JP5756016B2 - グルタミンシンセターゼ遺伝子の発現を不活性化する方法及び組成物 - Google Patents

Description

（連邦支援の研究によってなされた発明の権利に関する記載）
適用なし

本開示は、ゲノム操作、細胞培養、細胞株の作成及びタンパク質産生の分野におけるものである。

グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）は、Ｌ−グルタミンというアミノ酸の合成に必須の酵素である。Ｍｅｉｓｔｅｒ，Ａ．ｉｎ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（Ｊ．Ｍｏｒａ及びＲ．Ｐａｌａｃｉｏｓ編集）１−４０（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；１９８０）を参照されたい。ＧＳ陰性細胞株は、従って、Ｌ−グルタミン要求株である。ＧＳは、ＣＨＯ細胞由来の組み換えタンパク質発現系における選択マーカー遺伝子として頻繁に用いられている（Ｗｕｒｍ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：１３９３−１３９８）が、ＧＳ陰性ＣＨＯ株が存在しないので、選択を行なうために、ＧＳ阻害剤であるメチオニンスルホキシイミンを用いる必要がある。

それに加え、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ、５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸：ＮＡＤＰ＋酸化還元酵素）は、真核生物にとっても原核生物にとっても重要な酵素であり、ジヒドロ葉酸をテトラヒドロ葉酸に還元するＮＡＤＰＨ依存性還元を触媒し、このテトラヒドロ葉酸は、チミジル酸、プリンヌクレオチド、グリシン及びメチル化合物の生合成における１炭素単位の重要なキャリアである。

ＤＨＦＲ欠損細胞は、組み換えタンパク質を産生するために長きにわたって使用されてきた。ＤＨＦＲ欠損細胞は、葉酸代謝に関与する特定の因子が補給された培地内でしか増殖しないか、又は、細胞に、例えば、トランス遺伝子としてＤＨＦＲが与えられている場合にしか増殖しない。ＤＨＦＲトランス遺伝子が安定に組み込まれた細胞は、補給されていない培地でこの細胞を増殖させることによって選択することができる。さらに、単一のポリヌクレオチドを用いて細胞に導入する場合には、典型的には、外来配列を一緒に組み込む。従って、ＤＨＦＲトランス遺伝子が、目的のタンパク質をコードする配列も含んでいる場合には、選択された細胞は、ＤＨＦＲと目的のタンパク質の両方を発現するであろう。さらに、メトトレキサート（ＭＴＸ）のような阻害剤に反応して、ＤＨＦＲ遺伝子のコピー数を増やすことができる。従って、外来ＤＨＦＲとともに組み込まれた、目的のタンパク質をコードする配列は、上述の細胞を、濃度を徐々に高めたメトトレキサートにさらすことによって増やすことができ、これによって、目的の組み換えタンパク質を過剰発現させることができる。しかし、ＤＨＦＲ欠損細胞系は、組み換えタンパク質の発現に広く使用されているが、現時点で利用可能なＤＨＦＲ欠損細胞株は、この株の由来である親細胞ＤＨＦＲコンピテント細胞と同じようには増殖しない。

従って、１箇所及び複数箇所の遺伝子ノックアウトを含む哺乳動物細胞は、研究、薬物開発、細胞による治療に大きな有用性をもつ。しかし、研究者が目的とする遺伝子を標的として機能を失わせる従来の方法は、相同組み換え又は遺伝子ターゲティングのプロセスによるものである。Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２；Ｖａｓｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：８４０３−８４１０；Ｒａｇｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２：２７３４−２７４６；Ｋｏｈｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２，ｅ３。所定の両アレルをノックアウトすることは可能であるが、多くの細胞型について、この技術は、効率が悪すぎて、通常の用途ではあまりにも根気の必要な技術である。例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４−６２２。標的遺伝子を欠損させるこれらの方法は、相同組み換えし、まれに起こる望ましい事象を単離するために薬物の選択を順次繰り返す必要があり、このプロセスは、個々の遺伝子座に対する用途を制限してしまうのに十分なほど、根気が必要である。その結果、複数の標的遺伝子座で改変した哺乳動物細胞株の作成は、大部分が未開発の状態である。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、標的開裂及び遺伝子の不活性化に使用されている。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号；第２００５０２０８４８９号；第２００５００２６１５７号；第２００５００６４４７４号；第２００６０１８８９８７号；第２００６００６３２３１号；第２００８／００１５１６４号、米国特許出願第１２／２１８，０３５号、国際公開第ＷＯ ０７／０１４２７５号を参照されたい。なお、これらの開示内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。所定の標的配列に特異的な操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、Ｆｏｋ Ｉ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓ由来の制限エンドヌクレアーゼ）の触媒ドメインとの融合によって作られた場合、ＺＦＮは、選択されたゲノム位置で二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を起こさせる能力をもつ。この部位特異的なＤＳＢの除去は、ドナーＤＮＡが与えられる場合には相同性による修復プロセスによって、又は非相同末端再結合（ＮＨＥＪ）によって、細胞自体のＤＮＡ修復機構によって行なわれる。例えば、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３５：６４６−６５１（２００５）；Ｍｏｅｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０４：３０５５−３０６０（２００７）；Ｂｉｂｉｋｏｖａ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２１：２８９−２９７；Ｂｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００：７６４；Ｐｏｒｔｅｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：９６７−９７３；Ｌｏｍｂａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５：１２９８−１３０６；Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：８０８−８１６；Ｂｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６１：１１６９−１１７５；Ｌｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０２：２２３２−２２３７；Ｍｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３：１６３７０−１６３７５を参照されたい。

相同性による修復及びＮＨＥＪプロセスによって、標的とする遺伝子座の改変が起こるが、ＮＨＥＪによるアプローチは、ドナーＤＮＡの設計および合成を必要としないが、高い頻度で破壊されたアレルが生じ、ＮＨＥＪが介在するＤＳＢ修復のエラーが起こりやすい性質をうまく利用して、ＺＦＮをコードするＤＮＡ構築物の単純な一過性導入後に、哺乳動物細胞の標的遺伝子をノックアウトすることができる。例えば、Ｓａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５：５８０９−５８１４を参照されたい。ＺＦＮの技術によって、１個の細胞に由来するクローンを１つの９６ウェルプレートより少ない数のスクリーニングを行なうことによって、いくつかの独立したノックアウト細胞株を単離することが可能になった。ドナーＤＮＡを用いず、選択する方法も必要としないため、得られた１箇所の遺伝子ノックアウト株は、その後に遺伝子改変するのに適した出発細胞株である。

本明細書には、ＧＳ遺伝子を部分的又は完全に不活性化するための組成物が開示されている。また、本明細書には、上述の組成物（試薬）を製造する方法及び使用する方法、例えば、細胞内でＧＳを不活性化し、ＧＳ遺伝子が不活性化された細胞を製造する方法も開示されている。ＧＳが破壊された細胞株は、例えば、組み換えタンパク質の産生に有用である。

一つの態様では、ＧＳ遺伝子に結合するように操作されたジンクフィンガータンパク質が与えられる。本明細書に記載されている任意のジンクフィンガータンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上のジンクフィンガーを含んでいてもよく、それぞれのジンクフィンガーは、ＧＳ遺伝子の標的サブサイトに結合する認識ヘリックスを有している。特定の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は、表１に示される４つ、５つ、又は６つのフィンガー（個々のジンクフィンガーは、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６と称される）と、認識ヘリックスのアミノ酸配列とを含む。

別の態様では、ＤＨＦＲ遺伝子に結合するように操作されたジンクフィンガータンパク質が与えられる。本明細書に記載されている任意のジンクフィンガータンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上のジンクフィンガーを含んでいてもよく、それぞれのジンクフィンガーは、ＤＨＦＲ遺伝子の標的サブサイトに結合する認識ヘリックスを有している。特定の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は、表２に示される４つ、５つ、又は６つのフィンガー（個々のジンクフィンガーは、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６と称される）と、認識ヘリックスのアミノ酸配列とを含む。

別の態様では、本明細書に記載されているいずれかのジンクフィンガータンパク質と、少なくとも１つの開裂ドメイン又は少なくとも１つの開裂ハーフドメインとを含む融合タンパク質も与えられる。特定の実施形態では、開裂ハーフドメインは、野生型ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインである。他の実施形態では、開裂ハーフドメインは、操作されたＦｏｋＩ開裂ハーフドメインである。

さらに別の態様では、本明細書に記載されているタンパク質のどれでもコードするポリヌクレオチドが与えられる。

さらに別の態様では、本明細書に記載されているタンパク質及び／又はポリヌクレオチドのどれでも含む単離された細胞も与えられる。特定の実施形態では、ＧＳは、細胞内で（部分的又は完全に）不活性化される。本明細書に記載されているどの細胞も、例えば、選択された遺伝子内の標的部位に結合するように設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて不活性化されたさらなる遺伝子を含んでいてもよい。特定の実施形態では、本明細書で、ＦＵＴ８、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）が不活性化した細胞又は細胞株が与えられる。

それに加え、細胞内又は細胞株内でＧＳを不活性化する方法において、ジンクフィンガータンパク質及びその融合物を用いる方法が与えられる。

従って、別の態様では、本明細書で、細胞内で細胞ＧＳ遺伝子（例えば、内在性ＧＳ遺伝子）を不活性化する方法が与えられており、この方法は、（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を細胞に導入することを含み、この第１のポリペプチドが、（ｉ）内在性ＧＳ遺伝子の第１の標的部位に結合するように操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、（ｉｉ）開裂ドメインとを含み、その結果、上述のポリペプチドが上述の細胞内で発現し、それによって、上述のポリペプチドが上述の標的部位に結合し、上述のＧＳ遺伝子を開裂させる。特定の実施形態では、この方法は、第２のポリペプチドをコードする核酸を導入することをさらに含み、この第２のポリペプチドが、（ｉ）ＧＳ遺伝子の第２の標的部位に結合するように操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、（ｉｉ）開裂ドメインとを含み、その結果、上述の第２のポリペプチドが上述の細胞内で発現し、それによって、上述の第１のポリペプチド及び上述の第２のポリペプチドがそれぞれの標的部位に結合し、上述のＧＳ遺伝子を開裂させる。第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、第１の核酸によってコードされてもよいし、異なる核酸によってコードされてもよい。特定の実施形態では、１つもしくは複数のさらなるポリヌクレオチド又はポリペプチド、例えば、さらなるジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチドが上述の細胞内に導入される。

さらに別の態様では、本開示は、宿主細胞において目的の組み換えタンパク質を産生する方法を与え、この方法が、（ａ）内在性ＧＳ遺伝子を含む宿主細胞を得るステップと、（ｂ）上述の宿主細胞の内在性ＧＳ遺伝子を、本明細書に記載されているいずれかの方法によって不活性化するステップと、（ｃ）目的のタンパク質をコードする配列を含むトランス遺伝子を含む発現ベクターを、上述の宿主細胞に導入するステップとを含み、これによって組み換えタンパク質を産生する。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、抗体、例えば、モノクローナル抗体を含む。

本明細書に記載されているいずれかの細胞及び方法において、細胞又は細胞株は、例えば、以下の細胞に限定されないが、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ＮＩＨ３Ｔ３、ｐｅｒＣ６、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）のような昆虫細胞、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのような真菌細胞であってもよい。

図１の図Ａ〜Ｅは、ＣＨＯ細胞におけるＺＦＮが介在するグルタミンシンセターゼ遺伝子の破壊と、シングルノックアウトＧＳ^-/-細胞株の作成を示している。図１Ａは、活発に転写されたＧＳ遺伝子を模式的に示しており、７個のエクソンを含んでいる。開始コドンＡＴＧは、エクソン２内にある。また、図１Ａは、記載のようにＺＦＮ対ＺＦＮ９３７２／ＺＦＮ９０７５の標的配列がエクソン６にあること、ＺＦＮ対８３６１／８３６５の標的配列がエクソン２にあることも示している。エクソン６を標的とするさらなるＺＦＮ（９０７６、９１７９、７８５８、７８８９、９３７３）も示されている。 図１Ｂは、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ^TMＮｕｃｌｅａｓｅ Ａｓｓａｙで決定される場合の、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（左側のパネル）又はＣＨＯ−Ｓ細胞（右側のパネル）の中にあるＦｏｋ Ｉの触媒ドメインの野生型又は絶対的なヘテロ二量体ＥＬ／ＫＫ改変体のいずれかに結合したＺＦＮ対９３７２／９０７５を用いた、ＺＦＮが介在する内在性ＣＨＯ ＧＳ遺伝子の破壊を示すゲルである。 図１Ｃは、示されている細胞株の標的ＧＳ遺伝子座の例示的なＤＮＡ配列を、外からＬ−グルタミンを加えない状態での増殖特性とともに示す（「Ｌ−Ｇｌｕ増殖」；「＋」：Ｌ−グルタミンが存在しない状態で、野生型ＣＨＯと変わらない増殖；「−」：Ｌ−グルタミンが存在しない状態で、増殖しない）。ＺＦＮ標的配列には下線が引かれている。タンパク質への翻訳は、野生型配列の下に示されている。大文字はエクソン配列を示し、小文字はイントロン配列を示し、「−」は欠損を示し、太字は挿入部を示す。 図１Ｄは、抗ＧＳモノクローナル抗体を用いた（上側のパネル）、選択されたＣＨＯ−Ｓ細胞株（左側のパネル）及びＣＨＯ−Ｋ１細胞株（右側のパネル）のウェスタンブロット分析を示す。ローディングコントロールとして、ブロットを抗ＤＨＦＲ抗体（下側の図）で再びプローブした。 図１Ｅは、選択されたＣＨＯ−Ｋ１ ＧＳ^-/-細胞株を約３ヶ月間増殖させた場合の増殖及び生存率を示すグラフを示す。これらの細胞株の生存率（グラフ上部のなめらかな線）及び生存可能な細胞の密度（ギザギザの線）を、最初の３ヶ月の後３０日間示しており、ここで、細胞を、Ｌ−グルタミンを補給した培地中で増殖させ、この細胞を２〜３日ごとに分けた。Ｌ−グルタミンを断ったときを矢印で示した。 図２のパネルＡ〜Ｆは、ＣＨＯ細胞におけるＺＦＮが介在するＤＨＦＲ遺伝子の破壊と、ダブルノックアウトＤＨＦＲ^-/-ＧＳ^-/-細胞株の作成を示している。図２Ａは、ＣＨＯ細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子のゲノム構成と、ＺＦＮ対９４６１／７８４４の標的部位の位置（エクソン１にある、米国特許出願第２００８００１５１６４号を参照）、ＺＦＮ対９４７６／９４７７の標的部位の位置（エクソン１のＺＦＮ９４６１／７８４４開裂部位から３’方向に２４０ｂｐのイントロン１にある）を示している。 図２Ｂは、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ^TMＮｕｃｌｅａｓｅ Ａｓｓａｙで測定される場合の、ＺＦＮ対９４６１／７８４４（左側のパネル）及びＺＦＮ対９４７６／９４７７（右側のパネル）を用いた遺伝子改変の程度を示している。 図２Ｃは、両ＺＦＮ対をコードするプラスミドによる同時トランスフェクションから２日後のＧＳ^-/-クローンＢ３ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析を示しており、ＤＨＦＲ遺伝子座の約２４０ｂｐが欠損していた（第７レーンの小さな矢印）。コントロールとして準備したのは、空のベクター（第１レーン）、ＧＦＰコントロールベクター（第２レーン）、エクソンのＺＦＮ対のみ（ＺＦＮ９４６１／ＺＦＮ７８４４、第３レーン）、イントロンのＺＦＮ対のみ（ＺＦＮ９４７６／ＺＦＮ９４７７、第４レーン）、欠損部に対して「内側」のＺＦＮ（ＺＦＮ７８４４及びＺＦＮ９４７７、第５レーン）、欠損部に対して「外側」のＺＦＮ（ＺＦＮ９４６１及びＺＦＮ９４７６、第６レーン）でトランスフェクトした細胞であった。 図２Ｄは、１個の細胞株のＤＨＦＲ遺伝子タイピング分析の結果を示す。ホモ接合性クローンの場合、両アレルの共通配列を示している。複合ヘテロ接合性クローンの場合、各固有のアレルの配列が示されている。 図２Ｅは、各レーンの上に示されている細胞株から得た細胞全溶解物の指定の抗体（ＤＨＦＲ、ＧＳ、β−チューブリン）を用いたウェスタンブロット分析を示す。細胞株１Ｆ１．６及び２Ｂ１２．８（ＤＨＦＲ／ＧＳノックアウト）を分析しつつ、親細胞であるＧＳ^-/-細胞株Ｂ３、野生型ＣＨＯ細胞（ＷＴ）、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株ＤＧ４４（Ｕｒｌａｂ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：４０５−４１２）をコントロールとして使用した。 図２Ｆは、１Ｆ１．６細胞株及び２Ｂ１２．８細胞株の増殖と、外から与えたヒポキサンチン、チミジン及びグルタミンに対する、上述の株の依存性を示す。 図３ののパネルＡ〜Ｄは、ＣＨＯ細胞におけるＺＦＮが介在するＦＵＴ８遺伝子の破壊と、トリプルノックアウトＦＵＴ８^-/-ＤＨＦＲ^-/-ＧＳ^-/-細胞株の作成を示している。図３Ａは、エクソン１０に位置するＦＵＴ８ Ｆｕｔ ｍｏｔｉｆ ＩＩをコードする重要で高度に保存された領域を標的とするＺＦＮを模式的に示している。また、米国特許出願第１２／２１８，０１３５号も参照されたい。 図３Ｂは、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ^TMＮｕｃｌｅａｓｅ Ａｓｓａｙを用いて測定される場合の、ＺＦＮ対１２１７６／１２１７２をＤＨＦＲ^-/-ＧＳ^-/-クローン１Ｆ１．６に一過性導入してから２日後の遺伝子の改変度を示す。 図３Ｃは、ＦＡＣＳ分析による、トリプルＫＯクローン３５Ｆ２及び１４Ｃ１（パネルの左側の線）の蛍光−ＬＣＡ結合活性を示す。Ｆ−ＬＣＡ染色した野生型ＣＨＯ−Ｓ細胞（パネルの右側の線）をポジティブコントロールとして与え、染色していない細胞（点線）をネガティブコントロールとして与えた。 図３Ｄは、トリプルノックアウト細胞株３５Ｆ２及び１４Ｃ１について、ＦＵＴ８遺伝子座の遺伝子型（両アレルについて）を示しており、示されている配列は、両アレルについてのものである。大文字はエクソン１０の配列を示し、小文字はイントロン配列を示し、斜体はＦｕｔ ｍｏｔｉｆ ＩＩ配列を示し、太字は配列挿入部を示し、「−」は欠損を示す。また、タンパク質への翻訳は、野生型配列の下に示されている。下線部は、ＺＦＮ結合部位を示す。 図４のパネルＡ〜Ｃは、例示的なＺＦＮの設計と、ＣＨＯ ＧＳ遺伝子におけるＺＦＮの標的部位とを示す。図４Ａは、ＣＨＯ細胞内の、機能的なイントロンを含有するグルタミンシンセターゼ遺伝子の模式図である。この遺伝子は、７個のエクソンを含み、開始コドンＡＴＧは、エクソン２内にあり、エクソン６にあるＺＦＮ対ＺＦＮ９３７２／ＺＦＮ９０７５の標的配列も示されている。エクソン６の周囲にある目的の領域のヌクレオチド配列が示されている。大文字はエクソン６の配列を示しており、小文字はイントロン配列を示している。ＺＦＮ９３７２及びＺＦＮ９０７５の標的配列には下線が引かれている。 図４Ｂは、二本鎖の標的配列（下線が引かれている）へのＺＦＮ９３７２及びＺＦＮ９０７５の結合を模式的に示している。 図４Ｃは、ＺＦＮ９３７２及びＺＦＮ９０７５の標的配列及びジンクフィンガーの設計を示している。コアＤＮＡの標的配列（大文字）及び２つのフランキング塩基（小文字）が示されている。ＺＦＮ９０７５は、４つのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含んでおり、ＺＦＮ９３７２は、６つのジンクフィンガードメインを含んでいる。示されている標的ＤＮＡトリプレットに対する、それぞれのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの認識αヘリックスの「−１」位置〜「＋６」位置にあるアミノ酸残基が示されている。 図５は、ＺＦＮでトランスフェクトした細胞に由来するゲノムＧＳ遺伝子座の例示的な配列決定結果を示す。「Ｃ」は、数（所定の配列が観察された回数）を指し、「Ｇ」は、遺伝子型を指す。ＺＦＮの標的配列には下線が引かれている。太字は配列挿入部を示し、「−」は欠損を示す。 図６は、ホモ接合性ＧＳ^-/-細胞株（クローンＢ３）のＬ−グルタミン依存性増殖を示すグラフである。Ｌ−グルタミン存在下で、ＣＨＯ−Ｓ ＧＳ^-/-クローンＢ３（三角）は、野生型ＣＨＯ−Ｓ（ひし形）と同様に増殖する。外来性Ｌ−グルタミンが存在しない状態では、クローンＢ３（丸）は増殖が止まり、すべての細胞が４日以内に死滅したが、一方、野生型ＣＨＯ細胞（四角）は、増殖速度は低下したが、増殖は続いた。 図７のパネルＡ〜Ｃは、例示的なＺＦＮの設計と、ＣＨＯ ＤＨＦＲ遺伝子におけるＺＦＮの標的部位とを示す。図７Ａは、ＣＨＯ細胞内の指定のＺＦＮ対が標的とするＤＨＦＲ領域のヌクレオチド配列を示す。大文字はエクソン配列を示し、小文字はイントロン配列を示す。 図７Ｂは、二本鎖の標的配列（下線が引かれている）へＺＦＮが結合する場合に、ＤＨＦＲを標的とするＺＦＮを模式的に示している。「内側」の標的配列と記載されている２つのＺＦＮは、欠損される領域に対して内側にあり、一方、「外側」の標的配列と記載されている２つのＺＦＮは、予想される欠損の結合部より外側にある。 図７Ｃは、標的配列と、ＣＨＯ ＤＨＦＲ遺伝子を標的とする例示的なＺＦＮのジンクフィンガーの設計とを示す。コアＤＮＡの標的配列（大文字）及び２つのフランキング塩基（小文字）が示されている。すべてのＺＦＮは、４つのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含んでいる。示されている標的ＤＮＡのトリプレットに対する、それぞれのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの認識αヘリックスの「−１」位置〜「＋６」位置にあるアミノ酸残基が示されている。 図８は、ＺＦＮでトランスフェクションした細胞に由来するゲノムＤＨＦＲ遺伝子座の例示的な配列決定結果を示す。「Ｃ」は、数（所定の配列が観察された回数）を指し、「Ｇ」は、遺伝子型を指す。ＺＦＮの標的配列には下線が引かれている。太字は配列挿入部を示し、「−」は欠損を示す。太字は配列挿入部を示す。斜体は配列変更点を示す。大文字はエクソン配列を示し、小文字はイントロン配列を示す。 図９のパネルＡ〜Ｃは、ＣＨＯ ＦＵＴ８遺伝子を標的とするＺＦＮの標的部位と、フィンガーの設計とを示す。図９Ａは、ＦＵＴ８遺伝子のエクソン１０内にあるＺＦＮ結合部位とともに、エクソン１０内にある標的領域のヌクレオチド配列を模式的に示す。大文字はエクソン１０の配列を示し、小文字はイントロン配列を示す。ＺＦＮ１２１７６及びＺＦＮ１２１７２の標的配列には下線が引かれている。フコシルトランスフェラーゼモチーフＩＩを含むヌクレオチドは斜線で示されている。 図９Ｂは、二本鎖の標的配列（下線が引かれている）に結合するＺＦＮ１２１７６及びＺＦＮ１２１７２の模式図である。 図９Ｃは、標的配列と、ＺＦＮ１２１７６及びＺＦＮ１２１７２のジンクフィンガーの設計とを示す。コアＤＮＡの標的配列（大文字）及び２つのフランキング塩基（小文字）が示されている。ＺＦＮ１２１７６は、５種類のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含んでおり、ＺＦＮ１２１７２は、６種類のジンクフィンガードメインを含んでいる。示されている標的ＤＮＡのトリプレットに対する、それぞれのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの認識αヘリックスの「−１」位置〜「＋６」位置にあるアミノ酸残基が示されている。 図１０のパネルＡ〜Ｃは、ＣＣＲ５、ＧＲ及びＡＡＶＳ１の遺伝子座のＺＦＮ標的化を示す。図１０Ａは、Ｃ−Ｃケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、アデノ随伴ウイルスの組込部位（ＡＡＶＳ１）の遺伝子座の中にあるＺＦＮが標的とする部位の位置をそれぞれ模式的に示す。 図１０Ｂは、Ｆｏｋ触媒ドメインの野生型、ＺＦＮ−Ｆｏｋ Ｉ（ｗｔ）又は絶対的なヘテロ二量体ＥＬ／ＫＫ改変体、ＺＦＮ−Ｆｏｋ Ｉ（ＥＬ／ＫＫ）のいずれかに結合したＺＦＮ対をＫ５６２細胞に一過性同時トランスフェクションしてから２０日後に測定した場合、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ^TMＮｕｃｌｅａｓｅ Ａｓｓａｙで測定される場合の、ＣＣＲ５（左側のパネル）、ＧＲ（中央のパネル）、ＡＡＶＳ１（右側のパネル）の遺伝子座の、ＺＦＮが介在する同時破壊を示す。各レーンの処理は以下のとおりである。第１レーン、ＣＣＲ５ ＺＦＮ−ＦｏｋＩ（ｗｔ）；第２レーン、ＧＲ ＺＦＮ−Ｆｏｋ Ｉ（ｗｔ）；第３レーン、ＡＡＶＳ１ ＺＦＮ−Ｆｏｋ Ｉ（ｗｔ）；第４レーン、ＣＣＲ５ ＺＦＮ−Ｆｏｋ Ｉ（ＥＬ／ＫＫ）；第５レーン、ＧＲ ＺＦＮ−Ｆｏｋ Ｉ（ＥＬ／ＫＫ）；第６レーン、ＡＡＶＳ１ ＺＦＮ−Ｆｏｋ Ｉ（ＥＬ／ＫＫ）；第７レーン、ＣＣＲ５ ＺＦＮ−ＦｏｋＩ（ｗｔ）＋ＧＲ ＺＦＮ−ＦｏｋＩ（ｗｔ）＋ＡＡＶＳ１ ＺＦＮ−ＦｏｋＩ（ｗｔ）；第８レーン、ＣＣＲ５ ＺＦＮ−ＦｏｋＩ（ＥＬ／ＫＫ）＋ＧＲ ＺＦＮ−ＦｏｋＩ（ＥＬ／ＫＫ）＋ＡＡＶＳ１ ＺＦＮ−ＦｏｋＩ（ＥＬ／ＫＫ）。 図１０Ｃは、１種類のトリプルノックアウトクローンの遺伝子型を示し、指定の細胞株について、標的であるＣＣＲ５、ＧＲ、ＡＡＶＳ１の遺伝子座が示されている。ＺＦＮの標的配列には下線が引かれている。「−」は欠損を示し、太字は挿入部を示す。 図１１のパネルＡ及びＢは、示されている種と、本明細書で決定したＣＨＯ ＧＳゲノム配列との配列アラインメントを示す。図１１Ａは、エクソン２配列のアラインメントを示す。ＺＦＮ８３６１及びＺＦＮ８３６５の標的部位には下線が引かれている。 図１１Ｂは、エクソン６配列のアラインメントを示す。ＺＦＮ９０７５及びＺＦＮ９３７２の標的部位には下線が引かれている。 図１２のパネルＡ〜Ｄは、ヒト細胞及びマウス細胞における、ＺＦＮが介在する破壊を示している。図１２Ａ及び図１２Ｂは、ＣＨＯ ＧＳのエクソン２（図１２Ａ）及びＣＨＯ ＧＳのエクソン６（図１２Ｂ）を標的とするＺＦＮが介在する、ヒトＫ５６２におけるＧＳの破壊を示す。図１２Ｃ及び図１２Ｄは、ＣＨＯ ＧＳのエクソン２（図１２Ｃ）及びＣＨＯ ＧＳのエクソン６（図１２Ｄ）を標的とするＺＦＮが介在する、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞におけるＧＳの破壊を示す。 図１３のパネルＡ〜Ｃは、ＣＨＯ ＧＳ遺伝子座の完全なゲノム配列を示す（配列番号５５）。イントロン及びエクソンは、示されているとおりの名称である。 図１３のパネルＡ〜Ｃは、ＣＨＯ ＧＳ遺伝子座の完全なゲノム配列を示す（配列番号５５）。イントロン及びエクソンは、示されているとおりの名称である。 図１３のパネルＡ〜Ｃは、ＣＨＯ ＧＳ遺伝子座の完全なゲノム配列を示す（配列番号５５）。イントロン及びエクソンは、示されているとおりの名称である。 図１４のパネルＡ〜Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＳ特異的な遺伝子標的化の結果を示す。図１４Ａは、ＧＦＰドナー分子（ＧＦＰと記載されている）でトランスフェクトされた細胞と比較した場合の、ＧＳ特異的なＺＦＮ（ＧＳと記載されている）で処理された細胞におけるＮＨＥＪ活性の割合を示す。 図１４Ｂは、ＧＳ特異的なＺＦＮで処理された細胞プールに由来する２種類のクローンｇ１７及びｇ５２が、ウェスタンブロットによってアッセイされる場合、ＧＳを発現しないことを示している。 図１４Ｃは、ＧＳノックアウトクローンの７日間の増殖を示すグラフであり、増殖のためにグルタミンの補給を必要とすることを示している。

本明細書には、ＧＳ遺伝子を部分的又は完全に不活性化するための組成物及び方法が記載されている。また、本明細書には、上述の組成物（試薬）を製造する方法及び使用する方法、例えば、標的細胞内でＧＳを不活性化するために、上述の組成物（試薬）を製造する方法及び使用する方法も開示されている。標的細胞において、ＧＳ単独での不活性化、又はＤＨＦＲ及びＦＵＴ８のような他の遺伝子と合わせての不活性化を利用し、組み換えタンパク質を発現するための細胞株、例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の上昇を誘発するモノクローナル抗体を作成することができる。

（概要）
本方法の実施、及び本明細書に開示されている組成物の調製及び使用は、他の意味であると示されていない限り、分子生物学、生化学、クロマチンの構造及び分析、計算化学、細胞の培養、組み換えＤＮＡ、及び当該技術分野の技術内容に入るような関連する分野における従来の技術を利用する。これらの技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７及び定期的な更新；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ及びＡ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ編集），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９；及びＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ． Ｂｅｃｋｅｒ編集）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
（定義）
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」は、同じ意味で用いられ、線状又は環状の形状で、一本鎖又は二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマー長に関して限定があるものと解釈すべきでない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知のアナログ、塩基部分、糖部分及び／又はリン酸部分で改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）も包含していてもよい。一般的に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有しており、すなわち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対合するであろう。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」は、同じ意味で用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。また、この用語は、１つもしくは複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学アナログ又は改変された誘導体であるようなアミノ酸ポリマーにも適用される。

「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、高分子間の（例えば、タンパク質と核酸との間の）、配列特異的な非共有結合による相互作用を指す。結合相互作用のすべての成分が配列特異性であることが必要なわけではなく（例えば、ＤＮＡ骨格にあるリン酸残基と接触する）、全体としての相互作用が配列特異的であればよい。このような相互作用は、一般的に、解離定数（Ｋ_d）が１０^-6Ｍ^-1以下であることを特徴とする。「アフィニティ」は、結合の強さを指し、結合アフィニティが高くなると、Ｋ_dが低くなるという相関関係がある。

「結合性タンパク質」は、非共有結合によって別の分子と結合することが可能なタンパク質である。結合性タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子に結合してもよく（ＤＮＡ結合性タンパク質）、ＲＮＡ分子に結合してもよく（ＲＮＡ結合性タンパク質）、及び／又はタンパク質分子に結合してもよい（タンパク質結合性タンパク質）。タンパク質結合性タンパク質の場合には、自身に結合してもよく（ホモダイマー、ホモトリマーなどを形成する）、及び／又は、異なる１つもしくは複数のタンパク質の１つもしくは複数の分子に結合してもよい。結合性タンパク質は、２種類以上の結合活性を有していてもよい。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性、タンパク質結合活性を併せ持つ。

「ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質」（又は結合ドメイン）は、１つもしくは複数のジンクフィンガーを介して、配列特異的な様式でＤＮＡに結合するタンパク質であるか、又は大きなタンパク質の中にあるドメインであり、ジンクフィンガーは、この構造が亜鉛イオンの配位によって安定化するような、結合ドメイン内にあるアミノ酸配列の領域である。ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質との用語は、ジンクフィンガータンパク質又はＺＦＰと略されることが多い。

ジンクフィンガー結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作されて」いてもよい。ジンクフィンガータンパク質を操作する非限定的な方法の例は、設計及び選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質は、天然には存在しないタンパク質であり、主に、合理的な基準によって設計／組成がなされているタンパク質である。設計するための合理的な基準は、既存のＺＦＰ設計及び結合データに関するデータベースに格納されている情報に、置換則及び処理情報のためのコンピュータ化されたアルゴリズムを適用することを含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；また、ＷＯ９８／５３０５８号；ＷＯ９８／５３０５９号；ＷＯ９８／５３０６０号；ＷＯ０２／０１６５３６号、ＷＯ０３／０１６４９６号も参照されたい。

「選択された」ジンクフィンガータンパク質は、天然には存在しないタンパク質であり、このタンパク質は、主に、ファージディスプレイ、相互作用トラップ又はハイブリッド選択のような経験的なプロセスによって産生する。例えば、ＵＳ５，７８９，５３８号；ＵＳ５，９２５，５２３号；ＵＳ６，００７，９８８号；ＵＳ６，０１３，４５３号；ＵＳ６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１号；ＷＯ９６／０６１６６号；ＷＯ９８／５３０５７号；ＷＯ９８／５４３１１号；ＷＯ００／２７８７８号；ＷＯ０１／６０９７０号；ＷＯ０１／８８１９７号、ＷＯ０２／０９９０８４号を参照されたい。

用語「配列」は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、線状でも環状でもよく、分岐していてもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。用語「ドナー配列」は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さを有していてもよく、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチド長（又は、この範囲内の任意の整数値又はこれより大きな任意の整数値）であってもよく、好ましくは、約１００〜約１，０００ヌクレオチド長（又は、この範囲内の任意の整数値）、さらに好ましくは、約２００〜約５００ヌクレオチド長であってもよい。

「相同性があり、同一ではない配列」は、第１の配列が、第２の配列とある程度同一の配列を共有しているが、その配列が第２の配列と同一ではないような配列を指す。例えば、変異遺伝子の中で野生型配列を含むポリヌクレオチドは、その変異遺伝子の配列とは相同性があり、同一ではない。特定の実施形態では、２つの配列間の相同性の程度は、相互に相同組み換えし、通常の細胞機能で利用することが可能なほど十分に相同性がある。相同性があり、同一ではない２つの配列は、任意の長さを有していてもよく、ヌクレオチド１個程度なら（例えば、標的の相同組み換えによってゲノム点変異を修正するため）、相同性がなくてもよく、１０キロベース又はそれを少し超える程度なら（例えば、染色体内の所定の転位部位に遺伝子を挿入するため）、相同性がなくてもよい。相同性があり、同一ではない配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、２０〜１０，０００ヌクレオチド又はヌクレオチド対をもつ外来性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）を用いてもよい。

核酸及びアミノ酸配列の同一性を決定する技術は、当該技術分野で知られている。典型的には、このような技術は、ある遺伝子のためのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、及び／又はこのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を決定することと、これらの配列を、第２のヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較することとを含む。また、この様式で、ゲノム配列を決定し、比較することもできる。一般的に、同一性とは、ヌクレオチド同士又はアミノ酸同士で、それぞれ、２種類のポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の対応が厳密に取れていることを指す。２種類以上の配列（ポリヌクレオチド又はアミノ酸）を、同一性の割合を決定することによって比較することができる。２つの配列（核酸であってもアミノ酸配列であってもよい）の同一性の割合は、２つのアラインメントした配列の中で、正確に一致している個数を、短い方の配列の長さで割り、１００を掛けたものである。核酸配列の大まかなアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局部的な相同性アルゴリズムによって与えられる。このアルゴリズムを、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発されたスコア行列を用い、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって正規化することによって、アミノ酸配列に適用してもよい。ある配列の同一性の割合を決定するために、このアルゴリズムを行なう例は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ウィスコンシン州マディソン）によって、「ＢｅｓｔＦｉｔ」という実用的なアプリケーションで与えられている。配列間の同一性の割合又は類似性を算出するのに適した他のプログラムも一般的に当該技術分野で知られており、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータで使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、以下のデフォルトパラメータを用い、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰを使用してもよい。遺伝暗号＝ｓｔａｎｄａｒｄ；フィルタ＝なし；ストランド＝ｂｏｔｈ；カットオフ値＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥによる；データベース＝重複なし、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋのウェブサイトで見つけることができる。本明細書に記載されている配列に関し、所定の配列同一性の範囲は、約８０％〜１００％であり、この範囲内の任意の整数値である。典型的には、配列間の同一性の割合は、少なくとも７０〜７５％であり、好ましくは、８０〜８２％、さらに好ましくは８５〜９０％、さらにもっと好ましくは９２％、さらになお好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。

又は、ポリヌクレオチド間の配列類似性の割合は、相同性領域の間で安定な二本鎖を生成するような条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、次いで、一本鎖に特異的なヌクレアーゼで消化し、消化したフラグメントの大きさを決定することによって決定することができる。２つの核酸又は２つのポリペプチド配列は、その配列が、分子の所定の長さ範囲において、上述の方法を用いて決定された場合に少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０％〜８２％、さらに好ましくは８５％〜９０％、さらにもっと好ましくは９２％、さらになお好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を示す場合に、互いに実質的に相同性である。また、本明細書で使用される場合、実質的に相同性であるとは、特定のＤＮＡ又はポリペプチド配列に対し、完全に同一性を示す配列も指している。実質的に相同性のＤＮＡ配列は、例えば、特定の系で定義されているようなストリンジェントな条件で、サザンハイブリダイゼーション実験で同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当該技術分野の技術常識の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（前出）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，編集者Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。

２つの核酸フラグメントの選択的なハイブリダイゼーションを、以下のように決定することができる。２つの核酸分子間の配列同一性の割合は、この分子間のハイブリダイゼーション事象の効率及び強度に影響を与える。部分的に同一の核酸配列は、標的分子に対する、完全に同一の配列のハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害するであろう。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該技術分野でよく知られているハイブリダイゼーションアッセイを用いて評価することができる（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）。このようなアッセイを、種々の選択性を用いて行ってもよく、例えば、低ストリンジェントな条件から高ストリンジェントな条件までのさまざまな条件を用いて行ってもよい。低ストリンジェントな条件が用いられる場合、部分的にすら配列同一性がない第２のプローブ（例えば、標的分子との配列同一性が約３０％未満のプローブ）を用いて、非特異的な結合が存在しないことを評価することができ、その場合、非特異的な結合事象が存在しない場合には、この第２のプローブは、標的とハイブリダイズしないであろう。

ハイブリダイゼーションによる検出システムを利用する場合、リファレンスとなる核酸配列と相補性の核酸プローブが選択され、次いで、適切な条件を選択することによって、プローブとリファレンス配列とが、互いに選択的にハイブリダイズつまり結合し、二本鎖分子を形成する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でリファレンス配列と選択的にハイブリダイズさせることが可能な核酸分子は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列を検出することが可能な条件でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、典型的には、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％を超える配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列を検出することができる。プローブとリファレンス配列とが特定の配列同一性を有するようなプローブ／リファレンス配列のハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で知られているように決定することができる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，編集者Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照）。

ハイブリダイゼーション条件は、当業者にはよく知られている。ハイブリダイゼーションの厳密さは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチしたヌクレオチドを含むハイブリッドをどれほど形成しづらいかという程度を指し、厳密さが高くなると、ミスマッチしたハイブリッドの許容性が低くなるという相関関係にある。ハイブリダイゼーションの厳密性に影響を与える因子は、当業者には十分に知られており、温度、ｐＨ、イオン強度、例えば、ホルムアミド及びジメチルスルホキシドのような有機溶媒の濃度が挙げられるが、これらに限定されない。当業者には知られているように、ハイブリダイゼーションの厳密さは、温度を高くし、イオン強度を下げ、溶媒濃度を下げることによって高くなる。

ハイブリダイゼーション条件の厳密さに関し、例えば、配列の長さ及び性質、種々の配列の塩基組成、塩及び他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤の有無（例えば、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコール）、ハイブリダイゼーション反応の温度及び時間のパラメータ、並びに種々の洗浄条件のような因子を変えることによって、特定の厳密さを確立するのに多くの等価な条件を利用してもよいことは、当該技術分野でよく知られている。特定の一連のハイブリダイゼーション条件の選択は、当該技術分野で標準的な方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）。

「組み換え」は、２つのポリヌクレオチド間で遺伝情報を交換するプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組み換え（ＨＲ）」は、例えば、細胞の二本鎖の破壊を修復しているときに起こる変化の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチドの配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖の破壊を受けた分子）を修復するテンプレートとして「ドナー」分子を用い、ドナーから標的に遺伝情報を移動するため、「非乗換え型遺伝子変換」又は「短路遺伝子変換（ｓｈｏｒｔ ｔｒａｃｔ ｇｅｎｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」としてさまざまなものが知られている。任意の特定の理論によって束縛されることを望まないが、このような移動は、破壊した標的とドナーとの間で形成するヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチを修復すること、及び／又はドナーが、標的の一部分になり得る遺伝情報を再合成するのに使用されるような「合成に依存する鎖アニーリング」、及び／又は関連するプロセスを含んでいてもよい。このような特殊なＨＲによって、標的分子の配列が変わってしまい、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部分又はすべてが、標的ポリヌクレオチドに組み込まれることが多い。

「開裂」は、ＤＮＡ分子の共有結合性骨格が破損することを指す。開裂は、ホスホジエステル結合の酵素又は化学物質による加水分解を含む種々の方法（ただし、これらに限定されない）によって開始される場合がある。一本鎖の開裂及び二本鎖の開裂の両方の可能性があり、二本鎖の開裂は、２つの別個の一本鎖開裂事象の結果として生じる場合がある。ＤＮＡが開裂すると、平滑末端又は付着末端が生じる場合がある。特定の実施形態では、融合ポリペプチドが、標的である二本鎖ＤＮＡを開裂させるために用いられる。

「開裂ハーフドメイン」は、あるポリペプチド配列が、第２のポリペプチド（同じか、又は異なる）とともに、開裂活性（好ましくは、二本鎖の開裂活性）を有する複合体を形成するようなポリペプチド配列である。用語「第１の開裂ハーフドメイン及び第２の開裂ハーフドメイン」、「＋及び−の開裂ハーフドメイン」、「右側及び左側の開裂ハーフドメイン」は、同じ意味で用いられ、二量化する開裂ハーフドメインの対を指す。

「操作された開裂ハーフドメイン」は、ある開裂ハーフドメインが、別の開裂ハーフドメイン（例えば、別の操作された開裂ハーフドメイン）と必須ヘテロ二量体を形成するように改変されているような開裂ハーフドメインを指す。また、本明細書に参照により組み込まれる米国特許公開第２００５／００６４４７４号；第２００７／０２１８５２８号、第２００８／０１３１９６２号を参照されたい。

「クロマチン」は、細胞内のゲノムを含む核タンパク質の構造である。細胞クロマチンは、核酸と、主にＤＮＡと、タンパク質とを含んでおり、ヒストン染色体タンパク質と非ヒストン染色体タンパク質とが挙げられる。真核細胞の大部分のクロマチンは、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームのコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４のうち２つを含む八量体に会合する約１５０塩基対のＤＮＡと、ヌクレオソームのコアに向かって延びているリンカーＤＮＡ（有機体によって長さは可変）とを含む。ヒストンＨ１分子は、一般にリンカーＤＮＡに結合している。本開示の目的のために、用語「クロマチン」は、原核細胞及び真核細胞の両方で、あらゆる種類の細胞内核タンパク質を包含するという意味がある。細胞内クロマチンは、染色体のクロマチン及びエピソームのクロマチンを含む。

「染色体」は、細胞のすべてのゲノム又は一部分のゲノムを含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、核型によって特徴づけられることが多く、細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合である。細胞のゲノムは、１つもしくは複数の染色体を含んでもよい。

「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質の複合体、又は細胞の染色体核型の一部分ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例としては、プラスミド及び特定のウイルスゲノムが挙げられる。

「到達可能な領域」は、核酸に存在する標的部位に、この標的部位を認識する外来分子が結合することが可能な、細胞内クロマチンの中の部位である。任意の特定の理論によって束縛されることを望まないが、到達可能な領域は、ヌクレオソーム構造の中にはない領域であると考えられている。到達可能な領域の独特の構造は、化学物質及び酵素によるプローブ、例えば、ヌクレアーゼに対する感度によって検出可能であることが多い。

「標的部位」又は「標的配列」は、結合が存在するのに十分な条件であれば結合分子が結合するような核酸の一部分を規定する核酸配列である。例えば、５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’配列は、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。

「外来」分子は、細胞内に通常は存在しないが、１つもしくは複数の遺伝的な方法、生化学的な方法、又は他の方法によって細胞に導入することが可能な分子である。「細胞内に通常は存在する」は、細胞の特定の進化段階及び環境条件について決定される。従って、例えば、筋肉の胚期の成長中にのみ存在する分子は、成人の筋肉細胞に関しては外来分子である。同様に、熱ショックによって誘発される分子は、熱ショックを受けていない細胞に関しては外来分子である。外来分子は、例えば、機能不全の外来分子のうち、正常に機能するもの、又は正常に機能する外来分子のうち、機能不全のものを含んでもよい。

外来分子は、特に、コンビナトリアル化学プロセスによって作られるような低分子分子であってもよく、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類のような高分子、上述の分子の任意の改変された誘導体、又は上述の１つもしくは複数の分子を含む任意の複合体であってもよい。ＤＮＡ及びＲＮＡを含む核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、線状でもよく、分岐していてもよく、又は環状であってもよく、任意の長さを有していてもよい。核酸は、二本鎖を形成可能なもの、及び三本鎖を形成する核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号及び第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質としては、ＤＮＡ結合性タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合性タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼ、ヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。また、外来分子は、その細胞の由来である種とは異なる種から誘導された、内在性分子と同じ種類の分子であってもよい。例えば、配列決定されたヒト核酸を、元来はマウス又はハムスターに由来する細胞株に導入してもよい。

外来分子は、内在性分子と同じ種類の分子であってもよく、例えば、外来タンパク質又は核酸であってもよい。例えば、外来核酸は、細胞に導入された感染ウイルスのゲノム、プラスミド又はエピソームを含んでいてもよく、又は、細胞に通常は存在しない染色体を含んでいてもよい。外来分子を細胞に導入する方法は、当業者には知られており、脂質による移動（すなわち、中性脂質及びカチオン性脂質を含むリポゾーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子衝突、リン酸カルシウムによる共沈、ＤＥＡＥ−デキストランによる移動、ウイルスベクターによる移動が挙げられるが、これらに限定されない。また、外来分子は、異なる種に由来する核酸を指すことができ、例えば、ハムスターゲノムに挿入されたヒト遺伝子を指すことができる。

対照的に、「内在性」分子は、特定の環境条件で、特定の進化段階にある特定の細胞に通常に存在する分子である。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体又は他のオルガネラ、又は天然に存在するエピソームの核酸を含んでもよい。さらなる内在性分子としては、タンパク質、例えば、転写因子及び酵素が挙げられる。

「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が接続している分子であり、好ましくは共有結合している分子である。サブユニット分子は、同じ化学種の分子であってもよく、又は、異なる化学種の分子であってもよい。第１の種類の融合分子の例としては、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと開裂ドメインとが融合したもの）、融合核酸（例えば、上に記載した融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の種類の融合分子の例としては、三本鎖を形成する核酸とポリペプチドとが融合したもの、副溝バインダーと核酸とが融合したものが挙げられるが、これらに限定されない。

細胞内での融合タンパク質の発現は、融合タンパク質を細胞に送達することによって生じてもよく、又は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に送達することによって生じてもよく、このとき、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳され、融合タンパク質が生成する。トランススプライシング、ポリペプチド開裂及びポリペプチドのライゲーションは、細胞内でのタンパク質の発現に関与している場合もある。ポリヌクレオチド及びポリペプチドを細胞に送達する方法は、本開示の他の箇所で示されている。

「遺伝子」は、本開示の目的のために、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（以下参照）と、遺伝子産物の産生を制御するすべてのＤＮＡ領域とを含み、このような制御配列がコード配列及び／又は転写配列に隣接していてもよく、隣接していなくてもよい。従って、遺伝子は、必ずしも以下のものに限定するわけではなく、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列、例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム侵入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、遺伝子座調節領域を含む。

「遺伝子発現」は、ある遺伝子に含まれる情報を遺伝子産物へと変換することを指す。遺伝子産物は、遺伝子を直接転写した産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）リボザイム、構造ＲＮＡ又は任意の他の種類のＲＮＡ）、又はｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であってもよい。また、遺伝子産物としては、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、エディティングのようなプロセスによって改変されたＲＮＡ、および、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化、グリコシル化によって改変されたタンパク質が挙げられる。

遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性を変えることを指す。発現の調節としては、遺伝子の活性化及び遺伝子の発現が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子の不活性化は、本明細書に記載されているＺＦＰを含まない細胞と比較して、遺伝子の発現が何らかの形で低下することを指す。従って、遺伝子の不活性化は、完全なものであってもよく（ノックアウト）、又は部分的なものであってもよい（例えば、遺伝子が、通常の発現レベルよりも低い低次形態、又は、影響を与える活性が部分的に低下した、変異遺伝子の産物）。

「真核」細胞としては、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞（例えば、、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。

「目的の領域」は、細胞内クロマチンの任意の領域であり、例えば、遺伝子、又は遺伝子内にあるか、又は遺伝子に隣接する非コード領域であり、外来分子に結合することが望ましい。結合は、標的ＤＮＡを開裂させるため、及び／又は標的とする組み換えのためであってもよい。目的の領域は、染色体、エピソーム、オルガネラのゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）の中に存在していてもよく、又は、例えば感染ウイルスのゲノムの中に存在していてもよい。目的の領域は、遺伝子のコード領域内にあってもよく、コード領域の上流又は下流の、転写された非コード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列又はイントロンの中にあってもよく、又は、転写されていない領域の中にあってもよい。目的の領域は、１個のヌクレオチド対と同等の大きさであってもよく、２，０００ヌクレオチド対の長さであってもよく、又は任意の整数値のヌクレオチド対であってもよい。

用語「動作可能な接続」及び「動作可能に接続する」（又は「操作可能に接続する」）は、同じ意味で用いられ、２つ以上の成分（例えば、配列の要素）を併用することを指す場合に、両方の成分が正常に機能し、少なくとも１つの成分が、他の少なくとも１つの成分に影響を及ぼす機能に関与する可能性をもつように整列している。実例として、転写制御配列、例えばプロモーターは、転写制御配列が、１つもしくは複数の転写制御因子の有無に反応して、コード配列の転写レベルを制御する場合、コード配列に動作可能に接続する。転写制御配列は、一般的に、コード配列に対してｃｉｓになるように、動作可能に接続するが、コード配列に直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、コード配列に近接してはいないが、コード配列に動作可能に接続している転写制御配列である。

融合ポリペプチドに関し、用語「動作可能に接続する」は、それぞれの成分が、他の成分と接続している場合に、接続していない場合と同じ機能を発揮するという事実を指す場合がある。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが開裂ドメインに融合している融合ポリペプチドに関し、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン及び開裂ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位及び／又は結合部位に結合することが可能であり、一方、開裂ドメインが、標的部位の近くにあるＤＮＡを開裂させることが可能である場合に、動作可能な接続である。

タンパク質、ポリペプチド又は核酸の「融合フラグメント」は、配列が、全長タンパク質、ポリペプチド又は核酸と同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチド又は核酸と同じ機能を保持しているタンパク質、ポリペプチド又は核酸である。機能性フラグメントは、対応する天然の分子より多い数の残基を含んでいてもよく、天然の分子より少ない数の残基を含んでいてもよく、又は天然の分子と同じ数の残基を含んでいてもよく、及び／又は１つもしくは複数のアミノ酸又はヌクレオチドの置換を含んでいてもよい。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定する方法は、当該技術分野で十分に知られている。同様に、タンパク質の機能を決定する方法も十分に知られている。例えば、フィルタ結合アッセイ、電気泳動による移動度シフトアッセイ、又は免疫沈降アッセイによって、例えば、ポリペプチドがＤＮＡに結合する機能も決定することができる。ＤＮＡの開裂は、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前出）を参照。例えば、共免疫沈降法、ツーハイブリッドアッセイ、又は相補性によって、遺伝的かつ生化学的に、あるタンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力を決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，２４５号、ＰＣＴ ＷＯ ９８／４４３５０号を参照されたい。

用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、ポリクローナル及びモノクローナルの調製から得られる抗体を含み、さらに、以下のものを含む。ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３４９：２９３−２９９；及び米国特許第４，８１６，５６７号を参照）；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント及びＦ（ａｂ）フラグメント；Ｆｖ分子（非共有結合によるヘテロ二量体、例えば、Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７２）６９：２６５９−２６６２；及びＥｈｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８０）１９：４０９１−４０９６を参照）；一本鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８８）８５：５８７９−５８８３を参照）；ダイマー及びトリマーの抗体フラグメント構築物；ミニボディ（例えば、Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９２）３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１４９Ｂ：１２０−１２６を参照）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：１５３４−１５３６；及び英国特許公開第ＧＢ ２，２７６，１６９号、１９９４年９月２１日公開を参照）；このような分子から得られる任意の機能性フラグメント、ここで、このようなフラグメントは、親である抗体分子の免疫結合特性を保持している。

本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、均一な抗体の集合を含む抗体組成物を指す。この用語は、抗体の種類又は起源に関する限定はなく、製造される様式によっても限定されないことが意図されている。この用語は、免疫グロブリン全体だけではなく、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖのようなフラグメント、他のフラグメント、及び親であるモノクローナル抗体分子の免疫結合特性を示す、キメラ抗体及びヒト化抗体の均一な抗体の集合を包含する。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ
本明細書では、ＧＳ遺伝子を不活性化するために使用可能なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が記載されている。ＺＦＮは、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と、ヌクレアーゼ（開裂）ドメインとを含む。

Ａ．ジンクフィンガータンパク質
ジンクフィンガー結合ドメインは、選択した配列に結合するように操作されてもよい。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新しい結合特性を有していてもよい。操作方法としては、合理的な設計及び種々の選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的な設計は、例えば、３個（又は４個の）ヌクレオチドの配列及び個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを用いることを含み、それぞれの３個又は４個のヌクレオチドの配列は、特定の３個又は４個の配列に結合するジンクフィンガーの１つもしくは複数のアミノ酸配列と結合する。例えば、その全体が参照により組み込まれる、共同所有されている米国特許６，４５３，２４２号及び第６，５３４，２６１号を参照されたい。

ファージディスプレイ及びツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，４１０，２４８号；第６，１４０，４６６号；第６，２００，７５９号；第６，２４２，５６８；さらに、ＷＯ９８／３７１８６号；ＷＯ９８／５３０５７号；ＷＯ００／２７８７８号；ＷＯ０１／８８１９７号、第ＧＢ２，３３８，２３７号に開示されている。それに加え、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性を高めることが、例えば、共同所有されているＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。

標的部位の選択；ＺＦＰ、及び融合タンパク質（及び、これをコードするポリヌクレオチド）を設計し、構築する方法は、当業者に知られており、米国特許公開第２００５００６４４７４号及び第２００６０１８８９８７号に詳細に記載されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。

それに加え、これらの参考文献及び他の参考文献に開示されているように、ジンクフィンガードメイン及び／又は複数のフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質は、任意の適切なリンカー配列、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを用いて接続されていてもよい。また、例示的な６アミノ酸長以上のリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に任意の適切なリンカーの組み合わせを含んでいてもよい。さらなるリンカー構造の例は、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｆｏｒ Ｌｉｎｋｉｎｇ ＤＮＡーＢｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ Ａｎｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｏｍａｉｎｓという名称で２００８年５月２８日に出願した米国仮出願第６１／１３０，０９９号の中にみいだされる。

表１は、ＧＳ遺伝子内のヌクレオチド配列に結合するように操作されたいくつかのジンクフィンガー結合ドメインを記載している。また、図１及び図３も参照されたい。それぞれの行は、別個のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを記載している。各ドメインのＤＮＡ標的配列は、第１列に示されており、第２列〜第５列は、タンパク質中の各ジンクフィンガー（Ｆ１〜Ｆ４、Ｆ５又はＦ６）の認識領域のアミノ酸（ヘリックスの開始点からアミノ酸−１〜＋６）の配列を示す。大文字で示されているヌクレオチドは、ジンクフィンガーが直接標的としているトリプレットを示し、小文字で示されているヌクレオチドは、ジンクフィンガーが直接標的にはしていない塩基を示す（例えば、フィンガー間のリンカーが長いため、塩基が「飛ばされる」場合がある）。また、第１列には、タンパク質の識別番号が与えられている。

以下に示すように、特定の実施形態では、表１に示されている４つ、５つ又は６つのフィンガー結合ドメインが、例えば、ＦｏｋＩのようなＩＩ型の制限エンドヌクレアーゼの開裂ドメインの開裂ハーフドメインに融合する。例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号及び第２００７０２１８５２８号に開示されているように、標的を開裂するために、このようなジンクフィンガー／ヌクレアーゼハーフドメイン融合物の１つもしくは複数の対を用いる。

標的を開裂する場合、結合部位の近傍で５個以上のヌクレオチド対によって分けることができ、それぞれの融合タンパク質は、ＤＮＡ標的の反対側の鎖に結合することができる。ＧＳ遺伝子の標的開裂に、表１に示されているタンパク質のすべての対の組み合わせを用いてもよい。本開示に従って、ＺＦＮは、ＧＳ遺伝子の任意の配列を標的にしていてもよい。

Ｂ．開裂ドメイン
ＺＦＮは、ヌクレアーゼ（開裂ドメイン、開裂ハーフドメイン）も含んでいる。本明細書に開示されている融合タンパク質の開裂ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼから得ることができる。エンドヌクレアーゼから開裂ドメインを得ることが可能な例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、２００２−２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；及びＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを開裂するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ；ミクロコッカスヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；また、Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（編集）Ｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照）。これらの酵素のうち、１つもしくは複数の酵素（又はこれらの機能性フラグメント）を、開裂ドメイン及び開裂ハーフドメインの原料として用いてもよい。

同様に、開裂ハーフドメインは、上述のように、開裂活性のために二量化が必要な任意のヌクレアーゼ又はこれらの一部分から誘導してもよい。一般的に、融合タンパク質が開裂ハーフドメインを含む場合には、開裂のために２つの融合タンパク質が必要である。又は、２つの開裂ハーフドメインを含む１つのタンパク質を用いてもよい。この２つの開裂ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（又はその機能性フラグメント）から誘導されてもよく、それぞれの開裂ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（又はその機能性フラグメント）から誘導されてもよい。それに加え、２つの融合タンパク質の標的部位は、好ましくは、それぞれの標的部位に２つの融合タンパク質が結合することによって、例えば、開裂ハーフドメインが二量化によって機能的な開裂ドメインを形成することが可能なような空間位置に、開裂ハーフドメインが位置するように、お互いに配置されている。従って、特定の実施形態では、標的部位の近傍で、５〜８ヌクレオチド又は１５〜１８ヌクレオチドに分けることができる。しかし、任意の整数のヌクレオチド又はヌクレオチド対が、２つの標的部位の間にはさまっていてもよい（例えば、２〜５０ヌクレオチド対又はそれ以上）。一般的に、開裂部位は、標的部位と標的部位の間にある。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在しており、配列特異的にＤＮＡに結合することができ（認識部位で）、結合部位で、又は結合部位周辺でＤＮＡを開裂する。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを開裂し、分離可能な結合ドメインと開裂ドメインとを有している。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、片方の鎖の認識部位から９ヌクレオチド離れた部位で、他方の鎖の認識部位から１３ヌクレオチド離れた部位でＤＮＡの二本鎖の開裂を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号、第５，４８７，９９４号；及びＬｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。このように、ある実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素に由来する開裂ドメイン（又は開裂ハーフドメイン）と、１つもしくは複数のジンクフィンガー結合ドメインとを含み、ジンクフィンガー結合ドメインは操作されていても、操作されていなくてもよい。

開裂ドメインを結合ドメインから分離することが可能なＩＩＳ型制限酵素の例は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０，５７０−１０，５７５。従って、本開示の目的のために、開示されている融合タンパク質で使用するＦｏｋＩ酵素の一部分は、開裂ハーフドメインであると考えられる。従って、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を用いて、標的の二本鎖を開裂し、及び／又は標的の細胞内配列を交換する場合、触媒的に活性な開裂ドメインを再構築するために、それぞれＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を用いてもよい。又は、１個のジンクフィンガー結合ドメインと２個のＦｏｋＩ開裂ハーフドメインとを含む、１個のポリペプチド分子を用いてもよい。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を用いた、標的の開裂及び標的配列の交換に関するパラメータは、本開示の別の部分に記載されている。

開裂ドメイン又は開裂ハーフドメインは、開裂活性を保持するタンパク質の任意の部分であってもよく、又は、多量体化（例えば、二量化）して機能性開裂ドメインを形成する能力を保持している部分であってもよい。

例示的なＩＩＳ型制限酵素は、国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号に記載されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。また、さらなる制限酵素は、分離可能な結合ドメインと開裂ドメインとを有しており、これらの制限酵素は、本開示によって想定されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。

特定の実施形態では、開裂ドメインは、例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれている米国特許公開第２００５００６４４７４号；第２００６０１８８９８７号、第２００８０１３１９６２号に記載されているように、ホモ二量化が最小限になっているか、又は抑制されている１つもしくは複数の操作された開裂ハーフドメイン（二量化ドメイン変異体とも呼ばれる）を含む。ＦｏｋＩの位置４４６、位置４４７、位置４７９、位置４８３、位置４８４、位置４８６、位置４８７、位置４９０、位置４９１、位置４９６、位置４９８、位置４９９、位置５００、位置５３１、位置５３４、位置５３７、位置５３８にあるアミノ酸残基は、すべて、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインの二量化に影響を与える標的である。

必須ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの操作された開裂ハーフドメインの例としては、ＦｏｋＩの位置４９０及び５３８にあるアミノ酸残基に変異を含む第１の開裂ハーフドメインと、アミノ酸残基４８６及び４９９に変異を含む第２の開裂ハーフドメインとの対が挙げられる。

従って、ある実施形態では、４９０での変異によって、Ｇｌｕ（Ｅ）がＬｙｓ（Ｋ）と置き換わっており；５３８での変異によって、Ｉｓｏ（Ｉ）がＬｙｓ（Ｋ）に置き換わっており；４８６での変異によって、Ｇｌｎ（Ｑ）がＧｌｕ（Ｅ）に置き換わっており；位置４９９での変異によって、Ｉｓｏ（Ｉ）がＬｙｓ（Ｋ）に置き換わっている。特定的には、本明細書に記載されているような操作された開裂ハーフドメインは、ある開裂ハーフドメインで位置４９０（Ｅ→Ｋ）及び５３８（Ｉ→Ｋ）で変異させ、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と呼ばれる操作された開裂ハーフドメインを作り、別の開裂ハーフドメインで４８６（Ｑ→Ｅ）及び４９９（Ｉ→Ｌ）で変異させ、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と呼ばれる操作された開裂ハーフドメインを作ることによって調製された。この例で記載されているように、あるＺＦＮが「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」開裂ドメインを含み、他のＺＦＮが「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」開裂ドメインを含むＺＦＮ対は、「ＥＬ／ＫＫ」ＺＦＮ対とも呼ばれる。本明細書に記載されているような操作された開裂ハーフドメインは、これらの開裂ハーフドメインを含む１つもしくは複数のヌクレアーゼ対を開裂に使用する場合、異常な開裂が最小限になっているか、又はまったく起こらない、必須ヘテロ二量体の変異体である。例えば、あらゆる目的のために、その全体が本明細書に参照により組み込まれる米国特許公開第２００８０１３１９６２号を参照されたい。

本明細書に記載されているような操作された開裂ハーフドメインは、任意の適切な方法によって、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号（実施例５）及び第２００７０１３４７９６号（実施例３８）に記載されているような野生型開裂ハーフドメイン（Ｆｏｋ Ｉ）の部位特異的突然変異誘発によって、調製することができる。

Ｃ．ＧＳにおいて標的を開裂するためのさらなる方法
本明細書に開示されている方法で、ＧＳ遺伝子に標的部位を有する任意のヌクレアーゼを用いてもよい。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼは、非常に長い認識配列を有しており、そのうちいくつかは、統計的基礎に従って、ヒトと同じくらいの長さのゲノムに１つ存在すると思われている。ＧＳ遺伝子において標的を開裂するために、ＧＳ遺伝子内に固有の標的部位を有する任意のこのようなヌクレアーゼを、ジンクフィンガーヌクレアーゼの代わりに用いてもよく、又はジンクフィンガーヌクレアーゼに加えて用いてもよい。

例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。これらの認識配列は知られている。また、米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。

ほとんどのホーミングエンドヌクレアーゼの開裂特異性は、それらの認識部位に関して絶対的ではないが、それらの部位は、認識部位の１個のコピーを有する細胞内でホーミングエンドヌクレアーゼを発現することによって、哺乳動物と同じくらいの長さのゲノムあたり１回の開裂事象を得るのに十分な長さを有する。また、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの特異性を、天然にはない標的部位に結合するように操作することができることも報告されている。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９−６６を参照されたい。従って、所望の標的遺伝子座、例えば、ＧＳに特異的に結合するように設計された、操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ及び／又はメガヌクレアーゼを用いてもよい。

送達
本明細書に記載されているＺＦＮは、任意の適切な手段によって標的細胞に送達されてもよい。適切な細胞としては、真核細胞及び原核細胞及び／又はこれらの細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。このような細胞又は細胞株の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６細胞、及び、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）のような昆虫細胞、又は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのような真菌細胞が挙げられる。

ジンクフィンガーを含むタンパク質を送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号；第６，５０３，７１７号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，６０７，８８２号；第６，６８９，５５８号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；第７，１６３，８２４号に記載されており、これらの開示はすべて、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。

また、本明細書に記載されているようなＺＦＮは、１つもしくは複数のＺＦＮをコードする配列を含むベクターを用いて送達されてもよい。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（だだし、これらに限定されない）などを含む任意のベクター系を用いてもよい。また、その全体が本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号；第６，６０７，８８２号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；第７，１６３，８２４号を参照されたい。さらに、これらの任意のベクターが、１つもしくは複数のＺＦＮをコードする配列を含んでいてもよいことも明らかであろう。従って、１つもしくは複数のＺＦＮ対が細胞に導入される場合、ＺＦＮは、同じベクター又は異なるベクターに保持されていてもよい。複数のベクターを用いる場合、それぞれのベクターは、１個又は複数個のＺＦＮをコードする配列を含んでいてもよい。

従来のウイルスに由来する遺伝子及び非ウイルスに由来する遺伝子を移動する方法を用い、細胞（例えば、哺乳動物の細胞）及び標的組織に、操作されたＺＦＰをコードする核酸を導入してもよい。また、このような方法を用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞にＺＦＰをコードする核酸を投与してもよい。特定の実施形態では、ＺＦＰをコードする核酸を、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療用途で、又はｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子治療用途で投与する。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ネイキッドＤＮＡ、リポゾーム又はポロキサマーのような送達ビヒクルと複合体化した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡ及びＲＮＡのウイルスを含み、細胞に送達した後に、エピソームのゲノム又は組み込まれたゲノムを有していてもよい。遺伝子治療手順の総説としては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ（編集）（１９９５）；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）を参照されたい。

操作されたＺＦＰをコードする核酸の非ウイルス送達方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロゾーム、リポゾーム、免疫リポゾーム、ポリカチオン又は脂質：核酸接合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、薬剤によって高められたＤＮＡの取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を用いたソノポレーションを核酸の送達に用いてもよい。

さらなる例示的な核酸送達系としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ドイツ、ケルン）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（メリーランド州ロックビル）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（マサチューセッツ州ホリストン）、Ｃｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（例えば、米国特許第６，００８，３３６を参照）によって提供されるものが挙げられる。

リポフェクションは、例えば、ＵＳ５，０４９，３８６号、ＵＳ４，９４６，７８７号；ＵＳ４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ^TM及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ^TM）は、市販されている。ポリヌクレオチドの効果的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質及び中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものが挙げられる。細胞に送達されてもよく（ｅｘ ｖｉｖｏ投与）、又は標的組織に送達されてもよい（ｉｎ ｖｉｖｏ投与）。

標的とするリポゾームを含む脂質：核酸複合体、例えば、免疫脂質複合体の調製は、当業者にはよく知られている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号、第４，９４６，７８７号を参照）。

操作されたＺＦＰをコードする核酸を送達するためのＲＮＡウイルス又はＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイルスを、体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスのペイロードを核に導入させるために非常に発達したプロセスを活用する。ウイルスベクターを、患者に直接投与してもよく（ｉｎ ｖｉｖｏ）、又は、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで治療するためにウイルスベクターを用いてもよく、その改変された細胞を患者に投与してもよい（ｅｘ ｖｉｖｏ）。従来のウイルスに基づくＺＦＰ送達系としては、遺伝子導入のためのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター及びヘルペス単純ウイルスベクターが挙げられるが、これらに、限定されない。宿主ゲノムの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスの遺伝子導入方法を用いて可能であり、多くは、挿入されたトランス遺伝子が長期間にわたって発現する。さらに、多くの異なる細胞種及び標的組織で高い導入効率が観察されている。

レトロウイルスの親和性は、外来エンベロープタンパク質を取り入れ、標的細胞の有望な標的の集合を増やすことによって変えることができる。レンチウイルスベクターは、分割していない細胞に形質導入するか、又は感染させることが可能なレトロウイルスベクターであり、典型的には、ウイルス力価が高い。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織によって変わる。レトロウイルスベクターは、外来配列のパッケージング能が６〜１０ｋｂまでのシス作用性の長端末反復で構成されている。最小のシス作用性ＬＴＲは、ベクターを複製し、パッケージングするのに十分であり、次いで、標的細胞に治療用遺伝子を組み込むために用いられ、永久的にトランス遺伝子を発現する。広範囲に使用されるレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びこれらの組み合わせに由来するものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照）。

ＺＦＰ融合タンパク質の一過性発現が好ましい用途では、アデノウイルスに由来する系を用いてもよい。アデノウイルスに由来するベクターは、多くの細胞種において、きわめて高い導入効率を可能にしており、細胞分割を必要としない。このようなベクターを用い、力価が高く、高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生させることができる。また、細胞に標的核酸を形質導入するために、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの核酸及びペプチドの産生において、また、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療手順のために、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを用いる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１号；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照）。組み換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含む、いくつかの刊行物に記載されている。

臨床試験で遺伝子導入するために、少なくとも６種類のウイルスベクターによるアプローチが現時点で利用可能であり、これらは、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子によって欠損ベクターを補完し、形質導入剤を作成することを含むアプローチを利用している。

ｐＬＡＳＮ及びＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８−３０５（１９９５）；Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）；Ｍａｌｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療の治験で初めて使用された治療用ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０（１９９５））。ＭＦＧ−Ｓをパッケージングしたベクターで、５０％以上の導入効率が観察された（Ｅｌｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）；Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。

組み換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損型の非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに由来する、代替法として有望な遺伝子送達系である。すべてのベクターは、トランス遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５末端逆位配列のみが保持されているプラスミドから誘導される。形質導入された細胞のゲノムに取り込まれることによる、有効な遺伝子導入及び安定なトランス遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２−３（１９９８），Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：７４８−５５（１９９６））。

複製能が欠損した組み換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高い力価で産生され、いくつかの異なる細胞種を容易に感染させることができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、トランス遺伝子が、Ａｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、及び／又はＥ３遺伝子を置き換えるように操作されており、次いで、複製能が欠損したベクターをヒト２９３細胞内で増殖させ、欠損した遺伝子機能をトランスに供給する。Ａｄベクターを、ｉｎ ｖｉｖｏで、肝臓、腎臓、筋肉にみられるような分割せず、分化しない細胞を含めた複数の種類の組織に形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな輸送能力を有する。Ａｄベクターを臨床試験で使用する例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫療法のためのポリヌクレオチド治療を含んでいた（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験で遺伝子導入のためにアデノウイルスベクターを用いるさらなる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５−１０（１９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３−１０８９（１９９８）；Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）；Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）；Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。

パッケージング細胞を用い、宿主細胞を感染させることが可能なウイルス粒子を作る。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、レトロウイルスをパッケージングするψ２細胞又はＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療で用いられるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス粒子内にパッケージングするプロデューサー細胞株によって作られる。ベクターは、典型的には、パッケージングし、宿主に組み込む（適用可能な場合）のに必要な最小ウイルス配列を含んでおり、他のウイルス配列は、発現させたいタンパク質をコードする発現カセットと置き換わっている。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療で用いられるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングし、宿主ゲノムに組み込むのに必要な、ＡＡＶゲノム由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有している。ウイルスＤＮＡは、細胞株にパッケージングされ、他のＡＡＶ遺伝子をコードするヘルパープラスミド、すなわちｒｅｐ及びｃａｐを含んでいるが、ＩＴＲ配列は含んでいない。また、この細胞株は、ヘルパーとしてアデノウイルスで感染している。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製と、ヘルパープラスミドに由来するＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。このヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を含んでいないため、それほど多い量はパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感度が高い処理、例えば熱処理によって減らすことができる。

多くの遺伝子治療用途では、遺伝子治療ベクターが、特定の種類の組織に対して特異性が高い状態で送達されることが望ましい。従って、ウイルスの外側表面に、ウイルスコーティングタンパク質を含む融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、ウイルスベクターが所与の細胞型に対する特異性を有するように改変してもよい。このリガンドは、目的の細胞型に存在することが知られている受容体に対するアフィニティを有するように選択される。例えば、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように改変することができ、この組み換えウイルスに、ヒト上皮成長因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞が感染することを報告した。この原理を他のウイルス−標的細胞の対に拡張することができ、このとき、標的細胞は受容体を発現し、ウイルスは、細胞表面にある受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する。例えば、糸状ファージは、実際に選んだ任意の細胞内受容体に対し、特異的な結合アフィニティを有する抗体フラグメント（例えば、ＦＡＢ又はＦｖ）を示すように操作することができる。上述の記載は、主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することもできる。このようなベクターは、特定の標的細胞によって取り込まれやすい、特定の取り込み配列を含むように操作することができる。

遺伝子治療ベクターを、個々の患者に投与することによってｉｎ ｖｉｖｏで、典型的には、以下に示すように、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、又は頭蓋内への注入）又は局所適用によって送達してもよい。又は、ベクターをｅｘ ｖｉｖｏで、細胞、例えば、個々の患者から取り出した細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）又は万能供血者の造血幹細胞に送達し、次いで、通常は、ベクターが組み込まれた細胞を選択した後に、その細胞を患者に再び移植してもよい。

診断、研究又は遺伝子治療のためのｅｘ ｖｉｖｏでの細胞トランスフェクション（例えば、トランスフェクトした細胞を宿主である生物に再び注入することによる）は、当業者に十分に知られている。好ましい実施形態では、被検体である生物から細胞を単離し、ＺＦＰ核酸（遺伝子又はｃＤＮＡ）でトランスフェクトし、被検体である生物（例えば、患者）に再び注入する。ｅｘ ｖｉｖｏでトランスフェクトするのに適した種々の細胞型は、当業者に十分に知られている（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版、１９９４））、及び患者由来の細胞を単離し、培養する方法に関する記載について、この文献に引用されている参考文献を参照）。

一つの実施形態では、細胞トランスフェクション及び遺伝子治療のためのｅｘ ｖｉｖｏ手順で、幹細胞を使用する。幹細胞を用いる利点は、幹細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで他の細胞型に分化させることが可能なことであり、又は、骨髄に移植し、哺乳動物（例えば、細胞のドナー）に導入することができることである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αのようなサイトカインを用い、ＣＤ３４＋細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで臨床的に重要な免疫細胞型に分化させる方法が知られている（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照）。

幹細胞は、既知の方法を用い、形質導入及び分化のために単離される。例えば、幹細胞は、望ましくない細胞、例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、Ｉａｄ（分化した抗原提示細胞）に結合する抗体を用い、骨髄細胞のパニングによって骨髄細胞から単離される（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照）。

また、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞に形質導入するために、治療用ＺＦＰ核酸を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポゾームなど）を生物に直接投与してもよい。又は、ネイキッドＤＮＡを投与してもよい。分子を導入し、最終的に血液又は組織細胞と接触させるのに通常使用されるよ投与法は、以下のものに限定されないが、注射、注入、局所適用、エレクトロポレーションを含む任意の経路で投与する。このような核酸を投与するのに適切な方法が利用可能であり、当業者には十分に知られており、特定の組成物を投与するのに二種類以上の経路を用いてもよいが、しばしば、特定の経路が、別の経路よりも迅速で効率のよい反応を引き起こすことができる。

ＤＮＡを造血幹細胞に導入する方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。トランス遺伝子を造血幹細胞に、例えば、ＣＤ３４⁺細胞に導入するのに有用なベクターとしては、３５型アデノウイルスが挙げられる。

トランス遺伝子を免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入するのに適したベクターとしては、組み込みが起こらないレンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、Ｏｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３８２−１１３８８；Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１；Ｚｕｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０；Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７−２２２を参照。

医薬的に許容されるキャリアは、一部は、投与される特定の組成物によって決定され、一部は、組成物を投与するのに用いる特定の方法によって決定される。従って、以下に示すような、利用可能な医薬組成物の広範囲の適切な配合物が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版、１９８９を参照）。

上述のように、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞（ただし、これらの細胞に限定されない）を含む任意の種類の細胞内で、開示されている方法及び組成物を用いてもよい。タンパク質を発現するのに適した細胞株は、当業者に知られており、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）のような昆虫細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのような真菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞の子孫細胞、改変体及び誘導体を用いてもよい。

適用
ＧＳゲノム配列を不活性化するために、開示されている方法及び組成物を用いてもよい。上述のように、不活性化は、細胞内でＧＳ遺伝子の発現を部分的又は完全に抑制することを含む。ＧＳ遺伝子の不活性化は、例えば、１回の開裂事象によって、又は開裂した後、非相同末端結合によって、又は２箇所で開裂した後、この２つの開裂部位の間の配列を除去するように結合することによって、又はコード領域内にミスセンスコドン又はナンセンスコドンを標的として組み換えることによって、又は無関係な配列（すなわち、「スタッファー」配列）を標的として、遺伝子又はその制御領域を破壊するように、遺伝子又はその制御領域に組み換えることによって、又はスプライスアクセプター配列を標的として、イントロンに組み換え、転写物のミススプライシングを引き起こすことによって、達成することができる。

従って、本明細書に記載されている方法及び組成物によって、組み換えタンパク質の産生、例えば、α１−抗トリプシン抗体及び／又はモノクローナル抗体の産生に用いるためのＧＳ欠損細胞株を作成することができる。ＦＵＴ８が不活性化されている細胞が、大きなエフェクター機能を示す抗体、特にＡＤＣＣの誘発において大きなエフェクター機能を示す抗体を産生するため、さらなる遺伝子、例えば、ＦＵＴ８を不活性化してもよい。

実施例
実施例１：ＺＦＮの設計及び構築
Ａ．グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）のＺＦＮ
ＣＨＯゲノムの全配列は入手できないため、ＣＨＯ ＧＳ遺伝子をクローン化し、配列を決定し、ＺＦＮ設計のための標的ＤＮＡ配列を作成した。完全なＣＨＯ ＧＳ 配列が図１３に示されており、イントロン及びエクソンも示されている。

ＣＨＯ ＧＳ遺伝子のエクソン６にあるＺＦＮ標的部位が、入手可能な結晶構造に基づくＧＳタンパク質の触媒機能に必須のアミノ酸をコードしているため、この領域が選択され（例えば、Ａｌｍａｓｓｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２３：３０４−３０９；Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：９８６３−９８７２；Ｌｉａｗ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：６７５−６８１を参照）、この部位がＺＦＮによって変異すると、ＧＳの機能の活性が失われると予想された。ＣＨＯ ＧＳのエクソン６の部分的な配列を以下に示す。大文字はエクソン配列を示し、小文字はイントロン配列を示し、ＺＦＮ標的部位９３７２／９０７５（表１、図１Ａ及び図４Ａ）には下線が引かれている。

ＺＦＮ９３７２及びＺＦＮ９０７５への結合部位は図４Ｂに示されており、一方、図４Ｃは、これらのＺＦＮの標的及びフィンガーの設計を示している。

それに加え、エクソン２の部位を標的とするＺＦＮも設計された。ＣＨＯのエクソン２の部分的な配列を以下に示す。大文字はエクソン配列を示し、小文字はイントロン配列を示し、ＺＦＮ標的部位８３６５／８３６１（表１及び図１Ａ）には下線が引かれている。

ＣＨＯ ＧＳ配列（例えば、表１に示されているような）を標的とするＺＦＮを、米国特許出願第１２／２１８，０３５号に記載されているように哺乳動物の発現ベクター内でアセンブルし、ＣＨＯ細胞に一過性導入することによって試験した。

Ｂ．ＤＨＦＲのＺＦＮ
ＤＨＦＲを標的とするＺＦＮを、米国特許公開第２００８／００１５１６４号に記載されているように設計し、製造した。本明細書に記載されている実験では、９４６１／７８４４及び９４７６／９４７７と称されるＤＨＦＲ ＺＦＮ対（個々のＺＦＮは表２に示されている）を用いた。

Ｃ．ＦＵＴ８のＺＦＮ
ＦＵＴ８を標的とするＺＦＮを、米国特許出願第１２／２１８，０３５号に記載されているように設計し、製造した。本明細書に記載されている実験では、１２１７６及び１２１７２と称され、表３に記載されているＦＵＴ８のＺＦＮを使用した。

上述のＺＦＮをコードする配列を含むプラスミドを、本質的には、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３５（７０４２）：６４６−６５１に記載されているように、米国特許公開第２００８／０１３１９６２号及びＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：７７８−７８５に記載されているような野生型ＦｏｋＩ開裂ドメイン又は必須ヘテロ二量体であるＦｏｋＩ開裂ドメインへの融合によって構築した。

実施例２：内在性ＧＳのＧＳ−ＺＦＮ改変
ＧＳを標的とするＺＦＮが、内在性ＧＳの遺伝子座を予想どおりに改変するか否かを決定するために、本質的には製造業者の使用説明書に従って、ＣＥＬ−１ミスマッチアッセイを行なった（Ｔｒａｎｇｅｎｏｍｉｃ ＳＵＲＶＥＹＯＲ^TM）。簡単に説明すると、適切なＺＦＮプラスミド対を、血清を含有する培地で付着しながら増殖するＣＨＯ Ｋ−Ｉ細胞に、又は血清を含まない既知組成培地の懸濁物中で増殖するＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトした。

ＣＨＯ Ｋ−Ｉ細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得て、推奨されているように、この用途に適した１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補給したＦ−１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させた。ＣＨＯ−Ｓ細胞をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールズバッドＣＡ）から購入し、湿度を制御したインキュベーターシェーカー（ＡＴＲ，ｉｎｃ．（メリーランド州ローレル））中、３７℃、５％ＣＯ₂、１２５ｒｐｍで、必要な場合、８ｍＭ Ｌ−グルタミン及びＨＴサプリメント（１００μＭヒポキサンチンナトリウム及び１６μＭチミジン）（すべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールズバッド）製）を追加した、タンパク質を含まず、動物成分を含まない既知組成のＣＤ−ＣＨＯ培地中で増殖させ、懸濁培養物として維持した。

ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ^TMプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、プラスチック容器から付着細胞を剥離した。トランスフェクションのために、１００万個のＣＨＯ Ｋ−Ｉ細胞を、１μｇの各ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び１００μＬ Ａｍａｘａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔと混合した。Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ^TM中、プログラムＵ−２３を用いて細胞をトランスフェクトし、１．４ｍＬの加温したＦ−１２培地＋１０％ＦＣＳに回収した。

Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ^TMキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＺＦＮ処理された細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ＺＦＮが標的とするＧＳ遺伝子座の領域に適切なプライマーを用いたＰＣＲによって標的遺伝子座を増幅し、ＰＣＲ産物に溶融／アニーリング工程を行ない、変異ＤＮＡ及び野生型ＤＮＡのランダムな再アニーリングによって、変形した二本鎖ＤＮＡが生成した。次いで、ＣＥＬ−Ｉ酵素（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ^TM変異検出キット、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．）を加え、ミスマッチ部位でＤＮＡ二本鎖を特異的に開裂させた。ＣＥＬ−Ｉによって開裂したサンプルを１０％ＴＢＥポリアクリルアミドゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し、濃度測定器でＤＮＡバンドを定量した。前記のＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）に本質的に記載されているように、ＮＨＥＪの頻度を算出した。

図１Ａ及び図１Ｂに示されるように、ＧＳ ＺＦＮは、内在性ＧＳの遺伝子座を改変した。特に、ＺＦＮ９３７２及びＺＦＮ９０７５を含むＺＦＮ対は、改変が、ＣＨＯ−ＫＩ細胞の染色体の２６％（野生型開裂ドメインの場合）、２４％（操作された必須ヘテロ二量体を形成する開裂ドメイン）、ＣＨＯ−Ｓ細胞の染色体の２５％であった（図１Ｂ）。同様に、ＺＦＮ８３６１及び８３６５を含むＺＦＮ対（エクソン２を標的とする）は、染色体の７％を改変した。

Ｓｕｒｖｅｙｏｒ^TMＮｕｃｌｅａｓｅ Ａｓｓａｙ（図１Ａ）の結果と一致して、直接的な配列決定から、アレルの３４％（９１／２６６）が、ＮＨＥＪが介在するＤＮＡ修復に典型的なＺＦＮ標的部位に変異を有していることを確認した（例えば、Ｗｅｔｅｒｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）３：１４２５−１４３５を参照）。重要なことに、その配列決定した変異の８１％が、リーディングフレームのシフトを生じていた（図５）。

実施例３：ＧＳ陰性細胞株の作成
ＧＳが欠損したＣＨＯ細胞株を作成するために、実施例２に記載したＣＨＯ−Ｋ１をトランスフェクトしたプールと、ＣＨＯ−Ｓをトランスフェクトしたプールとを限界希釈することによって、１個の細胞から誘導した株を単離した。ＺＦＮ標的領域の配列決定から、ＣＨＯ−Ｓに由来する細胞株５４個のうち１７個（３１％）が、少なくとも１つの破壊されたＧＳ遺伝子を有しており、５４個のうち８個（１５％）が、変異アレルについてホモ接合体であり、２個が複合ヘテロ接合体であり、残りの７個がヘテロ接合体であった（１つは野生型アレルを含む）。ＣＨＯ−Ｋ１に由来する細胞株では、配列分析によって、５０個のうち１８個（３６％）が、少なくとも１つの破壊されたＧＳアレルを有しており、５個（１０％）が所与の変異についてホモ接合体である。また、ホモ接合変異株の遺伝子型を示す図１Ｃを参照されたい。

すべてのホモ接合性変異株は、ＧＳに変異があり、オープンリーディングフレームのシフトが起こっているか、又は重要なアミノ酸がフレーム内で欠損しており（例えば、Ｂ４株、ＫＡ２株、ＫＡ４株）、従って、活性なＧＳ酵素を産生しないと予想された。予想どおり、ホモ接合変異株は、野生型ＣＨＯ細胞とは対照的に、いずれも外来Ｌ−グルタミンが存在しない状態では増殖しなかった（図１）。

抗ＧＳモノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたウェスタンブロット分析から、フレームのシフト又は大きな欠損があるすべての細胞株は、検出可能なＧＳタンパク質を発現しないことが確認された（例えば、クローンＢ３、図１Ｄ）。小さなフレーム内欠損を有する株（Ｂ４及びＫＡ２）は、ウェスタンブロットで検出可能なＧＳタンパク質を発現したが、ＧＳ触媒活性に必須のアミノ酸がないことは同様であり、Ｌ−グルタミンが存在しない状態では、細胞は増殖しなかった（図１Ｃ）。また、細胞株Ｂ３の増殖は、グルタミン補給に依存していることも示された（図６を参照）。

これらのＧＳ^-/-表現型をさらに確認するために、既知組成の無血清培地の懸濁物で３ヶ月間増殖させるために、ＣＨＯ−Ｋ１に由来するクローンのうちの３つのクローンを順応させた。この細胞の増殖及び生存率を、さらに４ヶ月間集中してモニタリングした（図１Ｅ）。

ＺＦＮによって作成したＧＳ^-/-株は、無血清懸濁培地中、Ｌ−グルタミン存在下で普通に増殖した（同様の条件で増殖した業界標準ＣＨＯＫ１ＳＶと同様に、倍加時間２４〜２７時間）。次いで、Ｌ−グルタミンを除去すると、細胞の増殖がすぐに止まり、すぐに生存能力が失われた（図１Ｅの矢印を参照）。ヒトＩｇＧ抗体発現構築物の一過性トランスフェクションから、３種類すべてのＧＳ^-/-株が、ＣＨＯＫ１ＳＶ株で得られるトランス遺伝子発現レベルに匹敵する発現レベルでを支持したことが確認された。

以上をまとめると、これらのデータは、遺伝型及び表現型が確認されたＧＳノックアウトＣＨＯ細胞株を首尾よく作成できていることを裏付けている。

実施例４：ＧＳ−ＤＨＦＲダブルノックアウト細胞株の作成
ダブルノックアウト細胞株を作成するために、ＣＨＯ−Ｓ ＧＳ^-/-細胞株Ｂ３の背景に、ＤＨＦＲ遺伝子を標的とするＺＦＮを用いた。上述のＧＳについて記載されている方法を用いたＺＦＮが介在するＤＨＦＲのノックアウトは、米国特許公開第２００８／００１５１６４号に記載されている。

この実施例では、ＮＨＥＪによって開裂した染色体末端の修復によって、その間にあるゲノムフラグメントを除去するという目標のもとに、ＤＨＦＲ遺伝子の２つの別個の領域を標的とする２つのＺＦＮ対を、同時に送達した。ＺＦＮ特異的な遺伝子間配列が失われると、例えば、図１Ｄのタンパク質の発現を回復させる小さなフレーム内変異の可能性を除外した、より大きく、より良好な規定された変異が生じると予想された（「Ｂ４」と記載されている左側のパネル）。

ＣＨＯ ＤＨＦＲ遺伝子のエクソン１を標的とする、既に記載したＺＦＮ対９４６１／７８４４（米国特許公開第２００８／００１５１６４号）に加え、エクソン１のすぐ後のイントロンのうち、約２４０ｂｐ離れた部位を標的とする第２のＺＦＮ対を作成した（図２Ａ及び図７Ａ）。

実施例３に記載されるように一過性トランスフェクションを行ない、エクソン１を標的とするＺＦＮ９４６１／ＺＦＮ７８４４対、又はイントロン部位のみを標的とするＺＦＮ９４７６／ＺＦＮ９４７７（図７Ｂ及び７Ｃを参照）対のいずれかを用いたトランスフェクションによって、ＧＳ^-/-細胞株Ｂ３における内在性ＤＨＦＲ遺伝子座のアレル変異の頻度は、それぞれ１５％、１８％であった（図２Ｂ）。両方のＺＦＮ対をＧＳ^-/-細胞株Ｂ３に一緒にトランスフェクションすると、ＺＦＮ結合部位間の配列である約２４０ｂｐが欠損したと予想されるものと一致する短めのＰＣＲ増幅産物が現れた（図２Ｃ）。この欠損事象の頻度は、全アレルの約８％であると概算され、両方のＺＦＮ対が細胞に導入された場合にのみ観察された（図２Ｃ）。

推定欠損ＰＣＲフラグメントのクローニング及び配列決定から、ＺＦＮ標的部位の間の配列が予想どおり除去されていることがわかった（図８）。再結合した染色体末端の接合部で、配列内に軽微な変異が観察され、これは、ＮＨＥＪ修復プロセスに特徴的な、予想される小さな挿入及び除去と一致している。

１個の細胞に由来する株は、図２Ｃの第７レーンで、限界希釈によって、ＺＦＮで処理されたプールから単離された。ＰＣＲ増幅及び配列決定から、細胞株の９％（２００のうち１８）で、予想どおり約２４０ｂｐの欠損があることが明らかになった。これらの細胞株のうち４つ（スクリーニングしたすべての株の２％、欠損部があったすべての株の２２％）は、ＤＨＦＲ遺伝子に両アレル変異があることがわかった（図２Ｄ）。細胞株２Ｂ１２．８は、エクソン１とイントロン１のＺＦＮ開裂部位の間にある２４４ｂｐの領域が欠損したホモ接合体である。残りの株は、片方のアレルのみに２４０ｂｐの欠損があり、他方は、エクソンのＺＦＮ標的部位及び／又はイントロンのＺＦＮ標的部位で、ＮＨＥＪによって起こる従来のもっと小さな変異が存在した。例えば、細胞株１Ｆ１．６は、片方のアレルに約２４０ｂｐの欠損があった（２回のＺＦＮ開裂及び除去事象に一致する）が、他方のアレルは、エクソン１において４ｂｐが欠損し、フレームシフトを生じていた。

１Ｆ１．６細胞株及び２Ｂ１２．８細胞株は、遺伝子を完全にノックアウトしたものと一致する遺伝子型を有しており、さらなる特性決定のためにこれらを選択した。ウェスタンブロット分析から、これらの１個の細胞に由来する株のいずれにも、全長ＤＨＦＲもＧＳタンパク質も存在しないことがわかった（図２Ｅ）。さらに、どちらの株も、親細胞であるＧＳ^-/-株Ｂ３又は野生型ＣＨＯ細胞とは対照的に、ＤＨＦＲタンパク質の活性部位に結合するフルオレセイン標識されたメトトレキサートでは染色されなかった。最も重要なことに、１Ｆ１．６細胞株及び２Ｂ１２．８細胞株の増殖は、外来のヒポキサンチン及びチミジン（ＨＴ）及びＬ−グルタミンを培地に加えることに依存していた。対照的に、親細胞であるＧＳ^-/-株Ｂ３は、Ｌ−グルタミンを必要とするが、ＨＴは必要とせず、一方、ＤＨＦＲ陰性ＣＨＯ細胞株ＤＧ４４（ＧＳ^WT）は、ＨＴのみを必要とし、Ｌ−グルタミンを必要とせず、野生型ＣＨＯ−Ｓは、増殖するのにどちらの補給も必要なかった（図２Ｆ）。

外来ＨＴ及びＬ−グルタミンに依存していることは、１Ｆ１．６細胞株及び２Ｂ１２．８細胞株において、ＧＳ活性とＤＨＦＲ活性の両方が機能的に失われていることを裏付けている。

従って、以上をまとめると、これらのデータは、遺伝型及び表現型が確認されたＧＳ^-/-／ＤＨＦＲ^-/-ダブルノックアウトＣＨＯ細胞株を首尾よく作成できていることを示している。

実施例５：ＧＳ−ＤＨＦＲ−ＦＵＴ８トリプルノックアウト細胞株の作成
ＧＳ^-/-ＤＨＦＲ^-/-ＣＨＯ細胞株ＩＦ１．６を用い、ＧＳ、ＤＨＦＲ、ＦＵＴ８のトリプルノックアウトも作成した。米国特許出願第１２／２１８、０３５号に記載されているように、タンパク質治療薬の発現において、非ヒト細胞、例えばＣＨＯを用いて生じる異常なグリコシル化は、タンパク質産物の効能、半減期を変えることがあり、免疫原性さえも変えてしまうことがある。故に、非ヒト発現系において、タンパク質のグリコシル化をヒトに適用する方法が特に望ましい。ＣＨＯ ＦＵＴ８遺伝子は、ＧＤＰ−フコースから、Ｎ結合したオリゴ糖のＧｌｃＮＡｃコアへのフコースの移動を触媒するα１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする標的である。エクソン１０においてコードされる高度に保存されたＦｕｔ ｍｏｔｉｆ ＩＩにおけるアミノ酸残基の点変異によって、ＦＵＴ８酵素が不活性化する。

このように、本願発明者らは、ＦＵＴ８のエクソン１０に広がり、ＣＨＯ−Ｋ１ゲノムに由来するイントロンに隣接する領域をクローン化し、配列決定し、エクソン１０を標的にするようにＺＦＮを設計した（米国特許出願第１２／２１８，０３５号；図３Ａ及び図９）。ＺＦＮ１２１７２／ＺＦＮ１２１７６を細胞株１Ｆ１．６に一過性送達すると、ＦＵＴ８アレルの７．５％が改変し（図３Ｂ）、１個の細胞に由来する株を、このプールからの限界希釈によって得た。

市販の抗体を用いて、Ｃ．ｇｒｉｓｅｕｓ ＦＵＴ８は、検出されなかったため、本願発明者らは、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４−６２２に記載されているように、ＦＡＣＳによるｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ ａｇｇｌｕｔｉｎ（Ｆ−ＬＣＡ）結合アッセイを用い、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性をさらにアッセイした。ＬＣＡは、細胞表面にフコシル化したオリゴ糖コアが存在するような細胞に選択的に結合する。ＦＵＴ８活性が完全に失われているため、コアのフコシル化が起こらない細胞は、ＬＣＡに結合しない。ＺＦＮによって作成した細胞株を、Ｆ−ＬＣＡに結合する能力についてスクリーニングすると、株の２％（２００のうち４）で、まったくＦ−ＬＣＡに結合せず、このことは、ＦＵＴ８酵素活性がまったくないことを示す（図３Ｃ）。

ゲノムＤＮＡのＰＣＲ単位複製配列の配列決定から、両クローンとも、ＦＵＴ８標的遺伝子座に両アレル複合ヘテロ接合変異を有していることが確認され（図３Ｄ）、ＦＵＴ８の機能に必須の領域におけるリーディングフレームのシフトをコードしている。このように、両細胞株の遺伝子型は、Ｆ−ＬＣＡ結合がないという観察結果と一致しており（図３Ｃ）、３５Ｆ２細胞株及び１４Ｃ１細胞株において、ＦＵＴ８がＺＦＮによって遺伝的にも機能的にもノックアウトされていることを示す。また、ＦＵＴ８^-/-クローンは、両方とも、ＺＦＮによるトランスフェクション及び１個の細胞のクローニングを複数回繰り返しても、ＧＳ^-/-及びＤＨＦＲ^-/-の遺伝子型及び表現型を安定に維持していた。実際に、トリプルノックアウト細胞株の作成は、ＨＴ及びＬ−グルタミンを補給した血清含有培地中で増殖速度試験によって測定した場合、十分に耐え得るものであり、クローン３５Ｆ２及び１４Ｃ１において、集団の平均倍加時間はそれぞれ２１．８時間及び２１．６時間であった。以上をまとめると、これらのデータは、操作されたＺＦＮを用い、ＣＨＯ細胞において、シングル遺伝子ノックアウト、ダブル遺伝子ノックアウト、トリプル遺伝子ノックアウトを首尾よく作成できていることを示している。

実施例６：ＧＲ−ＣＣＲ５−ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃトリプルノックアウト細胞株の作成
また、不活性化したＺＦＮを一緒に投与することによって、トリプルノックアウト細胞株を作成した。特に、ＣＣＲ５、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（アデノ随伴ウイルス組込部位又は「ＡＡＶＳ１」としても知られる）が不活性化しているＫ５６２細胞株も、これらの遺伝子座を標的にするＺＦＮを同時に適用することによって作成した。

米国特許公開第２００８０１５９９９６号（ＣＣＲ５）；第２００８０１８８０００号（ＧＲ）、米国特許出願第１２／１５０，１０３号（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ／ＡＡＶＳ１）に記載されているように、ＣＣＲ５、ＧＲ、ＡＡＶＳ１を標的とするＺＦＮを作成した。これらの遺伝子の一部にあるＺＦＮ結合部位を示す図を図１０Ａに示す。ＣＣＲ５遺伝子は、３つのエクソンを含有し、コード配列（ＣＤＳ）は、エクソン３内にあり、ＣＣＲ５ ＺＦＮの標的配列は、示されているとおり、ＣＤＳ内にある。ＧＲ遺伝子は、９つのエクソンを含有し、ＧＲ ＺＦＮの標的配列は、エクソン３内にある。ＡＡＶＳ１ ＺＦＮの標的配列は、ＡＡＶＳ１領域の中ほどに位置している。

Ｆｏｋ Ｉの触媒ドメインの野生型、ＺＦＮ−Ｆｏｋ Ｉ（ｗｔ）又は必須ヘテロ二量体ＥＬ／ＫＫ改変体、ＺＦＮ−Ｆｏｋ Ｉ（ＥＬ／ＫＫ）のいずれかに結合する、ＺＦＮ対をコードするプラスミドを、Ｋ５６２細胞に一緒に一過性トランスフェクションし、ＣＣＲ５（左）、ＧＲ（中央）、ＡＡＶＳ１（右）の遺伝子座での改変頻度を、トランスフェクションから１０日後にＳｕｒｖｅｙｏｒ^TMＮｕｃｌｅａｓｅ Ａｓｓａｙによってそれぞれ決定した。図１０Ｂに示されているように、標的遺伝子に、ＺＦＮ処理後にＮＨＥＪを行なった。

これらのトリプルノックアウト細胞の１個の細胞に由来する細胞株も、上述のゲノムＤＮＡのＰＣＲ及び配列決定によって評価した。特に、ＣＣＲ５ ＺＦＮ−Ｆｏｋ Ｉ（ＥＬ／ＫＫ）＋ＧＲ ＺＦＮ−Ｆｏｋ Ｉ（ＥＬ／ＫＫ）＋ＡＡＶＳ１ ＺＦＮ−Ｆｏｋ Ｉ（ＥＬ／ＫＫ）で処理した、図１０Ｂの第８レーンのサンプルを試験した。欠損のある配列ではなく、改変されていない野生型（ｗｔ）配列を特異的に増幅させるようにＰＣＲプライマーを設計した。

結果を以下の表４に示す。ｗｔ配列を含むすべてのクローン（ｗｔ又はヘテロ接合体）は、示した大きさの目視できるＰＣＲバンドを有しており、一方、ノックアウト（ＫＯ）クローンには、目視できるＰＣＲバンドがなかった。ＣＣＲ５ ＰＣＲによってスクリーニングした、単細胞クローン１４４個のうち、５個のクローンがＣＣＲ５ ＫＯを含んでいた。９個のクローンは、ＧＲ ＰＣＲによってＧＲ ＫＯであると同定された。これらのクローンのうち２個は、ＣＣＲ５ ＫＯとＧＲ ＫＯを両方含んでいる。ＣＣＲ５ ＰＣＲ又はＧＲ ＰＣＲのいずれかに基づくＫＯクローンである１２クローンを、すべてＡＡＶＳ１ ＰＣＲによってスクリーニングした。スクリーニングした１４４個のクローンの中で、１個のＣＣＲ５シングルＫＯクローンを同定し、７個のＧＲシングルＫＯクローンを同定したが、ＡＡＶＳ１シングルＫＯクローンは同定する試みは実施しなかった。１個のＣＣＲ５／ＧＲ二重ＫＯクローンを同定した。２個のＣＣＲ５／ＡＡＶＳ１二重ＫＯクローンを同定した。１４４個のクローンの中で、ＧＲ／ＡＡＶＳ１二重ＫＯクローンは同定されなかったが、ＧＲ／ＡＡＶＳ１二重ＫＯクローンは、もっと多くのクローンをスクリーニングすれば同定された可能性が高い。１個のＣＣＲ５／ＧＲ／ＡＡＶＳ１トリプルＫＯクローン（Ｂ１７）を同定した。

トリプルノックアウトクローンＢ１７に由来する細胞の例示的な配列データを図１０Ｃに示している。ＺＦＮ標的配列には下線が引かれている。「−」は欠損を示し、太字は挿入部を示す。

実施例７：ＧＳを標的とするＺＦＮは、複数の種及び細胞型で活性である
本明細書に記載したＧＳ特異的なＺＦＮ（ヒトＣＨＯ細胞ＧＳ配列に対して設計されている）を、マウス細胞でも評価した。図１１Ａ及び図１１Ｂに示されるように、ＧＳ内のＺＦＮ標的部位は、種族間でもよく保存されていた。

ＺＦＮ対８３６１／８３６５（エクソン２を標的とする）及び９０７５／９３７２（エクソン６を標的とする）を、上の実施例２で記載したように、ヒトＫ５６２細胞及びマウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞内でＧＳを開裂する能力について評価した。

図１２に示されているように、ＣＨＯ ＧＳ配列に対して設計されたＺＦＮは、他のヒト細胞種及び他の種族でも機能を発揮した。

ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３細胞において、実施例２に記載されているように、ＧＳ特異的なＺＦＮ（ＺＦＮ９０７５及びＺＦＮ９３７２）も試験した。図１４Ａに示されているように、ＣＥＬ−Ｉ酵素（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ^TM変異検出キット、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．）は、ＮＨＥＪ発生率が２１％であることを示していた。

ＧＳノックアウト細胞株を、同じＧＳ ＺＦＮを用いたＣＨＯ細胞（実施例３を参照）と同じアプローチを用い、バックグラウンドのＨＥＫ２９３細胞を用いて作成した。２つのノックアウトクローンｇ１７及びｇ５２をさらに特性決定した。クローンｇ５２は、ＧＳ遺伝子座に１１ｂｐの欠損があるホモ接合体である。クローン１７は、片方のＧＳアレルに１６９ｂｐの欠損があり、他のアレルに４ｂｐの挿入がある。図１４Ｂに示されるように、ウェスタンブロッティングによって決定されるように、どちらのクローンもＧＳタンパク質を発現しない。重要なことに、両方のクローンが、増殖のために外からＬ−グルタミンを補給する必要があった（図１４Ｃを参照）。

従って、１個の哺乳動物細胞株において、標的遺伝子を連続的に又は同時に不活性化することによって複数の遺伝子を迅速にノックアウトするために、ＺＦＮを使用してもよい。本明細書に示されている結果は、細胞株又はＺＦＮの選択には依存しない。個々の遺伝子で起こるＺＦＮによる両アレルノックアウト事象の頻度（＞１％）を、選択マーカーに依存しないことと組み合わせると、このような遺伝子病変を迅速に「積み重ね」、以前には現実的ではないと考えられていた複雑な複数遺伝子をノックアウトした細胞株を作成する能力が得られる。真核細胞において、一過性のＺＦＮ発現後のみの遺伝子ノックアウトの高い効率、及び複数の特質を積み重ねる能力は、本質的にいかなる細胞型であってもカスタム遺伝子操作を調節しやすくする。

本明細書で述べられているあらゆる特許、特許明細書、刊行物は、その全体が参照により組み込まれる。

明確に理解してもらうことを目的として、説明及び実施例によってある程度詳細に開示されているが、本開示の趣旨又は範囲に逸脱することなく、種々の変更及び改変を行なうことができることは当業者には明らかであろう。従って、上の記載及び実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。

Claims (15)

1. 以下の
   

   

   に示される４つ又は６つのジンクフィンガーを有し、当該４つ又は６つのジンクフィンガーが、当該表の１つの行に示される配列及び順序を有する認識領域を有する、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン。
2. 請求項１に記載のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、少なくとも１つの開裂ドメイン又は少なくとも１つの開裂ハーフドメインとを含む、融合タンパク質。
3. 前記開裂ハーフドメインが、野生型ＦｏｋＩ開裂ハーフドメイン又は操作されたＦｏｋＩ開裂ハーフドメインである、請求項２に記載の融合タンパク質。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
5. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン又は融合タンパク質又は請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。
6. グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）遺伝子が、請求項１に記載のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを有するヌクレアーゼによって部分的又は完全に不活性化されており、当該ＧＳ遺伝子の不活性化が、ＧＳ遺伝子のエクソン２又はエクソン６の、ジンクフィンガーヌクレアーゼにより誘導される突然変異によるものである、細胞株。
7. 細胞において、細胞内在性ＧＳ遺伝子を不活性化する方法であって、この方法が、
   （ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を細胞に導入することを含み、この第１のポリペプチドが、
   （ｉ）請求項１に記載のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、
   （ｉｉ）開裂ドメインとを含み、その結果、前記ポリペプチドが前記細胞内で発現し、それによって、前記ポリペプチドが前記標的部位に結合し、前記ＧＳ遺伝子を開裂させる、方法。
8. 第２のポリペプチドをコードする核酸を導入することをさらに含み、この第２のポリペプチドが、
   （ｉ）前記ＧＳ遺伝子の第２の標的部位に結合するように操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、
   （ｉｉ）開裂ドメインとを含み、その結果、前記第２のポリペプチドが前記細胞内で発現し、それによって、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドがそれぞれの標的部位に結合し、前記ＧＳ遺伝子を開裂させる、請求項７に記載の方法。
9. 前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが、同じ核酸又は異なる核酸によってコードされる、請求項８に記載の方法。
10. 前記細胞においてＤＨＦＲ遺伝子を不活性化することをさらに含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記細胞においてＦＵＴ８遺伝子を不活性化することをさらに含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 宿主細胞において目的の組み換えタンパク質を産生する方法であって、この方法が、
    （ａ）内在性ＧＳ遺伝子を含む宿主細胞を得るステップと；
    （ｂ）前記宿主細胞の内在性ＧＳ遺伝子を、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法によって不活性化するステップと；
    （ｃ）目的のタンパク質をコードする配列を含むトランス遺伝子を含む発現ベクターを、前記宿主細胞に導入するステップとを含み、これによって前記組み換えタンパク質を産生する方法。
13. 前記目的のタンパク質が、α１−抗トリプシン抗体又はモノクローナル抗体を含む、請求項１２に記載の方法。
14. ＧＳ遺伝子が部分的又は完全に不活性化されている細胞株であって、この細胞株が、
    （ａ）請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法によって、細胞内でＧＳ遺伝子を不活性化することと、ここで当該ＧＳ遺伝子の不活性化が、ＧＳ遺伝子のエクソン２又はエクソン６の、ジンクフィンガーヌクレアーゼにより誘導される突然変異によるものである；
    （ｂ）ＧＳ遺伝子が部分的又は完全に不活性化されている細胞株を作成するのに適した条件下で、前記細胞を培養することによって産生される、細胞株。
15. 前記細胞が、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＷＩ３８細胞、Ｖ７９細胞、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨａＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ｐｅｒＣ６細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の細胞株。

Images