KR101794638B1

KR101794638B1 - Ｂａｘ- 및 ｂａｋ-결함 세포주들의 제조 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR101794638B1
Application number: KR1020117000526A
Authority: KR
Inventors: 트레버 콜링우드; 필립 디. 그레고리
Original assignee: 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date: 2008-06-10
Filing date: 2009-06-10
Publication date: 2017-12-04
Anticipated expiration: 2029-06-10
Also published as: KR101802393B1; IL209716A0; AU2009258117A1; EP2294191A2; IL209716A; HK1153233A1; KR20160113321A; CA2893175A1; KR20110026474A; EP2910568B1; IL224959A; US20100003756A1; EP2294191B1; EP2910568A2; EP2910568A3; EP2294191A4; US8597912B2; WO2009151591A3; WO2009151591A2; CA2893175C

Abstract

조작된 뉴클레아제를 이용하여 Bak- 및/또는 Bax-결함 세포주들 만들기 위한 방법들 및 조성물을 개시한다.

Description

ＢＡＸ- 및 ＢＡＫ-결함 세포주들의 제조 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR GENERATION OF BAX- AND BAK-DEFICIENT CELL LINES}

본 내용은 Bax 및/또는 Bak의 발현에 결함이 있는 세포주의 게놈 조작 및 생성뿐만 아니라 단백질(예, 항체, 항원 등), 바이러스 및/또는 바이러스 벡터의 생산에 Bax/Bak 결함 세포주의 용도 분야에 관한 것이다.

세포자멸(Apoptosis), 또는 예정된 세포 죽음은 외인성 또는 내인성 신호들뿐만 아니라 발생학적 신호들에 의해 촉발될 수 있다. 주요 두 가지 세포자멸성 경로가 확인되었다: 외인성 세포 죽음 경로에서 세포자멸은 세포상에서 발현되는 세포 표면 수용체들에 리간드의 결합을 통하여 개시되어, 결국 세포가 죽게 되며, 내인성 세포 죽음 경로에서 세포자멸은 세포 내에서 시작된다.

외인성 죽음 경로에 관련된 수용체들 중 가장 특징이 잘 알려진 것들이 종양 괴사 인자 수용체 패밀리 요소들이다. 리간드 연계시, 이들 수용체들은 죽음 유도 신호발생 복합체의 형성을 시작하고, 이 복합체는 필수적인 어뎁터(adaptor) 분자 FADD를 포함한다. 이번에는 FADD가 카스파제(Caspase) 8을 수거하고, 다시 카스파제 8은 자가단백질분해성 공정을 통하여 활성화된다. 일단 활성화되면, 카스파제 8은 카스파제 9 및 카스파제 3와 같은 추가 카스파제들을 활성화시키고, 세포 내 기질들의 분해를 개시하여, 결국 세포가 죽음에 이르게 된다. TNF 수용체 패밀리는 TNFR1; Fas; DR3 단백질들 가령, Apo3, WSL-1, TRAMP, 및 LARD; DR4; DR5 단백질들 가령 TRAIL-R2, TRICK2, 및 KILLER; 및 DR6를 포함한다.

Bcl-2 패밀리 단백질들의 요소들은 세포 죽음을 조절하는 능력으로 특징화된다. Bcl-2 및 이의 일부 상동체들, 가령 Bcl-x1는 세포자멸을 억제하지만, 반면 다른 패밀리 요소들, 가령, Bax 및 Bak는 일정 조건들하에서 세포자멸을 유도하거나 가속화시킨다. Bak 및 Bax뿐만 아니라 Bcl-xs, Bid, Bim, Bad 및 Bik는 Bcl-2 단백질들의 전(pro)-세포자멸군을 구성한다.

Bax 단백질은 Bcl-2와 매우 보존된 도메인들을 공유하는데, 도메인들중 일부는 Bax/Bcl-2 헤테로다이머들의 형성에 필요하며, 이것은 세포자멸 시그날들에 대한 생존 및 죽음 반응에 중요한 것으로 생각된다. 활성화후, Bax는 외측 미토콘드리아 막으로 전위되고, 여기서 올리고머를 형성하여, 막을 투과성으로 만들고, 사이토크롬 C를 포함하는 몇 가지 죽음 촉진 인자들을 방출한다(Scorrano et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 304:437-444). Bax는 미토콘드리아로부터 Bax를 분리시키는 Ku70 단백질과의 상호작용을 통하여 정상 세포에서 비활성인 형태로 제공될 수 있다(Sawada et al. (2003) Nat. Cell Biol. 5:320-329).

Bak는 또한 세포 죽음을 촉진시키고, Bcl-2에 의해 제공되는 세포자멸로부터 보호를 방해한다. Bax와 같이, Bak 유전자 산물은 적합한 자극후에 세포자멸성 세포 죽음을 주로 강화시킨다. Bak는 다양한 세포 타입들에서 세포자멸의 강력한 유도물질이다.

안티센스 분자들의 도입에 의해 Bax 및/또는 Bak의 발현이 감소되는 세포주들이 설명되어왔다. 예, Mandic et al. (2001) Mol. Cell Biol. 21:3684-3691 참고. 또한, Bax 및/또는 Bak 결함 섬유아세포들을 불사화시켜 세포주를 만들었다. U.S. 특허 출원 No. 20030091982 참고. 더욱이, Bax 및/또는 Bak의 비활성화를 위하여, 억제 도메인들에 융합된 자연 발생적 아연 핑거(finger) 단백질들(Grimes et al. (1996) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 93:14569-14573) 및 조작된(Engineered) 아연 핑거 단백질들 및 뉴클레아제들 (U.S. 특허 공개 No. 20060063231)이 설명되었다. 조작된 아연 핑거 뉴클레아제들은 또한 내생성 디하이드로폴레이트 환원효소 (dhfr) 및 CCR5 유전자들을 비활성화시키는데 이용되었다. 예, U.S. 특허 공개 No. 20080015164 및 PCT 공개 WO 2007/139982 참고.

그러나, 예를 들면, 세포자멸 저항성 세포주을 만들기 위하여, Bax 및 Bak 비활성화를 위한 방법 및 조성물이 여전히 요구된다.

개요

예를 들면, 다양한 내인성 죽음 자극에 저항성인 Bax 및/또는 Bak 결함 또는 녹아웃 세포주를 만들기 위하여, Bax 및/또는 Bak의 부분적인 또는 완전한 비활성화를 위한 방법들 및 조성물이 개시된다. 이들 세포주들은 재조합 단백질 (예, 항체, 항원, 치료 단백질) 생산에 유익하게 이용되는데, 그 이유는 통상의 세포주와 달리, Bax/Bak 결함 세포주는 많은 계대후에도 배양물에서 높은 수준의 단백질 생산을 계속하기 때문이다.

Bax/Bak 결함 세포주들은 또한 예를 들면, 재조합 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노연합 바이러스 (AVV) 벡터들의 생성에서 유전자 산물들을 발현시키는 바이러스 벡터의 생성에서 생산자 세포주들로 유용하다. 현재, 이들 바이러스 벡터의 발생에 이용되는 방법들은 시기부적절한 세포자멸을 통하여 불충분한 벡터 생산으로 이어지는 숙주세포(변형되지 않은 숙주세포들에서)에 상당히 중요하다. 따라서, 본 내용은 바이러스 벡터의 발생을 위하여 세포자멸 저항성 Bax/Bac 결함 세포주들의 필요성을 다룬다.

추가로, Bax 및/또는 Bak 결함 세포주들은 인간 인플루엔자 바이러스를 표적으로 하는 것과 같은 백신의 시험관내 생산에 유용하다. 이와 같은 백신 생산 세포들의 세포자멸은 (i) 전반적으로 감소된 생산량, 및 (ii) 또는 백신 로트(lot)의 기능부전 및 인간들에게 백신 로트를 사용할 수 없게 만드는 오염의 중요한 원인이 된다.

Bax 및/또는 Bak 결함 세포주들은 세포자멸이 연루된 암 및 기타 질환들 (예, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환 등)에 영향을 주는 물질들의 연구에도 유용하다. 마찬가지로, Bax 및/또는 Bak 결함 세포주들은 기초 연구 및 약물 발견에 유용한 도구들을 제공한다. 이와 같은 세포주들은 전기천공법(electroporation), 바이러스성 형질도입(viral transduction), 리포좀 매개된 전달 등과 같은 핵산 전달 과정들과 같은 특정 실험 조건들에 반응하여 및/또는 세포자멸성 반응 없이 이와 같은 상호작용들의 연구들 통하여 약물-표적 상호작용들과 기초 연구 이해를 측정할 수 있는 독물 또는 스트레스 유도된 패이로드(payload)의 전달에 반응하여 세포들의 증가된 생존을 제공한다.

하나의 측면에서, BAX 유전자 내에 결합되도록 조작된 아연 핑거 단백질들이 제공된다. 여기에서 설명되는 임의의 아연 핑거 단백질들은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 아연 핑거를 포함할 수 있으며, 각 아연 핑거는 BAX 유전자 내 표적 하위위치(subsite)에 결합되는 인식 헬릭스(helix)를 가진다. 특정 구체예들에서, 아연 핑거 단백질들은 4개의 핑거를 포함하는데(F1, F2, F3, F4 및 임의로 F5로 지정됨), 표 1에서 볼 수 있는 것과 같이 인식 헬릭스들의 아미노산 서열을 포함한다.

하나의 측면에서, BAK 유전자 내에 결합되도록 조작된 아연 핑거 단백질들이 제공된다. 여기에서 설명되는 임의의 아연 핑거 단백질들은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 아연 핑거를 포함할 수 있으며, 각 아연 핑거는 BAK 유전자 내 표적 하위위치(subsite)에 결합되는 인식 헬릭스(helix)를 가진다. 특정 구체예들에서, 아연 핑거 단백질들은 4개 또는 5개의 핑거를 포함하는데(F1, F2, F3, F4 및 F5로 지정됨), 표 2에서 볼 수 있는 것과 같이 인식 헬릭스들의 아미노산 서열을 포함한다.

특정 구체예에서, 조작된 아연 핑거 단백질 DNA 결합 도메인이 본 명세서에 제공되고, 상기 DNA 결합 도메인은 N-말단으로부터 C-말단까지 F1 내지 F4 순서의 4개의 아연 핑거 인식 부위를 포함하고, F1, F2, F3, 및 F4는 하기 아미노산 서열을 포함한다: F1: RSDHLST (서열식별번호:1); F2: DRSHLAR (서열식별번호:2); F3: QSSHLTR (서열식별번호:3); 및 F4: RSDNLRE (서열식별번호:4).

특정 구체예에서, 조작된 아연 핑거 단백질 DNA 결합 도메인이 본 명세서에 제공되고, 상기 DNA 결합 도메인은 N -말단으로부터 C-말단까지 F1 내지 F4 순서의 4개의 아연 핑거 인식 부위를 포함하고, F1, F2, F3, 및 F4는 하기 아미노산 서열을 포함한다: F1: RSANLSV (서열식별번호:5); F2: DRANLSR (서열식별번호:6); F3: NRTDLIR (서열식별번호:7); 및 F4: TSSNLSR (서열식별번호:8).

다른 구체예에서, 본 명세서는 조작된 아연 핑거 단백질 DNA 결합 도메인을 제공하고, 상기 DNA 결합 도메인은 N-말단으로부터 C-말단까지 F1 내지 F5 순서의 5개의 아연 핑거 인식 부위를 포함하고, F1, F2, F3, F4 및 F5는 하기 아미노산 서열을 포함한다: F1: RSDHLTT (서열식별번호:9); F2: RSDHLSE (서열식별번호:10); F3: RNDNRKT (서열식별번호:11); F4: QSGHLQR (서열식별번호:12); 및 F5 QSGHLSR (서열식별번호:13).

다른 구체예에서, 본 명세서는 조작된 아연 핑거 단백질 DNA 결합 도메인을 제공하고, 상기 DNA 결합 도메인은 N-말단으로부터 C-말단까지 F1 내지 F4 순서의 4개의 아연 핑거 인식 부위를 포함하고, F1, F2, F3, 및 F4는 하기 아미노산 서열을 포함한다: F1: RSDSLSA (서열식별번호:14); F2: DRSSRTK (서열식별번호:15); F3: RSDDLTR (서열식별번호:16); 및 F4: RSDALAR (서열식별번호:17).

다른 구체예에서, 본 명세서는 조작된 아연 핑거 단백질 DNA 결합 도메인을 제공하고, 상기 DNA 결합 도메인은 N-말단으로부터 C-말단까지 F1 내지 F5 순서의 4개의 아연 핑거 인식 부위를 포함하고, F1, F2, F3, F4 및 F5는 하기 아미노산 서열을 포함한다: F1: DRSDLSR (서열식별번호:45); F2: NRTDLIR (서열식별번호:7); F3: TSSNLSR (서열식별번호:8); F4: RSDTLSQ (서열식별번호:46); 및 F5: DRSARTR (서열식별번호:47).

다른 구체예에서, 본 명세서는 조작된 아연 핑거 단백질 DNA 결합 도메인을 제공하고, 상기 DNA 결합 도메인은 N-말단으로부터 C-말단까지 F1 내지 F5 순서의 4개의 아연 핑거 인식 부위를 포함하고, F1, F2, F3, F4 및 F5는 하기 아미노산 서열을 포함한다: F1: RSDALSV (서열식별번호:48); F2: DSSHRTR (서열식별번호:49); F3: QNAHRKT (서열식별번호:50); F4: RSDHLST (서열식별번호:1); 및 F5: TSGHLSR (서열식별번호:51).

다른 구체예에서, 본 명세서는 조작된 아연 핑거 단백질 DNA 결합 도메인을 제공하고, 상기 DNA 결합 도메인은 N-말단으로부터 C-말단까지 F1 내지 F5 순서의 4개의 아연 핑거 인식 부위를 포함하고, F1, F2, F3, F4 및 F5는 하기 아미노산 서열을 포함한다: F1: QNAHRKT (서열식별번호:50); F2: QSGDLTR (서열식별번호:53); F3: QSGDLTR (서열식별번호:53); F4: QSSNLAR (서열식별번호:54); 및 F5: TSSNRKT (서열식별번호:55).

다른 구체예에서, 본 명세서는 조작된 아연 핑거 단백질 DNA 결합 도메인을 제공하고, 상기 DNA 결합 도메인은 N-말단으로부터 C-말단까지 F1 내지 F6 순서의 4개의 아연 핑거 인식 부위를 포함하고, F1, F2, F3, F4 및 F5는 하기 아미노산 서열을 포함한다: F1: RSDNLAR (서열식별번호:57); F2: QSGDLTR (서열식별번호:53); F3: DNRQLIT (서열식별번호:58); F4: TSSNLSR (서열식별번호:8); F5: RSDTLSR (서열식별번호:59); 및 F6: RNDDRIT (서열식별번호:60).

다른 구체예에서, 본 명세서는 조작된 아연 핑거 단백질 DNA 결합 도메인을 제공하고, 상기 DNA 결합 도메인은 N-말단으로부터 C-말단까지 F1 내지 F5 순서의 4개의 아연 핑거 인식 부위를 포함하고, F1, F2, F3, F4 및 F5는 하기 아미노산 서열을 포함한다: F1: RSDNLTT (서열식별번호:62); F2: RSDHLSR (서열식별번호:63); F3: QSSDLRR (서열식별번호:64); F4: QSSHLTR (서열식별번호:3); 및 F5: RSDHLTQ (서열식별번호:65).

다른 구체예에서, 본 명세서는 조작된 아연 핑거 단백질 DNA 결합 도메인을 제공하고, 상기 DNA 결합 도메인은 N-말단으로부터 C-말단까지 F1 내지 F5 순서의 4개의 아연 핑거 인식 부위를 포함하고, F1, F2, F3, F4 및 F5는 하기 아미노산 서열을 포함한다: F1: QSGSLTR (서열식별번호:67); F2: TSSNRKT (서열식별번호:55); F3: DRSHLTR (서열식별번호:68); F4: RSDDRKT (서열식별번호:69); F5: NRTDLIR (서열식별번호:7) 및 F6: TSSNLSR (서열식별번호:8).

또 다른 측면에서, 여기에서 기재된 임의의 아연 핑거 단백질들과, 및 최소한 한 개의 절단 도메인 또는 최소한 한 개의 절단 하프-도메인을 포함하는 융합 단백질들 또한 제공된다. 특정 구체예들에서, 절단 하프-도메인은 야생형FokI 절단 하프-도메인이다. 다른 구체예들에서, 절단 하프-도메인은 조작된 FokI 절단 하프-도메인이다.

또 다른 측면에서, 여기에서 기재된 임의의 단백질들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드도 제공된다.

또 다른 측면에서, 여기에서 기재된 임의의 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 세포 역시 제공된다. 특정 구체예들에서, Bax 및/또는 Bak 가 비활성화된 세포주들은 Bax 및/또는 Bak 결함 세포주들을 만들기 위하여 여기에서 기재된 임의의 단백질들 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포들을 배양함으로써 만들어진다. 특정 구체예들에서, Bax 또는 Bak는 세포 또는 세포주에서 (부분적으로 또는 완전하게) 비활성화된다.

또한, 세포 또는 세포주에서 Bax 및/또는 Bak를 비활성화시키는 방법들에 있어서, 아연 핑거 단백질들 및 이의 융합체를 이용하는 방법들이 제공된다. 특정 구체예들에서, 세포에서 Bax 및/또는 Bak를 비활성화시키면 세포의 계대후 Bax 및/또는 Bak가 비활성화된 상태로 유지되는 세포주가 만들어지고, 따라서, 세포자멸에 저항성인 세포주가 만들어진다.

따라서, 또 다른 측면에서, 세포에서 세포성 BAX 및/또는 BAK 유전자 (예., 내생성 BAK/BAX 유전자(들))을 비활성화시키는 방법이 제공되는데, 이 방법은 (a) 제1 폴리펩타이드를 인코딩하는 제1 핵산을 세포 내로 도입시키는 것을 포함하고, 여기서 제1 폴리펩타이드는 (i) 내생성 BAK 및/또는 BAX 유전자 내의 제1 표적 위치에 결합하도록 조작된 아연 핑거 DNA 결합 도메인; 및 (ii) 절단 도메인을 포함하며; 상기 폴리펩타이드가 세포에서 발현됨으로써, 폴리펩타이드는 표적 위치에 결합하고, BAK 및/또는 BAX 유전자를 절단하게 된다. 특정 구체예들에서, 이 방법은 제2 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 도입시키는 것을 더 포함하며, 여기서 제2 폴리펩타이드는 (i) BAK 및/또는 BAX 유전자 내의 제2 표적 위치에 결합하도록 조작된 아연 핑거 DNA 결합 도메인; 및 (ii) 절단 도메인을 포함하고; 제2 폴리펩타이드는 세포 내에서 발현되어, 제1과 제2 폴리펩타이드는 이들의 각 표적 위치에 결합하고, BAK 및/또는 BAX 유전자를 절단하게 된다. 제1과 제2 폴리펩타이드들은 제1 핵산에 의해 또는 상이한 핵산들에 의해 인코딩될 수 있다. 특정 구체예들에서, 하나 이상의 추가 폴리뉴클레오티드들 또는 폴리펩타이드들이 세포 내로 도입되는데, 예를 들면, 추가적인 아연 핑거 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드들이 도입된다.

다른 측면에서, Bak 및/또는 Bax 발현에 결함(예, Bak 및/또는 Bax의 발현이 감소되거나 제거됨)이 있는 세포주를 만드는 방법도 제공된다. 특정 구체예들에서, 이 방법은 Bax 및/또는 Bak에 대해 결함이 있는 세포주를 만들기 위하여 하나 이상의 조작된 아연 핑거 뉴클레아제(또는 조작된 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산들)를 도입시키고, 연속하여 세포를 배양함으로써 Bak 및/또는 Bax의 부분적으로 또는 완전하게 비활성화를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 내용은 Bak 및/또는 Bax가 비활성화된 숙주세포 또는 세포주내에서 관심 단백질 또는 바이러스 또는 바이러스 벡터를 생산하는 방법을 제공한다. 특정 구체예들에서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 내생성 BAX 및/또는 BAK 유전자를 포함하는 숙주세포를 제공하는 단계; (b) 여기에서 기재된 임의의 방법들에 의해 숙주세포의 내생성 BAX 및/또는 BAK 유전자를 비활성화시키는 단계; 및 (c) 전이유전자를 포함하는 발현 벡터를 숙주세포 내로 도입시키는 단계, 전이유전자는 관심 단백질, 바이러스 또는 바이러스 벡터를 인코딩하는 서열을 포함하여, 관심 단백질, 바이러스 또는 바이러스 벡터가 생산된다. 다른 구체예들에서, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: Bak- 및/또는 Bax-결함 세포주를 제공하는 단계; 세포주내에서 재조합 단백질이 발현되는 조건들하에서 적어도 하나의 관심 재조합 단백질, 바이러스, 또는 바이러스 벡터를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포주에 도입시키는 단계. 관심의 재조합 단백질, 바이러스, 또는 바이러스 벡터를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 Bak- 및/또는 Bax-결함 세포주내로 안정적으로 /또는 일과적으로 도입될 수 있다. 여기에서 설명되는 임의의 방법들에서, 관심 단백질은 항체, 예를 들면, 단클론 항체를 포함한다. 다른 구체예들에서, 관심 단백질은 백신의 항원으로, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스로부터 유도된 HA 단백질로 유용한 단백질을 포함한다. 추가 구체예들에서, 이런 방법들은 완전한 바이러스 백신을 생산하는데 이용된다. 다른 구체예들에서, 재조합 바이러스 벡터는 상기 방법들에 의해 만들어지는데, 예를 들면, 한 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 내생성 BAX 및/또는 BAK 유전자를 포함하는 숙주세포를 제공하고; (b) 여기에서 기재된 임의의 방법들에 의해 숙주세포의 내생성 BAX 및/또는 BAK 유전자를 비활성화시키고; (c) 재조합 바이러스 벡터 시스템을 포함하는 하나 이상의 발현 벡터들을 도입시켜, 관심의 재조합 바이러스 벡터를 만든다.

여기에서 기재된 임의의 세포, 세포주들 및 방법들에서, 세포 또는 세포주는 COS, CHO (예, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (예를 들면, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), PerC.6®(Crucell); EBx^TM(Sigma-Aldrich Group), 곤충세포, 예를 들면, 스포도프테라 푸기페르다(Spodoptera fugiperda (Sf)) 또는 곰팡이 세포 예를 들면, 사카로미세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia) 및 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces) 또는 본 기술분야에 공지된 또는 새로 개발된 기타 세포주가 될 수 있다.

이들 측면 및 기타 측면들은 총괄적으로 기술된 내용에 근거하여 숙련된 업자들에게 명백할 것이다.

도 1은 조작된 아연 핑거 뉴클레아제를 이용하여 유전자의 엑손 2가 녹아웃된 CHO-K1 세포들의 유전자형을 도시한다. 결실된 염기들(야생형과 비교하였을 때)들은 콜론으로 나타낸다. 꼭대기 라인 (39F/38R) 은 야생형서열이며, 시작 코돈을 박스로 표시하였다. 클론 8H6는 대립유전자 A가 대립유전자 B와는 상이한 염기쌍 결실 패턴을 나타내는 화합물 이형접합체 녹아웃(KO)다. 클론 8D4는 동질접합체 녹아웃이다.
도 2, 패널 A 부터 D는 MDCK 세포에서 ZFN에 의한 BAK 및 BAX 유전자들의 변형을 설명한다. 도 2a는 BAK 표적화된 ZFN 처리된 세포 모음(pool) (17623/17622 또는 17627/17626) 및 ZFN 처리 안 된 세포들 ("벡터 단독")에서 CEL-I 분석에서 절단 과정들로 인하여 생성된 PCR 산물들을 보여주는 겔이다. BAK 유전자 자리에서 ZFN 에 의해 변형된 대립유전자들의 비율이 좌측 끝 두 개 라인 아래에 표시되어 있다. 도 2b는 BAX 표적화된 ZFN 처리된 세포 모음(17658/17659) 및 ZFN 처리 안 된 세포들 ("벡터 만")에서 CEL-I 분석에서 절단 과정들로 인하여 생성된 PCR 산물들을 보여주는 겔이다. BAX 유전자 자리에서 ZFN 에 의해 변형된 대립유전자들의 비율이 우측 끝 라인 아래에 표시되어 있다(8%). 도 2c는 BAK 표적화된 ZFN으로 처리된 다양한 MDCK 클론들의 PCR 결과를 보여준다. 클론 번호는 각 라인의 위에 표시하였고, 나타낸 각 BAK 대립유전자에서 돌연변이는 겔 아래 표시해두었다. 도 2d는 BAX 특이적 ZFN으로 처리된 MDCK 세포들의 PCR 분석을 요약한 것이다. 도면으로부터 볼 수 있는 것과 같이, 하나의 대립유전자상에 30bp의 결실과, 다른 대립유전자상에 1bp의 삽입된 BAX 단일 녹아웃들이 수득되었다. BAX/BAK 이중 녹아웃의 경우, BAX 대립유전자들은 BAX 특이적 ZFN을 이용하여 Bak 결함 클론내에서 표적화되었다. 볼 수 있는 것과 같이, 한 개의 와일드타입 BAX 대립유전자, 및 한 개의 돌연변이된 BAX 대립유전자를 포함하는 몇 가지 이형접합체 클론들이 확인되었다.
도 3 은 Bak 녹아웃 세포들에서 RNA 분석을 나타낸다. 겔에서 라인 1 내지 5 는 표시된 클론들과 대조군의 엑손 1-4로부터 Bak 전사체들의 RT-PCR 산물들을 보여준다. 라인6-10은 동일한 클론들과 대조군의 엑손 4-6로부터 Bax 전사체들의 RT-PCR 산물들을 보여준다. 라인 4에서 화살표로 나타낸 것과 같이, 클론 8H6 (화합물 이형접합체 클론)로부터 형성된 전사체들의 대부분은 엑손 2를 건너뛴다.
도 4, 패널 A 및 B는 Bak 8H6 녹아웃의 배경에서 생성된 21개 포지티브 Bak/Bax 이중 녹아웃 클론의 PCR 산물의 분석을 나타낸다. 클론 번호는 각 라인의 윗 부분에 표시해두었다. 분석된 79개 클론중에서 21개 (27%)가 Bsl I으로 절단되었는데, 이는 ZFN 절단 부위에 돌연변이가 있다는 것을 나타낸다. 도 4a의 Bsl I 저항성 대립유전자들의 서열은 도 4b에 나타낸다. 꼭대기 라인(52F/114R)은 배열을 위하여 4bp 갭이 삽입된 야생형서열이다. 30, 35, 45, 71 및 97로 지정된 클론에서 삽입 및 결실은 크기 때문에 나타내지 않는다. 클론 #100의 유전자 타입은 결정되지 않았다.
도 5는 Bax/Bak 이중 녹아웃 세포들에서 Bax 및 Bak 단백질 발현을 설명한다. 클론 번호는 각 라인 위에 표시해두었고, 탐지용으로 이용된 항체는 각 라인 아래 표시되어 있다 (Abcam #7977- Bax 단백질용 및 Sigma B5877-Bak 단백질용). 나타낸 것과 같이, 이중 KO 세포들은 전장의 또는 절두된 Bax 및 Bak 단백질들을 생산하지 않는다.
도 6 은 세포자멸의 지표가 되는 카스파제 활성(Caspases Roche Diagnostics Corporation)에 의해 측정된 것과 같이, Bax/Bak 이중 KO 세포들에서 세포자멸을 나타내는 그래프다. 흰색 막대는 1μM 스타우로스포린으로 유도된 후 카스파제 활성을 나타내고; 회색 막대는 유도 안 된 세포를 나타낸다. 테스트된 Bax-Bak-/- 클론들은 다음과 같다: 클론 47 (좌측으로부터 두 번째 막대들); 클론 71 (우측으로부터 두 번째 막대들); 및 클론 91 (가장 우측의 막대들).
도 7 은 BAX 및/또는 BAK 녹아웃 세포 클론들에서 단백질(단클론성 항체)생산을 나타내는 그래프다. 다이아몬드는 야생형 CHO 세포들에서 항체 생산을 나타내고, 사각형은 클론 8H6-71 BAX ^- BAK ^-/- CHO 세포들에서 단백질 생산을 설명한다.

발명의 상세한 설명

BAK 유전자 및/또는 BAX 유전자의 부분적인 또는 완전한 비활성화를 위한 조성물 및 방법들이 개시된다. 또한, 표적 세포에서 Bak 및 Bax 중 하나 또는 둘 모두를 비활성화시키기 위하여 이들 조성물(시약들)을 만들고, 이용하는 방법들도 개시된다. 표적 세포에서 Bak 및/또는 Bax의 비활성화는 세포자멸에 저항성이며, 항체, 재조합 바이러스 벡터들과 같은 재조합 단백질을 생산하고, 백신 제조(예, 하나 이상의 항원성 단백질들, 완전한 바이러스 백신 등)에 유용한 세포주를 만들기 위하여 이용될 수 있다.

포유류 세포들에서, Bax 및 Bak 는 예정된 세포 죽음을 촉진시키는데 관련된 것으로 본다. Zhang et al. (2000) Science 290:989-992 참고. 따라서, 여기에서 기재된 방법들 및 조성물은 Bax 및/또는 Bak 결함 세포주들을 만들수 있도록 허용된 Bax 및/또는 Bak의 표적화된 유전자 녹아웃(부분적 또는 완전한)에 매우 효과적인 방법을 제공한다. 많은 불사화된 세포주에서 볼 수 있는 변종의 성장 특징없이, 연장된 기간 동안 시험관에서 Bax/Bak 결함 세포주들을 배양할 수 있다. 따라서, 여기에서 기재된 세포주들은 재조합 단백질들 (예, 항체들), 백신 또는 재조합 바이러스 벡터들의 생산 및 세포자멸 관련된 질병 및 이상의 연구에 유용하다.

총론

본 명세서에 개시된 방법의 실시, 및 조성물의 제조 및 사용은, 달리 지적되지 않으면, 본 기술분야 내에 있는 바와 같은 분자생물학, 생화학, 염색체 구조 및 분석, 계산 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 관련 분야에서의 종래의 기술들을 적용한다. 이들 기술들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 참조, 예를 들어, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 및 제3판, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 및 주기적인 업데이트; 시리즈 METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, 제3판, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman 및 A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

정의

용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드", 및 "올리고뉴클레오티드" 는 호환되어 사용되며, 선형 또는 원형, 및 단일- 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 폴리머를 말한다. 본 내용을 위하여, 이들 용어들은 폴리머의 길이에 대해 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이들 용어들은 자연적 뉴클레오티드의 공지의 유사체뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 인산염 모이어티(예, 포스포로티오에이트 기본골격)에 변형이 있는 뉴클레오티드도 포함할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기-쌍 특이성을 가지며, 즉, A 의 유사체는 T와 염기쌍을 이룰 것이다.

용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 호환되어 이용되며, 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭한다. 이 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 대응하는 자연적으로 발생되는 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 폴리머에도 적용된다.

"결합"은 거대분자들(예, 단백질과 핵산 사이) 사이의 서열 특이적, 비-공유적 상호작용을 말한다. 상호작용이 전제적으로 서열 특이적이라면, 결합 상호작용의 모든 성분들은 서열 특이적일 필요는 없다(예, DNA 기본골격에서 인산염 잔기와의 접촉). 이와 같은 상호작용은 일반적으로 해리 상수(K_d) 가 10^-6　M^-1 또는 이보다 더 낮은 것을 특징으로 한다. "친화력"은 결합 강도를 말하는 것으로; 결합 강도의 증가는 더 낮은 K_d와 상관된다.

"결합 단백질"은 또 다른 분자에 비-공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은 예를 들면, DNA 분자 (DNA 결합 단백질), RNA 분자 (RNA 결합 단백질) 및/또는 단백질 분자 (단백질 결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질 결합 단백질의 경우에, 이것은 자체에 결합할 수 있고(호모다이머, 호모트리머 등을 형성하기 위하여) 및/또는 상이한 하나 이상의 단백질들에 결합할 수도 있다. 결합 단백질은 한 가지 이상의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들면, 아연 핑거 단백질들은 DNA 결합, RNA 결합 및 단백질 결합 활성을 가진다.

"아연 핑거 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 결합 도메인 내에 아미노산 서열 부위들로써, 아연 이온의 배위를 통하여 이들의 구조가 안정화되는 하나 이상의 아연 핑거를 통하여 서열 특이적인 방식으로 DNA에 결합하는 단백질, 또는 더 큰 내에 도메인이다. 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 흔히 아연 핑거 단백질 또는 ZFP으로 줄여서 부른다.

아연 핑거 결합 도메인들은 예정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작될 수" 있는데, 예를 들면 자연적으로 생성되는 아연 핑거 단백질의 인식 헬릭스 부위의 조작(하나 이상의 아미노산 변경)을 통하여 조작될 수 있다. 따라서, 조작된 아연 핑거 단백질들은 자연적으로 발생되지 않는 인식 헬릭스 부위를 포함하는 비-자연적으로 발생되는 단백질들이다. 아연 핑거 단백질들을 조작하는(engineering) 비-제한적인 예들은 디자인 및 선별이다. 디자인된 아연 핑거 단백질은 자연적으로 생성되지 않는 단백질로써, 이의 디자인/조성물은 합리적(rational) 기준으로부터 주로 결과된다. 디자인의 이성적인 기준은 기존의 ZFP 디자인 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스에서 프로세싱 정보를 위한 치환 규정 및 컴퓨터로 처리된 연산의 이용을 포함한다. 예를 들면, US 특허 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261 참고; WO　98/53058; WO　98/53059; WO　98/53060; WO　02/016536 및 WO　03/016496 참고.

"선택된" 아연 핑거 단백질은 파아지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선별과 같은 실험적 과정으로부터 주로 생겨나는, 자연계에서 볼 수 없는 단백질이다. 예를 들면, US　5,789,538; US 5,925,523; US　6,007,988; US　6,013,453; US 6,200,759; WO　95/19431; WO　96/06166; WO　98/53057; WO　98/54311; WO　00/27878; WO　01/60970 WO　01/88197 및 WO　02/099084 참고.

용어 "서열"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 서열을 말하는 것으로, DNA 또는RNA가 될 수 있으며; 선형, 원형 또는 분지형이 될 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥이 될 수 있다. 용어 "도너(donor) 서열"은 게놈안으로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 도너 서열은 임의의 길이가 될 수 있는데, 예를 들면 길이가 2 내지 10,000개 뉴클레오티드 (또는 이 범위 사이의 정수 또는 이 범위 이상의 임의의 정수), 바람직하게는 길이가 약 100 내지 1,000개의 뉴클레오티드 (또는 이 범위내의 임의의 정수), 더욱 바람직하게는 길이가 약 200 내지 500개의 뉴클레오티드가 된다.

"상동성(homdogous), 비-동일성 서열"은 제2 서열과 서열 동일성(identity) 수준을 공유하지만, 제2 서열과는 동일하지 않는 서열을 가진 제1 서열을 말한다. 예를 들면, 돌연변이 유전자의 야생형 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 돌연변이 유전자의 서열과는 상동성이지만 동일하지는 않는다. 특정 구체예들에서, 두 개 서열간에 상동성 정도는 정상적인 세포 기전들을 이용하여 이들 사에에 상동성 재조합을 허용하는데 충분하다. 두 개의 상동성 비-동일 서열은 임의의 길이가 될 수 있으며, 비-상동 수준은 한 개 뉴클레오티드만큼 작거나 (예, 표적화된 상동성 재조합에 의한 게놈 점 돌연변이의 교정용) 또는 10개 또는 그 이상의 kb 만큼 클 수 있다 (예, 염색체에서 예정된 규정장소 이의의 부위에 유전자 삽입). 상동성 비-동일한 서열을 포함하는 두 개의 폴리뉴클레오티드들은 동일한 길이를 가질 필요는 없다. 예를 들면, 20 내지 10,000개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍의 외인성 폴리뉴클레오티드 (예, 도너 폴리뉴클레오티드) 가 이용될 수 있다.

핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하는 기술들은 본 기술분야에 공지되어 있다. 일반적으로 이와 같은 기술들은 유전자의 mRNA의 뉴클레오티드 서열 및/또는 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 결정하고, 이들 서열을 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 이 방식으로 게놈 서열들 또한 결정되고, 비교될 수도 있다. 일반적으로, 동일성은 두 개의 폴리뉴클레오티드들 또는 폴리펩타이드 서열에 대해 차례로 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산을 말한다. 두 개 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)이 비교되어, 이들의 동일성 비율이 결정될 수 있다. 핵산 또는 아미노산 서열이든 간에 두 개 서열의 동일성 비율은 두 개의 배열된 서열간에 정확히 일치가 되는 수를 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 것이다. 여기에서 기재된 서열에 대해 바람직한 서열 동일성 범위는 대략 80% 내지 100% 및 이 사이의 임의의 정수값이다. 일반적으로 서열간에 동일성 비율은 적어도 70-75%, 바람직하게는 80-82%, 더욱 바람직하게는 85-90%, 더더욱 바람직하게는 92%, 더욱더 바람직하게는 95%, 및 가장 바람직하게는 98% 서열 동일성이다.

대안으로, 폴리뉴클레오티드들 사이에 서열 유사성 정도는 상동성 부위들 사이에 안정적인 중복체(duplex) 형성을 허용하는 조건하에서 폴리뉴클레오티드들을 하이브리드시키고, 이어서 단일가닥 특이적 뉴클레아제로 절단하고, 절단된 단편들의 크기 결정에 의해 측정될 수 있다. 상기의 방법들에 의해 결정된 바와 같이, 정해진 길이의 분자들에서 서열들이 적어도 약 70%-75%, 바람직하게는 80%-82%, 더욱 바람직하게는 85%-90%, 더욱 바람직하게는 92%, 더욱더 바람직하게는 95%, 및 가장 바람직하게는 98% 서열 동일성을 나타낼 때, 두 개의 핵산, 또는 두 개의 폴리펩타이드 서열들은 서로 실질적으로 상동성이다. 여기에서 사용된 것과 같이, 실질적으로 상동성이란 또한 특정화된 DNA 또는 폴리펩타이드 서열에 완벽한 동일성을 보이는 서열을 지칭한다. 실질적으로 동일성인 DNA 서열들은 특정 시스템에 대해 정의된 바와 같이, 예를 들면, 엄격한(stringent) 조건들하에 서든 하이브리드 반응 실험에서 확인될 수 있다. 적절한 하이브리드 반응 조건의 한정은 본 발명의 기술범위내에 있다. 예를 들면, Sambrook et al., supra; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames 및 S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press) 참고.

두 개의 핵산 단편들의 선택적 하이브리드화는 다음과 같이 결정될 수 있다. 두 개의 핵산 분자들 간에 서열 동일성 정도는 이들 두 분자간에 하이브리드 반응의 효과 및 강도에 영향을 준다. 부분적으로 동일한 핵산 서열은 표적 분자에 완벽하게 동일한 서열의 하이브리드 반응을 적어도 부분적으로 저해할 것이다. 완벽하게 동일한 서열의 하이브리드 반응의 저해는 본 기술분야에 잘 공지된 하이브리드 분석을 이용하여 평가될 수 있다 (예를 들면, 서든(DNA) 블랏, 노던(RNA) 블랏, 용액 하이브리드 반응 또는 이와 유사한 것들, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.참고). 이와 같은 분석들은 낮은 엄격성부터 높은 엄격성까지 다양한 조건들을 이용한 다양한 정도의 선택성을 이용하여 실시될 수 있다. 낮은 엄격성 조건들이 이용된다면, 부분적인 서열 동일성 정도가 부족한 2차 프로브(예를 들면, 표적 분자와 약 30% 미만의 서열 동일성을 가지는 프로브)를 이용하여, 비 특이적 결합 사건없는 상태에서 2차 프로브가 표적에 하이브리드되지 못하게 될 것이므로 비 특이적 결합의 없음이 평가될 것이다.

하이브리드화에 근거한 탐지 시스템을 이용할 때, 핵산 프로브는 기준 핵산 서열에 상보적인 것으로 선택되고, 적절한 조건의 선택에 의해, 프로브와 기준 서열은 선택적으로 하이브리드되거나, 또는 서로에 결합하여, 중합체 분자를 형성한다. 중간수준의 엄격한 하이브리드화 조건하에 기준 서열에 선택적으로 하이브리드될 수 있는 핵산 분자는 일반적으로 적어도 약 70% 서열 동일성을 가지는 길이가 적어도 10-14개 뉴클레오티드의 표적 서열의 탐지를 허용하는 조건하에 선택된 핵산 프로브의 서열과 하이브리드된다. 엄격한 하이브리드화 조건은 일반적으로 선택된 핵산 프로브와 약 90-95% 이상의 서열 동일성을 가지는 길이가 적어도 약 10-14개의 뉴클레오티드의 표적 핵산 서열의 탐지를 허용한다. 프로브 및 기준 서열이 특정 수준의 서열 동일성을 보유하는 프로브/기준 서열 하이브리드화에 유용한 하이브리드화 조건들은 본 기술분야에 공지된 것과 같이 결정될 수 있을 것이다 (예를 들면, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames 및 S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press).

하이브리드화 조건들은 본 기술분야에 잘 공지되어 있다. 하이브리드화 엄격성(stringency)은 잘못 짝지어진 뉴클레오티드들을 포함하는 하이브리드 형성을 선호하지 않는 정도를 말하는 것으로, 높은 엄격성은 잘못 짝지어진 하이브리드에 대해 더 낮은 내성과 관련된다. 하이브리드화의 엄격성에 영향을 주는 인자들은 본 기술분야의 업자들에게 잘 알려져 있으며, 온도, pH, 이온 강도 및 유기 용매, 예를 들면, 포름아미드 및 디메틸술폭시드와 같은 유기 용매의 농도를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 기술분야의 업자들에게 알려진 바와 같이, 하이브리드화 엄격성은 온도가 높을수록, 이온 강도가 낮을수록, 및 용매 농도가 낮을수록 증가한다.

하이브리드화를 위한 엄격성 조건들에 있어서, 특정 엄격성을 이루기 위해 수많은 등가의 조건들이 이용될 수 있다는 것은 잘 알려져 있는데, 예를 들면, 다음의 인자들을 조절하여 이루어진다: 서열들의 길이 및 특징, 다양한 서열들의 염기 조성, 염 및 기타 하이브리드화 용액 성분들의 농도, 하이브리드화 용액내에 차단제 (예를 들면, 덱스트란 설페이트 및 폴리에틸렌 글리콜)의 존부, 하이브리드화 반응 온도 및 시간뿐만 아니라 세척 조건들의 변화. 하이브리드화 조건들의 특정 세트의 선택은 본 기술분야의 표준 방법들에 따라 선택된다 (예를 들면, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.참고).

"재조합"은 두 개의 폴리뉴클레오티드들 사이에 유전자 정보 교환 프로세스를 말한다. 본 명세서에서, "상동성 재조합(HR)"은 세포들에서 이중가닥 단절(break)의 복구 동안 발생되는 이와 같은 효과의 특정 형태를 지칭한다. 이 프로세스는 뉴클레오티드 서열 상동성을 요구하고, "표적" 분자의 주형 복구에 "도너" 분자를 이용하고(예, 이중가닥 단절을 경험한 분자), "넌-크로스오버 유전자 전환" 또는 "숏 트랙 유전자 전환"과 같이 다양하게 알려져 있는데, 그 이유는 도너로부터 표적으로 유전자 정보의 전달로 이어지기 때문이다. 임의의 특정 이론에 결부됨을 원하지 않고, 이와 같은 전달은 절단된 표적과 도너 사이에 형성되는 이질중합체 DNA의 잘못된 짝의 수정도 포함할 수 있고/있거나 "합성 의존적 가닥 어닐링"을 포함할 수 있는데, 여기서 도너는 표적, 및/또는 관련된 프로세스의 일부분이 될 수도 있는 유전자 정보를 재합성하는데 이용된다. 이와 같은 특화된 HR는 종종 표적 분자의 서열의 변경을 초래하여 도너 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부 서열이 표적 폴리뉴클레오티드로 통합된다.

"절단"은 DNA 분자의 공유결합 기본골격의 단절을 말한다. 절단은 다양한 방법들, 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나 이에 한정되지 않는 방법들에 의해 개시될 수 있다. 단일가닥-절단 및 이중가닥 절단 모두 가능하며, 이중가닥 절단은 두 개의 별개 단일 가닥 절단 과정으로 인하여 발생될 수 있다. DNA 절단으로 블런트 엔드(blunt ends) 또는 스태글 엔드(staggered ends)가 만들어질 수 있다. 특정 구체예들에서, 융합 폴리펩타이드들이 표적화된 이중가닥 DNA 절단에 이용된다.

"절단 하프-도메인"은 제2 폴리펩타이드 (동일하거나 또는 상이한)와 결합으로 절단 활성 (바람직하게는 이중가닥 절단 활성)을 가지는 복합체를 형성하는 폴리펩타이드 서열을 말한다. "제1과 제2 절단 하프-도메인"; "+ 및 - 절단 하프-도메인들" 및 "좌우 절단 하프-도메인들"은 다이머를 형성하는 절단 하프-도메인들의 쌍을 지칭하는 것으로 호환 사용된다.

"조작된 절단 하프-도메인"은 또 다른 절단 하프-도메인(예를 들면 또다른 조작된 절단 하프-도메인)과 절단 하프-도메인의 불가피한 헤테로다이머를 형성하기 위하여 변형된 절단 하프-도메인이다. U.S. 특허 출원 Nos. 10/912,932 및 11/304,981 및 U.S. 가출원 No. 60/808,486 (2006년 5월 25 제출됨)-이들 전문이 참고문헌에 통합됨.

"크로마틴"은 세포 게놈을 포함하는 핵 단백질이다. 세포성 크로마틴은 핵산, 주로 DNA, 및 히스톤 및 비-히스톤 염색체 단백질들을 포함하는 단백질을 포함한다. 진핵 세포 크로마틴의 대부분은 뉴클레오좀 형태로 존재하고, 여기서 뉴클레오좀 코어는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4을 각 두 개씩을 포함하는 옥타머와 연합된 약 150bp DNA를 포함하고; 링커 DNA (유기체에 따라 다양한 길이를 가짐)는 뉴클레오좀 코어 사이에 걸쳐있다. 히스톤 H1 분자는 일반적으로 링커 DNA와 연합된다. 본 내용을 위하여, 용어 "크로마틴"은 진핵 및 원핵성 모든 타입의 세포성 핵 단백질을 포함한다는 의미다. 세포성 크로마틴은 염색체 및 에피좀성 크로마틴을 모두 포함한다.

"염색체"는 세포의 게놈 일부 또는 전부를 포함하는 크로마틴 복합체다. 세포의 게놈은 흔히 이의 핵형(karyotype)으로 특징화되는데, 핵형은 세포의 게놈을 포함하는 모든 염색체의 집합이다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.

"에피좀"은 복제가능한 핵산, 핵단백질 복합체 또는 세포의 염색체 핵형의 일부가 아닌 핵산을 포함하는 기타 구조다. 에피좀의 예로는 플라스미드 및 특정 바이러스성 게놈들을 포함한다.

"근접가능한 부위"은 핵산에 존재하는 표적 부위가 표적 위치를 인식하는 외인성 분자에 의해 결합된 세포성 크로마틴 내에 있는 부위다. 임의의 특정 이론에 결부되는 것을 원하지 않고, 근접가능한 부분은 뉴클레오좀 구조내에 포함안된 부분인 것으로 본다. 근접가능한 부분의 독특한 구조는 효소적 및 화학적 프로브들, 예를 들면, 뉴클레아제에 대한 이의 감응성으로 종종 탐지될 수 있다..

"표적 위치" 또는 "표적 서열"은 결합이 존재하도록 충분한 농도로 제공된다면 결합 분자가 결합하게 되는 핵산의 일부를 한정하는 핵산 서열이다. 예를 들면, 서열 5'-GAATTC-3'은 Eco　RI 제한 엔도뉴클레아제의 표적 위치다.

"외인성" 분자는 세포 내 정상적으로 존재하지 않는 분자이나, 하나 이상의 유전적, 생화학물 또는 기타 방법들에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. "세포에 정상적으로 존재한다"는 것은 세포의 특정 발생적 단계 및 환경 조건들에 근거하여 결정된다. 따라서, 예를 들면, 근육의 배 발생 동안에만 존재하는 분자는 성인 근육 세포에 있어서 외인성 분자가 된다. 유사하게, 열 쇼크에 의해 유도된 분자는 비-열 쇼크된 세포에 대해서 외인성 분자가 된다. 외인성 분자는 예를 들면, 기능 부전 내생성 분자의 기능 형(version) 또는 정상적인 기능을 하는 내생성 분자의 기능 부전 형을 포함할 수 있다.

외인성 분자는 다른 것들 중에서 소분자가 될 수 있는데, 이는 복합적인 화학 프로세스에 의해 생성되거나 또는 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지방단백질, 폴리사카라이드, 상기 분자들의 임의의 변형된 유도체 또는 상기 분자들중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체와 같은 거대 분자로부터 생성된다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하고, 단일- 또는 이중가닥일 수 있고; 선형, 분지형 또는 고리형이 될 수 있으며; 및 임의의 길이를 가질 수 있다. 핵산은 중합체를 형성하는 것뿐만 아니라 삼중합체 형성 핵산도 포함한다. 예를 들면, U.S. 특허 Nos. 5,176,996 및 5,422,251. 단백질들은 DNA 결합 단백질들, 전사 인자들, 크로마틴 리모델링 인자들, 메틸화된 DNA 결합 단백질들, 폴리머라제, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스포타제, 인테그라제, 리콤비나제, 리게이즈, 토포이소메라제, 기레이제(gyrases) 및 헬리카제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

외인성 분자는 내생성 분자와 동일한 타입의 분자가 될 수 있는데, 예를 들면, 외인성 단백질 또는 핵산이 될 수 있다. 예를 들면, 외인성 핵산은 세포 내로 도입된 감염성 바이러스성 게놈, 플라스미드 또는 에피좀을 포함할 수 있다. 세포 내로 외인성 분자들을 도입시키는 방법들은 본 기술분야의 업자들에게 공지된 것이며, 지질 매개된 전달 (예, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포좀), 전기천공법, 직접 주사, 세포 융합, 입자 투하(bombardment), 인산 칼슘염-공침전법, DEAE-덱스트란 매개된 절단 및 바이러스 벡터 매개된 전달을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 외생성 분자는 내생성 분자와 동일한 타입의 분자가 될 수 있지만, 세포가 유도된 종과는 상이한 종들로부터 유도된 것일 수 있다. 예를 들면, 인간의 서열화된 핵산 서열은 마우스 또는 햄스터로부터 원래 유도된 세포주로 도입될 수 있다.

대조적으로, "내생성" 분자는 특정 환경적 조건들하에서 특정 발생학적 단계에서 특정 세포에 정상적으로 존재하는 분자다. 예를 들면, 내생성 핵산은 염색체, 미토콘드리아의 게놈, 엽록체 또는 다른 세포 기관 또는 자연적으로 생성된 에피좀성 핵산을 포함할 수 있다. 추가적인 내생성 분자들은 단백질들, 예를 들면, 전사 인자들 및 효소들을 포함한다.

"융합" 분자는 두 개 이상의 아단위(subunit) 분자가 연결된, 바람직하게는 공유적으로 연결된 분자다. 아단위 분자들은 분자와 동일한 화학적 타입이거나, 분자들과 상이한 화학적 타입일 수도 있다. 융합 분자의 제1 타입의 예로는 융합 단백질들 (예를 들면, ZFP DNA 결합 도메인과 절단 도메인 사이의 융합) 및 융합 핵산 (예를 들면, 상기에서 기재된 융합 단백질을 인코딩하는 핵산)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 제2 융합 분자들의 타입의 예로는 삼중합체-형성 핵산과 폴리펩타이드 사이의 융합, 및 작은 홈 결합제(minor groove binder)와 핵산 사이의 융합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

세포 내에서 융합 단백질의 발현은 세포로 융합 단백질을 전달하거나 또는 세포로 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전달에 의해 일어날 수 있으며, 여기서 폴리뉴클레오티드가 전사되고, 전사체가 해독되어 융합 단백질이 생성된다. 트란스-스플라이싱(Trans-splicing), 폴리펩타이드 절단 및 폴리펩타이드 결찰(ligation)이 세포 내에서 단백질 발현에 관련될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩타이드를 세포로 전달하는 방법들은 본 내용의 여러 부분에 제시되고 있다.

본 내용에서 "유전자" 는 유전자 산물 (하기 참고)을 인코딩하는 DNA 부위뿐만 아니라, 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 부위들을 포함하는데, 이와 같은 조절 서열들이 코딩 및/또는 전사된 서열에 인접해있거나 인접해 있지 않는다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열들, 종료서열들, 해독 조절서열 가령, 리보좀 결합 위치들 및 내부 리보좀 유입 위치들, 인헨서(enhancers), 사일런스(silencers), 격리자(insulators), 경계 요소들(boundary elements), 복제 원점, 매트릭스 부착 위치들 및 유전자 위치 조절 부위들을 포함하나 반드시 이에 한정되지 않는다.

"유전자 발현"은 유전자 내에 포함된 정보가 유전자 산물로 전환되는 것을 말한다. 유전자 산물은 유전자의 직접적인 전사 산물 (예를 들면, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 임의의 기타 또는 RNA) 또는 mRNA 의 해독에 의해 만들어진 단백질이 될 수 있다. 유전자 산물들은 또한 캡핑(capping), 폴리아데닐화(polyadenylation), 메틸화, 및 에디팅(editing)과 같은 프로세스에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들면, 메틸화, 아세틸화, 포스포릴화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질들을 포함한다.

유전자 발현의 "조절"은 유전자의 활성에 변화를 말한다. 발현 조절은 유전자 활성 및 유전자 억제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 유전자 비활성화는 여기에서 기재되는 ZFP를 포함하지 않는 세포와 비교하였을 때 유전자 발현에서 임의의 감소를 말한다. 따라서, 유전자 비활성화는 부분적이거나 완전한 것일 수 있다.

"진핵" 세포는 곰팡이세포(가령, 이스트), 식물 세포, 동물 세포, 포류유 세포 및 인간 세포(예를 들면, T-세포들)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

"세포주"는 1차 배양물로부터 조직배양에서 확립된 세포 집단을 말한다. 따라서, 아연 핑거 뉴클레아제를 이용하여 생성된 세포주는 하나 이상의 표적 유전자들 (예를 들면, BAK 및/또는 BAX) 이 하나 이상의 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 부분적으로 또는 완전하게 비활성화되고, 세포(또는 세포주)의 후손은 배양에서 여러 차례 계대후에도 비활성화된 표현형을 유지하는 세포(또는 세포주)로부터 발생된다. 더욱이, 세포 또는 세포주는 하나 이상의 유전자의 발현이 감소 또는 제거(녹아웃)되면, 표시된 하나 이상의 유전자의 발현에 "결함"이 있다. 따라서, Bax/Bak 결함 세포주들은 Bax 및 Bak의 감소된 또는 녹아웃 발현을 보인다.

"관심 부위"은 크로마틴의 임의 조절 부위, 예를 들면, 유전자 내에 또는 유전자에 인접한 유전자 또는 넌-코딩 서열이며, 외인성 분자에 결합되는 것이 바람직하다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화된 재조합을 목적으로 할 수 있다. 관심 부위는 예를 들면 염색체, 에피좀, 세포 기관 게놈(예를 들면, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염성 바이러스성 게놈에 존재할 수 있다. 관심 부위는, 예를 들면 유전자의 코딩 조절 부위내에, 전사된 넌-코딩 부위내, 예를 들면, 리더 서열들, 트레일러(trailer) 서열들 또는 인트론들 또는 코딩 부위의 상류 또는 하류에 있는 비-전사된 부위에 있을 수 있다. 관심 부위는 단일 뉴클레오티드 쌍과 같이 작거나 또는 길이가 최대 2,000개 뉴클레오티드 쌍이 되거나 또는 임의의 수치의 뉴클레오티드 쌍이 될 수 있다.

두 개 이상의 성분들(예를 들면, 서열 요소들)의 병치와 관련하여 "작용성 링키지" 및 "작용가능하게 링크된" 용어는 호환 사용되며, 여기서 성분들은 두 개 성분 모두 정상적으로 기능을 하고, 성분들중 적어도 하나는 다른 성분들중 적어도 하나에 발휘되는 기능을 중재할 수 있는 것이 가능하도록 배열된다. 설명을 위하여, 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자들의 존부에 반응하여 코딩 서열의 전사 수준을 조절한다면, 프로모터와 같은 전사 조절 서열은 코딩 서열에 작용가능하게 링크되어 있다. 전사 조절 서열은 일반적으로 코딩 서열과 cis 형태로 링크되어 있지만, 코딩 서열에 직접적으로 인접할 필요는 없다. 예를 들면, 인헨서는 코딩 서열과 접촉해 있지는 않지만, 코딩 서열에 작용가능하도록 링크된 전사 조절 서열이다.

융합 폴리펩타이드에 대해서, "작용가능하도록 링크된" 이란 성분들 각각이 다른 성분들과 연동하여, 마치 링크 안 된 것처럼 각각이 기능을 하는 것과 동일한 기능을 실행한다는 것을 말한다. 예를 들면, ZFP DNA 결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩타이드의 경우, 융합 폴리펩타이드에서, ZFP DNA 결합 도메인 부위는 이의 표적 위치 및/또는 결합 위치에 결합할 수 있고, 절단 도메인은 표적 위치에 인접한 DNA를 절단할 수 있다면, ZFP DNA 결합 도메인과 절단 도메인은 작용가능하도록 링크되어 있다.

단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산의 "기능적 단편"은 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산의 서열이 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과는 동일하지 않지만, 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산이다. 기능적 단편은 대응하는 고유의 분자와 동일한 또는 더 많은, 또는 더 적은 수의 잔기를 포함할 수 있고/있거나 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환들을 포함할 수 있다. 핵산의 기능을 결정하는 방법들 (예를 들면, 코딩 기능 또는 또 다른 핵산에 하이브리드하는 능력)은 본 발명 분야에 잘 알려져 있다. 유사하게, 단백질 기능을 결정하는 방법들도 잘 알려져 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드의 DNA 결합 기능은 예를 들면, 필터 결합, 전기영동 이동성-쉬프트, 또는 면역침전 분석 등에 의해 결정될 수 있다. DNA 절단은 겔 전기영동에 의해 분석될 수 있다. Ausubel et al., supra. 참고. 또 다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력은 단백질, 예를 들면, 공동-면역침전법, 이중-하이브리드 분석 또는 유전적 및 생화학적 상보성에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, Fields et al. (1989) Nature 340:245-246; U.S. 특허 No. 5,585,245 및 PCT WO 98/44350 참고.

용어 "항체"란 본 명세서에 사용된 바와 같이, 다클론과 단클론 제제 모두로부터 얻은 항체, 및 하기를 포함한다: 하이브리드 (키메라) 항체 분자 (참조, 예를 들어, Winter et al., Nature (1991) 349:293-299; 및 U.S. 특허 No. 4,816,567); F(ab')2 및 F(ab) 단편; Fv 분자 (비공유 헤테로다이머, 참조, 예를 들어, Inbar et al., Proc Natl Acad Sci USA (1972) 69:2659-2662; 및 Ehrlich et al., Biochem (1980) 19:4091-4096); 단쇄 Fv 분자 (sFv) (참조, 예를 들어, Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85:5879-5883); 다이머 및 트리머 항체 단편 제작물; 미니항체 (참조, 예를 들어, Pack et al., Biochem (1992) 31:1579-1584; Cumber et al., J Immunology (1992) 149B: 120-126); 인간화 항체 분자 (참조, 예를 들어, Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327; Verhoeyan et al., Science (1988) 239:1534-1536; 및 U.K. 특허공보 No. GB 2,276,169, 공개 21 Sep. 1994); 및 그와 같은 분자로부터 얻은 어떤 기능적 단편, 여기서, 그와 같은 단편은 모(parent) 항체 분자의 면역적 결합 특성을 유지한다.

여기에서 사용된 것과 같이, "단클론 항체"는 상동성 항체 집단을 가지는 항체를 말한다. 이 용어는 항체의 종류 또는 기원에 제한을 두지 않으며, 이를 만드는 방법에도 제한을 두지 않는다. 이 용어는 완전한 면역글로블린뿐만 아니라 Fab, F(ab')₂, Fv, 및 기타 단편들과 같은 단편들, 및 모(parent) 단클론 항체 분자의 면역학적 결합 성질을 나타내는 키메라 및 인간화 동질성 항체 집단도 포함한다.

백신은 살아있는 유기체의 면역계를 자극하여 미래의 유해에 대해 보호를 제공하는데 이용되는 물질을 말한다. 면역화는 항체를 유도하거나 및/또는 T-임파세포가 병인균을 죽이고,/또는 유기체내에서 병인균에 대항하는 또는 기존에 유기체에 이미 노출된 항원에 대항하는 다른 세포들(예를 들면, 식세포)을 활성화시키는 세포계 면역 반응을 유도하는 프로세스를 말한다. 여기에서 사용된 "면역 반응"은 예를 들면, 다중 세포성 유기체가 유기체의 세포 또는 유기체의 여분의 세포성 유체에 침입하는 항원성 물질에 대항하여 항체를 생산하는 기전들을 포함한다. 생성된 항체는 면역글로블린 A, D, E, G 또는 M와 같은 임의의 면역학적 부류에 속할 수 있다. 다른 타입의 반응들, 예를 들면 세포성 및 체액성 면역 또한 포함된다. 항원에 대한 면역 반응은 잘 연구되어 있고, 광범위하게 보고되어 있다. 면역학에 대한 통람은 예를 들면, Roitt I., (1994). Essential Immunology, Blackwell Scientific Publication, London에서 제공된다. 면역학 방법들은 관례적이며 통상적이다 (예를 들면, Current Protocols in Immunology; Edited by John E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc. 참고).

"재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이질성 서열(예, 폴리뉴클레오티드 서열은 바이러스 기원이 아님)을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 벡터를 말한다. 재조합 파르보바이러스 벡터의 경우, 재조합 폴리뉴클레오티드는 적어도 한 개의, 바람직하게는 두 개의, 역전된 말단 반복 서열(ITR)의 측면에 있다.

"재조합 AAV 벡터 (rAAV 벡터)"는 적어도 한 개의, 바람직하게는 두 개의, 역전된 말단 반복 서열(ITR)의 측면에 있는 하나 이상의 이질성 서열(예, 폴리뉴클레오티드 서열은 AAV 기원이 아님)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터를 말한다. 이와 같은 rAAV 벡터들은 적절한 헬퍼 바이러스에 감염되고 (또는 적절한 헬퍼 기능을 발현시킬 수 있는), AAV rep 및 cap 유전자 산물들 (예를 들면, AAV Rep 및 Cap 단백질들)을 발현시킬 수 있는 숙주세포에서 복제되고, 감염성 바이러스 입자로 패키징될 수 있다. rAAV 벡터가 더 큰 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, 염색체내 또는 클로닝 또는 형질감염을 위해 이용되는 플라스미드와 같은 또 다른 벡터내)에 통합될 때, rAAV 벡터는 "프로(pro)-벡터"라고 하고, AAV 패키징 기능 및 적절한 헬퍼 기능 존재하에 복제 및 포집(encapsidation)에 의해 "해방(rescued)"될 수 있다. rAAV는 플라스미드, 선형 인공 염색체, 지질로 복합됨, 리포좀내에 포집되거나, 가장 바람직하게는 바이러스성 입자, 특히, AAV내에 포집되는 것을 포함하는 여러 다수의 형태로 있을 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. rAAV 벡터는 AAV 바이러스 입자내로 포집되어 "재조합 아데노 연합된 바이러스"(rAAV)를 만들 수 있다. 감염성 바이러스 입자를 만들기 위하여 포집될 수 있는 최대 크기의 벡터는 약 5.2 kb다.

아연 핑거 뉴클레아제

BAK 및/또는 BAX 유전자의 비활성화에 이용되는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFNs)가 여기에서 개시된다. ZFN는 아연 핑거 단백질 (ZFP)과 뉴클레아제 (절단) 도메인을 포함한다.

A. 아연 핑거 단백질들

아연 핑거 결합 도메인들은 선택된 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들면, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416 참고. 조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연-발생적 아연 핑거 단백질과 비교하였을 때, 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법들에는 합리적 디자인과 다양한 타입의 선별을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 합리적 디자인(Rational design)은 예를 들면, 세 개 쌍(또는 네 개 쌍) 뉴클레오티드 서열들과 개별 아연 핑거 아미노산 서열들을 포함하는 데이터베이스를 이용하는 것을 포함하는데, 각 세 개 쌍 또는 네 개 쌍 뉴클레오티드 서열은 특정 세 개 쌍 또는 네 개 쌍 서열에 결합되는 하나 이상의 아연 핑거 아미노산 서열들과 연합된다. 예를 들면, 공동 소유의 U.S. 특허 6,453,242 및 6,534,261, 이들 전문이 참고문헌에 통합됨.

파아지 디스플레이 및 이중-하이브리드 시스템을 포함하는 예시적인 선별 방법들은 US 특허5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568;뿐만 아니라 WO　98/37186; WO　98/53057; WO　00/27878; WO　01/88197 및 GB 2,338,237을 참고한다. 추가로, 아연 핑거 결합 도메인들에 대한 결합 특이성의 강화는 예를 들면, 공동-소유의 WO　02/077227에서 설명되고 있다.

표적 위치들의 선별; ZFP 및 융합 단백질들 (그리고 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들)의 디자인 및 작제를 위한 방법들은 본 기술분야의 업자들에게 공지되어 있고, U.S. 특허 출원 공개 Nos. 20050064474 및 20060188987에서 설명되고 있으며, 이들 전문이 참고문헌으로 통합됨.

추가로, 이들 문헌 및 기타 문헌에서 기재된 것과 같이, 아연 핑거 도메인들 및/또는 다중-핑거형 아연 핑거 단백질들은 임의의 적합한 링커 서열, 예를 들면, 길이가 5개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 링커들(예를 들면, TGEKP (서열식별번호:18), TGGQRP (서열식별번호:37), TGQKP (서열식별번호:19), 및/또는 TGSQKP (서열식별번호:20))을 포함하는 임의의 적절한 링커를 이용하여 함께 링크될 수 있다. U.S. 특허 Nos. 6,479,626; 6,903,185 참고; 길이가 6개 또는 그 이상의 아미노산으로된 예시적인 링커들은 U.S. 특허 7,153,949를 참고함. 여기에서 기재된 것과 같이 단백질들은 단백질들의 개별 아연 핑거사이에 링커들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

표 1 과 2는 BAX 유전자 (표 1) 및 BAK 유전자 (표 2)에서 뉴클레오티드 서열들에 결합되도록 조작된 아연 핑거 결합 도메인들을 설명한다. 각 줄에는 별도의 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 설명한다. 각 도메인에 대한 DNA 표적 서열은 제1 컬럼에 나타내고, 두 번째부터 다섯 번째 컬럼에는 단백질에서 각 아연 핑거(F1 부터 F4 또는 F5) 의 인식 부위의 아미노산 서열(헬릭스 출발에 대해 아미노산 -1부터 +6까지)을 보여준다. 또한 제1 컬럼에는 단백질의 식별 번호도 제공된다.

하기에서 기재된 것과 같이, 특정 구체예들에서, 표 1과 2에서 나타낸 것과 같은 4개 또는 5개 핑거 결합 도메인은 절단 하프-도메인, 예를 들면, FokI와 같은 타입 IIS 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인에 융합된다. 이와 같은 하나 이상의 아연 핑거/뉴클레아제 하프-도메인 융합 쌍은 예를 들면, U.S. 특허 공개 No. 20050064474에서 기재된 것과 같이 표적화된 절단에 이용된다.

표적화된 절단을 위하여, 결합 위치들의 가까운 모서리들은 5개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 쌍들에 의해 분리될 수 있고, 융합 단백질들의 각각은 DNA 표적의 반대 가닥에 결합할 수 있다. 일반적으로 표 1과 2에 나타낸 ZFN들은 이들의 표적 유전자의 절단을 위하여 쌍으로 이용된다. 본 내용에 따라, ZFN들은 BAX 또는 BAK 유전자 내에 임의의 서열을 표적으로 할 수 있다.

B. 절단 도메인들

ZFN들은 또한 뉴클레아제 (절단 도메인, 절단 하프-도메인)를 포함한다. 여기에서 기재된 융합 단백질들의 절단 도메인 부위는 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 절단 도메인이 유도될 수 있는 예시적인 엔도클레아제는 제한 엔도 뉴클레아제 및 호밍 (homing) 엔도뉴클레아제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; and Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388 참고. DNA를 절단하는 추가 효소들이 공지되어 있다 (예를 들면, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 미구균(micrococcal) 뉴클레아제; 이스트 HO 엔도뉴클레아제; Linn et al. (eds.)Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993 참고). 이들 효소들 중 하나 이상(또는 이의 기능적 단편들)은 절단 도메인 및 절단 하프-도메인들의 소스로 이용될 수 있다.

유사하게, 상기에서 제시된 것과 같이 절단 하프-도메인은 절단 활성을 위하여 다이머 형성을 필요로 하는 임의의 뉴클레아제 또는 이의 일부분으로부터 유도될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질들이 절단 하프-도메인들을 포함하는 경우, 절단을 위하여 두 개의 융합 단백질들을 필요로 한다. 대안으로, 두 개의 절단 하프-도메인을 포함하는 단일 단백질이 이용될 수 있다. 두 개의 절단 하프-도메인들은 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능적 단편들)로부터 유도되거나, 또는 각 절단 하프-도메인은 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능적 단편들)로부터 유도될 수 있다. 추가로, 각 표적 위치에 두 개의 융합 단백질의 결합은 서로에 대해 공간적 방향으로 절단 하프-도메인을 두게 되어, 절단 하프-도메인이 이령체형성에 의해 기능적인 절단 도메인의 형성이 허용되도록 바람직하게 두 개의 융합 단백질들에 대한 표적 위치가 배치된다. 따라서, 특정 구체예들에서, 표적 위치들의 가까운 모서리는 5-8개의 뉴클레오티드 또는 15-18개의 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있다. 그러나, 두 개의 표적 위치 사이에 임의의 숫자의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 끼어 있을 수 있다 (예를 들면, 2개 내지 50개의 뉴클레오티드쌍 또는 그 이상). 일반적으로, 절단 위치는 표적 위치들 사이에 있다.

제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소들) 는 많은 종들에서 존재하고, DNA에 서열 특이적 결합할 수 있고(인식 위치에서), 결합 위치 또는 결합 위치 부근에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소들 (예를 들면, 타입 IIS)은 인식 위치로부터 떨어진 위치에서 DNA를 절단하고, 분리될 수 있는 결합 및 절단 도메인을 가진다. 예를 들면, 타입 IIS 효소 Fok　I 는 이의 인식 위치로부터 한 가닥에서는 9개 뉴클레오티드 떨어져 있는 및 또 다른 가닥에서는 인식 위치로부터 13개 뉴클레오티드 떨어져 있는 DNA의 이중가닥 절단을 촉진한다. 예를 들면, US 특허들 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 및 Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982 참고. 따라서, 하나의 구체예에서, 융합 단백질들은 적어도 한 개의 타입 IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인)과, 조작된 또는 조작되지 않는 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인들을 포함한다.

이의 절단 도메인은 결합 도메인으로부터 분리가능한 예시적인 타입 IIS 제한 효소는 Fok　I이다. 이와 같은 특정 효소는 다이머일 때 활성이 있다. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. 따라서, 본 개시를 목적으로, 개시된 융합 단백질들에 이용될 수 있는 FokI 효소의 일부분은 절단 하프-도메인으로 간주된다. 따라서, 아연 핑거-Fok　I 융합을 이용하여 표적화된 이중가닥 절단 및/또는 표적화된 세포 서열의 치환을 위하여, 두 개의 융합 단백질들은 촉매에 의해 활성화되는 절단 도메인을 재구성하는데 이용될 수 있는데, 이들 각 융합 단백질은 FokI 절단 하프-도메인을 포함한다. 대안으로, 아연 핑거 결합 도메인과 두 개의 Fok　I 절단 하프-도메인을 포함하는 단일 폴리펩타이드 분자 또한 이용될 수 있다. 아연 핑거-Fok　I 융합을 이용하여 표적화된 절단 및 표적화된 서열 변경을 위한 변수들은 본 내용 곳곳에서 제공된다.

절단 도메인 또는 절단 하프-도메인은 절단 활성을 보유하는 또는 기능적 절단 도메인을 형성하기 위하여 다중체(예를 들면, 다이머화)를 형성하는 능력을 보유하는 단백질의 임의의 부위가 될 수 있다.

예시적인 타입 IIS 제한 효소들은 국제 공개WO 07/014275에 설명되어 있고, 이는 전문이 통합되어 있다. 추가적인 제한 효소들은 또한 분리가능한 결합 및 절단 도메인들을 포함하는데, 이것들도 본 내용에 의해 고려된다. 예를 들면, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.

특정 구체예들에서, 예를 들면, U.S. 특허 공개 Nos. 20050064474 및 20060188987 및 U.S. 출원 No. 11/805,850 (2007년 5월 23일자 제출됨)(이들 모두 전문이 참고문헌에 통합됨)에서 기재된 것과 같이, 절단 도메인은 호모다이머화를 최소화시키거나 또는 방해하는 하나 이상의 조작된 절단 하프-도메인 (또한 다이머 형성 도메인 돌연변이체로 지칭됨)을 포함한다. Fok I의 아미노산 잔기 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538은 모두 Fok I 절단 하프-도메인들의 다이머화에 영향을 주는 표적들이다.

불가피하게 헤테로다이머를 형성하도록 조작된 Fok I의 조작된 예시적인 절단 하프-도메인들은 제1 절단 하프-도메인에는 Fok I의 위치 490 및 538의 아미노산 잔기의 돌연변이가 있고, 제 2 절단 하프-도메인에는 아미노산 잔기 486 및 499에서 돌연변이가 있는 쌍을 포함한다.

따라서, 하나의 구체예에서, 위치 490에서 돌연변이는 Glu(E)를 Lys(K)으로 치환시키고; 위치 538에서 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)으로 치환시키고; 위치 486에서 돌연변이는 Gln(Q)를 Glu(E)으로 치환시키고; 위치 499에서 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)으로 치환시킨다. 특히, 여기에서 기재된 조작된 절단 하프-도메인들은 한 개의 절단 하프-도메인에서 위치 490 (E→K) 및 위치 538 (I→K) 돌연변이에 의해 조작된 절단 하프-도메인, "E490K:I538K"를 만들고, 또 다른 절반 하프-도메인에서 위치 486(Q→E) 및 위치 499 (I→L)에서 돌연변이에 의해, 조작된 절단 하프-도메인, "Q486E:I499L"을 만든다. 여기에서 기재된 조작된 절단 하프-도메인들은 비정상적인 절단이 최소화된 또는 사라진 불가피한 헤테로다이머 돌연변이체다. 예를 들면, 실시예 U.S. 가출원 No. 60/808,486 (2006년 5월 25일 제출됨)의 실시예 1 참고, 모든 목적을 위해 이의 전문이 참고문헌으로 통합됨.

여기에서 기재된 조작된 절단 하프-도메인들은 U.S. 특허 공개 No. 20050064474 (예를 들면, 실시예 5 참고); 및 WO 07/139898에서 기재된 것과 같이, 야생형 절단 하프-도메인들 (Fok I)의 위치-직접적인 돌연변이생성과 같은 임의의 적절한 방법에 의해 만들어질 수 있다.

대안으로, 뉴클레아제는 소위 "쪼개진(split)-효소" 기술(U.S. 특허 공개 No. 20090068164 참고)을 이용하여 생체내에서 핵산 표적 위치에서 어셈블리될 수 있다. 이와 같은 쪼개진 효소들의 성분들은 별개의 발현 구조체 상에서 발현되거나 또는 개별 성분들은 예를 들면, 자가절단 2A 펩타이드 또는 IRES 서열에 의해 분리되어 있는 하나의 오픈 리딩 프레임내에서 링크될 수 있다. 성분들은 개별 아연 핑거 결합 도메인이거나 또는 메가(mega)뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인들이 될 수 있다.

C. 표적화된 절단의 추가 방법

BAX 또는 BAK 유전자에서 표적 위치를 갖는 어떤 뉴클레아제는 본 명세서에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 호밍(homing) 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제는 아주 긴 인식 서열을 가지며, 그 서열들의 일부는 인간 크기의 게놈에서 한번 통계적 기준으로 존재할 것 같다. BAX 및/또는 BAK 유전자에서 독특한 표적 위치를 갖는 어떤 그와 같은 뉴클레아제는 이들 유전자에서 표적화된 절단을 위해 아연 핑거 뉴클레아제 대신에 또는 추가하여 사용될 수 있다.

예시적인 호밍 엔도뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII을 포함한다. 이들의 인식 서열은 공지되어 있다. 관련 참조, U.S. 특허 No. 5,420,032; U.S. 특허 No. 6,833,252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs catalogue.

대부분의 호밍 엔도뉴클레아제의 절단 특이성이 인식 부위에 대해 절대적인 것은 아니지만, 부위는, 최대 크기의 게놈에 대한 단일 절단 이벤트(event)가 인식 부위의 단일 복사물을 함유하는 세포에서 호밍 엔도뉴클레아제를 발현시켜서 얻을 수 있을 정도의 충분한 길이다. 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 특이성은 비천연 표적 위치를 결합하기 위해 조작될 수 있다는 것이 또한 보고되었다. 참조, 예를 들어, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66.

전달

본 명세서에 기재된 ZFN은 임의의 적당한 수단에 의해 표적 세포로 전달될 수 있다. 적당한 세포는 비제한적으로 진핵 및 원핵 세포 및/또는 세포주를 포함한다. 그와 같은 세포로부터 산출된 세포 또는 세포주의 비제한적인 예는 COS, CHO (예를 들어, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (예를 들어, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), 및 perC6 세포, 및 곤충 세포, 예컨대 스포도테라 푸기페르다(Spodoptera fugiperda, Sf), 또는 진균 세포, 예컨대 사카로미세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia) 및 쉬조사카로마이신(Schizosaccharomyces)을 포함한다. 특정 구체예에서, 세포주는 CHO-K1, MDCK 또는 HEK293 세포주이다.

아연 핑거를 포함하는 단백질을 전달하는 방법은 예를 들어 U.S. 특허 Nos. 6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824에 기재되어 있고, 이들 모두의 명세서의 그 전체가 참고로 본 명세서에 통합된다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 ZFN은 또한 하나 이상의 ZFN를 인코딩하는 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 전달될 수 있다. 어떤 벡터 시스템은 사용될 수 있고, 그 시스템은 비제한적으로, 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노(adeno) 관련 바이러스 벡터 등을 포함한다. 관련 참조, U.S. 특허 Nos. 6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824, 이는 그 전체로 참고로 본 명세서에 통합된다. 게다가, 이들 벡터의 어떤 것이 하나 이상의 ZFN 인코딩 서열을 포함할 수 있다는 것을 분명할 것이다. 따라서, 한 쌍 이상의 ZFN이 세포에 도입될 때, ZFN은 동일한 벡터 또는 상이한 벡터 상에 전달될 수 있다. 다중 벡터가 사용될 때, 각 벡터는 하나 또는 다중 ZFN을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.

종래의 바이러스 및 비(non)바이러스계 유전자 이식 방법은 세포 (예를 들어, 포유류 세포) 및 표적 조직에서, 조작된 ZFP을 인코딩하는 핵산을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 그와 같은 방법은 또한 ZFP을 인코딩하는 헥산을 실험실 내에서 세포에 투여하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, ZFP을 인코딩하는 헥산은 생체내 또는 실험실내 유전자 치료 용도를 위해 투여된다. 비(non)바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드(naked) 핵산, 및 리포솜 또는 폴록사머와 같은 전달 비클(vehicle)과 복합된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하고, 이는 세포에의 전달 후에 에피좀 또는 통합 게놈을 갖는다. 유전자 치료 절차의 검토를 위해, 참고 Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology 및 Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology 및 Immunology Doerfler 및 Boehm (eds.) (1995); 및 Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

조작된 ZFP를 인코딩하는 핵산의 비(non)바이러스성 전달의 방법은 전기천공법, 리포펙션(lipofection), 미세주입, 유전자총(biolistics), 바이로솜(virosome), 리포솜, 면역리포솜, 다양이온(polycation) 또는 지질:핵산 콘쥬게이트(conjugate), 네이키드(naked) DNA, 인공 바이리온(virion), 및 DNA의 제제 향상된 흡수를 포함한다. 예를 들어, Sonitron 2000 시스템 (Rich-Mar)를 사용하는 유전자치료법(Sonoporation)이 또한 핵산의 전달을 위해 사용될 수 있다.

추가적인 예시적인 핵산 전달 시스템은 하기에 의해 제공된 것들을 포함한다: Amaxa Biosystems (Cologne, Germany), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX 분자 전달 시스템 (Holliston, MA) 및 Copernicus Therapeutics Inc, (참조 예를 들어 US6008336). 리포펙션(lipofection)은 예를 들어, US 5,049,386, US 4,946,787; 및 US 4,897,355)에 기재되어 있고, 리포펙션(lipofection) 시약은 시판되고 있다 (예를 들어, Transfectam^TM 및 Lipofectin^TM). 폴리뉴클레오티드의 능률적인 수용체-인식 리포펙션(lipofection)에 적당한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024를 포함한다. 전달은 세포 (실험실내 투여) 또는 표적 조직 (생체내 투여)로 일 수 있다.

표적화된 리포솜, 예컨대 면역지질 복합체를 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에 공지되어 있다 (참조, 예를 들어, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); U.S. Pat. Nos. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787).

조작된 ZFP를 인코딩하는 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스계 시스템의 사용은 바이러스를 인체에서 특이 세포로 표적으로 삼고 바이러스 페이로드(payload)를 핵(nucleus)으로 트래피킹(trafficking)하기 위한 아주 발단된 공정을 이용한다. 바이러스 벡터는 환자 (생체내)에 직접 투여될 수 있고, 또는 실험실내에서 세포를 처리하기 위해 사용될 수 있고, 변형된 세포는 환자 (실험실내)에 투여된다. ZFP의 전달을 위한 종래의 바이러스계 시스템은, 비제한적으로, 유전자 이식을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연합 우두(vaccinia) 및 헤르페스 단순 바이러스 벡터를 포함한다. 숙주 게놈에서의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노 연합된 바이러스 유전자 이식 방법으로 가능하고, 이로써, 삽입된 전이유전자가 장기간 발현된다. 따라서, 높은 형질도입 능력은 많은 상이한 세포형 및 표적 조직에서 관찰되었다.

레트로바이러스의 향성(向性)은 이질적인 엔빌로프(envelope) 단백질을 편입시킴으로써 변경될 수 있고, 이는 표적 세포의 가능성 있는 표적 모집단을 확대한다. 렌티바이러스 벡터는 비분할성 세포을 형질도입하거나 감염시키고 전형적으로 높은 바이러스 적정농도를 생산할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 유전자 이식 시스템의 선택은 표적 조직에 의존한다. 레트로바이러스 벡터는 6-10 kb이하의 이질적인 서열에 대한 패키징 능력을 갖는 cis-작용 긴 말단 반복부로 구성된다. 최소 cis-작용 LTR는 벡터의 복제 및 패키징에 충분하고, 그 다음, 이 벡터는 영구적인 전이유전자 발현을 제공하기 위해 치료 유전자를 표적 세포에 통합하기 위해 사용된다. 널리 사용된 레트로바이러스 벡터는 생쥐(murine) 백혈병 바이러스 (MuLV), 긴팔원숭이(gibbon ape) 백혈병 바이러스 (GaLV), 유인원 면역결함 바이러스 (SIV), 인간 면역결함 바이러스 (HIV), 및 이들의 조합에 기초한 것들을 포함한다 (참조, 예를 들어, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).

ZFP 융합 단백질의 일시적인 발명이 바람직한 적용에서, 아데노바이러스계 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스계 벡터는 많은 세포형에서 아주높은 형질도입 능률이 가능하고, 세포분열을 필요로 하지 않는다. 그와 같은 벡터에 의해, 발현의 높은 적정농도 및 높은 레벨을 얻었다. 이 벡터는 비교적 간단한 시스템으로 다량으로 생산될 수 있다. 아데노 연합된 바이러스 ("AAV") 벡터는, 또한 예를 들어, 핵산 및 펩타이드의 실험실내 생산에서, 및 생체내 및 실험실내 유전자 치료 절차를 위해 표적 핵산으로 세포를 형질도입하기 위해 사용될 수 있다. (참조, 예를 들어, West et al., Virology 160:38-47 (1987); U.S. 특허 No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). 재조합 AAV 벡터의 제작은 하기를 포함하는 수많은 출원에 기재되어 있다: U.S. 특허 No. 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).

적어도 6개의 바이러스 벡터 접근방법은 임상실험에서 유전자 이식을 위해 현재 이용가능하고, 이 실험은 형질도입제를 산출하기 위해 헬퍼 세포주에 삽입된 유전자에 의한 불량 벡터의 보완을 수반하는 접근방법을 이용한다.

pLASN 및 MFG-S는 임상실험에 사용되었던 레트로바이러스 벡터의 예이다 (Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN는 유전자 치료 실험에 사용된 제1 치료 벡터였다 (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). 50% 이상의 형질도입 능력은 MFG-S 패키징된 벡터에 대해 관찰되었다 (Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997).

재조합 아데노 연합된 바이러스 벡터 (rAAV)는 불량 및 비병원성 파르보바이러스 아데노 연합 타입 2 바이러스를 기초로 한 유망한 대안적인 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 전이유전자 발현 카세트의 옆에 배치된 AAV 145 bp 말단 역반복부만을 유지하는 플라스미드로부터 유도된다. 형질도입된 세포의 게놈에의 통합에 기인한 능률적인 유전자 이식 및 안정된 전이유전자 전달은 이러한 벡터 시스템의 주요 특징이다 (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)).

복제 결함 재조합 아데노바이러스 벡터 (Ad)은 고적정농도로 생산될 수 있고, 수많은 상이한 세포 유형을 쉽게 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 조작되고, 이로써, 전이유전자는 Ad E1a, E1b, 및/또는 E3 유전자를 대체하고; 그 뒤에, 복제 불량 벡터는 트랜스(trans)로 결실된 유전자 기능을 공급하는 인간 293 세포에서 번식된다. Ad 벡터는 분화된 세포, 예컨대 간, 신장 및 근육에서 발견된 것을 미분열하는 것을 포함하는 다중 형태의 조직을 생체내에서 형질도입할 수 있다. 종래의 Ad 벡터는 큰 수용력을 갖는다. 임상실험에서의 Ad 벡터의 사용의 예는 근육내 주사에 의한 항종양 면역을 위한 폴리뉴클레오티드 치료를 수반했다(Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). 임상실험에서 유전자 이식을 위한 아데노바이러스 벡터의 유전자 이식의 사용의 예는 하기를 포함한다: Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998).

패키징(Packaging) 세포들을 이용하여 숙주세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자들을 만든다. 이와 같은 세포는 아데노바이러스를 포함하는 293 세포, 및 Ψ2 세포 또는 레트로바이러스를 포함하는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에 이용되는 바이러스 벡터들은 핵산 벡터를 바이러스성 입자안으로 패키징하는 생산자 세포주에 의해 일반적으로 만들어진다. 이들 벡터들은 일반적으로 패키징 및 숙주내로 후속적으로 통합하는데 요구되는 최소한의 바이러스성 서열만을 포함하고, 다른 바이러스성 서열은 발현되는 단백질을 인코딩하는 발현 카세트에 의해 대체된다. 상실된 바이러스성 기능들은 패키징 세포주에 의해 트랜스(trans)로 공급된다. 예를 들면, 유전자 치료법에 이용되는 AVV 벡터들은 AVV 게놈으로부터 일반적으로 패키징 및 숙주 게놈으로 통합하는데 필요한 역전된 말단 반복 (ITR) 서열만을 보유한다. 바이러스성 DNA는 세포주내에 패키징되고, 세포주는 다른 AAV 유전자들, 즉, rep 및 cap를 인코딩하나 ITR 서열들은 부족한 헬퍼 플라스미드를 포함한다. 이 세포주는 헬퍼인 아데노바이러스에 의해 또한 감염된다. 헬퍼 바이러스는 헬퍼 플라스미드로부터 AVV 유전자의 발현과 AVV 벡터의 복제를 촉진시킨다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열들이 부족하기 때문에 많은 양이 패키징되지는 않는다. AVV보다 아데노바이러스가 열처리에 더 민감하기 때문에 예를 들면, 열처리에 의해 아데노바이러스에 의한 오염을 줄일 수 있다.

많은 유전자 치료법 적용에서, 특정 세포 타입에 높은 특이성을 가진 유전자 치료법 벡터가 전달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 벡터는 바이러스의 세포 표면상에 바이러스 피복 단백질과의 융합 단백질로써 리간드를 발현시켜 주어진 세포 타입에 대해 특이성을 가지도록 변형될 수 있다. 이런 리간드는 관심대상의 세포 타입에 존재하는 것으로 알려진 수용체에 대한 친화성을 가지는 것이 선택된다. 예를 들면, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995)는 gp70에 융합된 인간 헤레굴린(heregulin)을 발현시키도록 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스를 변형시킬 수 있고, 재조합 바이러스는 인간 상피 성장인자 수용체를 발현시키는 특정 인간 유방 암세포를 감염시킨다고 보고하였다. 이 원리는 표적 세포가 수용체를 발현시키고, 바이러스는 세포-표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 기타 바이러스-표적 세포 쌍에까지 확장될 수 있다. 예를 들면, 필라멘트성 파아지는 가상의 임의 선택된 세포 수용체에 대한 특이적 결합 활성을 가지는 항체 단편들 (예를 들면, FAB 또는 Fv) 을 나타내도록 조작될 수 있다. 비록 상기 설명이 주로 바이러스 벡터들에 적용되지만, 동일한 원리는 비-바이러스 벡터들에도 적용될 수 있다. 이와 같은 벡터들은 특이적 표적 세포들에 의한 취입을 선호하는 특정 취입(uptake) 서열을 포함하도록 조작될 수 있다.

유전자 치료 벡터들은 개별 환자들에게 투여되어 생체로 전달될 수 있는데, 일반적으로 하기에서 설명되는 것과 같이, 전신 투여 (예를 들면, 정맥, 복막, 근육, 피하, 또는 두개골내 주입) 또는 국소 제공에 의해 전달된다. 대안으로, 벡터들은 개별 환자로부터 외식된(explant) 세포(예를 들면, 임파세포, 골수 흡입물, 조직 생검) 또는 보편적 도너 조혈 줄기 세포와 같은 세포로 생체외에서(ex vivo) 전달되고, 벡터가 통합된 세포를 선별한 후에, 이 세포들을 환자에게 재이식한다.

진단, 연구 또는 유전자 치료용 생체외 세포 형질감염 (예를 들면, 숙주 유기체로 형질감염된 세포들의 재-주입을 통하여)은 본 기술분야의 당업자에 잘 알려져 있다. 바람직하나의 구체예에서, ZFP 핵산 (유전자 또는 cDNA)으로 형질감염된 대상 유기체로부터 세포들을 분리시키고, 대상 유기체 (예를 들면, 환자)로 다시 재주입시킨다. 생체외 형질감염에 적절한 다양한 세포 타입들이 본 기술 분야에 업자들에게 잘 알려져 있다 (예를 들면, Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (제3판, 1994)) 참고, 환자로부터 세포를 어떻게 분리하고, 세포를 배양시키는지에 대한 논의를 위하여 여기에 언급된 참고문헌들 참고).

하나의 구체예에서, 줄기 세포들은 세포 형질감염 및 유전자 치료를 위한 생체외 과정에 이용된다. 줄기 세포를 이용하는데 있어서 장점은 이들 줄기 세포들은 시험관에서 다른 세포 타입으로 분화될 수 있고, 또는 포유류 (가령, 세포의 도너) 내로 도입되었을 때, 골수에 접합될 수 있다는 것이다. 시험관에서 GM-CSF, IFN-γ그리고 TNF-α와 같은 사이토킨들을 이용하여 CD34+ 세포들을 임상학적으로 중요한 면역세포 타입으로 분화시키는 방법은 공지된 것이다 (Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992) 참고).

공지된 방법들을 이용하여 형질도입 및 분화를 위하여 줄기세포들을 분리한다. 예를 들면, 줄기 세포들은 CD4+ 및 CD8+ (T 세포들), CD45+ (panB 세포), GR-1 (과립구), 및 Iad (분화된 항원 제공 세포들)와 같은 원하지 않는 세포에 결합하는 항체로 패닝(panning) 시켜 골수 세포들로부터 분리된다(Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992) 참고).

치료용 ZFP 핵산들을 포함하는 벡터들 (예를 들면, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포좀 등)은 또한 생체내에서 세포의 형질도입을 위하여 유기체에 직접 투여될 수도 있다. 대안으로, 네이키드(naked) DNA가 투여될 수도 있다. 분자를 혈액 또는 조직 세포와 궁극적으로 접촉되도록 하기 위하여 통상적으로 이용되는 임의의 경로, 주사, 주입, 국소 제공 및 전기천공법을 포함하나 이에 한정되지 않는 경로에 의해 투여된다. 이와 같은 핵산을 투여하기 위한 적합한 방법들이 이용가능하며, 본 기술분야에 당업자에게 잘 알려져 있으며, 특정 조성물을 투여하기 위하여 하나 이상의 투여 경로가 이용될 수도 있지만, 특정한 경로는 다른 경로보다 좀더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.

DNA를 조혈 줄기세포 내로 도입시키는 방법등은 예를 들면, U.S. 특허 No. 5,928,638에서 설명되어 있다. 조혈 줄기 세포, 예를 들면, CD34⁺ 세포 내로 전이유전자를 도입시키는데 유익한 벡터들은 아데노바이러스 타입 Type 35을 포함한다.

면역 세포들(예를 들면, T-세포들)내로 전이유전자를 도입시키는데 유익한 벡터들은 비-통합 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 예를 들면, Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222 참고.

약제학적으로 허용가능한 담체들은 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라 조성물을 투여하는데 이용되는 특정 방법들에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 하기에서 기재된 것과 같이 이용가능한 약학 조성물의 적절한 제형은 광범위하다 (예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989참고).

상기에서 나타낸 것과 같이, 설명된 방법들 및 조성물은 원핵 세포들, 곰팡이 세포들, 고세균(Archaeal) 세포들, 식물 세포들, 곤충 세포들, 동물 세포들, 척추동물 세포들, 포유류 세포들 및 인간 세포들을 포함하나 이에 한정되지 않은 임의의 타입의 세포에 이용될 수 있다. 단백질 발현에 적합한 세포주는 본 기술 분야의 업자들에게 공지의 것이며, COS, CHO (예를 들면, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (예를 들면, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), perC6, 스포도프테라 푸기페르다(Spodoptera fugiperda) (Sf)와 같은 곤충 세포들, 및 사카로미세스(Saccharomyces), 피스키아(Pischia) 및 쉬조사카로미세스( Schizosaccharomyces) 와 같은 곰팡이 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이들 세포주들의 후손, 변이체 및 유도체들 또한 이용될 수 있다.

키트

여기에서 기재된 임의의 조성물을 포함하는 또는 여기에서 기재된 임의의 방법들을 실행하기 위한 키트들이 제공된다. 키트는 일반적으로 Bak 또는 Bax내 표적 위치에 결합하는 하나 이상의 아연 핑거 단백질들 (예를 들면, 아연 핑거 뉴클레아제)을 포함한다. 따라서, BAK 및/또는 BAX 녹아웃 세포주를 만들기 위한 키트가 제공된다. 키트는 또한 세포의 형질변환, 세포의 배양 배지 및/또는 분석을 실행하기 위한 완충액도 포함할 수 있다. 일반적으로, 키트는 또한 지시사항, 패키징 또는 광고 전단이 부착되거나 또는 키트의 다른 성분들과 함께 제공되는 라벨을 포함한다.

적용

설명된 방법들 및 조성물은 BAX 및/또는 BAK 게놈 서열의 비활성화에 이용될 수 있다. 상기에서 명시된 바와 같이, 비활성화는 세포 내에서 Bax 및/또는 Bak 유전자 발현을 부분적으로 또는 완벽하게 억제시키는 것을 포함한다. Bax- 및/또는 Bak 결함 세포주들 (예를 들면, 이중 Bax/Bak 녹아웃 세포주들)은 여기에서 기재된 것과 같이 만들어질 수 있다. Bak 및/또는 Bax의 비활성화는 예를 들면, 단일 절단 과정, 절단후 비-동일성 말단 결합에 의해, 두 위치에서 절단후, 두 개 절단 위치 사이에 서열을 제거하기 위한 결합에 의해, 코딩 부위으로 미스센스 또는 넌센스 코돈의 표적화된 재조합에 의해, 유전자 또는 조절 부위를 파괴시키기 위하여 무관한 서열 (예, 독촉("stuffer") 서열)을 유전자 또는 이의 조절 부위으로 표적화된 재조합에 의해, 유전자 또는 조절 부위를 파괴시키기 위하여 관심 서열을 인코딩하는 외인성 핵산 서열의 표적화된 재조합에 의해, 또는 전사체의 잘못된 접합(splicing)을 일으키기 위하여 인트론내로 접합 수용 서열의 표적화된 재조합에 의해 수득될 수 있다.

Bax 및/또는 Bak의 ZFN 매개된 비활성화(녹아웃)를 위한 다양한 응용법이 있다. 예를 들면, 여기에서 기재된 것과 같이 생성된 Bax 및/또는 BAK에 결함이 있는 세포주는 세포자멸에 저항성이며, 관심의 외인성 단백질들을 배양물에서 발현시킬 때, Bax 및/또는 Bak에 결함이 없는 세포주들보다 더 오래 성장하고 건강하게 유지된다. 따라서, 여기에서 기재된 것과 같이 Bax/Bak 결함 세포주들은 하나 이상의 관심 단백질 (예를 들면, 항체들, 항원들, 치료 단백질들) 및/또는 재조합 바이러스 벡터들(예, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노 연합된 바이러스성 (AAV) 벡터의 장기적이고 효과적인 생산에 이용될 수 있다. 추가로, 다른 세포자멸 관련된 유전자들의 파괴는 단독으로 또는 복합적으로든 세포자멸을 예방하는데 효과적이라는 것을 증명할 수 있다. 특히, 세포자멸 촉진 단백질들 (예, Bik, Bim, Bad 등)의 BH3- 유일한 패밀리 요소들이 유전자 파괴 및/또는 녹아웃의 표적이 될 수 있다.

추가로, 여기에서 설명되는 Bax 및/또는 BAK 결함 세포주들은 완전한 바이러스 및/또는 아단위 백신 생산에 유용하다. 예를 들면, 인플루엔자 감염된 세포주는 명백한 세포자멸 증거를 보인다는 것은 알려진 사실이다. 따라서, 본 발명의 Bax 및/또는 Bak 결함 세포주들을 인플루엔자 백신과 같은 바이러스성 백신의 좀더 효과적이고 장기적인 생산에 이용할 수 있다. 인플루인자 감염에 민감하지 않는 종, MDCK 세포와 같은 개의 세포에서 인플루엔자 백신 생산이 특히 바람직하다. 숙주세포 세포자멸은 백신 산물에 생산 세포의 성분들로 오염 가능성을 초래한다는 것은 알려진 사실이다. 이와 같은 오염은 인간에게 방출하고 사용하기 위하여 필수적인 순도 및 품질을 갖추어야 하는 산물 로트의 기능 부전을 초래할 수 있다. Bax 및/또는 BAK 결함 세포주들을 이용함으로써 세포자멸의 예방을 통하여 오염을 감소시키면 생산성 및 효율을 모두 얻을 수 있다.

실시예

실시예 1: BAX - 및 BAK -ZFN의 디자인 및 제작

아연 핑거 단백질들은 BAX 및 BAK에서 표적 위치들을 인식하도록 디자인되었다. 예시적인 디자인들은 표 1과 2에 나타내고 있다.

ZFN의 적절한 쌍을 인코딩하는 서열들을 포함하는 플라스미드들은 Urnov et al. (2005) Nature 435(7042):646-651에서 기재된 것과 같이 기본적으로 만들어졌다. 또한, U.S. 특허 공개 No. 20080015164 및 WO 2007/139982도 참고.

실시예 2: 유전자타입 분석

다양한 세포 타입에서 BAK- 및 BAX 비활성화된 클론들이 만들어졌고, 유전자 수준에서 분석되었다.

A. CHO 세포들

ZFNs 11205 및 10350을 인코딩하는 플라스미드는 CHO K1 세포들에게 형질감염되었다. CHO K1 세포들은 American Type Culture Collection로부터 구하였고, 추천한 바와 같이, 적합한 품질의10% 태아 송아지 혈청(FCS, Cyclone)이 보충된 F-12 배지(Invitrogen)에서 성장시켰다. TrypLE Select^TM프로테아제(Invitrogen)를 이용하여 플라스틱 용기로부터 세포들을 떼어놓았다. 형질감염을 위하여, 백만개의 CHO K1 세포들을 2㎍의 아연-핑거 뉴클레아제 플라스미드와100㎕ Amaxa Solution T와 혼합하였다. 세포들은 Amaxa Nucleofector II^TM에서 프로그램U-23를 이용하여 형질감염되었고, 1.4mL 따뜻한 F-12 배지 + 10% FCS로 회수되었다.

게놈 DNA는 수거되고, BAK 위치 부위는 올리고 GJC 39F (5'-tcaagaggtttcatggcgag-3')(서열식별번호:25) 및 GJC 38R (5'-ttctctctcttgtgcttatgg-3')(서열식별번호:26)를 이용하여 PCR 증폭되었다. InVitrogen의 Accuprime HiFi 폴리머라제를 이용한 PCR은 다음과 같다: 94℃에서 처음 3분간 변성 후, 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐닝 단계에 이어서, 68℃에서 30초간 연장 단계로 된 PCR을 30회 실시하였다. 30 회를 끝낸 후, 반응물은 68℃에서 7분간 항온처리시킨 후, 그 다음 10℃에서 무기한(indefinitely) 항온처리시켰다.

PCR 산물들은 겔 정제시키고, 서열화시키고, 두 개의 대립유전자는 회수되었다. 두 가지 예시적인 클론의 부분적인 BAK 유전자형 (결실부분들)은 도 1에 나타낸다. 이들 클론에서, ZFN들은 야생형 출발 위치를 포함한 결실을 도입시켰다. 대립유전자들은 A와 B로 표시하였다.

서열화된 두 개의 클론에 있어서, BAK의 대립유전자들 모두 변형되었다. 클론 8H-6은 이형접합체 화합물 (대립유전자 A는 대립유전자 B보다 더 큰 결실을 가진다)이었고, 클론 8D-4는 동일접합체였다. 도 1 참고.

B. MDCK 세포들

BAK- 및 BAX 표적화된 ZFN들은 CHO 세포들에 대해서 설명된 것과 같이, Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 세포에서 테스트되었는데, 단, BAK (개의 BAK 유전자에서 표적 위치들을 인식함)의 경우에는 ZFN 17622 및 17623이 이용되었고, BAX (개의 BAX 유전자에서 표적 위치들을 인식)에 대해서는 ZFN 17658 및 17659이 이용되었다.

MDCK BAK- 및 BAX-ZFN 처리된 세포들은 또한 예를 들면, U.S. 특허 공개 Nos. 20080015164; 20080131962 및 20080159996에서 기재된 것과 같이, Surveyor^TM 뉴클레아제 (Transgenomic)로 검사되었다. ZFN 17622/17623 및 ZFN 17627/17626 으로 처리된 MDCK 세포들은 BAK 대립유전자에서 차례로 3.7% 및 1.1% 붕괴를 나타내었다 (도 2a). ZFN 17658 및 17659으로 처리된 MDCK 세포들은 BAX 대립유전자에서 8.0% 붕괴를 나타내었다 (도 2b).

게놈 DNA는 수거되었고, BAK 유전자 위치의 일부분은 올리고 YS 13F (5'-ctcctttcacagagatgcag-3')(서열식별번호:70) 및 YS 14R (5'-caggagagacagagtggtca-3')(서열식별번호:71)을 이용하여 PCR 증폭되었다. 게놈 DNA는 수거되었고, BAX 유전자 위치의 일부분은 올리고 YS 21F (5'-aaaaagactgcagtggcgca-3')(서열식별번호:72) 및 YS 22R (5'-tcacccagaggtcaatggat-3')(서열식별번호:73) 을 이용하여 PCR증폭되었다. BAK 및 BAX (야생형 및 BAK--결실된 클론 모두에서)의 PCR 증폭체들은 클론되었고, 서열화되었다.

도 2c에서 볼 수 있는 것과 같이, 다양한 BAK 특이적 ZFN 처리된 클론들의 분석에서 ZFN 처리된 MDCK 클론들은 하나의 또는 BAK 대립유전자들 두 가지 모두에서 붕괴를 가지고 있는 것으로 나타났다. 유사하게, 도 2d에서는 BAX 특이적 ZFN으로 처리된 MDCK 세포의 PCR 분석을 나타내고, 한 대립유전자상에서는 30bp의 결실을 가지고, 또 다른 대립 유전자상에서는 1bp의 삽입을 가지고 있는 BAX 단일 녹아웃들이 수득되었다는 것을 보여준다. BAX/BAK 이중 녹아웃의 경우, BAX 대립유전자들은 BAX 특이적 ZFN들을 이용하여 Bak 결함 클론에서 표적화되었다. 볼 수 있는 바와 같이, 하나의 와일드 타입 BAX 대립유전자, 및 하나의 돌연변이된 BAX 대립유전자를 포함하는 몇 가지 이형접합체 클론들이 확인되었다.

실시예 3: Bak 결실 클론들의 RNA 분석

실시예 2에서 기재된 바와 같이, BAK 비활성화된 CHO 세포 클론들로부터 BAK 전사체들이 또한 분석되었다.

야생형 CHO-KI 세포들 및 BAK 결실 클론들로부터 High Pure RNA Isolation Kit(Roche Applied Science)를 이용하여 제조업자의 권고에 따라 RNA를 정제하였다. 2.5㎍의 전체 RNA가 다음과 같이 역전사 반응에 이용되었다: 500ng oligo(dT)는 RNA와 혼합되고, 1㎕의 10mM dNTP 혼합물과 혼합되었다. 물을 최종 용적이 20㎕가 되도록 첨가하였다. 혼합물은 65℃까지 가열시키고, 얼음위에서 냉각시키고, 4㎕ 5X 제1 가닥(First-strand) 완충액 (Invitrogen) 및 0.1M DTT을 보충하였다. 혼합물은 2분간 42℃에서 항온처리되었다. 1㎕의 Superscript II reverse transcriptase®(InVitrogen) 가 반응물에 첨가되었고, 반응물은 50분간 42℃에서 항온처리되었다. 역전사 반응은 15분간 70℃에서 항온처리시킴으로써 중단되었다. 1㎕ 의 생성된 cDNA는 다음과 같이 InVitrogen사의 Accuprime^TM HiFi 폴리머라제를 이용한 PCR 반응에 이용되었다: 94℃에서 처음 3분 변성시킨 후, 94℃에서 30초간 변성 단계, 이어서 60℃에서 30초간 어닐링 단계, 이어서 68℃에서 30초간 연장 단계의 PCR 사이클을 25회 실행한다. 30회의 사이클의 완료 후, 반응물은 7분간 68℃에서 항온처리되고, 그 다음 10℃에서 무기한 항온처리된다. BAK의 올리고뉴클레오티드들은 GJC 24F (5'-catctcacatctggaccacagccg-3')(서열식별번호:27) 및 GJC 25R (5'-ctggaactctgtgtcgtatctccgg-3')(서열식별번호:28)이며; BAX 의 올리고뉴클레오티드들은 GJC 12F (5'-cttcttccgggtggcagctg-3')(서열식별번호:29) 및 GJC 23R (5'-cccgaagtatgagaggaggccatc-3')(서열식별번호:30)이었다.

도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 클론 8H6 (화합물 이형접합체클론)로부터 형성된 전사체는 이 클론이 엑손 2를 건너뛴다는 것을 보여준다. 추가로, 예상된 것과 같이, BAK 결실은 BAX의 접합(splicing)에는 효과가 없었다.

실시예 4: BAK / BAX 이중 녹아웃 세포주들의 생성 및 분석

BAK 및 BAX 모두가 비활성화된 세포주들이 만들어졌다. 특히, BAX를 향한 아연 핑거 뉴클레아제들이 디자인되었고, 상기에서 기재된 것과 같이 제작되었다. 실시예 2와 3에서 기재된 것과 같이, Bak 결함 CHO 세포들내에서 BAX 디자인들을 인코딩하는 플라스미드들은 표 1에 나타내었다.

BAX PCR 산물들을 ZFN 절단 위치에서 돌연변이를 탐지하는 Bsl I으로 절단시켜, BAX 비활성화에 대해 세포들을 테스트하였다. 각 클론에서 약 25,000개의 세포들을 100㎕ QuickExtract^TM 용액 (Epicentre)에 용해시키고, 생성된 정제안된 용해물의 1㎕를 다음과 같이 InVitrogen사의 Accuprime^TM HiFi 폴리머라제를 이용한 PCR 반응에 이용되었다: 94℃에서 처음 3분 변성시킨 후, 94℃에서 30초간 변성 단계, 이어서 60℃에서 30초간 어닐링 단계, 이어서 68℃에서 30초간 연장 단계의 PCR사이클을 35회 실행한다. 30회의 사이클의 완료 후, 반응물은 7분간 68℃에서 항온처리되고, 그 다음 10℃에서 무기한 항온처리된다. BAX 붕괴 클론들을 스크리닝하기 위한 올리고뉴클레오티드들은 GJC 52F (5'-cagaggaatgaaagcaaagg-3')(서열식별번호:31) 및 GJC 114R (5'-tgaaccaggctgggagattt-3')(서열식별번호:32)이다. PCR 반응물에 0.1㎕ Bsl I (New England Biolabs) 와 0.1㎕ 10mg/mL BSA 및 0.1㎕ 10X Buffer #4 (New England Biolabs)가 첨가되었다. 55℃에서 3시간 동안 절단(digestion)이 진행되었고, 그 다음 절단 산물들은 1% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석되었다.

도4에서 볼 수 있는 것과 같이, BAK ^-/- BAX-형질감염된 클론들중 21개가 예측된 BAX 붕괴를 포함하였다.

BAK/BAX 이중 녹아웃 클론들은 또한 Bax 및 Bak 단백질들의 발현에 대해서도 테스트되었다. 100㎕ RIPA 완충액 (Sigma)+ 프로테아제 저해제 (Complete Mini tablets, Roche Applied Science)에 재현탁시키고, 1시간 동안 얼음위에서 항온처리시켜 백만개의 BAX ^- /BAK ^-/- 세포들로부터 용해물을 준비하였다. 용해물은 10분간 14,000rpm에서 원심분리되고, 10㎕의 상청액은 웨스턴(Western) 블랏에 이용되었다. 클론으로부터 단백질 추출물들은 항-Bax 항체 (Abcam 및 항-Bak 항체 (Sigma))로 프로브되었다. 도 5에서 볼 수 있는 것과 같이, BAX ^- /BAK ^-/- 이중 녹아웃 세포들은 전장 또는 절두된 Bax 또는 Bak 단백질들을 발현시키지 않았다.

실시예 5: BAX ^- / BAK ^-/- 이중 녹아웃 세포주에서 세포자멸은 저지된다

스타우로스포린 유도된 세포자멸에 대하여 BAX ^- /BAK ^-/- 이중 녹아웃 세포주들의 저항성을 테스트하였다.

간단하게, 세 가지 상이한 BAX ^- /BAK ^-/- -녹아웃 세포주 (#47, 71, 97)에서 25000개의 세포 및 25000개의 야생형 CHO-KI 세포들로부터 25000개의 세포를 96-웰 배양접시상에 F-12 배지+10% 태아 소 혈청상에 접종하였다. 12시간의 성장후, 세포들은 37℃에서 6시간 동안 1μM 스타우로스포린 (Sigma, S-4400)에 노출되었다. Homogenous Caspase Assay Kit(Roche Applied Science)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 카스파제(세포자멸 동안 유일하게 활성인 상태의 프로테아제이며, 미토콘드리아로부터 사이토크롬 C의 Bak- 및 Bax 매개된 방출에 의해 활성화됨) 활성화를 측정하였다. 분석 시작 후 2.5시간에 데이터가 기록되었다. 세포 접종 밀도에서 작은 변수를 교정하기 위하여, 카스파제 활성은 CytoTox-One^TMKit (Promega)를 이용하여 LDH-A 효소 활성(세포수의 대체)을 이용하여 표준화시켰다.

도 6에서 볼 수 있는 것과 같이, BAX ^- /BAK ^-/- 세포주들에서 세포자멸은 탐지되지 않았다.

이와 같은 결과들은 조작된 뉴클레아제를 이용하여 세포자멸 저항성 Bax- 및 Bak 결함 세포주들이 신속하게 만들어진다는 것을 보여준다. 절단 위치에서 NHEJ 의 오류-가능성(error-prone process) 프로세스를 통한 부적절한 DNA 복구는 기능적으로 유해한 돌연변이를 초래하였다. NHEJ 유도된 돌연변이들이 통상의 유전자 붕괴에 의해 만들어진 것에 비하여 작지만, BAK 및 BAX의 선택된 주요 부위로 이들 돌연변이들을 표적화시키는 조작된 뉴클레아제(ZFN)의 능력은 비록 작지만, 틀내(in-frame)의 결실이 비활성화를 확실하게 초래할 수 있도록 하였다.

더욱이, CHO 세포주의 필요에 따라 만든 유전적 또는 표현형적 변화들을 가지는 상이한 많은 아류형이 존재하지만, 여기에서 설명되는 ZFN들은 임의의 세포주 또는 아류형에서 BAX 및/또는 BAK를 신속하게 붕괴시키는데 이용될 수 있다. 추가로, 아연 핑거 단백질 결합 위치들은 포유류 종들에서 보존된 것으로 선별될 수 있기 때문에, 임의의 종으로부터 유도된 세포들에서 BAX 및 BAK를 비활성화시키도록 ZFN을 디자인할 수 있다.

실시예 6: BAX ^- / BAK ^-/- 이중 녹아웃 세포주들에서 재조합 단백질의 생산이 증가한다

야생형 CHO-KI 세포들 및 BAX ^- BAK ^-/- 클론 8H6-71로부터 단백질 생산이 분석되었다 (도 5 참고). 야생형 및 녹아웃 세포주들은 모두 IgG 중쇄 및 경쇄 유전자, 및 퓨로마이신 저항성 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질감염되었다. 8㎍/mL 퓨로마이신으로 세포들이 선별되었고, 퓨로마이신 저항성 모음의 배양 상청액은 2.5주 동안 2일 주기로 표본채취되었다. 이 실험 동안 세포에서 영양적인 기아와 배양 성장에서 후에 세포자멸을 유도하기 위하여 독성 대사물질 축적이 일어나도록, 세포에는 영양소가 공급되지 않았다.

4-8일 시점에 두 배양물에서 IgG 수준은 유사하였다. 그러나, 12-17일 시점에서, 이중-녹아웃 배양물의 IgG 수준은 야생형 CHO 세포 배양물의 수준보다 2-5배 더 높았다 (도 7).

여기에서 언급된 모든 특허, 특허 출원들 및 공개물은 이들 전문이 참고문헌에 통합된다.

이해를 목적으로 하는 실시예와 설명을 위하여 어느 정도 상세하게 제공되었지만, 개시된 내용의 범위 또는 사상으로부터 벗어나지 않고 다양한 변화 및 수정이 실시될 수 있다는 것은 본 기술분야의 업자들에게 자명할 것이다. 따라서, 상기 설명 및 실시예들로 한정되어서는 안 된다.

SEQUENCE LISTING <110> SANGAMO BIOSCIENCES, INC. COLLINGWOOD, Trevor GREGORY, Philip D. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR GENERATION OF BAX- AND BAK-DEFICIENT CELL LINES <130> 8325-0062.40 <140> PCT/US2009/003484 <141> 2009-06-10 <150> US 61/131,579 <151> 2008-06-10 <150> US 61/133,792 <151> 2008-07-02 <160> 94 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAX <400> 1 Arg Ser Asp His Leu Ser Thr 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAX <400> 2 Asp Arg Ser His Leu Ala Arg 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAK/BAX <400> 3 Gln Ser Ser His Leu Thr Arg 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAX <400> 4 Arg Ser Asp Asn Leu Arg Glu 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease 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Glu Lys Pro 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker sequence <400> 19 Thr Gly Gln Lys Pro 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic linker sequence <400> 20 Thr Gly Ser Gln Lys Pro 1 5 <210> 21 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: SBS 10077 <400> 21 cagggtggct gg 12 <210> 22 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: SBS 10079 <400> 22 gatccagaca ag 12 <210> 23 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: SBS 11205 <400> 23 ggaggaaagg ggtgg 15 <210> 24 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: SBS 10350 <400> 24 gtggcggccc tg 12 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: GJC 39F <400> 25 tcaagaggtt tcatggcgag 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: GJC 38R <400> 26 ttctctctct tgtgcttatg g 21 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: GJC 24F <400> 27 catctcacat ctggaccaca gccg 24 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: GJC 25R <400> 28 ctggaactct gtgtcgtatc tccgg 25 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: GJC 12F <400> 29 cttcttccgg gtggcagctg 20 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: GJC 23R <400> 30 cccgaagtat gagaggaggc catc 24 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: GJC 52F <400> 31 cagaggaatg aaagcaaagg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: GJC 114R <400> 32 tgaaccaggc tgggagattt 20 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: SBS 14238 <400> 33 tttcaggcct tggttggc 18 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAK <400> 34 Asp Arg Ser His Leu Ser Arg 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAK <400> 35 Thr Ser Gly Ser Leu Thr Arg 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAK <400> 36 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Glu 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAK <400> 37 His Ser Asn Ala Arg Lys Thr 1 5 <210> 38 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: SBS 10526 <400> 38 cgtctggaca ag 12 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAK <400> 39 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Val 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc 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Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAX <400> 47 Asp Arg Ser Ala Arg Thr Arg 1 5 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAX <400> 48 Arg Ser Asp Ala Leu Ser Val 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAX <400> 49 Asp Ser Ser His Arg Thr Arg 1 5 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAK/BAX <400> 50 Gln Asn Ala His Arg Lys Thr 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAX <400> 51 Thr Ser Gly His Leu Ser Arg 1 5 <210> 52 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: SBS 17622 <400> 52 aatgatgcag catga 15 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAK <400> 53 Gln Ser Gly Asp Leu 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nuclease targeted to BAK <400> 60 Arg Asn Asp Asp Arg Ile Thr 1 5 <210> 61 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: SBS 17627 <400> 61 aggggtggct gggtag 16 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAK <400> 62 Arg Ser Asp Asn Leu Thr Thr 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAK <400> 63 Arg Ser Asp His Leu Ser Arg 1 5 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAK <400> 64 Gln Ser Ser Asp Leu Arg Arg 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAK <400> 65 Arg Ser Asp His Leu Thr Gln 1 5 <210> 66 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: SBS 17626 <400> 66 gatccaccgg gcaatgca 18 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAK <400> 67 Gln Ser Gly Ser Leu Thr Arg 1 5 <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAK <400> 68 Asp Arg Ser His Leu Thr Arg 1 5 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger nuclease targeted to BAK <400> 69 Arg Ser Asp Asp Arg Lys Thr 1 5 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: YS 13F <400> 70 ctcctttcac agagatgcag 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: YS 14R <400> 71 caggagagac agagtggtca 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: YS 21F <400> 72 aaaaagactg cagtggcgca 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: YS 22R <400> 73 tcacccagag gtcaatggat 20 <210> 74 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide: linker sequence <400> 74 Thr Gly Gly Gln Arg Pro 1 5 <210> 75 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 1: 39F\38R <400> 75 cagtgctgcc aaccaaggcc tgaaagatgg cgtctggaca aggacc 46 <210> 76 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 1: Bak 8H6-1/Bak 8H6-3 <400> 76 cagtgctgga caaggacc 18 <210> 77 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 1: Bak 8H6-2/Bak 8H6-4 <400> 77 cagtgctgcc aaccaaggcc catctggaca aggacc 36 <210> 78 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 1: Bak 8D4-1 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <400> 78 cagtgntgcc aaccaaggac aaggacc 27 <210> 79 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 1: Bak 8D4-2/Bak 8D4-3/Bak 8D4-4 <400> 79 cagtgctgcc aaccaaggac aaggacc 27 <210> 80 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 4B: 52F114R <400> 80 tggacactgg acttcctccg agagcggctg cttgtctgga tccaagacca gggtggctgg 60 gtgagacccc ttagtccttg tcacacttta gactagtggt tctcaaactt c 111 <210> 81 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 4B: 11, 18, 22, 28, 50, and 91 <400> 81 tggacactgg acttcctccg agagcggctg cttgtctgga tccaagaaag accagggtgg 60 ctgggtgaga ccccttagtc cttgtcacac tttagactag tggttctcaa acttc 115 <210> 82 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 4B: 13 <400> 82 tggacactgg acttcctccg agagcggctg cttgtctgga tccaagaacc agggtggctg 60 ggtgagaccc cttagtcctt gtcacacttt agactagtgg ttctcaaact tc 112 <210> 83 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 4B: 30 <400> 83 tggacactgg acttcctccg agagcggctg cttgtctgga ttgacgcaga taaaattcca 60 tttcatccct actatactat taaagaccta ctaggagcct tcatgcta 108 <210> 84 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 4B: 35 <400> 84 tggacactgg acttcctccg agagcggctg cttgtctgga tccaagagac tctgctggcg 60 ctctaccttg tccctcatgt tctgtgtggc tttagggaag aaccctttat 110 <210> 85 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 4B: 40, 87 <400> 85 tggacactgg acttcctccg agagcggctg cttgtctgga tccagggtgg ctgggtgaga 60 ccccttagtc cttgtcacac tttagactag tggttctcaa acttc 105 <210> 86 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 4B: 46 <400> 86 ggtgagctgg gtgagacccc ttagtccttg tcacacttta gactagtggt tctcaaactt 60 c 61 <210> 87 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 4B: 47 <400> 87 tggacactgg acttcctccg agagcggctg cttgtctgga tccagactag tggttctcaa 60 acttc 65 <210> 88 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 4B: 57 <400> 88 tggacactgg acttcctccg agagcggctg cttgtctgga tccaagaaga ccagggtggc 60 tgggtgagac cccttagtcc ttgtcacact ttagactagt ggttctcaaa cttc 114 <210> 89 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 4B: 71 <400> 89 tggacactgg acttcctccg agagcggctg cttgtcaaac ttc 43 <210> 90 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 4B: 72 <400> 90 tggacactgg acttcctccg agagcggctg cttgtctgga tccatgaggg cagagtatct 60 acagaaatat ttgtaatctt tctactgata atactcatct cttcctaact catg 114 <210> 91 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 4B: 93 <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (91)..(91) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (96)..(96) <223> n is a, c, g, or t <400> 91 tggacactgg acttcctccg agagcggctg cttgtctgga tccaagacca nggtggctgg 60 gtgagacccc ttantccttg tcacacttta nactantggt tctcaaactt c 111 <210> 92 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 4B: 97 <400> 92 tggacactgg acttcctcc 19 <210> 93 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 4B: 106 <400> 93 tggacactgg acttcctccg agagcggctg cttgtctgag accccttagt ccttgtcaca 60 ctttagacta gtggttctca aacttc 86 <210> 94 <211> 113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence from Fig. 4B: 108 <400> 94 acactggact tcctccgaga gcggctgctt gtctggatcc aagataagac cagggtggct 60 gggtgagacc ccttagtcct tgtcacactt tagactagtg gttctcaaac ttc 113

Claims

BAK 유전자 내의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 아연 핑거 단백질로서, DNA-결합 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 4개의 아연 핑거 도메인을 가진 단백질에 대하여 F1 내지 F4, 5개의 아연 핑거 도메인을 가진 단백질에 대하여 F1 내지 F5 및 6개의 아연 핑거 도메인을 가진 단백질에 대하여 F1 내지 F6의 순서의 4개, 5개 또는 6개의 아연 핑거 인식 부위를 포함하고, 상기 아연 핑거 단백질은 하기 아미노산 서열을 상기 아연 핑거 인식 부위 내에 가진 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 아연 핑거 단백질:
(i) F1: RSDHLTT (SEQ ID NO: 9);
F2: RSDHLSE (SEQ ID NO:10);
F3: RNDNRKT (SEQ ID NO:11);
F4: QSGHLQR(SEQ ID NO:12); 및
F5: QSGHLSR (SEQ ID NO:13); 이때 상기 단백질은 SEQ ID NO: 23으로 나타내는 표적 부위에 결합하고;
(ii) F1: RSDSLSA (SEQ ID NO:14);
F2: DRSSRTK (SEQ ID NO:15);
F3: RSDDLTR (SEQ ID NO:16); 및
F4: RSDALAR (SEQ ID NO:17); 이때 상기 단백질은 SEQ ID NO: 24로 나타내는 표적 부위에 결합하고;
(iii) F1: DRSHLSR (SEQ ID NO:34);
F2: TSGSLTR (SEQ ID NO:35);
F3: RSDSLSA (SEQ ID NO:14);
F4: DRSSRTK (SEQ ID NO:15);
F5: RSDNLSE (SEQ ID NO:36); 및
F6: HSNARKT (SEQ ID NO:37); 이때 상기 단백질은 SEQ ID NO: 33으로 나타내는 표적 부위에 결합하고;
(iv) F1: RSDNLSV (SEQ ID NO:39);
F2: DRSNLTR (SEQ ID NO:40);
F3: RSDTLSE (SEQ ID NO:41); 및
F4: RSQTRKT (SEQ ID NO:42); 이때 상기 단백질은 SEQ ID NO: 38로 나타내는 표적 부위에 결합하고;
(v) F1: QNAHRKT (SEQ ID NO:50);
F2: QSGDLTR (SEQ ID NO:53);
F3: QSGDLTR (SEQ ID NO:53);
F4: QSSNLAR (SEQ ID NO:54); 및
F5: TSSNRKT (SEQ ID NO:55); 이때 상기 단백질은 SEQ ID NO: 52로 나타내는 표적 부위에 결합하고;
(vi) F1: RSDNLAR (SEQ ID NO:57);
F2: QSGDLTR (SEQ ID NO:53);
F3: DNRQLIT (SEQ ID NO:58);
F4: TSSNLSR (SEQ ID NO:8);
F5: RSDTLSR (SEQ ID NO:59); 및
F6: RNDDRIT (SEQ ID NO:60); 이때 상기 단백질은 SEQ ID NO: 56으로 나타내는 표적 부위에 결합하고;
(vii) F1: RSDNLTT (SEQ ID NO:62);
F2: RSDHLSR (SEQ ID NO:63);
F3: QSSDLRR (SEQ ID NO:64);
F4: QSSHLTR (SEQ ID NO:3); 및
F5: RSDHLTQ (SEQ ID NO:65); 이때 상기 단백질은 SEQ ID NO: 61로 나타내는 표적 부위에 결합하고; 및
(viii) F1: QSGSLTR (SEQ ID NO:67);
F2: TSSNRKT (SEQ ID NO:55);
F3: DRSHLTR (SEQ ID NO:68):,
F4: RSDDRKT (SEQ ID NO:69);
F5: NRTDLIR (SEQ ID NO:7); 및
F6: TSSNLSR (SEQ ID NO:8); 이때 상기 단백질은 SEQ ID NO: 66으로 나타내는 표적 부위에 결합한다.
제1항의 아연 핑거 단백질 및 적어도 하나의 절단 도메인 또는 적어도 하나의 절단 하프-도메인을 포함하는 융합 단백질.
제2항에 있어서, 상기 절단 하프-도메인은 야생형 또는 조작된 FokI 절단 하프-도메인인 융합 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 아연 핑거 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항의 단백질을 포함하는 분리된 세포.
제4항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 세포.
제2항의 융합 단백질을 사용하여 BAK 유전자가 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 세포주.
세포에서 내생성 세포 Bak의 비활성화 방법에 있어서, 상기 방법은
제2항에 따른 제1 융합 단백질을 인코딩하는 제1 핵산을 세포 내로 도입시키고, 이로 인해 제1 융합 단백질이 그것의 표적 부위에 결합하고 Bak 유전자를 절단하는 단계를 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 제2 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 도입시키고, 이로 인해 제1 및 제2 융합 단백질이 이들 각각의 표적 부위에 결합하여 Bak 유전자를 절단하게 되는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드는 동일한 핵산에 의해 인코딩되는 방법.
제8항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드는 상이한 핵산에 의해 인코딩되는 방법.
숙주세포에서 관심 재조합 단백질을 생산하는 방법에 있어서, 상기 방법은,
(a) 내생성 Bax 유전자를 포함하는 숙주세포를 제공하는 단계;
(b) 제8항 내지 제11항 중 어느 하나의 항의 방법에 따라 숙주세포의 내생성 Bax 유전자를 비활성화시키는 단계; 및
(c) 관심 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 전이유전자를 포함하는 발현 벡터를 숙주세포 내로 도입함으로써, 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 관심 상기 단백질은 항원을 포함하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 항원은 인플루엔자 항원을 포함하는 방법.
Bak가 부분적으로 또는 완전히 비활성화되는 세포주에 있어서, 상기 세포주는,
(a) 제8항 내지 제11항 중 어느 하나의 항의 방법에 따라 세포에서 Bak를 비활성화시키는 단계; 및
(b) Bak가 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 세포주를 산출하기 위한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계에 의해 생산되는 세포주.
제15항에 있어서, 상기 세포는 COS 세포, CHO 세포, VERO 세포, MDCK 세포, WI38 세포, V79 세포, B14AF28-G3 세포, BHK 세포, HaK 세포, NS0 세포, SP2/0-Ag14 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, 및 perC6 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 포유류 세포인 세포주.
제15항에 있어서, 상기 세포주는 Bax에 결함이 있는 세포주.
제16항에 있어서, 상기 세포주는 Bax에 결함이 있는 세포주.