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KR102048855B1 - 암 면역요법을 위한 ror1(ntrkr1) 특이적 키메라 항원 수용체 - Google Patents

암 면역요법을 위한 ror1(ntrkr1) 특이적 키메라 항원 수용체 Download PDF

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KR102048855B1
KR102048855B1 KR1020177005614A KR20177005614A KR102048855B1 KR 102048855 B1 KR102048855 B1 KR 102048855B1 KR 1020177005614 A KR1020177005614 A KR 1020177005614A KR 20177005614 A KR20177005614 A KR 20177005614A KR 102048855 B1 KR102048855 B1 KR 102048855B1
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Abstract

본 발명은 선택된 막 항원에 대한 면역 세포 특이성 및 반응성을 재조정할 수 있는 재조합 키메라 단백질인 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것으로, 더욱 특히 결합하는 세포외 리간드는 ROR1 양성 세포에 대한 특정 면역성을 제공하는 ROR1 모노클로날 항체로부터 유래된 scFV이다. 상기 CAR이 제공된 공학 처리된 면역 세포는 림프종 및 백혈병, 및 고형 종양, 예를 들어, 유방, 결장, 폐, 및 신장 종양을 치료하는데 특히 적합하다.

Description

암 면역요법을 위한 ROR1(NTRKR1) 특이적 키메라 항원 수용체{ROR1(NTRKR1) SPECIFIC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS FOR CANCER IMMUNOTHERAPY}
본 발명은 대부분의 골수성 세포에서 발견되는 세포 표면 당단백질인 ROR1에 대한 면역 세포 특이성 및 반응성을 재조정할 수 있는 재조합 키메라 단백질이며, 환자에서 만성 림프성 백혈병(CLL) 또는 고형 종양, 예를 들어, 유방, 결장, 폐 및 신장 종양을 진단하기 위해 이용되는 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다. 본 발명에 따른 CAR은 T-세포 또는 NK 세포에서 발현되는 경우 ROR1 항원을 갖는 악성 세포를 치료하는데 특히 유용하다. 발생된 공학 처리된 면역 세포는 악성 세포에 대한 높은 수준의 특이성을 나타내어, 면역요법에 대한 안전성 및 효율을 제공한다.
생체 외에서 발생된 자가 항원-특이적 T 세포의 전달을 수반하는 입양 면역요법은 바이러스 감염 및 암을 치료하는데 가망성이 있는 전략이다. 입약 면역요법에 사용되는 T 세포는 항원-특이적 T 세포의 확장 또는 유전공학을 통한 T 세포의 재조정에 의해 생성될 수 있다(Park, Rosenberg et al. 2011). 바이러스 항원 특이적 T 세포의 전달은 바이러스 감염 및 희귀한 바이러스-관련 악성종양과 관련된 이식의 치료에 사용되는 널리 확립된 시술이다. 유사하게, 종양 특이적 T 세포의 분리 및 전달은 흑색종을 치료하는데 성공적인 것으로 밝혀졌다.
T 세포에서의 신규한 특이성이 트랜스제닉 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)의 유전적 전달을 통해 성공적으로 발생되어 왔다(Jena, Dotti et al. 2010). 3세대의 CAR에 대한 개략적 표시가 도 1에 제시되어 있다. CAR은 단일 융합 분자 내에서 하나 이상의 신호전달 도메인과 회합되는 표적화 모이어티로 구성된 합성 수용체이다. 일반적으로, CAR의 결합 모이어티는 가요성 링커에 의해 연결된 모노클로날 항체의 가볍고 가변적인 단편을 포함하는 단일-사슬 항체(scFv)의 항원-결합 도메인으로 구성된다. 수용체 또는 리간드 도메인을 기초로 한 결합 모이어티가 또한 성공적으로 이용되어 왔다. 1세대 CAR에 대한 신호전달 도메인은 CD3제타 또는 Fc 수용체 감마 사슬의 세포질 영역으로부터 유래된다. 1세대 CAR은 T-세포 세포독성을 성공적으로 재조정하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이들은 생체 내에서 장기간의 확장 및 항-종양 활성을 제공하는데는 실패했다. 공동-자극 분자로부터의 신호전달 도메인 뿐만 아니라 막횡단 및 힌지 도메인이 첨가되어 2세대 및 3세대의 CAR을 형성하였고, 이는 인간에서 일부 성공적인 시험적 치료를 발생시켰으며, 여기서 T-세포는 CD19를 발현하는 악성 세포에 대해 재조정될 수 있었다(June, et al., 2011). 그러나, CD19 ScFv와 관련하여 사용된 신호전달 도메인, 막횡단 및 공동-자극 도메인의 특정 조합은 오히려 항원-특이적이었고, 임의의 항원 마커로 확장될 수 없었다.
만성 림프성 백혈병(CLL)은 활동하고 있는 혈액학자에 의해 다루어지는 가장 흔하게 진단되는 백혈병 중 하나이다. 몇 년 동안, CLL을 갖는 환자는 긴 자연 병력 및 완전한 반응을 거의 발생시키지 않는 단지 약간 효과적인 요법을 갖는 것으로 유사하게 간주되어 왔다. 최근에, VH 돌연변이 상태 및 관련된 ZAP-70 과다발현, 파괴된 p53 기능, 및 염색체 이상의 생물학적 유의성과 관련된 여러 중요한 관찰은 초기 질병 진행 및 열악한 생존에 대해 높은 위험이 있는 환자를 확인하는 능력을 초래시켰다. 이들 연구와 동시에, 뉴클레오시드 유사체, 모노클로날 항체 리툭시맙(rituximab) 및 알렘투주맙(alemtuzumab)을 포함하는 여러 치료가 도입되었다. 임상 시험에서의 이들 요법의 조합은 대증 CLL에 대한 최초 요법으로 적용되는 경우 높은 전면적이고 종합적인 반응률을 발생시켰다. 따라서, CLL의 최초 위험 층화 및 치료의 복잡성이 유의하게 증가되었다. 더구나, 이들 최초 요법이 작용하지 않는 경우, 플루다라빈(fludarabine)-무반응성 질병을 갖는 CLL 환자의 접근법은 매우 난제일 수 있다(Byrd J.C et al, 2014).
만성 림프성 백혈병(CLL)에 대한 면역요법의 한 후보 항원은 티로신-단백질 키나제 막횡단 수용체 ROR1(NTRKR1으로도 언급됨; UniProtKB/TrEMBL) entries : Q01973)이다. ROR1(수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1)은 세포외 면역글로불린(Ig)-유사, Kringle, 및 Frizzled-유사 시스테인 풍부 도메인을 함유하는 120-kDa의 당단백질이다(도 2). 이러한 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 중추신경계에서 신경돌기 성장을 조절하는 수용체 티로신 키나제이다. 이는 타입 I 막 단백질이며, 세포 표면 수용체의 ROR 아과(subfamily)에 속한다(Reddy et al, 1997). 정상 백혈구와 관련하여 CLL을 갖는 환자에서의 ROR1 단백질 발현 및 CLL의 병리생물학에서의 이의 역할이 추가로 연구할만 하다. ROR1은 암 면역요법을 위한 적절한 표적일 수 있다(Daneshmanesh et al; 2008). ROR1은 확실히 다양한 B-세포 악성종양 뿐만 아니라 유방, 결장, 폐 및 신장 종양을 포함하는 일부 고형 종양의 서브셋에서 발현된다. ROR1은 종양발생 신호전달에서 상피성 종양에서의 종양 세포 생존을 촉진하는 기능을 하는 것으로 생각된다. 중요하게는, ROR1은 지방조직 및 췌장 조직을 제외한 중요한 기관에서 발현되지 않고, 이는 정상 세포를 사멸시키는 잠재적 독성을 감소시킨다(Hudecek et al, 2013). ROR1은 배아형성 동안 발현되나, 미성숙 B-세포 전구체의 서브셋을 제외하고 정상 성인 조직에는 부재하며, 지방세포에서는 낮은 수준으로 발현된다(Hudecek et al., 2010; Matsuda et al., 2001). ROR1은 전사 프로파일링에 의해 B-세포 만성 림프성 백혈병(B-CLL)에서 발현되는 것으로 처음 밝혀졌고(Klein et al., 2001; Rosenwald et al., 2001), 외투 세포 림프종(MCL), t(1;19) 염색체 전위를 갖는 급성 림프모구 백혈병(ALL), 및 폐암, 유방암, 결장암, 췌장암, 신장암 및 난소암의 서브셋을 포함하는 많은 암의 표면에서 이후에 확인되었다(Baskar et al., 2008; Bicocca et al., 2012; Daneshmanesh et al., 2008; Dave et al., 2012; Fukuda et al., 2008; Yamaguchi et al., 2012; Zhang et al., 2012a, 2012b). 폐 샘암종 및 t(1;19) ALL 둘 모두에서, ROR1은 종양발생 신호전달에서 협력하며, siRNA를 이용한 ROR1의 넉다운은 종양 세포 생존을 유지시키는데 있어서 상기 분자의 중요한 역할을 밝혀내었다(Bicocca et al., 2012; Choudhury et al., 2010; Gentile et al., 2011; Yamaguchi et al., 2012). 따라서, ROR1 손실은 종양에 의해 용이하게 용인되지 않을 수 있어, 이를 광범위하게 적용될 수 있는 CAR 재조정 T-세포 요법을 위한 매력적인 후보로 만든다. 따라서, 본 발명자는 ROR1이 CAR-발현 T 세포를 이용함으로써 CLL 뿐만 아니라 고형 종양, 예를 들어, 유방, 결장, 폐, 난소 및 신장 종양을 치료하기 위한 가치 있는 표적 항원일 수 있는 것으로 간주하였다.
스탠리 리델 박사(Dr. Stanley Riddell) 및 로렌스 쿠퍼 박사(Dr. Laurence Cooper)의 실험실에서 이전에 4A5 및 2A2 scFv를 각각 함유하는 항-ROR1 scCAR를 설계하고 확인하였다(Cooper et al 2010; Hudecek et al.,2013). 특히, 후데섹 등(Hudecek et al)은 다양한 길이의 IgG4 힌지 및 CD28 막횡단 도메인을 함유하는 항-ROR1 scCAR을 개시한다.
CAR 구조를 설계하고, 적합한 성분을 이용함으로써 CAR 기능성의 개선이 여전히 필요한데, 이는 이들 파라미터가 중요한 역할을 하고 미세한 조정이 필요하기 때문이다.
따라서, 이전 전략에 대한 대안으로서, 본 발명은 ROR1 악성 세포를 표적으로 하기 위해 면역 세포에서 발현될 수 있는 유의한 임상적 장점을 갖는 ROR1 특이적 CAR을 제공한다. 본 발명자는 CAR 구조를 적합한 성분의 선택과 조합함으로써 이들이 암성 표적 세포에 대한 높은 세포독성을 갖는 특이적 ROR1 단일 사슬 CAR을 획득할 수 있는 것을 발견하였다.
발명의 개요
본 발명자는 다양한 구조를 갖고, 다양한 ROR1 특이적 항체로부터 유래된 다양한 scFV를 포함하는 ROR1 특이적 CAR을 생성시켰다.
본 발명에 따른 ROR1(NTRKR1) 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)는 도 4에 예시된 바와 같은 V1 내지 V6으로부터 선택된 폴리펩티드 구조 중 하나를 가질 수 있으며, 상기 구조는 모노클로날 항-ROR1 항체로부터의 VH 및 VL을 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인, 힌지, 막횡단 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인 및 4-1BB로부터의 공동-자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다.
더욱 특히, 본 발명에 따른 ROR1(NTRKR1) 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)는 도 4에 예시된 바와 같은 V3, V5 및 V1으로부터 선택된 폴리펩티드 구조 중 하나를 가질 수 있으며, 상기 구조는 모노클로날 항-ROR1 항체로부터의 VH 및 VL을 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인, 힌지, CD8α 막횡단 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인 및 4-1BB로부터의 공동-자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다. 이러한 ROR1(NTRKR1) 특이적 항원 수용체는 세포독성과 관련하여 예기치 않은 우수한 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.
한 구체에에서, ROR1 특이적 CAR은 구조 V1을 갖고, FcγRIIIα 힌지 및 CD8α 막횡단 도메인을 포함한다.
바람직한 구체예에서, ROR1 특이적 CAR은 구조 V3를 갖고, CD8α 힌지 및 CD8α 막횡단 도메인을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, ROR1 특이적 CAR은 구조 V5를 갖고, IgG1 힌지 및 CD8α 막횡단 도메인을 포함한다.
특히, H10 및 D10 항-ROR1 항체로부터 유래된 상기 항원 결합 도메인(scFv)은 현저한 항암 특성을 나타내었다.
더욱이, 인간화 scFv가 뮤린 H10 및 D10 항-ROR1 항체로부터 생성되었다.
본 발명의 바람직한 CAR 폴리펩티드는 SEQ ID NO.79 내지 138로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 시험관 내에서의 비특이적 활성화(예를 들어, 항 CD3/CD28 코팅된 비드 및 재조합 IL2를 이용함) 후, 공여자로부터의 T-세포가 바이러스 형질도입을 이용하여 이들 CAR을 발현하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환되었다. 특정 예에서, T-세포는 이식편 대 숙주 반응을 예방하기 위해 더욱 특히 TCR의 성분(αβ - T-세포 수용체)의 파괴에 의해 비-동종반응성 T-세포를 생성시키도록 추가로 공학 처리되었다. 본 발명의 CAR은 동종이형 T-세포의 상황에서 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다.
생성된 공학 처리된 T-세포는 ROR1 양성 세포에 대해 다양한 정도로 시험관 내에서 반응성을 나타내었고, 이는 본 발명의 CAR이 T-세포의 항원 의존성 활성화, 및 또한 증식에 기여하는 것을 나타내며, 이는 이들을 면역요법에 유용하게 만든다.
본 발명의 CAR을 인코딩하는 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열은 본 발명의 명세서에 상술된다.
본 발명의 공학 처리된 면역 세포는 치료적 적용, 예를 들어, 만성 림프성 백혈병(CLL), 소림프구 림프종(SLL), 외투 세포 림프종(MCL), t(1;19) 염색체 전위를 갖는 급성 림프모구 백혈병(ALL)을 치료하는데 특히 유용하다. 이들은 또한 고형 종양, 예를 들어, 유방, 결장, 폐, 및 신장 종양을 치료하기 위해 이용될 수 있다.
도 1: 단일 사슬 키메라 항원 수용체(scCAR)는 가장 일반적으로 특정 항원에 결합하는 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역(도 1a)을 T 세포 신호전달 분자의 세포내 부분, 예를 들어, TCR-관련 CD3 복합체의 성분(ζ
Figure 112017020005290-pct00001
사슬)(도 1b)에 연결시킴으로써 생성된다. 1세대의 scar는 활성화 신호를 전달하는 T 세포 신호전달 도메인만 함유한다(도 1c 좌측). 2세대 scCAR는 생체 내에서 T 세포 지속 및 항-종양 기능을 향상시키는 단일 공동자극 분자 엔도도메인, 예를 들어, CD28 또는 41BB의 엔도도메인(도 1c 중간)을 또한 포함한다. 3세대 scCAR은 적어도 2개의 공동자극 분자 엔도도메인, 예를 들어, CD28 및 41BB의 엔도도메인을 포함한다(도 1c 우측).
도 2: 세포외 부분, 막횡단 부분, 및 세포내 도메인으로 구성된 ROR1 단백질의 구조; 세포외 부분 및 세포내 도메인은 이전에 설명된 바와 같이 다수의 부분을 함유한다.
도 3a, 3b, 3c 및 3d: (I) D10 및 H10 VH 및 VL 뮤린 서열로부터의 서열과 면역글로불린의 가변 영역을 인코딩하는 V 및 J 유전자에 의해 인코딩된 점라인 인간 서열의 정렬, 이들 서열은 뮤린 서열과 높은 상동성을 공유한다. 안정성 목적(특히, CDR의 안정성 목적)을 위해, AA의 "가장 중요한" 위치가 뮤린 기원되어야 하는 AA에 해당하는 상부 라인에서 화살표에 의해 제시되며, 하부 라인의 "덜 중요한" 위치는 인간 또는 뮤린 기원일 수 있는 위치이다. (II) MGT/DomainGapAlign(Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005))은 D10 및 H10 VH 및 VL 뮤린 서열의 도메인 아미노산 서열을 정렬시키고, "IMGT-갭(gap)"을 수행하는 것을 가능케 한다. 입력 서열이 제시되고, V-REGION, C-DOMAIN 및 C-LIKE-DOMAIN에 대한 IMGT의 독특한 넘버링에 따라 갭과 함께 IMGT 도메인 디렉토리의 가장 가까운 점라인 V-REGION 또는 가장 가까운 C-DOMAIN과 정렬된다.
도 4: 다양한 CAR 구조의 개략적 표현(V1 내지 V6).
도 5: 다양한 인간 세포주 상의 ROR1 표면 분자의 수.
도 6: scCAR 스크리닝 절차
도 7: 인간 T 세포에서의 scCAR의 전체 발현. (A) 실험 1. (B) 실험 2.
도 8: 인간 T 세포에서의 scCAR의 세포 표면 발현. (A) 실험 1. (B) 실험 2.
도 9: 표적 세포와의 공동-배양시 scCAR 변형된 T 세포의 탈과립. 실험 1. (B) 실험 2(좌측으로부터 우측으로 세포주 및/또는 처리: MDA-MB-2301, PC-3, MCF-7, 활성화 없음, PMA+ 이오노마이신(ionomycin)).
도 10: 인간 T 세포에서의 scCAR의 세포 표면 발현. 데이터는 4개의 독립적 실험의 평균 +/- SD로 제공된다.
도 11: 표적 세포와의 공동-배양시 scCAR 변형된 T 세포의 탈과립. 데이터는 4개의 독립적 실험의 평균 +/- SD로 제공된다.
도 12: 표적 세포와의 공동-배양시 scCAR-변형된 T 세포에 의한 IFNγ 생성. 데이터는 4개의 독립적 실험의 평균 +/- SD로 제공된다(좌측으로부터 우측으로 세포주 및/또는 처리: Jeko-1, K562, MDA-MB-2301, PC-3, MCF-7, 활성화 없음).
도 13: 부착 표적 세포와의 공동-배양시 scCAR-변형된 T 세포의 세포독성 활성. 데이터는 4개의 독립적 실험의 평균 +/- SD로 제공된다.
도 14: 현탁 표적 세포와의 공동-배양시 scCAR-변형된 T 세포의 세포독성 활성. 데이터는 4개의 독립적 실험의 평균 +/- SD로 제공된다.
도 15: 본 발명에 따른 공학 처리된 면역 세포의 개략적 표현. 이러한 도면에 제공된 공학 처리된 면역 세포는 CAR을 인코딩하는 레트로바이러스 폴리펩티드로 형질도입된 T-세포이다. 이러한 T-세포는 환자로의 더 낫고 안전한 이식을 가능케 하도록 추가로 공학 처리되며, 이는 본 발명의 구성 내에서 선택적이다. X 유전자는, 예를 들어, TCR의 성분(TCR알파 또는 TCR베타)을 발현하는 유전자일 수 있고, Y는 면역-억제 약물에 대한 T-세포의 민감성과 관련된 유전자, 예를 들어, CD52(알렘투주맙(alemtuzumab)과 관련됨) 또는 HPRT(6-티오구아닌과 관련됨)일 수 있다.
표 1: scFv가 아닌 다양한 CAR 성분의 서열
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표 2: 뮤린 기원의 scFv의 서열, 이들 scFv의 이들의 CDR 및 D10 및 H10으로부터의 인간화 scFv
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표 3: 구조 V-1의 CAR
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표 4: 구조 V-2의 CAR
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표 5: 구조 V-3의 CAR
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표 6: 구조 V-4의 CAR
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표 7: 구조 V-5의 CAR
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표 8: 구조 V-6의 CAR
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발명의 상세한 설명
본원에서 특별히 정의되지 않는 한, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 유전자 요법, 생화학, 유전학 및 분자생물학 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 모든 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 이용될 수 있으며, 적합한 방법 및 물질이 본원에 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 이들의 전체내용이 참조로서 포함된다. 상충의 경우, 정의를 포함하는 본 발명의 명세서가 우선한다. 추가로, 물질, 방법 및 예는 단지 예시이며, 달리 특정하지 않는 한 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 실시는 달리 지정하지 않는 한 당 분야의 기술 범위 내에 있는 세포생물학, 세포 배양, 분자생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 상기 기술은 문헌에 의해 충분히 설명된다. 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); 시리즈인, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), 특히, Vols.154 및 155 (Wu et al. eds.) 및 Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); 및 Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)]을 참조한다.
ROR1 특이적 키메라 항원 수용체
본 발명은 세포외 리간드-결합 도메인, 막횡단 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는 항-ROR1 키메라 항원 수용체(CAR)의 새로운 설계에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "세포외 리간드-결합 도메인"은 리간드에 결합할 수 있는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드로 정의된다. 바람직하게는, 도메인은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 세포외 리간드-결합 도메인은 특정 질병 상태와 관련된 표적 세포 상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인지하도록 선택될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 세포외 리간드-결합 도메인은 가요성 링커에 의해 연결된 표적 항원 특이적 모노클로날 항 CD-123 항체의 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 가변 단편을 포함하는 단일 사슬 항체 단편(scFv)을 포함한다. 상기 VL 및 VH는 바람직하게는 표 2에 나타낸 바와 같이 2A2, 4A5 및 D10으로 언급되는 항체로부터 선택된다.
또한, G6, G3, H10, 2A4 및 1C11의 VL 및 VH를 또한 언급하는 표 2는 이들 각각의 서열 SEQ ID NO.37, 41, 45, 49, 53, 58, 63, 67, 71 및 75 뿐만 아니라 각각의 서열 SEQ ID ID NO.31, 36, 57 및 62의 D10 및 H10의 인간화된 VL 및 VH를 개시한다.
도 4는 본 발명에 따른 CAR의 6 형태의 구조를 제시한다. 표 1은 예로서 추가 실험에서 사용된 성분을 제시한다.
본 발명에 따른 ROR1(NTRKR1) 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)는 도 4에 예시된 바와 같은 V1 내지 V6으로부터 선택된 폴리펩티드 구조 중 하나를 가질 수 있으며, 상기 구조는 모노클로날 항-ROR1 항체로부터의 VH 및 VL을 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인, 힌지, 막횡단 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인 및 4-1BB로부터의 공동-자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다.
더욱 특히, 본 발명은 도 4에 예시된 바와 같은 V3, V5 및 V1으로부터 선택된 폴리펩티드 구조 중 하나를 갖는 ROR1(NTRKR1) 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것으로, 상기 구조는 모노클로날 항-ROR1 항체로부터의 VH 및 VL을 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인, 힌지, CD8α 막횡단 도메인 및 CD3 제타 신호전달 도메인 및 4-1BB로부터의 공동-자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다.
항원-결합 도메인
본 발명의 ROR1 CAR의 항원 결합 도메인은 모노클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 및 이들의 기능성 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 조직외 항원에 결합하는 임의의 도메인일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 세포외 리간드-결합 도메인은 가요성 링커에 의해 연결된 표적 항원 특이적 모노클로날 ROR1 항체의 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 가변 단편을 포함하는 단일 사슬 항체 단편(scFv)을 포함한다. 상기 VL 및 VH는 바람직하게는 표 2에 나타낸 바와 같이 H10, D10, 4A5, G6, G3, 2A2, 2A4, 및 1C11로 언급되는 항체로부터 선택된다. 이들은 바람직하게는, 예를 들어, 서열 SEQ ID NO:10을 포함하는 가요성 링커에 의해 함께 연결된다. 즉, 상기 CAR은 형태 V1 내지 V6에 대해 표 3 내지 표 8에 도시된 바와 같이 사이에 링커를 갖는 VH 및 VL 사슬의 조합으로부터 발생된 서열과 적어도 90%, 95% 97% 또는 99%의 동일성을 나타내는 폴리펩티드 서열을 포함하는 세포외 리간드-결합 도메인을 포함한다.
특히 바람직한 구체예에서, 상기 VL 및 VH는 항체 H10으로부터 유래된다.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 VL 및 VH는 항체 D10으로부터 유래된다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 항체"는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성되는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 박테리오파지, 효모 발현 시스템 또는 포유동물 세포 발현 시스템, 더욱 특히 항체의 CDR 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입된 T 세포에 의해 발현된 항체 또는 항체 단편을 의미한다. 상기 용어는 또한 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체 또는 항체 단편을 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 상기 DNA 분자는 항체 또는 항체 단편 단백질, 또는 항체 또는 항체 단편을 특정하는 아미노산 서열을 발현하고, 상기 DNA 또는 아미노산 서열은 당 분야에서 이용 가능하고 널리 공지된 재조합 또는 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 이용하여 획득된다.
본원에서 사용되는 용어 "인간화 항체"는 폴리펩티드가 인간화 중쇄 가변 영역 및 인간화 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 모(parental) 모노클로날 항체의 항원-결합 특이성을 실질적으로 보유하면서 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 프레임워크(FR) 영역을 포함할 수 있다. 인간화 중쇄 가변 영역 및/또는 인간화 경쇄 가변 영역은 상보성-결정 영역(CDR)을 제외하고 적어도 약 87%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 100% 인간화된다. 항원-결합 폴리펩티드 분자는 모노클로날 항체 공여자(예를 들어, 마우스 모노클로날 항체 공역자)로부터 유래될 수 있고, 모노클로날 항체로부터의 CDR(예를 들어, 마우스 모노클로날 CDR)을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 또는 바이러스-형질전환된 림프구의 실험실-성장된 세포 클론에 의해 생성된 항체를 의미하며, 이는 천연 항체보다 더욱 풍부하고 균일하며, ROR1 항원 상의 단일 부위에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 여러 상이한 면역 세포로부터 제조되는 폴리클로날 항체와 대조적으로 단일한 모세포의 모든 클론인 동일한 면역 세포에 의해 제조되는 일특이적 항체이다. 모노클로날 항체는 일가 친화성을 가지며, 즉, 이들은 동일 에피토프에 결합한다.
본 발명은 상기와 같은 ROR1 특이적 키메라 항원 수용체(ROR1 CAR)를 개시하며, 상기 세포외 리간드 결합-도메인은 인간화된 VH 및 VL 사슬을 포함한다.
표 2는 D10 및 H10 항-ROR1 항체에 해당하는 인간화 scFv(VH 및 VL 사슬)의 서열을 제시한다.
도 3a 내지 3d는 문헌[Lefranc MP et al (Lefranc, MP, Ehrenmann F, Ginestoux C, Giudicelli V, Duroux P "Use of IMGT (®) databases and tools for antibody engineering and humanization", Methods Mol Biol. 2012; 907: 3-37)]에 따른 방법에 적용된 후의 뮤린의 D10 및 H10 scFv 대 이들의 인간화 형태의 정렬을 제공한다. 이들에서, 4개의 정렬이 표시된다:
- CDRs,
- 상단 화살표로 표시된 "가장 중요한" 아미노산(AA), 이들 AA는 뮤린 기원으로 유지되는 것을 의미한다;
- 상단 화살표로 표시된 "덜 중요한" 아미노산, 이들 AA는 뮤린 기원 또는 인간 기원일 수 있음을 의미하고; 본 발명의 인간화 서열은 실제로 인간 또는 뮤린 기원으로부터의 상기 "덜 중요한" AA의 모든 조합에 의해 제조될 수 있는 모든 상이한 서열의 세트이며; 이들 서열은 직전에 제시된 바와 같은 CDR 및 "가장 중요한" AA를 함유한다.
인간화 항체는 CDR-이식(예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 유럽 특허 번호 EP 239,400; 국제 공개 번호 WO 91/09967; 및 미국 특허 번호 5,225,539, 5,530,101, 및 5,585,089 참조), 베니어링(veneering) 또는 리서피싱(resurfacing)(예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 유럽 특허 번호 EP 592,106 및 EP 519,596; 문헌[Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; 및 Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973] 참조), 사슬 셔플링(예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 5,565,332 참조), 및 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0042664, 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0048617, 미국 특허 번호 6,407,213, 미국 특허 번호 5,766,886, 국제 공개 번호 WO 9317105, 문헌[Tan et al., J. Immunol., 169: 1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16): 10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), 및 Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)]에 개시된 기술을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 당 분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 종종, 프레임워크 영역 내의 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경시키기 위해, 예를 들어, 개선시키기 위해 CDR 공여 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환은 당 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어, 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정 위치에서 색다른 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다(예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 퀸 등(Queen et al.)의 미국 특허 번호 5,585,089; 및 리치만 등(Riechmann et al.)의 문헌[1988, Nature, 332:323]을 참조한다).
본 발명의 한 양태는 특히 도 4에 예시된 바와 같은 V3, V5 및 V1으로부터 선택된 폴리펩티드 구조 중 하나를 갖는 ROR1(NTRKR1) 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것으로, 상기 구조는 모노클로날 항-ROR1 항체로부터의 VH 및 VL을 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인, 힌지, CD8α 막횡단 도메인(CD8α TM) 및 CD3 제타 신호전달 도메인 및 4-1BB로부터의 공동-자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다.
바람직한 구체예에 따르면, 상기 막횡단 도메인은 SEQ ID NO.6(CD8α TM)과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 공유하는 폴리펩티드에 의해 인코딩된다.
또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 상기 힌지는 구조 V3, V5 및 V1에 대해 각각 SEQ ID NO.4(CD8α), SEQ ID NO.5(IgG1) 및 SEQ ID NO.3(FcγRIIIα)과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 공유하는 폴리펩티드에 의해 인코딩된다.
더욱 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 ROR1-특이적 CAR은 SEQ ID NO.4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CD8α 힌지 및 SEQ ID NO:6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CD8α 막횡단 도메인을 포함하는 폴리펩티드 구조 V3를 갖는다.
또 다른 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 ROR1 특이적 CAR은 SEQ ID NO.5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 IgG1 힌지 및 SEQ ID NO:6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CD8α 막횡단 도메인을 포함하는 폴리펩티드 구조 V5를 갖는다.
한 구체예에 따르면, 상기 ROR1(NTRKR1) 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)는 도 4에 예시된 바와 같은 V3, V5 및 V1으로부터 선택된 폴리펩티드 구조 중 하나를 갖고, 여기서 세포외 리간드 결합 도메인은 하기를 포함한다:
- SEQ ID NO.54(CDR-H1), SEQ ID NO:55(CDR-H2) 및 SEQ ID NO:56(CDR-H3)의 마우스 모노클로날 항체 H10으로부터의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 VH, 및;
- SEQ ID NO.59(CDR-L1), SEQ ID NO:60(CDR-L2) 및 SEQ ID NO:61(CDR-L3)의 마우스 모노클로날 항체 H10으로부터의 CDR을 포함하는 가변 경쇄 VL;
또는:
- SEQ ID NO.28(CDR-H1), SEQ ID NO.29(CDR-H2) 및 SEQ ID NO.30(CDR-H3)의 마우스 모노클로날 항체 D10으로부터의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 VH, 및;
- SEQ ID NO.33(CDR-L1), SEQ ID NO:34(CDR-L2) 및 SEQ ID NO:35(CDR-L3)의 마우스 모노클로날 항체 D10으로부터의 CDR을 포함하는 가변 경쇄 VL.
바람직한 구체예에서, 상기 ROR1(NTRKR1) 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)는 도 4에 예시된 바와 같은 V3, V5 및 V1으로부터 선택된 폴리펩티드 구조 중 하나를 가지며, 상기 세포외 리간드 결합-도메인은 하기와 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL 사슬을 포함한다:
- SEQ ID NO:53(H10-VH) 및 SEQ ID NO:58(H10-VL), 또는
- SEQ ID NO:27(D10-VH) 및 SEQ ID NO:32(D10-VL), 또는;
또 다른 구체예에서, 상기 ROR1(NTRKR1) 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)는 도 4에 예시된 바와 같은 V3, V5 및 V1으로부터 선택된 폴리펩티드 구조 중 하나를 갖고, 여기서 상기 세포외 리간드 결합-도메인은 인간화된 H10 또는 D10 항체로부터의 VH 및 VL 사슬을 포함한다.
특히, 상기 세포 리간드 결합-도메인은 인간화 VH 및 VL 사슬을 포함하며, 여기서
- 가변 중쇄 Hu H10 VH는 SEQ ID NO:57에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 갖고,
- 가변 경쇄 Hu H10 VH는 SEQ ID NO:62에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 갖고,
또는:
- 가변 중쇄 Hu D10 VH는 SEQ ID NO:31에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 갖고,
- 가변 경쇄 Hu D10은 SEQ ID NO:36에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 갖는다.
또 다른 구체예에 따르면, 상기 ROR1(NTRKR1) 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)는 도 4에 예시된 바와 같은 V3, V5 및 V1으로부터 선택된 폴리펩티드 구조 중 하나를 갖고, 여기서 상기 CAR 폴리펩티드는 SEQ ID NO:117(H10v3-CAR 서열), 또는 SEQ ID NO:93(D10v3-CAR 서열), 또는 SEQ ID NO:95(D10v5-CAR 서열)와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 공유한다.
CAR 구조
본 발명에 따른 CAR의 신호 전달 도메인 또는 세포내 신호전달 도메인은 면역 세포 및 면역 반응의 활성화를 발생시키는 표적으로의 세포외 리간드 결합 도메인의 결합 후의 세포내 신호전달을 담당한다. 즉, 신호 전달 도메인은 CAR이 발현되는 면역 세포의 일반적인 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 세포용해 활성 또는 사이토카인의 분비를 포함하는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "신호 전달 도메인"은 효과기 신호를 전달하고, 세포가 특화된 기능을 수행하도록 지정하는 단백질의 부분을 나타낸다.
CAR에서 사용하기 위한 신호 전달 도메인의 바람직한 예는 항원 수용체 진입 후 신호 전달을 개시하기 위해 일제히 작용하는 T 세포 수용체 및 공동-수용체의 세포질 서열 뿐만 아니라 동일한 기능적 능력을 갖는 상기 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 임의의 합성 서열일 수 있다. 신호 전달 도메이은 항원-의존성 일차 활성화를 개시시키는 것, 및 이차 또는 공동-자극 신호를 제공하기 위해 항원-독립적 방식으로 작용하는 것의 세포질 신호전달 서열의 2개의 별개의 부류를 포함한다. 일차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. ITAM은 syk/zap70 부류 티로신 키나제에 대한 결합 부위로 작용하는 다양한 수용체의 세포질내 꼬리에서 발견되는 널리 규명된 신호전달 모티프이다. 본 발명에서 사용되는 ITAM의 예는 TCR제타, FcR감마, FcR베타, FcR엡실론, CD3감마, CD3델타, CD3엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것을 비제한적인 예로 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, CAR의 신호 전달 도메인은 아미노산 서열(SEQ ID NO:9)과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 95% 97% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD3제타 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 CAR의 신호 전달 도메인은 공동-자극 신호 분자 또는 이의 일부를 포함한다. 공동-자극 분자는 효과적인 면역 반응에 필요한 항원 수용체 또는 이들의 리간드가 아닌 세포 표면 분자이다. "공동-자극 리간드"는 T-세포 상의 인지체 공동-자극 분자에 특이적으로 결합하고, 예를 들어, TCR/CD3 복합체와 펩티드가 로딩된 MHC 분자의 결합에 의해 제공된 일차 신호에 더하여 증식 활성화, 분화 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포 상의 분자를 나타낸다. 공동-자극 리간드는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공동자극 리간드(ICOS-L), 세포간 부착 분자(ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, 림프독소 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, Toll 리간드 수용체에 결합하는 효능제 또는 항체 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 공동-자극 리간드는 특히 T 세포 상에 존재하는 공동-자극 분자, 비제한적인 예로, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드와 특이적으로 결합하는 항체를 또한 포함한다.
"공동-자극 분자"는 공동-자극 리간드와 특이적으로 결합하여, 이에 의해 세포에 의한 공동-자극 반응, 비제한적인 예로, 증식을 매개하는 T-세포 상의 인지체 결합 파트너를 나타낸다. 공동-자극 분자는 MHC 부류 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 공동자극 분자의 예는 CD27, CD28, CD8, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 CAR의 신호 전달 도메인은 4-1BB(GenBank: AAA53133.) 및 CD28(NP_006130.1)의 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 공동-자극 신호 분자 또는 이의 일부를 포함한다. 특히, 본 발명의 CAR의 신호 전달 도메인은 SEQ ID NO:8로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99%의 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 CAR은 세포의 표면 막에서 발현된다. 따라서, 이러한 CAR은 막횡단 도메인을 추가로 포함한다. 적절한 막횡단 도메인의 특징적인 특징은 세포, 바람직하게는 본 발명에서 면역 세포, 특히 림프구 세포 또는 자연 살해(NK) 세포의 표면에서 발현되고, 소정의 표적 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 유도하기 위해 함께 상호작용하는 능력을 포함한다. 막횡단 도메인은 천연 또는 합성원으로부터 유래될 수 있다. 막횡단 도메인은 임의의 막-결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 비제한적인 예로, 막횡단 폴리펩티드는 T-세포 수용체의 서브유닛, 예를 들어, CD3 복합체를 구성하는 α, β, γ 또는
Figure 112017020005290-pct00013
폴리펩티드, IL2 수용체 p55(α 사슬), p75(β 사슬) 또는 γ-사슬, Fc 수용체, 특히 Fcγ 수용체 III 또는 CD 단백질의 서브유닛 사슬일 수 있다. 대안적으로, 막횡단 도메인은 합성 막횡단 도메인일 수 있고, 소수성 잔기, 예를 들어, 류신 및 발린을 우세하게 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 막횡단 도메인은 인간 CD8 알파 사슬(예를 들어, NP_001139345.1)로부터 유래된다. 막횡단 도메인은 상기 세포외 리간드-결합 도메인과 상기 막횡단 도메인 사이에 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "힌지 영역"은 일반적으로 막횡단 도메인을 세포외 리간드-결합 도메인에 연결시키는 기능을 하는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 특히, 힌지 영역은 더 나은 가요성 및 세포외 리간드-결합 도메인에 대한 더 나은 접근성을 제공하기 위해 이용된다. 힌지 영역은 300개 이하의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100개의 아미노산, 가장 바람직하게는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 천연 발생 분자의 모두 또는 일부, 예를 들어, CD8, CD4 또는 CD28의 세포외 영역의 전부 또는 일부, 또는 항체 불변 영역의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 힌지 영역은 천연 발생 힌지 서열에 상응하는 합성 서열일 수 있거나, 전적으로 합성 힌지 서열일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 힌지 도메인은 SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 및 SEQ ID NO.5로 본 명세서에서 각각 언급되는 인간 CD8 알파 사슬, FcγRIIIα 수용체 또는 IgG1의 부분, 또는 이들 폴리펩티드와 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 95% 97% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 힌지 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명에 따른 CAR은 일반적으로 더욱 특히 SEQ ID NO.6 또는 7의 폴리펩티드와 동일성을 나타내는 CD8α 및 4-1BB로부터 선택된 막횡단 도메인(TM)을 추가로 포함한다. SEQ ID NO.6의 CD8α TM이 바람직하다.
바람직한 구체예에 따르면, ROR1 특이적 CAR은 도 4에 예시된 바와 같은 V3, V5 및 V1으로부터 선택된 폴리펩티드 구조를 갖고, 상기 구조는 모노클로날 항-ROR1 항체로부터의 VH 및 VL을 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인, CD8α 힌지, CD8α 막횡단 도메인, 및 CD3 제타 신호전달 도메인 및 4-1BB로부터의 공동-자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에 따르면, ROR1 특이적 CAR은 도 4에 예시된 바와 같은 V3, V5 및 V1으로부터 선택된 폴리펩티드 구조를 갖고, 상기 구조는 모노클로날 항-ROR1 항체로부터의 VH 및 VL을 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인, IgG1 힌지, CD8α 막횡단 도메인, 및 CD3 제타 신호전달 도메인 및 4-1BB로부터의 공동-자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다.
바람직한 구체예에 따르면, ROR1 특이적 CAR은 도 4에 예시된 바와 같은 V3, V5 및 V1으로부터 선택된 폴리펩티드 구조를 갖고, 상기 구조는 모노클로날 항-ROR1 항체로부터의 VH 및 VL을 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인, FcγRIIIα 힌지, CD8α 막횡단 도메인, 및 CD3 제타 신호전달 도메인 및 4-1BB로부터의 공동-자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다.
표 3-8은 모든 6개의 형태 V1 내지 V6에 대한 CAR 구조를 제시한다.
표적 항원의 하향조절 또는 돌연변이는 암 세포에서 흔하게 관찰되며, 항원-손실 회피 변이체를 발생시킨다. 따라서, 종양 회피를 상쇄시키고, 면역 세포가 표적에 대해 더욱 특이적이 되도록 하기 위해, 본 발명에 다른 ROR1 특이적 CAR은 표적에서 상이한 요소에 동시에 결합하고 이에 의해 면역 세포 활성화 및 기능을 증가시키는 또 다른 세포외 리간드-결합 도메인을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 세포외 리간드-결합 도메인은 동일한 막횡단 폴리펩티드 상에 세로로 1열로 위치될 수 있고, 임의로 링커에 의해 분리되어 있을 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 상이한 세포외 리간드-결합 도메인은 CAR을 구성하는 상이한 막횡단 폴리펩티드에 위치할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 각각 하나의 상이한 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 CAR의 집단에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 면역 세포를 제공하고, 상기 세포의 표면에서 각각이 상이한 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 CAR의 집단을 발현시키는 것을 포함하는 면역 세포를 공학 처리하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 면역 세포를 제공하고, 상기 세포로 각각이 상이한 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 CAR의 집단을 구성하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 것을 포함하는 면역 세포를 공학 처리하는 방법에 관한 것이다. CAR의 집단은 각각이 상이한 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 CAR을 의미한다. 본 발명에 따른 상이한 세포외 리간드 결합 도메인은 바람직하게는 표적 내의 상이한 요소에 동시에 결합하고, 이에 의해 면역 세포 활성화 및 기능을 증가시킬 수 있다. 본 발명은 또한 각각이 상이한 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 CAR의 집단을 포함하는 분리된 면역 세포에 관한 것이다.
폴리뉴클레오티드, 벡터:
본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 기재된 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 벡터에 관한 것이다.
폴리뉴클레오티드는 발현 카세트 또는 발현 벡터(예를 들어, 박테리아 숙주 세포로의 도입을 위한 플라스미드, 또는 바이러스 벡터, 예를 들어, 곤충 숙주 세포의 트랜스펙션을 위한 배큘로바이러스 벡터, 또는 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예를 들어, 포유동물 숙주 세포의 트랜스펙션을 위한 렌티바이러스)로 구성될 수 있다.
특정 구체예에서, 상이한 핵산 서열이 리보솜 스킵 서열을 인코딩하는 핵산 서열, 예를 들어, 2A 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터에 포함될 수 있다. 피코르나바이러스의 아프토바이러스(Aphthovirus) 서브그룹에서 확인된 2A 펩티드는 코돈에 의해 인코딩되는 2개의 아미노산 사이에 펩티드 결합의 형성 없이 한 코돈으로부터 다음 코돈으로 리보솜 "스킵"을 야기시킨다(문헌 (Donnelly and Elliott 2001; Atkins, Wills et al. 2007; Doronina, Wu et al. 2008) 참조). "코돈"은 리보솜에 의해 하나의 아미노산 잔기로 번역되는 mRNA(또는 DNA 분자의 센스 가닥) 상의 3개의 뉴클레오티드를 의미한다. 따라서, 2개의 폴리펩티드는 폴리펩티드가 인 프레임(in frame)으로 존재하는 2A 올리고펩티드 서열에 의해 분리되는 경우 mRNA 내의 단일한 연속 열린해독틀로부터 합성될 수 있다. 이러한 리보솜 스킵 메커니즘은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 단일 메신저 RNA에 의해 인코딩된 여러 단백질의 발현을 위해 여러 벡터에 의해 사용되는 것으로 공지되어 있다.
막횡단 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 유도하기 위해, 분비 신호 서열(선도 서열, 프리프로(prepro) 서열 또는 프리 서열로도 공지됨)이 폴리뉴클레오티드 서열 또는 벡터 서열에 제공된다. 분비 신호 서열은 막횡단 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되고, 즉, 2개의 서열은 정확한 해독틀로 연결되고, 새로이 합성된 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 유도하도록 위치된다. 분비 신호 서열은 일반적으로 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 5'에 위치되나, 특정 분비 신호 서열이 관심 핵산 서열 내의 다른 곳에 위치될 수 있다(예를 들어, 웰치 등(Welch et al.)의 미국 특허 번호 5,037,743; 홀랜드 등(Holland et al.)의 미국 특허 번호 5,143,830 참조). 바람직한 구체예에서, 신호 펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 또는 2를 포함한다.
당업자는 유전 부호의 축퇴성에 비추어 이들 폴리뉴클레오티드 분자 중에서 상당한 서열 변화가 가능함을 인지할 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산 서열은 포유동물 세포에서의 발현, 바람직하게는 인간 세포에서의 발현에 대해 코돈-최적화된다. 코돈-최적화는 제공된 종의 고도로 발현되는 유전자에서 일반적으로 희귀한 관심 코돈의 서열에서의 상기 종의 고도로 발현되는 유전자에서 일반적으로 빈번한 코돈에 의한 교환을 나타내며, 상기 코돈은 교환되는 코돈과 같은 아미노산을 인코딩한다.
CAR이 제공된 면역 세포를 공학 처리하는 방법:
본 발명은 이전에 기재된 바와 같이 ROR1 CAR 중 하나를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 면역 세포에 생체외로 도입시키는 것을 포함하는 면역요법을 위한 면역 세포를 제조하는 방법을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 면역 세포에서 안정적으로 발현되는 것을 고려하여 렌티바이러스 벡터에 포함된다.
추가 구체예에 따르면, 상기 방법은 상기 세포를 동종이형 이식에 더욱 적합하게 만들기 위해 유전학적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함한다.
첫번째 양태에 따르면, 면역 세포는, 예를 들어, WO 2013/176915에 기재된 바와 같이 T-세포 수용체(TCR)의 하나 이상의 성분을 발현하는 적어도 하나의 유전자를 비활성화시킴으로써 동종이형으로 만들 수 있으며, 이는 HLA 또는 β2m 단백질 발현을 인코딩하거나 조절하는 유전자의 비활성화와 조합될 수 있다. 따라서, 이식편 대 숙주 증후군 및 이식 거부의 위험이 유의하게 감소된다.
또 다른 양태에 따르면, 면역 세포는 ROR1 양성 악성 세포를 치료하기 위한 표준 치료로서 사용되는 면역억제 약물 또는 화학요법 치료에 대한 이들의 내성을 개선시키기 위해 추가로 유전공학 처리될 수 있다. 예를 들어, Campath(알렘투주맙(alemtuzumab)) 및 글루코코르티코이드 치료의 약물 표적인 CD52 및 글루코코르티코이드 수용체(GR)는 세포를 이들 치료에 대해 내성이 되도록 하고, 특정 ROR1 CAR이 제공되지 않은 환자 자신의 T-세포에 비해 경쟁적 장점을 제공하기 위해 비활성화될 수 있다. CD3 유전자의 발현은 또한 또 다른 면역 억제 약물인 테플리주맙(Teplizumab)에 대한 내성을 제공하기 위해 억제되거나 감소될 수 있다. HPRT의 발현은 또한 특히 급성 림프모구 백혈병의 치료를 위한 화학요법에서 일반적으로 사용되는 세포증식억제제인 6-티오구아닌에 대한 내성을 제공하기 위해 본 발명에 따라 억제되거나 감소될 수 있다.
본 발명의 추가 양태에 따르면, 면역 세포는 T-세포 활성화의 조절제로서 작용하는 "면역 체크포인트"로 작용하는 단백질, 예를 들어, PDCD1 또는 CTLA-4를 인코딩하는 유전자를 비활성화시킴으로써 이들을 더욱 활성으로 만들거나 소진을 제한하도록 하기 위해 추가로 조작될 수 있다. 발현이 감소되거나 억제될 수 있는 유전자의 예는 표 9에 표시되어 있다.
표 9: 면역 체크포인트 단백질을 인코딩하는 유전자의 목록.
Figure 112017020005290-pct00014
Figure 112017020005290-pct00015
바람직한 구체예에서, 면역 세포를 추가로 공학 처리하는 상기 방법은 DNA 분해에 의해 상기 언급된 것과 같은 유전자를 선택적으로 비활성화시키기 위해 특정 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 특히 mRNA를 상기 T 세포로 도입시키는 것을 수반한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제 또는 Cas9 엔도뉴클레아제이다. TAL-뉴클레아제는 다른 유형의 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 비해 지금까지 입증된 더 높은 특이성 및 분해 효율을 가져, 이들을 일정한 전환과 함께 대규모로 공학 처리된 면역 세포를 생성시키기 위한 선택 엔도뉴클레아제로 만들었다.
전달 방법
상기 기재된 다양한 방법은 세포로 CAR을 도입시키는 것을 수반한다. 비제한적인 예로, 상기 CAR은 하나의 플라스미드 벡터에 의해 인코딩되는 트랜스진(transgene)으로서 도입될 수 있다. 상기 플라스미드 벡터는 또한 상기 벡터를 수용한 세포의 확인 및/또는 선택을 제공하는 선택 마커를 함유할 수 있다.
폴리펩티드는 세포로의 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입의 결과로서 세포에서 제자리에서 합성될 수 있다. 대안적으로, 상기 폴리펩티드는 세포 외부에서 생성될 수 있고, 그후 세포로 도입될 수 있다. 세포로 폴리뉴클레오티드 작제물을 도입시키기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 폴리뉴클레오티드 작제물이 세포의 유전체로 통합되는 안정적 형질전환 방법, 폴리뉴클레오티드 작제물이 세포의 유전체로 통합되지 않는 일시적 형질전환 방법 및 바이러스 매개 방법을 비제한적인 예로 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스), 리포솜 등에 의해 세포로 도입될 수 있다. 예를 들어, 일시적 형질전환 방법은, 예를 들어, 미세주입, 전기천공 또는 입자 봄바드먼트(particle bombardment)를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 세포에서 발현되는 것을 고려하여 벡터, 더욱 특히 플라스미드 또는 바이러스에 포함될 수 있다.
공학 처리된 면역 세포
본 발명은 또한 세포를 공학 처리하기 위한 상기 방법에 의해 획득될 수 있는 분리된 세포 또는 세포주에 관한 것이다. 특히, 상기 분리된 세포는 상기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 CAR을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 분리된 세포는 각각이 상이한 세포외 리간드 결합 도메인을 포함하는 CAR의 집단을 포함한다. 특히, 상기 분리된 세포는 CAR을 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 유전적으로 변형된 면역 세포는 항원 결합 메커니즘과 독립적으로 활성화되고 증식한다.
본 발명의 범위에 분리된 면역 세포, 바람직하게는 이전에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 획득된 T-세포가 또한 포함된다. 상기 면역 세포는 선천 및/또는 적응 면역 반응의 개시 및/또는 수행과 기능적으로 관련된 조혈 기원의 세포를 나타낸다. 본 발명에 따른 상기 면역 세포는 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 줄기 세포는 성체 줄기 세포, 비-인간 배아 줄기 세포, 더욱 특히 비-인간 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 프로제니터 세포, 골수 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포일 수 있다. 대표적 인간 세포는 CD34+ 세포이다. 상기 분리된 세포는 또한 수지상 세포, 살해 수지상 세포, 비만 세포, NK-세포, B-세포 또는 염증성 T-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절성 T-림프구 또는 헬퍼 T-림프구로 구성된 군으로부터 선택된 T-세포일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 세포는 CD4+ T-림프구 및 CD8+ T-림프구로 구성된 군으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 세포의 확장 및 유전적 변형 전, 세포의 공급원이 다양한 비제한적인 방법을 통해 대상체로부터 획득될 수 있다. 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 비제한적인 공급원으로부터 획득될 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 당업자에게 공지되어 있고 이용 가능한 임의의 수의 T 세포주가 이용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 세포는 건강한 공여자, 암으로 진단된 환자 또는 감염으로 진단된 환자로부터 유래될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 세포는 상이한 표현형 특징을 나타내는 세포의 혼합된 집단의 일부이다. 본 발명의 범위에 이전에 기재된 방법에 따라 형질전환된 T-세포로부터 획득된 세포주가 또한 포함된다. 면역억제 치료에 대해 내성이고 이전 방법에 의해 획득될 수 있는 변형된 세포가 본 발명의 범위에 포함된다.
바람직한 구체예로서, 본 발명은 환자로의 동종이형 이식을 위해 기능성 TCR을 발현하지 않고 ROR1 양성 세포에 대해 반응성인 상기 기재된 바와 같은 ROR1 CAR이 제공된 T-세포 또는 T-세포의 집단을 제공한다.
T 세포의 활성화 및 확장
T 세포의 유전적 변형 전이거나 후이건 간에, 본 발명의 유전적으로 변형된 면역 세포가 항원 결합 메커니즘과 독립적으로 활성화되고 증식한다 하더라도, 본 발명의 면역 세포, 특히 T-세포는, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허 출원 공개 번호 20060121005에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 일반적으로 추가로 활성화되고 확장될 수 있다. T 세포는 시험관 내 또는 생체 내에서 확장될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 T 세포는 T-세포에 대한 활성화 신호를 발생시키기 위해 CD3 TCR 복합체 및 T 세포의 표면 상의 공동-자극 분자를 자극하는 작용제와의 접촉에 의해 확장된다. 예를 들어, T-세포에 대한 활성화 신호를 발생시키기 위해 화학물질, 예를 들어, 칼슘 이온운반체 A23187, 포르볼(phorbol) 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA), 또는 미토겐 렉틴 유사 식물적혈구응집소(PHA)가 이용될 수 있다.
비제한적인 예로서, T 세포 집단은 항-CD3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 표면 상에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉, 또는 칼슘 이온운반체와 함께 단백질 키나제 C 활성제(예를 들어, 브리오스타틴(bryostatin))과의 접촉에 의해서와 같이 시험관 내에서 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 보조 분자의 공동-자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 이용된다. 예를 들어, T 세포의 집단이 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건하에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. T 세포 배양에 적절한 조건은 혈청(예를 들어, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, - 2, 1L-15, TGFp, 및 TNF- 또는 당업자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가물을 포함하는 증식 및 생활력에 필요한 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, 최소 필수영양 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는, X-vivo 5, (Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가물은 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제, 예를 들어, N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 배지는 혈청 비함유하거나 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 규정된 세트의 호르몬, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 일정량의 사이토카인(들)이 보충된, 아미노산, 소듐 피루베이트, 및 비타민이 첨가된 RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1, 및 X-Vivo 20, Optimizer를 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신이 실험 배지에만 포함되고, 대상체로 주입되는 세포의 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지지하는데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 대기(예를 들어, 공기 + 5% C02) 하에서 유지된다. 다양한 자극 횟수에 노출된 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 상기 세포는 조직 또는 세포와의 공동-배양에 의해 확장될 수 있다. 상기 세포는 또한 생체 내에서, 예를 들어, 상기 세포를 대상체로 투여한 후에 대상체의 혈액 내에서 확장될 수 있다.
치료 적용
또 다른 구체예에서, 이전에 기재된 바와 같은 다양한 방법에 의해 획득된 분리된 세포 또는 상기 분리된 세포로부터 유래된 세포주가 약제로서 이용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 약제는 암 치료, 특히 B-세포 림프종 및 백혈병의 치료를 필요로 하는 환자에서의 B-세포 림프종 및 백혈병의 치료에 이용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 분리된 세포 또는 상기 분리된 세포로부터 유래된 세포주가 암의 치료를 필요로 하는 환자에서 암의 치료를 위한 약제의 제조에 이용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 방법에 의존하며, 상기 방법은 하기 단계 중 적어도 하나를 포함한다:
(a) 이전에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 획득 가능한 면역-세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 형질전환된 면역 세포를 상기 환자에 투여하는 단계,
한 구체예에서, 본 발명의 상기 T 세포는 확실한 생체내 T 세포 확장을 겪을 수 있고, 연장된 기간 동안 지속될 수 있다.
상기 치료는 개선적, 치료적 또는 예방적 치료일 수 있다. 이는 자가 면역요법의 일부 또는 동종이형 면역요법 치료의 일부일 수 있다. 자가는 환자를 치료하기 위해 이용된 세포, 세포주 또는 세포의 집단이 상기 환자로부터 유래되거나, 인간 백혈구 항원(HLA) 적합 공여자로부터 유래되는 것을 의미한다. 동종이형은 환자를 치료하기 위해 이용된 세포 또는 세포의 집단이 상기 환자로부터 유래되지 않고, 공여자로부터 유래되는 것을 의미한다.
개시된 방법과 함께 이용될 수 있는 세포는 이전 섹션에 기재되어 있다. 상기 치료는 ROR1-발현 세포, 특히 ROR1-발현 세포의 과잉을 특징으로 하는 전암성 또는 악성 암 질환이 진단된 환자를 치료하는데 이용될 수 있다. 상기 질환은 혈액암, 예를 들어, 백혈병 또는 악성 림프세포증식성 장애에서 발견된다.
백혈병은 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상 증후군, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 및 골수형성이상 증후군일 수 있다.
림프세포증식 장애는 림프종, 특히 만성 림프성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 및 소포 림프종(소세포 및 대세포)일 수 있다.
한 바람직한 구체예에 따르면, 만성 림프성 백혈병(CLL) 또는 소림프구 백혈병(SLL)의 치료를 위해 상기 공학 처리된 T 세포가 제공된다.
또 다른 바람직한 구체예에 따르면, CLL 또는 SLL의 상기 치료제가 ROR1-CAR-T 세포 주입 전에 림프구 고갈된 환자에 투여된다. 상기 림프구 고갈은 일반적으로 화학요법제, 바람직하게는 플루다라빈(fludarabine)(F), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)(C), 벤다무스틴(bendamustine)(B) 또는 리툭시맙(rituximab)(R) 또는 이들의 조합물과 같은 약물을 이용하여 수행된다. 통상적으로, εR 또는 FBR의 조합물이 CAR-T 세포 투여 전에 림프구 고갈에 이용될 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 외투 세포 림프종(MCL), t(1;19) 염색체 전위를 갖는 급성 림프모구 백혈병(ALL)의 치료를 위해 상기 공학 처리된 T 세포가 제공된다.
치료될 수 있는 암은 비-고형 종양(예를 들어, 전-B ALL(소아 적응증), 성인 ALL, 외투 세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 혈액 종양)을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR로 치료되는 암의 유형은 백혈병 또는 림프구 악성종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암이 또한 포함된다.
또한, 고형 종양, 예를 들어, 유방, 결장, 폐, 및 신장 종양이 본 발명의 CAR에 의해 치료될 수 있다. 또한, 본 발명의 공학 처리된 T 세포는 췌장암, 신장암 또는 난소암의 치료제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 공학 처리된 면역 세포를 이용한 치료는 항체 요법, 화학요법, 사이토카인 요법, 수지상 세포 요법, 유전자 요법, 호르몬 요법, 레이저 광 요법 및 방사선 요법의 군으로부터 선택된 암에 대한 하나 이상의 요법과 조합될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 치료제는 면역억제 치료를 받고 있는 환자에 투여될 수 있다. 확실히, 본 발명은 바람직하게는 적어도 하나의 면역억제제에 대한 수용체를 인코딩하는 유전자의 비활성화로 인해 상기 면역억제제에 대해 내성이 된 세포 또는 세포의 집단에 의존한다. 이러한 양태에서, 면역억제 치료는 본 발명에 따른 T-세포의 선택 및 환자 내에서의 확장을 도와야 한다.
본 발명에 따른 세포 또는 세포의 집단의 투여는 에어로졸 흡입, 주입, 섭취, 수혈, 삽입 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 피하, 피내, 종양내, 림프노드내, 골수내, 근내, 정맥내 또는 림프관내 주입, 또는 복막내로 환자에 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 세포 조성물은 바람직하게는 정맥내 주입에 의해 투여된다.
세포 또는 세포의 집단의 투여는 체중 kg 당 104-109개의 세포, 바람직하게는 체중 kg 당 105 내지 106개의 세포(이들 범위 내의 세포 수의 모든 정수 값을 포함함)의 투여로 구성될 수 있다. 세포 또는 세포의 집단은 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세포의 상기 유효량은 단일 용량으로 투여된다. 또 다른 구체예에서, 세포의 상기 유효량은 일정 기간에 걸쳐서 1회 초과의 용량으로 투여된다. 투여 시기는 담당의의 판단 내이며, 환자의 임상 상태에 좌우된다. 세포 또는 세포의 집단은 임의의 공급원, 예를 들어, 혈액 은행 또는 공여자로부터 획득될 수 있다. 개별적 필요가 다양할 수 있으나, 특정 질병 또는 질환에 대한 제공된 세포 유형의 유효량의 최적 범위의 결정은 당 분야의 기술 내이다. 유효량은 치료적 또는 예방적 이익을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 투여량은 수용자의 수용자의 연령, 건강 및 체중, 존재시 병행 치료의 종류, 치료의 빈도 및 요망되는 효과의 특성에 좌우될 것이다.
또 다른 구체예에서, 세포 또는 상기 세포를 포함하는 조성물의 상기 유효량은 비경구 투여된다. 상기 투여는 정맥내 투여일 수 있다. 상기 투여는 종양 내의 주입에 의해 직접 이루어질 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 세포는 MS 환자에 대한 항바이러스 요법제, 시도포버(cidofovir) 및 인터류킨-2, 사이타라빈(Cytarabine)(ARA-C로도 공지됨) 또는 나탈리지이맙(nataliziimab) 치료제와 같은 작용제를 이용한 치료 또는 건선 환자에 대한 에팔리즈티맙(efaliztimab) 치료 또는 PML 환자에 대한 다른 치료를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 임의의 수의 관련 치료 양식과 함께(예를 들어, 상기 치료 양식 전, 상기 치료 양식과 동시 또는 상기 투여 양식 후) 환자에게 투여된다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 T 세포는 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예를 들어, 사이클로스포린(cyclosporin), 아자티오프린(azathioprine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미코페놀레이트(mycophenolate), 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제(immunoablative agent), 예를 들어, CAMPATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 사이톡신(cytoxin), 플루다리빈(fludaribine), 사이클로스포린, FK506, 라파마이신(rapamycin), 미코페놀산(mycoplienolic acid), 스테로이드, FR901228, 사이토카인, 및 방사선조사와 함께 이용될 수 있다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린을 억제하거나(사이클로스포린 및 FK506), 성장 인자 유도 신호전달에 중요한 p70S6 키나제를 억제(라파마이신)한다(Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993). 추가의 구체예에서, 본 발명의 세포 조성물은 골수 이식, 화학요법제, 예를 들어, 플루다라빈(fludarabine), 외부-광선 방사선 요법(XRT), 사이클로포스파미드, 또는 항체, 예를 들어, OKT3 또는 CAMPATH를 이용한 T 세포 제거 요법과 함께(예를 들어, 전, 동시 또는 후) 환자에게 투여된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 세포 조성물은 B-세포 제거 요법제, 예를 들어, CD20과 반응하는 작용제, 예를 들어, 리툭산(Rituxan) 후에 투여된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 대상체는 고 용량 화학요법 후 말초 혈액 줄기 세포 이식을 이용한 표준 치료를 받을 수 있다. 특정 구체예에서, 이식 후, 대상체는 본 발명의 확장된 면역 세포의 주입을 투여받는다. 추가의 구체예에서, 확장된 세포는 수술 전 또는 수술 후에 투여된다.
기타 정의
- 달리 언급하지 않는 한, 관사("a", "an" 및 "the) 및 "적어도 하나"는 상호교환적으로 사용되며, 하나 또는 하나 초과를 의미한다. - 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기는 1-문자 코드에 따라 본원에서 표시되며, 여기서, 예를 들어, Q는 Gln 또는 글루타민 잔기를 의미하고, R은 Arg 또는 아르기닌 잔기를 의미하고, D는 Asp 또는 아스파르트산 잔기를 의미한다.
- 아미노산 치환은 한 아미노산 잔기의 또 다른 아미노산 잔기에 의한 대체를 의미하고, 예를 들어, 펩티드 서열 내에서의 아르기닌 잔기의 글루타민 잔기에 의한 대체가 아미노산 치환이다.
- 뉴클레오티드는 다음과 같이 표시된다: 뉴클레오시드의 염기를 표시하기 위해 1-문자 코드가 이용되고; a는 아데닌이고, t는 티민이고, c는 시토신이고, g는 구아닌이다. 축퇴성 뉴클레오티드에 대해, r은 g 또는 a(퓨린 뉴클레오티드)에 상당하고, k는 g 또는 t에 상당하고, s는 g 또는 c에 상당하고, w는 a 또는 t에 상당하고, m은 a 또는 c에 상당하고, y는 t 또는 c(피리미딘 뉴클레오티드)에 상당하고, d는 g, a 또는 t에 상당하고, v는 g, a 또는 c에 상당하고, b는 g, t 또는 c에 상당하고, h는 a, t 또는 c에 상당하고, n은 g, a, t 또는 c에 상당한다.
- 본원에서 사용되는 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 올리고뉴클레오티드, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 생성된 단편, 및 라이게이션, 절단, 엔도뉴클레아제 작용, 및 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의해 생성된 단편을 나타낸다. 핵산 분자는 천연-발생 뉴클레오티드(예를 들어, DNA 및 RNA), 또는 천연-발생 뉴클레오티드의 유사체(예를 들어, 천연-발생 뉴클레오티드의 거울상 이성질체 형태), 또는 둘 모두의 조합물인 단량체로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 모이어티 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티에서 변경을 가질 수 있다. 당 변형은, 예를 들어, 하나 이상의 하이드록실기의 할로겐, 알킬기, 아민, 및 아지도기에 의한 대체를 포함하거나, 당은 에테르 또는 에스테르로서 관능화될 수 있다. 더욱이, 전체 당 모이어티는 입체적 및 전자적으로 유사한 구조, 예를 들어, 아자-당 및 카르보사이클릭 당 유사체로 대체될 수 있다. 염기 모이어티에서의 변형의 예는 알킬화된 퓨린 및 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 널리 공지된 헤테로사이클릭 치환물을 포함한다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 결합의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
- 키메라 항원 수용체(CAR)는 표적 세포에 존재하는 성분에 대한 결합 도메인, 예를 들어, 요망되는 항원(예를 들어, 종양 항원)에 대한 항체-기반 특이성과 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인을 조합시켜 특정한 항-표적 세포 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 발생시키는 분자를 의도한다. 일반적으로, CAR은 T 세포 항원 수용체 복합체 제타 사슬(scFvFc:ζ)의 세포내 신호전달 도메인에 융합된 세포외 단일 사슬 항체(scFvFc)로 구성되며, T 세포에서 발현되는 경우 모노클로날 항체의 특이성을 기초로 하여 항원 인지를 재조정하는 능력을 갖는다. 본 발명에서 사용되는 CAR의 한 예는 ROR1 항원에 대해 재조정하는 CAR이며, 이는 비제한적인 예로 아미노산 서열 SEQ ID NO:79 내지 138을 포함할 수 있다.
- 용어 "엔도뉴클레아제"는 DNA 또는 RNA 분자, 바람직하게는 DNA 분자 내의 핵산 사이의 결합의 가수분해(분해)를 촉매작용할 수 있는 임의의 야생형 또는 변이체 효소를 나타낸다. 엔도뉴클레아제는 DNA 또는 RNA 분자의 서열에 상관없이 DNA 또는 RNA 분자를 분해하지 않고, "표적 서열" 또는 "표적 부위"로 추가로 언급되는 특정 폴리뉴클레오티드 서열에서 DNA 또는 RNA 분자를 인지하고 분해한다. 엔도뉴클레아제는 12개 초과의 염기쌍(bp) 길이, 더욱 바람직하게는 14-55 bp의 폴리뉴클레오티드 인지 부위를 통상적으로 갖는 경우 희귀-절단 엔도뉴클레아제로 분류될 수 있다. 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 규정된 유전자좌에 DNA 이중-가닥 틈새(DSB)를 도입함으로써 HR을 유의하게 증가시킨다(Perrin, Buckle et al. 1993; Rouet, Smih et al. 1994; Choulika, Perrin et al. 1995; Pingoud and Silva 2007). 희귀-절단 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 귀소 엔도뉴클레아제(Paques and Duchateau 2007), 공학 처리된 아연-손가락 도메인과 FokI와 같은 제한 효소의 촉매 도메인의 융합으로부터 발생하는 키메라 아연-손가락 뉴클레아제(ZFN)(Porteus and Carroll 2005), CRISPR 시스템으로부터의 Cas9 엔도뉴클레아제(Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013) 또는 화학적 엔도뉴클레아제(Eisenschmidt, Lanio et al. 2005; Arimondo, Thomas et al. 2006)일 수 있다. 화학적 엔도뉴클레아제에서, 화학적 또는 펩티드적 분해제가 핵산의 중합체 또는 특정 표적 서열을 인지하고 이에 의해 특정 서열에 분해 활성을 표적화하는 또 다른 DNA에 컨쥬게이션된다. 화학적 엔도뉴클레아제는 또한 특정 DNA 서열에 결합하는 것으로 공지된 오르소페난트롤린의 합성 뉴클레아제 유사 컨쥬게이트, DNA 분해 분자, 및 트리플렉스-형성 올리고뉴클레오티드(TFO)를 포함한다(Kalish and Glazer 2005). 상기 화학적 엔도뉴클레아제는 본 발명에 따른 용어 "엔도뉴클레아제"에 포함된다.
- "TALE-뉴클레아제"(TALEN)는 전사 활성제 유사 효과기(TALE)로부터 통상적으로 유래된 핵산-결합 도메인 및 핵산 표적 서열을 분해하기 위한 하나의 뉴클레아제 촉매 도메인으로 구성된 융합 단백질을 의도한다. 촉매 도메인은 바람직하게는 뉴클레아제 도메인이고, 더욱 바람직하게는, 예를 들어, I-TevI, ColE7, NucA 및 Fok-I와 같은 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 도메인이다. 특정 구체예에서, TALE 도메인은, 예를 들어, I-CreI 및 I-OnuI 또는 이들의 기능성 변이체와 같은 메가뉴클레아제에 융합될 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 뉴클레아제는 단량체 TALE-뉴클레아제이다. 단량체 TALE-뉴클레아제는 특정 인지 및 분해를 위해 이합체화를 필요로 하지 않는 TALE-뉴클레아제, 예를 들어, WO2012138927에 기재된 공학 처리된 TAL 반복부와 I-TevI의 촉매 도메인의 융합체이다. 전사 활성제 유사 효과기(TALE)는 복수의 반복 서열을 포함하는 박테리아 종 잔토모나스(Xanthomonas)로부터의 단백질이며, 각각의 반복부는 핵산 표적화 서열의 각각의 뉴클레오티드 염기에 특이적인 위치 12 및 13(RVD)에 2-잔기를 포함한다. 유사 모듈 염기-퍼(per)-염기 핵산 결합 특성(MBBBD)을 갖는 결합 도메인이 또한 다양한 박테리아 종에서 출원인에 의해 최근에 발견된 새로운 모듈 단백질로부터 유래될 수 있다. 새로운 모듈 단백질은 TAL 반복부보다 많은 서열 변이성을 나타내는 장점을 갖는다. 바람직하게는, 다양한 뉴클레오티드의 인지와 관련된 RVD는 C를 인지하는 HD, T를 인지하는 NG, A를 인지하는 NI, G 또는 A를 인지하는 NN, A, C, G 또는 T를 인지하는 NS, T를 인지하는 HG, T를 인지하는 IG, G를 인지하는 NK, C를 인지하는 HA, C를 인지하는 ND, C를 인지하는 HI, G를 인지하는 HN, G를 인지하는 NA, G 또는 A를 인지하는 SN 및 T를 인지하는 YG, A를 인지하는 TL, A 또는 G를 인지하는 VT 및 A를 인지하는 SW이다. 또 다른 구체예에서, 중요한 아미노산 12 및 13은 뉴클레오티드 A, T, C 및 G에 대한 이들의 특이성을 조절하기 위해, 특히 이러한 특이성을 향상시키기 위해 다른 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다. TALE-뉴클레아제는 이미 기재되었으며, 유전자 표적화 및 유전자 변형을 자극하기 위해 사용된다(Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al. 2011). 맞춤-제작 TAL-뉴클레아제가 상표명 TALENTM(Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France)으로 상업적으로 이용 가능하다.
본 발명에 따른 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 또한 Cas9 엔도뉴클레아제일 수 있다. 최근, 타입 II 원핵생물 CRISPR(주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복서열(Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats)) 적응 면역 시스템(리뷰를 위해 (Sorek, Lawrence et al. 2013) 참조)로부터의 RNA-유도된 Cas9 뉴클레아제(Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013)를 기초로 하여 새로운 유전체 공학처리 도구가 개발되었다. CRISPR 관련(Cas) 시스템은 박테리아에서 처음 발견되었고, 바이러스이거나 플라스미드이건 간에 외래 DNA에 대한 방어로 작용한다. CRISPR-매개 유전체 공학처리는 처음 프로토-스페이서 인접 모티프(PAM)로 언급되는 짧은 서열 모티프가 종종 측접된 표적 서열의 선택에 의해 진행된다. 표적 서열 선택 후, 이러한 표적 서열에 상보적인 특정 crRNA가 공학 처리된다. CRISPR 타입 II 시스템에 필요한 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)가 crRNA와 쌍을 이루고, 제공된 Cas9 단백질에 결합된다. Cas9은 tracRNA와 cRNA의 염기 쌍형성을 촉진하는 분자 앵커로 작용한다(Deltcheva, Chylinski et al. 2011). 이러한 3원 복합체에서, 이중 tracrRNA:crRNA 구조는 엔도뉴클레아제 Cas9을 인지체 표적 서열로 유도하는 가이드 RNA로 작용한다. Cas9-tracrRNA:crRNA 복합체에 의한 표적 인지는 표적 서열과 crRNA 사이의 상동성에 대해 표적 서열을 스캐닝함으로써 개시된다. 표적 서열-crRNA 상보성에 더하여, DNA 표적화는 프로토스페이서에 인접한 짧은 모티프(프로토스페이서 인접 모티프 - PAM)의 존재를 필요로 한다. 이중-RNA와 표적 서열 사이의 쌍형성 후, Cas9은 이후 PAM 모티프의 업스트림에 블런트 이중 가닥 틈새에 3 염기를 도입시킨다(Garneau, Dupuis et al. 2010).
희귀-절단 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제의 명칭으로도 공지된 귀소 엔도뉴클레아제일 수 있다. 상기 귀소 엔도뉴클레아제는 당 분야에 널리 공지되어 있다(Stoddard 2005). 귀소 엔도뉴클레아제는 DNA 표적 서열을 인지하고, 단일-가닥 또는 이중-가닥 틈새를 발생시킨다. 귀소 엔도뉴클레아제는 12 내지 45 염기쌍(bp) 길이의 범위, 일반적으로 14 내지 40 bp 길이의 범위의 DNA 표적 부위를 매우 특이적으로 인지한다. 본 발명에 따른 귀소 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, LAGLIDADG 엔도뉴클레아제, HNH 엔도뉴클레아제, 또는 GIY-YIG 엔도뉴클레아제에 해당할 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 귀소 엔도뉴클레아제는 I-CreI 변이체일 수 있다.
- "전달 벡터" 또는 "전달 벡터들"은 본 발명에서 필요한 작용제/화학물질 및 분자(단백질 또는 핵산)을 세포와 접촉시키거나(즉, "접촉시키는"), 세포 또는 세포하 구획 내부로 전달하기 위해(즉, "도입시키는") 본 발명에서 이용될 수 있는 임의의 전달 벡터를 의도한다. 이는 리포솜 전달 벡터, 바이러스 전달 벡터, 약물 전달 벡터, 화학 담체, 중합체 담체, 리포플렉스(lipoplex), 폴리플렉스(polyplex), 덴드리머(dendrimer), 미세기포(초음파 조영제), 나노입자, 에멀젼 또는 다른 적절한 전달 벡터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 전달 벡터는 분자, 화학물질, 거대분자(유전자, 단백질), 또는 다른 벡터, 예를 들어, 플라스미드, Diatos에 의해 개발된 펩티드의 전달을 가능케 한다. 이들 경우에, 전달 벡터는 분자 담체이다. "전달 벡터" 또는 "전달 벡터들"은 또한 트랜스펙션을 수행하기 위한 전달 방법을 의도한다.
- 용어 "벡터" 또는 "벡터들"은 이와 연결된 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 본 발명에서의 "벡터"는 염색체, 비-염색체, 반-합성 또는 합성 핵산으로 구성될 수 있는 바이러스 벡터, 플라스미드, RNA 벡터 또는 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 벡터는 이들에 연결된 핵산의 자가 복제(에피솜 벡터) 및/또는 발현(발현 벡터)을 가능케 하는 벡터이다. 많은 수의 적합한 벡터가 당업자에게 공지되어 있고, 상업적으로 이용 가능하다.
바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파르보바이러스(예를 들어, 아데노 관련 바이러스), 코로나바이러스, 음성 가닥 RNA 바이러스, 예를 들어, 오르소믹소바이러스(예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 랍도바이러스(예를 들어, 광견병 및 물집입안염 바이러스), 파라믹소바이러스(예를 들어, 홍역 및 센다이), 양성 가닥 RNA 바이러스, 예를 들어, 피코르나바이러스 및 알파바이러스, 및 이중-가닥 DNA 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스 타입 1 및 2, 엡스타인-바 바이러스, 사이토메갈로바이러스), 및 폭스바이러스(예를 들어, 우두, 조류폭스 및 카나리폭스) 벡터를 포함한다. 다른 바이러스는, 예를 들어, 노르워크 바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파포바바이러스, 헤파드나바이러스, 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스의 예는 조류 백혈증-육종, 포유동물 C-타입, B-타입 바이러스, D 타입 바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스푸마바이러스를 포함한다(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
- "렌티바이러스 벡터"는 이의 비교적 큰 패키징 능력, 감소된 면역원성 및 큰 범위의 다양한 세포 유형을 높은 효율로 안정적으로 형질도입시키는 이들의 능력으로 인해 유전자 전달에 대해 매우 가망성 있는 HIV-기반 렌티바이러스 벡터를 의미한다. 렌티바이러스 벡터는 일반적으로 3개(패키징, 외피 및 전달) 이상의 플라스미드의 생산자 세포로의 일시적 트랜스펙션 후에 발생된다. HIV와 같이, 렌티바이러스 벡터는 바이러스 표면 당단백질과 세포 표면 상의 수용체의 상호작용을 통해 표적 세포로 진입한다. 진입시, 바이러스 RNA는 역전사를 겪고, 이는 바이러스 역전사효소 복합체에 의해 매개된다. 역전사의 생성물은 이중-가닥의 선형 바이러스 DNA이며, 이는 감염된 세포의 DNA 내의 바이러스 통합을 위한 기질이다. "통합 렌티바이러스 벡터(또는 LV)"는 비제한적인 예로서 표적 세포의 유전체로 통합될 수 있는 벡터를 의미한다. 반대로, "비-통합 렌티바이러스 벡터(또는 NILV)"는 바이러스 통합효소의 작용을 통해 표적 세포의 유전체로 통합되지 않는 효과적인 유전자 전달 벡터를 의미한다.
- 전달 벡터 및 벡터는 임의의 세포 투과화 기술, 예를 들어, 소노포레이션(sonoporation) 또는 전기천공 또는 이들 기술의 유도물과 관련되거나 조합될 수 있다.
- 세포 또는 세포들은 시험관내 배양을 위한 임의의 살아 있는 진핵생물 세포, 일차 세포 및 이들 유기체로부터 유래된 세포주를 의도한다.
- "일차 세포" 또는 "일차 세포들"은 매우 적은 집단 배가를 겪고, 따라서 연속적인 종양형성성 또는 인공의 무한증식 세포주에 비해 이들이 유래되는 조직의 주요 기능적 성분 및 특징을 더욱 나타낸는, 시험관내 성장을 위해 살아 있는 조직으로부터 직접 획득되고(즉, 생검 물질) 확립된 세포를 의도한다.
비제한적인 예로서, 세포주는 CHO-K1 세포; HEK293 세포; Caco2 세포; U2-OS 세포; NIH 3T3 세포; NSO 세포; SP2 세포; CHO-S 세포; DG44 세포; K-562 세포, U-937 세포; MRC5 세포; IMR90 세포; Jurkat 세포; HepG2 세포; HeLa 세포; HT-1080 세포; HCT-116 세포; Hu-h7 세포; Huvec 세포; Molt 4 세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
모든 이들 세포주는 관심 유전자 또는 단백질을 생성시키고, 발현시키고, 정량하고, 검출하고, 연구하기 위한 세포주 모델을 제공하기 위해 본 발명의 방법에 의해 변형될 수 있고; 이들 모델은 또한 비제한적인 예로서 연구 및 생성 및 다양한 분야, 예를 들어, 화학, 바이오연료, 치료학 및 농업경제학에서 생물학적으로 관심있는 활성 분자를 스크리닝하기 위해 이용될 수 있다.
- "돌연변이"는 폴리뉴클레오티드(cDNA, 유전자) 또는 폴리펩티드 서열에서의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개 이상의 뉴클레오티드/아미노산의 치환, 결실, 삽입으로 의도된다. 돌연변이는 유전자의 코딩 서열 또는 이의 조절 서열에 영향을 미칠 수 있다. 이는 또한 유전체 서열의 구조 또는 인코딩된 mRNA의 구조/안정성에 영향을 미칠 수 있다.
- "변이체(들)"은 모 분자의 아미노산 서열에서의 적어도 1개의 잔기의 돌연변이 또는 대체에 의해 획득된 반복 변이체, 변이체, DNA 결합 변이체, TALE-뉴클레아제 변이체, 폴리펩티드 변이체로 의도된다.
- "기능성 변이체"는 단백질 또는 단백질 도메인의 촉매적으로 활성인 돌연변이체로 의도되며; 이러한 돌연변이체는 이의 모 단백질 또는 단백질 도메인에 비해 동일한 활성 또는 추가의 특성, 또는 더 높거나 더 낮은 활성을 가질 수 있다.
- "동일성"은 2개의 핵산 분자 또는 폴리펩티드 사이의 서열 동일성을 나타낸다. 동일성은 비교의 목적을 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열 내의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열 내의 위치가 동일한 염기에 의해 점유된 경우, 상기 분자는 상기 위치에서 동일하다. 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 유사성 또는 동일성의 정도는 핵산 서열에 의해 공유된 위치에서 동일하거나 일치하는 뉴클레오티드의 수의 함수이다. GCG 서열 분석 패키지(University of Wisconsin, Madison, Wis.)의 일부로서 이용 가능한 FASTA, 또는 BLAST를 포함하는 다양한 정렬 알고리즘 및/또는 프로그램이 2개의 서열 사이의 동일성을 계산하기 위해 이용될 수 있고, 예를 들어, 디폴트 설정으로 이용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 특정 폴리펩티드와 적어도 70%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖고, 바람직하게는 실질적으로 동일한 기능을 나타내는 폴리펩티드 뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 고려된다. 달리 표시되지 않는 한, 유사성 스코어는 BLOSUM62의 사용을 기초로 할 것이다. BLASTP가 사용되는 경우, 유사성 퍼센트는 BLASTP 양성 스코어를 기초로 하고, 서열 동일성 퍼센트는 BLASTP 동일성 스코어를 기초로 한다. BLASTP "동일성"은 동일한 높은 스코어의 서열 쌍에서의 전체 잔기의 수 및 분획을 나타내고; BLASTP "양성"은 정렬 스코어가 양성 값을 갖고 서로 유사한 잔기의 수 및 분획을 나타낸다. 이들 정도의 동일성 또는 유사성 또는 본원에 개시된 아미노산 서열에 대한 임의의 중간 정도의 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열이 고려되고, 본 발명의 개시에 포함된다. 유사한 폴리펩티드의 폴리뉴클레오티드 서열은 유전 부호를 이용하여 추론되며, 통상적인 수단, 특히 유전 부호를 이용하여 이의 아미노산 서열을 역번역함으로써 획득될 수 있다.
- "신호-전달 도메인" 또는 "공동-자극 리간드"는 T-세포 상의 인지체 공동-자극 분자에 특이적으로 결합하고, 예를 들어, TCR/CD3 복합체와 펩티드가 로딩된 MHC 분자의 결합에 의해 제공된 일차 신호에 더하여 증식 활성화, 분화 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포 상의 분자를 나타낸다. 공동-자극 리간드는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공동자극 리간드(ICOS-L), 세포간 부착 분자(ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, 림프독소 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, Toll 리간드 수용체에 결합하는 효능제 또는 항체 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 공동-자극 리간드는 특히 T 세포 상에 존재하는 공동-자극 분자, 비제한적인 예로, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드와 특이적으로 결합하는 항체를 또한 포함한다.
"공동-자극 분자"는 공동-자극 리간드와 특이적으로 결합하여, 이에 의해 세포에 의한 공동-자극 반응, 비제한적인 예로, 증식을 매개하는 T-세포 상의 인지체 결합 파트너를 나타낸다. 공동-자극 분자는 MHC 부류 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 "공동-자극 신호"는 일차 신호, 예를 들어, TCR/CD3 라이게이션과 조합하여 T 세포 증식 및/또는 주요 분자의 상향조절 또는 하향조절을 발생시키는 신호를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "세포외 리간드-결합 도메인"은 리간드에 결합할 수 있는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드로 정의된다. 바람직하게는, 도메인은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 세포외 리간드-결합 도메인은 특정 질병 상태와 관련된 표적 세포 상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인지하도록 선택될 수 있다. 따라서, 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염, 자가면역 질병 및 암 세포와 관련된 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체" 또는 "환자"는 비-인간 영장류 및 인간을 포함하는 동물계의 모든 일원을 포함한다.
본 발명의 상기 기재된 설명은 임의의 당업자가 본 발명을 제조하고 이용하는 것을 가능케 하도록 본 발명을 제조하고 이용하는 방식 및 공정을 제공하며, 이러한 가능케 함은 본래 기재의 일부를 구성하는 첨부된 청구항의 주제에 특히 제공된다.
숫자상의 한계 또는 범위가 본원에 언급되는 경우, 종점이 포함된다. 또한, 숫자상의 한계 또는 범위 내의 모든 값 및 하위범위가 명백히 기재되는 것과 같이 특별히 포함된다.
상기 기재는 당업자가 본 발명을 제조하고 이용하는 것을 가능케 하도록 제시되며, 특정 적용 및 이의 필요조건의 상황에서 제공된다. 바람직한 구체예에 대한 다양한 변형이 당업자에게 용이하게 명백할 것이며, 본원에 정의된 일반적 원리는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 다른 구체예 및 적용에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 제시된 구체예로 제한하고자 하는 것이 아니라, 본원에 개시된 원리 및 특징과 일치하는 가장 넓은 범위로 제공되어야 한다.
본 발명은 일반적으로 기재되었으나, 단지 예시의 목적으로 본원에 제공되고, 달리 특정하지 않는 한 제한하고자 하는 것이 아닌 특정한 특정 예를 참조로 하여 추가의 이해가 획득될 수 있다.
일반적 방법
일차 세포
말초 혈액 단핵 세포를 건강한 자원 공여자로부터의 백혈구연층(Etablissement Francais du Sang)으로부터의 밀도 구배 원심분리에 의해 분리시켰다. 이후, T 림프구를 EasySep 인간 T 세포 농축 키트(Stemcell Technologies)를 이용하여 정제하고, 20 ng/ml IL-2(Miltenyi) 및 5% 인간 AB 혈청(Seralab)이 보충된 X-vivo 15 배지(Lonza) 중 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Life Technologies)로 활성화시켰다.
세포주
K562, Jeko-1, MDA-MB-231, PC-3 및 MCF-7 세포주를 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection)로부터 획득하였다. K562 세포를 10% 열-비활성화 FCS, 2mmol/L L-글루타민 및 100 유닛/ml 페니실린, 및 100㎍/mL 스트렙토마이신이 보충된 IMDM에서 배양하였다. Jeko-1 세포를 20% 열-비활성화 FCS, 2mmol/L L-글루타민 및 100 유닛/ml 페니실린, 및 100㎍/mL 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640에서 배양하였다. MDA-MB-231 세포를 10% 열-비활성화 FCS, 2mmol/L L-글루타민 및 100 유닛/ml 페니실린, 및 100㎍/mL 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양하였다. PC-3 세포를 10% 열-비활성화 FCS, 2mmol/L L-글루타민 및 100 유닛/ml 페니실린, 및 100㎍/mL 스트렙토마이신이 보충된 F-12K에서 배양하였다. MCF-7 세포를 10% 열-비활성화 FCS, 2mmol/L L-글루타민 및 100 유닛/ml 페니실린, 및 100㎍/mL 스트렙토마이신 및 0.01mg/ml 인간 인슐린이 보충된 DMEM에서 배양하였다.
ROR1 세포 표면 발현의 정량
다양한 인간 세포주에서의 ROR1 표면 분자의 수를 제조업체의 설명서에 따라 모노클로날 항-ROR1 항체 클론 2A(Miltenyi) 및 Dako QiFIKIT를 이용한 포화 결합에 의해 결정하였다.
scCAR을 인코딩하는 DNA의 합성
scCAR을 인코딩하는 DNA를 GenScript에 의해 합성하였다.
scCAR에 대한 시험관내 전사 mRNA 벡터의 작제
scCAR을 인코딩하는 DNA를 T7 프로모터와 BGH 폴리 A 사이에 플라스미드 pCLS9632에 클로닝하였다.
RNA 시험관내 전사
scCAR을 인코딩하는 mRNA를 시험관내 전사시키고, 제조업체의 설명서에 따라 mMessage mMachine T7 Ultra 키트(Life technologies)를 이용하여 아데닐중합체 형성시켰다. RNA를 RNeasy 컬럼(Qiagen)으로 정제시키고, 사이토포레이션(cytoporation) 배지 T(Harvard Apparatus)에서 용리시키고, Nanodrop ND-1000 분광광도계를 이용하여 260 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량하였다. RNA의 품질을 변성 포름알데하이드/MOPS 아가로스 젤에서 확인하였다.
T 세포의 RNA 전기천공
활성화 4-5일 또는 11-12일 후, T 림프구를 AgilePulse MAX system(Harvard Apparatus)을 이용한 메신저 RNA의 전기전달에 의해 트랜스펙션시켰다. I. 5x106개의 세포를 0.4 cm 큐벳으로 scCAR를 인코딩하는 15㎍의 mRNA와 혼합하였다. 전기천공을 WO2013176915에 기재된 프로토콜에 따라 수행하였다. 전기천공 후, 세포를 배양 배지로 희석시키고, 37℃/5% CO2에서 인큐베이션하였다.
scCAR의 검출
흐름세포측정법에 의해: T 세포를 PE-표지된 폴리클로날 염소 항-마우스(Fab)2 항체(Jackson Immunoresearch) 또는 비오틴-표지된 단백질 L(GenScript) 및 이후 피코에리트린-표지된 스트렙타비딘(BD pharmingen)으로 염색하고, 최종적으로 MACSQuant 흐름세포측정기(Miltenyi)를 이용하여 분석하였다.
웨스턴 블로팅에 의해: 1x106개의 T 세포를 1mM 오르소바나데이트, 3㎍/ml의 프로테아제 억제제 및 2mM의 PMSF를 함유하는 50㎕ RIPA 완충액 중에서 용해시켰다. 세포 용해질을 임의의 kD™ 아크릴아미드 젤(BioRad) 상에서 SDS-PAGE에 의해 분리시켰다. 니트로셀룰로스 막으로의 전달 후, 이를 마우스 항-인간 CD3z(pharmingen) 및 이후 염소 항-마우스 IgG 호스라디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)-컨쥬게이션된 항체(Sigma)와 인큐베이션하였다. 항체 결합을 ECL 키트(Pierce)를 이용하여 나타내었다.
탈과립화 검정
5 x 104개의 T 세포를 96-웰 플레이트 중에서 웰 당 0.1 ml로 5 x 104개의 ROR1-양성 또는 ROR1-음성 세포와 함께 공동 배양하였다. APC-표지된 항-CD107a(BD Biosciences)를 1㎍/ml의 항-CD49d(BD Biosciences), 1㎍/ml의 항-CD28(Miltenyi), 및 1x 모넨신 용액(eBioscience)에 더하여 공동-배양의 시작시에 첨가하였다. 6시간 인큐베이션 후, 세포를 고정 가능한 생활력 염료(eBioscience) 및 비오블루(vioblue)-표지된 항-CD8(Miltenyi)로 염색하고, MACSQuant 흐름세포측정기(Miltenyi)를 이용하여 분석하였다. 탈과립화 세포독성 T 세포는 CD8+CD107a+ 세포에 해당한다.
사이토카인 방출 검정
5 x 104개의 T 세포를 96-웰 플레이트 중에서 웰 당 0.1 ml로 5 x 104개의 ROR1-양성 또는 ROR1-음성 세포와 함께 공동 배양하였다. 24시간 인큐베이션 후, 배양 상층액을 수거하고, IFNγROR1-양성 또는 ROR1-음성 세포에 대해 분석하였다.
세포독성 검정
부착 표적 세포를 이용하여: 2 x 104개의 ROR1-양성 또는 ROR1-음성 세포를 96 웰 플레이트 중에서 웰 당 0.1ml로 시딩하였다. 플레이팅 다음날, ROR1-양성 및 ROR1-음성 세포를 CellTrace CFSE로 표지시키고, 4시간 동안 4 x 105개의 T 세포와 공동-배양하였다. 이후, 세포를 수거하고, 고정 가능한 생활력 염료(eBioscience)로 염색시키고, MACSQuant 흐름세포측정기(Miltenyi)를 이용하여 분석하였다.
특정 용해의 백분율을 하기 식을 이용하여 계산하였다:
Figure 112017020005290-pct00016
현탁 표적 세포를 이용하여: ROR1-양성 및 ROR1-음성 세포를 각각 CellTrace CFSE 및 CellTrace Violet으로 표지시켰다. 약 2 x 104개의 ROR1-양성 세포를 96-웰 플레이트에서 웰 당 0.1ml로 4 x 105개의 T 세포와 함께 2 x 104개의 ROR1 음성 세포와 공동-배양하였다. 4시간의 인큐베이션 후, 세포를 수거하고, 고정 가능한 생활력 염료(eBioscience)로 염색시키고, MACSQuant 흐름세포측정기(Miltenyi)를 이용하여 분석하였다.
특정 용해의 백분율을 상기 식을 이용하여 계산하였다.
실시예
CAR 폴리펩티드 서열의 예:
이후, 60개의 ROR1 scCAR의 서열 SEQ ID NO.79 내지 138(펩티드 신호를 가짐)이 제공된다. 이들은 2A2, 4A5, D10, G6, G3, H10, 2A4 및 1C11의 8개의 상이한 항체로부터의 scFv, 및 V1 내지 V6의 CAR 구조를 갖는다.
형태 V1, V3 및 V5(CD8α 막횡단 도메인을 갖는 scCAR)를 2A2 scFv를 갖는 scCAR을 제외하고는 하기 실험에서 검정하였고, V1 형태만(비교를 위한 기준으로서) 시험하였으며, 이는 문헌[Hudecek et al (2013)]에 기재된 바와 동일한 구조를 갖는다.
프레임 내의 서열이 바람직한 VH 및 VL 서열에 해당한다. 그러나, VH 및 VL은 본 발명에 따라 CAR 효율을 개선시키기 위해 교환될 수 있다.
2A2 v1 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO. 79)
Figure 112017020005290-pct00017
2A2 v2 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.80)
Figure 112017020005290-pct00018
2A2 v3 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.81)
Figure 112017020005290-pct00019
2A2 v4 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.82)
Figure 112017020005290-pct00020
2A2 v5 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.83)
Figure 112017020005290-pct00021
2A2 v6 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.84)
Figure 112017020005290-pct00022
4A5 v1(SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.85)
Figure 112017020005290-pct00023
4A5 v2 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.86)
Figure 112017020005290-pct00024
4A5 v3 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.87)
Figure 112017020005290-pct00025
4A5 v4 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.88)
Figure 112017020005290-pct00026
4A5 v5 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.89)
Figure 112017020005290-pct00027
4A5 v6 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.90)
Figure 112017020005290-pct00028
D10 v1 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.91)
Figure 112017020005290-pct00029
D10 v2 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.92)
Figure 112017020005290-pct00030
D10 v3 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.93)
Figure 112017020005290-pct00031
D10 v4 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.94)
Figure 112017020005290-pct00032
D10 v5 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.95)
Figure 112017020005290-pct00033
D10 v6 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.96)
Figure 112017020005290-pct00034
인간화된 D10-V1 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.97)
Figure 112017020005290-pct00035
인간화된 D10-V2 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.98)
Figure 112017020005290-pct00036
인간화된 D10-V3 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.99)
Figure 112017020005290-pct00037
인간화된 D10-V4 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.100)
Figure 112017020005290-pct00038
인간화된 D10-V5 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.101
Figure 112017020005290-pct00039
인간화된 D10-V6 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.102)
Figure 112017020005290-pct00040
G6 v1 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.103)
Figure 112017020005290-pct00041
G6 v2 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.104)
Figure 112017020005290-pct00042
G6 v3 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.105)
Figure 112017020005290-pct00043
G6 v4 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.106)
Figure 112017020005290-pct00044
G6 v5 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.107)
Figure 112017020005290-pct00045
G6 v6 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.108)
Figure 112017020005290-pct00046
G3 v1 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.109)
Figure 112017020005290-pct00047
G3 v2 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.110)
Figure 112017020005290-pct00048
G3 v3 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.111)
Figure 112017020005290-pct00049
G3 v4 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.112)
Figure 112017020005290-pct00050
G3 v5 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.113)
Figure 112017020005290-pct00051
G3 v6 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.114)
Figure 112017020005290-pct00052
H10 v1 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.115)
Figure 112017020005290-pct00053
H10 v2 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.116)
Figure 112017020005290-pct00054
H10 v3 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.117)
Figure 112017020005290-pct00055
H10 v4 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.118)
Figure 112017020005290-pct00056
H10 v5 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.119)
Figure 112017020005290-pct00057
H10 v6 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.120)
Figure 112017020005290-pct00058
인간화된 H10-v1 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.121)
Figure 112017020005290-pct00059
인간화된 H10-v2 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.122)
Figure 112017020005290-pct00060
인간화된 H10-v3 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.123)
Figure 112017020005290-pct00061
인간화된 H10-v4 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.124)
Figure 112017020005290-pct00062
인간화된 H10-v5 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.125)
Figure 112017020005290-pct00063
인간화된 H10-v6 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.126)
Figure 112017020005290-pct00064
2A4 v1 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.127)
Figure 112017020005290-pct00065
2A4 v2 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.128)
Figure 112017020005290-pct00066
2A4 v3 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.129)
Figure 112017020005290-pct00067
2A4 v4 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.130)
Figure 112017020005290-pct00068
2A4 v5 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.131)
Figure 112017020005290-pct00069
2A4 v6 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.132)
Figure 112017020005290-pct00070
1C11 v1 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.133)
Figure 112017020005290-pct00071
1C11 v2 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.134)
Figure 112017020005290-pct00072
1C11 v3 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.135)
Figure 112017020005290-pct00073
1C11 v4 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.136)
Figure 112017020005290-pct00074
1C11 v5 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.137)
Figure 112017020005290-pct00075
1C11 v6 (SEQ ID NO.1 + SEQ ID NO.138)
Figure 112017020005290-pct00076
실시예 1: ROR1 -양성 및 -음성 세포주의 선택
다양한 세포 표면 발현 수준의 ROR1을 발현하는 세포주를 확인하기 위해, 12개의 인간 세포주를 Qifikit(Dako) 및 항-인간 ROR1 mAb 클론 2A2(재료 및 방법 참조)를 이용하여 흐름세포측정법에 의해 분석하였다. 이들 세포주 중 9개는 mRNA 또는 단백질 수준에서 ROR1에 대해 양성인 것으로 문헌에서 이전에 기재되었다(표 10).
표 10: 문헌에서 ROR1에 대해 양성인 것으로 보고된 세포주
Figure 112017020005290-pct00077
흐름세포측정법 결과는 MDA-MB-231(ATCC® HTB-26), MDA-MB-468(ATCC® HTB. 132), Hs746T(ATCC® HTB-135) 및 HT-29(ATCC® HTB-38) 세포가 가장 높은 수준의 ROR1 세포 표면 발현을 발현한 것을 나타낸다. 높은 발현 세포주의 대략 절반 수준인 더 낮은 수준의 ROR1 세포 표면 발현이 PC-3(ATCC.®. CRL-1435), NCI-H1993(ATCC® CRL 5909), A549(ATCC CCL-185) 및 Jeko-1(ATCC CRL-3006) 세포에서 검출되었다(도 5).
이들 결과로부터, MCF-7, K562 및 T 세포가 ROR1을 발현하지 않고, Cal51이 이의 표면에서 단지 매우 낮은 수준의 ROR1을 발현한 것이 또한 관찰되었다.
이러한 세포주로부터, 항-ROR1 scCAR의 활성을 스크리닝하기 위해 다양한 수준의 ROR1을 발현하는 PC-3 및 MDA-MB-231 세포, 및 ROR1 음성인 MCF-7 세포의 3개의 부착 세포주를 선택하였다.
또한, 항-ROR1 scCAR의 활성을 스크리닝하기 위해 ROR1 양성인 Jeko-1 세포 및 ROR1 음성인 K562 세포의 2개의 현탁 세포주를 선택하였다.
실시예 2: 항- ROR1 scCAR의 생성
2세대의 18개의 ROR1-특이적 scCAR의 한 세트(도 1c)를 생성시키고, 하기 실험에서 시험하였다.
이들은 표 1-2의 하기 빌딩 블록의 융합으로부터 발생한다:
- 뮤린 기원으로부터의 scFv 또는 D10, G6, G3, H10, 2A4 또는 1C11로부터의 인간화 형태;
- 1개의 스페이서: 인간 FcγRIIIα, CD8α 또는 IgG1 힌지;
- 인간 CD8α의 막횡단 도메인 및 인간 41BB의 공동자극 도메인;
- 인간 CD3ζ의 활성화 도메인
다양한 결합 친화성 및 다양한 에피토프 특이성의 수용체를 발생시키기 위해 scCAR에서 다양한 scFv를 이용하였다.
mAb D10 및 G6은 3' Ig 유사 영역 및 Ig 유사 도메인과 ROR1의 CRD 도메인 사이의 링커 영역을 표적으로 한다(도 2).
mAb G3, H10 및 2A4는 ROR1의 IgG 유사 영역을 표적으로 한다(도 2).
mAb 1C11은 ROR1의 CRD 도메인을 표적으로 한다(도 2).
ROR1의 근위 및 원위 에피토프 둘 모두에 의한 scCAR 진입을 최적화시키기 위한 노력으로 scCAR에서 상이한 길이의 3개의 스페이서(16 AA, 45 AA 및 231 AA)를 이용하였다(Guest et al., 2005).
실시예 3: 항- ROR1 scCAR의 시험관내 시험
상기와 같이 설계된 항-ROR1 scCAR을 도 6에 제시된 2-단계 스크리닝 방법을 이용하여 인간 일차 T 세포에서 시험하였다.
스크리닝 과정의 첫번째 단계에서, 항-CD28/CD3 비드 및 IL-2를 이용하여 4-5일 동안 이전에 활성화된 일차 인간 T 세포를 이전에 제시된 18개의 항-ROR1 scCAR을 인코딩하는 mRNA로 천기천공시켰다. 전기천공 하루 후, scCAR 발현을 흐름세포측정법 및 웨스턴 블롯에 의해 평가하고, scCAR-변형된 T 세포 활성을 T 세포 탈과립화를 측정함으로써 평가하였다. 웨스턴 블롯에 의해 검출되고, 적어도 하나의 ROR1 양성 세포주와의 공동배양시 T 세포의 유의한 특정 탈과립화(≥20%)를 유도한 scCAR을 스크리닝 과정의 두번째 단계로 통과시키기 위해 선택하였다.
스크리닝 과정의 두번째 단계에서, 항-CD28/CD3 비드 및 IL-2를 이용하여 11-12일 동안 이전에 활성화된 일차 인간 T 세포를 첫번째 스크리닝 단계 후에 선택된 항-ROR1 scCAR을 인코딩하는 mRNA로 천기천공시켰다. 전기천공 1-2일 후, scCAR 발현을 흐름세포측정법에 의해 평가하고, scCAR-변형된 T 세포 활성을 T 세포의 효과기 기능(탈과립화, IFNg 생성 및 세포용해 활성)을 측정함으로써 평가하였다. 적어도 하나의 ROR1 양성 세포주와의 공동-배양시 T 세포의 유의한 특정 탈과립화(≥20%), T 세포의 유의한 특정 세포독성(≥20%의 표적 세포 용해) 및 T 세포에 의한 IFNg의 유의한 생성(≥1500pg/ml)을 유도한 scCAR을 잠재적 scCAR 후보로 선택하였다.
상기 scCAR을 짧은 힌지에 융합된 2A2 scFv를 함유하는 기준 scCAR(SEQ ID NO.79)과 체계적으로 비교하였는데, 이는 이러한 scCAR이 문헌[Hudecek et al., 2013]에서 기능적인 것으로 이전에 밝혀졌기 때문이다.
a) scCAR의 일차 스크리닝:
scCAR 발현
첫째로, 항-ROR1 scCAR의 전체 발현을 항-인간 CD3 제타 mAb를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 T 세포에서 평가하였다. 중간(CD8α 힌지) 또는 긴 스페이서(IgG1 힌지)를 함유한 scCAR이 이들이 보유한 scFv가 무엇이든 간에 T 세포 용해질에서 강하게 검출된 것이 관찰되었다. 그러나, 짧은 스페이서(FcγRIIIα)를 함유한 scCAR에 대해, G6, G3 및 H10 scFv를 갖는 것은 잘 검출된 반면, D10, 2A4 및 1C11 scFv를 갖는 것은 약하게 검출되거나 검출되지 않았다(도 7a 및 7b).
이후, T 세포에서의 항-ROR1 scCAR의 표면 발현을 항-Fab 또는 단백질 L을 이용한 흐름세포측정법에 의해 평가하였다(도 8a 및 8b).
하기가 관찰되었다:
- 웨스턴 블롯에 의해 T 세포 용해질에서 잘 검출된 scCAR D10-v3, D10-v5, G6-v3, G6-v5, G3-v3, G3-v5, H10-v3, H10-v5, 2A4-v3 및 2A4-v5는 또한 흐름세포측정법에 의해 T 세포 표면에서 잘 검출되었다;
- 웨스턴 블롯에 의해 T 세포 용해질에서 검출되지 않거나 거의 검출되지 않은 scCAR D10-v1, 2A4-v1 및 1C11-v1은 또한 흐름세포측정법에 의해 T 세포 표면에서 검출되지 않았다.
scCAR 활성
scCAR 활성을 평가하기 위해, scCAR-변형된 T 세포의 탈과립화를 ROR1-양성(MDA-MB-231 및 PC-3) 또는 ROR1-음성(MCF-7) 세포와의 공동-배양시에 분석하였다.
scCAR D10-v1, D10-v3, D10-v5, H10-v1, H10-v3 및 H10-v5로 변형된 T 세포는 MCF-7 세포와의 공동-배양시 보다 MDA-MB-231 및 PC-3 세포와의 공동-배양시에 더욱 유의하게(≥20%) 탈과립화된 것으로 관찰되었다(도 9a 및 9b).
도 9a 및 도 9b는 변형되지 않은 T 세포 뿐만 아니라 scCAR H10 및 D10으로 변형된 T 세포가 어쨌건 MDA-MB-231, PC-3 및 MCF-7 세포와의 공동배양시 scCAR G6, G3, 2A4 및 1C11보다 훨씬 잘 탈과립화되는 것을 제시한다.
일차 스크리닝의 결론:
전체적으로, 이들 결과는 본 발명에서 설계된 18개의 항-ROR1 scCAR 중에서 6개(D10-v1, D10-v3, D10-v5, H10-v1, H10-v3 및 H10-v5)가 스크리닝 과정의 두번째 단계로 통과하기 위해 선택되어야 하는 기준을 충족시킨 것을 입증하였다.
b) scCAR의 이차 스크리닝
scCAR 발현
T 세포에서의 항-ROR1 scCAR의 표면 발현을 단백질 L을 이용한 흐름세포측정법에 의해 평가하였다.
활성화 4-5일 후 전기천공된 T 세포에서 잘 검출된 scCAR D10-v3, D10-v5, H10-v3 및 H10-v5(도 8a 및 8b)가 활성화 11-12일 후에 전기천공된 T 세포에서 검출되지 않거나 단지 약하게 검출된 것이 관찰되었다(도 10).
scCAR 활성
첫째로, scCAR 활성을 평가하기 위해, scCAR-변형된 T 세포의 탈과립화를 ROR1-양성(MDA-MB-231, PC-3 및 Jeko-1) 또는 ROR1-음성(MCF-7 및 K562) 세포와의 공동-배양시에 분석하였다.
scCAR D10-v1, H10-v1 및 H10-v5로 변형된 T 세포와 대조적으로, scCAR D10-v3, D10-v5 및 H10-v3로 변형된 T 세포는 MCF-7 세포와의 공동-배양시 또는 배지 단복보다 MDA-MB-231 및 PC-3 세포와의 공동-배양시에 더욱 유의하게 탈과립화(≥20%)된 것이 관찰되었다(도 11).
이후, ROR1-양성(MDA-MB-231, PC-3 및 Jeko-1) 또는 ROR1-음성(MCF-7 및 K562) 세포와의 공동-배양시의 scCAR-변형된 T 세포에 의한 IFNγ의 생성을 분석하였다.
scCAR D10-v1, H10-v1 및 H10-v5로 변형된 T 세포와 대조적으로, scCAR D10-v3, D10-v5 및 H10-v3로 변형된 T 세포가 MCF-7, K562 세포와의 공동-배양시 또는 배지 단복보다 MDA-MB-231, PC-3 및 Jeko-1 세포와의 공동-배양시에 유의하게 더 많은 IFNγ(≥1500pg/ml)를 생성시킨 것이 관찰되었다(도 12).
최종적으로, scCAR-변형된 T 세포의 세포독성 활성을 ROR-1-음성(MCF-7 및 K562) 또는 ROR1-양성(MDA-MB-231, PC-3 및 Jeko-1) 세포와의 공동-배양시에 분석하였다.
scCAR D10-v1, H10-v1 및 H10-v5로 변형된 T 세포와 대조적으로, scCAR D10-v3, D10-v5 및 H10-v3로 변형된 T 세포가 공동-배양에서 20% 초과의 PC-3 세포를 특별히 사멸시킨 것이 관찰되었다(도 13). scCAR D10-v3 및 H10-v3로 변형된 T 세포가 또한 공동-배양에서 20% 초과의 MDA-MB-231 및 Jeko-1 세포를 사멸시켰으나, 이는 scCAR D10-v5로 변형된 T 세포에 대해서는 그렇지 않았다(도 13 및 도 14).
이차 스크리닝의 결론:
전체적으로, 이들 결과는 시험된 모든 scCAR로부터 D10-v3, D10-v5 및 H10-v3가 가장 가치 있는 scCAR인 것을 입증하였다.
형태 V2의 2개의 CAR에 대한 약간의 장점이 세포독성의 유도와 관련하여 기재될 수 있다(시험된 다양한 ROR1-양성 세포주에 대한 더 나은 반응).
실시예 4: ROR1 -CAR을 발현하는 TCRα 비활성화 세포의 증식
도 15는 희귀 절단 엔도뉴클레아제를 이용함에 의한 TCRα 비활성화의 개략적 대표도를 제시한다. T-세포 수용체 알파 불변 사슬 영역(TRAC) 유전자 내에서 15-bp 스페이서에 의해 떨어져 있는 2개의 17-bp 길이의 서열(절반 표적으로 언급됨)을 표적으로 하는 이종이합체 TALE-뉴클레아제를 설계하고 생성시켰다. 각각의 절반 표적은 표 11에 나열된 절반 TALE-뉴클레아제의 반복부에 의해 인지된다.
표 11: TCR알파 유전자를 표적으로 하는 TAL-뉴클레아제
Figure 112017020005290-pct00078
각각의 TALE-뉴클레아제 작제물을 T7 프로모터의 조절하에서 제한 효소 분해를 이용하여 포유동물 발현 벡터로 서브클로닝하였다. TRAC 유전체 서열을 분해하는 TALE-뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA를 T7 프로모터의 다운스트림에 코딩 서열을 갖는 플라스미드로부터 합성하였다.
항-CD3/CD28 코팅된 비드로 72시간 동안 예비활성화된 정제된 T 세포를 절반 TRAC_T01 TALE-뉴클레아제 둘 모두를 인코딩하는 2개의 mRNA 각각으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 48시간 후, 동일 공여자로부터의 T 세포의 다양한 그룹을 각각 이전에 기재된 ROR1 CAR(SEQ ID NO:79 내지 138) 중 하나를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 형질도입 2일 후, CD3NEG 세포를 항-CD3 자기 비드를 이용하여 정제하고, 형질도입 5일 후, 세포를 가용성 항-CD28(5 ㎍/ml)로 재활성화시켰다.
주 당 2회 세포를 계수함으로써 재활성화 후 30일 이하 동안 세포 증식을 후속시켰다. 특히 항-CD28로 재활성화되는 경우 형질도입되지 않은 세포에 비해 ROR1 CAR을 발현하는 TCR 알파 비활성화 세포에서의 증가된 증식이 관찰되었다.
ROR1 CAR을 발현하는 인간 T 세포가 활성화된 상태를 나타내는지 연구하기 위해, 활성화 마커 CD25의 발현을 형질도입 7일 후에 FACS에 의해 분석하였다. ROR1 CAR을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 정제된 세포를 형질도입되지 않은 세포에 비한 이들의 활성화를 평가하기 위해 이들의 표면에서 CD25 발현에 대해 검정하였다. 증가된 CD25 발현은 항-CD28 재활성화를 나타내거나, 재활성화 상태가 아님을 나타내었다.
참고문헌
Figure 112017020005290-pct00079
Figure 112017020005290-pct00080
Figure 112017020005290-pct00081
Figure 112017020005290-pct00082
Figure 112017020005290-pct00083
SEQUENCE LISTING <110> CELLECTIS <120> ROR1 (NTRKR1) SPECIFIC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS FOR CANCER IMMUNOTHERAPY <130> P81404824PCT <150> PA201470465 <151> 2014-07-29 <160> 143 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> signal peptide <400> 1 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly 20 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> signal peptide <400> 2 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> FcgRIIIa hinge <400> 3 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 4 <211> 45 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> CD8alpha hinge <400> 4 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala 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CAR sequence <400> 138 Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Leu Trp Leu Arg Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ile Leu Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Glu Val Leu Ile Thr Gln Thr Pro Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala 145 150 155 160 Ser Gln Asp Ile Gly Ser Ser Leu Asn Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp 165 170 175 Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly 180 185 190 Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu 195 200 205 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Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 420 425 430 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 435 440 445 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 450 455 460 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala 465 470 475 480 Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg 485 490 495 Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys 500 505 510 Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys 515 520 525 Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val 530 535 540 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 545 550 555 560 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 565 570 575 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 580 585 590 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 595 600 605 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 610 615 620 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 625 630 635 640 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 645 650 <210> 139 <211> 49 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <223> TRAC T01 target sequence <400> 139 ttgtcccaca gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgaga 49 <210> 140 <211> 530 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> TAL binding domain TRAC_T01-L <400> 140 Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys 1 5 10 15 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 20 25 30 His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly 35 40 45 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 50 55 60 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 65 70 75 80 Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 85 90 95 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala 100 105 110 Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 115 120 125 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala 130 135 140 Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 145 150 155 160 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val 165 170 175 Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 180 185 190 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu 195 200 205 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 210 215 220 Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 225 230 235 240 Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala 245 250 255 Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 260 265 270 Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys 275 280 285 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 290 295 300 His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly 305 310 315 320 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 325 330 335 Gln 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binding domain TRAC_T01-R <400> 141 Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys 1 5 10 15 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 20 25 30 His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly 35 40 45 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 50 55 60 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His 65 70 75 80 Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 85 90 95 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala 100 105 110 Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu 115 120 125 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala 130 135 140 Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 145 150 155 160 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val 165 170 175 Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 180 185 190 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln 195 200 205 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 210 215 220 Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 225 230 235 240 Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala 245 250 255 Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 260 265 270 Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys 275 280 285 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 290 295 300 His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly 305 310 315 320 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 325 330 335 Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 340 345 350 Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val 355 360 365 Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala 370 375 380 Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 385 390 395 400 Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala 405 410 415 Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala 420 425 430 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val 435 440 445 Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 450 455 460 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln 465 470 475 480 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 485 490 495 Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 500 505 510 Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala 515 520 525 Leu Glu 530 <210> 142 <211> 2814 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> polynucleotide encoding TRAC_T01-L TALEN <400> 142 atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60 gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120 aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180 acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240 aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300 ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360 agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420 gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480 ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 540 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 600 gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 720 ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780 cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 840 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 900 caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1020 agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080 caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag 1140 caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200 ccggagcagg tggtggccat cgccagccac gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc 1260 cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1320 atcgccagca atattggtgg caagcaggcg ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg 1380 ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt 1440 ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500 ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 1560 acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1620 gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1680 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 1740 attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800 cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 1860 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920 caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1980 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040 agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100 ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160 cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220 aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280 gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340 aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400 aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460 gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520 aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580 gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640 aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700 tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760 gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814 <210> 143 <211> 2832 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> polynucleotide encoding TRAC_T01-R TALEN <400> 143 atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60 gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120 cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180 ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240 ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300 gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360 acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420 attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg 480 acgggtgccc cgctcaactt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc 540 ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600 ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 660 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 720 gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 840 attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900 cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 960 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1020 caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1080 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1140 agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200 caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag 1260 caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320 ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1380 cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1440 atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1500 ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag caatattggt 1560 ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1620 ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 1680 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1740 gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 1800 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 1860 gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1920 cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg 1980 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gacccctcag 2040 caggtggtgg ccatcgccag caatggcggc ggcaggccgg cgctggagag cattgttgcc 2100 cagttatctc gccctgatcc ggcgttggcc gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg 2160 gcctgcctcg gcgggcgtcc tgcgctggat gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220 agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280 ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340 gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400 aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460 gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520 caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580 cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640 tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700 tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760 ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820 gccgactgat aa 2832

Claims (54)

  1. 모노클로날 항-ROR1 항체로부터의 VH 및 VL을 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인; CD8α 힌지, IgG1 힌지 및 FcγRIIIα 힌지로부터 선택되는 힌지; CD8α 막횡단 도메인; 및 CD3 제타 신호전달 도메인 및 4-1BB로부터의 공동-자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 폴리펩티드 구조를 갖는 ROR1(NTRKR1) 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)로서, 상기 세포외 리간드 결합-도메인이 하기를 포함하는, ROR1(NTRKR1) 특이적 키메라 항원 수용체(CAR):
    - SEQ ID NO:54(CDR-H1), SEQ ID NO:55(CDR-H2) 및 SEQ ID NO:56(CDR-H3)의 마우스 모노클로날 항체 H10으로부터의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 VH, 및
    - SEQ ID NO:59(CDR-L1), SEQ ID NO:60(CDR-L2) 및 SEQ ID NO:61(CDR-L3)의 마우스 모노클로날 항체 H10으로부터의 CDR을 포함하는 가변 경쇄 VL;
    또는
    - SEQ ID NO:28(CDR-H1), SEQ ID NO:29(CDR-H2) 및 SEQ ID NO:30(CDR-H3)의 마우스 모노클로날 항체 D10으로부터의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 VH, 및
    - SEQ ID NO:33(CDR-L1), SEQ ID NO:34(CDR-L2) 및 SEQ ID NO:35(CDR-L3)의 마우스 모노클로날 항체 D10으로부터의 CDR을 포함하는 가변 경쇄 VL.
  2. 제 1항에 있어서, CD8α 막횡단 도메인이 SEQ ID NO:6과 적어도 80%의 서열 동일성을 공유하는 ROR1 특이적 CAR.
  3. 제 1항에 있어서, 힌지가 SEQ ID NO:4(CD8α), SEQ ID NO:5(IgG1) 또는 SEQ ID NO:3(FcγRIIIα)과 적어도 80%의 서열 동일성을 공유하는 ROR1 특이적 CAR.
  4. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 CD8α 힌지 및 SEQ ID NO:6에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 CD8α 막횡단 도메인을 포함하는, ROR1 특이적 CAR.
  5. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:5에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 IgG1 힌지 및 SEQ ID NO:6에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 CD8α 막횡단 도메인을 포함하는, ROR1 특이적 CAR.
  6. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 FcγRIIIα 힌지 및 SEQ ID NO:6에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 CD8α 막횡단 도메인을 포함하는, ROR1 특이적 CAR.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 세포외 리간드 결합-도메인이 SEQ ID NO:53(H10-VH) 및 SEQ ID NO:58(H10-VL)과 각각 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL 사슬을 포함하는 ROR1 특이적 CAR.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 세포외 리간드 결합-도메인이 SEQ ID NO:27(D10-VH) 및 SEQ ID NO:32(D10-VL)과 각각 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL 사슬을 포함하는 ROR1 특이적 CAR.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 세포외 리간드 결합-도메인이 인간화된 H10 또는 D10 항체로부터의 VH 및 VL 사슬을 포함하는 ROR1 특이적 CAR.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 세포외 리간드 결합-도메인이 VH 및 VL 사슬을 포함하고, 여기서
    - VH 사슬이 SEQ ID NO:57에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 갖고,
    - VL 사슬이 SEQ ID NO:62에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 갖는,
    ROR1 특이적 CAR.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 세포외 리간드 결합-도메인이 하기를 포함하는 ROR1 특이적 CAR:
    - SEQ ID NO:31에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 갖는 VH 사슬, 및
    - SEQ ID NO:36에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 갖는 VL 사슬.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 CAR 폴리펩티드가 SEQ ID NO:117(H10v3-CAR 서열)과 적어도 80%의 서열 동일성을 공유하는 ROR1 특이적 CAR.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 CAR 폴리펩티드가 SEQ ID NO:93(D10v3-CAR 서열)과 적어도 80%의 서열 동일성을 공유하는 ROR1 특이적 CAR.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 CAR 폴리펩티드가 SEQ ID NO:95(D10v5-CAR 서열)와 각각 적어도 80%의 서열 동일성을 공유하는 ROR1 특이적 CAR.
  15. 제 1항에 있어서, 4-1BB로부터의 상기 공동-자극 도메인이 SEQ ID NO:8과 적어도 80%의 동일성을 갖는 ROR1 특이적 CAR.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 CD3 제타 신호전달 도메인이 SEQ ID NO:9와 적어도 80%의 동일성을 갖는 ROR1 특이적 CAR.
  17. 제 1항에 있어서, 신호 펩티드를 추가로 포함하는 ROR1 특이적 CAR.
  18. 제 1항에 있어서, 상기 CAR이 SEQ ID NO:117(H10v3-CAR 서열), SEQ ID NO:93(D10v3-CAR 서열) 또는 SEQ ID NO:95(D10v5-CAR 서열)의 아미노산 서열을 갖는 ROR1 특이적 CAR.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 따른 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  20. 제 19항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  21. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 따른 ROR1 특이적 CAR을 세포 표면 막에서 발현하는, 조작된 면역 세포.
  22. 제 21항에 있어서, 염증성 T-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절성 T-림프구 또는 헬퍼 T-림프구로부터 유래된, 조작된 면역 세포.
  23. 제 21항에 있어서, TCR의 발현이 상기 면역 세포에서 억제되는, 조작된 면역 세포.
  24. 제 21항에 있어서, 상기 세포가 적어도 하나의 면역 억제 또는 화학요법 약물에 대한 내성을 제공하도록 돌연변이되는, 조작된 면역 세포.
  25. 제 21항에 있어서, 요법에서 사용하기 위한 조작된 면역 세포.
  26. 제 21항에 있어서, 암의 치료에서 약제로서 사용하기 위한 조작된 면역 세포.
  27. 제 21항에 있어서, ROR1-발현 세포에 의해 특징지어진 전암성 또는 악성 암 질환의 요법에서 사용하기 위한 조작된 면역 세포.
  28. 제 21항에 있어서, 혈액 암 질환의 요법에서 사용하기 위한 조작된 면역 세포.
  29. 제 21항에 있어서, 혈액 암 질환이 만성 림프성 백혈병(CLL), 소림프구 림프종(SLL), 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상 증후군, 외투 세포 림프종(MCL), 및 t(1;19) 염색체 전위를 갖는 급성 림프모구 백혈병(ALL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 혈액 암 질환의 요법에서 사용하기 위한 조작된 면역 세포.
  30. 제 21항에 있어서, 질환이 고형 종양인 요법에서 사용하기 위한 조작된 면역 세포.
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