된 물질을 함유한) 이의 단계 (b)의 혼합 모드 용출물 중의 매우 순수한 에타너셉트 혼합물의 전체 수율은, 어디서나 이의 정제(예를 들면, 단백질 A 정제) 전에 수확 세포 배양액에 원래 존재하는 에타너셉트계 혼합물의 약 30 내지 약 50wt%일 수 있다.

수확 세포 배양액의 정제는 또한, 기타의 크로마토그래피 수단, 예를 들면, 이온 교환 모이어티들과 소수성 상호작용 모이어티들 둘 다를 갖는 크로마토그래피 수지를 사용하는 혼합 모드 크로마토그래피에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 추가의 여과 단계(예를 들면, 바이러스 여과, 및 접선 유동 여과)가 상기한 혼합 모드 크로마토그래피 방법의 단계 (b)에서 제조된 용출물을 추가로 가공하기 위해 공지된 방식으로 수행될 수 있다.

본 발명은 소정의 단백질의 부정확하게 폴딩된 형태(응집물 포함)로부터의 정확하게 폴딩된 형태의 분리, 및 특히, 에타너셉트계 화학종의 매우 불균질한 혼합물을 포함하는 포유류 세포 배양 수확물로부터 수득된 미스폴딩된(및 응집된) 에타너셉트로부터의 제대로 폴딩된 에타너셉트의 분해를 위한 대단히 개선된 분리방법을 제공한다.

도 1은 Capto-MMC 및 Capto-Adhere 혼합 모드 수지의 화학 구조를 도시한다.
도 2a(단백질 A로부터의 용출 프로파일)는 1M 아르기닌을 함유하는 제시된 pH에서의 0.1M 시트레이트에 의한 용출을 사용한 정확하게 폴딩된 에타너셉트 단백질과 미스폴딩된 에타너셉트 단백질 둘 다를 포함하는 CHO 수확 배양물의 단백질-A로부터의 용출 프로파일을 도시한다. 연속 곡선(solid curve)은 UVabso 흡광도이고; 점선 곡선은 전도율이다(하기 도면에서도 동일함).
도 2b(단백질 A로부터의 용출 프로파일)는 단백질-A로부터 용출된 샘플에 대한 Native-PAGE 결과를 도시하며, 여기서, 레인(lane)-1은 표준물(시판 Enbrel)이고; 레인-2는 로드(Load)이고; 레인-3은 FT(flow-through)이고; 레인-4, pH 6.0; 레인-5, pH 4.2; 레인-6, pH 3.7; 레인-7, pH 3.0이다.
도 3a(Capto MMC로부터의 단백질 A 풀의 용출 프로파일)는 10mM 포스페이트, pH 7.5에서 NaCl 또는 아르기닌에 의한 용출의 CAPTO MMC 크로마토그램을 도시한다.
도 3b(Capto MMC로부터의 단백질 A 풀의 용출 프로파일)는 용출된 샘플의 SDS-PAGE 및 native-PAGE를 도시하며, 여기서, 레인-0, 표준물; 레인-1, 로드; 레인-2, FT; 레인-3, 0.15M NaCl; 레인-4, 0.3M NaCl; 레인-5, 1M 아르기닌이다.
도 4a(Capto MMC로부터의 단백질 A 풀의 용출 프로파일)는 pH 7.5에서 0 내지 0.5M NaCl 구배에 의한 용출의 크로마토그래프를 도시한다. 컬럼은 구배 용출(gradient elution) 전에 10mM 포스페이트, pH 7.5로 평형화시켰다.
도 4b(Capto MMC로부터의 단백질 A 풀의 용출 프로파일)는 용출된 샘플의 native-PAGE를 도시하며, 여기서, 레인-0, 표준물; 레인-1, 로드; 레인-2 내지 레인-8, 용출된 분획; 레인-9, 1M 아르기닌이다.
도 4c(Capto MMC로부터의 단백질 A 풀의 용출 프로파일)는 상이한 단백질 A 풀에 대한 용출된 샘플의 SDS-PATE 및 native-PAGE를 도시하며, 여기서, 레인-0, 표준물; 레인-1, 로드, 레인-2, FT; 레인-3 내지 레인-8, 용출된 분획; 레인-9, 1M 아르기닌이다.
도 5a(Capto-MMC로부터의 단백질-A 풀의 용출 프로파일) pH 7.5에서 0-0.4M Na₂S0₄ 구배에 의한 용출의 크로마토그램. 컬럼은 구배 용출 전에 10mM 포스페이트, pH 7.5로 평형화시켰다.
도 5b(Capto-MMC로부터의 단백질-A 풀의 용출 프로파일) 용출된 샘플의 SDS-PAGE 및 native-PAGE를 도시하며, 여기서, 레인-1, 로드; 레인-2, FT; 레인-3, 완충 세척액; 레인-4 내지 레인-9, 용출된 분획; 레인-10, 1M 아르기닌이다.
도 6은 Capto-MMC 용출된 분획의 HIC 분석을 도시한다.
도 7a(Capto-MMC로부터의 단백질-A 풀의 용출 프로파일)는 pH 및 염 구배에 의한 용출의 크로마토그램을 도시한다.
도 7b(Capto-MMC로부터의 단백질-A 풀의 용출 프로파일)는 용출된 샘플의 SDS-PAGE 및 native-PAGE를 도시하며, 여기서, 레인-0, 표준물; 레인-1, 로드; 레인-2 및 3, FT; 레인-4 내지 레인-8, 용출된 분획; 레인-9, 1M 아르기닌이다.
도 8a(Capto-MMC로부터의 단백질-A 풀의 용출 프로파일)는 pH 및 Na₂S0₄ 구배에 의한 용출의 크로마토그램을 도시한다.
도 8b(Capto-MMC로부터의 단백질-A 풀의 용출 프로파일)는 용출된 샘플의 SDS-PAGE 및 native-PAGE를 도시하며, 여기서, 레인-0, 표준물; 레인-1, 로드; 레인-2, FT; 레인-3 내지 레인-5, 용출된 분획; 레인-6, 1M 아르기닌이다.
도 9는 Capto-Adhere로부터의 단백질-A 풀의 Native-PAGE를 도시하며, 여기서, 레인-0, 표준물; 레인-1, 로드; 레인-2, 5mM 시트레이트(pH 4.5); 레인-3 및 4, 0.1M 아르기닌(pH 4.5); 레인-5, 0.5M 아르기닌이다. 관찰된 저분자량 화학종이 박스로 표시되어 있다.
도 10a(Capto-Adhere로부터의 단백질-A 풀의 용출 프로파일)는 pH 및 아르기닌 구배에 의한 용출의 크로마토그램을 도시한다.
도 10b(Capto-Adhere로부터의 단백질-A 풀의 용출 프로파일)는 용출된 샘플의 SDS-PAGE 및 native-PAGE를 도시하며, 여기서, 레인-0, 표준물; 레인-1, 로드; 레인-2 내지 레인-4, FT; 레인-5 내지 레인-7, 용출된 분획; 레인-8, 0.5M 아르기닌이다.
도 11a(Capto-Adhere로부터의 단백질-A 풀의 용출 프로파일)는 pH 및 아르기닌 구배에 의한 용출의 크로마토그램을 도시한다.
도 11b(Capto-Adhere로부터의 단백질-A 풀의 용출 프로파일)는 용출된 샘플의 native-PAGE를 도시하며, 여기서, 레인-0, 표준물; 레인-1, 로드; 레인-2, FT; 레인-3 내지 레인-5, 용출된 분획; 레인-6, 1M 아르기닌이다.
도 12는 실시예 12의 단계 3B에서 수득된 Capto-Adhere 혼합 모드 수지 용출 분획(여기서, 로딩 샘플은 실시예 12의 단계 3A에서 수득된 물질이다)의 HIC(소수성 상호작용 크로마토그래피) 분석의 개략적 도식이다. 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 퍼센트가 수직 축에 나타내어져 있고, 시간 경과에 따른 염 구배의 적용이 수평 축에 나타내어져 있다. 구배시 초기에 수득되는 용출 분획은 100% 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 함유한다.
도 13(Capto-Adhere로부터의 Capto-MMC 풀의 용출 프로파일)은 용출된 샘플의 SDS 및 Native-PAGE를 도시한다. 용출은 pH 7.5에서 아르기닌 구배로 수행하였으며, 여기서, 레인-0, 표준물; 레인-1, 로드; 레인-2 및 3, FT; 레인-4 내지 레인-7, 용출된 분획; 레인-8, 1M 아르기닌이다.
도 14는 Capto-Adhere로부터의 Capto-MMC 풀의 용출 크로마토그램이다. 용출은 pH 7.5에서 NaCl 구배에 의해 수행하였다.
도 15a(Capto-Adhere로부터의 Capto-MMC 풀의 용출 프로파일)는 pH 7.5에서 염/아르기닌 구배에 의한 용출의 크로마토그램을 도시한다.
도 15b(Capto-Adhere로부터의 Capto-MMC 풀의 용출 프로파일)는 용출된 샘플의 SDS-PAGE 및 native-PAGE를 도시하며, 여기서, 레인-0, 표준물; 레인-1, 로드; 레인-2, FT; 레인-3 내지 레인-6, 용출된 분획; 레인-7, 1M 아르기닌이다.
도 16은 실시예 12에서 제조된 에타너셉트 물질에 상응하는 HIC 크로마토그램이며, 여기서, 본질적으로 어떠한 보다 작은 2차 피크(미스폴딩된 물질)도 나타내지 않는 플롯은 본 발명(실시예 12)에 따라 제조된 물질에 상응하고; 비교 목적으로 제공된, 시판 에타너셉트에 상응하는 도면 상의 추가의 곡선은, 미스폴딩된 및/또는 응집된 물질을 나타내는 2차 미량 피크를 나타내는 것으로 보인다.

본 발명은, 이온 교환 및 소수성 인력 원리 둘 다를 사용하는 혼합 모드 수지, 예를 들면, Capto^TM MMC 및 Capto^TM Adhere가 소정의 단백질 분석물에 결합하여 부정확하게 폴딩된 형태에 비해 정확하게 폴딩된 형태를 우선적으로(즉, 선택적으로) 용출시키는데 사용될 수 있다는 본 발명에서의 발견을 전제로 한다. 상기한 혼합 모드 수지 둘 다는 단백질 분석물을 끌어당겨 결합하기 위한 두 가지 상이한 모드, 즉, 이온 교환 인력 및 소수성 상호작용을 제공하는 모이어티들(즉, 화학 그룹들)를 갖는 리간드들을 포함한다.

정의

본 명세서에 사용되는 용어들은 일반적으로, 본 발명의 문맥 내에서 그리고 각 용어가 사용되는 구체적인 문맥 내에서 당업계의 통상적인 의미를 갖는다. 본 발명을 기재하는데 사용되는 특정 용어들은 본 발명의 기술내용에 관해 전문가에게 추가의 안내를 제공하기 위해 아래에 또는 달리 명세서에 논의되어 있다. 특정 용어들에 대해 동의어가 제공되어 있다. 하나 이상의 동의어들의 재인용은 다른 동의어들의 사용을 배제하지 않는다. 본원에 논의된 모든 용어들의 예를 포함한 본 명세서 어디에서의 예의 사용은 단지 예시적인 것이며, 본 발명의 또는 예시된 용어의 범위 및 의미를 어떠한 방식으로든 제한하는 것은 아니다. 본 발명은 본 명세서에 제공된 다양한 양태들로 제한되지 않는다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충할 경우에는, 정의를 포함한 본 문서가 제어할 것이다.

"..쯤(around)", "약(about)" 또는 "대략(approximately)"은 일반적으로, 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 10% 이내, 5, 4, 3, 2 또는 1% 이내를 의미해야 한다. 제공된 수치 양은 근사치이며, 용어 "..쯤(around)", "약(about)" 또는 "대략(approximately)"은, 명백히 나타내어져 있지 않다면, 유추할 수 있음을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "에타너셉트"는 Enbrel^®의 상업적 제형에 함유된 활성 성분, 즉, 사람 면역글로불린 G("IgG1")의 Fc 부분[단편, 결정화 가능]에 연결된 사람 75 킬로달톤(p75) 종양 괴저 인자 수용체(TNFR)의 세포외 리간드-결합 부분으로 이루어진 융합 폴리펩타이드의 동종이량체를 의미한다. 에타너셉트는 상기한 바와 같은 75 킬로달톤 TNFR:Fc 분자의 두 개의 쇄가 Fc 부분의 힌지 영역에서 디설파이드 결합(linkage)에 의해 연결되어 있다는 점에서 동종이량체이다. 에타너셉트는 934개의 아미노산으로 이루어지고, 대략 150 킬로달톤의 겉보기 분자량을 가지며, 이의 Fc 성분은 불변 중쇄 2(CH2) 도메인, 불변 중쇄 3(CH3) 도메인 및 힌지 영역을 함유하지만, 사람 IgG1의 불변 중쇄 1(CH1) 도메인은 함유하지 않는다. 본 출원의 목적을 위해, 용어 "에타너셉트"는 또한, 상기한 바와 같은 폴리펩타이드의 기능에는 상당한 영향을 미치지 않는 아미노산 구조에 있어서의 사소한 변형(아미노산의 결손, 부가 및/또는 치환을 포함함)을 갖는 에타너셉트를 포함할 수 있다. 용어 에타너셉트는 또한, 에타너셉트의 소위 바이오시밀러(biosimilar) 또는 바이오베터(biobetter) 이형태인 것으로 의도하거나 고려하는 단백질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본원에서 사용되는 용어 "정확하게 폴딩된 에타너셉트"는, Enbrel^®에서 활성 성분의 형태 및 생물학적 활성과 동일하거나 실질적으로 동일한 TNF의 억제를 위한 생물학적 활성 및 형태를 갖는 에타너셉트 동종이량체(위에 정의된 바와 같음)의 폴딩 형태를 나타내는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 용어 "부정확하게 폴딩된 에타너셉트"는 다음을 포함하는 것으로 의도된다: (i) 에타너셉트(위에 정의된 바와 같음)와 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와는 상이한 형태를 갖는 동종이량체성 단백질(여기서, 상기 상이한 형태는 단백질이 TNF 억제제로서의 생물학적 활성이 부족하거나 실질적으로 부족하게 만든다); 및/또는 (ii) 둘 이상의 정확하게 및/또는 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 동종이량체가 정확하게 폴딩된 에타너셉트보다 높은 분자량을 갖는 화학종을 형성하도록 하는 방식으로 회합(즉, 응집 또는 클럼핑)되어 있는 응집물; 및/또는 (iii) (i)과 (ii)와의 혼합물; 및/또는 (iv) 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 동일하거나 본질적으로 동일한 서열 또는 이의 일부를 포함하지만, 정확하게 폴딩된 에타너셉트에 비해 (보다 큰 소수성으로 인해) HIC 컬럼 상에서 감소된 용출 위치를 나타내는, 응집된, 즉, 클럼핑된 단백질 조성물.

용어 "치료"는 포유동물에서 질환에 대한 치료약의 임의의 투여 또는 적용을 나타내며, (예를 들면, 퇴행을 야기하거나, 상실하거나 없어지거나 결함이 있는 기능을 회복 또는 복구시킴으로써) 질환을 억제시키고, 이의 발병을 막고, 질환을 완화시키거나, 비효율적인 프로세스를 자극함을 포함한다. 상기 용어는 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하고, 포유동물에서 병리학적 상태 또는 장애의 임의의 치료를 포괄함을 포함한다. 상기 효과는 장애 또는 이의 증상을 전부 또는 일부 예방하는 측면에서 예방학적일 수 있고/있거나, 장애 및/또는 장애에 기인할 수 있는 부작용에 대한 부분적인 또는 완전한 치유의 측면에서 치료학적일 수 있다. 이것은 (1) 장애에 걸리기 쉬울 수 있지만 증상이 있는 것은 아닌 대상체에서 장애가 발생하거나 재발하는 것을 예방하거나, (2) 장애의 발병을 막는 것과 같이 장애를 억제시키거나, (3) 예를 들면, 상실하거나 없어지거나 결함이 있는 기능을 회복 또는 복구시키거나, 비효율적인 프로세스를 자극함으로써 장애 또는 이의 증상의 퇴행을 야기하는 것과 같이 숙주가 더 이상 장애 또는 이의 증상을 앓지 않도록 장애 또는 적어도 이와 관련된 증상을 정지 또는 중단시키거나, (4) 장애 또는 이와 관련된 증상들을 완화, 경감 또는 개량시킴(여기서, 개량은 넓은 의미에서 적어도 염증, 통증 및/또는 종양 크기와 같은 파라미터의 크기에 있어서의 감소를 나타내는데 사용된다)을 포함한다.

용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 비독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 재료, 제형화 조제, 또는 임의의 통상의 유형의 부형제를 나타낸다. 약제학적으로 허용되는 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 제형의 다른 성분들과 상용성이다.

용어 "조성물" 또는 "제형"은 당업계에서 통상적이고 치료적, 진단적 또는 예방적 목적을 위해 대상체에게 투여하기에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 같은 담체를 통상적으로 함유하는 혼합물을 나타낸다. 이것은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 세포에 또는 배양 배지에 존재하는 세포 배양물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 경구 투여용 조성물은 용제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 서방출 제형, 구강 세정제(oral rinse) 또는 산제를 형성할 수 있다.

본 발명은 소정의 단백질의 부정확하게 폴딩된 형태로부터 정확하게 폴딩된 형태를 분리하는데 적합하다. 본 발명의 방법에 따라 가공될 수 있는 단백질의 예는 G-CSF, IGF, 인슐린, 성장 호르몬 등과 같이 재폴딩을 필요로 하는 디설파이드-함유 단백질 뿐만 아니라 조작된 항체, 예를 들면, 단쇄 가변 도메인 항체 단편을 포함한다.

본 발명의 혼합 모드 크로마토그래피 방법에 따라 정제하기에 적합한 에타너셉트는, 항체의 경우에는 하이브리도마와 같은 에타너셉트를 발현하는 살아있는 숙주 세포에 의해, 또는 융합 폴리펩타이드 또는 항체의 경우에는 폴리펩타이드를 생성하도록 유전 조작된 숙주 세포에 의해 생성될 수 있다. 폴리펩타이드를 생성하도록 세포를 유전 조작하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다[예를 들면, 문헌(참조: Ausubel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York)]. 이러한 방법은 폴리펩타이드를 암호화하여 발현되도록 하는 핵산을 살아있는 숙주 세포에 도입함을 포함한다. 이러한 숙주 세포는 세균 세포, 진균 세포, 또는 바람직하게는, 배양물에서 성장하는 동물 세포일 수 있다. 세균 숙주 세포는 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 이, 콜라이 균주의 예는 다음을 포함한다: HB101, DHS.alpha, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539, 및 외래성 DNA를 절단하지 못한 임의의 이. 콜라이 균주. 사용될 수 있는 진균 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 아스퍼질러스 세포(Aspergillus cell)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 동물 세포주의 몇가지 예는 CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, 및 W138이다. 새로운 동물 세포주를 당업계의 숙련가들에 의해 널리 공지된 방법을 사용하여(예를 들면, 형질전환, 세균 감염 및/또는 선택에 의해) 확립할 수 있다. 임의로, 에타너셉트는 숙주 세포에 의해 배지로 분비될 수 있다.

미스폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 혼합 모드 크로마토그래피 분리 전에, 발현된 에타너셉트의 정제를 표준 방법에 의해 수행할 수 있다. 에타너셉트가 세포내 생산되는 경우, 미립자 부스러기를, 예를 들면, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 에타너셉트가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 먼저 표준 폴리펩타이드 농축 필터를 사용하여 농축시킬 수 있다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제를 또한 가할 수 있고, 미생물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.

에타너셉트는, 예를 들면, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피, 및 단백질 A 크로마토그래피, 이온-교환 컬럼에서의 분별화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSET® 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 크로마토그래피(예를 들면, 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공지되거나 아직 발견되지 않은 정제 기술의 임의의 조합을 사용하여 정제할 수 있다.

매우 일반적인 측면에서, 에타너셉트(이에 제한되지 않음)에 적용되는 바와 같이, 본 발명은, (a) 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 둘 다를 갖는 에타너셉트계 단백질 혼합물을 함유하는 용액을, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트가 수지에 결합되도록 할 수 있는 조건하에서 이온 교환 모이어티들 뿐만 아니라 소수성 상호작용 모이어티들로 기능화된 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 도입하는 단계; 및 그후, (b) 생성된 용출물이 단계 (a)에서 도입된 단백질 용액보다 더 높은 비율의 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 갖도록 수지로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 용출시킬 수 있는 용출 배지로 수지를 세척하는 단계를 포함하는 단백질 분리방법을 제공한다.

임의로, 상기 방법은, CHO 세포 배양물과 같은 포유류 세포 배양물에서 에타너셉트를 발현시킨 다음, 발현 생성물을, 예를 들면, 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제하는 예비 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 그 결과 단백질 A 생성물 산출물이 본 발명의 단계 (a)에서 사용되는 단백질 용액이 된다. 본 발명의 방법은 포유류 발현 및 본 발명의 단계 (a)에서 사용하기 위한 출발 용액을 야기하는 단백질 A 단계가 소정의 제조 현장에서 첫번째 엔티티(first entity)로 수행될 수 있도록 하는 방식으로 실시될 수 있지만, 본 발명의 혼합 모드 분리의 방법은 동일하거나 상이한 제조 현장에서 동일하거나 상이한 엔티티로 수행될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

단계 (a)를 위한 조건 - CAPTO MMC 혼합 모드 수지에의 결합. 본 발명의 단계 (a)에서, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단백질 용액은 CAPTO MMC 혼합 모드 수지에 결합시키기 위해 약 4 내지 약 8의 pH에서, 바람직하게는 약 4 내지 약 6의 pH에서 CAPTO MMC 혼합 모드 수지에 도입되어야 한다. 또는, CAPTO ADHERE 혼합 모드 수지가 사용되는 경우, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단계 (a)의 단백질 용액은 CAPTO ADHERE 혼합 모드 수지에 결합시키기 위해 약 6 내지 약 8.5의 pH에서, 바람직하게는 약 7 내지 약 8의 pH에서 CAPTO ADHERE 혼합 모드 수지에 도입되어야 한다.

단계 (b)를 위한 조건 - 혼합 모드 수지로부터의 용출. 단계 (b)에서, 용출 배지는 소정 농도의 염을 포함하며, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트에 비해 정확하게 폴딩된 에타너셉트 단백질의 우선적인 용출에 효과적인 소정의 방식으로 컬럼에 적용된다. 일반적으로 말해서, 용출물이 정확하게 폴딩된 에타너셉트 대 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 보다 높은 비를 함유해야 하지만, 염 용액 및 수지에의 이의 적용 방식은, 바람직하게는 단계 (b)의 용출물에서 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양이 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양을 크게 초과하도록 선택된다. 초기 용출된 분획은 본질적으로 100% 정확하게 폴딩된 단백질을 함유할 수 있다. 염 용액 용출 단계는 구배를 통해서와 같이 염 용액의 몰 농도를 변화(증가)시킴에 의해 달성될 수 있다. 구배는 단계적으로 달성될 수 있지만, 연속 선형인 것이 바람직하다. 바람직한 양태에서, 염 용액은 염화나트륨("NaCl")을 함유한다. NaCl 선형 구배는 약 0 내지 약 1M일 수 있다.

대안적인 양태에서, 염 용액은 황산나트륨("Na₂S0₄")을 함유할 수 있다. Na₂S0₄ 용액은 또한 단계적으로 또는 선형 구배로, 바람직하게는 선형으로, 가장 바람직하게는 약 0 내지 약 1molar의 농도 구배로 적용될 수 있다.

에타너셉트는 CHO 세포에서 배양함으로써 수득될 수 있다.

바람직한 양태에서, 염 용액은 NaCl을 포함한다.

하기 과정들은 발현 생성물의 발현, 정제, 및 본 발명의 혼합 모드 크로마토그래피 방법으로부터 수득된 에타너셉트-함유 용출물의 분석을 위해 뒤따른다:

에타너셉트의 발현. 에타너셉트는 C-말단에서 사람 Fc에 융합된 사람 TNFR 세포외 도메인에 대해 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합 CHO 세포의 조건 배지(conditioned media; "CM")에서 발현된다. 에타너셉트의 포유류 발현에 대한 당업계의 예는 인용에 의해 본원에 포함된 하기 미국 특허들에서 찾아볼 수 있다: 제RE 36755호; 미국 특허 제5,605,690호; 제EP 464,533호; 제EP 417,563호; 미국 특허 제8.063,182호; 및 미국 특허 제7,294,481호.

단백질 A 크로마토그래피. 상기 수득된 CM을 1ml HiTrap r단백질 A 컬럼(제조원: GE Healthcare)을 갖는 단백질 A 컬럼을 사용하여 가공하고, 10mM 포스페이트, 0.1M NaCl, pH 7.0 용액으로 평형화시켰다. 컬럼을 1M 아르기닌-하이드로클로라이드("아르기닌"), 0.1M 시트레이트, pH 6.0 용액으로 세척한 후, 결합된 단백질을 1M 아르기닌 및 0.1M 시트레이트를 함유하는 pH 4.2, 3.7 및 3.0으로 단계적으로 용출시켰다. 또는, 컬럼을 0.1M 시트레이트를 갖는 하향 pH에서 아르기닌 없이 가공할 수 있다. 아르기닌의 부재시, 대부분의 에타너셉트는 3.85의 pH에서 용출되어 오염물 뿐만 아니라 이 pH 미만에서 용출되는 부정확하게 폴딩된 에타너셉트, 에타너셉트의 단편, 에타너셉트의 응집물 등을 포함한 용출물을 제공하였다. 그후, 단백질 A 용출물을 아래 실시예에 기재된 바와 같이 HiTrap 컬럼(제조원: GE Healthcare)에서 Capto^TM MMC 또는 Capto^TM Adhere에 적용한다.

단백질 A 용출물의 분석. 상기 수득된 단백질 A 용출물의 분석은 도 2a 및 2B에 도시되어 있다. 도 2a는 1M 아르기닌을 함유하는 저 pH 완충액을 사용한 단백질-A로부터의 용출 프로파일을 도시한다. 큰 UV 흡광도 피크가 pH 6.0에서 관찰되었으며(6.0으로 표시된 피크), native-PAGE(레인-1)에 의해 실험된 바와 같이 시판 에타너셉트에 상응하는 밴드는 함유하지 않았다(도 2b, 레인-4): 어떠한 에타너셉트도 단백질-A 컬럼을 통해 유동하지 않았음을 주지한다(레인-2 및 3 비교). 어떠한 단백질 밴드도 pH 6.0에서 관찰되지 않았지만(레인-4), 관찰된 큰 UV 흡광도는 안료의 용출을 나타낸다. 베이스라인 흡광도에 도달한 후(도 2a), 컬럼을 그후 0.1M 아르기닌, 0.1M 시트레이트, pH 4.2에서 용출시켰으며, 첨예한 용출 피크가 야기되었다(도 2a, 4.2로 표시됨). 이러한 피크의 Native-PAGE 분석 결과, 스미어링 저 이동성 밴드들(smearing low mobility bands)과 함께 에타너셉트의 강한 밴드를 나타내었다(레인-5). 용출된 단백질의 HIC 분석 결과, 2개의 피크를 나타내었으며, 첫번째 피크는 시판 에타너셉트의 주 피크에 상응하고, 두번째 피크는 시판 에타너셉트에 또한 존재하는 미량 화학종에 상응한다. 두번째 피크의 특성이 명확하지는 않지만, 이것이 단백질-A에 결합되고, 따라서, Fc 도메인을 함유하기 때문에, 에타너셉트의 미스폴딩된 화학종인 것으로 보인다. 남은 결합된 단백질은 pH 3.7 및 그후 3.0에서 용출시켰으며, 이들 둘 다는 1M 아르기닌을 함유한다. 이러한 낮은 pH 용매는 도 2a에 도시된 바와 같이 작은 피크의 용출을 야기한다(3.7 및 3.0). pH 3.7 피크는 소량의 에타너셉트를 함유하는 반면(레인-6), pH 3.0 피크는 미스폴딩된 화학종 뿐만 아니라 응집될 수도 있는 화학종에 상응하는 저 이동성 화학종을 주로 함유하였다(레인-7). 유사한 용출 패턴은 아르기닌의 부재시 관찰되었다. 에타너셉트를 용출시키는데 보다 낮은 pH, 예를 들면, pH 3.85가 필요하였으며, pH에 있어서의 추가의 감소는 저 이동성 화학종의 용출을 초래하였다. 이러한 저 이동성 화학종이 단백질-A에 결합된다는 사실은, 이들이 또한 Fc-융합 단백질이었음을 의미한다. 이러한 화학종은 에타너셉트보다 더 낮은 pH에서 용출되기 때문에, 이들은 단백질-A에 보다 단단히 결합되었다. 이러한 분석은, 분석적 HIC에 의해 분석되는 바와 같이, 재조합 CHO 세포에서의 에타너셉트의 발현이 정확하게 폴딩된 화학종에 상응하는 비손상(정확하게 폴딩된) 에타너셉트, 및 부정확하게 미스폴딩된 화학종에 상응하는 저 이동성 화학종 둘 다를 야기함을 확인시켜 준다. 미스폴딩된 화학종은 HIC에서 나중에 용출되기 때문에, 이것은 비손상 에타너셉트보다 더 소수성이다. CHO 클론 및 발효 조건에 따라, 정확하게 폴딩된 화학종의 양은 단백질 A 용출물의 40 내지 60wt%로 다양하였다. 하기 실시예에서는, 미스폴딩된 화학종으로부터 폴딩된 화학종을 분리하기 위한 혼합 모드 크로마토그래피의 성능(capacity)이 평가된다.

분석 방법.

단백질 A, Capto^TM MMC 및 Capto^TM Adhere 조성물로부터의 용출된 분획은 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 변성 SEC(dSEC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 native-PAGE와 같은 당업계에 널리 공지된 각종 기술을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피의 기술은 문헌[참조: Hawe et al, Pharm. Res. 2011, 28: 2302 and/or van Marrschalkerweerd et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 2011, 78: 213]에 기재되어 있다.

SDS-PAGE. 예를 들면, 단백질 A, Capto^TM MMC 및 Capto^TM Adhere로부터의 용출된 분획은 나트륨 도데실설페이트 또는 비손상 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(각각 SDS-PAGE 또는 native-PAGE)에 의해 분석할 수 있다. SDS-PAGE 및 native-PAGE 둘 다는 6% 트리스-글리신 겔(제조원: Life Technology)을 사용하여 수행하였다. SDS-PAGE는 디설파이트-결합된 응집물이 관찰될 수 있도록 비-환원 조건하에서 수행할 수 있다.

크기 배제 크로마토그래피. 본 발명의 혼합 모드 크로마토그래피 방법을 사용하여 수득된 용출물 분획은 분석물을 크기에 의해 분리하는 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC") 방법인 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 널리 공지된 기술을 사용하여 분석할 수 있다[문헌 참조: Rogner, M. (2000). Size Exclusion Chromatography. Protein Liquid Chromatography. M. kastner. Amsterdam, Elsevier. 61: 89-145.]. 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, 이동상 완충액은 50mM 인산나트륨 일염기성 일수화물 및 150mM 아르기닌을 함유하도록 제조할 수 있다. pH는 1M HC1을 사용하여 6.5로 조절한다. 분리는 Tosoh TSK-Gel G4000 SWxl 7.8mm × 30cm(cat. no. 8542)에 직선으로 부착된 Tosoh TSK-Gel SWxl 6mm × 4cm 가드 컬럼(cat. no. 8543)을 사용하여 수행할 수 있다. 분리를 수행하기 위해, 컬럼을 실온(23℃)으로 되게 하고, 0.5mL/min의 유량에서 이동상으로 평형화시킨다. 에타너셉트를 포함하는 50mg/mL의 용액 5㎕를 자동샘플러를 사용하여 컬럼에 주입한다. 분리는 약 0.5mL/분의 유량에서 약 30분에 걸쳐 달성될 수 있다. 컬럼 용출물을 이 시간 동안 280nm의 파장에서 모니터링하였다. 통합은 Chromeleon 소프트웨어(Dionex)를 사용하여 수행할 수 있다. 통합 전에, 에타너셉트를 함유하지 않는 완충액에 대한 SEC 크로마토그램을 모든 크로마토그램으로부터 공제한다. 모든 통합은 12분 내지 26분의 체류 시간 사이에 수행할 수 있다. 몇가지 파라미터를 사용하여 피크를 정의한다. 검출된 피크에 대한 최소 면적을 0.05mAu*min으로 설정한다. 피크 검출을 위한 이차원 감도는 0.01mAu 및 75초로 설정한다. 피크 숄더(peak shoulder)를 수동 통합 도구(manual integration tool)를 사용하여 수동으로 추가한다. 검출된 모든 피크는 2단계로 수동으로 조절한다. 첫째, 피크 베이스라인(피크의 바닥 경계선)을 수평으로 조절한다. 둘째, 피크 베이스라인의 수직 위치를 크로마토그램 베이스라인의 수직 위치로 조절한다. 크로마토그램 베이스라인 값은 분석물의 부재하에서의 신호로서 정의된다. 분석물의 부재하에서의 신호는 12분 체류 시간에서의 흡광도(mAu)로서 정의된다.

소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC). 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 분석은 1.8 내지 0M의 황산암모늄 구배를 사용하여 Butyl-Sepharose® 상에서 수행할 수 있다. HIC 크로마토그래피는 또한 미국 특허 제7,294,481호(제19단락, 49행-55행 참고)에 기재된 방식으로 수행할 수 있다. 미국 특허 제7,157,557호; 문헌[참조: Chen J, Tetrault J, Ley A. (2008) J Chromatogr A. 1 177, 272-81; Gagnon P. and Grund E.(1996) BioPharm, 9, 54-64; and Lu, Y., Williamson, B., and Gillespie, R. Recent advancement in application of hydrophobic interaction chromatography for aggregate removal in industrial purification process. Curr. Pharm. Biotech]를 또한 참고한다.

본 발명의 혼합 모드 크로마토그래피 방법에 따라 제조된 에타너셉트 제제의 HIC 분석에 관해, 인용에 의해 본원에 포함된 미국 특허 제7,294,481호의 도 4에 3개의 피크가 있는 에타너셉트 제제의 HIC 크로마토그램이 담겨 있음을 주지하며, 상기 3개의 피크 중에서 가장 큰 것('481 특허에서 "피크 2"로서 확인됨)은 제대로 폴딩된 에타너셉트 융합 단백질을 나타내는 것으로 기재된 반면; 보다 작은 피크('481 특허에서 "피크 3"으로서 확인됨)는 특허권자에 의해 "혼동된(scrambled)"(즉, 당해 논의에서 부정확하게 폴딩된과 동의어인 것으로 믿어진다) 에타너셉트 뿐만 아니라 응집된 에타너셉트를 함유하는 것으로 상정된다(미국 특허 제7,294,481호 제22단락, 13행-66행, 및 이의 도 5 참조). 본 발명의 상당한 잇점은 매우 고순도인 에타너셉트 함유 제제를 상업적으로 매력적인 수율로 제공할 수 있는 능력이며, 여기서 '481 특허의 도 4 및 도 5에 언급되고, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 것으로 본원에서 믿어지는 HIC 크로마토그램의 "피크 3"은 실질적으로 감소되거나 본질적으로 없어질 수 있다.

본 발명은 추가로, 에타너셉트의 약제학적 제형에 관한 것이며, 여기서, 이러한 제형에서 사용하기 위한 고순도 에타너셉트는 본 발명의 방법을 사용하여 수득된다. 본 발명의 제형은 또한 완충제, 장성 개질제, 부형제, 약제학적으로 허용되는 담체 및 약제학적 조성물의 기타의 통상적으로 사용되는 불활성 성분을 포함할 수 있다. 간소화를 위해, 이들은 본 출원의 후반에서 보다 상세하게 논의된다.

완충제는 pH를 목적하는 범위로 유지시킨다. 적합한 완충제는 히스티딘, 인산칼륨, 나트륨 또는 칼륨 시트레이트, 말레산, 암모늄 아세테이트, 트리스-(하이드록시메틸)-아미노메탄(트리스), 각종 형태의 아세테이트 및 디에탄올아민을 포함한다. 제형 중의 완충제의 농도는 바람직하게는 약 1mM 내지 약 1M, 보다 바람직하게는 약 10mM 내지 약 200mM이다. 완충제는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 공지된 방법으로 제조되고 시판 공급업체로부터 이용 가능하다.

적합한 완충제의 예는 포스페이트, 히스티딘, 시트레이트, 말레에이트, 타르트레이트, 석시네이트, 아세테이트, 트리스-(하이드록시메틸)-아미노메탄(트리스), 바이카보네이트이다.

바람직한 양태에서, 완충제는 인산나트륨이다.

바람직한 양태에서, 약제학적 조성물의 pH는 생리학적 수준이거나 그 부근이다. 따라서, 바람직하게는, 제공된 조성물의 pH는 약 5.8 내지 약 8.4; 보다 더 바람직하게는 약 6.2 내지 약 7.4이다. 당업계의 통상의 숙련가는 특정 제형에서 에타너셉트의 안정성 및 용해도를 최대화하기 위해 필요에 따라 pH를 조절할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 생리학적 범위를 벗어나지만 환자에게 허용 가능한 pH의 에타너셉트 제형 또한, 본 발명의 범위 내에 있다.

장성 개질제는 용액의 삼투압에 기여하는 분자이다. 약제학적 조성물의 삼투압은 바람직하게는 활성 성분의 안정성을 최대화하고/하거나 투여시 환자의 불편을 최소화하도록 조절된다. 약제학적 조성물이 혈청과 등장성이고, 즉, 동일하거나 유사한 삼투압을 갖는 것이 일반적으로 바람직하며, 이것은 장성 개질제의 첨가에 의해 달성된다.

바람직한 양태에서, 제공된 제형의 삼투압은 약 180 내지 약 420mOsM이다. 그러나, 삼투압은 특정 조건이 요구됨에 따라 보다 높거나 낮을 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

삼투압을 조절하는데 적합한 장성 개질제의 예는 아미노산(아르기닌은 포함하지 않음)(예를 들면, 시스테인, 히스티딘 및 글리신), 염(예를 들면, 염화나트륨, 염화칼륨 및 시트르산나트륨) 및/또는 당류/폴리올(예를 들면, 수크로즈, 글루코즈 및 만니톨)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

바람직한 장성 개질제는 글리신, 알라닌, 염화나트륨, 염화칼륨 및 황산나트륨이다.

바람직한 양태에서, 제형 중의 장성 개질제의 농도는 바람직하게는 약 1mM 내지 약 1M, 보다 바람직하게는 약 10mM 내지 약 200mM이다. 장성 개질제는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 공지된 방법으로 제조되고 시판 공급업체로부터 구입가능하다.

용액 속에서도(또한 건조된 형태 또는 동결된 형태에서도) 폴리펩타이드를 안정화시키는, 화학적 첨가제, 공-용질 또는 공-용매라고도 하는 부형제를 또한 약제학적 조성물에 가할 수 있다. 부형제는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 공지된 방법으로 제조되고 시판 공급업체로부터 구입가능하다.

적합한 부형제의 예는 당/폴리올, 예를 들면: 수크로즈, 락토즈, 글리세롤, 크실리톨, 소르비톨, 만니톨, 말토즈, 이노시톨, 트레할로즈, 글루코즈; 중합체, 예를 들면: 혈청 알부민(소 혈청 알부민(BSA), 사람 SA 또는 재조합 HA), 덱스트란, 폴리(비닐 알콜) PVA, 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈(HPMC), 폴리에틸렌이민, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 하이드록시에틸셀룰로즈(HEC); 비수성 용매, 예를 들면: PEG 및 글리세롤 및 디메틸포름아미드(DMF); 아미노산, 예를 들면: 프롤린, L-세린, 나트륨 글루탐산, 알라닌, 글리신, 리신 하이드로클로라이드, 사르코신 및 감마-아미노부티르산; 계면활성제, 예를 들면: Tween®-80(폴리소르베이트 80), Tween®-20(폴리소르베이트 20), SDS, 폴리소르베이트, 폴록사머; 및 여러 종류의 부형제, 예를 들면: 인산칼륨, 아세트산나트륨, 황산암모늄, 황산마그네슘, 황산나트륨, 트리메틸아민 N-옥사이드, 베타인, 금속 이온(예를 들면, 아연, 칼슘 및 마그네슘), CHAPS, 모노라우레이트, 2-O-베타-만노글리세레이트 또는 상기의 임의의 배합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

바람직한 부형제는 수크로즈, 락토즈, 글리세롤, 크실리톨, 소르비톨, 만니톨, 말토즈, 이노시톨, 트레할로즈, 글루코즈, 소 혈청 알부민(BSA), 사람 혈청 알부민(HSA), 재조합 알부민, 덱스트란, PVA, 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈(HPMC), 폴리에틸렌이민, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 하이드록시에틸셀룰로즈(HEC), PEG, 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 알라닌, 글리신, 리신 하이드로클로라이드, 사르코신, SDS, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴록사머 188, 트리메틸아민 N-옥사이드, 베타인, 아연 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, CHAPS, 수크로즈 모노라우레이트 및 2-O-베타-만노글리세레이트이다.

본 발명의 제형 중의 하나 이상의 부형제의 농도는 바람직하게는 약 0.001 내지 5중량%, 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 2중량%이다.

경우에 따라, 본 발명에 따라 제조된 에타너셉트 제제는 상업용 Enbrel가 최근에 공급되는 동일한 제형에서 사용될 수 있으며, 이러한 제형은 약 25 내지 약 75mg/ml의 제형을 포함하고, 수크로즈, 염화나트륨, L-아르기닌 하이드로클로라이드 및 인산나트륨을 추가로 포함한다.

또는, 본 발명에 따라 수득된 에타너셉트 제제는 아르기닌을 함유하지 않는 약제학적 제형으로 공급될 수 있으며; 예를 들면, 임의의 비-아르기닌 제형은 2011년 10월 18일 및 2012년 7월 9일자로 각각 출원된 맨니그 등(Manning et al.)의 미국 가특허원 제USSN 61/548,518호 및 제61/669480호에 기재되어 있으며, 이들 둘 다는 전문이 인용에 의해 본원에 포함된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 포유동물에게 투여함을 포함하여, 포유동물을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 포유동물은 에타너셉트에 의해 유리하게 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 갖는다.

바람직한 양태에서, 에타너셉트는 조성물로 치료하고자 하는 것과 동종의 포유동물로부터 유도된다.

바람직한 양태에서, 포유동물은 사람이다.

제공된 조성물로 치료될 수 있는 질환 또는 장애는 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 베게너병(육아종증), 크론병(또는 염증성 장 질환), 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), C형 간염, 자궁내막증, 천식, 악액질, 건선 및 아토피성 피부염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물로 치료될 수 있는 추가의 질환 또는 장애는 국제 공개공보 제WO 00/62790호, 제WO 01/62272호, 미국 특허 출원 제2001/0021380호 및 미국 특허 제7,648,702 B2호에 기재된 것들을 포함하며, 상기 문헌들의 관련 부분은 인용에 의해 본원에 포함된다.

제공된 약제학적 조성물은 전신 주사에 의해, 예를 들면, 정맥 주사에 의해; 또는 관련 부위로의 주사 또는 적용에 의해, 예를 들면, 부위가 수술시 노출되는 경우 부위로의 직접 주사 또는 직접 적용에 의해; 또는 국소 적용에 의해, 치료를 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 제공된 에타너셉트 조성물 중의 하나를 류마티스 관절염의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 포유동물에게 투여함을 포함하여, 류마티스 관절염을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.

제공된 조성물 중의 에타너셉트의 치료학적 유효량은 치료하고자 하는 상태, 상태의 중증도, 사전 치료법, 및 환자의 임상 병력 및 치료제에 대한 반응에 따라 좌우될 것이다. 적절한 용량은 이것이 한번에 또는 일련의 투여에 걸쳐 환자에게 투여될 수 있도록 담당의의 판단에 따라 조절할 수 있다.

하나의 양태에서, 성인 용량당 에타너셉트 유효량은 약 1 내지 500mg/㎡, 또는 약 1 내지 200mg/㎡, 또는 약 1 내지 40mg/㎡ 또는 약 5 내지 25mg/㎡이다.

또는, 플랫 용량(flat dose)을 투여할 수 있으며, 이의 양은 2 내지 500mg/용량, 2 내지 100mg/용량 또는 약 10 내지 80mg/용량에 이를 수 있다.

용량을 1주당 1회 이상 투여하고자 하는 경우, 예시적인 용량 범위는 상기한 용량 범위와 동일하거나 보다 낮으며, 바람직하게는 용량당 25 내지 100mg/용량의 범위로 1주당 2회 이상 투여된다.

또 다른 양태에서, 주사에 의한 투여를 위해 허용 가능한 용량은 80 내지 100mg/용량을 함유하거나, 대안적으로, 용량당 80mg을 함유한다.

용량은 매주, 격주 투여하거나, 수 주(예를 들면, 2 내지 8주)로 나누어 투여할 수 있다.

하나의 양태에서, 에타너셉트는 단일 피하(SC) 주사에 의해 25 내지 75mg/ml로 투여된다.

몇몇 예에서, 환자 상태의 개선은 약 100mg 이하 용량의 약제학적 조성물을 적어도 3주의 기간에 걸쳐 1주당 1 내지 3회 투여함으로써 수득될 것이다. 목적하는 정도의 개선을 유도하기 위해서는 장기간 동안의 치료가 필요할 수 있다. 불치의 만성 상태의 경우, 섭생을 무기한으로 지속할 수 있다. 소아 환자(4-17세)의 경우, 적합한 섭생은 0.4mg/kg 내지 5mg/kg 용량의 에타너셉트를 1주당 1회 이상 투여함을 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 약제학적 제형은 벌크 제형으로 제조할 수 있으며, 이로써, 약제학적 조성물의 성분들을 투여에 필요한 것보다 더 높게 조절하고, 투여 전에 적절하게 희석시킨다.

약제학적 조성물은 단독 치료제로서 또는 필요에 따라 추가의 치료제와 병용하여 투여할 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 제공된 치료 및/또는 예방 방법은 치료학적 유효량의 또 다른 활성제의 투여와 병용하여 사용된다. 다른 활성제는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하기 전에, 투여하는 동안 또는 투여한 후에 투여할 수 있다. 또 다른 활성제는 제공된 조성물의 일부로서, 또는 대안적으로, 별도의 제형으로서 투여할 수 있다.

제공된 약제학적 조성물의 투여는 비경구, 경구, 협측, 비강, 직장, 복강내, 피내, 경피, 피하, 정맥내, 동맥내, 심장내, 심실내, 두개내, 기관내, 경막내 투여, 근육내 주사, 유리체내 주사 및 국소 적용을 포함한 다양한 방식으로 달성될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여, 즉, 피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 뇌척수내, 관절내, 활액내 및/또는 경막내 투여에 특히 유용하다. 비경구 투여는 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해 수행될 수 있다. 주사용 약제학적 조성물은 방부제를 첨가한 채, 단위 투여 형태로, 예를 들면, 앰플로 또는 다중-용량 용기에 존재할 수 있다. 또한, 다수의 최신 약물 전달법이 개발되었으며, 본 발명의 약제학적 조성물은 이러한 신규한 방법들, 예를 들면, Inject-ease®, Genject®, 주사기 펜, 예를 들면, GenPen® 및 무침(needleless) 장치, 예를 들면, MediJector® 및 BioJector®를 사용한 투여에 적합하다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 아직 밝혀지지 않은 투여 방법들을 위해 채택될 수 있다[문헌 참조: Langer, 1990, Science, 249:1527-1533].

제공된 약제학적 조성물은 또한 데포트 제제로서 제형화될 수 있다. 이러한 지효성 제형은 이식(예를 들면, 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 제형을 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용 가능한 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지로, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들면, 난용성 염으로서 개질시킬 수 있다.

약제학적 조성물은, 경우에 따라, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 바이알, 팩 또는 디스펜서에 존재할 수 있다. 하나의 양태에서, 디스펜서 장치는 바로 주사하기 위한 단일 용량의 액체 제형을 갖는 시린지를 포함할 수 있다. 상기 시린지에는 투여 지침서가 첨부될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 수성 약제학적 조성물을 함유하는 키트 또는 용기에 관한 것이다. 수성 약제학적 조성물 중의 폴리펩타이드의 농도는 광범위한 범위에 걸쳐 변할 수 있지만, 일반적으로 수성 제형 ml당 약 0.05 내지 약 20,000㎍(㎍/ml)의 범위 이내이다. 키트에도 사용 지침서가 첨부될 수 있다.

본 발명은 그 안의 다수의 수정 및 변화가 당업계의 숙련가에게 자명하기 때문에 단지 예시적인 것으로서 의도되는 하기 실시예에 보다 특히 기재되어 있다. 부록 A는 본 발명의 추가의 대표적인 양태를 제공한다.

실시예 1

NaCl 용출을 사용한 Capto™ MMC 혼합 모드 정제

당해 실시예에서, 상기한 바와 같이 수득된 단백질 A 용출물을 Capto™ MMC 크로마토그래피에 적용한다. Capto™ MMC 컬럼을 5mM 시트레이트, pH 4.5 용액으로 평형화시킨다. 5mM 시트레이트로 단백질 A 용출물을 적절하게 희석(예를 들면, 단백질 A 단계의 용출 완충액에 따라 3 내지 6배 희석)시켜, 컬럼에 완전히 결합시킨다. SDS-PAGE 분석에서 나타내어지는 바와 같이, 로딩 샘플(pH 4.2, 단백질 A 용출물)은 매우 불균질하며, Capto™ MMC 컬럼을 통해 어떠한 단백질도 유동하지 않는다. 그후, 결합된 단백질을 10mM 포스페이트, pH 7.5 용액 중에서 0.15M NaCl로 용출시키며, 이것은 pH(4.5 내지 7.5) 및 NaCl 농도(0 내지 0.15M)에 있어서 동시 변화를 초래한다. 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 함유하는 첨예한 용출 피크가 용출물의 분석으로부터 관찰된다. 그러나, 회수율은 약 40 내지 50%이었다. 바로 앞에 기재된 바와 같은 용출 단계 후, 남은 결합된 단백질 물질을 함유하는 수지를 10mM 포스페이트, pH 7.5 용액 중에서 0.3M NaCl 및 1M 아르기닌과 접촉시켜, 주로 미스폴딩된 화학종 뿐만 아니라 디설파이트-결합된 응집물을 함유하는 용출을 야기한다. 당해 실시예는 Capto™ MMC가 정확하게 폴딩된 화학종으로부터 미스폴딩된 화학종을 분리하는데 효과적임을 입증한다. 미스폴딩된 화학종이 보다 높은 염 농도(0.3M 대 0.1M)에서 용출된다는 사실은 이들이 컬럼과의 보다 강한 정전기 상호작용을 가짐을 의미한다. 또한, 1M 아르기닌이 미스폴딩된 및 또한 응집된 단백질의 용출을 더욱 증가시키는데, 이것은 이들 단백질이 정전기 상호작용 뿐만 아니라 소수성 상호작용을 통해 Capto™ MMC에 결합되며, 아르기닌이 정전기 상호작용과 소수성 상호작용 둘 다의 붕괴를 증진시킴을 나타낸다. 당해 실시예에서 수득된 용출물 분획의 분석이 도 3a 및 3B에 나타내어져 있다.

실시예 2

NaCl 을 사용한 Capto ™ MMC 혼합 모드 정제

pH 7.5로 평형화된 수지

이전 실시예에서는, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단백질 용액을 초기에 pH 4.5에서 CAPTO MMC 수지와 접촉시켰다. 당해 실시예에서는, Capto™ MMC 컬럼을 먼저 10mM 포스페이트, pH 7.5 용액으로 평형화시킨 다음, NaCl에 이어 아르기닌으로 용출시키는 경우 실시예 1에서 관찰된 바와 유사한 용출이 관찰된다. 구체적으로, 이러한 pH 평형화 동안 어떠한 에타너셉트도 용출되지 않는다. 에타너셉트는 pH 7.5에서 음으로 하전되기 때문에 이러한 결과는 예상치 못한 것이며; 에타너셉트의 pI는 중질 당화(heavy glycosylation)로 인해 4.9 내지 5.4에 이른다. 따라서, pH 4.5에서 또는 그 미만에서, 에타너셉트는 양으로 하전되며, 이에 따라, 음으로 하전된 Capto™ MMC 리간드에 결합되지만, 소수성 상호작용이 결합에 기여할 수 있다. pH 7.5에서, 음으로 하전된 에타너셉트는 음으로 하전된 Capto™ MMC로부터 분리되어야 하지만, 이것은 발생하지 않는 것으로 밝혀졌다. 이것은 음으로 하전된 컬럼과 에타너셉트 간의 정전기 반발을 압도하는 에타너셉트와 Capto™ MMC 사이의 소수성 상호작용에 의해 설명될 수 있다. 또는, Capto™ MMC는 단백질 모이어티(단백질 모이어티의 pI는 ~8.1이다) 상의 국소 양전하에 결합함에 의해 결합된 단백질을 유지할 수 있다.

실시예 3

용출을 위해 NaCl 구배를 사용한 Capto ™ MMC 혼합 모드 정제

당해 실시예에서, 성공적인 용출은 NaCl 농도 구배를 사용하여 달성된다. 구체적으로, 컬럼을 10mM 포스페이트, pH 7.5 용액으로 세척한 후, 결합된 단백질을 0 내지 0.5M의 선형 염 구배로 용출시켰다. 로딩 샘플(pH 4.2 단백질 A 용출물)은 상기 경우에서와 같이 극도로 불균질하며(정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 둘 다를 함유함), 결합된 단백질은 NaCl 구배의 증가하는 이온 강도로 용출시킨다. 180분 후, 구배를 중단한 다음, 염 농도를 0.5M로 되게 하며, 이것이 약간 증진된 단백질 용출을 야기한다. 후속적인 분석에 의해 측정되는 바와 같이, 저 염 분획은 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 더 많이 함유하고, 고 염 분획은 저 이동성(미스폴딩된 및 응집된) 화학종이 풍부하였다. 마지막으로, 남은 단백질을 1M 아르기닌, 10mM 포스페이트, pH 7.5 용액으로 용출시킨다. 이러한 분획은 에타너셉트를 함유하지 않으며, 전적으로 저 이동성 (미스폴딩된/응집된) 화학종을 함유한다. 수지의 사전 평형 상태와 함께, 상이한 단백질 A 용출물에서의 Capto™ MMC의 NaCl 구배 용출의 사용은 정확하게 폴딩된 에타너셉트 측면에서 더욱 순수한 용출물을 야기한다. 용출 배지 중의 낮은 NaCl 농도에서, 용출된 샘플은 폴딩된 에타너셉트가 풍부하다. 상기한 염 구배가 수지에 적용됨에 따라 미스폴딩된 화학종이 용출물 중에 점진적으로 증가한다. 염 구배가 완료된 후, 수지를 1M 아르기닌 용액과 접촉시키며, 후속적인 SDS-PAGE 분석에서 자명한 바와 같이, 이로부터 생성된 용출물 분획은 미스폴딩된 화학종(미스폴딩된 화학종 뿐만 아니라 응집된 화학종 포함)을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 저 이동성 화학종 중의 일부는 SDS-PAGE 상에서 부정확하게 폴딩된(그러나 비-응집된) 에타너셉트인 것으로 믿어지며, 이것은 미스폴딩된 화학종의 일부가 정확하게 폴딩된 에타너셉트 동종이량체보다 native-PAGE 상에서 느린 이동성을 가진 미스폴딩된 에타너셉트 동종이량체로서 이동함을 나타낸다. 당해 실시예에서 수득된 용출물 분획의 분석이 도 4a, 4b 및 4c에 제공되어 있다.

실시예 4

용출을 위해 Na ₂ S0 ₄ 구배를 사용한 Capto™ MMC 혼합 모드 정제

당해 실시예에서는, 혼합 모드 수지로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 용출을 위한 염 구배로서 NaCl 대신에 Na₂S0₄ 구배가 사용된다. NaCl이 일반적으로 IEC에서 단백질을 용출시키는데 독점적으로 사용되지만, 상이한 염은 다양한 정도의 염석(단백질의 침전) 효과를 갖는 것으로 일반적으로 공지되어 있다. NaCl은 MgCl₂와 같은 염용 염(salting-in salt)과 Na₂S0₄와 같은 염석 염(salting-out salt) 사이의 중간이다. NaCl은 에타너셉트와 Capto™ MMC 간의 정전기 상호작용을 약화시키는데 효과적일 수 있지만, 소수성 상호작용을 약화시키는데 있어서는 중립적일 수 있다. Na₂S0₄ 또한 정전기 상호작용을 약화시키는데 효과적이지만, 이것은 강한 염석 염으로 공지되어 있기 때문에 소수성 상호작용을 증진시키는 것으로 본원에서 생각되었다. 따라서, 저 이동성 화학종이 위에 나타낸 바와 같이 소수성 상호작용에 의해 컬럼에 결합되는 경우, 이의 용출은 Na₂S0₄에 의해 억제될 수 있다. 이것은 10mM 포스페이트, pH 7.5 용액으로 CAPTO MMC 수지 컬럼을 pH 평형화시킨 후, 0 내지 0.4M의 Na₂S0₄ 구배로 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 함유하는 단백질 용액을 용출시킴으로써 시험한다. 단백질의 Na₂S0₄ 구배 용출이 완료된 후, 컬럼을 1M 아르기닌, pH 7.5 용액으로 세척한다. 도 5a는 용출 크로마토그램을 도시하는 반면 도 5b는 용출된 분획의 SDS-PAGE 및 native-PAGE를 도시한다. 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 비교적 첨예한 밴드가 저 Na₂S0₄ 분획(레인 6 및 7 도 5b)에서 관찰되며, 이들 분획의 순도는 로드(레인 1)보다 높다. 보다 높은 Na₂S0₄ 농도는 native-PAGE 상에서 저 이동성 화학종의 용출을 야기한다(레인 8 및 9 도 5b). pH 7.5에서의 최종 1M 아르기닌 용출은 저 이동성 (미스폴딩된/응집된) 화학종의 용출을 야기한다. 이 분획에는 약간의 에타너셉트가 있는 것으로 보이며(레인 10 도 5b), 이것은 Na₂S0₄가 또한 비손상 에타너셉트의 용출을 억제시킬 수 있음을 나타낸다. Na₂S0₄가 미스폴딩된 화학종으로부터 폴딩된 화학종을 분리하는데, 더 많이는 아니더라도, 똑같이 효과적이지만 이것은 비손상 에타너셉트(레인 10)의 보유를 초래할 수 있다고 결론지을 수 있다.

실시예 5

NaCl 및 pH 구배를 갖는 용출을 사용한 Capto ™ MMC 혼합 모드 정제

상기 실시예에서는, pH 평형화 단계 동안, 즉, pH가 4.5(5mM 시트레이트) 내지 7.5(10mM 포스페이트)로 변하는 동안 어떠한 단백질도 용출되지 않는 것으로 관찰된다. 그러나, 단백질 로딩의 양이 1ml 컬럼당 10mg 이상 증가하는 경우, 더 이상 그렇지 않다. pH 변화 동안 단백질의 용출 증가가 보다 높은 로딩시에 발생하지만, 이러한 관찰에 대한 이유는 명확하지 않다. 이러한 용출된 샘플의 순도는 로딩 샘플보다 크지만, 저 염 분획보다는 훨씬 작다. 예를 들면, 로딩 샘플(단백질 A 용출물)이 단지 51%의 정확하게 폴딩된 에타너셉트 화학종을 함유하는 경우, pH 평형화 동안 발생하는 용출은 단지 65% 순도로서, 로드보다는 높지만 저 염 분획보다는 훨씬 낮은 반면, 상기 실시예에서의 염 용출은, 분석적 HIC에 의해 측정되는 바와 같이, 염 구배의 시작시 96% 순도를 제공할 수 있다(도 6). 도 6에 플롯팅된 바와 같이, 용출된 분획의 순도는 염 농도 증가로 96%에서 20%로 점진적으로 감소하며, 이것은 Capto™ MMC에 대한 native-PAGE 결과와 일치한다(도 3b, 4b, 5b). 1M 아르기닌 분획의 순도(정확하게 폴딩된 에타너셉트의 측면에서)는 낮으며(단지 11%), 이것 또한 native-PAGE 분석과 일치한다(도 4b, 레인 9 및 도 5b, 레인 10 참조). 상기한 관찰사항을 고려하여, 보다 큰 단백질 로딩을 위한 컬럼 pH 평형화 동안 정확하게 폴딩된 화학종의 잠재적인 손실에 대응하기 위해, pH 구배를 염 구배와 조합하는 것이 유리할 수 있다는 것이 본원에 구체화된 발견과 관련하여 상정된다. 따라서, 당해 실시예 5 아래에서는, 본 발명의 방법의 상기 정의된 단계 (b)를 수행할 때 pH 구배를 염 구배와 조합한다. 당해 실시예에서는, pH 변화와 염 구배를 조합함에 의해, 혼합 모드 수지 컬럼의 초기 pH 평형 동안 소량의 제대로 폴딩된 에타너셉트가 바람직하지 않게 용출될 수 있는 가능성이 없어진다. 구체적으로, 결합된 단백질은 pH와 NaCl 농도 둘 다의 동시 구배에 의해 용출되며, 즉, 컬럼은 5mM 시트레이트, pH 4.5 용액으로부터 NaCl을 함유하는 10mM 포스페이트, pH 7.5 용액으로 현상된다. 이것은 pH와 염 농도 둘 다의 동시 변화를 초래하며, 이들 둘 다 결합된 단백질의 용출을 야기한다. 이것은 저 이동성 화학종이 나중의 분획에서(즉, 보다 높은 pH 및 염 농도에서) 및 최종 1M 아르기닌, pH 7.5 세척액에서 용출된다는 점에서 pH 평형이 관찰된 후 염 용출 프로파일과 유사하다. 예를 들면, 단백질 A 용출물(24mg)은 pH 4.5에서 컬럼에 결합되고, 5mM 시트레이트, pH 4.5 내지 0.5M NaCl을 함유하는 10mM 포스페이트 pH 7.5의 구배에 의해 용출된다. 이러한 큰 로드와 pH 평형은, pH 변화 동안 결합된 단백질의 용출을 야기할 수 있는 것으로 상정된다. pH 및 염 구배 동안의 용출 프로파일은 실제 구배의 시작시에는 작은 피크를 나타내고, 구배의 중간에는 주 피크(목적하는 정확하게 폴딩된 에타너셉트)를 나타낸다. 관찰된 작은 피크는 pH 평형이 초기에 pH/염 구배 없이 수행되는 경우에 관찰되는 용출에 상응할 수 있다. NaCl/pH 구배 용출이 완료된 후, 컬럼을 1M 아르기닌 용액을 사용한 추가의 용출에 적용하며, 이것은 저 이동성 화학종에 상응하는 첨예한 최종 피크를 야기한다. 초기 용출되는 저 염 및 저 pH 분획은 에타너셉트가 풍부한 반면, 고 염 및 고 pH 분획은 저 이동성 화학종의 용출을 나타내었다; pH는 4.5에서 7.5로 점진적으로 증가하며, 예를 들면, 중간 염 농도에서는 pH 4.1 내지 5.1이고, 구배의 말기에는 pH 6.6이다. 1M 아르기닌, pH 7.5 용액을 갖는 최종 세척액은 native-PAGE에서는 스미어링 밴드를 보이고 SDS-PAGE에서는 다중 밴드를 보이며, 이것은 본질적으로 pH 변화를 야기하는 초기 컬럼 평형과 10mM 포스페이트, pH 7.5 세척 후에 초래되는 용출과 동일하다. 풀에서의 제대로 폴딩된 에타너셉트의 회수율은 ~70%이었다. 유사한 결과는 용출을 10mM 포스페이트, pH 7.5 용액과 동일한 pH/염 구배로 수행하다가 0.25M NaCl을 함유하는 보다 낮은 염에서 종료하는 경우에 수득된다. 보다 낮은 염 농도를 사용하는 이러한 구배는 ~50%의 수율을 갖는 에타너셉트의 불완전한 용출을 야기한다. 이전 실시예에서와 같이, 큰 피크는 1M 아르기닌 세척액에서 관찰되었으며, 이것은 저 이동성(미스폴딩된/응집된) 에타너셉트 화학종에 상응한다. 당해 실시예에서 수득된 용출물의 분석이 도 7a 및 7b에 나타내어져 있다.

실시예 6

용출을 위해 Na ₂ SO ₄ / pH 구배를 사용한 Capto ™ MMC 혼합 모드 정제

상기 실시예 5에서 사용되는 과정과 유사하게, pH/염 구배 용출을 또한 최종 용매로서 0.5M Na₂S0₄ 용액을 사용하여 수행하였으며, 이것이 미스폴딩된 화학종으로부터의 폴딩된 화학종의 분해를 개선시키는 것으로 생각된다. 풀에서의 에타너셉트의 회수율은 ~50%이고, 낮은 회수율은 0.5M Na₂S0₄에 의한 증진된 소수성 상호작용으로 인한 것으로 믿어지며, 이것은 1M 아르기닌 세척액에서 주로 용출되는 미스폴딩된 화학종 뿐만 아니라 1M 아르기닌 세척액에서 또한 보이는 에타너셉트의 체류를 야기한다. 따라서, Na₂S0₄의 사용은 정확하게 폴딩된 화학종으로부터 미스폴딩된 화학종의 분리(즉, 분해)를 증진시킬 수 있지만, 또한 에타너셉트의 회수를 감소시킨다. 당해 실시예에서 용출물의 분석을 위해, 도 8a 및 8b를 참조할 수 있다.

실시예 7

Capto ™ Adhere ; pH 7.5 및 pH 4.5에서 NaCl 을 사용한 용출

당해 실시예에서, 정확하게 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 화학종과 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 화학종 둘 다를 포함하는 단백질 A 용출물을 혼합 모드 수지로서 Capto™ Adhere를 사용하는 혼합-모드 크로마토그래피에 적용한다. 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 화학종을 포함하는 단백질 용액의 결합은 pH 7.5에서 수행하였으며, 이때 에타너셉트는 음으로 하전되며, 따라서, 양으로 하전된 Capto™ Adhere 리간드에 결합되어야 한다. pH 4.2 단백질 A 용출물을 10mM 포스페이트, pH 7.5 용액에 비해 투석하는 경우, 단백질 결합은 완벽하지만, 염 단독(pH 7.5에서)에 의한 용출은 비효과적인 것으로 밝혀졌으며, 이는 Capto™ Adhere가 상당히 소수성임을 시사한다. 따라서, 에타너셉트의 pI가 4.9 내지 5.4이기 때문에, 아마도 pH 4.5의 보다 낮은 용출 pH에서 에타너셉트 화학종은 양으로 하전되고, 따라서, pH 4.5에서 양으로 하전된 Capto™ Adhere 수지로부터 반발하는 것으로 고려된다. 이러한 가능성은 pH 4.5에서 Capto™ Adhere로부터 에타너셉트 화학종의 용출을 수행함에 의해 조사된다. (pH 7.5로 투석되었던) pH 4.2 단백질 A 용출물을 10mM 포스페이트, pH 7.5 용액으로 평형화된 Capto™ Adhere에 결합시킨다. 단백질 로딩 후, 컬럼을 동일한 완충액에서 0 및 0.2M NaCl로 세척하며, 이 세척액에 어떠한 단백질도 용출되지 않는다.

실시예 8

Capto™ Adhere; pH 4.5에서 아르기닌의 존재/부재하의 용출

실시예 7의 결과에 비추어, 결합된 단백질을 그후 아르기닌을 갖는 및 갖지 않는 5mM 시트레이트, pH 4.5 용액으로 용출시킨다. 당해 실시예에서는 NaCl 대신에 아르기닌을 사용하여, 보다 소수성인 화학종(아르기닌)이 Capto™ Adhere 리간드의 소수성 성질을 감안하여 용출에 영향을 미치는 방식을 조사한다. 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 함께 저 이동성 (미스폴딩된/응집된) 화학종이 5mM 시트레이트, pH 4.5 세척 용액(아르기닌을 함유하지 않음)으로 용출되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 분획에서의 저 이동성 화학종의 용출은, 이 분획의 측정된 pH가 3.0이었기 때문에, pH의 갑작스런 변화로 인한 것일 수 있다. 이러한 단계를 5mM 시트레이트, pH 4.5 용액 중에서 0.1 및 0.2M 아르기닌을 사용하여 반복하는 경우, 단지 한계량(marginal amount)의 정확하게 폴딩된 에타너셉트이 관찰된다. 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 완전한 용출은 0.5M 아르기닌을 필요로 하지만, 용출물은 바람직하지 않은 양의 저 이동성 화학종을 포함한다. 따라서, pH 4.5에서조차, 아르기닌은 저 농도에서 비효과적이며, 보다 높은 아르기닌 농도에서는, 폴딩된 화학종과 미스폴딩된 화학종 간의 불량한 분해가 초래되는 것으로 밝혀졌다. 당해 실시예에서 수득된 용출물의 분석에 대해서는 도 9를 참조한다.

실시예 9

Capto™ Adhere; 두 개의 아르기닌 구배 및 7.5 내지 4.5의 pH 구배를 사용한 용출

조합된 pH/아르기닌 구배가 제대로 폴딩된 화학종과 미스폴딩된 화학종 간의 보다 나은 분해를 야기할 수 있는 것으로 상정된다. CAPTO MMC에 대한 이전 실시예에서와 같이, 5mM 시트레이트를 사용한 7.5에서 4.5로의 pH 평형 동안의 pH 강하는, 아르기닌 농도 구배(예를 들면, 아르기닌을 함유하는 10mM 포스페이트, pH 7.5 내지 5mM 시트레이트, pH 4.5의 구배)와 이후에 결합될 수 있는 pH의 동시 구배를 적용함에 의해 방지할 수 있다. 두 개의 아르기닌 구배를 이러한 pH 구배로 조사하였다. 0.25M 아르기닌으로의 아르기닌 구배의 경우(도 10a 및 10b), 최종 0.5M 아르기닌 세척액이 저 이동성 화학종과 에타너셉트 둘 다의 용출을 야기하는 것으로 밝혀졌으며, 이것은 단지 0.25M 아르기닌의 아르기닌 농도 구배의 사용이 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 완전 용출에는 불충분하다는 것을 나타낸다. 따라서, (7.5 내지 4.5의 상기 pH 구배와 결합하여) 0 내지 0.5M의 아르기닌 구배를 조사하였다(도 11a 및 11b). 후속적인 native-PAGE 분석으로부터, 상대적인 피크 높이가 이전 0.25M 아르기닌 구배보다 더 높은 아르기닌 구배를 갖는 최종 1M 아르기닌 세척액의 경우에 더 작다는 것이 자명하다. 2차 피크는 관찰되지 않는데, 이는 분해가 제대로 발휘되지 못할 수도 있음을 시사한다. pH 구배는 용출된 분획의 pH가 7.5에서 6.0, 5.7, 5.2, 최종적으로 4.5로 점진적으로 감소하도록 이루어진다. 0.5M 아르기닌 및 pH 구배에 관해, 주 용출 피크에서의 두 개의 분획은 정확하게 폴딩된 에타너셉트가 풍부하며, ~65%의 단백질 회수율을 갖는다. 구배의 후반부에는 에타너셉트를 함유하는 스미어링 밴드를 나타내었다. 따라서, pH 구배와 함께 0.5M 아르기닌 구배가 결합된 에타너셉트의 용출을 증가시키지만, 아르기닌/pH 구배의 후반부에는 정확하게 폴딩된 에타너셉트가 미스폴딩된 화학종과 공동-용출되었다. 최종 1M 아르기닌 세척액은 단지 스미어링 밴드만 나타내었다.

실시예 10

Capto™ Adhere; 아르기닌 구배와 7.5 내지 4.5의 pH 구배를 사용한 용출

아르기닌 구배 용출을 또한 Capto™ MMC 풀을 사용하여 pH 7.5에서 수행한다. 결합된 단백질을 10mM 포스페이트, pH 7.5에서 0.6M 아르기닌, 10mM 포스페이트, pH 7.5의 구배로 용출시켰다. SDS-PAGE 및 native-PAGE 프로파일은 중간 분획(0.2 내지 0.4M 아르기닌)에서의 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 용출을 보여준다(도 13). 두 가지 겔 모두에서 보여지는 바와 같은 저 이동성 화학종은, 나중 분획 및 최종 1M 아르기닌 pH 7.0 세척액에서 관찰된다. 그에 비해, 0.6M 아르기닌을 pH 7.5에서의 구배 용출에서 0.5M NaCl로 대체하는 경우, 에타너셉트의 용출이 크게 감소하였다. 도 14는 0.5M NaCl로의 염 구배 동안 pH 7.5에서의 용출 프로파일을 도시한다. 구배 동안 두 개의 피크가 관찰되었으며, 이것은 주로 에타너셉트를 함유하지만 낮은 수율을 갖는다. 다량의 에타너셉트가 최종 1M 아르기닌 세척액에서 용출되는데, 이것은 pH 7.5와 결합된 0.5M NaCl의 염 농도가 미스폴딩된/응집된 물질로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하는데 최적이 아니었음을 나타낸다. 위에 주지된 바와 같이, 1M 아르기닌은 저 이동성 화학종이 존재하기는 하지만 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 용출시키는데 매우 효과적이었다. 약 0 내지 약 1M NaCal의 구배를 사용하기 위해 염 용출 구배를 개질시키고 pH 8에서 용출을 수행하면 실시예 12에서 보여지는 바와 같은 이러한 구배의 초기 용출 생성물에서 높은 저 이동성 (미스폴딩된/응집된) 화학종에 비해 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 탁월한 분해가 야기되는 것으로 주지된다. Capto Adhere에 결합하는 에타너셉트의 소수성 기여가 pH 8.0에서 감소되어, NaCl 단독에 의한 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 효과적인 용출을 야기하는 것으로 보인다.

실시예 11

Capto™ Adhere; pH 7.5에서 아르기닌/NaCl 구배를 사용한 용출

당해 실시예에서는, 조합된 NaCl/아르기닌 구배를 pH 7.5에서 조사한다. 이러한 두 가지 구배를 조사하였다: 용출 배지에 대해 조사된 첫번째 구배는 최종 NaCl 및 아르기닌 농도가 각각 0.4 및 0.2인 구배이다. 그후, 최종 NaCl 및 아르기닌 농도가 각각 0.25M NaCl 및 0.5M 아르기닌인 두번째 구배를 조사한다. 두 가지 경우 모두에서, 구배는 10mM 포스페이트, pH 7.5 용액에서 적용된다. 첫번째 구배는 소수성 상호작용을 감소시키고 이에 따라 에타너셉트를 용출시키기에는 여전히 너무 약하였다. 두번째 구배는 최종 1M 아르기닌 세척액에서의 보다 작은 피크에 의해 나타내어지는 바와 같이 보다 효과적이었다. 특히, SDS-PAGE에서 확인되는 바와 같이, 에타너셉트의 용출은 고분자량(저 이동성/미스폴딩된/응집된) 화학종 없이 0.25M NaCl, 0.5M 아르기닌까지 두번째 시험된 구배 전반에 걸쳐 발생한다. 그후, 이러한 고분자량 화학종은 최종 1M 아르기닌 세척액에서 용출된다. native-PAGE에서, 비손상의 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 대부분은 중간 분획에서 용출되는 것으로 나타났다. 스미어링 밴드가 1M 아르기닌 세척액에서 관찰되었다. 따라서, 아르기닌과 NaCl의 조합이 에타너셉트의 용출 및 미스폴딩된 화학종에 상응하는 저 이동성 및 고분자량 화학종의 분리를 유도할 수 있다는 것이 자명하다. Capto™ MMC 풀(60 내지 80% 순수)에 대한 Capto™ Adhere 분획의 HIC 분석 결과, (꼬리 분획을 제외하고서) 구배 동안 용출된 분획은 통상적으로 95% 이상의 순도를 제공하는 것으로 나타났다. 당해 실시예에서 수득된 용출물의 분석이 도 15a 및 15b에 나타내어져 있다.

실시예 12 - Capto™ Adhere 및 Capto™ MMC

당해 실시예에서, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 미스폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단백질 A 용출물은 상기한 단백질 A 방법과 유사한 방법으로 수득하였다. 이어서, 용출물을 Capto™ MMCe 컬럼에 적용한 다음, 생성물 풀을 Capto™ ADHERE 컬럼에 적용하여 우수한 에타너셉트 생성물을 정량적으로 및 정성적으로 둘 다 제공하였다.

단계 1. 세포 증식. 당업계에 공지된 방식으로, 생산용 생물반응기의 접종을 위해 충분한 수의 세포들을 생성하는데 필요한 세포 증식은 에타너셉트 융합 단백질을 발현하는 CHO 세포들의 클론을 사용하여 수행한다. 이러한 발현 과정의 생성물(수확된 세포 배양액)은 추가의 불순물과 함께, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩되고/되거나 응집된 에타너셉트와의 혼합물을 야기한다. 이러한 단백질 혼합물을 포함하는 수확된 세포 배양액을 세제 바이러스 불활성화(detergent viral inactivation)에 적용한다.

단계 2. 친화성 크로마토그래피. 친화성 크로마토그래피는 통상의 단백질 A 친화성 컬럼을 사용하여 널리 공지된 방식으로 상기 단계 1에서 수득된 수확된 세포 배양물에서 수행한다. 생성물 회수율은 대략 85%이다. 수득된 생성물은 정확하게 폴딩된 에타너셉트, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 및/또는 정확하게 및/또는 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 응집물, 또는 단백질 단편을 포함하는 복합 단백질 혼합물이다. 이러한 단백질 A 친화성 컬럼 정제 단계로부터 수득된 생성물을 pH 3.5로 되도록 조절한 다음, 바이러스 불활성화 단계에 적용한다. 바이러스 불활성화 후, 생성물을 pH 5.5로 되도록 조절한 다음, 상업적으로 입수된 캡슐 필터를 사용하여 공지된 방식으로 추가로 청정화시킨다.

단계 3A. 혼합-모드 양이온 교환 크로마토그래피. 31.8L(45cm 직경 × 20cm 상 높이) 팩킹된 상 GE Healthcare Capto MMC 크로마토그래피 컬럼을 상기 단계 2에서 수득된 생성물을 정제하는데 사용한다. 사용 전에, 컬럼을 2CV의 25mM 아세테이트 pH 5.5로 평형화시키고, 2CV의 0.1N NaOH, 1M NaCl로 위생처리하고, 2CV의 25mM 아세테이트, 0.7M NaCl, pH 5.5로 중화시킨다. 그후, 컬럼을 유출물이 pH 5.5 및 3.5mS/cm일 때까지 8 내지 10CV의 25mM 아세테이트 pH 5.5로 평형화시킨다. 상기 단계 2로부터의 단백질 A 풀을 WFI로 ≤6mS/cm로 되도록 희석시키고, 각 사이클에 대해 15g/L 배지 이하의 컬럼 로딩으로 되도록 적용한다. 컬럼을 200cm/h의 선 속도(linear velocity)에서 작동시켜 6분의 체류 시간을 제공한다. 로딩 후, 컬럼을 2CV의 25mM 아세테이트 pH 5.5로 세척한다. 그후, 생성물을 8.5CV, 15% 내지 85% 구배의 25mM 아세테이트 pH 5.5 내지 25mM 아세테이트, 0.7M NaCl, pH 5.5로 용출시킨다. 생성물 수집은 0.15 OD(A280, 1.0cm 경로 길이)에서 시작하고, 최대 피크의 50%에서 수집을 종료한다. 용출물 용적은 대략 5CV이다. 잔류 생성물 및 오염물을 2CV의 10mM 트리스, 1M NaCl, pH 8.0을 사용하여 컬럼으로부터 스트리핑하고 버린다. 혼합 모드 컬럼으로부터 수득된 생성물을 Millipore Opticap XL10, 0.22㎛ Durapore 캡슐 필터, (0.69m²)를 사용하여 여과한다. 이러한 단계로부터 수득된 생성물은 단계 2에서 수득된 단백질 A 물질의 약 70%의 회수율을 나타낸다.

단계 3B. 혼합 모드 음이온 교환 크로마토그래피. 27.0L(45cm 직경 × 17cm 상 높이) 팩킹된 상 GE Healthcare Capto Adhere 크로마토그래피 컬럼을 상기 단계 3A에서 수득된 생성물을 추가로 정제하는데 사용한다. 사용 전에, 컬럼을 2CV의 25mM 트리스, pH 8.0으로 평형화시키고, 2CV의 0.1N NaOH, 1M NaCl로 위생처리하고, 2CV의 25mM 트리스, pH 8.0으로 중화 및 평형화시킨다. 생성물 로딩 전에, 컬럼을 3CV의 10mM 트리스, pH 8.0으로 평형화시킨다. 상기 단계 3A로부터의 Capto MMC 풀을 풀 kg당 ~0.045kg의 1M 트리스, pH 8.3을 사용하여 pH 8.1로 되도록 조절한다. 상기 단계 3A로부터의 생성물을 WFI로 1:3.8로 일련으로 희석시켜 전도율을 12.0mS/cm 및 pH 8.0로 조절한다. 그후, 생성된 물질을 15g/L 배지 이하의 컬럼 로딩으로 적용한다. 컬럼을 170cm/h의 선 속도에서 작동시켜 6분 체류 시간을 제공한다. 로딩 후, 컬럼을 2CV의 25mM 트리스, pH 8.0으로 세척한다. 그후, 생성물을 10CV 구배(20% 내지 90%)의 25mM 트리스, pH 8.0 내지 10mM 트리스, 1M NaCl, pH 8.0으로 용출시킨다. 생성물 수집은 0.15 OD(A280, 1.0cm 경로 길이)에서 시작하고, 최대 피크의 25%에서 수집을 종료한다. 용출물 용적은 4 내지 6CV이다. 용출된 생성물을 시판중인 캡슐 필터를 사용하여 여과한 다음, 공지된 방식으로 바이러스 여과 및 접선 유동 여과 단계에 적용한다. 단계 3B(최종 바이러스 여과 및 접선 유동 여과 단계 포함)로부터의 전반적인 생성물 회수율은 대략 68%이었다. 여과 단계 전에 측정한 생성물 회수율은 약 75%이었다. 이러한 단계로부터의 용출 분획에 대해 수득된 HIC 데이터의 개략적 도식이 도 12에 도시되어 있다.

분석: 당해 실시예에서 수득된 최종 여과된 생성물은, HIC로 측정하여 약 90wt% 이상의 정확하게 폴딩된 에타너셉트; HIC로 측정하여 5wt% 이하의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 화학종; HIC 분석에 의해 약 3wt% 이하의 클리핑된 물질(이의 TNFR 부분이 절단된 에타너셉트의 단편인 것으로 믿어짐) 및 크기 배제 크로마토그래피로 측정하여 95wt% 이상의 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 합한 양을 갖는 것으로 밝혀졌다.

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단백질 결합이 염석 조건의 존재하에서 발생한다는 사실은, HIC로의 소수성 단백질 결합은 통상적으로 강한 염석을 필요로 한다는 것을 고려하면, 소수성 상호작용이 Capto™ MMC 및 Capto™ Adhere에 결합하는 에타너셉트에 관련되지 않을 가능성을 시사한다. 그러나, 소수성 상호작용은 단백질과 이들 혼합 모드 수지 간의 정전기 상호작용의 존재하에서 촉진될 수 있다. 따라서, 특정 이론에 결합시키고자 하는 것은 아니지만, 혼합 모드 수지에 대한 에타너셉트의 결합은 염석 조건의 부재하에서도 정전기성 및 소수성 상호작용 모드 둘 다를 통해 매개될 수 있다. 분석적 HIC는, 보다 낮은 황산암모늄 농도에서 용출되는 미스폴딩된 화학종이 폴딩된 화학종보다 더 소수성임을 명확히 나타낸다. 폴딩된 및 미스폴딩된 화학종 둘 다가 동일한 정전기 성질을 갖고 Capto™ MMC 또는 Capto™ Adhere 리간드의 하전된 그룹에 똑같이 잘 결합된다고 가정하면, 미스폴딩된 화학종의 보다 강한 소수성 기여가 이들이 혼합 모드 수지에 더 단단히 결합되도록 하여, 이전 실시예들에서 관찰되는 바와 같이 미스폴딩된 화학종에 대해 보다 강한 용출 조건을 필요하게 만들 수 있다. Capto™ MMC의 경우, 이것은 소수성 상호작용을 상당히 증가시키기에는 충분하지 않을 수 있지만 Capto™ MMC와 정확하게 폴딩된 화학종과 부정확하게 폴딩된 화학종 둘 다 간의 추가의 정전기 상호작용을 파괴하기에는 충분할 수 있는 보다 높은 염 농도에서 달성될 수 있다. 이와 달리, Capto™ Adhere는 정확하게 폴딩된 화학종을 용출시키는데 아르기닌, 또는 대안적으로 보다 높은 염 농도와 보다 높은 pH를 필요로 하는 Capto™ MMC보다 더 소수성인 것으로 보인다. 미스폴딩된 화학종을 용출시키는데 보다 높은 아르기닌 농도 또는 보다 가혹한 조건이 필요하다.

본 발명이 용어들 "미스폴딩된" 또는 "부정확하게 폴딩된" 또는 "부적절하게 폴딩된"을 상호교환 가능하게 사용하지만, 혼합 모드 수지가 미스폴딩된 화학종을 함유하는 것으로 밝혀진 동일한 용출 분획에서 응집된 화학종을 제거하는데 효과적인 것으로 또한 밝혀졌다는 점에서, 이들 용어들은 응집된 화학종을 또한 포함하고자 의도되는 것으로 이해되어야 한다. 사실상, 에타너셉트는 SDS-PAGE에서 알 수 있는 바와 같이 디설파이트-결합된 올리고머를 형성한다. 이러한 올리고머는 주로 1M 아르기닌 세척액에서 용출되며, 이것은 수지와의 이들의 보다 강한 소수성 상호작용을 나타낸다. 따라서, 에타너셉트의 경우, Capto™ MMC와 Capto™ Adhere 둘 다가 미스폴딩된 및 응집된 화학종의 동시 제거를 야기할 수 있는 것으로 보인다. 미스폴딩된 물질 및 응집물의 제거는, 이들이 공유결합되든 비-공유결합되든 간에, 응집물 물질(정확하게 폴딩되든 또는 부정확하게 폴딩되든)의 잠재적인 면역원성으로 인해 보다 안전한 생물의약품을 제공하기 위해 대단히 요구된다.

이전 실시예들에서의 아르기닌의 효과와 관련하여, 아르기닌(아르기닌 하이드로클로라이드)은 염으로서 작용할 뿐만 아니라 소수성 상호작용을 약화시킨다는 것이 자명하다. 아르기닌은 단백질 응집 및 표면 흡착을 억제하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 또한, 아르기닌은 방향족 그룹과 상호작용하여 단백질들 간의 또는 단백질과 표면 간의 방향족-방향족 또는 방향족-양이온 상호작용을 방해한다. Capto™ MMC와 Capto™ Adhere 둘 다는 단백질 결합에 기여할 수 있는 방향족 그룹을 갖는다. 이러한 결합 모드가 NaCl이 아니라 아르기닌에 의해 효과적으로 교란될 수 있다는 것은 예측되지 못했었다. 아르기닌은 또한 지방산들 간의 상호작용을 약화시키며, 이는 이것이 방향족 그룹을 통해 매개되지 않고 소수성 상호작용을 교란시킬 수 있음을 시사한다. 따라서, 아르기닌의 소수성 성질은, 기계론적으로 명백히 이해되지는 않지만, 단백질-단백질 상호작용 및 표면 흡착, 및 이에 따라 혼합 모드 수지로부터의 단백질 용출을 조절하는데 중요한 역할을 할 수 있다. 그러나, 상기 실시예 12에서 보여지는 바와 같이, 매우 고순도 에타너셉트 제제를 제공하도록 본 발명을 실시하기 위해 아르기닌을 사용하는 것은 필요하지 않다. 이것은 아마도 단백질 결합에 대한 Capto MMC 및 Capto Adhere 수지의 약한 소수성 기여로 인한 것이다. 그럼에도 불구하고, NaCl과 병용한 아르기닌의 사용이, 단백질에 대한 혼합 모드 크로마토그래피의 회수 및 분해를 개선시킬 수 있다.

부록 A

추가의 대표적인 양태

(우선권 출원 제 USSN 61/699,552호에 기재됨)

부정확하게 폴딩된 단백질로부터 정확하게 폴딩된 단백질을 분리하기 위한 혼합 모드 크로마토그래피 방법으로서,

A. (a) 소정의 단백질의 정확하게 폴딩된 형태와 부정확하게 폴딩된 형태 둘 다를 포함하는 제1 단백질 혼합물을, 이온 교환 모이어티들과 소수성 모이어티들 둘 다를 갖는 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합시키는 단계;

(b) 상기 혼합 모드 수지로부터 상기 정확하게 폴딩된 단백질을 용출시켜, 상기 제1 단백질 혼합물에서보다 더 높은 비율의 정확하게 폴딩된 단백질을 포함하는 제2 단백질 혼합물을 수득하는 단계

를 포함하는, 부정확하게 폴딩된 단백질로부터 정확하게 폴딩된 단백질을 분리하기 위한 혼합 모드 크로마토그래피 방법.

B. 양태 A에 있어서, 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 Capto™ MMC 혼합 모드 크로마토그래피 수지인, 방법.

C. 양태 A에 있어서, 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 Capto™ Adhere 혼합 모드 크로마토그래피 수지인. 방법.

D. 양태 A 내지 C 중 어느 하나에 있어서, 상기 정확하게 및 부정확하게 폴딩된 단백질 형태는, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는, 방법.

E. 양태 D에 있어서, 상기 부정확하게 폴딩된 에타너셉트는 단계 (b)에서 수득된 용출물의 약 10wt% 이하, 바람직하게는 약 5wt% 이하를 구성하고; 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트는 단계 (b)에서 수득된 용출물의 약 90wt% 이상, 바람직하게는 약 95wt% 이상을 구성하고; 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 합한 양은 단계 (b)에서 수득된 용출물의 적어도 약 95wt%, 바람직하게는 적어도 약 98wt%를 구성하는, 방법.

F. 양태 A 내지 E 중 어느 하나에 있어서, 상기 혼합 모드 수지는 Capto™ MMC이고, 상기 방법의 단계 (a) 및 (b)는 약 4.5 내지 약 7.5의 pH에서 수행되며; 상기 용출 단계 (b)는 상기 혼합 모드 수지를 염 용액과 접촉시킴에 의해 수행되는, 방법.

G. 양태 A 내지 E 중 어느 하나에 있어서, 상기 혼합 모드 수지는 Capto™ Adhere이고, 단계 (a) 및 (b)는 약 4.5 내지 약 8.5의 pH에서 수행되며; 상기 용출 단계 (b)는 상기 혼합 모드 수지를 염 용액과 접촉시킴에 의해 수행되고, 상기 용액은 임의로 아르기닌을 추가로 포함하는, 방법.

H. 양태 F 또는 G에 있어서, 상기 염 용액은, 염 농도가 점진적으로 증가되는 구배를 통해 단계 (b)에 적용되는, 방법.

I. 양태 H에 있어서, 상기 단계 (b)의 염 농도 구배는 약 0M에서 약 1M로의 염 농도의 증가를 야기하는, 방법.

J. 양태 F 내지 I 중 어느 하나에 있어서, 상기 염은 염화나트륨 및 황산나트륨으로부터 선택되는, 방법.

K. 양태 A 내지 J 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 (b) 동안, 단계 (b)에서 수지와 접촉하는 용액의 pH는 점진적으로 변하는, 방법.

L. 양태 K에 있어서, pH는 점진적으로 증가하는, 방법.

M. 양태 K에 있어서, pH는 점진적으로 감소하는, 방법.

N. 양태 A 내지 M 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 (b)의 용출물에서 수득된 정확하게 폴딩된 단백질의 양은, 단계 (a)에서 상기 수지에 도입된 단백질 혼합물에 존재하는 단백질의 양의 적어도 약 60wt%인, 방법.

O. 양태 N에 있어서, 상기 정확하게 폴딩된 단백질의 양은, 단계 (a)에서 상기 수지에 도입된 단백질 혼합물에 존재하는 단백질의 양의 적어도 약 70wt%인, 방법.

P. 양태 A 내지 0 중 어느 하나에 있어서, 적어도 90wt%의 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 바람직하게는 약 5wt% 이하의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단백질 혼합물이, 하기 단계들 이외의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하기 위한 어떠한 크로마토그래피 분리 또는 정제 단계를 수행하지 않고서 또는 이를 수행할 필요 없이 수득되는, 방법:

(1) 바람직하게는 단백질 A 크로마토그래피 정제 단계를 포함하는, 하나 이상의 정제 단계(여기서, 이러한 단계(들)는 에타너셉트계 단백질을 함유하는 수확 세포 배양액을 정제하기 위해 사용되며, 이러한 정제 단계는 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터의 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 인지 가능한 분리를 유도하지 못한다);

(2) 양태 1에 기재된 혼합 모드 크로마토그래피 단계 (a) 및 단계 (b); 및

(3) 분석 목적으로만 수행되는 SEC, HIC 또는 기타의 분석적 크로마토그래피 단계들.

Q. 양태 A 내지 P 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 (b)의 용출물에 존재하는 단백질의 양은 A 280에서의 UV 흡광도에 의해 측정되고; 상기 단계 (b)의 용출물 중의 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 측정되며; 단계 (b)의 용출물에 존재하는 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 합한 양은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되는, 방법.

R. 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하기 위해 단백질 혼합물을 정제하기 위한 혼합 모드 크로마토그래피 방법으로서, 상기 방법은,

(a) 소수성 모이어티들과 이온 교환 모이어티들을 갖는 혼합 모드 크로마토그래피 수지를, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 둘 다가 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 부착, 결합 또는 포획되도록, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단백질 혼합물을 함유하는 용액과 접촉시키는 단계; 및

(b) 혼합 모드 수지를 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 에타너셉트 단백질을 용출시킬 수 있는 용액과 접촉시켜, 정확하게 폴딩된 에타너셉트 대 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양의 비가 단계 (a)에서 수지에 도입된 단백질 혼합물에서보다 높은 용출물을 수득하는 단계

를 포함하는, 단백질 혼합물에 존재하는 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하기 위해 단백질 혼합물을 정제하기 위한 혼합 모드 크로마토그래피 방법.

S. 양태 R에 있어서, 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 Capto™ MMC 혼합 모드 크로마토그래피 수지인, 방법.

T. 양태 R에 있어서, 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 Capto™ Adhere 혼합 모드 크로마토그래피 수지인, 방법.

U. 양태 A 내지 T에 있어서,

(A) 부정확하게 폴딩된 에타너셉트가 단계 (b)에서 수득된 용출물의 약 5wt% 이하를 구성하고; 정확하게 폴딩된 에타너셉트가 단계 (b)에서 수득된 용출물의 약 90wt% 이상을 구성하며; 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 합한 양이 단계 (b)에서 수득된 용출물의 적어도 약 95wt%를 구성하거나;

(B) 단계 (b)에서 수득된 용출물, 또는 이의 일부가 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하고, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트는 함유하지 않거나 본질적으로 함유하지 않는, 방법.

V. 양태 A 내지 U 중 어느 하나에 있어서, 상기 혼합 모드 수지는 Capto™ MMC이고, 상기 방법의 단계 (a) 및 (b)는 약 4.5 내지 약 7.5의 pH에서 수행되며; 상기 용출 단계 (b)는 혼합 모드 수지를 염 용액과 접촉시킴에 의해 수행되는, 방법.

W. 양태 R 내지 V 중 어느 하나에 있어서, 상기 혼합 모드 수지는 Capto™ Adhere이고, 단계 (a) 및 (b)가 약 4.5 내지 약 8.5의 pH에서 수행되며; 상기 용출 단계 (b)는 혼합 모드 수지를 염 용액과 접촉시킴에 의해 수행되고, 상기 용액은 임의로 아르기닌을 추가로 포함하는, 방법.

X. 양태 V 또는 W에 있어서, 상기 염 용액은, 염 농도가 점진적으로 증가되는 구배를 통해 단계 (b)에 적용되는, 방법.

Y. 양태 X에 있어서, 상기 단계 (b)의 염 농도 구배는 약 0M에서 약 1M로의 염 농도의 증가를 야기하는, 방법.

Z. 양태 V 내지 Y 중 어느 하나에 있어서, 상기 염은 염화나트륨 및 황산나트륨으로부터 선택되는, 방법.

AA. 양태 R 내지 Z 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 (b) 동안, 단계 (b)에서 수지와 접촉하는 용액의 pH가 점진적으로 증가되거나 점진적으로 감소되는, 방법.

BB. 양태 R 내지 AA 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 (b)의 용출물에서 수득된 정확하게 폴딩된 단백질의 양은, 단계 (a)에서 상기 수지에 도입된 단백질 혼합물에 존재하는 단백질의 양의 적어도 약 60wt%, 바람직하게는 적어도 약 70wt%인, 방법.

CC. 양태 A 내지 BB 중 어느 하나에 있어서,

상기 방법이,

단계 (a)와 단계 (b)를 수행함에 의해 1차 혼합 모드 분리(분리 #1)를 수행하고; 이어서,

단계 (a)와 (b)를 다시 수행함으로써 2차 혼합 모드 분리(분리 #2)를 수행하는 방식으로 2회 이상 실시되고;

여기서, 상기 분리 #1의 단계 (b)에서 수득된 용출물은, 상기 분리 #2의 단계 (a)에서 단백질 혼합물을 함유하는 용액으로서 사용되는, 방법.

DD. 양태 CC에 있어서, 상기 분리 #1에서 사용되는 상기 혼합 모드 수지는, 상기 분리 #2에서 사용되는 혼합 모드 수지와 동일하거나 상이한, 방법.

EE. 양태 DD에 있어서, 상기 분리 #1 및 분리 #2는 하기 조합으로부터 선택되는 방식으로 수행되는, 방법:

분리 #1은 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO MMC를 사용하고,

분리 #2는 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO ADHERE를 사용함;

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분리 #1은 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO ADHERE를 사용하고,

분리 #2는 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO MMC를 사용함;

--------------

분리 #1은 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO MMC를 사용하고,

분리 #2는 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO MMC를 사용함; 또는

--------------

분리 #1은 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO ADHERE를 사용하고,

분리 #2는 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO ADHERE를 사용함.

FF. 양태 EE에 있어서, 상기 분리 #1 및 상기 분리 #2는 하기 방식으로 수행되는, 방법: 상기 분리 #1은 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO MMC를 사용하고; 상기 분리 #2는 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO ADHERE를 사용함.

GG. 양태 A 내지 FF 중 어느 하나의 방법에 의해 수득되는, 에타너셉트-함유 단백질 혼합물, 또는 상기 혼합물을 포함하는 약제학적으로 허용되는 제형으로서, 상기 단백질 혼합물은 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 상기 단백질 혼합물의 약 90wt% 이상을 구성하는 양으로 포함하고; 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 상기 단백질 혼합물의 약 5wt% 이하를 구성하는 양으로 포함하며; 상기 단백질 혼합물은 에타너셉트-함유 단백질 혼합물의 적어도 약 95wt%, 바람직하게는 적어도 약 98wt%를 구성하는 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 합한 양을 갖는, 양태 A 내지 FF 중 어느 하나의 방법에 의해 수득되는, 에타너셉트-함유 단백질 혼합물, 또는 상기 혼합물을 포함하는 약제학적으로 허용되는 제형.

HH.

TNF 알파 매개된 상태에 대한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하기에 적합한 매우 순수한 에타너셉트를 함유하는 약제학적으로 허용되는 제형으로서, 상기 제형은 다량의 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 소량의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단백질 혼합물을 함유하며:

(i) 상기 부정확하게 폴딩된 에타너셉트는 상기 단백질 혼합물의 약 10wt% 이하, 바람직하게는 약 8wt% 이하, 가장 바람직하게는 약 5wt% 이하를 구성하고;

(ii) 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트는 상기 단백질 혼합물의 90wt% 이상, 바람직하게는 약 92wt% 이상, 바람직하게는 약 95wt% 이상을 구성하며;

(iii) 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트(이들의 응집물은 포함하지 않음)의 총량은 상기 단백질 혼합물의 적어도 95중량%, 바람직하게는 적어도 98중량%를 구성하고;

상기 제형은 상기 대상체에게 투여하기에 적합한 제형을 제공하는 약제학적으로 허용되는 불활성 성분, 부형제 또는 담체를 추가로 포함하는, TNF 알파 매개된 상태에 대한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하기에 적합한 매우 순수한 에타너셉트를 함유하는 약제학적으로 허용되는 제형.

II. 양태 HH에 있어서, 상기 에타너셉트 제제는, 상기 제형의 약 25 내지 약 75mg/ml를 구성하고, 상기 제형은 수크로즈, 염화나트륨, L-아르기닌 하이드로클로라이드 및 인산나트륨을 추가로 포함하는, 제형.

JJ.

에타너셉트-함유 단백질 혼합물 안에 존재하는 부정확하게 폴딩된 에타너셉트에 비해 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양과 관련한 높은 순도를 갖는 에타너셉트-함유 단백질 혼합물의 제조방법으로서, 상기 방법은,

(1) 에타너셉트를 포유류 발현 시스템에서 발현시켜, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 둘 다를 포함하는 에타너셉트-함유 단백질 혼합물을 함유하는 수확 세포 배양액을 수득하는 단계;

(2) 단계 (1)에서 수득된 수확 세포 배양액을 정제 공정에 적용하여, 단계 (1)에서 생성된 수확 세포 배양액에 존재하는 바람직하지 않은 불순물을 감소된 양으로 갖거나 실질적으로 함유하지 않는 에타너셉트-함유 단백질 혼합물을 수득하는 단계;

(3) 단계 (2)에서 수득된 에타너셉트-함유 단백질 혼합물을, 상기 혼합물에 함유된 단백질을 이온 교환 모이어티들과 소수성 상호작용 모이어티들 둘 다를 갖는 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 부착시키기 위해, 상기 수지와 1회 이상 접촉시키는 단계; 및

(4) 단계 (3)으로부터의 상기 단백질 결합 수지를, 상기 혼합 모드 수지로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 용출시키는 용액과 접촉시켜, 단계 (3)에서 상기 수지에 도입된 에타너셉트-함유 혼합물에서보다 부정확하게 폴딩된 에타너셉트에 비해 더 높은 비율의 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 갖는 에타너셉트-함유 단백질 혼합물을 포함하는 용출물을 수득하는 단계

를 포함하고, 여기서,

(i) 단계 (2)의 정제로부터 수득된 에타너셉트-함유 단백질 혼합물에 존재하는 단백질의 양은, 단계 (1)에서 수득된 수확 세포 배양액에 존재하는 에타너셉트계 단백질 혼합물의 양의 적어도 약 80wt%이고;

(ii) 단계 (4)에서 용출된 단백질 혼합물에 존재하는 정확하게 폴딩된 에타너셉트 단백질과 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 단백질의 합한 양은, 단계 (2)로부터 수득된 단백질 혼합물에 존재하는 그들의 양의 적어도 약 60wt%이며;

(iii) 단계 (4)의 용출물에 존재하는 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은, 단계 (1)에서 수득된 수확 세포 배양액에 존재하는 에타너셉트-함유 단백질 혼합물의 양의 적어도 약 30wt%, 바람직하게는 적어도 약 35wt%이고;

(iv) 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트는 단계 (4)에서 수득된 용출물의 적어도 약 90wt%, 바람직하게는 적어도 약 95wt%를 구성하는, 에타너셉트-함유 단백질 혼합물 안에 존재하는 부정확하게 폴딩된 에타너셉트에 비해 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양과 관련한 높은 순도를 갖는 에타너셉트-함유 단백질 혼합물의 제조방법.

KK. 양태 JJ에 있어서, 상기 혼합 모드 수지는 CAPTO MMC 및 CAPTO ADHERE로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.

LL. 양태 JJ 또는 KK에 있어서,

단계 (5): 단계 (4)의 용출물에서 수득된 단백질 혼합물을, 상기 혼합물에 함유된 단백질을 이온 교환 모이어티들과 소수성 상호작용 모이어티들 둘 다를 갖는 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 부착시키기 위해, 상기 수지와 접촉시키는 단계에 이어

단계 (6): 상기 수지를 이로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 용출시키는 용액과 접촉시켜, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트에 비해 더 높은 비율의 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 갖는 단백질 혼합물을 포함하는 용출물을 수득하는 단계

인 추가의 단계들을 포함하고;

여기서, 상기 추가의 단계 (5) 및 단계 (6)에서 사용되는 혼합 모드 수지는 단계 (3) 및 단계 (4)에서 사용되는 혼합 모드 수지와 동일하거나 상이한, 방법.

MM. 양태 LL에 있어서, 단계 (3) 및 단계 (4)에서 사용되는 상기 혼합 모드 수지는 CAPTO MMC이고, 단계 (5) 및 단계 (6)에서 사용되는 수지는 CAPTO ADHERE인, 방법.

NN. 양태 JJ 내지 MM 중 어느 하나에 있어서, 단계 4 (및/또는 양태 LL의 경우 단계 6)가 혼합 모드 수지로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 용출시키기 위해 혼합 모드 수지를 염 용액과 접촉시킴에 의해 수행되고, 임의로, (i) 염 용액의 농도가 용액과 수지의 상기 접촉 동안 단계 (4) 또는 (6)에서 점진적으로 증가되고; 임의로 (ii) 용출 용액의 pH가 용액과 수지의 상기 접촉 동안 단계 (4) 또는 (6)에서 점진적으로 증가되거나 감소되는, 방법.

00. 양태 JJ 내지 NN 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 단계에서 수득되는 생성물은 바이러스 여과 및/또는 접선 유동 여과와 같은 여과에 적용되는, 방법.

PP. 양태 JJ 내지 00 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 2는 단백질 A 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 수행되는, 방법.

QQ. 양태 JJ 내지 00 중 어느 하나에 있어서, 상기 단계 2는 소수성 모이어티들과 이온 교환 모이어티들을 갖는 혼합 모드 수지를 사용하여 수행되는, 방법.

RR. 양태 A 내지 PP 중 어느 하나에 있어서, 적어도 90wt%의 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 바람직하게는 약 5wt% 이하의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단백질 혼합물은, 하기 단계들 중의 하나 이상 이외의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하기 위한 어떠한 크로마토그래피 분리 또는 정제 단계를 수행하지 않고 수득되는, 방법:

(1) 임의로, 바람직하게는 단백질 A 크로마토그래피 정제 단계를 포함하는 하나 이상의 정제 단계(이러한 단계(들)은 에타너셉트계 단백질을 함유하는 수확 세포 배양액을 정제하는데 사용되며, 여기서, 정제 단계는 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하지 못한다);

(2) 양태 A에서 인용된 혼합 모드 크로마토그래피 단계 (3) 및 단계 (4) (또는 양태 LL에 따라 단계 3, 4, 5 및 6)의 1회 이상의 발생; 및

(3) 임의로, 분석 목적으로만 수행되는 하나 이상의 SEC, HIC 또는 기타의 크로마토그래피 단계.

SS. 양태 A 내지 RR 중 어느 하나에 있어서, 분석 목적으로만 수행되는 경우를 제외하고서는, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하는 수단으로서 단일 모드 소수성 상호작용 크로마토그래피의 사용을 배제하는, 방법.

TT. 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단백질 혼합물(여기서, 상기 혼합물은 양태 A 내지 SS 중 어느 하나의 방법으로 수득되고, 단백질 혼합물 중의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은 상기 혼합물의 약 5wt% 이하이다)을 함유하는 약제학적 제형을 TNF 매개된 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, TNF 매개된 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법.

UU. 양태 TT에 있어서, 상기 단백질 혼합물 중의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은 상기 혼합물의 약 3wt% 이하이고, 상기 혼합물 중의 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은 상기 혼합물의 약 95wt% 이상인, 방법.

VV. 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단백질 혼합물(여기서, 상기 단백질 혼합물 중의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은 상기 혼합물의 약 5wt% 이하이다)을 함유하는 약제학적 제형을 TNF 매개된 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, TNF 매개된 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법.

WW. 양태 TT 내지 VV에 있어서, 상기 단백질 혼합물 중의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은 상기 혼합물의 약 3wt% 이하이고, 상기 혼합물 중의 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양이 혼합물의 약 95wt% 이상인, 방법.

XX. 양태 TT 내지 VV 중 어느 하나에 있어서, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트(이의 응집물은 배제됨)의 합한 양이 상기 혼합물의 적어도 약 95wt%인, 방법.

YY. 양태 XX에 있어서, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트(이의 응집물은 배제됨)의 합한 양이 상기 혼합물의 적어도 약 98wt%인, 방법.

ZZ. 양태 A 내지 YY 중 어느 하나에 있어서, 용어 "부정확하게 폴딩된 에타너셉트"가, 달리 주지되지 않는 한, 정확하게 폴딩된 및/또는 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 응집물을 포함하는 것으로 이해되는, 방법 또는 조성물.

AAA. 양태 JJ 내지 QQ에 있어서, 단계 1의 수확 세포 배양물에 함유된 에타너셉트계 단백질의 양이 Fc elisa에 의해 측정되는, 방법.

BBB. 양태 JJ 내지 QQ 중 어느 하나에 있어서, 단계 4(또는 양태 LL의 경우에서와 같이, 단계 4 및 6)에서 혼합 모드 수지로부터 수득된 용출물에 존재하는 에타너셉트계 단백질의 양이 A280에서의 UV 흡광도에 의해 측정되는, 방법.

CCC. 양태 BBB에 있어서, 단계 2의 정제 공정으로부터 수득된 생성물에 존재하는 에타너셉트계 단백질의 양이 A280에서의 UV 흡광도에 의해 또는 Fc elisa에 의해 측정되는, 방법.

DDD. 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하기 위한 방법으로서, 이러한 분리를 달성하기 위해 크로마토그래피 수단들이 사용되고, 상기 크로마토그래피 수단들이, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 혼합물을 이온 교환 모이어티들과 소수성 모이어티들을 갖는 혼합 모드 크로마토그래피 수지와 접촉시킨 다음, 이로부터 용출시켜, 적어도 약 85wt%, 바람직하게는 적어도 약 90wt%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95wt%의 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 용출물을 수득하는 혼합 모드 크로마토그래피로 단독으로 이루어지거나 이러한 혼합 모드 크로마토그래피로 본질적으로 이루어지는, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하기 위한 방법.

EEE. 양태 DDD에 있어서, 상기 혼합 모드 수지는 CAPTO MMC 및 CAPTO ADHERE로부터 선택되고; 상기 용출은, 염 용액으로 수행되며, 증가하는 염 농도의 구배를 사용하여 임의로 적용되며; 상기 염 용액의 pH는, 약 4 내지 약 8.5의 범위이고, 상기 pH가 점진적으로 증가하거나 감소하는 구배로 임의로 적용되며; 상기 용출물은 일정 시간의 기간에 걸쳐 상기 수지로부터 수득되고, 상기 기간에 초기에 수집된 용출물은 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 함유하지 않거나 본질적으로 함유하지 않는, 방법.

Claims (31)

1. 부정확하게 폴딩된 에타너셉트(incorrectly folded etanercept)로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트(correctly folded etanercept)를 분리하기 위한 혼합 모드 크로마토그래피 방법으로서,
   (a) 소정의 에타너셉트-함유 단백질의 정확하게 폴딩된 형태(folded conformation)와 부정확하게 폴딩된 형태 둘 다를 포함하는 제1 에타너셉트-함유 단백질 혼합물을, 이온 교환 모이어티(moiety)들과 소수성 모이어티들 둘 다를 갖는 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합시키는 단계;
   (b) 상기 혼합 모드 수지를 염 용액과 접촉시킴에 의해 상기 혼합 모드 수지로부터 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 용출시켜, 상기 제1 에타너셉트 혼합물에서보다 더 높은 비율의 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 제2 에타너셉트-함유 단백질 혼합물을 수득하는 단계를 포함하고;
   상기 염 용액은 염화나트륨 또는 황산나트륨을 함유하고; 상기 염 용액은 0에서 1M로의 단계적 또는 선형 농도 구배로 적용되며;
   상기 부정확하게 폴딩된 에타너셉트는 단계 (b)에서 수득된 용출물의 10wt% 미만을 구성하고; 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트는 단계 (b)에서 수득된 용출물의 90wt% 이상을 구성하며; 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 상기 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 합한 양은 단계 (b)에서 수득된 용출물의 적어도 95wt%를 구성하고;
   상기 단계 (a) 및 (b)는 4.5 내지 8.5의 pH에서 수행되며; 상기 염 용액은 아르기닌을 추가로 포함하고;
   상기 방법은 분석 목적으로만 수행되는 경우를 제외하고서는, 소수성 상호작용 크로마토그래피의 사용을 배제하는, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하기 위한 혼합 모드 크로마토그래피 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 Capto™ MMC 혼합 모드 크로마토그래피 수지인, 혼합 모드 크로마토그래피 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 Capto™ Adhere 혼합 모드 크로마토그래피 수지인, 혼합 모드 크로마토그래피 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트 형태와 상기 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 형태는, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는, 혼합 모드 크로마토그래피 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 부정확하게 폴딩된 에타너셉트는 단계 (b)에서 수득된 용출물의 5wt% 이하를 구성하고; 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트는 단계 (b)에서 수득된 용출물의 90wt% 이상을 구성하며; 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 상기 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 합한 양은 단계 (b)에서 수득된 용출물의 적어도 95wt%를 구성하는, 혼합 모드 크로마토그래피 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 혼합 모드 수지는 Capto™ MMC이고, 상기 방법의 단계 (a) 및 (b)는 4.5 내지 7.5의 pH에서 수행되는, 혼합 모드 크로마토그래피 방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 혼합 모드 수지는 Capto™ Adhere이고, 단계 (a) 및 (b)는 4.5 내지 8.5의 pH에서 수행되며; 상기 용출 단계 (b)는 상기 혼합 모드 수지를 염 용액과 접촉시킴에 의해 수행되고, 상기 용액은 아르기닌을 추가로 포함하는, 혼합 모드 크로마토그래피 방법.
8. 제1항에 있어서, 단계 (b) 동안, 단계 (b)에서 상기 수지와 접촉하는 용액의 pH가 증가 또는 감소하는 구배로 적용되는, 혼합 모드 크로마토그래피 방법.
9. 제1항에 있어서, 단계 (b)의 상기 용출물에 존재하는 에타너셉트의 양은 A 280에서의 UV 흡광도에 의해 측정되고; 단계 (b)의 상기 용출물 중의 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 측정되며; 단계 (b)의 상기 용출물에 존재하는 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 합한 양은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되는, 혼합 모드 크로마토그래피 방법.
10. 제1항에 있어서,
    상기 방법이,
    단계 (a)와 단계 (b)를 수행함에 의해 1차 혼합 모드 분리(분리 #1)를 수행하고; 이어서,
    단계 (a)와 단계 (b)를 다시 수행함으로써 2차 혼합 모드 분리(분리 #2)를 수행하는 방식으로 2회 이상 실시되고,
    여기서, 분리 #1의 단계 (b)에서 수득된 상기 용출물은 분리 #2의 단계 (a)에서 에타너셉트 혼합물을 함유하는 용액으로서 사용되는, 혼합 모드 크로마토그래피 방법.
11. 제10항에 있어서, 분리 #1에서 사용되는 상기 혼합 모드 수지는, 분리 #2에서 사용되는 혼합 모드 수지와 동일하거나 상이한, 혼합 모드 크로마토그래피 방법.
12. 제10항에 있어서, 분리 #1 및 분리 #2는 하기 조합으로부터 선택되는 방식으로 수행되는, 혼합 모드 크로마토그래피 방법:
    분리 #1은 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO MMC를 사용하고,
    분리 #2는 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO ADHERE를 사용함;
    --------------
    분리 #1은 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO ADHERE를 사용하고,
    분리 #2는 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO MMC를 사용함;
    --------------
    분리 #1은 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO MMC를 사용하고,
    분리 #2는 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO MMC를 사용함; 또는
    --------------
    분리 #1은 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO ADHERE를 사용하고,
    분리 #2는 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO ADHERE를 사용함.
13. 제12항에 있어서, 분리 #1 및 분리 #2는 하기 방식으로 수행되는, 혼합 모드 크로마토그래피 방법:
    분리 #1은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO MMC를 사용하고;
    분리 #2는 상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지로서 CAPTO ADHERE를 사용함.
14. 제1항의 혼합 모드 크로마토그래피 방법으로 수득되는 에타너셉트-함유 단백질 혼합물, 또는 상기 혼합물을 포함하는 약제학적으로 허용되는 제형(formulation)으로서, 상기 에타너셉트-함유 단백질 혼합물은 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 상기 에타너셉트-함유 단백질 혼합물의 90wt% 이상을 구성하는 양으로 포함하고; 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 상기 에타너셉트-함유 단백질 혼합물의 5wt% 이하를 구성하는 양으로 포함하며; 상기 단백질 혼합물은 에타너셉트-함유 단백질 혼합물의 적어도 95wt%를 구성하는 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 합한 양을 갖는, 제1항의 혼합 모드 크로마토그래피 방법으로 수득되는 에타너셉트-함유 단백질 혼합물, 또는 상기 혼합물을 포함하는 약제학적으로 허용되는 제형.
15. TNF 알파 매개된 상태에 대한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 에타너셉트를 함유하는 제1항의 방법으로 얻어지는 약제학적으로 허용되는 제형으로서, 상기 제형은 다량의 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 소량의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단백질 혼합물을 함유하며,
    (i) 상기 부정확하게 폴딩된 에타너셉트는 상기 단백질 혼합물의 10wt% 미만을 구성하고;
    (ii) 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트는 상기 단백질 혼합물의 90wt% 이상을 구성하며;
    (iii) 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 상기 부정확하게 폴딩된 에타너셉트(이들의 응집물은 포함하지 않음)의 총량은 상기 단백질 혼합물의 적어도 95중량%를 구성하고, 혼합 모드 크로마토그래피 이외에 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하기 위한 크로마토그래피 분리 또는 정제 단계를 수행하지 않고서 수득되고;
    상기 제형은 약제학적으로 허용되는 불활성 성분, 부형제 또는 담체를 추가로 포함하는, TNF 알파 매개된 상태에 대한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 에타너셉트를 함유하는 약제학적으로 허용되는 제형.
16. 제15항에 있어서, 에타너셉트 제제(preparation)는, 상기 제형의 25 내지 75mg/ml를 구성하고, 상기 제형은 수크로즈, 염화나트륨, 및 인산나트륨을 추가로 포함하는, 약제학적으로 허용되는 제형.
17. 제1항에 있어서, 상기 방법은,
    (1) 에타너셉트를 발현시켜, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 둘 다를 포함하는 에타너셉트-함유 단백질 혼합물을 함유하는 수확 세포 배양액을 수득하는 단계;
    (2) 단계 (1)에서 수득된 수확 세포 배양액을 정제 공정에 적용하여, 단계 (1)에서 수득된 수확 세포 배양액에 존재하는 바람직하지 않은 불순물의 양이 감소된 에타너셉트-함유 단백질 혼합물을 수득하는 단계;
    (3) 단계 (2)에서 수득된 에타너셉트-함유 단백질 혼합물을 이온 교환 모이어티들과 소수성 상호작용 모이어티들 둘 다를 갖는 혼합 모드 크로마토그래피 수지와 1회 이상 접촉시켜 상기 혼합물에 함유된 단백질을 상기 수지에 부착시키는 단계; 및
    (4) 단계 (3)으로부터의 상기 단백질 결합 수지를, 상기 혼합 모드 수지로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 용출시키는 용액과 접촉시켜, 에타너셉트-함유 단백질 혼합물을 포함하는 용출물을 수득하는 단계를 포함하고;
    상기 용액은 염화나트륨, 황산나트륨, 또는 아르기닌을 함유하는 염 용액이고; 상기 염 용액은 0에서 1M로의 단계적 또는 선형 농도 구배로 적용되고;
    상기 단계 (4)는 4.5 내지 8.5의 pH에서 수행되며, 여기서,
    (i) 단계 (2)의 정제로부터 수득된 에타너셉트-함유 단백질 혼합물에 존재하는 단백질의 양은, 단계 (1)에서 수득된 수확 세포 배양액에 존재하는 에타너셉트계 단백질 혼합물의 양의 적어도 80wt%이고;
    (ii) 단계 (4)에서 용출된 단백질 혼합물에 존재하는 정확하게 폴딩된 에타너셉트 단백질과 부정확하게 폴딩된 에타너셉트 단백질의 합한 양은, 단계 (2)로부터 수득된 단백질 혼합물에 존재하는 그들의 양의 적어도 60wt%이며;
    (iii) 단계 (4)의 용출물에 존재하는 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은, 단계 (1)에서 수득된 수확 세포 배양액에 존재하는 에타너셉트-함유 단백질 혼합물의 양의 적어도 30wt%이고;
    (iv) 상기 정확하게 폴딩된 에타너셉트는 단계 (4)에서 수득된 용출물의 적어도 90wt%를 구성하고;
    상기 방법은 분석 목적으로만 수행되는 경우를 제외하고서는, 소수성 상호작용 크로마토그래피의 사용을 배제하는, 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 혼합 모드 수지는 CAPTO MMC 및 CAPTO ADHERE로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
19. 제18항에 있어서,
    단계 (5): 단계 (4)의 용출물에서 수득된 단백질 혼합물을 이온 교환 모이어티들과 소수성 상호작용 모이어티들 둘 다를 갖는 혼합 모드 크로마토그래피 수지와 접촉시켜 상기 혼합물에 함유된 단백질을 상기 수지에 부착시키는 단계에 이어,
    단계 (6): 상기 수지를 이로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 용출시키는 용액과 접촉시켜, 단백질 혼합물을 포함하는 용출물을 수득하는 단계
    인 추가의 단계들을 포함하고;
    여기서, 상기 추가의 단계 (5) 및 단계 (6)에서 사용되는 혼합 모드 수지는 단계 (3) 및 단계 (4)에서 사용되는 혼합 모드 수지와 동일하거나 상이한, 방법.
20. 제19항에 있어서, 단계 (3) 및 단계 (4)에서 사용되는 상기 혼합 모드 수지는 CAPTO MMC이고, 단계 (5) 및 단계 (6)에서 사용되는 수지는 CAPTO ADHERE인, 방법.
21. 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 단백질 혼합물을 함유하고, 여기서, 상기 단백질 혼합물 중의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은 상기 혼합물의 5wt% 이하인, 제1항의 방법으로 얻어지는 TNF 매개된 질환을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
22. 제21항에 있어서, 상기 단백질 혼합물 중의 부정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은 상기 혼합물의 3wt% 이하이고, 상기 혼합물 중의 정확하게 폴딩된 에타너셉트의 양은 상기 혼합물의 95wt% 이상인, 약제학적 조성물.
23. 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하기 위한 방법으로서, 이러한 분리를 달성하기 위해 크로마토그래피 수단들이 사용되고, 상기 크로마토그래피 수단들이, 정확하게 폴딩된 에타너셉트와 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 혼합물을 이온 교환 모이어티들과 소수성 모이어티들을 갖는 혼합 모드 크로마토그래피 수지와 접촉시킨 다음, 이로부터 용출시켜, 적어도 95wt%의 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 포함하는 용출물을 수득하는 혼합 모드 크로마토그래피로 단독으로 이루어지거나 이러한 혼합 모드 크로마토그래피로 본질적으로 이루어지고, 상기 방법은 분석 목적으로만 수행되는 경우를 제외하고서는, 소수성 상호작용 크로마토그래피의 사용을 배제하는, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하기 위한 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 혼합 모드 수지는 CAPTO MMC 및 CAPTO ADHERE로부터 선택되고; 상기 용출은, 염 용액으로 수행되며, 증가하는 염 농도의 구배를 사용하여 임의로 적용되며; 상기 염 용액의 pH는, 4 내지 8.5의 범위이고, 상기 pH가 점진적으로 증가하거나 감소하는 구배로 임의로 적용되며; 상기 용출물은 일정 시간의 기간에 걸쳐 상기 수지로부터 수득되고, 상기 기간에 초기에 수집된 용출물은 부정확하게 폴딩된 에타너셉트를 함유하지 않거나 본질적으로 함유하지 않는, 부정확하게 폴딩된 에타너셉트로부터 정확하게 폴딩된 에타너셉트를 분리하기 위한 방법.
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