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KR101778111B1 - 당액의 제조방법 및 그 장치 - Google Patents

당액의 제조방법 및 그 장치 Download PDF

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KR101778111B1
KR101778111B1 KR1020127025071A KR20127025071A KR101778111B1 KR 101778111 B1 KR101778111 B1 KR 101778111B1 KR 1020127025071 A KR1020127025071 A KR 1020127025071A KR 20127025071 A KR20127025071 A KR 20127025071A KR 101778111 B1 KR101778111 B1 KR 101778111B1
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Abstract

당화 효소로서 사상균 유래 셀룰라아제를 사용하는 셀룰로오스 가수분해의 방법으로서, 셀룰로오스에 당화 효소를 첨가해 1차 가수분해한 후 상기 1차 가수분해물을 1차 당액과 고형물로 고액 분리하고, 상기 고형물에 가수하여 2차 가수분해한 후 상기 2차 가수분해물을 2차 당액과 잔사로 고액 분리 하며, 1차 당액 및/또는 2차 당액을 한외여과막에 통과시켜서 여과하여 막측으로부터 당화 효소를 회수하고, 투과측으로부터 당 용액을 회수하는 것을 목적으로 한다.
이것에 의해, 셀룰로오스 전처리물로부터 당액을 제조하는 방법에 있어서 셀룰라아제 등의 효소 사용량을 삭감하는 방법을 제공한다.

Description

당액의 제조방법 및 그 장치{MANUFACTURING METHOD FOR SUGAR SOLUTION AND DEVICE FOR SAME}
본 발명은 셀룰로오스로부터 당액을 제조하는 방법 및 그 장치에 관한 것이다.
당을 원료로 한 화학품의 발효 생산 프로세스는 여러가지 공업원료 생산에 이용되고 있다. 이 발효 원료가 되는 당으로서 현재, 사탕수수, 전분, 사탕무 등의 식용 원료로부터 유래되는 것이 공업적으로 사용되고 있지만, 금후의 세계 인구의 증가에 의한 식용 원료 가격의 고등, 또는 식용과 경합한다고 하는 윤리적인 측면으로부터 재생 가능한 비식용 자원, 즉 셀룰로오스 함유 바이오매스로부터 효율적으로 당액을 제조하는 프로세스, 또는 얻어진 당액을 발효 원료로 해서 효율적으로 공업 원료로 변환하는 프로세스의 구축이 금후의 과제가 되고 있다.
셀룰로오스 함유 바이오매스로부터 당액을 제조하는 방법으로서 농황산을 사용해서 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스를 산가수분해해서 당액을 제조하는 방법(특허문헌 1 또는 특허문헌 2), 셀룰로오스 함유 바이오매스를 희황산으로 가수분해 처리한 후에, 또한 셀룰라아제 등의 효소 처리함으로써 당액을 제조하는 방법이 개시되어 있다(비특허문헌 1). 또한 산을 사용하지 않는 방법으로서 250℃∼500℃정도의 아임계수를 사용해서 셀룰로오스 함유 바이오매스를 가수분해해서 당액을 제조하는 방법(특허문헌 3), 또한 셀룰로오스 함유 바이오매스를 아임계수 처리한 후에 또한 효소 처리함으로써 당액을 제조하는 방법(특허문헌 4), 또한 셀룰로오스 함유 바이오매스를 240℃∼280℃의 가압 열수로 가수분해 처리한 후에 또한 효소 처리함으로써 당액을 제조하는 방법(특허문헌 5)이 개시되어 있다.
최근, 특히 에너지 사용량 및 환경 부하가 적고, 또한 당 수량(收量)이 많은 효소를 사용한 바이오매스의 가수분해 방법이 널리 검토되고 있다. 그러나, 이러한 효소를 사용하는 방법의 결점으로서 효소비가 높다고 하는 과제가 있었다.
이러한 기술과제를 해결하는 방법으로서 가수분해에 사용한 효소를 회수 재이용하는 방법이 제안되어 있다. 예를 들면, 스핀 필터에 의한 연속 고액 분리를 행하고, 얻어진 당액을 한외여과막에 통과시켜서 여과하여 효소를 회수하는 방법(특허문헌 6), 효소 당화의 단계에 있어서 계면활성제를 투입함으로써 효소 흡착을 억제해 회수 효율을 향상시키는 방법(특허문헌 7), 효소 당화 후의 잔사를 통전 처리함으로써 효소 성분을 회수하는 방법(특허문헌 8), 효소 당화 후의 잔사를 다시 새로운 바이오매스에 재투입함으로써 효소를 회수 재이용하는 방법(특허문헌 9) 등이 개시되어 있다.
일본 특허 공표 평 11-506934호 공보 일본 특허 공개 2005-229821호 공보 일본 특허 공개 2003-212888호 공보 일본 특허 공개 2001-95597호 공보 일본 특허 3041380호 공보 일본 특허 공개 2006-87319호 공보 일본 특허 공개 소 63-87994호 공보 일본 특허 공개 2008-206484호 공보 일본 특허 공개 소 55-144885호 공보
상술한 바와 같이, 효소를 회수·재이용하는 것에 의한 당액의 제조방법에 대해서 개발되어 있지만, 효소 사용량을 삭감한다고 하는 관점에 있어서는 그 효과는 불충분했다. 따라서, 본 발명에서는 종래의 방법에서의 효소 사용량의 삭감 효과를 상회하는 프로세스를 개발하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 예의 검토한 결과, 당화 효소로서 사상균 유래 셀룰라아제를 사용하는 셀룰로오스 가수분해의 방법으로서, 셀룰로오스에 당화 효소를 첨가해 1차 가수분해한 후 상기 1차 가수분해물을 1차 당액과 고형물로 고액 분리하고, 상기 고형물에 가수하여 2차 가수분해한 후 상기 2차 가수분해물을 2차 당액과 잔사로 고액 분리하며, 1차 당액 및/또는 2차 당액을 한외여과막에 통과시켜서 여과하여 막측으로부터 당화 효소를 회수하고, 투과측으로부터 당 용액을 회수하는 공정을 포함하는 방법이다.
즉, 본 발명은 이하의 (1)∼(13)의 구성을 갖는다.
(1) 당화 효소로서 사상균 유래 셀룰라아제를 사용해서 셀룰로오스를 가수분해하는 것에 의한 당액의 제조방법으로서, 셀룰로오스에 당화 효소를 첨가하여 1차 가수분해한 후 그 1차 가수분해물을 1차 당액과 고형물로 고액 분리하는 공정, 고형물에 물을 첨가하여 2차 가수분해한 후 그 2차 가수분해물을 2차 당액과 잔사로 고액 분리하는 공정, 1차 당액 및/또는 2차 당액을 한외여과막에 통과시켜서 여과하여 비투과측으로부터 당화 효소를 회수하고, 투과측으로부터 당액을 회수하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
(2) (1)에 있어서, 사상균 유래 셀룰라아제가 트리코데르마 유래 셀룰라아제인 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 셀룰로오스가 바이오매스를 암모니아 처리, 수열 처리 또는 희황산 처리한 처리물 유래인 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 있어서, 2차 가수분해가 무기염(칼슘염을 제외함), 친수성 유기용매, 아미노산, 비이온성 계면활성제 및 그것들을 함유하는 당액으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 존재 하에서의 가수분해인 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
(5) (4)에 있어서, 무기염(칼슘염을 제외함)이 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 황산염, 암모늄염, 염산염, 인산염, 아세트산염, 및 질산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
(6) (5)에 있어서, 무기염(칼슘염을 제외함)이 염화나트륨, 아세트산나트륨, 황산나트륨, 황산수소나트륨, 인산2수소나트륨, 인산수소나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄, 인산수소2칼륨, 황산암모늄, 염화마그네슘, 황산마그네슘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
(7) (4)에 있어서, 친수성 유기용매가 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 이소프로판올, N,N-디메틸포름아미드, 부탄올, 아세톤, 아세토니트릴, 에틸렌글리콜 및 글리세린으로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
(8) (4)에 있어서, 아미노산이 아르기닌, 시스테인, 글루탐산, 히스티딘 및 리신으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
(9) (1) 내지 (8) 중 어느 한 항에 있어서, 1차 가수분해물 또는 2차 가수분해물의 고액 분리가 프레스 여과인 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
(10) (1) 내지 (9) 중 어느 한 항에 있어서, 당액을 역침투막 및/또는 나노여과막에 통과시켜서 여과하여 당액을 농축하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
(11) (1) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 당액의 제조방법을 위한 장치로서, 1차 가수분해를 행하는 교반 탱크, 고액 분리장치, 2차 가수분해를 행하는 2차 가수분해조 또는 프레스 여과장치, 1차 가수분해물 및 2차 가수분해물을 분리하는 고액 분리장치, 1차 당액 및/또는 2차 당액으로부터 당화 효소와 당액을 분리하는 한외여과막 장치를 구성으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
(12) (1) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 당액의 제조방법을 위한 장치로서, 1차 가수분해를 행하는 반응조, 온수 공급조를 갖는 프레스 여과장치, 프레스 여과장치의 여과액을 온수 공급조에 순환시키는 순환 라인, 1차 당액 및/또는 2차 당액으로부터 당화 효소와 당액을 분리하는 한외여과막 장치를 구성으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
(13) (11) 또는 (12)에 있어서, 상기 한외여과막 장치에 의해 얻어지는 당액을 농축하기 위한 역침투막 및/또는 나노여과막을 설치한 당액 농축장치를 구성으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
(발명의 효과)
본 발명에서는 1차 가수분해 후 고액 분리를 행해 얻어진 고형물에 포함되는 잔존 효소 성분을 이용한 2차 가수분해를 행함으로써 1)당 생산량이 증대하는 효과, 2) 효소의 회수량이 증대하는 효과가 있다. 따라서, 종래 기술에 대하여 경제적으로 이점을 갖는다.
도 1은 본 발명의 당액의 제조방법의 실시형태를 나타낸 약도이다.
도 2는 본 발명의 당액의 제조방법을 실시하기 위한 장치의 형태를 나타낸 약도이다.
도 3은 본 발명의 당액의 제조방법을 실시하기 위한 장치의 형태를 나타낸 약도이다.
도 4는 본 발명의 당액의 제조방법의 2차 가수분해를 프레스 여과실 내에서 행하는 실시형태를 나타내는 약도이다.
도 5는 본 발명의 당액의 제조방법을 실시하기 위한 장치의 형태를 나타낸 약도이다.
도 6은 본 발명의 당액의 제조방법을 실시하기 위한 장치의 형태를 나타낸 약도이다.
도 7은 본 발명의 당액의 제조방법의 2차 가수분해를 프레스 여과실 내에서 행하는 실시형태를 나타내는 약도이다.
도 8은 본 발명의 당액의 제조방법을 실시하기 위한 장치의 형태를 나타낸 약도이다.
도 9는 본 발명의 당액의 제조방법으로 얻어지는 2차 당액에 포함되는 효소를 전기영동에 의해 분석한 결과를 도시한 도면이다.
도 10은 본 발명의 당액의 제조방법의 2차 가수분해를 1차 가수분해와 독립된 2차 가수분해조에서 행하는 실시형태를 나타내는 약도이다.
도 11은 본 발명의 당액의 제조방법의 2차 가수분해를 1차 가수분해와 독립된 2차 가수분해조에서 행하는 실시형태를 나타내는 약도이다.
도 12는 본 발명의 당액의 제조방법의 2차 가수분해를 1차 가수분해와 독립된 2차 가수분해조에서 행하는 실시형태를 나타내는 약도이다.
도 13은 본 발명의 당액의 제조방법의 1차 가수분해 및 2차 가수분해를 동일한 탱크에서 행하는 실시형태를 나타내는 약도이다.
도 14는 한외여과막 장치의 앞공정에 정밀여과막 장치를 설치한 실시형태를 나타내는 약도이다.
도 15는 정밀여과막 모듈을 사용해서 크로스플로우(cross-flow) 여과하는 실시형태를 나타내는 약도이다.
도 16은 정밀여과막 모듈을 사용해서 데드엔드(dead-end) 여과하는 실시형태를 나타내는 약도이다.
셀룰로오스는 버개스(bagasse), 스위치그라스(switchgrass), 네이피어그라스(napier grass), 에리안투스(Erianthus), 옥수수대(corn stover), 볏짚(rice straw), 보릿짚(wheat straw) 등의 초본계 바이오매스, 또는 수목, 폐건재 등의 목질계 바이오매스에 다량으로 포함되어 있고, 본 발명에서는 이들 셀룰로오스 함유 바이오매스를 원료로서 바람직하게 이용할 수 있다.
셀룰로오스 함유 바이오매스에는 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스(이하, 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스의 총칭으로서 「셀룰로오스」라고 한다.) 이외에 방향족고분자인 리그닌 등을 함유하고 있기 때문에, 본 발명의 당액의 제조방법에 있어서 바이오매스 유래의 셀룰로오스를 당액의 원료로 할 경우 전처리를 실시함으로써 효소에 의한 가수분해 효율을 향상시킬 수 있다. 셀룰로오스 함유 바이오매스의 전처리 방법으로서는 산 처리, 황산 처리, 희황산 처리, 알칼리 처리, 가성소다 처리, 암모니아 처리, 수열 처리, 아임계수 처리, 미분쇄 처리, 스팀 처리를 들 수 있지만, 본 발명에 있어서는 암모니아 처리, 수열 처리 또는 희황산 처리인 것이 바람직하다.
암모니아 처리는 일본 특허 공개 2008-161125호 공보 및 일본 특허 공개 2008-535664호 공보에 준거한다. 예를 들면, 사용하는 암모니아 농도는 바이오매스에 대하여 0.1∼15중량%의 범위에서 첨가하고, 4∼200℃, 바람직하게는 90∼150℃에서 처리한다. 첨가하는 암모니아는 액체 상태, 또는 기체 상태의 어느 쪽이라도 좋다. 또한 첨가하는 형태는 순암모니아이어도 암모니아 수용액의 형태이어도 좋다. 처리 횟수는 특별하게 한정되지 않고 상기 처리를 1회 이상 행하면 좋다. 특히 상기 처리를 2회 이상 행할 경우, 1회째와 2회째 이후의 처리를 다른 조건에서 실시해도 좋다. 암모니아 처리에 의해 얻어진 처리물은 효소에 의한 가수분해 반응을 더 행하기 때문에 암모니아의 중화 또는 암모니아의 제거를 행할 필요가 있다. 중화는 가수분해물로부터 고형분을 고액 분리에 의해 제거한 암모니아에 대하여 행해도 좋고, 고형분을 포함한 채의 상태에서 행해도 좋다. 중화에 사용하는 산 시약은 특별하게 한정되지 않는다. 암모니아의 제거는 암모니아 처리물을 감압 상태로 유지함으로써 암모니아를 기체 상태로 휘발시켜서 제거할 수 있다. 또한 제거한 암모니아는 회수 재이용해도 좋다.
희황산 처리의 경우, 황산의 농도는 0.1∼15중량%인 것이 바람직하고, 0.5∼5중량%인 것이 보다 바람직하다. 반응 온도는 100∼300℃의 범위로 설정할 수 있고, 120∼250℃로 설정하는 것이 바람직하다. 반응 시간은 1초∼60분의 범위에서 설정할 수 있다. 처리 횟수는 특별하게 한정되지 않고 상기 처리를 1회 이상 행하면 좋다. 특히 상기 처리를 2회 이상 행할 경우, 1회째와 2회째 이후의 처리를 다른 조건에서 실시해도 좋다. 희황산 처리에 의해 얻어진 가수분해물은 산을 포함하고 있고, 또한 셀룰라아제에 의한 가수분해 반응을 행하기 위해서, 또는 발효 원료로서 사용하기 위해서 중화를 행할 필요가 있다.
수열 처리의 경우, 셀룰로오스 함유 바이오매스가 0.1∼50중량%가 되도록 물을 첨가한 후 100∼400℃의 온도에서 1초∼60분 처리한다. 이러한 온도 조건에 있어서 처리함으로써 셀룰로오스의 가수분해가 일어난다. 처리 횟수는 특별하게 한정되지 않고 상기 처리를 1회 이상 행하면 좋다. 특히 상기 처리를 2회 이상 행할 경우, 1회째와 2회째 이후의 처리를 다른 조건에서 실시해도 좋다.
본 발명에서 사용하는 셀룰라아제는 사상균 유래 셀룰라아제이다. 사상균으로서는 트리코데르마속(Trichoderma), 아스페르길루스속(Aspergillus), 셀룰로모나스속(Cellulomonas), 클로스트리듐속(Clostridium), 스트렙토마이세스속(Streptomyces), 배잘록침개미속(Humicola), 아크레모니움속(Acremonium), 기계충버섯속(Irpex), 털곰팡이속(Mucor), 탈라로미케스속(Talaromyces) 등의 미생물을 들 수 있다. 이들 미생물은 배양액 내에 셀룰라아제를 산생하기 때문에 그 배양액을 미정제의 사상균 유래 셀룰라아제로서 그대로 사용해도 좋고, 또한 배양액을 정제하고 제제화한 것의 사상균 유래 셀룰라아제 혼합물로서 사용해도 좋다. 사상균 셀룰라아제를 정제하고 제제화한 것으로서 사용할 경우, 프로테아제 조해제(阻害劑), 분산제, 용해 촉진제, 안정화제 등 효소 이외의 물질을 첨가한 것을 셀룰라아제 제제로서 사용해도 좋다.
본 발명에서 사용하는 사상균 유래 셀룰라아제는 트리코데르마속이 산생하는 셀룰라아제(이하, 트리코데르마 유래 셀룰라아제)인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에서는 트리코데르마 유래 셀룰라아제 중 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei)로부터 유래되는 셀룰라아제인 것이 보다 바람직하고, 구체적으로는 트리코데르마 리세이 QM9414(Trichoderma reesei QM9414), 트리코데르마 리세이 QM9123(Trichoderma reesei QM9123), 트리코데르마 리세이 RutC-30(Trichoderma reesei RutC-30), 트리코데르마 리세이 PC3-7(Trichoderma reesei PC3-7), 트리코데르마 리세이 CL-847(Trichoderma reeseiCL-847), 트리코데르마 리세이 MCG77(Trichoderma reesei MCG77), 트리코데르마 리세이 MCG80(Trichoderma reesei MCG80), 트리코데르마 비리데 QM9123(Trichoderma viride 9123) 등의 트리코데르마속의 미생물 유래의 셀룰라아제인 것이 바람직하다. 또한, 상기 트리코데르마속으로부터 유래되는 미생물로서, 이것들을 변이제 또는 자외선 조사 등으로 변이 처리를 실시하여 셀룰라아제 생산성이 향상된 변이주 유래의 셀룰라아제이어도 좋다.
사상균 유래 셀룰라아제는 셀로비오하이드로라제(cellobiohydrolase), 엔도글루카나아제(endoglucanase), 엑소글루카나아제(exoglucanase), β-글루코시다아제(β-glucosidase), 크실라나아제(xylanase), 크실로시다제(xylosidase) 등의 복수의 효소 성분을 포함한 셀룰로오스를 가수분해해서 당화하는 활성을 갖는 효소 조성물이다. 사상균 유래 셀룰라아제는 셀룰로오스 분해에 있어서 이러한 복수의 효소 성분이 포함됨으로써, 그 협주 효과 또는 보완 효과에 의해 효율적인 셀룰로오스의 가수분해를 실시할 수 있기 때문에 본 발명에 있어서 바람직하게 사용된다.
셀로비오하이드로라제란 셀룰로오스의 말단 부분으로부터 가수분해되어 가는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 총칭이며, EC 번호: EC 3.2.1.91로서 셀로비오하이드로라제에 귀속되는 효소군이 기재되어 있다.
엔도글루카나아제란 셀룰로오스 분자쇄의 중앙 부분으로부터 가수분해되는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 총칭이며, EC 번호: EC 3.2.1.4로서 엔도글루카나아제에 귀속되는 효소군이 기재되어 있다.
엑소글루카나아제란 셀룰로오스 분자쇄의 말단으로부터 가수분해되는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 총칭이며, EC 번호: EC 3.2.1.74로서 엑소글루카나아제에 귀속되는 효소군이 기재되어 있다.
β-글루코시다아제란 셀로올리고당(cellooligosaccharide) 또는 셀로비오스(cellobiose)에 작용하는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 총칭이며, EC 번호: EC 3.2.1.21로서 β-글루코시다아제에 귀속되는 효소군이 기재되어 있다.
크실라나아제란 헤미셀룰로오스 또는 특히 크실란에 작용하는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 총칭이며, EC 번호: EC 3.2.1.8로서 크실라나아제에 귀속되는 효소군이 기재되어 있다.
크실로시다제란 크실로올리고당에 작용하는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 총칭이며, EC 번호: EC 3.2.1.37로서 크실로시다제에 귀속되는 효소군이 기재되어 있다.
이러한 사상균 유래 셀룰라아제 성분은 겔 여과, 이온 교환, 2차원 전기영동 등 공지 방법에 의해 분리하고, 분리한 성분의 아미노산 서열 분석(N말단 분석, C말단 분석, 질량 분석)을 행하여 데이터베이스와의 비교에 의해 동정할 수 있다.
또한, 사상균 유래 셀룰라아제의 효소활성은 아비셀 분해활성, 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 분해활성, 셀로비오스 분해활성, 크실란 분해활성, 만난 분해활성 등이라는 다당의 가수분해 활성에 의해 평가할 수 있다. 아비셀 분해활성에 관여하는 주된 셀룰라아제 성분은 셀룰로오스 말단 부분으로부터 가수분해되는 특징을 갖는 셀로비오하이드로라제 또는 엑소글루카나아제이다. 또한, 크실란 분해활성에 관여하는 주된 셀룰라아제 성분은 크실라나아제, 크실로시다제이다. 셀로비오스 분해활성에 관여하는 주된 셀룰라아제 성분은 주로 β-글루코시다아제이다. CMC 분해활성에 관여하는 주된 셀룰라아제 성분은 셀로비오하이드로라제, 엑소글루카나아제, 엔도글루카나아제이다. 여기에서 "주된"이라고 하는 의미는 가장 분해에 관여하는 것이 알려져 있는 것으로부터의 표현이며, 이것 이외의 효소 성분도 그 분해에 관여하고 있는 것을 의미하고 있다.
사상균 유래 셀룰라아제로서는 조효소물이 바람직하게 사용된다. 조효소물은 사상균속의 미생물이 셀룰라아제를 산생하도록 조정한 배지 중에서 임의의 기간 상기 미생물을 배양한 배양 상청으로부터 유래된다. 사용하는 배지 성분은 특별하게 한정되지 않지만, 셀룰라아제의 산생을 촉진하기 위해서 셀룰로오스를 첨가한 배지를 일반적으로 사용할 수 있다. 그리고, 조효소물로서 배양액을 그대로, 또는 사상균체만을 제거한 것의 배양 상청이 바람직하게 사용된다.
조효소물 중의 각 효소 성분의 중량비는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 트리코데르마 리세이 유래의 배양액에는 50∼95중량%의 셀로비오하이드로라제가 포함되어 있고, 나머지의 성분에 엔도글루카나아제, β-글루코시다아제 등이 포함되어 있다. 또한, 트리코데르마속의 미생물은 강력한 셀룰라아제 성분을 배양액 중에 생산하는 한편, β-글루코시다아제에 관해서는 세포내 또는 세포 표층에 유지하고 있기 때문에 배양액 중의 β-글루코시다아제 활성은 낮으므로 조효소물에 이종 또는 동종의 β-글루코시다아제를 더 첨가해도 좋다. 이종의 β-글루코시다아제로서는 아스페르길루스속 유래의 β-글루코시다아제를 바람직하게 사용할 수 있다. 아스페르길루스속 유래의 β-글루코시다아제로서 노보자임사에서 시판되고 있는 Novozyme 188 등을 예시할 수 있다. 조효소물에 이종 또는 동종의 β-글루코시다아제를 첨가하는 방법으로서는 트리코데르마속의 미생물에 유전자를 도입하고, 그 배양액 중에 산생되도록 유전자 재조합된 트리코데르마속의 미생물을 배양하고, 그 배양액을 단리하는 방법이어도 좋다.
본 발명에서는 상술의 사상균 유래 셀룰라아제에 의한 셀룰로오스의 가수분해를 1차 가수분해와 2차 가수분해로 나누어서 실시하는 것을 특징으로 하고 있다. 이하, 공정순으로 설명한다.
본 발명에 있어서의 1차 가수분해란 당화 효소와 접촉하지 않는 셀룰로오스에 대하여 당화 효소를 첨가해 가수분해를 행하는 것을 가리킨다. 1차 가수분해로서 사용하는 효소는 후술의 미사용 효소이어도 회수 효소이어도 좋지만, 효소 사용량, 특히 미사용 효소의 사용량을 삭감한다고 하는 점에 있어서 회수 효소 및 미사용 효소를 양쪽 혼합해서 사용하는 것이 바람직하다.
상술의 1차 가수분해의 반응 온도는 40∼60℃의 범위인 것이 바람직하고, 특히 트리코데르마 유래 셀룰라아제를 사용할 경우 45∼55℃의 범위인 것이 보다 바람직하다.
1차 가수분해의 반응 시간은 2시간∼200시간의 범위인 것이 바람직하다. 2시간 미만이면 충분한 당 생성이 얻어지지 않아 바람직하지 못하다. 한편으로 200시간을 초과하면 효소활성이 저하하여 후술의 2차 가수분해에서 충분한 당 생성 및 효소 회수를 행할 수 없기 때문에 바람직하지 못하다.
1차 가수분해의 pH는 4.0∼5.5의 범위인 것이 바람직하다. 또한, 사상균 유래 셀룰라아제로서 트리코데르마속 유래 셀룰라아제를 사용할 경우, 그 반응 최적 pH는 5.0이며, 특히 1차 가수분해의 경우에는 가수분해의 과정에서 pH의 변화가 일어나기 때문에 산 또는 알칼리를 이용하여 일정 pH를 유지하면서 실시하는 것이 바람직하다.
1차 가수분해물에는 1차 당액과 고형물이 포함되고, 고형물에는 미분해의 셀룰로오스 또는 헤미셀룰로오스라고 하는 다당 성분, 및 리그닌 등의 본래 당화 효소 에 의해서는 분해될 수 없는 성분이 포함되어 있다. 또한, 고형물에는 비교적 대량의 사상균 유래 셀룰라아제가 흡착된 상태에 있다. 따라서, 본 발명에서는 1차 가수분해물의 고형물에 포함되는 다당 성분과 사상균 유래 셀룰라아제로 후술의 2차 가수분해를 실시하기 위해서 고액 분리에 의해 얻어진 고형분을 회수하는 것을 특징으로 하고 있다. 고액 분리의 방법으로서는 원심 분리, 프레스 여과를 들 수 있지만, 본 발명에 있어서는 프레스 여과에 의해 고형분을 회수하는 것이 바람직하다.
고액 분리로서의 프레스 여과가 바람직한 이유로서, 1) 당액의 회수율이 뛰어난 점을 들 수 있다. 본 발명은 종래 기술에 대하여 당 회수율 및 효소 회수율의 향상을 과제로 하고 있다. 따라서, 1회의 고액 분리에서 보다 많은 당액 성분을 회수할 수 있는 고액 분리의 방법인 쪽이 바람직하다. 고액 분리에 의한 당액 성분의 회수율은 특히 2차 가수분해 후에 가수(加水)하는 물의 양을 증가시킴으로써 향상시킬 수 있다. 단, 이 가수하는 물의 양이 증가하면 2차 당액으로서의 당 농도가 낮아지기 때문에 바람직하지 못하다. 따라서, 최대한 물의 사용량을 억제하면서 높은 당 회수율을 얻는다고 하는 관점에서 고액 분리는 프레스 여과인 것이 바람직하다. 또한, 2) 아주 맑은 여과액을 얻을 수 있는 점을 들 수 있다. 본 발명에서는 고액 분리에서 얻어진 1차 당액 및/또는 2차 당액을 한외여과막에 통과시켜서 여과하여 효소 성분의 회수를 행한다. 이 한외여과막에 통과시키는 당액으로서 고형분 또는 미립자 성분이 적은 것이 막 파울링(fouling)의 관점에서 바람직하지만, 프레스 여과의 경우 고형분 또는 미립자 성분이 적기 때문에 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 2차 가수분해란 1차 가수분해물을 고액 분리함으로써 얻어지는 고형물에 대하여 고형물에 흡착된 사상균 유래 셀룰라아제만으로 두번째의 가수분해를 행하는 것을 가리킨다. 즉, 2차 가수분해에서는 새롭게 당화 효소를 첨가하지 않고 흡착 효소만으로 고형물의 가수분해를 행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는, 종래 기술(1차 가수분해만)에 대하여 새로운 효소를 투입하지 않고 2차 가수분해를 행함으로써 당 생성량 및/또는 효소 회수율을 향상시키는 것을 특징으로 한다. 종래 기술에 있어서도 당연히, 당 생산량 및/또는 효소 회수는 할 수 있지만, 본 발명의 2차 가수분해를 행함으로써 보다 많은 당과 효소를 회수할 수 있다. 그 큰 이유로서 생성 당의 제거에 의한 효소 저해의 해제가 있다. 1차 가수분해 후의 상태로서 다량의 당 성분이 포함되어 있는 상태이다. 그래서, 고액 분리를 행하여 가수분해에 의한 생성 당(글루코오스, 크실로오스, 올리고당)을 제거하고, 또한 물을 첨가함으로써 용액 성분으로서 포함되는 생성 당 농도를 저하시킬 수 있다. 이것에 의해 효소의 생성물 저해를 해제할 수 있고, 고형분에 흡착된 효소만으로 충분한 2차 가수분해를 행할 수 있다. 따라서, 효소 사용량은 종래 기술과 같아도 본 발명의 2차 가수분해를 행함으로써 종래 기술 이상의 당 및/또는 효소를 회수할 수 있다.
본 발명에서 가수하는 물의 첨가량은 특별하게 한정되지 않지만, 2차 가수분해시의 고형물 농도가 1∼20중량% 사이가 되도록 첨가하는 것이 바람직하다. 20중량%보다 고형물 농도가 많을 경우, 반대로 1중량%보다 고형물 농도가 적을 경우에는 당 생성량 및/또는 효소 회수량의 관점에서 효율적이지 않아 바람직하지 못하다.
상술의 2차 가수분해의 반응 온도는 40∼60℃의 범위인 것이 바람직하고, 특히 트리코데르마 유래 셀룰라아제를 사용할 경우, 40∼55℃의 범위인 것이 보다 바람직하고, 또한 50℃의 범위인 것이 보다 바람직하다.
2차 가수분해의 반응 시간은 5∼180분의 범위인 것이 바람직하다. 5분 미만이면 흡착 효소의 회수 효율이 낮고, 한편으로 180분 이상 행해도 흡착 효소의 회수 효율이 증가하지 않아 비효율적이다.
2차 가수분해의 pH는 6.0∼8.0의 범위인 것이 바람직하다. 또한, 사상균 유래 셀룰라아제로서 트리코데르마속 유래 셀룰라아제를 사용할 경우, 그 반응 최적 pH는 5.0이며, 특히 1차 가수분해의 경우에는 pH는 5.0에서 실시하는 것이 바람직하지만, 2차 가수분해에서는 흡착 효소의 회수를 주목적으로 하기 때문에 흡착 효소의 회수 효율이 높은 pH6.0∼8.0의 범위에서 행하는 것이 바람직하다. pH6.0 미만이면 회수 효소량이 저감하고, 한편으로 pH8.0을 초과하면 당화 효소의 실활이 일어나므로 바람직하지 못하다. 즉, pH6.0∼8.0의 범위이면 당화 효소의 실활이 무한히 낮은 조건에서, 또한 당화 효소의 높은 회수 효율을 얻을 수 있다.
2차 가수분해물에는 2차 당액과 고형물이 포함되고, 1차 가수분해와 같이 고액 분리, 바람직하게는 프레스 여과에 의해 그것들을 분리할 수 있다.
2차 가수분해에 있어서는 비이온성 계면활성제, 아미노산, 무기염(칼슘염을 제외함), 친수성 유기용매에서 선택되는 1 이상의 화합물을 첨가할 수 있다. 이러한 화합물을 첨가함으로써 당 생성량, 회수 효소량, 회수 효소활성의 어느 하나 이상을 증대시킬 수 있다. 특히, 회수 효소활성이 높으면 회수 효소 재이용시에 신규효소의 첨가량을 삭감할 수 있기 때문에 경제적으로 바람직하다.
2차 가수분해는 계면활성제의 존재 하이어도 좋고, 그 중에서도 비이온성 계면활성제인 것이 바람직하다. 이것은 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제 또는 양성 계면활성제를 사용할 경우, 당화 효소의 실활을 촉진하고, 2차 가수분해반응에 저해적으로 작용하기 때문이고, 또한 회수 효소의 활성도 실활시키기 때문에 바람직하지 못하다. 한편 비이온성 계면활성제에 관해서는 높은 당 생성 효율, 및 높은 효소의 회수 효율을 얻을 수 있기 때문에 바람직하게 사용된다.
비이온성 계면활성제란 계면활성제의 친수부분이 비전해질로 구성되는 계면활성제이다. 비이온성 계면활성제의 구체예로서는, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 폴리옥시에틸렌알킬알릴에테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르, 폴리옥시에틸렌나프틸에테르, 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르, 폴리옥시에틸렌알킬아민, 글리세린 지방산 에스테르, 아세틸렌계 폴리옥시에틸렌옥사이드 등을 들 수 있고, 이것들은 단독 또는 2종 이상을 혼합해서 사용해도 좋지만, 바람직하게는 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체이다. 또한, 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체의 분자량은 500∼15000의 범위인 것이 바람직하다.
상술의 비이온성 계면활성제의 첨가량은 0.05∼5중량%의 범위에서 첨가하는 것이 바람직하다. 0.05중량% 미만이면 당화 효소의 회수 효율이 낮고, 한편으로 5중량%를 초과하면 당화 효소의 실활이 촉진되고 또한 경제적으로도 불리해지기 때문에 바람직하지 못하다.
2차 가수분해는 무기염의 존재 하이어도 좋고, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 황산염, 암모늄염, 염산염, 인산염, 아세트산염, 질산염 등의 무기염을 사용할 수 있다. 더욱 바람직한 무기염으로서는 염화나트륨, 아세트산나트륨, 황산나트륨, 황산수소나트륨, 인산2수소나트륨, 인산수소나트륨, 염화칼륨, 인산수소2칼륨, 황산암모늄, 염화마그네슘, 황산마그네슘 등이며, 이 중 가장 바람직하게는 나트륨염인 염화나트륨, 황산나트륨, 황산수소나트륨, 마그네슘염인 염화마그네슘, 황산마그네슘이다. 이러한 무기염을 첨가함으로써 회수 효소의 아비셀 분해활성 및 크실란 분해활성을 높일 수 있다.
또한 이러한 무기염의 대체물로서 해수를 사용할 수도 있다. 해수 중에 포함되는 무기염은 염화나트륨 2.6∼2.7%, 염화마그네슘 0.3∼0.4%, 황산마그네슘 0.1∼0.2%, 염화칼륨 약 0.07%를 일반적으로 포함해서 이루어지는 가장 자연계에 대량으로 존재하는 무기염 수용액이다. 따라서, 해수를 무기염 수용액으로서 2차 가수분해에 사용할 수 있다. 해수의 pH는 그 염조성에 의해 대략 결정되고, 일반적으로는 pH8.2∼8.5의 범위에 있고, 그대로의 pH 또는 임의의 pH로 조정해서 2차 가수분해에 사용할 수 있다. 바람직하게는 그 pH를 5∼8.3의 범위로 조정하는 것이 회수 효소의 셀룰라아제 활성을 향상시키는 점에서 바람직하다. pH 조정에는 황산, 염산 등 일반적인 산을 사용하면 되고, 특별히 한정되는 것은 아니다.
또한 이러한 무기염의 대체물로서 셀룰로오스 함유 바이오매스, 그 전처리물, 또는 가수분해 후에 얻어지는 당화 잔사 등을 보일러 연소시킨 회분(灰分)을 무기염의 대체로서 사용할 수 있다. 이러한 회분에는 칼륨염을 많이 포함하고, 이것을 물에 용해시킴으로써 무기염 수용액을 조정할 수 있다.
상술의 무기염의 첨가량은 0.05∼5중량%의 범위에서 첨가하는 것이 바람직하다. 0.05중량% 미만이면 당화 효소의 회수 효율이 낮고, 한편으로 5중량%를 초과하면 당화 효소의 실활이 촉진되며 또한 경제적으로도 불리해지기 때문에 바람직하지 못하다. 무기염 수용액으로서 해수를 사용할 경우에 관해서는 해수의 희석 배율 1/10∼1의 범위에서 설정하는 것이 바람직하다.
2차 가수분해는 친수성 유기용매의 존재 하이어도 좋다. 본 발명에서 말하는 친수성 유기용매란 20℃의 조건 하에서 물에 대하여 100g/L 이상의 용해도를 나타내는 것을 가리킨다. 한편, 상술의 조건 하에서 100g/L 미만의 용해도를 나타내는 것을 소수성 유기용매라고 한다. 소수성 유기용매로서는 1-부탄올(74g/L), 1-펜타놀(27g/L), 1-헥사놀(5.8g/L), 아세트산 에틸(83g/L), 헥산(미량), 클로로포름(미량) 등을 예시할 수 있지만 이것에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 말하는 친수성 유기용매의 대표적인 예로서 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 이소프로판올, 디메틸술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, 아세톤, 아세토니트릴, 에틸렌글리콜, 글리세린 등을 예시할 수 있다. 이러한 친수성 유기용매를 첨가함으로써 회수 효소의 아비셀 분해활성을 높이는 효과가 있기 때문에 바람직하다.
상술의 친수성 유기용매의 첨가량은 0.05∼5중량%의 범위에서 첨가하는 것이 바람직하다. 0.05중량% 미만이면 당화 효소의 회수 효율이 낮고, 한편으로 5중량%를 초과하면 당화 효소의 실활이 촉진되며 또한 경제적으로도 불리해지기 때문에 바람직하지 못하다.
2차 가수분해는 아미노산의 존재 하이어도 좋고, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 이것들의 유도체를 사용할 수 있다. 이러한 아미노산 중, 수 용해성이 높은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 발린이 바람직하고, 가장 바람직하게는 높은 아비셀 분해활성을 나타내는 회수 효소를 얻을 수 있는 아르기닌, 시스테인, 글루탐산, 히스티딘, 리신인 것이 바람직하다.
상술의 아미노산의 첨가량은 0.05∼5중량%의 범위에서 첨가하는 것이 바람직하다. 0.05중량% 미만이면 당화 효소의 회수 효율이 낮고, 한편으로 5중량%를 초과하면 당화 효소의 실활이 촉진되며 또한 경제적으로도 불리해지기 때문에 바람직하지 못하다.
본 발명에서는 상술의 1차 당액 및/또는 2차 당액을 한외여과막에 통과시켜서 여과하여 비투과측으로부터 당화 효소를 분리 회수하고, 투과측으로부터 당 용액을 회수한다. 본 발명에서 사용하는 한외여과막의 분획 분자량은 단당인 글루코오스(분자량 180)를 투과할 수 있고, 효소를 저지할 수 있는 한외여과막이면 한정되지 않는다. 구체적으로는 분획 분자량 500∼50000의 범위이면 좋고, 5000∼50000의 범위의 한외여과막인 것이 보다 바람직하고, 보다 바람직하게는 분획 분자량 10000∼30000이다. 한외여과막의 기능막의 소재로서는 폴리에테르술폰(PES), 폴리술폰(PS), 폴리아크릴로니트릴(PAN), 폴리불화비닐리덴(PVDF), 재생 셀룰로오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스에스테르, 술폰화 폴리술폰, 술폰화 폴리에테르술폰, 폴리올레핀, 폴리비닐알콜, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리4불화에틸렌 등의 소재를 사용할 수 있지만, 재생 셀룰로오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스에스테르는 셀룰라아제에 의한 분해를 받기 때문에 PES, PVDF 등의 합성 고분자를 소재로 한 한외여과막을 사용하는 것이 바람직하다. 한외여과막의 여과 방식으로서 데드엔드 여과, 크로스플로우 여과가 있지만, 막 파울링 억제의 관점으로부터 크로스플로우 여과인 것이 바람직하다. 또한 사용하는 한외여과막의 막형태로서는 평막형, 스파이럴형, 튜블러형, 중공사형 등 적당한 형태의 것을 사용할 수 있다. 구체적으로는 DESAL사의 G-5타입, G-10타입, G-20타입, G-50타입, PW타입, HWS UF타입, KOCH사의 HFM-180, HFM-183, HFM-251, HFM-300, HFM-116, HFM-183, HFM-300, HFK-131, HFK-328, MPT-U20, MPS-U20P, MPS-U20S, Synder사의 SPE1, SPE3, SPE5, SPE10, SPE30, SPV5, SPV50, SOW30, 아사히 카세이제의 마이크로저(등록상표) UF 시리즈 분획 분자량 3000으로부터 100000에 상당하는 것, 니토 덴코 가부시키가이샤제의 NTR7410, NTR7450 등을 들 수 있다.
2차 가수분해에 비이온성 계면활성제, 무기염, 친수성 유기용매, 아미노산 등의 화합물을 첨가할 경우, 그 2차 당액에는 당연히 이것들의 첨가한 화합물을 포함하게 된다. 이러한 2차 당액의 화합물은 종류 및 첨가량에 따라서는 후단계 발효 공정에 저해적으로 작용할 가능성도 있다. 이러한 경우, 2차 당액으로부터 한외여과막을 사용해서 회수 효소만을 분리 회수한 후, 투과측으로부터 얻어지는 무기염을 포함하는 당액은 폐액으로서 처리하면 좋다.
본 발명에서는 1차 당액 및 2차 당액을 한외여과막에 통과시켜서 여과하고, 투과측으로부터 얻어진 당액을 역침투막 및/또는 나노여과에 통과시켜서 더 여과하는 것이 바람직하다. 본 발명의 경우, 본 발명에서는 1차 당액에 비하여 2차 당액은 당 농도가 낮아질 경우가 있고, 그 이유로서 1) 고형물에 흡착된 당화 효소만을 사용한 가수분해 반응이기 때문에 당화 효소의 절대량이 적다, 2) 고형물로서 잔존한 리그노셀룰로오스의 가수분해 효율이 낮다라고 하는 이유를 들 수 있다. 따라서, 2차 당액만, 또는 2차 당액과 1차 당액을 혼합해서 후단계의 발효 공정에서 사용할 경우, 당 농도가 낮고, 발효산물 농도가 저하되는 경우가 있지만, 당액을 역침투막 및/또는 나노여과막에 통과시켜서 여과함으로써 당액의 당 농도의 저하를 막을 수 있다. 또한, 여기에서 말하는 당 농도는 단당 성분, 특히 글루코오스 및 크실로오스의 총량을 가리키고, 이러한 당 농축에 있어서의 농축 배율 등은 한정되나 것은 아니고, 후단계의 발효 공정에 최적인 농도까지 농축되는 것이면 한정되는 것은 아니다. 또한 농축 전의 당 용액의 당 농도는 특별하게 한정되지 않지만, 10g/L∼100g/L인 것이 바람직하다. 또한 농축 후의 당 농도는 특별하게 한정되지 않지만, 일반적으로 50g/L∼200g/L의 범위의 당 농도이면 후단계의 발효 공정에 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 나노여과막 또는 역침투막의 소재에는 아세트산 셀룰로오스계 폴리머, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리이미드, 비닐 폴리머, 폴리술폰 등의 고분자 소재를 사용할 수 있지만, 상기 1종류의 소재로 구성되는 막에 한정되지 않고, 복수의 막 소재를 포함하는 막이어도 좋다.
본 발명에서 사용하는 나노여과막은 스파이럴형의 막 엘리먼트가 바람직하게 사용된다. 바람직한 나노여과막 엘리먼트의 구체예로서는, 예를 들면 아세트산 셀룰로오스계의 나노여과막 엘리먼트인 GE Osmonics사제 GEsepa, 폴리아미드를 기능층으로 하는 알파라발사제 나노여과막 엘리먼트의 NF99 또는 NF99HF, 가교 피페라진 폴리아미드를 기능층으로 하는 필름테크사제 나노여과막 엘리먼트의 NF-45, NF-90, NF-200, NF-270 또는 NF-400, 또는 가교 피페라진 폴리아미드를 주성분으로 하는 도레이 카부시키가이샤제 나노여과막의 UTC60을 포함하는 동사제 나노여과막 엘리먼트 SU-210, SU-220, SU-600 또는 SU-610을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 NF99 또는 NF99HF, NF-45, NF-90, NF-200 또는 NF-400, 또는 SU-210, SU-220, SU-600 또는 SU-610이며, 더욱 바람직하게는 SU-210, SU-220, SU-600 또는 SU-610이다.
또한, 본 발명에서 사용하는 역침투막은 나노여과막과 마찬가지로 스파이럴형의 막 엘리먼트가 바람직하게 사용된다. 바람직한 역침투막 엘리먼트의 구체예로서는, 예를 들면 도레이 카부시키가이샤제 폴리아미드계 역침투막 모듈인 저압 타입의 SU-710, SU-720, SU-720F, SU-710L, SU-720L, SU-720LF, SU-720R, SU-710P, SU-720P 이외에, 역침투막으로서 UTC70을 포함하는 고압 타입의 SU-810, SU-820, SU-820L, SU-820FA, 동사 아세트산 셀룰로오스계 역침투막 SC-L100R, SC-L200R, SC-1100, SC-1200, SC-2100, SC-2200, SC-3100, SC-3200, SC-8100, SC-8200, 니토 덴코(주)제 NTR-759HR, NTR-729HF, NTR-70SWC, ES10-D, ES20-D, ES20-U, ES15-D, ES15-U, LF10-D, 알파라발제 RO98pHt, RO99, HR98PP, CE4040C-30D, GE제 GE Sepa, Filmtec제 BW30-4040, TW30-4040, XLE-4040, LP-4040, LE-4040, SW30-4040, SW30HRLE-4040 등을 들 수 있다.
상술한 본 발명의 당액의 제조방법을 실시하는 장치에 관해서 이하에 설명한다.
본 발명의 당액의 제조방법을 실시하기 위한 장치로서 1차 가수분해를 행하는 교반 탱크(2), 2차 가수분해를 행하는 2차 가수분해조(28) 또는 프레스 여과장치(8), 1차 가수분해물 및 2차 가수분해물을 분리하는 고액 분리장치(25, 30), 1차 당액 및/또는 2차 당액으로부터 당화 효소와 당액을 분리하는 한외여과막 장치(12, 33)를 적어도 구성으로서 포함할 필요가 있다. 이러한 장치에 실시형태를 설명하기 위해서 도 2∼도 8, 도 10∼도 16을 구체예로서 나타냈다. 도 2∼도 8, 도 10∼도 16에 관해서 그 장치 특징을 기준으로 형태 1∼형태 4로 분류했다. 형태 1은 2차 가수분해를 프레스 여과장치(8) 내에서 실시하기 위한 장치 형태이며, 도 2∼도 8에 대응한다.
형태 1은 프레스 여과실 내부에 물을 순환시킴으로써 2차 가수분해를 실시하는 형태이며, 고액 분리로서의 프레스 여과장치(8)가 있으면 본 발명의 2차 가수분해를 실시할 수 있는 장치 형태이다. 이점은 장치 구성이 단순해서 장치 비용을 낮게 억제할 수 있는 점이 있다. 단, 그 한편으로 1차 당액 및 2차 당액의 장치 내에서의 오염(contamination)이 결점이다.
형태 2는 2차 가수분해하기 위한 2차 가수분해조(28)를 포함하는 장치 형태를 나타낸다. 형태 2에서는 교반 탱크(2)와 2차 가수분해조(28)를 독립적으로 갖고 있다. 형태 2의 이점은 2차 가수분해조(28)에서 고형물을 재현탁할 수 있고, 2차 가수분해의 효율이 높은 점이 있다. 또한, 특히 2차 가수분해에 첨가하는 화합물의 종류 또는 농도에 따라서는 후단계의 당액의 발효에서 저해적으로 작용할 가능성도 있다. 따라서, 형태 2와 같이 1차 가수분해를 행하는 교반 탱크(2)에 대하여 2차 가수분해 전용의 2차 가수분해조(28)를 보유하고, 또한 2차 당액 전용의 고액 분리(30), 또한 2차 당액 전용의 한외여과막 장치(33)가 보유되어 있는 것은 1차 당액 및 2차 당액의 오염을 피할 수 있는 이점을 갖는다. 그 한편으로, 형태 2에서는 2차 가수분해조(28)를 비롯하여 설비점수가 전체적으로로 증가하는 것에 따라 설비 비용이 증가한다고 하는 결점을 갖는다.
다음에, 형태 3으로서 1차 가수분해를 행하는 교반 탱크(2)에 있어서 2차 가수분해도 행하는 장치 형태를 나타내는 도면이다. 형태 3에서는 교반 탱크(2)에서 얻어진 가수분해물을 고액 분리하여 이것을 다시 교반 탱크(2)로 되돌리고, 여기에 물을 첨가해서 2차 가수분해를 행하는 장치 형태이다. 이점은 가장 장치 점수를 줄일 수 있어 설비 비용을 삭감할 수 있다고 하는 것에 있다. 단, 그 한편으로 1차 당액 및 2차 당액의 장치 내에서의 오염이 결점이다.
또한, 형태 4는 고액 분리장치(25)와 한외여과막 장치(12)의 사이에 정밀여과막 장치(36)를 설치한 실시형태의 부분 도면이다. 정밀여과막 장치를 설치하는 이점으로서 고액 분리에서 충분히 제거할 수 없었던 불용성 미립자를 제거할 수 있어 후단계의 한외여과막 장치(12)의 막 막힘을 저감할 수 있다.
형태 장치의 특징 대응 도면
1 2차 가수분해를 프레스 여과조 장치 내에서 실시하는 장치 형태 도 2∼도 8
2 2차 가수분해를 2차 가수분해조에서 실시하는 장치 형태 도 10∼도 12
3 2차 가수분해를 1차 가수분해와 동일 교반 탱크에서 실시하는 장치 형태 도 13
4 한외여과막 장치의 앞공정에 정밀여과막 장치를 설치한 장치 형태(부분 도면) 도 14∼도 16
이하, 형태 1의 2차 가수분해를 프레스 여과장치 내에서 실시한 형태에 관하여 도 2∼도 8의 약도를 사용하여 설명한다.
본 발명의 당액의 제조방법을 실시하기 위한 장치로서 1차 가수분해를 행하는 교반 탱크(2), 온수 공급조(6)를 갖는 프레스 여과장치(8), 프레스 여과장치(8)의 여과액을 온수 공급조(6)에 순환시키는 순환 라인(10), 1차 당액 및/또는 2차 당액으로부터 당화 효소와 당 용액을 분리하는 한외여과막 장치(12)를 구성으로서 포함하는 장치를 들 수 있다. 본 발명의 당액의 제조방법을 위한 장치에 대해서 도면으로 나타내어지는 장치를 예시해서 설명한다.
도 2 및 도 3은 도 4에서 나타내는 온수 통수구(15)와 가수분해물 투입구(14)를 별도로 갖는 프레스 여과장치(8)를 사용할 때의 장치 약도이다. 한편, 도 5 및 도 6은 도 7에서 나타내는 가수분해물 투입구겸 온수 통수구(21)를 갖는 프레스 여과장치(8)를 사용할 때의 장치의 약도이다. 또한 도 2 및 도 5는 교반 탱크(2)와 온수 공급조(6)를 독립적으로 갖는 장치의 약도이다. 한편, 도 3 및 도 6은 교반 탱크(2)를 온수 공급조로서 병용할 경우의 장치의 약도이다.
도 2의 장치에 관해서 상세하게 설명한다. 1차 가수분해를 행하는 교반 탱크(2)는 셀룰로오스를 공급하는 공급구(3) 및 리그노셀룰로오스를 교반 혼합하는 교반장치(4), 교반 탱크를 보온하는 보온설비(1)를 구비한다. 교반 탱크(2)에서 얻어진 1차 가수분해물은 가수분해물 투입구(14)로부터 프레스 여과장치(8)에 투입된다. 여기에서 컴프레서(9)에 의한 압착에 의해 고액 분리를 행하고, 프레스 여과실 내에 유지된 고형물에 대하여 온수 공급조(6)로부터 온수를 온수 통수구(15)로 통수한다. 온수 공급조(6)는 물공급 라인(5), 온수를 소정 온도로 보온하는 온수 공급조 보온설비(7) 및 프레스 여과의 여과액을 순환시키는 순환 라인(10)을 구비한다. 프레스 여과에서 얻어진 1차 당액 및/또는 2차 당액은 여과액 회수 탱크(11)에 유지되고, 한외여과막 장치(12)에 의해 여과된다. 회수된 당화 효소는 당화 효소 회수 라인을 통해서 회수 및/또는 재이용된다.
도 3의 장치에 관해서 상세하게 설명한다. 1차 가수분해를 행하는 교반 탱크(2)는 셀룰로오스를 투입하는 투입구(3) 및 셀룰로오스를 교반 혼합하는 교반장치(4), 교반 탱크를 보온하는 보온설비(1)을 구비한다. 교반 탱크(2)에서 얻어진 1차 가수분해물은 가수분해물 투입구(14)로부터 프레스 여과장치(8)에 투입된다. 여기에서 컴프레서(9)에 의한 압착에 의해 고액 분리를 행하고, 프레스 여과실 내에 유지된 고형물에 대하여 온수 공급조(6)로부터 온수를 온수 통수구(15)로 통수한다. 프레스 여과장치(8)에 가수분해물 투입구(14) 및 온수 통수구(15)가 연결되어 있고, 밸브에 의해 흐름을 바꿀 수 있다. 프레스 여과에서 얻어진 1차 당액 및/또는 2차 당액은 여과액 회수 탱크(11)에 유지되고, 한외여과막 장치(12)에 의해 여과된다. 회수된 당화 효소는 당화 효소 회수 라인을 통해서 회수 및/또는 재이용된다.
도 5의 장치에 관해서 상세하게 설명한다. 1차 가수분해를 행하는 교반 탱크(2)는 셀룰로오스를 투입하는 투입구(3) 및 셀룰로오스를 교반 혼합하는 교반장치(4), 교반 탱크를 보온하는 보온설비(1)를 구비한다. 교반 탱크(2)에서 얻어진 1차 가수분해물은 가수분해물 투입구겸 온수 통수구(21)로부터 프레스 여과장치(8)에 투입된다. 여기에서 컴프레서(9)에 의한 압착에 의해 고액 분리를 행하고, 프레스 여과실 내에 유지된 고형물에 대하여 온수 공급조(6)로부터 온수를 가수분해물투입구겸 온수 통수구(21)에 통수한다. 온수 공급조(6)는 물공급 라인(5), 온수를 소정 온도로 보온하는 온수 공급조 보온설비(7) 및 프레스 여과의 여과액을 순환시키는 순환 라인(10)을 구비한다. 프레스 여과에서 얻어진 1차 당액 및/또는 2차 당액은 여과액 회수 탱크(11)에 유지되고, 한외여과막 장치(12)에 의해 여과된다. 회수된 당화 효소는 당화 효소 회수 라인을 통해서 회수 및/또는 재이용된다.
도 6의 장치 시스템에 관해서 상세하게 설명한다. 1차 가수분해를 행하는 교반 탱크(2)는 셀룰로오스를 투입하는 투입구(3) 및 셀룰로오스를 교반 혼합하는 교반장치(4), 교반 탱크를 보온하는 보온설비(1)를 구비한다. 교반 탱크(2)에서 얻어진 1차 가수분해물은 가수분해물 투입구겸 온수 통수구(21)로부터 프레스 여과장치(8)에 투입된다. 여기에서 컴프레서(9)에 의한 압착에 의해 고액 분리를 행하고, 프레스 여과실 내에 유지된 고형물에 대하여 교반 탱크(2)로부터 온수를 가수분해물투입구겸 온수 통수구(21)로 통수한다. 프레스 여과에서 얻어진 1차 당액 및/또는 2차 당액은 여과액 회수 탱크(11)에 유지되고, 한외여과막 장치(12)에 의해 여과된다. 회수된 당화 효소는 당화 효소 회수 라인을 통해서 회수 및/또는 재이용된다.
상술의 장치에 있어서, 2차 가수분해는 1차 가수분해물을 프레스 여과하고, 얻어진 고형물을 유지한 여과실 조 내에 40∼60℃의 온수를 통수 및/또는 순환시킴으로써 2차 가수분해를 행할 수 있다. 프레스 여과 후의 고형물은 함수율이 낮고,또한 유동성이 낮기 때문에 2차 가수분해를 별도 교반조 내 등에서 고형물의 재분산을 행하는데에 에너지 동력을 요한다. 또한, 미리 온수 공급조(6)에서 40∼60℃의 범위로 보온해 둔 온수를 프레스 여과실 내에 통수함으로써 고형물에 흡착된 효소 성분의 활성을 높일 수 있고, 본 발명의 2차 가수분해를 실시할 수 있다. 온수의 통수량은 통수량이 지나치게 많으면 2차 당액의 당 농도가 지나치게 낮아지므로 바람직하지 못하다. 또한 한편으로 통수량이 적으면 여과실 내의 반응 온도를 충분히 유지할 수 없어 바람직하지 못하다. 또한, 한번 통수한 물을 40∼60℃로 가열해 다시 순환시킴으로써 반응 온도를 유지할 수 있고, 2차 당액의 당 농도를 높일 수 있다. 온수의 통수 및/또는 순환 시간은 5분∼180분의 범위인 것이 바람직하다. 5분보다 짧으면 충분한 2차 가수분해를 행할 수 없고, 한편으로 180분을 초과해도 당 생성 속도가 포화되어 오기 때문에 에너지적으로 바람직하지 못하다.
프레스 여과장치에 대해서 도 4 및 도 7에 약도로서 나타낸다. 도 4는 1차 가수분해물을 가수분해물 투입구(14)로부터 프레스 여과실 내(20)에 투입하고, 그 후 압판(19)으로 압착함으로써 고액 분리를 행한다. 그 후에 온수를 온수 통수구(15)로부터 통수하고, 고형물(1차 가수분해물)(18)에 온수를 접촉시켜 여과포(17)를 통해서 여과된다. 이 여과액은 또한 보온장치를 거쳐서 순환시켜 온수 통수구(15)로부터 다시 프레스 여과실 내로 통수된다. 이것을 순환해서 행함으로써 프레스 여과실 내에서 2차 가수분해를 실시할 수 있다. 도 7은 온수를 가수분해물투입구겸 온수 통수구(21)로부터 온수를 공급하는 방법을 나타내는 약도이다. 즉, 1차 가수분해물을 가수분해물 투입구겸 온수 통수구(21)로부터 프레스 여과실 내(20)에 투입하고, 압판(19)으로 압착함으로써 고액 분리를 행한다. 그 후에 온수를 가수분해물 투입구겸 온수 통수구(21)로부터 통수하고, 고형물(1차 가수분해물)(18)에 온수를 접촉시켜 여과포(17)를 통해서 여과된다. 이 여과액은 또한 보온장치를 거쳐서 순환시켜 가수분해물 투입구겸 온수 통수구(21)로부터 다시 프레스 여과실 내로 통수된다. 이것을 순환해서 행함으로써 프레스 여과실 내에서 2차 가수분해를 실시할 수 있다. 프레스 여과실 내로의 온수의 통수 및/또는 순환 시간은 5분∼180분의 범위인 것이 바람직하다. 5분보다 짧으면 충분한 2차 가수분해를 행할 수 없고, 한편으로 180분을 초과해도 당 생성 속도가 포화되어 오기 때문에 에너지적으로 바람직하지 못하다. 또한, 온수의 통수량은 통수량이 지나치게 많으면 2차 당액의 당 농도가 지나치게 낮아지므로 바람직하지 못하다. 또 한편으로 통수량이 적으면 여과실 내의 반응 온도를 충분히 유지할 수 없어 바람직하지 못하다. 이러한 경우, 한번 통수한 물을 40℃∼60℃로 가열해 다시 순환시킴으로써 반응 온도를 유지할 수 있고, 2차 당액의 당 농도를 높일 수 있다.
도 2의 장치에 추가하여, 또한 당액을 농축하는 역침투막 및/또는 나노여과막을 설치한 당 농축장치가 부수된 장치에 대해서 도 8에 약도로서 나타낸다. 구체적으로는, 한외여과막 장치(12)의 여과액측에 당 용액 탱크(22) 및 이것과 펌프를 통해서 연결된 나노여과막 장치 및/또는 역침투막 장치(23), 또한 여과액 라인(24)을 포함하는 장치이다. 또한, 도 3, 도 5 또는 도 6의 장치에 나노여과막 장치 및/또는 역침투막 장치를 접속시키는 경우에는 도 2와 마찬가지로 도 3, 도 5 또는 도 6의 장치에 부수된 한외여과막 장치(12)의 후공정으로서, 도 8과 같은 방식으로 나노여과막 장치 및/또는 역침투막 장치를 접속시키면 좋다.
다음에 형태 2의 2차 가수분해를 2차 가수분해조에서 실시하는 형태에 관하여 도 10∼도 12로 설명한다.
도 10의 장치 시스템에서는 1차 가수분해를 행하는 교반 탱크(2)와, 2차 가수분해를 행하는 2차 가수분해조(28)를 독립적으로 갖는 장치 시스템 실시예를 도시한 도면이다. 고액 분리장치(25)는 원심 분리, 필터 프레스, 벨트 필터 등 1차 가수분해물을 고액 분리 가능한 장치이면 한정되지 않는다. 고액 분리장치(25)에서 얻어진 고형물은 고형물 이송수단(26)에 의해 2차 가수분해조(28)로 이송된다. 고형물 이송수단(26)으로서는 벨트 컨베이어, 스크류 펌프 등 고형물의 성상에 알맞은 이송수단을 선정하면 한정되지 않는다. 2차 가수분해조(28)는 2차 가수분해를 실시하기 위해서 적어도 보온설비 2(2차 가수분해조)(27)를 가지고 이루어진다. 또한, 고형물을 교반 혼합하기 위한 교반 장치 2(2차 가수분해조)(29)를 더 가져도 좋다. 또한, 2차 가수분해물을 고액 분리하는 고액 분리장치 2(2차 가수분해조)(30)를 가져도 좋다. 고액 분리장치 2(2차 가수분해조)(30)에서 분리된 2차 당액은 2차 당액 회수 탱크(32)로 이송된다. 2차 당액 회수 탱크(32)의 2차 당액은 2차 당액 한외여과막 장치(33)에서 여과되어 효소의 회수를 행한다.
도 11의 장치 시스템에서는 1차 가수분해를 행하는 교반 탱크(2)와 2차 가수분해조(28), 고액 분리장치(25)와 고액 분리장치 2(2차 가수분해물)(30)를 각각 독립적으로 갖지만, 한외여과막 장치(12)는 1차 당액 및 2차 당액 공통에서 사용할 경우의 실시형태이다. 도 10과 같이 2차 가수분해조(28)에서 얻어진 2차 가수분해물은 고액 분리장치 2(2차 가수분해물)(30)에서 고액 분리되어 2차 당액 이송 라인(34)을 통해서 여과액 탱크(11)로 이송된다. 여과액 탱크(11)에 회수된 1차 당액 및 2차 당액은 동시적 또는 순차적으로 한외여과막 장치(12)에서 여과되어 효소와 당을 분리한다.
도 12의 장치 시스템에서는 1차 가수분해를 행하는 교반 탱크(2)와 2차 가수분해조(28)를 독립적으로 갖고 있지만, 고액 분리장치(25)와 한외여과막 장치(12)는 1차 당액 및 2차 당액 공통에서 사용하는 실시형태이다. 2차 가수분해조(28)에서 얻어진 2차 가수분해물은 2차 가수분해물 이송 라인(35)을 통해서 고액 분리장치(25)로 이송되어 2차 당액과 고형물로 분리된다. 고액 분리장치(25)에서 분리된 1차 당액 및 2차 당액은 여과액 회수 탱크(11)에 회수되고, 동시적 또는 순차적으로 한외여과막 장치(12)에서 여과되어 효소와 당을 분리한다.
다음에 형태 3의 2차 가수분해를 1차 가수분해와 동일 탱크에서 실시하는 형태에 관해 도 13으로 설명한다.
도 13의 장치에서는 1차 가수분해를 행하는 교반 탱크(2)에서 얻어진 1차 가수분해물을 고액 분리장치(25)에서 분리하고, 얻어진 고형물을 2차 가수분해물이송 라인(35)에 의해 1차 가수분해조에 순환시켜 1차 가수분해조에서 2차 가수분해를 행하는 실시형태를 나타낸다. 고액 분리장치(25)에서 분리된 1차 당액 및 2차 당액은 여과액 회수 탱크(11)에 회수되고, 한외여과막 장치(12)에 통과되어 여과되어 효소와 당을 분리한다.
다음에 한외여과막 장치의 앞공정에 정밀여과막 장치를 설치한 장치 형태에 관하여 도 14∼도 16으로 설명한다. 도 14는 한외여과막 장치(12)의 앞공정에 정밀여과막 장치(36)를 설치한 실시형태(부분 도면)이다. 정밀여과막 장치(36)는 고액 분리장치(33), 또는 프레스 여과장치(8)에서 얻어진 1차 당액 및/또는 2차 당액에 포함되는 불용성 미립자 성분을 제거할 수 있는 것이면 특별하게 한정되지 않지만, 평균 세공 지름 0.01㎛∼1㎛의 범위의 정밀여과막을 예시할 수 있다. 또한 정밀여과막 장치(36)에 있어서의 여과 방식은 크로스플로우 여과(도 15), 데드엔드 여과(도 16)의 어느 것이라도 좋다.
도 15는 크로스플로우 여과에 의해 정밀여과를 행하는 정밀여과막 장치(36)의 실시형태이며, 정밀여과막 원수 탱크(37)에 1차 당액 및/또는 2차 당액을 저장하고, 정밀여과막(38)에 대하여 펌프로 순환하면서 여과해도 좋다.
도 16은 데드엔드 여과에 의해 정밀여과를 행하는 실시형태이다. 정밀여과막 원수 탱크(37)에 1차 당액 및/또는 2차 당액을 저장하고, 정밀여과막(38)으로 여과한다. 데드엔드 여과의 경우, 경우에 따라서는 막 표면의 기포 세정을 행하기 위한 압공 공급장치(39)를 구비하고 있어도 좋고, 또한 역세정을 위한 역세정펌프(40)를 설치하고 있어도 좋다. 또한, 역세정은 정밀여과액 회수조(41)에 회수된 여과액이라도 좋고, 경우에 따라서는 일반적인 막 세정액 또는 약액이어도 좋다. 정밀여과막(38)은 평막, 중공사막의 어느 것이라도 좋다. 중공사막은 내압식 또는 외압식의 어느 것이라도 좋다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이것들에 한정되는 것은 아니다.
(참고예 1) 셀룰로오스 전처리물의 조정
1. 셀룰로오스 전처리물 1의 조정(희황산 처리)
셀룰로오스로서 볏짚을 사용했다. 셀룰로오스를 황산 1% 수용액에 담그고, 150℃에서 30분 오토클레이브 처리(닛토코아츠제)했다. 처리 후 고액 분리를 행하여 황산 수용액(이하, 희황산 처리액)과 황산 처리 셀룰로오스로 분리했다. 다음에 황산 처리 셀룰로오스와 고형분 농도가 10중량%가 되도록 희황산 처리액과 교반 혼합한 후 수산화나트륨에 의해 pH를 5 부근으로 조정했다. 이것을 셀룰로오스 전처리물 1로서 이하 실시예에 사용했다.
2. 셀룰로오스 전처리물 2의 조정(암모니아 처리)
셀룰로오스로서 볏짚을 사용했다. 상기 셀룰로오스를 소형 반응기(타이아츠 가라스 고교제, TVS-N2 30ml)에 투입하여 액체 질소로 냉각했다. 이 반응기에 암모니아 가스를 유입시켜 시료를 완전하게 액체 암모니아에 침지시켰다. 리액터의 덮개를 닫고 실온에서 15분쯤 방치했다. 이어서, 150℃의 오일 배스 내에서 1시간 처리했다. 처리 후 반응기를 오일 배스로부터 꺼내어 드래프트 중에서 즉시 암모니아 가스를 누출시킨 후, 또한 진공펌프로 반응기 내를 10Pa까지 진공 처리하여 건조시켰다. 이것을 셀룰로오스 전처리물 2로서 이하 실시예에 사용했다.
3. 셀룰로오스 전처리물 3의 조정(수열 처리)
셀룰로오스로서 볏짚을 사용했다. 상기 셀룰로오스를 물에 담그고, 교반하면서 180℃에서 20분간 오토클레이브 처리(닛토 코아츠 가부시키가이샤제)했다. 그 때의 압력은 10MPa이었다. 처리 후는 용액 성분(이하, 수열 처리액)과 처리 바이오매스 성분으로 원심분리(3000G)를 이용하여 고액 분리했다. 이 처리 바이오매스 성분을 셀룰로오스 전처리물 3으로서 이하 실시예에 사용했다.
(참고예 2) 당 농도의 측정
당액에 포함되는 글루코오스 및 크실로오스 농도는 하기에 나타내는 HPLC 조건에서 표품과의 비교에 의해 정량했다.
컬럼 : Luna NH2(Phenomenex사제)
이동상 : 밀리Q: 아세토니트릴=25:75(유속 0.6mL/분)
반응액 : 없슴
검출방법 : RI(시차굴절율)
온도 : 30℃
(참고예 3) 트리코데르마 유래 셀룰라아제의 조정
트리코데르마 유래 셀룰라아제는 이하의 방법으로 조정했다.
[전배양]
옥수수 침지액(corn steep liquor) 5%(w/vol), 글루코오스 2%(w/vol), 주석산암모늄 0.37%(w/vol), 황산암모늄 0.14(w/vol), 인산2수소칼륨 0.2%(w/vol), 염화칼슘 2수화물 0.03%(w/vol), 황산마그네슘 7수화물 0.03%(w/vol), 염화아연 0.02%(w/vol), 염화철(III) 6수화물 0.01%(w/vol), 황산구리(II) 5수화물 0.004%(w/vol), 염화망간 4수화물 0.0008%(w/vol), 붕산 0.0006%(w/vol), 7몰리브덴산 6암모늄 4수화물 0.0026%(w/vol)이 되도록 증류수에 첨가하여 100mL를 500mL 배플을 가진 삼각플라스크에 채우고, 121℃에서 15분간 오토클레이브 멸균했다. 방냉 후, 이것과는 별도로 각각 121℃에서 15분간 오토클레이브 멸균한 PE-M과 Tween80을 각각 0.01%(w/vol) 첨가했다. 이 전배양 배지에 트리코데르마 리세이 PC3-7을 1×105개/mL가 되도록 식균하고, 28℃, 72시간, 180rpm으로 진탕 배양하여 전배양으로 했다(진탕장치 : TAITEC사제 BIO-SHAKER BR-40LF).
[본배양]
옥수수 침지액 5%(w/vol), 글루코오스 2%(w/vol), 셀룰로오스(아비셀) 10%(w/vol), 주석산암모늄 0.37%(w/vol), 황산암모늄 0.14%(w/vol), 인산2수소칼륨0.2%(w/vol), 염화칼슘 2수화물 0.03%(w/vol), 황산마그네슘 7수화물 0.03%(w/vol), 염화아연 0.02%(w/vol), 염화철(III) 6수화물 0.01%(w/vol), 황산구리(II) 5수화물 0.004%(w/vol), 염화망간 4수화물 0.0008%(w/vol), 붕산 0.0006%(w/vol), 7몰리브덴산 6암모늄 4수화물 0.0026%(w/vol)이 되도록 증류수에 첨가하고, 2.5L를 5L용량 교반병(ABLE사제 DPC-2A) 용기에 채우고, 121℃에서 15분간 오토클레이브 멸균했다. 방냉 후, 이것과는 별도로 각각 121℃에서 15분간 오토클레이브 멸균한 PE-M과 Tween80을 각각 0.1% 첨가하고, 미리 상기의 방법으로 액체 배지에서 전배양한 트리코데르마 리세이 PC3-7을 250mL 접종했다. 그 후에 28℃, 87시간, 300rpm, 통기량 1vvm으로 배양을 행하고, 원심분리 후 상청을 막여과(밀리포어사제 스테리컵(Stericup)-GV 재질: PVDF)했다. 이 상술 조건에서 조정한 배양액에 대하여 β-글루코시다아제(Novozyme 188)를 단백질 중량비로서 1/100량 첨가하고, 이것을 트리코데르마 유래 셀룰라아제로 해서 이하 실시예에 사용했다.
(참고예 4) 셀룰라아제 활성 측정방법
셀룰라아제 활성은 1) 아비셀 분해활성, 2) 카르복시메틸셀룰로오스(CMC) 분해활성, 3) 셀로비오스 분해활성, 4) 크실란 분해활성의 4종의 분해활성으로 나누어 이하의 순서로 활성을 측정 평가했다.
1) 아비셀 분해활성
효소액(소정 조건으로 조정)에 대하여 아비셀(Merch사제, Cellulose Microcrystalline)을 1g/L, 아세트산나트륨 완충액(pH5.0)을 100mM이 되도록 첨가하고, 50℃에서 24시간 반응시켰다. 반응액은 1mL 튜브로 조정하고, 상기 조건에서 회전 혼화하면서 반응을 행하였다. 반응 후 튜브를 원심분리하고, 그 상청 성분의 글루코오스 농도를 측정했다. 글루코오스 농도는 참고예 2에 기재된 방법에 준해서 측정했다. 아비셀 분해활성은 생성된 글루코오스 농도(g/L)를 그대로 활성값으로 했다.
2) CMC 분해활성
효소액에 대하여 카르복시메틸셀룰로오스 10g/L, 아세트산나트륨 완충액(pH5.0)을 100mM이 되도록 첨가하고, 50℃에서 0.5시간 반응시켰다. 반응액은 1mL 튜브로 조정하고, 상기 조건에서 회전 혼화하면서 반응을 행하였다. 반응 후 튜브를 원심분리하고, 그 상청 성분의 글루코오스 농도를 측정했다. 글루코오스 농도는 참고예 2에 기재된 방법에 준해서 측정했다. CMC 분해활성은 생성된 글루코오스 농도(g/L)를 그대로 활성값으로 했다.
3) 셀로비오스 분해활성
효소액에 대하여 셀로비오스(와코쥰야쿠) 500mg/L, 아세트산나트륨 완충액(pH5.0)을 100mM이 되도록 첨가하고, 50℃에서 0.5시간 반응시켰다. 반응액은 1mL 튜브로 조정하고, 상기 조건에서 회전 혼화하면서 반응을 행하였다. 반응 후 튜브를 원심분리하고, 그 상청 성분의 글루코오스 농도를 측정했다. 글루코오스 농도는 참고예 2에 기재된 방법에 준해서 측정했다. 셀로비오스 분해활성은 생성된 글루코오스 농도(g/L)를 그대로 활성값으로 했다.
4) 크실란 분해활성
효소액에 대하여 크실란(Birch wood xylan, 와코쥰야쿠) 10g/L, 아세트산나트륨 완충액(pH5.0)을 100mM이 되도록 첨가하여 50℃에서 4시간 반응시켰다. 반응액은 1mL 튜브로 조정하고, 상기 조건에서 회전 혼화하면서 반응을 행하였다. 반응 후 튜브를 원심분리하고, 그 상청 성분의 크실로오스 농도를 측정했다. 크실로오스 농도는 참고예 2에 기재된 방법에 준해서 측정했다. 크실로오스 분해활성은 생성된 크실로오스 농도(g/L)를 그대로 활성값으로 했다.
(실시예 1) 트리코데르마 유래 셀룰라아제에 의한 셀룰로오스의 가수분해
이하 실시예로서 트리코데르마 유래 셀룰라아제를 사용한 셀룰로오스의 가수분해에 있어서 1차 가수분해, 및 2차 가수분해를 행한 결과를 나타낸다. 실험방법은 이하의 방법으로 행하였다.
(공정 1: 1차 가수분해)
셀룰로오스 전처리물 1∼3(각 1g)에 증류수를 첨가하고, 트리코데르마 유래 셀룰라아제 10mg을 첨가하며, 총 중량이 10g이 되도록 증류수를 더 첨가했다. 또한, 본 조성물의 pH가 4.5∼5.3의 범위가 되도록 희석 황산 또는 희석 가성소다로 조정했다. pH를 조정한 본 조성물을 가지달린 시험관에 옮기고(도교 리카사제 φ30 NS14/23), 50℃에서 24시간 보온 및 교반하여 가수분해를 행하였다(도쿄 리카사제: 소형 메커니컬 교반기 CPS-1000, 변환 어댑터, 3방향 코크가 있는 첨가구, 보온장치 MG-2200). 가수분해물을 원심분리(3000G, 10분)에 의해 고액 분리하고, 1차 당액(6mL)과 고형물로 분리했다. 얻어진 1차 당액의 글루코오스 및 크실로오스 농도는 참고예 2 기재의 방법으로 측정했다. 또한, 1차 당액의 당 생성량(mg)은 이하의 식으로 산출하고, 이 결과를 표 2에 정리했다.
1차 당액의 당 생성량(mg)={24시간 후의 당 농도(g/L)-0시간 후의 당 농도(g/L)}×6(mL).
Figure 112012077784044-pct00001
(공정 2: 2차 가수분해)
공정 1에서 얻어진 고형물에 총 중량이 10g이 되도록 증류수를 더 첨가했다. 또한, 본 조성물의 pH가 4.5∼5.3의 범위가 되도록 희석 황산 또는 희석 가성소다로 조정했다. 본 조성물을 가지달린 시험관에 옮기고(도쿄 리카사제 φ30 NS14/23), 50℃에서 1시간 보온 및 교반하여 2차 가수분해를 행하였다(도쿄 리카사제: 소형 메커니컬 교반기 CPS-1000, 변환 어댑터, 3방향 코크가 있는 첨가구, 보온장치 MG-2200). 가수분해물을 원심분리(3000G, 10분)로 고액 분리하고, 2차 당액(6mL)과 고형 잔사로 분리했다. 2차 당액의 글루코오스 및 크실로오스 농도는 참고예 2 기재의 방법으로 측정했다. 또한, 2차 당액의 당 생성량(mg)은 이하의 식으로 산출했다.
2차 당액의 당 생성량(mg)={1시간 후의 당 농도(g/L)-0시간 후의 당 농도(g/L)}×6(mL).
이 결과를 표 3에 정리했다. 2차 가수분해에서는 특단효소의 첨가는 행하고 있지 않지만 1시간의 보온에 의해 당 농도가 증가하는 것이 판명되었다. 즉, 고형물 중에 잔존하고 있는 1차 당액 또는 고형물로의 흡착 효소만으로 2차 가수분해 반응이 보여졌다.
Figure 112012077784044-pct00002
(공정 3: 당화 효소의 회수)
공정 1의 1차 가수분해에서 얻어진 1차 당액(6mL), 및 공정 2의 2차 가수분해에서 얻어진 2차 당액(6mL)을 혼합하고, 이 용액으로부터 당화 효소의 회수를 행하였다.
상기 용액을 분획 분자량 10000의 한외여과막(Sartorius stedim biotech사제, VIVASPIN 20, 재질: PES)으로 여과하고, 막 획분이 1mL가 될 때까지 4500G에서 원심했다. 증류수 10mL를 막 획분에 첨가하고, 다시 막 획분이 1mL이 될 때까지 4500G에서 원심했다. 이 후, 막 획분으로부터 효소를 회수했다. 회수한 효소의 단백질 농도는 BCA 측정 키트(BCA Protein Assay Reagent kit, 피아스사)를 사용해서 행하고, 소알부민(2mg/mL)을 표품으로 해서 562㎚의 흡광도를 측정하고, 비색정량을 행하였다. 회수할 수 있었던 효소 농도(mg/mL)를 막 획분의 용액량 1mL로 곱해서 회수할 수 있었던 당화 효소량을 산출했다. 그 결과, 표 4에 나타내어지는 바와 같이 1.6∼2.6mg의 효소를 회수할 수 있는 것이 판명되었다.
Figure 112012077784044-pct00003
(실시예 2) 2차 가수분해에 있어서의 반응 온도와 당 생성량/회수 효소량으로의 영향
실시예 1의 공정 2에 있어서 반응 온도를 25℃∼90℃의 온도로 설정하고, 2차 가수분해를 실시했을 때의 2차 당액(6mL) 중의 당 생성량(글루코오스, g)을 표 5에 나타낸다. 본 발명의 2차 가수분해에서는 40∼60℃의 범위, 즉 트리코데르마 유래 셀룰라아제의 반응 최적온도에 있어서 당 생성량이 가장 증대하는 것이 판명되었다.
Figure 112012077784044-pct00004
또한, 실시예 1의 공정 2에 있어서 반응 온도를 25∼90℃의 온도로 설정하고, 공정 3의 당화 효소의 회수를 행하여 회수할 수 있었던 당화 효소량을 산출했다. 그 결과, 표 6에 보여지는 바와 같이 2차 가수분해의 반응 온도 40∼60℃에 있어서 당화 효소의 회수 효소량이 증대하는 것이 판명되었다. 또한, 더욱 바람직한 2차 가수분해의 온도는 50℃인 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112012077784044-pct00005
(실시예 3) 회수 효소의 분석
실시예 1에 있어서의 공정 3에서 얻어진 회수 효소(셀룰로오스 전처리물 2)에 관해서 SDS-PAGE에 의한 전기영동을 행하고, 회수 효소 성분에 관해서 분석을 행했다. 우선, 회수 효소에 동량의 샘플 처리 버퍼(ATTO사제 Ez Apply)를 혼합하고, 100℃에서 10분 처리했다. 처리 샘플을 15% 전기영동용 겔(gel)(ATTO사제 e-PAGEL)에 5μL 제공하여 전기영동을 행하였다(40mA, 30분). 겔을 인출하고, 쿠마시브릴리언트블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색 후(Bio-Rad사제 Bio-safe CBB), 증류수로 탈색을 행하였다. 얻어진 전기영동의 겔 염색한 결과를 도 9에 나타낸다. 40℃∼60℃에 있어서, 특히 트리코데르마 유래 셀룰라아제 성분 중 셀로비오하이드로라제가 회수 효소 성분으로서 포함되는 것을 확인할 수 있었다.
(실시예 4) 2차 가수분해에 있어서의 반응 시간과 당 생성량/회수 효소량의 관계
실시예 1의 공정 2에 있어서 반응 시간을 0∼720분의 범위로 설정하고, 2차 가수분해를 실시했을 때의 2차 당액(6mL) 중의 당 생성량(글루코오스, g)을 표 7에 나타낸다. 본 발명의 2차 가수분해는 적어도 5분 이상 행함으로써 충분한 당 생성량을 얻을 수 있는 것이 판명되었다. 한편으로, 180분을 초과하는 범위에 있어서는 회수 효소량에 변화 등이 보이지 않았다.
Figure 112012077784044-pct00006
이어서, 실시예 1의 공정 2에 있어서 반응 시간을 0∼720분의 범위로 설정하고, 공정 3의 당화 효소의 회수를 행하여 회수할 수 있었던 당화 효소량을 산출했다. 그 결과, 표 8에 보여지는 바와 같이 본 발명의 2차 가수분해는 적어도 5분 이상 행함으로써 충분한 회수 효소량을 얻을 수 있는 것이 판명되었다. 한편으로, 180분을 초과하는 범위에 있어서는 회수 효소량에 변화가 보여지지 않았다.
Figure 112012077784044-pct00007
(실시예 5) 2차 가수분해에 있어서의 pH와 회수 효소량의 관계
실시예 1의 공정 2에서는 pH4.5∼5.3의 범위가 되도록 희석 황산 또는 희석 가성소다로 조정해서 50℃에서 실시했지만, 본 실시예에서는 pH를 3∼10의 각 pH 범위가 되도록 희석 완충액을 사용해서 설정하고, 2차 가수분해를 50℃에서 실시했다. 완충액으로서는 pH3∼8의 범위에서는 2mM의 아세트산나트륨 완충액을 사용하고, pH9∼10의 범위에서는 2mM의 글리신수산화나트륨 완충액을 사용했다. pH 이외는 실시예 1과 같은 방법으로 실시했다. 그 결과, 표 9에 보여지는 바와 같이 2차 가수분해의 pH를 6.0∼8.0의 범위에서 행함으로써 회수 효소량을 증대시킬 수 있는 것이 판명되었다.
Figure 112012077784044-pct00008
(실시예 6) 2차 가수분해에 있어서의 비이온성 계면활성제의 첨가량과 회수 효소량의 관계
비이온성 계면활성제로서 플루로닉 F-68(BASF사제)을 사용했다. 실시예 1의 공정 2에 있어서 플루로닉 F-68을 최종 농도 0.01∼5%의 범위가 되도록 첨가해 2차 가수분해를 실시했다. 비이온성 계면활성제의 첨가 이외는 실시예 1과 같은 방법으로 실시했다. 그 결과, 표 10에 보여지는 바와 같이 비이온성 계면활성제를 0.05% ∼2%의 범위에서 첨가함으로써 회수 효소량을 증대시킬 수 있었다.
Figure 112012077784044-pct00009
(참고예 4) 1차 가수분해물의 대량 조정
1차 가수분해물의 대량 조정은 셀룰로오스 전처리물 3(2kg)에 트리코데르마 유래 셀룰라아제 20g을 첨가하고, 총 중량이 20kg이 되도록 증류수를 더 첨가했다. 또한, 본 조성물의 pH가 4.5∼5.3의 범위가 되도록 희석 황산 또는 희석 가성소다로 조정했다. 이 액을 액온이 45∼50℃를 유지하도록 보온하면서, 또한 pH가 4.5∼5.3의 범위를 유지하도록 희석 황산, 희석 가성소다를 첨가해서 24시간 효소와 셀룰로오스 전처리물 3을 반응시켰다(이하 반응 후의 액을 효소 당화 슬러리액이라고 함).
(비교예 1) 프레스 여과에 의한 고액 분리(1차 가수분해 후의 고액 분리)
참고예 4에서 얻어진 효소 당화 슬러리액 10L를 이용하여 이하의 순서로 프레스 여과를 실시했다. 프레스 여과는 소형 필터프레스 장치(야부타 산교제 필터프레스 MO-4)를 사용했다. 여과포는 폴리에스테르제 직포(야부타 산교제 T2731C)를 사용했다. 효소 당화 슬러리액 10L를 소형 탱크 속에 넣어서 밑에서부터 압축공기로 폭기하면서 액 투입구를 열어서 에어펌프(타이요 인터내셔널제 66053-3EB)로 서서히 여과실 내에 효소 당화 슬러리액을 투입했다. 투입 후 1분간 나온 여과액은 여과액에 탁함이 남아 있기 때문에 소형 탱크 내로 되돌렸다. 서서히 에어펌프의 구동압력을 상승시켜서 여과실 내의 압력을 상승시켜 가서 여과액이 나올 때까지 압입 공정을 행하였다. 이 때의 최대 압입 압력은 0.15MPa이었다. 이상의 압입 공정에 필요로 한 시간은 30분이었다.
이어서, 여과실에 부설되어 있는 다이어프램을 부풀어오르게 해서 압착 공정을 행하였다. 서서히 압착 압력을 상승시켜 가서 0.5MPa까지 상승시키고나서 약 30분간 방치해서 여과액을 회수했다. 이상의 압착 공정에 필요로 한 시간은 40분이었다.
압착 공정 종료 후 다이어프램, 탱크 내의 압력을 개방한 후, 얻어진 고형물을 회수했다. 얻어진 여과액의 총량은 9.0L이었다. 나머지 액 성분에 대해서는 장치 데드볼륨 때문에 손실되었다. 얻어진 여과액, 즉 비교예 1의 1차 당액의 당 농도를 측정한 결과 글루코오스 농도가 35g/L, 크실로오스 농도가 7g/L이었다. 즉, 비교예 1에서의 글루코오스 생산량은 315g, 크실로오스 생산량은 63g이었다(표 11).
(비교예 2) 프레스 여과에 의한 고액 분리(1차 가수분해 후의 고액 분리, 고형물의 세정)
참고예 4에서 얻어진 효소 당화 슬러리액 10L를 이용하여 이하 순서로 프레스 여과를 실시했다. 프레스 여과는 비교예 1과 같은 장치를 사용해서 실시하고, 압입 공정까지 비교예 1과 같은 조건에서 실시했다. 압착 공정은 0.2MPa까지 압착 압력을 상승시켜서 5분 정도 여과액을 회수했다. 이 시점에서 회수할 수 있었던 여과액량은 8L이었다. 얻어진 여과액, 즉 비교예 2의 1차 당액의 당 농도를 측정한 결과 글루코오스 농도가 35g/L, 크실로오스 농도가 7g/L이었다. 따라서, 이 1차 가수분해의 글루코오스 생산량(1차 당액의 당 생산량)은 280g, 크실로오스 생산량이 56g이었다(표 11).
이어서, 프레스 여과실 내에 남은 고형물의 물세정을 이하의 순서로 실시했다. 또한 본 조작은 2차 가수분해는 아니다.
탱크 내에 18℃의 증류수 2.5L를 첨가하고, 압입 압력을 0.2MPa로 해서 여과액이 나오지 않게 될 때까지 압입 공정을 행하였다. 이어서, 여과실에 부설되어 있는 다이어프램을 부풀어오르게 해서 압착 공정을 행하였다. 서서히 압착 압력을 상승시켜 가 0.5MPa까지 상승시키고나서 약 30분간 방치해서 여과액을 회수했다. 이상 압착 공정에 필요로 한 시간은 35분이었다. 압착 공정 종료 후 다이어프램, 탱크 내의 압력을 개방한 후 얻어진 고형물을 회수했다. 얻어진 여과액의 총량은 3.5L이었다. 나머지의 액 성분에 대해서는 장치 데드볼륨 때문에 손실되었다. 얻어진 여과액, 즉 비교예 2의 2차 당액의 당 농도를 측정한 결과 글루코오스 농도가 14g/L, 크실로오스 농도가 3.1g/L이었다. 따라서, 이 때의 글루코오스 생산량은 49g, 크실로오스 생산량이 11g이었다(표 11).
Figure 112012077784044-pct00010
(실시예 6) 프레스 여과실 내에서의 2차 가수분해
참고예 4에서 얻어진 효소 당화 슬러리액 10L를 이용하여 이하 순서로 고액 분리 및 2차 가수분해를 실시했다.
프레스 여과는 비교예 2와 같은 장치 및 조건에서 실시했다. 즉, 회수할 수 있었던 여과액량은 8L이었다. 얻어진 여과액, 즉 실시예 2의 1차 당액의 당 농도를 측정한 결과 글루코오스 농도가 35g/L, 크실로오스 농도가 7g/L이었다. 따라서, 이 시점에서의 글루코오스 생산량은 280g, 크실로오스 생산량이 56g이었다. 이것을 실시예 6의 1차 당액의 당 생산량으로서 표 12에 정리했다.
이어서, 프레스 여과실 내에서의 2차 가수분해를 이하 순서로 실시했다.
압착 공정 중에서 탱크 내에 증류수 2.5L를 첨가했다. 그 후, 탱크를 러버 히터로 증류수 온도가 50℃가 될 때까지 가열했다. 따뜻해진 시점에서 여과실에 슬러리액과 같은 방법으로 이 50℃의 온수를 여과실에 투입했다. 또한, 여기에서 얻어진 여과액은 모두 탱크 내로 되돌려서 순환시키도록 했다. 이 순환 상태를 여과액이 나오기 시작한 단계부터 1시간 행하였다. 또한, 여과액의 온도를 측정한 결과 10분 후에 40℃, 15분 후 이후는 45℃로 일정하게 되었다. 압입 압력은 0.15MPa로 일정하게 했다. 120분 경과 후 여과액측을 탱크로의 순환으로부터 인출로 바꾸고, 압입 압력을 0.2MPa로 해서 여과액이 나오지 않게 될 때까지 압입 공정을 행하였다. 이어서, 여과실에 부설되어 있는 다이어프램을 부풀어오르게 해서 압착 공정을 행하였다. 서서히 압착 압력을 상승시켜 가 0.5MPa까지 상승시키고나서 약 30분간 방치해서 여과액을 회수했다. 이상 압착 공정에 필요로 한 시간은 35분이었다. 압착 공정 종료 후 다이어프램, 탱크 내의 압력을 개방한 후 얻어진 고형물을 회수했다. 얻어진 여과액의 총량은 3.5L이었다. 나머지의 액 성분에 대해서는 장치 데드볼륨 때문에 손실되었다. 얻어진 여과액의 당 농도를 측정한 결과 글루코오스 농도가 28g/L, 크실로오스 농도가 5g/L이었다. 따라서, 이 때의 글루코오스 생산량은 98g, 크실로오스 생산량이 17.5g이었다. 이것을 실시예 6의 2차 가수분해 및 고액 분리에서 얻어진 2차 당액의 당 생산량으로서 표 12에 정리했다.
Figure 112012077784044-pct00011
비교예 1 및 비교예 2의 2차 가수분해를 실시하지 않을 경우와 표 12의 실시예 6을 비교하면, 본 발명의 2차 가수분해를 실시함으로써 당 생산량이 대폭 증대하는 것이 판명되었다.
(실시예 7) 프레스 여과실의 2차 가수분해에서 얻어진 당화 효소의 회수량
실시예 6에서 얻어진 1차 당액(6mL) 및 2차 당액(6mL)을 혼합하고, 이 당액으로부터 당화 효소의 회수를 행하였다. 또한 비교를 위해서, 비교예 2에서 얻어진 1차 당액(6mL) 및 고형물 세정액(6mL)을 혼합하고, 이 당액으로부터 당화 효소의 회수도 행하였다. 당액을 분획 분자량 10000의 한외여과막(Sartorius stedim biotech사제, VIVASPIN 20, 재질: PES)으로 여과하고, 막 획분이 1mL가 될 때까지 4500G에서 원심했다. 증류수 10mL를 막 획분에 첨가하고, 다시 막 획분이 1mL가 될 때까지 4500G에서 원심했다. 이 후, 막 획분으로부터 효소를 회수했다. 회수한 효소의 단백질 농도는 BCA 측정 키트(BCA Protein Assay Regent kit, 피아스사)를 사용해서 행하고, 소알부민(2mg/mL)을 표품으로 해서 562㎚의 흡광도를 측정하고, 비색정량을 행하였다. 회수할 수 있었던 효소 농도(mg/mL)를 막 획분의 용액량 1mL로 곱해서 회수할 수 있었던 당화 효소량을 산출했다. 그 결과, 표 13에 보여지는 바와 같이, 비교예 2의 당액으로부터 회수한 효소량에 대하여 실시예 6에서는 온수의 통수에 의한 효과에 의해 당화 효소의 회수량이 증대하는 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112012077784044-pct00012
(실시예 8) 당화 효소의 회수 및 재이용
비교예 2 및 실시예 6에서 얻어진 1차 당액(8L), 및 2차 당액(3.5L)을 각각 혼합하고, 이 각 혼합 용액 11.5L로부터 당화 효소의 회수를 행하였다. 당화 효소의 회수는 분획 분자량 10000의 한외여과막(GE제 SEPA PW 시리즈, 기능면 재질: 폴리에테르술폰)의 평막을 세팅한 소형 평막 여과장치[GE제 Sepa(등록상표）CF II Med/High Foulant System]를 사용해서 실시했다. 원수측 유속 2.5L/분, 막 플럭스가 0.1m/D로 일정해지도록 조작 압력을 제어하면서 11.5L 중 11L를 여과했다. 그 때문에 원수측에는 0.5L의 당화 효소를 회수했다. 이어서, 얻어진 0.5L의 회수 효소를 셀룰로오스 전처리물 3(1kg)에 첨가하고, 증류수를 더 첨가하여 총 중량이 10kg이 되도록 조정했다. 또한, 본 조성물의 pH가 4.5∼5.3의 범위가 되도록 희석 황산 또는 희석 가성소다로 조정했다. 이 액을 액온이 45∼50℃를 유지하도록 보온하면서, 또한 pH가 4.5∼5.3의 범위를 유지하도록 희석 황산, 희석 가성소다를 첨가해서 24시간 효소와 셀룰로오스 전처리물 3을 반응시켰다. 그 결과, 표 14에 보여지는 바와 같이 비교예 2의 당액(1차·2차)으로부터의 회수 효소를 사용한 당 생성량보다 실시예 6의 당액(1차·2차)으로부터의 회수 효소를 사용한 당 생성량 쪽이 많은 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112012077784044-pct00013
(실시예 9) 1차 당액 및 2차 당액의 역침투막(RO막)에 의한 농축
실시예 6의 1차 당액 및 2차 당액 각 1L의 역침투막(RO막)에 의한 농축을 행하였다. 우선, 1차 당액 및 2차 당액을 세공 지름 0.45㎛의 정밀여과막에 의한 사전 여과를 행하였다. 얻어진 각 막 처리액 1L를 사용해서 RO막 농축을 실시했다. RO막은 가교 전방향족계 역침투막 "UTC80"(도레이 카부시키가이샤제)을 사용하고, 이 RO막을 소형 평막 여과장치[GE제 Sepa(등록상표）CF II Med/High Foulant System]에 셋팅하여 원수 온도를 25℃, 고압 펌프의 압력을 3MPa로 여과 처리를 행하였다. 이 처리에 의해 0.7L의 투과액을 얻었다. 이 때의 글루코오스 및 크실로오스 농도는 표 15에 나타내는 바와 같으며, 본 발명의 1차 당액 및 2차 당액은 RO막에 의한 농축에 의해 당 농도를 높일 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112012077784044-pct00014
(실시예 10) 1차 당액 및 2차 당액의 나노여과막(NF막)에 의한 농축
실시예 8의 1차 당액 및 2차 당액 각 1L의 나노여과막(NF막)에 의한 농축을 행하였다.
우선, 1차 당액 및 2차 당액을 세공 지름 0.45㎛의 정밀여과막에 의한 사전여과를 행하였다. 얻어진 각 막 처리액 1L를 사용해서 NF막 농축을 실시했다. NF막은 가교 피페라진 폴리아미드계 나노여과막 "UTC60"(도레이 카부시키가이샤제)을 사용하고, 이 NF막을 소형 평막 여과장치[GE제 Sepa(등록상표）CF II Med/High Foulant System]에 셋팅하여 원수 온도를 25℃, 고압 펌프의 압력을 3MPa로 여과 처리를 행하였다. 이 처리에 의해 0.7L의 투과액을 얻었다. 이 때의 글루코오스 및 크실로오스 농도는 표 16에 나타내는 바와 같으며, 본 발명의 1차 당액 및 2차 당액은 NF막에 의한 농축에 의해 당 농도를 높일 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112012077784044-pct00015
(비교예 3) 원심분리에 의한 고액 분리(1차 가수분해 후의 고액 분리)
실시예 7에서 얻어진 효소 당화 슬러리액 10L를 이용하여 이하의 순서로 원심분리를 실시했다.
500mL 원침관(遠沈管) 25개에 효소 당화 슬러리 400mL를 투입하고, 3000G에서 10분 원심분리했다. 각 원침관으로부터 240mL의 상청을 회수할 수 있고, 이것을 25개분, 즉 합계 6L 회수할 수 있었다. 각 원침관에 있어서 나머지 160mL(합계 4L)는 원침관의 고형물로서 회수했다. 얻어진 여과액, 즉 실시예 8의 1차 당액의 당 농도를 측정한 결과 글루코오스 농도가 35g/L, 크실로오스가 7g/L이었다. 따라서, 이 고액 분리로서 원심분리를 행해 얻어지는 당은 글루코오스 생산량(1차 당액의 당 생산량)은 210g, 크실로오스 생산량이 42g이었다(표 17).
(비교예 4) 원심분리에 의한 고액 분리(1차 가수분해 후의 고액 분리, 고형물의 세정)
실시예 7에서 얻어진 효소 당화 슬러리액 10L를 이용하여 이하의 순서로 원심분리를 실시했다.
500mL 원침관 25개에 효소 당화 슬러리 400mL를 투입하고, 비교예 3에 기재된 방법과 마찬가지로 원심분리하여 합계 6L 회수할 수 있었다.
각 원침관에 있어서 나머지 160mL(합계 4L)는 원침관의 고형물로서 회수했다. 얻어진 여과액, 즉 실시예 8의 1차 당액의 당 농도를 측정한 결과 글루코오스 농도가 35g/L, 크실로오스가 7g/L이었다. 따라서, 이 고액 분리로서 원심분리를 행해 얻어지는 당은 글루코오스 생산량(1차 당액의 당 생산량)은 210g, 크실로오스 생산량이 42g이었다(표 17).
이어서, 남은 고형물의 물세정을 이하의 순서로 실시했다. 본 조작은 2차 가수분해는 아니다.
상기 원심분리에서 회수한 고형물에 물을 첨가하고, 다시 원심분리에 의해 고액 분리를 행해 당액을 회수했다. 원침관 25개에 남은 각 침전 성분 160mL에 대하여 100mL의 증류수를 가수했다. 이 때 증류수의 온도는 18℃이었다. 가수 후, 원침관을 가볍게 회전 혼화한 후에 다시 3000G에서 10분 원심분리했다. 원심분리 후 각 원침관으로부터 150mL의 상청을 회수할 수 있고, 25개분, 즉 합계 3.75L 회수할 수 있었다. 얻어진 상청, 즉 비교예 4의 2차 당액의 당 농도를 측정한 결과 글루코오스 농도가 21g/L, 크실로오스 농도가 4g/L이었다. 따라서, 이 때의 글루코오스 생산량은 79g, 크실로오스 생산량이 15g이었다(표 17).
Figure 112012077784044-pct00016
(실시예 11) 원심분리에 의한 고액 분리(1차 가수분해 및 2차 가수분해)
참고예 4에서 얻어진 효소 당화 슬러리액 10L를 이용하여 이하의 순서로 원심분리를 실시했다.
500mL 원침관 25개에 효소 당화 슬러리 400mL를 투입하고, 비교예 3에 기재된 방법과 마찬가지로 원심분리하여 합계 6L 회수할 수 있었다.
이어서, 남은 고형물에 대하여 이하의 순서로 2차 가수분해를 실시했다. 500mL 원침관 25개에 효소 당화 슬러리 400mL를 투입하고, 3000G에서 10분 원심분리했다. 원심분리 후 각 원침관으로부터 240mL의 상청을 회수할 수 있고, 이것을 25개분, 즉 합계 6L 회수할 수 있었다. 각 원침관에 있어서 나머지 160mL(합계 4L)는 원침관의 침전 성분으로서 회수했다. 얻어진 여과액, 즉 실시예 11의 1차 당액의 당 농도를 측정한 결과 글루코오스 농도가 35g/L, 크실로오스가 7g/L이었다. 따라서, 이 고액 분리로서 원심분리를 행해 얻어지는 당은 글루코오스 생산량(1차 당액의 당 생산량)은 210g, 크실로오스 생산량이 42g이었다. 이것을 1차 가수분해의 경우의 당 생산량(1차 당액의 당 생산량)으로서 표 17에 정리했다.
이어서, 상기 원심분리에서 회수한 침전 성분에 물을 첨가하고, 다시 원심분리에 의해 고액 분리를 행해 당액을 회수했다. 원침관 25개에 남은 각 침전 성분 160mL에 대하여 미리 50℃로 보온해 둔 100mL의 증류수를 가수했다. 가수 후 원침관을 가볍게 회전 혼화한 후, 50℃로 설정한 항온조 내에서 1시간 방치했다. 방치 후 원침관을 가볍게 회전 혼화한 후, 다시 3000G에서 10분 원심분리했다. 원심분리 후 각 원침관으로부터 150mL의 상청을 회수할 수 있고, 25개분, 즉 합계 3.75L 회수할 수 있었다. 얻어진 상청, 즉 실시예 11의 2차 당액의 당 농도를 측정한 결과 글루코오스 농도가 29g/L, 크실로오스 농도가 5g/L이었다. 따라서, 이 때의 글루코오스 생산량은 109g, 크실로오스 생산량이 19g이었다(표 18).
Figure 112012077784044-pct00017
표 17의 비교예 3 및 비교예 4의 2차 가수분해를 실시하지 않을 경우와 표 18의 실시예 11을 비교하면, 본 발명의 2차 가수분해를 실시함으로써 당 생산량이 대폭 증대하는 것이 판명되었다. 단, 실시예 11과 고액 분리를 프레스 여과에 의해 실시한 실시예 6에 비교하면, 고액 분리를 원심분리에 의해 실시한 경우에는 당 생산량이 낮은 것이 표 12와 표 18의 비교에 의해 판명되었다. 이것은 고액 분리에 의한 당 회수 효율이 원심분리보다 프레스 여과 쪽이 높은 것이 주된 요인이다.
(실시예 12) 2차 가수분해에 있어서의 회수 효소의 셀룰라아제 분해활성
실시예 1(셀룰로오스 전처리물 3, 50℃), 실시예 2(셀룰로오스 전처리물 3, 25℃) 및 실시예 5(셀룰로오스 전처리물 3, 플루로닉 F-68: 0.1%, 0.25%, 0.5%, 1%, 2%)의 조건에서 2차 가수분해를 행하고, 회수한 회수 효소의 셀룰라아제 활성을 참고예 4의 방법으로 측정했다. 활성값은 실시예 1(50℃)의 조건으로 회수한 효소활성을 기준(활성=1)으로 해서 상대값으로 표 19에 정리했다. 크실란 분해활성에 관해서는 검출할 수 없는 조건도 존재하고, 이것들을 ND(not detected)로 표기했다. 또한, 기준인 실시예 1에 관해서도 크실란 분해활성은 ND이었기 때문에 실시예 5의 플루로닉 F-68, 0.5%일 때의 크실란 분해활성을 1로 해서 상대활성을 적었다.
Figure 112012077784044-pct00018
25℃ 조건에 있어서의 회수 효소(실시예 2)의 모든 셀룰라아제 활성은 없고, 한편으로 50℃, 더욱이는 50℃이고 비이온성 계면활성제(플루로닉 F-68)을 포함하는 조건(실시예 5)의 회수 효소인 쪽이 셀룰라아제 활성 전반이 우수하다고 하는 결과를 얻었다.
(비교예 5) 양이온성 및 음이온성 계면활성제의 효소 회수에의 첨가 효소
2차 가수분해에 첨가하는 화합물로서 음이온 계면활성제로서 라우릴 황산나트륨(SDS), 양이온성 계면활성제로서 염화벤잘코늄 1%를 사용했다. 실시예 1(셀룰로오스 전처리물 3)에 있어서 상술의 계면활성제를 최종 농도 1%가 되도록 첨가해 2차 가수분해를 실시했다. 실시예 1과 같은 순서로 회수 효소를 취득하고, 회수 효소의 셀룰라아제 활성을 측정했지만, 어느 조건에 있어서도 활성을 검출할 수 없었다. 따라서, 회수 효소의 활성을 유지한 채 회수하기 위해서는 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제는 사용할 수 없는 것을 확인할 수 있었다.
(실시예 13) 2차 가수분해에 있어서의 무기염의 종류와 회수 효소활성의 관계
2차 가수분해에 첨가하는 화합물로서 각종 무기염(염화나트륨, 아세트산나트륨, 황산나트륨, 황산수소나트륨, 인산2수소나트륨, 인산수소나트륨, 염화칼륨, 황산암모늄, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 염화칼슘)을 사용했다. 실시예 1(셀룰로오스 전처리물 3)에 있어서 상술의 각 무기염을 최종 농도 1%가 되도록 첨가해 2차 가수분해를 실시했다. 첨가 후의 pH는 5.5∼6.0의 범위가 되도록 수산화나트륨 또는 염산으로 조정했다. 무기염의 첨가 이외는 실시예 1과 같은 조건(50℃, 1시간)에서 실시했다. 활성값은 실시예 1(셀룰로오스 전처리물 3, 50℃)의 조건에서 회수한 효소활성을 기준(활성=1)으로 해서 상대값으로 표 20에 정리했다. 크실란 분해활성에 관해서는 검출할 수 없는 조건도 존재하고, 이것들을 ND(not detected)로 표기했다. 또한, 기준인 실시예 1에 관해서도 크실란 분해활성은 ND이었기 때문에 실시예 5의 인산수소2칼륨일 때의 크실란 분해활성을 1로 해서 상대활성을 적었다.
Figure 112012077784044-pct00019
그 결과, 표 20에 보여지는 바와 같이 무기염을 첨가하지 않을 경우에 비하여 무기염을 첨가한 쪽이 회수 효소량은 증가하는 경향이 있는 것이 판명되었다. 단, 칼슘계의 무기염인 염화칼슘에서는 회수 효소활성이 거의 없은 것이 판명되었다. 또한, 같은 칼슘염인 황산칼슘, 탄산수소칼슘도 마찬가지로 검토했지만, 이들 칼슘염의 수 용해성이 낮아 소정 농도(최종 농도 1%)까지 용해할 수 없어 실시할 수 없었다. 따라서, 무기염 중에서도 칼슘계의 무기염은 본 발명의 2차 가수분해에 첨가하는 화합물로서는 부적합한 것이 판명되었다.
(실시예 14) 2차 가수분해에 있어서의 무기염의 첨가 농도의 영향
무기염의 첨가 농도에 의한 영향에 관해서 나트륨염인 염화나트륨을 사용해서 확인했다. 실시예 13과 같은 순서로 염화나트륨 농도를 0%, 0.1%, 0.5%, 1%, 5%로 2차 가수분해를 행하고, 회수한 회수 효소의 셀룰라아제 분해활성을 참고예 4에 준해서 측정했다. 활성값은 실시예 1(50℃)의 조건에서 회수한 효소활성을 기준(활성=1)으로 해서 상대값으로 표 21에 정리했다. 크실란 분해활성에 관해서는 검출할 수 없는 조건도 존재하고, 이것들을 ND(not detected)로 표기했다. 또한, 기준인 실시예 1에 관해서도 크실란 분해활성은 ND이었기 때문에 염화나트륨 0.5%일 때의 크실란 분해활성을 1로 해서 상대활성을 적었다.
Figure 112012077784044-pct00020
표 21에 나타낸 바와 같이 무기염으로서의 염화나트륨을 0.1% 첨가하는 것만으로 회수 효소의 아비셀 분해활성이 향상되고, 또한 0.5% 이상 첨가에 의해 모든 분해활성에 관하여 미첨가시에 비해서 크게 향상되는 것이 판명되었다.
(실시예 15) 무기염 첨가와 2차 가수분해 온도의 관계
염화나트륨 1%의 조건에 있어서 2차 가수분해의 온도를, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃의 각 온도로 설정하고, 회수 효소의 활성을 측정했다. 활성값은 실시예 1(셀룰로오스 전처리물 3, 50℃)의 조건에서 회수한 효소활성을 기준(활성=1)으로 해서 상대값으로 표 22에 정리했다. 크실란 분해활성에 관해서는 검출할 수 없는 조건도 존재하고, 이것들을 ND(not detected)로 표기했다. 또한, 기준인 실시예 1에 관해서도 크실란 분해활성은 ND이었기 때문에 염화나트륨 1%, 60℃일 때의 크실란 분해활성을 1로 해서 상대활성을 적었다.
Figure 112012077784044-pct00021
표 22에 나타낸 바와 같이 염화나트륨 존재 하에서는 특히 아비셀 분해활성에 관해서 온도가 50℃에 가까워질수록 회수 효소활성이 증대하는 경향이 있지만, 60℃에서는 오히려 활성이 감소하는 것이 판명되었다. CMC 분해활성, 셀로비오스 분해활성에 관해서는 온도 의존적인 회수량의 증가는 확인할 수 없고, 60℃를 초과해도 분해활성은 저하하지 않았다. 크실란 분해활성에 관해서는 30℃∼50℃까지는 회수 효소의 분해활성이 증대하지만, 60℃가 되면 격감하는 것이 판명되었다.
(실시예 16) 2차 가수분해에 있어서의 무기염으로서의 해수 이용
실시예 13∼15에 있어서 무기염의 첨가에 의해 회수 효소량 및 활성이 증대하는 것을 확인할 수 있었다. 그래서, 무기염을 포함하는 수용액으로서 「해수」로 대체할 수 있는지 검토했다. 해수는 가나가와현 미사키 어항 부근에서 채취한 해수(pH8.3, 고형물 용해량 3.2%)를 사용했다. 또한 해수의 pH 조정에는 황산을 사용하고, pH6.5(해수 1L당 황산 24mg 첨가), pH5.0(해수 1L당 황산 50mg 첨가), pH3.8(해수 1L당 황산 100mg 첨가)으로 조정했다. 2차 가수분해에 있어서의 해수 첨가량은 최종 농도 50%(희석율 1/2)가 되도록 고형물에 첨가하고, 50℃에서 1시간 2차 가수분해를 행하였다. 회수할 수 있었던 효소활성을 표 23에 나타낸다. 활성값은 실시예 1(셀룰로오스, 전처리물 3, 50℃)의 조건에서 회수한 효소활성을 기준(활성=1)으로 해서 상대값으로 표 23에 정리했다. 크실란 분해활성에 관해서는 검출할 수 없는 조건도 존재하고, 이것들을 ND(not detected)로 표기했다. 또한, 기준인 실시예 1(셀룰로오스, 전처리물 3, 50℃)에 관해서 크실란 분해활성은 ND이었기 때문에 이 해수 pH3.8일 때의 크실란 분해활성을 1로 해서 상대활성을 적었다.
Figure 112012077784044-pct00022
표 23에 나타낸 바와 같이 무기염으로서 해수를 사용했을 경우에 있어서도 회수 효소의 셀룰라아제 활성이 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 염화나트륨 등 시약 무기염을 사용했을 때의 각 분해활성과 같은 경향을 나타내는 것이 판명되었다. 단, pH3.8에서는 아비셀 분해활성이 기타 pH 조건에 비하여 저하되는 것을 알 수 있었다.
(실시예 17) 해수 첨가와 2차 가수분해 온도의 관계
해수 중에서도 첨가 효과가 가장 뛰어난 해수 pH5.0의 조건에 있어서 2차 가수분해의 온도를 30℃, 40℃, 50℃, 60℃의 각 온도로 설정하고, 회수 효소의 활성을 측정했다. 활성값은 실시예 1(셀룰로오스 전처리물 3, 50℃)의 조건에서 회수한 효소활성을 기준(활성=1)으로 해서 상대값으로 표 24에 정리했다. 크실란 분해활성에 관해서는 검출할 수 없는 조건도 존재하고, 이것들을 ND(not detected)로 표기했다. 또한, 기준인 실시예 1(셀룰로오스, 전처리물 3, 50℃)에 관해서 크실란 분해활성은 ND이었기 때문에 이 해수 온도 60℃일 때의 크실란 분해활성을 1로 해서 상대활성을 적었다.
Figure 112012077784044-pct00023
표 24에 나타낸 바와 같이 해수 존재 하에서는 특히 아비셀 분해활성에 관해서 온도가 50℃에 가까워질수록 활성이 증대하는 경향이 있고, 60℃에서는 오히려 활성이 감소하는 것이 판명되었다. CMC 분해활성, 셀로비오스 분해활성에 관해서는 온도 의존적인 회수량의 증가는 확인할 수 없고, 60℃를 초과해도 분해활성은 저하하지 않았다. 크실란 분해활성에 관해서는 30℃∼50℃까지는 회수 효소의 분해활성이 증대하지만, 60℃가 되면 격감하는 것이 판명되었다. 이러한 경향은 실시예 15의 염화나트륨에서 얻어진 경향과 유사한 것이었다.
(실시예 18) 2차 가수분해에 있어서의 아미노산의 첨가량과 회수 효소량의 관계
2차 가수분해에 첨가하는 화합물로서 각종 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린)을 사용했다. 실시예 1(셀룰로오스 전처리물 3, 50℃)에 있어서 상술의 각 아미노산을 최종 농도 1%가 되도록 첨가해 2차 가수분해를 실시했다. 또한, 아스파라긴산, 티로신은 소정 농도까지 용해할 수 없어 최종 농도 1%로 조정할 수 없었다. 첨가 후의 pH는 5.5∼6.5의 범위가 되도록 염산 및/또는 수산화나트륨으로 조정했다. 아미노산의 첨가 이외에는 실시예 1과 같은 방법으로 실시했다. 활성값은 실시예 1(셀룰로오스, 전처리물 3, 50℃)의 조건에서 회수한 효소활성을 기준(활성=1)으로 해서 상대값으로 표 25에 정리했다. 크실란 분해활성에 관해서는 검출할 수 없는 조건도 존재하고, 이것들을 ND(not detected)로 표기했다. 또한, 기준인 실시예 1(셀룰로오스, 전처리물 3, 50℃)에 관해서 크실란 분해활성은 ND이었기 때문에 활성이 검출된 리신에서의 크실란 분해활성을 1로 해서 히스티딘의 상대활성을 적었다.
Figure 112012077784044-pct00024
그 결과, 표 25에 나타내는 바와 같이 아미노산을 첨가하지 않을 경우에 비하여 각종 아미노산을 첨가한 쪽이 회수 효소량은 증가하는 경향이 있는 것이 판명되었다. 또한, 아미노산 중에서도, 특히 글루탐산, 리신, 히스티딘, 아르기닌, 시스테인을 첨가함으로써 회수 효소활성을 증대시킬 수 있는 것이 판명되었다. 특히, 아비셀 분해활성에 관해서 시스테인의 첨가 효과가 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 리신, 히스티딘에 관해서는 특히 크실란 분해활성의 향상을 확인할 수 있었다.
(실시예 19) 아미노산 첨가와 2차 가수분해 온도의 관계
2차 가수분해에 첨가하는 화합물로서 아미노산 중에서도 첨가 효과가 가장 뛰어난 시스테인 1%의 조건에 있어서, 2차 가수분해의 온도를 30℃, 40℃, 50℃, 60℃의 각 온도로 설정하여 회수 효소의 활성을 측정했다. 활성값은 실시예 1(셀룰로오스 전처리물 3, 50℃)의 조건에서 회수한 효소활성을 기준(활성=1)으로 해서 상대값으로 표 26에 정리했다. 크실란 분해활성에 관해서는 어느 조건에서도 검출할 수 없고, ND(not detected)로 표기했다.
Figure 112012077784044-pct00025
표 26에 나타낸 바와 같이 시스테인 존재 하에서는, 특히 아비셀 분해활성에 관해서 온도가 50℃에 가까워질수록 활성이 증대하는 경향이 있고, 60℃에서는 오히려 활성이 감소하는 것이 판명되었다. CMC 분해활성, 셀로비오스 분해활성에 관해서는 온도 의존적인 회수량의 증가는 확인할 수 없고, 60℃를 초과해도 분해활성은 저하하지 않았다. 크실란 분해활성에 관해서는 어느 온도에 있어서도 활성을 확인할 수 없었다.
(실시예 20) 2차 가수분해에 있어서의 친수성 유기용매의 첨가량과 회수 효소활성의 관계
2차 가수분해에 첨가하는 화합물로서 친수성 유기용매(메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 이소프로판올, 디메틸술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, 아세톤, 아세토니트릴, 에틸렌글리콜, 글리세린)를 사용했다. 실시예 1(셀룰로오스 전처리물 3, 50℃)에 있어서 상술의 친수성 유기용매를 최종 농도 1%가 되도록 첨가해 2차 가수분해를 실시했다. 친수성 유기용매의 첨가 이외에는 실시예 1과 같은 방법으로 실시했다. 활성값은 실시예 1(셀룰로오스 전처리물 3, 50℃)의 조건에서 회수한 효소활성을 기준(활성=1)으로 해서 상대값으로 표 27에 정리했다. 크실란 분해활성에 관해서는 어느 조건에서도 검출할 수 없고, ND(not detected)로 표기했다.
Figure 112012077784044-pct00026
그 결과, 표 27에 보여지는 바와 같이 친수성 유기용매를 첨가함으로써 회수 효소활성, 특히 아비셀 분해활성을 증대시킬 수 있는 것이 판명되었다.
(비교예 6) 2차 가수분해에 있어서의 소수성 유기용매의 첨가에 의한 효과
2차 가수분해에 첨가하는 화합물로서 n-헥산, 1-부탄올, 1-펜타놀을 실시예 19와 같은 순서로 실시했지만, 소수성 유기용매가 수상과 분리되어 버려 한외여과막에 의한 회수가 곤란했다. 효소 회수 여하에 관계없이 소수성 유기용매에서는 조작성의 나쁨을 이유로 해서 2차 가수분해에 첨가하는 화합물로서는 부적합한 것이 판명되었다.
(실시예 21) 친수성 유기용매 첨가와 2차 가수분해 온도의 관계
2차 가수분해에 첨가하는 화합물로서 실시예 20에 사용한 친수성 유기용매의 하나인 에탄올 1%의 조건에 있어서 2차 가수분해의 온도를 30℃, 40℃, 50℃(실시예 20과 같음), 60℃의 각 온도로 설정하고, 회수 효소의 활성을 측정했다. 활성값은 실시예 1(셀룰로오스 전처리물 3, 50℃)의 조건에서 회수한 효소활성을 기준(활성=1)으로 해서 상대값으로 표 28에 정리했다. 크실란 분해활성에 관해서는 어느 조건에서도 검출할 수 없고, ND(not detected)로 표기했다.
Figure 112012077784044-pct00027
에탄올 존재 하에서는 특히 아비셀 분해활성에 관해서 온도가 50℃에 가까워질수록 활성이 증대하는 경향이 있고, 60℃에서는 오히려 활성이 감소하는 것이 판명되었다. CMC 분해활성, 셀로비오스 분해활성에 관해서는 온도 의존적인 회수량의 증가는 확인할 수 없고, 60℃를 초과해도 분해활성은 저하하지 않았다. 크실란 분해활성에 관해서는 어느 온도에서도 활성을 검출할 수 없었다.
(비교예 7) 2차 가수분해에 있어서의 수용성 고분자의 첨가에 의한 효과
2차 가수분해에 첨가하는 화합물로서 각종 수용성 고분자를 사용했다. 수용성 고분자는 폴리알릴아민-HCl-3S(PAA-3S, 닛토보우), 폴리알릴아민-HCl-10S(PAA-10S, 닛토보우), 폴리에틸렌글리콜 #4000(PEG #4000, 나카라이테스크), 폴리에틸렌글리콜 #6000(PEG #6000, 나카라이테스크), 폴리에틸렌글리콜 #20,000(PEG #20,000, 와코쥰야쿠), 폴리비닐알콜 500(PVA, 와코쥰야쿠), 폴리비닐피롤리돈(PVP, 시그마알드리치)을 사용했다. 실시예 1(셀룰로오스, 전처리물 3, 50℃)에 있어서 상술의 수용성 고분자를 최종 농도 1%가 되도록 첨가해 2차 가수분해를 실시했다. 또한, 첨가 후의 pH는 5.5∼6.5의 범위가 되도록 염산 및/또는 수산화나트륨으로 조정했다. 수용성 고분자의 첨가 이외에는 실시예 1와 같은 방법으로 실시했다. 활성값은 실시예 1(셀룰로오스, 전처리물 3, 50℃)(50℃)의 조건에서 회수한 효소활성을 기준(활성=1)으로 해서 상대값으로 표 29에 정리했다. 크실란 분해활성에 관해서는 검출할 수 없는 조건도 존재하고, 이것들을 ND(not detected)로 표기했다.
Figure 112012077784044-pct00028
수용성 고분자 존재 하에서는 모든 분해활성에 관해서 첨가에 의한 회수 효소의 활성 증대는 확인되지 않았다.
(산업상의 이용 가능성)
본 발명에서 얻어지는 당액은 여러가지 발효산물의 당 원료로서 사용할 수 있다.
1 : 보온설비 2 : 교반 탱크
3 : 셀룰로오스 공급구 4 : 교반장치
5 : 물공급 라인 6 : 온수 공급조
7 : 온수 공급조 보온설비 8 : 프레스 여과장치
9 : 컴프레서 10 : 순환 라인
11 : 여과액 회수 탱크 12 : 한외여과막 장치
13 : 당화 효소 회수 라인 14 : 가수분해물 투입구
15 : 온수 통수구 16 : 외측 프레임
17 : 여과포 18 : 고형물(1차 가수분해물)
19 : 압판 20 : 프레스 여과실 내
21 : 가수분해물 투입구겸 온수 통수구
22 : 당 용액 탱크
23 : 나노여과막 장치 또는 역침투막 장치
24 : 여과액 라인 25 : 고액 분리장치
26 : 고형물 이송수단 27 : 보온설비 2(2차 가수분해조)
28 : 2차 가수분해조 29 : 교반장치 2(2차 가수분해조)
30 : 고액 분리장치 2(2차 가수분해물)
31 : 2차 당액 탱크 32 : 2차 당액 회수 탱크
33 : 2차 당액 한외여과막 장치 34 : 2차 당액 이송 라인
35 : 2차 가수분해물 이송 라인 36 : 정밀여과막 장치
37 : 정밀여과막 원수 탱크 38 : 정밀여과막
39 : 압공 공급장치 40 : 역세정 펌프
41 : 정밀여과액 회수조

Claims (13)

  1. 당화 효소로서 사상균 유래 셀룰라아제를 사용해서 셀룰로오스를 가수분해하는 것에 의한 당액의 제조방법으로서,
    상기 셀룰로오스에 상기 당화 효소를 첨가하여 1차 가수분해한 후 그 1차 가수분해물을 1차 당액과 고형물로 고액 분리하는 공정,
    상기 고형물에 물을 첨가하여 2차 가수분해한 후 그 2차 가수분해물을 2차 당액과 잔사로 고액 분리하는 공정(단, 2차 가수분해에 있어서 새로운 셀룰로오스를 첨가하지 않는다), 및
    상기 1차 당액 및/또는 상기 2차 당액을 한외여과막에 통과시켜서 여과하여 비투과측으로부터 당화 효소를 회수하고, 투과측으로부터 당액을 회수하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 사상균 유래 셀룰라아제는 트리코데르마 유래 셀룰라아제인 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 셀룰로오스는 바이오매스를 암모니아 처리, 수열 처리 또는 희황산 처리한 처리물 유래인 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 2차 가수분해는 무기염(칼슘염을 제외함), 친수성 유기용매, 아미노산, 비이온성 계면활성제 및 그것들을 함유하는 당액으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 존재 하에서의 가수분해인 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 무기염(칼슘염을 제외함)은 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 황산염, 암모늄염, 염산염, 인산염, 아세트산염, 및 질산염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 무기염(칼슘염을 제외함)은 염화나트륨, 아세트산나트륨, 황산나트륨, 황산수소나트륨, 인산2수소나트륨, 인산수소나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄, 인산수소2칼륨, 황산암모늄, 염화마그네슘, 황산마그네슘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
  7. 제 4 항에 있어서,
    상기 친수성 유기용매는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 이소프로판올, N,N-디메틸포름아미드, 부탄올, 아세톤, 아세토니트릴, 에틸렌글리콜 및 글리세린으로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
  8. 제 4 항에 있어서,
    상기 아미노산은 아르기닌, 시스테인, 글루탐산, 히스티딘 및 리신으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 1차 가수분해물 또는 상기 2차 가수분해물의 고액 분리는 프레스 여과인 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    당액을 역침투막 및/또는 나노여과막에 통과시켜서 여과하여 당액을 농축하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 당액의 제조방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
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