KR102032573B1

KR102032573B1 - 미세조류로부터 스쿠알렌을 추출하기 위한 방법

Info

Publication number: KR102032573B1
Application number: KR1020137030414A
Authority: KR
Inventors: 사뮈엘 파티니에
Original assignee: 로께뜨프레르
Priority date: 2011-05-27
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2019-10-15
Anticipated expiration: 2032-05-25
Also published as: JP2014515275A; FR2975705B1; US20140073037A1; CN103608459A; KR20140023367A; JP5990575B2; EP2714917B1; WO2012164211A1; CN103608459B; CA2835027C; CA2835027A1; FR2975705A1; EP2714917A1

Abstract

본 발명은 트라우스토키트리알레스 종 과(Thraustochytriales sp . family)에 속하는 미세조류를 발효시켜 생성된 스쿠알렌을 유기 용매를 사용하지 않고 추출하기 위한 방법에 관한 것으로, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 1) 세포간 가용성 물질의 농도를 낮춰 발효 배지의 총 건조 중량에 대한 생물체량의 건조중량으로 표현되는 순도가 30 내지 99% 사이를 달성하도록 트라우스토키트리알레스 목에 속하는 미세조류의 생물체량을 준비하는 단계; 2) 효소 처리에 의해 생성되는 에멀젼 형성을 방지하면서 상기 미세조류의 세포벽을 깨뜨리기 위해 중성 또는 염기성 프로테아제의 군으로부터 선택된 프로테아제 효소를 사용하여, 결과적인 생물체량을 처리하는 단계; 3) 수상으로부터 오일을 분리하기 위해, 결과적인 반응 혼합물을 원심분리하는 단계; 및 4) 이렇게 생성된 스쿠알렌이 풍부한 미가공 오일을 회수하는 단계.

Description

미세조류로부터 스쿠알렌을 추출하기 위한 방법{METHOD FOR EXTRACTING SQUALENE FROM MICROALGAE}

본 발명은 트라우스토키트리알레스 종 과(Thraustochytriales sp. family) 미세조류로부터 유기 용매 없이 스쿠알렌을 최적으로 추출하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적을 위해, "트라우스토키트리알레스 종 과 미세조류(microalgae of the Thraustochytriales sp. family)"라는 표현은 시조카이트리움 속(Schizochytrium sp .), 오란티오키트리움 속 (Aurantiochytrium sp .), 및 트라우스토키트리움 속(Thraustochytrium sp .)의 종에 속하는 미세조류를 의미하고자 한 것이다.

스쿠알렌은 30개의 탄소 원자 및 50개의 수소 원자를 포함하는 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사-헥센의 화학식인 트리테르펜, 이소프레노이드이다.

스쿠알렌은 (피지에서 발견되는) 인간을 포함하여 모든 고등 생물체에서 자연적으로 생성되는 지질이다. 스쿠알렌은 사실 콜레스테롤, 스테로이드 호르몬 및 비타민 D의 생합성에 필수적인 중간체이다(콜레스테롤 대사 경로의 효소의 하나인 스쿠알렌 모노옥시게나제는 스쿠알렌 분자의 말단 중 하나를 산화시킴으로써 그의 고리화를 유도하여 그 결과 콜레스테롤 및 다른 스테로이드들로 전환될 라노스테롤이 된다).

산업적으로, 스쿠알렌은 특히 식품 부문, 화장품 분야 및 약학 분야에서 사용된다.

식품 보충제로서, 스쿠알렌은 대개 캡슐 또는 오일로 제형화된다.

화장품 분야에서, 스쿠알렌 분자는 보습 크림의 항산화제, 대전방지제 및 유화제로 사용되어, 지방 자취 또는 감각을 남기지 않으면서 빠르게 피부를 투과하고 다른 오일들 및 비타민들과 잘 혼합될 수 있다.

이와 같은 분야에서, 스쿠알렌의 매우 높은 불안정성(6개의 불포화)을 고려할 때, 시장에서 발견되는, 일반적으로 매우 높은 수준의 순도(99%)를 가지며 스쿠알렌보다 보다 좋은 항산화제인 (수소첨가에 의해 수득된) 포화된 형태의 스쿠알란(squalane)인 점에 유의해야 한다.

독성학적 연구는, 화장품에서 사용되는 농도에서 스쿠알렌 및 스쿠알란은 어떠한 독성도 나타내지 않으며, 인간 피부를 자극하거나 민감하지 않음을 보여주고 있다.

약학 분야에서, 스쿠알렌은 백신의 보조제로 사용된다.

이러한 보조제는 면역계를 자극하고 백신에 대한 반응을 증가시키는 물질이다.

본 적용 분야에서 스쿠알렌의 순도 수준은 극히 중요하다.

실제로, 만일 경구로 복용된다면 스쿠알렌은 완전히 안전한 것으로 여겨지지만, 주사 경로는 논란의 대상이 된다.

실제로, 의약 분야에서 인간 수여자에 대한 유해의 위험은 스쿠알렌이 불순물로 오염된 상항에서 증가될 수 있는데, 이는 말 그대로 보조제가 그 자신의 불순물에 대한 강한 면역반응도 유발할 수 있기 때문이다.

따라서, 불순물(미량의 금속들 특히 수은 및 미량의 다른 독소들)이 없는 고품질 스쿠알렌을 가지는 것이 극히 중요하다.

스쿠알렌을 생성하고 추출하기 위한 일정한 수의 경로들이 문헌에서 제안된다.

스쿠알렌은 종종 심해 상어와 같은 연골 어류의 간에 저장된 것으로 발견되는 (그런 이유로 이름 지어진) 화합물이다.

따라서 이것은 상어가 남획되는 이유 중 하나인데, 이미 상어는 그 지느러미 때문에 사냥되어져 왔다. 이와 같이, 상어간은 현재 "건강에 좋음"과 같이 기재되는 젤 캡슐을 생성하기 위해 판매된다.

그러나, 이와 같이 판매되는 스쿠알렌은 주로 상어 간으로부터 추출된 것으로 건강 문제들로부터 자유롭지 않다.

이는 상어가 인간에게 유해한 물질을 생성할 수 있는 병원균으로 감염될 수 있기 때문이다. 게다가, 생물체의 제거 및 정제 기관인 상어의 간은 인간에게 유해한 카르차톡신(carchatoxin)과 같은 독소를 함유할 수 있다.

이러한 환경적인 우려(상어 개체수의 대폭 감소) 및 건강에 대한 우려(생선 간이 건강에 대한 우려가 되는 독소도 저장하고 있음)는 스쿠알렌의 식물로부터의 추출을 촉발하였다.

따라서 올리브 오일 및 야자유 및 곡류로부터 또는 아마란스, 종자, 쌀겨 또는 맥아로부터 유래한 다른 오일로부터 스쿠알렌을 단리하는 것이 가능하다.

그러나 이 경우 주요한 단점은 스쿠알렌이 약 0.1wt% 내지 0.7wt%의 매우 적은 양으로 추출된다는 것이다.

실질적인 강화 및 정제 방법을 시행함으로써 종종 비싸게 만들어진, 상어 간으로부터 또는 식물로부터 추출하는 방법에 대한 제1 대안으로, 천연 효모 또는 재조합 효모, 특히 사카로미세스 유형의 미생물로부터 스쿠알렌을 생성하기 위한 제1 방법이 제안되어 왔다.

이와 같이, 사카로미세스 세러비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 스쿠알렌을 생성하는 능력이 있는 것으로 알려져 있지만, 생물체량 g당 약 0.041mg 정도의 매우 적은 양이다(Bhattacharjee, P. et al., 2001, in World J. Microb . Biotechnol., 17, pp. 811-816).

따라서, 유전적 재조합에 의해 이러한 생성능을 최적화하는 작업이 수행되어 왔다. 그러나 의약 분야에 대해 특허 출원 WO 2010/023551(백신 보조제로서 97%를 초과하는 순도를 가지는 스쿠알렌의 생산)에 제시된 바와 같이, 이러한 제1 대안은 (건조 세포의 15wt%를 초과하는) 스쿠알렌 과생산 재조합 효모를 가지는 것이 가능한 경우에만 산업화 가능하다.

공교롭게도, 이러한 재조합 세포들을 얻기 위해서는 분자생물학적 수단을 이용한 수많은 힘들고, 지루하고, 복잡한 대사 조작 단계의 시행이 요구되며, 이는 결과적으로 스쿠알렌 생합성 경로 자극 및 스쿠알렌 이화 경로 저해를 야기한다.

상어 간 또는 식물에서 추출하는 방법에 대한 제2 대안으로서, (트라우스토키트리움, 오란티오키트리움, 및 시조카이트리움 속을 포함하는)트라우스토키트리알레스 목의 미세조류, 보다 구체적으로는 시조카이트리움 만그로베이(Schizochytrium mangrovei) 또는 시조카이트리움 리마시늄(Schizochytrium limacinum)으로부터 스쿠알렌을 생성하는 유망한 방법이 제안되었다.

이러한 미세조류는 타가 영양(heterotrophic) 조건(빛 없음; 탄소원으로서 글루코즈를 제공)하에서 스쿠알렌을 생성하며 따라서 미생물 발효 분야의 당업자에 의해 용이하게 조작될 수 있다.

따라서 이러한 방법은, 제어된 발효 조건에 의하여, 정제가 식품, 화장품 및 의약품의 요구들을 쉽게 만족시킬 수 있는 스쿠알렌의 품질을 제공할 수 있다.

그러나, 이러한 트라우스토키트리알레스 목의 미세조류에서 스쿠알렌은 도코사헥사에노산(또는 DHA), ω3류의 다가 불포화 지방산과 같은 관심있는 다른 지질 화합물들의 공동생성물이다.

따라서, 스쿠알렌은 특히 (카르테노이드 및 스테롤과 함께) 상업적인 DHA 오일의 비누화되지 않는 분획의 성분들 중 하나로 기술되는 것 같다.

비교하면, 시조카이트리움 만그로베이 FB1 균주는 0.017%의 스쿠알렌에 대해 6.2% 세포 건조중량의 비율로 DHA를 생성한다.

결과적으로, 스쿠알렌을 천연적으로 생성하는 미생물은 적은 양으로 생성한다:

- 트라우스토키트리움 ACEM 6063에 대해서는 생물체량 g당 약 0.1㎎(참고. Lewis et al., Mar . Biotechnol., 2001, pp 439-447)

- 시조카이트리움 만그로베이 FB1에 대해서는 생물체량 g당 약 0.162(참고. Yue Jiang et al., J. Agric . Food Chem., 2004, 52, pp 1196-1200).

그러므로, 생산량을 증가시키기 위해서는, 발효 조건을 최적화하는 것이 필수적인 것 같다.

그러나, 행해진 모든 노력에도 불구하고, 이 값들은 올리브 오일에 대한 기준치(약 4.24 mg/g)보다 여전히 낮다.

기껏해야, 최적화된 생산은 다음과 같은 생산양의 결과 초래한다:

- 트라우스토키트리움 ACEM 6063 생물체량 g당 약 1mg 내지 1.2mg의 스쿠알렌(참고. Qian Li et al., J. Agric . Food Chem ., 2009, 57, 4267-4272 또는 Lewis et al., Mar . Biotechnol ., 2001, 3, 439-447);

- 시조카이트리움 생물체량 g당 0.72mg의 스쿠알렌(참고. G. Chen et al., New Biotechnology , 2010, 27-4, pp 382-389);

- 오란티오키트리움 만그로베이 생물체량 g당 0.53mg의 스쿠알렌(참고. K.W. Fan et al., World J. Microbiol . Biotechnol ., 2010, 26-3, pp 1303-1309);

- 시조카이트리움 만그로베이 생물체량 g당 1.17 ±0.6mg의 스쿠알렌 (참고. C-J Yue and Y. Jiang, Process Biochemistry , 2009, 44, 923-927).

본 출원회사는 또한 스스로 당 분야의 문헌에서 아직 도달한 적이 없는 수준으로, 즉 (이하에서 예시할 바와 같이) 100g의 생물체량 당 적어도 8g의 스쿠알렌을 생성할 수 있는 방법을 제공함으로써 트라우스토키트리알레스 종 과의 미세조류에 의한 스쿠알렌의 생산을 보다 개선하는데 기여하였다.

실험실 규모에서, 발효 배지로부터 유래된 생물체량으로부터 스쿠알렌을 추출하기 위한 방법들은 유기 용매를 사용하는 종래의 방법들이다:

- Yue Jiang et al., J. Agric . Food Chem ., 2004, 52, 1196-1200은 메탄올/아세톤(7:3 v/v)에서 지질을 가용화한 후 클로로포름/메탄올(2:1 v/v)로 세척하는 방법을 기술한다;

- C-J Yue and Y. Jiang, Process Biochemistry , 2009, 44, 923-927에서는 감압동결건조된 세포에서 에탄올을 가지고 사전 비누화 후 헥산으로 스쿠알렌 및 콜레스테롤 추출을 시행한다;

- G. Chen et al., New Biotechnology , 2010, 27-4, pp 382-389에서는 감압동결건조 세포에서 KOH(10% w/v)-에탄올(75% v/v)로 비누화한 후 헥산으로 스쿠알렌 추출이 수행된다;

- Lewis et al., Mar . Biotechnol ., 2001, 439-447에서는 감압동결건조된 세포에서 총 지질을 클로로포름/메탄올/물(1:2:0.8 v/v/v)의 3원 혼합물을 사용하여 1차 추출한 후 비누화되지 않는 지질을 수득하기 위해, 이러한 총 지질의 일부를 메탄올/물(4:1 w/v) 중의 5% KOH 용액으로 처리하고 이어서 헥산-클로로포름(4:1 v/v)으로 비누화되지 않는 중성 지질을 본추출한다.

보다 큰 규모에서는, 인간 및 환경에 유해한 용매들의 사용을 피하기 위해 다른 해결책들이 제안되어 왔다.

일화로, 특허 KR 2008/0017960에서는, 예를 들어, 사이클로 덱스트린 용액 중에 스쿠알렌을 함유하는 배지를 둠으로써, 사이클로 덱스트린/스쿠알렌 복합체를 수득하고, 그 후, 상기 배지로부터의 복합체의 분리를 용이하게 하기 위해 CaCl₂, CaSO₄, MgCl₂ 또는 MgSO₄와 같은 응고제를 첨가하는 것이 제안된다. 그러나 이러한 스쿠알렌을 단리하기 위해서는 스쿠알렌을 디컴플렉스하는 것 역시 필요하다.

그러나, 실제로, 두 가지의 기술이 주로 기술된다:

- 초임계 CO₂로 추출하기 위한 방법;

- 유기 용매 없이 추출하기 위한 방법.

따라서, 클로로포름 또는 헥산으로 추출하는 방법에 대한 제1 대안은 초임계 CO₂이다.

본 기술은 500 Dalton 미만(스쿠알렌의 분자량은 400Da보다 약간 작음)의 분자량을 가지는 비극성 화합물의 추출에 아주 적합하다.

스쿠알렌은 100과 250bar 사이의 압력에서 초임계 CO₂에 녹는다.

본 기술로 추출하는 것에 대한 상당히 많은 작업이 보트리오콕커스 브라우니(Botryococcus braunii), 세데네무스 오블리커스(Scenedesmus obliquus) 또는 토루라스포라 델브루키(Torulaspora delbrueckii)에 대해 착수되었다.

더욱이, 초임계 CO₂는 따라서 세포 용해 및 스쿠알렌 단리 둘 다에 사용될 수 있다.

그러나, 세포로부터 지질을 추출하기 전에 세포를 동결감압건조하는 것이 권장되며, 이는 미생물의 유형에 따라 기술을 적응시키기 위해 많은 부가적인 작업을 요구한다.

더욱이, 이러한 조건은 매력적인 비용으로 산업적 스케일로 바꾸는 것이 어렵다.

기술적인 제2 대안은 유기 용매 없이 지질을 추출하는 것이다.

Benemann 및 Oswald에 의한 수많은 소논문 및 문헌으로부터, 또는, 예를 들어, 특허 EP 1 252 324 및 EP 1 305 330으로부터 얻은 교시들은 이러한 접근을 기술하나, 이 중 어느 것에도 스쿠알렌 추출을 위한 최적화된 조건의 구체화한 것은 없다.

J.Benemann & W.Oswald의, 승인번호 No. DE-FG22-93PC93204에 따라, Pittsburgh Energy Technology Center를 위해 제작된 보고서인 "Systems and Economic Analysis of Microalgae Ponds for Conversion of CO2 to Biomass"라는 제목의 그들의 1996년 소논문에서, 생물체량을 농축하기 위해서뿐만 아니라 동시에 오일 상 조류로부터 지질을 추출하기 위해서도 원심분리가 사용될 수 있음을 교시한다.

이러한 분리는 물, 조류의 지질 및 생물체량의 다른 구성성분들 사이의 상대적으로 큰 밀도 차에 기반한 것이다.

Oswald & Benneman은 이를 특히 고온 오일 추출 방법에 의해, 응집된 조류 생물체량으로부터 베타-카로틴을 추출하기 위한 방법의 맥락에서 기술하였다.

따라서, 수확 및 처리 단계는 보통의 응집 및 원심분리 단계와 중첩된다.

특허 EP 1 252 324는 세포간 지질을 내보내기 위한 습중 미생물 생물체량의 파괴, 무거운 층 및 가벼운 층을 포함하는 "상-분리 혼합물"을 생성하기 위한 방법에 의한 세포 용해물의 처리, 지질-함유의 가벼운 층으로부터 무거운 층의 비중 분리, 및 이후 지질을 수득하기 위해 상기 가벼운 상 내의 물/지질 에멀젼을 깨뜨리는 것을 보고하고 있다.

에멀젼 상태가 순수한 지질의 회수를 방지하는 것을 주목하는 것이 중요하다. 그러므로 지질이 "실질적으로" 비-에멀젼화될 때까지 물, 알코올 및/또는 아세톤일 수 있는 세척 용액으로 에멀젼을 세척하는 방법을 사용하는 것이 필요하다. 그러나 5%를 초과하는 비극성 유기 용매는 사용하지 않을 것이 권장된다.

또한 에멀젼의 오일/물 계면은 세포 찌꺼기에 의해 안정화되는 것으로 이해된다. 이는, 열(적어도 50℃) 또는 알칼리 처리가 단백질을 변성시키고 유기 물질을 가용화시키기 때문에, 세포-파괴 단계 이전 또는 세포-파괴 단계 동안 발효 배지 가열, 또는 세포-파괴 단계 동안 발효 배지에 염기의 첨가가 에멀젼 형성을 낮추는 데 기여하는 것에 대한 이유가 된다.

이러한 방법은 모든 유형의 지질(인지질; 유리 지방산; 지방산 트리글리세라이드를 포함하는 지방산 에스테르; 스테롤; 색소(예컨대, 카르테노이드 및 옥시-카르테노이드), 및 다른 지방산 및 피토스테롤, 지질-관련 화합물(예컨대, 에르고티오닌, 리포익산 및, 베타-카로틴, 토코트리에놀 및 토코페롤을 포함하는 항산화제))의 추출을 허용하는 것으로 알려진다.

이 때, 바람직한 지질 및 지질-관련 화합물은 콜레스테롤; 피토스테롤; 데스모스테롤; 토코트리에놀; 토코페롤; 유비퀴논; 베타-카로틴, 루테인, 라이코펜, 아스타잔틴, 제아잔틴, 칸타잔틴과 같은 카르테노이드 및 잔토필; 및 복합 리놀레산과 같은 지방산; 및 에이코사펜타에노산, 도코사펜타에노산, 도코사헥사에노산, 아라키돈산, 스테아리돈산, 디호모-감마-리놀레산 및 감마-리놀레산과 같은 오메가-3 및 오메가-6형의 다가 불포화 지방산이다.

스쿠알렌은 이와 같이 구상되지는 않으며, 원심분리를 명확하게 수행하기 위한 임의의 특정한 세포 용해 방법 또는 조건도 제공되지 않았다.

특허 EP 1 305 440에서는, 모르티엘라 알피나(Mortierella alpina)에 의해 생성된 아라키돈산 추출에 특히 전념하고 있다.

종래 기술에 기술된 것보다 더 효과적인 스쿠알렌 추출 방법을 개발하는 것과 관련하여, 본 출원 회사는 트라우스토키트리알레스 종 과의 미세조류의 발효 배지로부터 유기 용매 없이 이러한 화합물을 추출하기 위한 조건의 최적화에 대한 자체적인 연구를 진전시켜 왔다.

따라서, 본 발명은 트라우스토키트리알레스 종 과(Thraustochytriales sp. family)에 속하는 미세조류를 발효시켜 생성된 스쿠알렌을 유기 용매 없이 추출하기 위한 방법에 관한 것으로, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:

1) 세포간 가용성 물질의 농도를 낮춰서 발효 배지의 총 건조 중량에 대한 생물체량의 건조중량으로 표현되는 순도가 30 내지 99% 사이, 바람직하게는 95% 초과를 달성하도록 트라우스토키트리알레스 목에 속하는 미세조류의 생물체량을 준비하는 단계,

2) 효소 처리에 의해 생성되는 에멀젼 형성을 방지하면서 상기 미세조류의 세포벽을 깨뜨리기 위해 중성 또는 염기성 프로테아제의 군으로부터 선택된 프로테아제 효소, 예를 들어, 알칼라아제를 사용하여, 결과적인 생물체량을 처리하는 단계,

3) 수상(aqueous phase)으로부터 오일을 분리하기 위해, 결과적인 반응 혼합물을 원심분리하는 단계, 및

4) 이렇게 생성된, 스쿠알렌이 풍부한 미가공 오일을 회수하는 단계.

본 발명에 따른 방법의 제1 단계는 세포간 가용성 물질의 농도를 낮추고 발효 배지의 총 건조 중량에 대한 생물체량의 건조중량으로 표현되는 순도가 30 내지 99% 사이, 바람직하게는 95% 초과를 달성하도록 트라우스토키트리알레스 목(Thraustochytriales family)에 속하는 미세조류의 생물체량을 준비하는 단계에 있다.

본 발명의 목적을 위해, "세포간 가용성 물질"이란 용어는 발효 배지의 모든 가용성 유기 오염물, 예컨대, 염, 잔류 글루코즈, 단백질 및 펩타이드 등과 같은 수용성 화합물을 의미하도록 의도된다.

트라우스토키트리알레스 목에 속하는 미세조류로서, 하기의 상업적으로 이용가능한 균주가 시험되었다.

- ATCC 20888로 지칭되는, 시조카이트리움 속(Schizochytrium sp.),

- ATCC PRA 276으로 지칭되는, 오란티오키트리움 속Aurantiochytrium sp .).

더욱이, 본 출원 회사는 2011년 4월 14일에 제CNCM I-4469호에 따라 프랑스의 파스퇴르 연구소의 국립 미생물 배양물 은행(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)에 기탁되고, 제M 209118호에 따라 중국의 우한 대학교(Wuhan 430072, P.R. China) 중국 전형 배양물 보관센터(CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION)에도 기탁된 자체 생산 균주인 시조카이트리움 속 역시 가지고 있다.

배양은 타가 영양 조건 하에서 수행되었다. 일반적으로 배양 단계는 균주를 소생시키기 위한 전배양 단계, 및 이후의 그 자체의 배양 또는 발효 단계를 포함한다. 후자의 단계는 관심 있는 지질 화합물들을 생성하는 단계에 해당된다.

미세조류를 배양하기 위한 조건들은 당 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, New Biotechnology, 2010, 27 4, pp 382 389의 G. Chen에 의한 소논문은 하기의 연속적인 단계를 포함하는 방법을 기술한다:

- 글루코즈, 글루탐산 일나트륨, 효모 추출물 및 다양한 미량 요소들을 포함하는 한천 영양 배지 상에 유지되는 균주로부터 시작한다,

- 소생된 생물체량을 수득하기 위해, 25℃의 온도, pH 6에서, 회전식 진탕기(orbital shaker)상의 엘렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask) 내에서 전배양을 준비한다,

- 전배양에서 사용된 것과 동일한 배양 배지를 가지는 또 다른 일련의 엘렌마이어플라스크 생산물에 이전 단계에서 수득한 생물체량을 대략 0.5% (v/v)로 접종하고 온도를 25℃로 유지한다.

전배양은 바람직하게는 24 내지 74시간, 바람직하게는 대략 48시간 지속될 수 있다. 배양은, 배양 부분에 대해서, 바람직하게는 60 내지 150 시간 지속될 수 있다.

미세 조류의 생장에 요구되는 탄소의 공급원은 바람직하게는 글루코즈이다.

질소 공급원의 본질에 관하여서는, 본 출원 회사는 효모 추출물, 요소, 글루탐산 나트륨 및 황산 암모늄으로 이루어진 군으로부터 단독으로 또는 조합으로 취하여 질소 공급원을 선택하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 마찬가지로, 전체적으로 또는 부분적으로 요소를 글루탐산 나트륨으로 교체하거나 또는 글루탐산 나트륨 및 황산 암모늄의 혼합물을 사용하는 것이 가능하다.

종래 기술의 방법들에서 통상적으로 사용되던 효모 추출물, 5㎖/ℓ의 비율로 사용된, Sigma사에 의해 판매되는 BME 칵테일과 같은 비타민 칵테일로 보충된 요소가 바람직할 수 있다.

바람직하게는, 전배양 배지는 비타민B1, B6 및 B12를 포함한다.

배양 배지의 pH에 관하여서는, 이하에서 예시될 바와 같이, 5.5와 6.5 사이로 유지될 것이며 바람직하게는 6의 값으로 고정된다. pH는 당업자에게 알려진 임의의 수단, 예를 들어, 2 N의 황산과 그 후, 8 N 수산화 나트륨 첨가에 의해 조절될 수 있다.

마지막으로, 용해된 산소의 함량은 20%와 0% 사이의 값으로 조절될 수 있으며, 0%가 되기 전, 24와 48 시간 사이의, 바람직하게는 36 시간인 초기 기간 동안 바람직하게는 5%로 유지될 수 있다. 산소 전달에 관해서는, 또한 45mmol/ℓ/hour를 넘지 않도록, 당업자에게 알려진 임의의 수단에 의해 조절될 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, 발효기로부터 추출된 생물체량은 발효 배지 총 건조 중량에 대한 생물체량의 건조 중량으로 표현되는, 95%를 초과하는 순도를 달성하도록 당업자에게 알려진 임의의 수단으로 처리된다.

유리하게는, 본 출원 회사는, 이후에 예시될 바와 같이, 세포 간 가용성 물질을 (원심분리에 의한) 연쇄 농축/생물체량의 희석을 거쳐 세척하는 것을 권장한다.

그 후, 이와 같이 세포 간 가용성 물질이 정제된 생물체량은 탈염수 또는 정제수, 바람직하게는 정제수로, 우선적으로 6% 내지 12% 사이의 건조 물질 함량으로, 바람직하게는 10% 내지 12% 사이의 건조 물질 함량으로 조정된다.

본 발명에 따른 방법의 제2 단계는 효소 처리에 의해 생성되는 에멀젼 형성을 방지하면서 상기 미세조류의 세포벽을 깨뜨리기 위해 중성 또는 염기성 프로테아제의 군으로부터 선택된 프로테아제 효소, 예를 들어, 알칼라아제를 사용하여, 결과적인 생물체량을 처리하는 단계에 있다.

세포벽의 효소 용해 단계의 준비로서, 용해 효소의 작용을 촉진하는 균일한 혼합을 가능하게 하면서 효소 처리에 의해 일어날 수 있는 세포 용해물의 에멀젼화를 제한하도록, 12% 건조 물질 함량을 가지는 생물체량이 프로펠러 교반기 (낮은 전단) 및 (생성된 소용돌이 효과를 파괴하기 위한) 배플을 구비한 반응기 안에 넣어진다.

온도는 50℃를 초과하는 온도, 바람직하게는 대략 60℃의 온도로 조정되며 pH는 7 초과, 바람직하게는 대략 8로 조절된다. 본 출원에서, "대략"이라는 용어는 언급된 값의 ±10%, 바람직하게는 언급된 값의 ±5%를 가리키는 값을 의미한다. 물론, 정확한 값은 포함된다. 예를 들어, 대략 100은 90과 110 사이, 바람직하게는 95와 105사이를 의미한다.

이러한 조건은 건조중량으로 0.4% 및 1% 사이, 바람직하게는 건조 중량으로 1%의 농도로 사용되는 알칼라아제 효소 (예를 들어, Nobozymes사에 의해 판매되는 것)의 활성에 최적이다.

용해의 지속시간은 2 및 8시간 사이, 바람직하게는 4시간이다.

용해의 종료 단계에서, 본 출원 회사는 5%(v/v)를 초과하는, 바람직하게는 대략 10%(v/v)의 에탄올을 반응 혼합물 (유중수 에멀젼 형태)에 첨가하고 여기에 추가 15분간 교반하는 것을 권장한다.

에탄올은 에멀젼-불안정화제로서 적은 비율로 계에 첨가된다.

본 발명에 따른 방법의 제3 단계는 수상으로부터 오일을 분리하기 위해, 결과적인 반응 혼합물을 원심분리하는 단계에 있다.

이전 단계의 종료시 수득된, 에탄올로 불안정화된 에멀젼은 원심분리된다.

세 개의 상이 수득된다:

- 가벼운 상부의 상(오일),

- 주로 수용성인 중간 상(물 + 수용성 물질), 및

- 하부의 상(세포 찌꺼기 펠렛).

3개의 상의 분리는 수상 및 세포 찌꺼기로부터 추출된 가벼운 상부의 상(오일)의 회수를 가능하게 하는, Alfa Laval 사에 의해 판매되는 Clara 20과 같은 3-산출 분리 장치의 농축모드에서 수행된다.

수상은, 그 부분에 대해서, 분리기의 무거운 상의 산출을 통하여 추출된다. 고상은 자가-세척을 통하여 추출된다.

본 발명에 따른 방법의 2단계 종료 시 수득된 세포 용해물은, 70 내지 90℃ 사이, 특히 70 내지 80℃ 사이, 그리고 바람직하게는 80℃의 온도까지 가열될 수 있으며, 그 후 (여기서, 에멀젼화를 더 제한하기 위해) 양변위 펌프를 사용하여 공급된다. 바람직하게는, 세포 용해물의 pH는 8 내지 12 사이의 값, 바람직하게는 10의 값이 될 수 있다.

원심력은 4000g 초과, 바람직하게는 6000 내지 10000g 사이이다.

에멀젼화되지 않은 가벼운 상은 바람직하게는 단일 경로로 수득된다.

본 발명에 따른 방법의 제4 단계는 최종적으로 스쿠알렌이 풍부한 상부의 오일 상을 회수하는 데에 있다.

본 발명은 예시적이고 비제한적으로 의도된 이하의 실시예에 의해 더욱 명확하게 이해될 것이다.

실시예 1

본원에서, 미세조류의 발효는 본배양/생산 단계 전, 두 개의 연속적인 전배양 단계로 수행되었다.

본 실험에서, 제1 전배양 배지에 비타민들이 첨가되었으나, 비타민들의 제2 전배양 배지 및 생산에의 첨가는 선택적이었다.

따라서, 전배양 배지는 하기 표 1 및 표 2에 주어진 조성을 가진다:

제1 전배양 배지	%
글루코즈	3
효모 추출물	0.4
글루탐산의 나트륨 염	6.42
NaCl	1.25
MgSO₄	0.4
KCl	0.05
CaCl₂	0.01
NaHCO₃	0.05
KH₂PO₄	0.4
비타민 혼합물	0.14
미량 원소들	0.8

제2 전배양 배지	%
글루코즈	8.57
글루탐산의 나트륨 염	6.42
효모 추출물	0.64
NaCl	2
KH₂PO₄	0.64
MgSO₄	2.29
CaCl₂	0.03
NaHCO₃	0.03
Na₂SO₄	0.03
비타민 혼합물	0.14
미량 원소들	0.2

일반적으로, clerol FBA3107 소포제는 1㎖/ℓ로 사용되었다. 선택적으로, 오염성 박테리아의 생장을 방지하기 위해, 50㎎/ℓ의 페니실린 G 나트륨 염이 사용되었다. 글루코즈는 KH₂PO₄를 이용하여, 침전물(마그네슘-암모늄-포스페이트)의 형성을 피하기 위해 나머지 배지로부터 분리되도록 멸균되었다. 멸균 여과 후 비타민 혼합물 및 미량의 원소들이 첨가되었다. 배양/생산 배지의 조성은 하기 표 3에 주어진다.

	%
T0에서 글루코즈 첨가	7.5
요소	1
효모 추출물	1.2
NaCl	0.25
KH₂PO₄	0.96
MgSO₄	1.2
CaCl₂	0.12
NaHCO₃	0.12
KCl	0.08
비타민 혼합물 첨가	0.4
미량 원소들	0.56

비타민 혼합물 및 미량의 원소들의 조성은 하기 표 4 및 표 5에 주어진다:

비타민 혼합물	g/ℓ
B1	45
B6	45
B12	0.25

미량 원소들	g/ℓ
MnCl₂.2H₂O	8.60
CoCl2.6H₂O	0.2
NiSO₄.6H₂O	7.50
Na₂MoO₄.2H₂O	0.15
ZnSO₄.7H₂O	5.70
CuSO₄.5H₂O	6.50
FeSO₄.7H₂O	32.00
ZnCl₂	1.50

발효의 수행

제1 전배양은 Cognis Dueseldorf사에 의해 판매되는 clerol FBA 3107 소포제 한 방울이 첨가된 500㎖ 배플형 엘렌마이어 플라스크에서 수행되었다.

배양배지는 선택적으로 0.25㎎/ℓ의 비율로 페니실린 G 나트륨 염이 보충된 배지의 구성성분들이 완전히 용해된 후에 여과되었다.

접종은 페트리 접시에 배양된 미세조류의 군집을 (백금이 하나 당 10 ㎕의 비율로) 취함으로써 수행되었다.

인큐베이션은 28℃의 온도에서 (회전식 진탕기 상에서) 100rpm으로 진탕하면서 24 내지 36 시간 지속되었다.

생물체량이 가라 앉기 때문에 (또는 벽에 부착되기 때문에), 엘렌마이어 플라스크를 잘 진탕한 후 3 내지 5㎖의 시료를 취하는 데 주의하였다.

제2 전배양에서, 관이 장착된 2ℓ의 배플형 엘렌마이어 플라스크가 사용되었다.

한 방울의 소포제 및 효모 추출물이 100㎖의 물에 첨가되었다.

배지의 모든 구성성분들이 300㎖의 탈염수에 용해된 후 여과되었다. 선택적으로 페니실린 G 나트륨 염 첨가 및 엘렌마이어 플라스크에 앞서 그의 멸균 전에 한 방울의 소포제 첨가가 가능하였다.

그 후, 접종은 3 내지 5㎖의 제1 전배양물로 수행되었다.

인큐베이션은 28℃에서 100rpm으로 진탕하며 추가의 24 내지 36 시간동안 수행되었다.

본배양은 20ℓ의 반응기에서 하기의 방식으로 수행되었다:

- 침전물 형성을 방지하기 위해, 반응기 안의 배지의 일 부분 멸균 및 다른 부분의 멸균을 별도로,

- 배양 배지에 대해 0.5% v/v 비율로, 제2 전배양 종료 시 생성된 생물체량을 이용하여 수행된 접종,

- 30℃로 유지된 배양,

- 35~40 m㏖/ℓ/h로 고정된 산소 전달 속도,

- 0.2 내지 0.3 VVM의 통기,

- 5.5 초과의 초기 pH

- 글루코즈 농도가 15와 70g/ℓ 사이를 유지하도록, 농도가 20% 초과하자마자 글루코즈의 공급.

하기 표 6은 본 출원회사의 시조카이트리움 속으로 얻어진 결과를 제공한다.

시험	E
전배양 온도(℃)	28
배양 온도(℃)	30
배양 종료시 스쿠알렌 적정량 (g/l)	4.4
생물체량 (g/l)	54
건조 생물체량에 대한 스쿠알렌(g/100g)	8.2

시조카이트리움 속 생물체량에서 스쿠알렌을 정량하기 위한 방법

분석은 생물체량의 비드 파괴 및 클로로포름/메탄올을 이용한 저온추출 후 25℃에서 양성자 NMR로 수행되었다. 정량은 하기에 기술된 바와 같은 내부 표준에 의해 수행되었다.

스펙트럼은 400MHz로 작동된 Avance III 400 분광기(Bruker Spectrospin)상에서 얻어졌다.

생물체량의 파괴: 대략 200mg의 신선한 생물체량을 정확하게 무게를 칭량한다. 대략 1~1.5cm의 유리 비드 및 0.1㎖의 메탄올을 첨가한다. 관을 밀봉하고 볼텍스(vortex) 믹서로 적어도 5분 간 교반한다.

저온 추출: 대략 2㎎의 트리페닐 포스페이트(TPP), 0.9㎖의 메탄올 및 2㎖의 클로로포름을 첨가한다. 관을 밀봉하고 볼텍스 믹서로 1분 간 교반한다. 냉장고에 넣는다. 정착시킨 후(최소 1시간), 조심스럽게 맑은 상부의 상을 회수하고, 상온에서 질소 스트림하에 건조되도록 증발시키기 위해 상부의 상을 초자로 옮긴다. 건조된 추출물을 0.5㎖의 CDCl₃ 및 0.1㎖의 CD₃OD에 용해시키고 NMR 관으로 옮긴다.

스펙트럼 기록: 기기에 적절한 설정을 적용한 후, 용매 억제 및 회전 없이 적어도 15초의 완화시간을 가지고 획득을 수행한다. 스펙트럼 창은 7.25ppm의 클로로포름 피크로 보정된 스펙트럼으로 적어도 -1 내지 9ppm 사이가 되어야 한다. 수동 모드에서 퓨리에 변환, 상 보정, 베이스라인 공제 후, 스펙트럼이 사용되었다(지수 곱셈 없이, LB=GB=0).

신호의 활용: 100의 값을 (9 TPP 양성자에서 카운팅 시) 7.05 내지 7.15ppm 사이인 클로로포름의 신호를 함유하지 않는 미해결 TPP 피크에 할당한다. 1.55ppm의 스쿠알렌 신호 면적을 통합한다(6개의 양성자에서 단일항을 카운팅).

결과의 계산 및 표현: 결과는 가공하지 않은 무게 백분율로 표현된다.

여기서,

A_s: 1.55ppm에서 스쿠알렌 신호의 면적

P_TPP: 통합된 미해결 TPP 피크의 양성자 수: 9

W_TPP: 칭량된 TPP의 g무게

M_TPP: TPP의 g/mol인 몰질량(M_TPP=326g/mol)

M_S: 스쿠알렌의 g/mol인 몰질량(M_S=410g/mol)

PE: 신선한 생물체량의 g무게

실시예 2: 본 발명에 따른 스쿠알렌의 추출

실시예 1의 종료 시 수득된 생물체량은 발효 종료 시 54g/ℓ의 농도였다.

발효 종료시 수득된 스쿠알렌의 적정량은 4.4g/ℓ였다.

발효기로부터 추출된 생물체량은 원심분리(5000g로 5분) 및 생물체량의 희석(1/3(펠렛 부피/물 부피)의 비율로)에 의한 연속적인 2개의 일련의 농축을 거쳐 세포 간 가용성 물질을 제거하기 위해 세척된다.

총 미가공 건조 물질 함량에 대한 건조 세포 농도는 95%이다.

그 후, 건조 물질 함량은 증류수를 이용하여 12%로 조정된다.

세척된 생물체량은 (Interscience 사에 의해 판매되는 것과 같은) 프로펠러 교반기 및 배플이 구비된 2 ℓ 발효기 유형의 라보 반응기에서 교반된다.

이러한 시스템은 용해 효소의 작용에 필수적인 양호한 혼합을 허용하면서 생성된 세포 용해물의 에멀젼화를 제한하는 것을 가능하게 한다.

온도는 60℃로 조정되며 pH는 수산화 나트륨을 이용하여 대략 8로 조절된다.

이러한 조건은 건조중량으로1%의 양으로 첨가된 알칼라아제 효소(Nobozymes)의 활성에 최적이다.

용해의 지속시간은 4시간으로 설정된다.

용해 종료 시, 추가의 15분 간 교반을 계속하면서 10%의 에탄올(V_에탄올/V_용해물)이 반응 혼합물(유중수 에멀젼)에 첨가된다.

온도를 다시 80℃까지 증가시키고 이어서 3-산출 농축기 모드로 구성된 Alfa Laval Clara 20 원심분리 모듈 상에서 원심분리가 수행된다.

원심분리는 특히 고체/액체/액체 유형의 3상 혼합물을 분리하는데 매우 적합하다.

9600rpm의 회전으로 대략 10000g에 도달할 수 있다.

세포 용해물은 양변위 펌프를 사용하여 100 내지 400ℓ/h의 유속으로 공급된다.

무거운 상과 가벼운 상 사이의 계면은 무거운 상의 산출 배압을 조정함으로써 이동된다.

자가-세척 빈도는 2 내지 15분의 빈도로 조정된다.

이와같이, 미가공 오일은 85%를 초과하는 수율로 회수되었고 사실상 생성된 모든 스쿠알렌을 함유한다.

실시예 3: 핵산을 이용한 종래 방법에 의한 스쿠알렌 추출의 비교 실시예

실시예 2에 기술된 바와 같음:

- 실시예 1 종료 시 수득된 생물체량은 발효 종료 시 54g/ℓ의 농도였다.

- 발효 종료시 수득된 스쿠알렌의 적정량은 4.4g/ℓ였다.

발효기로부터 추출된 생물체량도 역시 원심분리에 의해 120g/ℓ으로 농축된다.

생물체량은 50ℓ 탱크에서 150rpm으로 교반을 계속하였고, 60℃까지 가열된다.

그 후, pH는 45% 수산화칼륨을 사용하여 10으로 조정되었다.

이러한 조건은 완전한 알칼리 용해를 달성하기 위해 6시간 동안 유지되었다.

용해의 질은 광학 현미경 하에서, 그리고 시료의 원심분리(2분, 10000g)에 의해 모니터링 되었다.

용해 종료시, 10 리터의 에탄올(1 에탄올 부피/용해물 부피)이 탱크에 첨가되었고 45℃로 유지되며 10분간 교반되었다. 그 후, 10 리터의 헥산이 30분간 교반을 계속하면서 탱크에 첨가되었다.

그 후, 혼합물은 가벼운 분획물(헥산+오일)을 분리하기 위해 원심분리되었고 가벼운 분획물은 1m³ 탱크에 저장되었다.

무거운 상(수상)은 다시 10 리터의 헥산 존재하에 넣어져, 추출 수율을 증가시키기 위해 이전과 동일한 계획에 따라 2차 추출물을 형성하였다.

두 개의 유기 분획은 회전형 증발기에서 헥산의 증발을 수행하기 위해 결합되었다.

추출된 오일의 헥산 잔류물은 닦아낸 필름 증발기(80℃; 1mbar)를 사용하여 증발시킴으로써 제거되었다.

이와 같이, 미가공 오일은 70%의 수율로 회수되었다.

따라서, "종래의" 추출 방법은 본 발명에 따른 방법보다 훨씬 덜 효율적이다.

국립 미생물 배양 수집소

CNCMI-4469

20110414

중국 국립균배양 수집소

CCTCCM209118

20090610

Claims

트라우스토키트리알레스 종 과(Thraustochytriales sp. family)에 속하는 미세조류를 발효시켜 생성된 스쿠알렌을 유기 용매 없이 추출하기 위한 방법으로서,
1) 세포간 가용성 물질의 농도를 낮춰서 발효 배지의 총 건조 중량에 대한 생물체량의 건조 중량으로 표현되는 순도가 30 내지 99% 사이, 또는 95% 초과 내지 99 %를 달성하도록 트라우스토키트리알레스 종 과에 속하는 미세조류의 생물체량을 준비하는 단계;
2) 효소 처리에 의해 생성되는 에멀젼 형성을 방지하면서, 상기 미세조류의 세포벽을 깨뜨리기 위해 중성 또는 염기성 프로테아제들의 군으로부터 선택된 프로테아제 효소, 또는 알칼라아제를 사용하여, 상기 생성된 생물체량을 처리하는 단계;
3) 수상으로부터 오일을 분리하기 위해 상기 생성된 반응 혼합물을 원심분리하는 단계; 및
4) 이렇게 생성된 스쿠알렌이 풍부한 미가공 오일을 회수하는 단계
를 포함하고,
여기서 트라우스토키트리알레스 종 과에 속하는 미세조류가 시조카이트리움 속(Schizochytrium sp.), 오란티오키트리움 속(Aurantiochytrium sp.) 및 트라우스토키트리움 속(Thraustochytrium sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하며, 상기 유기 용매는 에탄올을 제외하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
단계 1)에서 정제된 생물체량은 그 후 6% 내지 12% 사이의 건조 물질 함량으로, 또는 10% 내지 12% 사이의 건조 물질 함량으로 조정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
단계 2)의 효소 처리는, 프로펠러 교반기와 배플을 구비한 장치에서 비-전단, 에멀젼화용 약한 교반으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
단계 2)의 효소 처리는 50℃ 초과, 또는 대략 60℃의 온도 및 pH가 7 초과, 또는 대략 8에서 수행되는 것을 특징으로 하며, 여기서 "대략"은 언급된 값의 ±10%를 가리키는 값을 의미하는 것인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
효소 처리의 종료 시 5%(v/v) 초과, 또는 대략 10%(v/v)로 에탄올을 첨가하는 것을 특징으로 하며, 여기서 "대략"은 언급된 값의 ±10%를 가리키는 값을 의미하는 것인, 방법.
제5항에 있어서,
에탄올 처리는 10분 초과, 또는 15분 간 교반하면서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
원심 분리 전, 반응 혼합물의 온도는 70 내지 90℃ 사이, 또는 80℃이고, 반응 혼합물의 pH는 8 내지 12 사이의 값, 또는 10값이 될 수 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
원심 분리는 수상 및 세포 찌꺼기로부터 추출된 가벼운 상부의 상(오일)의 회수를 가능하게 하는 농축기 모드의 3-산출 분리기(3-output separator)에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제8항에 있어서,
원심 분리는 4000g 초과, 또는 6000 및 10000g 사이, 또는 대략 10000g의 원심력으로 수행되는 것을 특징으로 하며, 여기서 "대략"은 언급된 값의 ±10%를 가리키는 값을 의미하는 것인, 방법.