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KR101705102B1 - Ｗｄｒｐｕｈ 에피토프 펩티드 및 이를 포함하는 백신 - Google Patents

Ｗｄｒｐｕｈ 에피토프 펩티드 및 이를 포함하는 백신 Download PDF

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KR101705102B1
KR101705102B1 KR1020117014316A KR20117014316A KR101705102B1 KR 101705102 B1 KR101705102 B1 KR 101705102B1 KR 1020117014316 A KR1020117014316 A KR 1020117014316A KR 20117014316 A KR20117014316 A KR 20117014316A KR 101705102 B1 KR101705102 B1 KR 101705102B1
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wdrpuh
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peptides
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타쿠야 츠노다
류지 오사와
사치코 요시무라
토모히사 와타나베
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온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 및 61의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 뿐만 아니라 상기 언급된 아미노산 서열에서 1, 2, 또는 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가되나 세포독성 T 세포 유도성을 여전히 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 이런 펩티드들을 포함한, 종양 치료 또는 예방용 약제를 제공한다. 또한, 본 발명의 펩티드는 백신으로서 사용될 수 있다.

Description

ＷＤＲＰＵＨ 에피토프 펩티드 및 이를 포함하는 백신{WDRPUH EPITOPE PEPTIDES AND VACCINES CONTAINING THE SAME}
본 발명은 그 전체의 내용이 본 명세서에 참조로서 통합되는, 2008년 12월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 제 61/200,962호와 2009년 3월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 제 61/209,704호에 기반한다.
본 발명은 생명과학 분야에 관한 것이며, 보다 구체적으로 암 치료 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 암 백신, 및 종양 예방 및 치료를 위한 약물로써 매우 효과적인 신규한 펩티드에 관한 것이다.
CD8 양성 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)는 주조직적합성 복합체(MHC, major histocompatibility complex) 클래스 I 분자에서 발견되는 종양 관련 항원(TAA)으로부터 유래한 에피토프(epitope) 펩티드를 인식한 후, 상기 종양 세포를 사멸시킨다는 것이 입증되었다. TAA의 첫 번째 예로서, 멜라노마 항원(MAGE) 패밀리가 발견된 후, 주로 면역학적인 접근을 통해 많은 다른 TAA가 발견되었다(Boon T, Int J 암 1993 May 8, 54(2): 177-80; Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). 몇몇의 이러한 TAA들은 현재 면역치료 표적으로서, 임상 개발이 진행중이다.
강력하고, 특이적인 항종양 면역 작용을 유도할 수 있는 신규한 TAA의 동정은 다양한 암 종류를 위한 펩티드 백신 전략의 임상 활용 및 개발을 추가로 보장한다(Harris CC, J Natl 암 Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; Butterfield LH et al., 암 Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; Vissers JL et al., 암 Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; Tanaka F et al., 암 Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; Fujie T et al., Int J 암 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; Kikuchi M et al., Int J 암 1999 May 5, 81(3): 459-66; Oiso M et al., Int J 암 1999 May 5, 81(3): 387-94). 현재까지, 이러한 종양 관련 항원 유래 펩티드를 이용한 임상 시험에 관한 다수의 보고가 있었다. 불행히도, 매우 낮은 객관적 반응률이 현재까지 이러한 암 백신 시험에서 관찰되었다(Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).
TAA의 사용이 결실, 변형에 기인하는 암세포의 면역탈출(immune escape)의 잘 알려진 위험 또는 면역선택(immune selection)에 의한 치료적인 결과로서 TAA의 하향조절을 최소화할 수 있기 때문에, 암세포의 증식과 생존에 필수적인 TAA는 면역치료의 표적으로서 적합하다.
23,040 유전자를 포함하는 게놈 와이드 cDNA 마이크로어레이(cDNA microarray)를 이용한 유전자 발현 프로파일을 통해서 WDRPUH는 간세포암에서 상향조절되는 새로운 WD 반복(repeat) 단백질로서 동정했다.(Silva et al., Neoplasia 2005 Apr;7(4):348-55, WO 2003/104276). WD 반복-포함하는 단백질(repeat-containing protein)은 세포분열(Feldman et al., Cell. 1997 Oct 17;91(2):221-30)과 소낭성의 수송 조절(regulation of vesicular traffic)(Pryer et al., J Cell Biol. 1993 Feb;120(4):865-75), 세포골격의 개조(Vaisman et al., Mol Gen Genet. 1995 Apr 20;247(2):123-36), RNA 프로세싱(RNA processing)(Bjorn et al., Mol Cell Biol. 1989 Sep;9(9):3698-709.), 신호전달을 포함하는 넓은 범위의 생리적인 기능에서 결정적인 역할을 한다고 알려져 있다. 노던 블랏 분석(Northern blot analysis)은 고환을 제외한 정상적인 장기에서는 발현되지 않고, 간세포암에서 과반수로 현저하게 높은 수준으로 과발현되었음을 나타냈다. 게다가, siRNA에 의한 WDRPUH 발현 저해는 인간 간세포암 세포주의 성장을 상당히 저해하는 것으로 나타났다(Silva et al., Neoplasia 2005 Apr;7(4):348-55, WO 2003/104276).
[PTL 1] WO 2003/104276
[NPL 1] Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80 [NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9 [NPL 3]Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20) 1442-55 [NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13), 3134-42 [NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9 [NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14 [NPL 7]Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8 [NPL 8] Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72 [NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66 [NPL 10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94 [NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80 [NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42 [NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15 [NPL 14] Silva et al., Neoplasia 2005 Apr;7(4):348-55 [NPL 15] Bjorn et al., Mol Cell Biol. 1989 Sep;9(9):3698-709 [NPL 16] Vaisman et al., Mol Gen Genet. 1995 Apr 20;247(2):123-36) [NPL 17] Pryer et al., J Cell Biol. 1993 Feb;120(4):865-75 [NPL 18] Feldman et al., Cell. 1997 Oct 17;91(2):221-30
발명의 요약
본 발명은 면역 치료에 적합한 표적의 발견에 부분적으로 근거한다. TAA가 일반적으로 면역 체계에서 "자가"로 인식되고, 따라서 종종 선천적 면역원성을 갖지 않기 때문에, 적절한 표적의 탐색이 매우 중요하다. 잘 알려져 있는 바와 같이, GeneBank 등록 번호(GenBank Accession No.) NM_145054 (서열번호: 63)의 유전자에 의해 암호화되는 WDRPUH 단백질 (서열번호: 64)가 간세포암의 암 조직에서 상향 조절되는 것으로서 확인된다는 것을 인식하는 것으로서, WDRPUH는 면역치료의 후보 표적이다.
적어도 일부분은 본 발명은 WDRPUH에 특이적으로 CTL을 유도하는 능력을 가진 WDRPUH의 유전자 생산물의 특이적 에피토프 펩티드의 동정에 기본을 두고 있다.아래에 상세히 설명하자면, 건강한 기증자로부터 획득한 말초단핵세포(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)는 ADRPUH로부터 유래된 HLA-A*2402 또는 HLA-A*0201 결합 후보 펩티드를 이용하여 자극되었다. 각각의 후보 펩티드로 펄스된 HLA-A24 또는 HLA-A2 양성 표적 세포에 대하여 특이적 세포 독성을 가진 CTL 라인 (line)이 규명되었다. 그 결과는 펩티드가 외견상으로는 WDRPUH를 발현하는 세포에 대하여 강력하고 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 HLA-A24 또는 HLA-A2 제한적 에피토프 펩티드라고 설명하고 있다. 게다가 이러한 결과들은 WDRPUH가 강력한 면역원성이며 이의 에피토프는 종양 면역 치료법에 효율적인 표적이라는 것을 나타낸다.
따라서 본 발명의 목적은 HLA 항원과 결합한 격리된 펩티드를 제공하는 것인데 이 펩티드는 WDRPUH (서열번호: 64) 또는 WDRPUH의 단편으로 구성되어 있다. 이와 같은 펩티드는 CTL 유도성을 갖고 생체 외(ex vivo)에 CTL을 유도하거나 또는 간세포암과 같은 암에 대하여 면역반응을 유도하기 위해 개체에 투여하는 것으로 사용될 것으로 기대된다. 이 펩티드는 강력한 CTL 유도성을 보여주는 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 및 61 가운데 선택된 아미노산 서열로 가급적으로 구성된 나노펩티드(nonapeptide) 또는 데카펩티드(decapeptide)일 수도 있다.
또한, 본 발명은 변형된 펩티드가 원래의 CTL 유도성을 유지하는 동안, 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 삽입, 결실 또는 첨가된, 서열번호 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 및 61의 아미노산 서열을 갖는 변형된 펩티드를 고려한다.
본 발명에서 앞으로 해결해야 하는 과제는 본 발명의 임의의 펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)를 제공하는 것이다. 이런 폴리뉴클레오티드는 CTL 유도성을 지닌 항원 제시 세포(APC)를 유도하는 것 또는 본 발명의 펩티드에 반하는 나아가 최종적으로 암에 반하는 면역반응을 유도하기 위해 개체에 투여하기 위해 사용될 수 있다.
개체에 투여되었을 때, 본 발명의 펩티드는 항원 제시 세포의 표면에 제시되며, 그런 다음 각각의 펩티드를 표적으로 하는 CTL을 유도한다. 따라서, 본 발명의 목적은 CTL을 유도하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드 중 어느 하나를 포함하는 제제를 제공하는 것이다. 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 어느 하나를 포함하는 제제는 수술 후의 재발의 방지를 위한 방법 및/또는 간세포암과 같은 암의 치료 및/또는 예방에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 수술 후 재발의 방지를 위한 방법 및/또는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 현재 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 어느 하나를 포함하는 약학적 제제를 제공하는 것이다. 본 발명의 제제 또는 약학적 제제는 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 제시하거나 또는 대신에 본 발명의 펩티드 중 어느 하나를 제시하는 엑소솜 또는 항원 제시 세포를 활성 성분으로서 포함할 수 있다.
본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이것의 표면에 제시하는 항원 제시 세포를 유도하는 능력이 있다. 예를 들어, 상기 유도는 본 발명의 펩티드와 개체로부터 유래된 항원 제시 세포를 접촉하는 것 또는 항원 제시 세포 내로 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것으로 성취될 수 있다. 이와 같은 항원 제시 세포는 표적 펩티드에 대하여 높은 CTL 유도성을 지니고 있고 암 면역치료법에 유용하게 쓰인다. 따라서, 본 발명의 앞으로의 과제는 방법으로 수득한 항원 제시 세포와 CTL 유도성을 갖는 항원 제시 세포의 유도 방법을 제시하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 CTL을 유도하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 T 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계 또는 이것의 표면에 본 발명의 펩티드를 제시하는 엑소솜 또는 항원 제시 세포와 CD8 양성 세포를 공생 배양하는 단계를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드와 결합하는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 소단위 폴리펩티드를 암호화한다. 다음과 같은 방법으로 수득한 CTL은 간세포암과 같은 암의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 따라서, 본 발명의 앞으로의 과제는 본 발명의 어떤 방법으로 수득한 CTL을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암에 대하여 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 WDRPUH 폴리펩티드, WDRPUH 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 엑소솜 또는 본 발명의 WDRPUH 폴리펩티드를 제시하는 항원 제시 세포 중 어느 하나를 포함하는 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 특히, 암, 간세포암으로 한정하지 않으며, WDRPUH 과발현과 관련된 임의의 질병에든 응용하여 사용가능하다는 것을 밝혔다.
상기 본 발명의 요약 및 하기의 발명의 상세한 설명 모두는 내용을 예시한 것이며, 본 발명 또는 본 발명의 다른 내용이 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다양한 측면 및 활용은 도면의 간단한 설명 및 본 발명의 상세한 설명 및 이에 따른 바람직한 실시예를 고려하면, 당업자에게 명백해질 수 있다.
[도 1] 도 1은 WDRPUH로부터 유래된 펩티드로 유도된 CTL의 IFN-감마 ELISPOT 분석 결과를 나타내는 일련의 그림을 포함한다. WDRPUH-A24-9-40 (서열번호: 1) (a)로 자극된 웰 번호 #3 그리고 #6, WDRPUH-A24-9-314 (서열번호: 2) (b)로 자극된 웰 번호 #8, WDRPUH-A24-9-509 (서열번호: 3) (c)로 자극된 웰 번호 #2 그리고 #6, WDRPUH-A24-9-339 (서열번호: 4) (d)로 자극된 웰 번호 #1,#2 그리고 #5, WDRPUH-A24-10-409 (서열번호: 16) (e)로 자극된 웰 번호 #2, #3, #4, #6, #7 그리고 #8, WDRPUH-A24-10-40 (서열번호: 17) (f)로 자극된 웰 번호 #5, #6 그리고 #8에 있는 CTL은 각각 대조군에 비하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타낸다. 사각형 상자로 나타낸 상기 웰 안의 세포는 CTL 라인을 확립하기 위하여 증폭하였다. 도면에서, "+"는 적합한 펩티드에 의해서 펄스된 웰에 있는 세포를 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 세포를 나타낸다.
[도 2] 도 2는 IFN-감마 ELISA 분석에서 WDRPUH-A24-9-40 (서열번호: 1) (a), WDRPUH-A24-9-314 (서열번호: 2) (b), WDRPUH-A24-9-509 (서열번호: 3) (c), WDRPUH-A24-9-339 (서열번호: 4) (d), WDRPUH-A24-10-409 (서열번호: 16) (e) 및 WDRPUH-A24-10-40 (서열번호: 17) (f)로 자극된 CTL 라인의 IFN-감마 생성을 나타내는 일련의 선 그래프를 포함한다. 각각의 펩티드를 이용한 자극에 의해서 확립된 CTL 라인은 대조군에 비하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타낸다. 도면에서, "+"는 적합한 펩티드에 의해서 펄스된 웰 안의 세포를 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 세포를 나타낸다.
[도 3] 도 3은 WDRPUH 및 HLA-A*2402를 외인성으로 발현하는 표적 세포에 반하여 특이적 CTL 활성을 나타내는 선 그래프로 구성되어 있다. 오로지 전장의 WDRPUH 유전자 또는 HLA-A*2402로 형질도입된 COS7 세포가 대조군으로 준비되었다. WDRPUH-A24-9-314 (서열번호: 2)로 확립된 CTL 라인은 WDRPUH과 HLA-A*2402 (검은색 마름모형)으로 형질도입된 COS7 세포에 대하여 특이적 CTL 활성을 나타낸다. 반대로, 유의적 특이적 CTL 활성은 HLA-A*2402 (삼각형)이나 WDRPUH (원형)을 발현하는 표적 세포에 대하여 검출되지 않았다.
[도 4a-h] 도 4a-h는 WDRPUH로부터 유래된 펩티드에 유도된 CTL의 IFN-감마 ELISPOT 분석의 결과를 나타내는 일련의 그림을 포함한다. WDRPUH-A2-9-39 (서열번호: 30) (a)로 자극된 웰 번호 #2 그리고 #7, WDRPUH-A2-9-407 (서열번호: 31) (b)로 자극된 웰 번호 #2 , WDRPUH-A2-9-288 (서열번호: 34) (c)로 자극된 웰 번호 #3, WDRPUH-A2-9-237 (서열번호: 36) (d)로 자극된 웰 번호 #6, WDRPUH-A2-9-543 (서열번호: 37) (e)로 자극된 웰 번호 #4, WDRPUH-A2-10-570 (서열번호: 40) (f)로 자극된 웰 번호 #4, WDRPUH-A2-10-263 (서열번호: 41) (g)로 자극된 웰 번호 #2 및 #8, WDRPUH-A2-10-78 (서열번호: 45) (h)로 자극된 웰 번호 #5에 있는 CTL는 각각 대조군에 비하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타낸다. 사각형 상자로 나타낸 상기 웰 안의 세포는 CTL 라인을 확립하기 위하여 증폭하였다. 도면에서, "+"는 적합한 펩티드에 의해서 펄스된 웰에 있는 세포를 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 세포를 나타낸다.
[도 4i-l] 도 4i-l은 WDRPUH로부터 유래된 펩티드로 유도된 CTL의 IFN-감마 ELISPOT 분석의 결과를 나타내는 일련의 그림을 포함한다. WDRPUH-A2-10-10 (서열번호: 49) (i)로 자극된 웰 번호 #2, WDRPUH-A2-10-411 (서열번호: 55) (j)로 자극된 웰 번호 #6 , WDRPUH-A2-10-287 (서열번호: 57) (k)로 자극된 웰 번호 #7 그리고 WDRPUH-A2-10-265 (서열번호: 61) (l)로 자극된 웰 번호 #6에 있는 CTL는 각각 대조군에 비하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타낸다. 사각형 상자로 나타낸 상기 웰 안의 세포는 CTL 라인을 확립하기 위하여 증폭하였다. 도면에서, "+"는 적합한 펩티드에 의해서 펄스된 웰에 있는 세포를 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 세포를 나타낸다.
[도 5] 도 5a 및 5b는 IFN-감마 ELISA 분석으로부터 감지된 서열번호: 34 (b) 및 서열번호: 30 (a)으로 자극된 CTL 라인의 IFN-감마 생성을 나타내는 선 그래프로 구성되어 있다. 각각의 펩티드를 이용한 자극에 의해서 확립된 CTL 라인은 대조군에 비하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타낸다. 도면에서, "+"는 적합한 펩티드에 의해서 펄스된 웰 안의 세포를 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 세포를 나타낸다. 도 5c 및 5d는 서열번호: 30 (c) 및 서열번호: 34 (d)으로 자극된 CTL 라인으로부터 제한적인 희석에 의해 확립된 CTL 클론(clone)의 IFN-감마 생성을 나타낸다. 상기 나타난 결과들은 서열번호: 30 (c) 및 서열번호: 34 (d)을 이용한 자극에 의해 확립된 CTL 클론이 대조군에 비하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타낸다는 것을 증명한다. 도면에서, "+"는 서열번호: 30 (c) 및 서열번호: 34 (d)에 의해서 펄스된 웰 안의 세포를 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 세포를 나타낸다. 도 5e는 WDRPUH 및 HLA-A*2402를 외인성으로 발현하는 표적 세포에 대하여 특이적 CTL 활성을 나타내는 선 그래프로 구성되어 있다. 오로지 전장의 WDRPUH 유전자 또는 HLA-A*2402로 형질도입된 COS7 세포가 대조군으로 준비되었다. WDRPUH-A2-9-288 (서열번호: 34)로 확립된 CTL 클론은 WDRPUH과 HLA-A*2402 (검은색 마름모형)으로 형질도입된 COS7 세포에 반하여 특이적 CTL 활성을 나타낸다. 반대로, 중요하지 않은 유의적 특이적 CTL 활성은 HLA-A*2402 (삼각형)이나 WDRPUH (원형)을 발현하는 표적 세포에 대하여 검출되지 않았다.
비록, 본 명세서에 기재된 어떠한 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 방법 및 재료는 본 발명의 실시예를 수행 또는 검사하는데 사용될 수 있으나, 바람직한 방법, 도구, 및 재료는 여기에 기재된다. 그러나, 본 재료 및 방법이 기재되기 이전에, 본 발명은 명세서에 기재된 특정 사이즈, 모양, 부피, 재료, 방법, 프로토콜 등에 한정되지 않으며, 이들은 통상적인 실험 및 최적화에 부합하여 변형될 수 있다. 또한, 본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어는 특정한 버전 또는 내용을 기술하기 위한 목적이나, 오직 첨부된 청구항으로 제한되는 본 발명의 범위로 제한하려는 의도는 아니다.
본 명세서에서 언급된 개별 공개, 특허 또는 특허 출원의 내용은 그 전체가 명세서에 참조로서 통합된다. 그러나, 본 명세서의 어느 것도 본 발명은 이전 발명으로 인하여 선행되는 문헌의 자격이 없다는 인정으로서, 만들어지지 않는다.
충돌이 일어날 경우, 충돌이 있는 경우, 정의를 포함한 본 명세서에 따른다. 추가로, 상기 재료, 방법, 및 실시예만 설명될 수 있으나, 제한하려는 의도는 아니다.
I. 정의
본 발명에서 사용되는 단어는 별도로 명시되지 않는 한, 단수를 의미한다.
본 발명에서 호환적으로 사용되는 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 1개 이상의 아미노산 잔기로 된 아미노산 중합체가 변형된 잔기, 또는 천연 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연 아미노산에 상응하는 인공 화학 모방체와 같은 비천연 잔기에 적용된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 아미노산과 합성 아미노산, 및 천연 아미노산과 마찬가지로 기능하는 아미노산 유사체(analog) 및 아미노산 모방체(mimetic)를 의미한다. 천연 아미노산은 유전 코드에 의해 암호화되는 아미노산, 및 세포에서 번역 후 변형된 아미노산[예를 들면, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 감마-카복시글루탐산(gamma-carboxyglutamate) 및 O-포스포세린(O-phosphoserine)]이다. 상기 용어 "아미노산 유사체"는 천연 아미노산과 같은 기본적인 화학 구조(수소, 카복실기, 아미노기 및 R기에 결합하는 α탄소)를 가지고 있지만, 변형된 R기 또는 변형된 골격을 가지는 화합물을 의미한다[예를 들면, 호모세린(homoserine), 노르루신(norleucine), 메티오닌(methionine), 설폭사이드(sulfoxide), 메티오닌 메틸 설포니움(methionine methyl sulfonium)]. 상기 용어 "아미노산 모방체"는 서로 다른 구조를 갖지만, 일반적인 아미노산과 비슷한 기능이 있는 화학적 화합물을 의미한다.
아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명위원회가 권장하는, 일반적으로 알려진 3문자 상징 또는 1문자 상징에 의해 기재되어 질 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드", "유전자", "뉴클레오티드" 및 "핵산"은 따로 명시되지 않는 한, 호환적으로 사용된다.
별도로 명시되지 않는 한, 상기 용어 "암"은 예를 포함하는 WDRPUH 유전자를 과발현하는 암을 나타내지만, 간세포암에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어 "세포독성 T 림프구", "세포독성 T 세포" 및 "CTL"은 따로 명시되지 않는 한, 호환적으로 사용되며, 따로 특별히 나타내지 않는 한, 비-자가 세포(예를 들면, 종양 세포, 바이러스 감염된 세포)를 인식하고 이러한 세포의 사멸을 유도하는 T 림프구의 하위 그룹을 나타낸다.
별도로 명시되지 않는 한 상기 용어 "HLA-A2"는 HLA-A0201 또는 HLA-A0206와 같은 서브타입(subtype)을 포함한다.
별도로 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 발명이 속한 업계에서 전통적인 기술중 하나로 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
II. 펩티드( Peptides )
WDRPUH로부터 유래한 펩티드가 CTL에 의해 인식되는 항원으로서 역할을 한다는 것을 나타내기 위하여, WDRPUH로부터 유래된 펩티드(서열번호: 64)가 일반적으로 HLA 대립 유전자로 알려진, HLA-A24에 의해 한정되는 항원 에피토프인지 여부를 분석하였다(Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994). WDRPUH로부터 유래된 HLA-A24 결합 펩티드 후보는 HLA-A24에 대한 그들의 결합 친화성을 바탕으로 동정되었다. 아래의 펩티드는 후보 펩티드이다.
WDRPUH-A24-9-40 (서열번호: 1),
WDRPUH-A24-9-314 (서열번호: 2),
WDRPUH-A24-9-509 (서열번호: 3),
WDRPUH-A24-9-339 (서열번호: 4),
WDRPUH-A24-10-409 (서열번호: 16), 및
WDRPUH-A24-10-40 (서열번호: 17).
WDRPUH로부터 유래된 HLA-A02 결합 펩티드 후보는 HLA-A02에 대한 그들의 결합 친화성을 바탕으로 동정되었다. 아래의 펩티드는 후보 펩티드이다.
WDRPUH-A2-9-39 (서열번호: 30),
WDRPUH-A2-9-407 (서열번호: 31),
WDRPUH-A2-9-288 (서열번호: 34),
WDRPUH-A2-9-237 (서열번호: 36),
WDRPUH-A2-9-543 (서열번호: 37),
WDRPUH-A2-10-570 (서열번호: 40),
WDRPUH-A2-10-263 (서열번호: 41),
WDRPUH-A2-10-78 (서열번호: 45),
WDRPUH-A2-10-10 (서열번호: 49),
WDRPUH-A2-10-411 (서열번호: 55),
WDRPUH-A2-10-287 (서열번호: 57), 및
WDRPUH-A2-10-265 (서열번호: 61).
이렇게 확립된 CTL은 각각의 펩티드로 펄스된 표적 세포에 대해 강력한 특이적 CTL 활성을 보였다. 이러한 결과는 WDRPUH가 CTL에 의해 인식되는 항원이고 상기 펩티드는 HLA-A24 또는 HLA-A2에 의해 한정되는 WDRPUH의 에피토프 펩티드임을 나타낸다.
WDRPUH 유전자는 간세포암과 같은 암 세포에서 과발현되고 대부분 정상 장기에서는 발현되지 않으므로, 이것은 면역치료의 좋은 표적이다. 따라서, 본 발명은 CTL에 인식되는 WDRPUH 유래 에피토프에 상응하는 노나펩티드(9개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드) 및 데카펩티드(10개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드)를 제공한다. 본 발명 펩티드의 특별히 바람직한 예로는 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 및 61 가운데 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드를 포함한다.
일반적으로, Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1,152(1): 163-75에 기재된 바와 같이, 인터넷상에서 현재 사용가능한 소프트웨어 프로그램을 이용하여 컴퓨터 상(in silico)에서 다양한 펩티드와 HLA 항원 사이의 결합 친화성을 산출하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75; 및 Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81를 참조로 하여 기재되어 있는 바에 따라, HLA 항원과의 결합 친화성을 측정할 수 있다. 결합 친화성을 측정하는 방법은, 예를 들면, Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190; 및 Protein Science, 2000, 9: 1838-1846에 기재되어 있다. 따라서, 하나는 앞에 언급한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 HLA 항원과의 높은 결합 친화성을 갖는 WDRPUH의 단편을 선택할 수 있다. 그래서, 본 발명은 이러한 공지된 프로그램을 이용하여 동정된 HLA 항원에 결합하는 WDRPUH로부터 유래된 어떤 단편들로 구성된 펩티드를 포함한다. 게다가, 본 발명의 펩티드 역시 WDRPUH의 전장으로 구성된다.
본 발명의 펩티드는 상기 펩티드가 그 CTL 유도성을 유지하는 한 부가적인 아미노산 잔기를 인접시킬 수 있다. 본 발명의 펩티드에 인접한 상기 특정 아미노산 잔기는 원래의 펩티드의 CTL 유도성을 손상시키지 않는 한 임의의 종류의 아미노산으로 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 WDRPUH로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고 HLA 항원에 결합 능력을 가진 펩티드를 제공한다. 이와 같은 펩티드는 전형적으로 약 40 아미노산 미만, 흔히 약 20 아미노산 미만, 보통 약 15 아미노산 미만이다.
일반적으로, 펩티드에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산의 변형은 상기 펩티드의 기능에 영향을 끼치지 않으며, 몇몇의 경우에는 심지어 본래 펩티드의 원하는 기능을 강화시킬 수 있다. 사실, 변형된 펩티드(즉, 본래의 참조 서열과 비교하여, 하나, 둘 또는 다수의 아미노산 잔기가 변형된(즉, 치환, 결실, 첨가 또는 삽입) 아미노산 서열로 구성되는 펩티드)는 본래 펩티드의 생물학적 활성을 유지한다고 알려지고 있다(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). 따라서, 하나의 실시예에서, 본 발명의 상기 펩티드는 CTL 유도성 및 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 및 61 중에서 선택되는 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 심지어 다수의 아미노산이 삽입, 첨가, 결실 및/또는 치환된 아미노산 서열을 모두 가질 수 있다.
당 기술은 단일 아미노산 또는 아미노산의 일부 비율이 바뀌는, 아미노산 서열 각각의 치환이 본래 아미노산 측쇄의 특성을 보존하는 결과를 내는 경향이 있음을 알고 있다. 보통, 이들은 단백질의 변화가 본래 단백질과 유사한 기능을 갖는 변형된 단백질을 만드는 "보존적 치환" 또는 "보존적 변형"이라고 일컫는다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당 업계에 잘 알려져 있다. 보존되는 아미노산 측쇄 특성의 예는 예를 들어, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기의 작용기 또는 공통적인 특성을 갖는 측쇄가 포함된다: 지방족 측쇄(G, A, V, L, I, P); 측쇄를 포함하는 수산기 그룹(S, T, Y); 측쇄를 포함하는 황 원자(C, M); 측쇄를 포함하는 카르복실산 및 아미드(amide)(D, N, E, Q); 측쇄를 포함하는 염기(R, K, H); 및 측쇄를 포함하는 방향족(H, F, Y, W). 아울러, 하기의 8개 그룹은 각각 보존적 치환으로서 당 업계에서 서로 허용될 수 있는 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌(A), 글라이신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루타민산(E);
3) 아스파르긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 라이신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들면, Creighton, Proteins 1984 참조).
이러한 보존적으로 변형된 펩티드는 또한 본 발명의 펩티드로 간주된다. 그러나, 본 발명의 펩티드는 이에 한정되지 않으며 상기 변형된 펩티드가 본래 펩티드의 CTL 유도성을 유지하는 한, 비-보존적 변형을 포함할 수 있다. 더욱이, 변형된 펩티드는 CTL 유도성 펩티드의 다형성 변이, 종간 유사체(interspecies homologues), 및 WDRPUH의 대립 유전자를 제외하지 않는다.
필요한 CTL 유도성을 유지하기 위하여, 소수(예를 들어, 1, 2 또는 몇몇) 또는 적은 퍼센트의 아미노산을 변형(삽입, 첨가, 결실 및/또는 치환)할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 용어 "몇몇"은 5개 미만의 아미노산, 예를 들어, 3,4개 또는 그 이하를 의미한다. 변형된 아미노산의 퍼센트는 바람직하게 20% 미만이며, 보다 바람직하게는 15% 미만이며, 그보다 더욱 바람직하게는 10% 미만, 또는 1 내지 5%이다.
게다가, 아미노산 잔기는 증가된 결합 친화성을 가지는 변형된 펩티드를 생산하기 위하여 상기 펩티드에 치환, 삽입, 결실 및/또는 첨가될 수도 있다. 면역치료의 문맥으로 이용될 때, 본 발명의 펩티드는 세포 또는 엑소솜의 표면에 제시되며, 바람직하게는 HLA 항원과의 복합체로서 제시된다. 자연적으로 나타난 펩티드와 더불어, HLA 항원에 결합함으로써 나타나는 펩티드 서열의 규칙성은 이미 알려져 있으며(J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), 이러한 규칙성에 기반한 변형은 발명의 면역원성 펩티드에 도입될 수 있다. 예를 들면, HLA-A24 결합을 증가시키기 위하여, 페닐알라닌(phenylalanine), 타이로신(tyrosine), 메티오닌(methionine), 또는 트립토판(tryptophan)으로 치환된 N-말단으로부터 , 및/또는 페닐알라닌(phenylalanine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 트립토판(tryptophan), 또는 메티오닌(methionine)으로 치환된 C-말단의 아미노산을 두 번째 아미노산으로 치환하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 서열번호의 아미노산 서열에서 N 말단의 두 번째 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 타이로신(tyrosine), 메티오닌(methionine), 또는 트립토판(tryptophan) 및, 펩타이드로 치환, 및/또는 서열번호의 아미노산 서열에서 C 말단이 페닐알라닌(phenylalanine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 트립토판(tryptophan), 또는 메티오닌(methionine)으로 치환된, 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16 및 17로 구성된 그룹으로부터 선별된 아미노산을 갖는 펩티드는 본 발명에 의해서 포함된다. 반면에, 높은 HLA-A2 결합 친화도를 갖는 펩티드들은 류신(leucine) 또는 메티오닌(methionine)으로 치환된 N 말단으로부터 두 번째 아미노산, 및/또는 발린(valine) 또는 류신(leucine)으로 치환된 C 말단의 아미노산을 갖는다. 따라서, N 말단으로부터 두 번째 아미노산이 류신(leucine) 또는 메티오닌(methionine)으로 치환, 및/또는 C 말단이 발린(valine) 또는 류신(leucine)으로 치환된 서열번호: 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 및 61 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드들은 본 발명에 의해서 포함된다. 치환은 마지막 아미노산에서 뿐만 아니라, 펩티드의 잠재적 T cell receptor(TCR)인지 위치에도 도입될 수 있다. 다수의 연구에서 예를 들어 CAP1, p53(264-272), Her-2/neu(369-377) 또는 gp100(209-217)의 아미노산 치환에 의한 펩티드는 본래와 동등하거나 또는 우수하다는 것을 보였다(Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 및 S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).
또한, 본 발명은 상기 펩티드의 N 및/또는 C 말단에 하나, 두 개 또는 몇 개의 아미노산의 첨가를 고려한다. 또한 높은 HLA 항원 결합 친화성을 가지고 CTL 유도성을 보유하는 이와 같은 변형된 펩티드는 본 발명에 포함된다.
그러나, 상기 펩티드 서열이 상이한 기능을 갖는 내인성 또는 외인성의 아미노산 서열의 일부와 동일할 경우, 특이적 물질에 대한 자가면역 질환 및/또는 알러지 증상과 같은 부작용이 유도될 수 있다. 따라서, 상기 펩티드의 서열과 일치하는 다른 단백질의 아미노산 서열과 일치하는 경우를 방지하기 위하여, 우선 이용가능한 데이타베이스를 이용하여 상동성 검색을 수행하는 것이 바람직하다. 목적 펩티드와 비교하여 1개 또는 2개 아미노산의 차이가 있는 펩티드조차 존재하지 않는다는 상동성 검색 결과가 확실해진다면, 상기 목적 펩티드는 이의 HLA 항원과의 결합 친화성, 및/또는 상기와 같은 부작용의 위험이 없는 CTL 유도성을 증가시키기 위하여 변형될 수 있다.
비록 상기 기재된 바와 같이 HLA 항원에 대한 높은 결합 친화성을 갖는 펩티드는 매우 효과적일 것으로 예상되지만, 지표로서 높은 결합 친화성의 존재에 따라 선택된 상기 후보 펩티드들은 CTL 유도성의 존재에 대해 더욱 조사된다. 여기에서, 구문 "CTL 유도성"은 항원 제시 세포(APCs)에 제시될 때, CTL를 유도하는 펩티드의 능력을 의미한다. 나아가, "CTL 유도성"은 상기 펩타이드의 CTL 활성 유도, CTL 증식, 표적 세포의 CTL 용해 증진, 및 CTL IFN-감마 생성을 증가시키는 능력을 포함한다.
CTL 유도성의 확인은 인간 MHC 항원(예를 들면, B-림프구, 대식세포, 및 수지상 세포(DC))을 운반하는 항원 제시 세포 또는 좀 더 특이적으로 인간 말초혈액 단핵구 백혈구로부터 유래된 DC를 유도하고 상기 펩티드로 자극한 후, CD8-양성 세포와 혼합한 다음, 표적 세포에 대하여 CTL에 의해서 생성되고 방출된 IFN-감마를 측정하는 것에 의해서 수행된다. 반응 체계로서, 인간 HLA 항원을 발현하도록 제작된 형질전환 동물(예를 들어, BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class restricted T(H) response에 기재됨)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 세포는 51Cr 등으로 방사선 표지될 수 있으며, 세포독성 활성은 상기 표적세포로부터 방출되는 방사능으로부터 산출될 수 있다. 대안적으로, CTL 유도성은 고정화된 펩티드를 운반하는 항원 제시 세포의 존재하에 CTLs에 의해서 생성되고 방출되는 IFN-감마를 측정하고, 항-IFN-감마 단일클론 항체를 이용하여 상기 배지 내의 억제 구간을 가시화함으로써 측정할 수 있다.
상기 기재한 바와 같이 상기 펩티드의 CTL 유도성 검사 결과, 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 및 61 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 노나펩티드(nonapeptide) 또는 데카펩티드(decapeptide)는 HLA 항원에 대해 높은 결합 친화성 뿐만 아니라 특히 높은 CTL 유도성을 보인다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 이러한 펩티드들은 본 발명의 바람직한 실시예로서 시험된다.
더구나, 상동성 분석실험의 결과는 상기의 펩티드는 또 다르게 잘 알려진 인간 유전자 생산물로부터 유래된 펩티드와 의미 있는 상동성을 갖고 있지 않다는 것을 나타내었다. 이것은 면역치료법에 있어서 본 발명의 펩티드의 사용으로 인하여 잘 알려지지 않거나 원하지 않은 면역 반응의 가능성이 줄어든다는 것을 의미한다. 따라서, 이러한 양상으로부터 또한, 상기의 펩티드는 WDRPUH에 반하여 암환자에 있어서 면역을 이끌어내는 것이 더 선호된다. 따라서, 본 발명에서 특별히 선호된 펩티드는 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 및 61로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것들을 포함한다.
또한, 상기 기재한 변형과 더불어 본 발명의 펩티드는 결과적인 펩티드가 본래 펩티드의 필요한 CTL 유도성을 유지하는 한 다른 펩티드와의 연결이 가능하다. 적합한 펩티드의 예는 다른 TAA로부터 유래된 펩티드로 유도된 CTL 또는 본 발명의 펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 펩티드들 사이에 위치한 링커(linker)는 당 업계에 잘 알려져 있고 그 예로는, AAY (P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) and K (S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715)을 포함하지만 이에 한정하지 않는다.
게다가, 본 발명의 펩티드는 결과적인 펩티드가 본래 펩티드의 필요한 CTL 유도성을 유지하는 한, 다른 물질들과 연결될 수 있다. 본래 펩티드의 생물학적 활성을 파괴시키지 않는 한 적합한 물질들은 그 예로 펩티드, 지질, 당 및 당 사슬, 아세틸기(acetyl group), 천연 및 합성 폴리머 등을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다. 상기 펩티드는 본래 펩티드의 생물학적 활성을 파괴시키지 않는 한, 글리코실화(glycosylation), 측쇄 산화, 또는 인산화(phosphorylation), 등과 같은 변형을 포함할 수 있다. 이러한 종류의 변형은 추가적인 기능을 부여하기 위하여(예를 들면, 표적화 기능, 및 전달 기능), 또는 상기 폴리펩티드를 안정화시키기 위하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 생체 내(in vivo) 안정성을 증가시키기 위하여, 당업계에는 D-아미노산, 아미노산 미메틱스(mimetics) 또는 비자연적인 아미노산을 도입할 수 있다는 것이 알려져 있다. 또한 이러한 개념은 본 발명의 폴리펩티드에 적용될 수 있다. 폴리펩티드의 안정성은 다양한 방법으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 펩티드가수분해효소 및 인간 혈장 및 혈청과 같은, 다양한 생물학적 배지가, 안정성을 시험하기 위하여 사용될 수 있다(예를 들면, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302 참조).
잘 알려진 바와 같이, 하나, 두 개 또는 몇몇의 아미노산 잔기의 치환, 삽입, 결실 및/또는 첨가로부터 변형된, 하지만 여전히 본래 펩티드와 비교해서 같거나 높은 활성을 가진 펩티드를 스크린(screen) 또는 선별하는 것은 가능하다. 따라서, 본 발명은 또한 본래의 펩티드와 비교해서 같거나 높은 활성을 가지는 변형된 펩티드를 스크리닝(screening) 또는 선별하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들면, 다음과 같은 방법은 아래의 단계로 구성되어질 수 있다.
a: 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가에 의한 본 발명의 펩티드에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변형하는 단계;
b: 변형된 펩티드의 활성을 나타내는 단계; 및
c: 본래의 펩티드와 비교해서 같거나 더 높은 활성을 가지는 것으로 나타난 펩티드를 선별하는 단계.
명세서에서, b 단계에서 밝혀진 활성은 MHC 결합 활성, 항원 제시 세포 또는 CTL 유도성, 및/또는 세포독성 활성일 수도 있다.
또한, 명세서에서, 본 발명의 펩티드는 "WDRPUH 펩티드(들)" 또는 "WDRPUH 폴리펩티드(들)"로 기재될 수 있다.
Ⅲ. WDRPUH 펩티드의 제조
본 발명의 펩티드는 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드는 재조합 DNA 기술 또는 화학적 합성을 사용하여, 합성적으로 제조될 수 있다. 본 발명의 상기 펩티드는 각각 합성되거나, 둘 또는 이상의 펩티드로 구성되는 긴 폴리펩티드로서 합성될 수 있다. 다음으로, 상기 펩티드는 자연적으로 형성되는 숙주 세포 단백질 및, 이의 단편, 또는 다른 화학적 물질이 실질적으로 제거되도록 분리, 즉 정제 또는 분리될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 선별된 아미노산 서열을 기초로 한 화학 합성을 통해 얻어질 수 있다. 합성에 적용될 수 있는 종래 펩티드 합성 방법의 예들은 하기를 포함하나, 이에 한정하지 않는다:
(i) 펩티드 합성(Peptide Synthesis), Interscience, New York, 1966;
(ii) 단백질(The Proteins), Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;
(iii) 펩티드 합성(Peptide Synthesis)(일본어), Maruzen Co., 1975;
(iv) 펩티드 합성의 기본 및 실험(일본어), Maruzen Co., 1985;
(v) 제약 개발(두 번째 권)(일본어), Vol. 14(펩티드 합성), Hirokawa, 1991;
(vi) WO99/67288; 및
(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "고체상 펩티드 합성(Solid Phase peptide synthesis)", Academic Press, New York, 1980, 100-118.
대안적으로, 본 발명의 펩티드는 펩티드를 생산하기 위한 모든 공지된 유전 공학 기술을 적용하여 획득될 수 있다(예를 들면, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology(eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). 예를 들면, 우선, 발현할 수 있는 형태로 목적 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적합한 벡터(예를 들면, 프로모터 서열에 상응하는 조절 서열의 하위 단계)가 제조되고 적합한 숙주 세포에 형질전환된다. 그리고 상기 숙주 세포는 관심있는 펩티드를 생산하기 위하여 배양된다. 또한, 상기 펩티드는 시험관 내 번역 체계(in vitro translation system)를 조정하여 시험관 내에서 생성될 수 있다.
IV. 폴리뉴클레오티드( Polynucleotides )
또한, 본 발명은 상기 언급된 본 발명의 임의의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클리레오티드를 제공한다. 이들은 WDRPUH 유전자의 보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 자연적으로 발생되는 WDRPUH 유전자(GenBank 등록번호 NM_145697 (서열번호: 34))로부터 유래되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이하, 구문 "보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열"은 동일하거나 필수적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 의미한다. 유전자 코드의 퇴화도(degeneracy)로 인하여, 대다수의 기능적으로 동일한 핵산은 특정한 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG, 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해서 특정화되는 각 위치에서, 상기 코돈은 암호화되는 폴리펩티드를 변화시키지 않고 이에 상응되는 임의의 코돈으로 변화할 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이(silent variation)"이며, 이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류이다. 또한, 본 명세서에서 펩티드를 암호화하는 모든 핵산 서열은 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 당 업계에서 일반적인 기술의 하나는 핵산 내의 각 코돈(예외 일반적으로 메티오닌(methionine)을 위한 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판(tryptophan)을 위한 유일한 코돈인, TGG)은 기능적으로 동일한 분자를 생산하기 위하여 변형되는 것을 인식할 수 있다. 따라서, 펩티드를 암호화하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 공개된 서열에 암시적으로 기재된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 및 이의 변이체로 구성될 수 있다. DNA는 A, T, C, 및 G와 같은 염기로 적절하게 구성되며, RNA에서는 T가 U로 치환된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열 사이에 삽입하거나 또는 삽입하지 않은 채로, 본 발명의 다양한 펩티드를 암호화할 수 있다. 예를 들면, 삽입하는 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드 또는 번역된 펩티드의 절단 위치(예, 효소 인식 서열)를 제공할 수 있다. 더욱이, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 코딩 서열에 대하여 임의의 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 펩티드의 발현을 위하여 필요한 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자 등이 있는 발현 벡터(플라스미드)일 수 있다. 일반적으로, 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 폴리머라아제(polymerase) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 이용한 종래의 재조합 기술을 통해 폴리뉴클레오티드의 조작에 의해서 제조될 수 있다.
재조합 및 화학적 합성 기술 모두는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 생산하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 컴피턴트(competent) 세포로 형질도입되었을 때 발현될 수 있는, 적합한 벡터 내로 삽입함으로써 생산될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 PCR 기술을 이용하여 증폭되거나 적합한 숙주에서 발현될 수 있다(예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989 참조). 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5에 기재된 바와 같이, 고체상(solid phase) 기술을 이용하여 합성될 수 있다.
V. 엑소솜( Exosome )
본 발명은 본 발명의 펩티드와 HLA 항원 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는, 엑소솜으로 부르는 세포소낭(intracellular vesicles)을 추가로 제공한다. 엑소솜은 예를 들어, 일본 특허 출원 코효(Kohyo) 공개번호 Hei 11-510507 및 WO99/03499에 기재된 방법을 이용하여 제조될 수 있고, 치료 및/또는 예방을 위한 개체인 환자로부터 획득된 항원 제시 세포(APC)를 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 엑소솜은 본 발명의 펩티드와 유사한 모양으로, 백신으로써 접종될 수 있다.
상기 복합체를 포함하는 HLA 항원의 타입(type)은 치료 및/또는 예방이 필요한 개체와 매치(match)되어야만 한다. 예를 들면, 일본 인구에서는, HLA-A24 및 HLA-A2, 특히 HLA-A2402, 및 HLA-A0201 또는 HLA-A0206이 일반적이므로, 일본인 환자의 치료를 위해서 적합하다. 일본인 및 백인 중에서 높게 발현되는 A24 타입 또는 A2 타입의 이용은 효과적인 결과를 얻는데 유리하고, A2402, A0201 또는 A0206과 같은 아형(subtype) 또한 이용될 수 있다. 일반적으로, 임상에서, 치료가 필요한 환자의 HLA 항원의 타입이 사전에 조사되고, 특정 항원에 대해 높은 수준의 결합 친화력을 갖거나, 항원 제시에 의해 CTL 유도성을 갖는 펩티드를 적절히 선택할 수 있다. 게다가, 높은 결합 친화성 및 CTL 유도성 모두를 갖는 펩티드를 얻기 위하여, 자연적으로 유발된 WDRPUH 부분 펩티드의 아미노산 서열을 기본으로 1, 2, 또는 다수 아미노산의 치환, 삽입, 결실 및/또는 첨가가 이루어질 수 있다.
본 발명의 엑소솜을 위한 A24 타입 HLA 항원을 이용할 때 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16, 및 17 가운데 선별된 서열을 갖는 펩티드는 이용법을 찾는다. 그 대신에 본 발명의 엑소솜을 위한 A2 타입 HLA 항원을 이용할 때 서열번호: 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 및 61 중 어느 하나의 서열을 갖는 펩티드는 이용법을 찾는다.
VI. 항원 제시 세포( Antigen - presenting cells , APCs )
또한, 본 발명은 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하고 있는 항원 제시 세포(antigen-presenting cell, APCs)를 제공한다. 항원 제시 세포는 치료 및/또는 예방의 대상이 되는 환자로부터 유래될 수 있으며, 그 자체로 백신으로서 투여되거나 또는 본 발명의 펩티드, 엑소솜, 또는 CTL를 포함하는 다른 약물과의 조합으로서 투여될 수 있다.
상기 항원 제시 세포는 특정 종류의 세포에 한정되지 않으나, 림프구에 의해서 인식되기 위하여 그들의 세포 표면에 단백질 항원을 제시하는 것으로 알려져 있는, 랑게르한스 세포(Langerhans cell), 대식세포, B 세포, 및 활성화된 T 세포를 포함한다. DC는 항원 제시 세포 중에서 강력한 CTL 유도 활성을 갖는 대표적인 항원 제시 세포이기 때문에, DC는 본 발명의 항원 제시 세포로서 사용할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 항원 제시 세포는 말초혈액 단핵구 백혈구로부터 유래된 DC에 의해서 유도되고, 그런 다음 시험관 내, 생체 외(ex vivo), 또는 생체 내(in vivo)에서 본 발명의 펩티드와 접촉(자극)하여 수득될 수 있다. 구문 "항원 제시 세포 유도"는 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 상기 세포 표면에 제시하기 위해 본 발명의 펩티드, 또는 본 발명의 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 세포와 접촉(자극)하는 것을 포함한다. 본 발명의 펩티드가 개체에 투여될 때, 본 발명의 펩티드가 존재하는 항원 제시 세포는 개체의 체내에서 유도된다. 따라서, 본 발명의 항원 제시 세포는 개체에 본 발명의 펩티드를 투여된 후 개체로부터 항원 제시 세포를 수집하는 것으로 수득될 수 있다. 그 대신에 본 발명의 항원 제시 세포는 본 발명의 펩티드를 갖는 개체로부터 수집한 항원 제시 세포를 접촉하는 것으로 수득될 수 있다.
본 발명의 항원 제시 세포는 상기 펩티드, 엑소솜 또는 본 발명의 CTL를 포함하는 다른 약과 함께 조합하거나 또는 개체가 개체 자신으로부터의 암에 대하여 면역반응을 유도하는 목적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 생체 외(ex vivo) 투여는 하기의 단계를 포함한다:
a: 첫 번째 개체로부터 항원 제시 세포를 수집하는 단계;
b: 단계 a의 항원 제시 세포와 펩티드를 접촉시키는 단계; 및
c: 단계 b의 펩티드가 탐지된 항원 제시 세포를 두 번째 개체에 투여하는 단계.
상기 첫 번째 개체 및 두 번째 개체는 동일한 개체일 수 있으며, 또는 다른 개체일 수도 있다. 단계 b에서 획득한 항원 제시 세포는 간세포암을 포함하는 암을 치료 및/또는 예방을 위한 백신으로서 투여될 수 있다. 또한, 본 발명은 항원 제시 세포를 유도하는 약학적 조성물을 제조하기 위해 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 수용체를 함께 혼합하거나 제형화하는 단계를 포함한, 방법 또는 과정을 제공한다.
본 발명의 하나의 측면에 따르면, 상기 항원 제시 세포는 높은 수준의 CTL 유도성을 갖는다. "높은 수준의 CTL 유도성" 용어에 있어서, 상기 높은 수준이란 펩티드와 접촉하지 않거나 CTL를 유도할 수 없는 펩티드와 접촉한 항원 제시 세포에 의해 성취된 CTL 유도성 수준에 대해 상대적인 것이다. 이러한 높은 수준의 CTL 유도성을 갖는 항원 제시 세포는 위에서 언급한 상기 방법뿐만 아니라 시험관 내(in vitro)에서 항원 제시 세포에 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 전달하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 제조될 수 있다. 상기 도입된 유전자는 DNA 또는 RNA 형태일 수 있다. 도입을 위한 방법의 예는, 리포펙타민(lipofection), 전기천공법(electroporation), 및 인산 칼슘(calcium phosphate) 방법과 같이, 당 업계에서 일반적으로 수행되는 다양한 방법을 특정한 제한 없이 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 이는 Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Published Japanese Translation of International Publication No. 2000-509281에 기재된 바에 따라 수행될 수 있다. 상기 유전자를 항원 제시 세포에 전달함으로써, 상기 유전자는 상기 세포 내에서 전사, 번역 등을 거치며, 그리고 나서 수득된 단백질은 제시 기작(presentation pathway)을 통해 MHC 클래스 Ⅰ 또는 클래스 Ⅱ에 의해 진행되고 제시된다.
VII. 세포독성 T lymphocytes(CTLs )
본 발명의 임의의 펩티드에 대해서 유도되는 CTL는 생체 내(in vivo)에서 암 세포를 표적으로 하는 면역 반응을 강화하며 따라서 펩티드 그 자체와 유사한 유형으로, 백신으로서 사용될 수 있다. 따라서, 또한, 본 발명은 본 발명의 임의의 펩티드에 의해 특이적으로 유도 또는 활성화되는 분리된 CTL를 제공한다.
이러한 CTL는 (1) 개체에 본 발명의 펩티드를 투여하고, 개체로부터 유래된 CTL를 수집하고; (2) 개체 유래된 항원 제시 세포 및 CD8-양성 세포, 또는 말초혈액 단핵구 백혈구를 시험관 내(in vitro)에서 본 발명의 펩티드와 접촉(자극)하고, CTL를 분리하고; 또는 (4) 본 발명의 펩티드와 결합하는 T 세포 수용체(TCR) 소단위 폴리펩티드를 암호화하는 유전자인 T 세포 안으로 도입함으로써 획득될 수 있다. 상기 항원 제시 세포 또는 엑소솜은 위에 상술한 방법에 의해 준비될 수 있고, (4)의 방법은 아래의 "VIII. T 세포 수용체(TCR)" 부분에 상세히 있다.
본 발명의 펩티드를 제시하는 항원 제시 세포로부터 자극됨으로써 유도되는, 상기 CTL는, 치료 및/또는 예방의 대상이 되는 환자로부터 유래될 수 있으며, 그 자체로 투여되거나, 또는 효과를 조절하기 위한 목적으로 본 발명의 펩티드 또는 엑소솜을 포함하는 다른 약물과 조합으로 투여될 수 있다. 상기 수득된 CTL는 본 발명의 펩티드를 제시하는 표적세포, 예를 들면, 유도에 사용된 동일한 펩티드에 대해 특이적으로 작용한다. 상기 표적 세포는 내인성으로 WDRPUH를 발현하는 세포, 예를 들면, 간세포암, 이거나, 또는 상기 WDRPUH 유전자가 형질도입된 세포일 수 있다; 그리고 상기 펩티드에 의해서 자극되기 때문에 본 발명의 펩티드를 세포 표면에 제시하는 세포는 활성화된 CTL 공격의 표적으로서도 사용할 수 있다.
VIII. T 세포 수용체(T cell receptor , TCR )
또한, 본 발명은 T 세포 수용체(TCR)의 소단위를 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물, 및 이를 이용한 방법을 제공한다. 상기 TCR 소단위는 본 발명의 상기 특이적 펩티드를 제시하는 종양 세포에 대하여 T 세포의 특이성을 줄 수 있는 TCR을 형성하는 능력을 가진다. 당 업계에 공지된 방법을 사용하여, 본 발명의 하나 또는 이상의 펩티드로 유도된 CTL의 TCR 소단위로서 알파(alpha-) 및 베타(beta-) 사슬의 핵산이 동정될 수 있다(WO2007/032255 및 Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)). 예를 들면, 상기 PCR 방법은 TCR 분석에 선호된다. 분석을 위한 상기 PCR 프라이머(primer)가 있을 수 있다., 예를 들면,
5' 다른 방향 프라이머 (서열번호: 65)로서 5'-R 프라이머 (5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3') 및 TCR 알파 사슬 C 부분 (서열번호: 66)에 특이적인 3-TRa-C 프라이머 (5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3'),
TCR 베타 사슬 C1 부분 (서열번호: 67) 에 특이적인 3-TRb-C1 프라이머 (5'-tcagaaatcctttctcttgac-3') 또는
3' 다른 방향 프라이머로서 TCR 베타 사슬 C2 부분 (서열번호: 68)에 특이적인 3-TRbeta-C2 primers (5'- ctagcctctggaatcctttctctt-3'),
그러나 이에 한정하지 않는다. TCR의 유도체는 높은 결합활성을 갖고 있는 WDRPUH 펩티드에 나타나는 표적세포와 결합할 수 있으며, 선택적으로 생체 내(in vivo) 및 시험관 내(in vitro)에서 WDRUH 펩티드를 제시하는 표적 세포를 효과적으로 사멸시키는 것을 매개할 수 있다.
상기 TCR 소단위를 암호화하는 핵산은 예를 들면 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)와 같은 적합한 벡터 내로 도입될 수 있다. 이러한 벡터들은 당 업계에 잘 알려졌다. 상기 핵산 또는 이들을 포함하는 벡터는 T 세포, 예를 들면, 환자로부터 유래한 T 세포 내로 유용하게 전이될 수 있다. 유리하게, 본 발명은 우수한 암 세포 사멸 특성을 갖는 변형된 T 세포를 신속하고 용이하게 생성하게 할 수 있도록 환자 자신의 T 세포(또는 다른 포유류의 T 세포)를 신속하게 변형시키는 규격화된 조성물을 제공한다.
상기 특이적 TCR은 T 세포 표면에 TCR이 있을 때 표적 세포에 반하여 T 세포 특이적 활성을 갖고, HLA 분자 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 특이적으로 인지할 수 있는 수용체이다. 위 복합체의 특이적 인지는 임의의 밝혀진 방법에 의해서도 확인되어질 수 있고, 예를 들어, ELISPOT 분석, 본 발명의 펩티드와 HLA 분자를 이용한 4분자체(tetramer) 분석을 포함한 방법이 선호된다. 상기 세포 표면의 상기 TCR을 발현하는 T 세포가 TCR에 의한 세포를 인식하고, 그 신호는 세포 내적으로 전송 된다는 것을 ELISPOT 분석에 의해 확인할 수 있다. T 세포 표면에 복합체가 존재할 때 T 세포 독성 활성을 위에 언급된 복합체가 줄 수 있다는 확인 또한, 밝혀진 방법에 의해 이행되어 질 수 있다. 예를 들면, 크롬(chromium) 방출 분석과 같은, HLA 양성 표적 세포에 반하여 세포독성 활성의 측정하는 방법이 선호된다. 또한, 본 발명은 HLA-A24의 문맥에서의 서열번호: 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 및 61의 펩티드, 및 또한 HLA-A2의 문맥에서의 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16 및 17의 WDRPUH 펩티드와 결합하는 TCR 소단위 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로 형질도입함으로써 제조되는 CTL을 제공한다. 상기 형질도입된 CTL은 생체 내의 암 세포로 귀소할 수 있으며, 공지된 시험관 내 배양 방법에 의해 증폭될 수 있다(예를 들면, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461(1989)). 본 발명의 상기 CTL는 치료 또는 보호를 필요로 하는 환자의 암을 치료 또는 예방하는데 유용한 면역원성 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다(WO2006/031221).
방지 및 예방은 질환으로부터 사망 또는 질병률의 부담을 감소시킬 수 있는 임의의 활동을 포함한다. 방지 및 예방은 "첫 번째, 두 번째, 및 세 번째 방지 단계"에서 발생할 수 있다. 첫 번째 방지 및 예방은 질병의 발생을 피할 수 있는 반면, 두 번째 및 세 번째 단계의 방지 및 예방은 기능 복구 및 질환 관련된 합병증을 감소시킴으로써 이미 확립된 질환의 부정적인 효과를 감소시킬 뿐만 아니라, 질병 및 위급한 증상의 발달의 방지 및 예방에 목표를 둔다. 대안적으로, 방지 및 예방은, 예를 들면, 종양의 증식 및 전이를 감소시키는, 혈관생성을 감소시키는, 특정 질환의 심화를 경감시키는 것을 목적으로 하는 다양한 종류의 예방적 치료법을 포함한다.
암의 치료 및/또는 예방 또는, 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지는 암 세포의 수술적 제거, 암성 세포 성장의 억제, 종양의 퇴화 또는 퇴행, 암 발생의 차도 및 억제의 유도, 종양 감소, 및 전이의 감소 또는 억제와 같은 하기의 단계의 임의의 것을 포함한다. 암의 효과적인 치료 및/또는 예방은 사망률을 감소시키고, 암을 가진 개인의 예후를 개선시키며, 혈액 내 종양 마커의 수준을 감소시키며, 암에 동반되는 지각할 수 있는 증상들을 감소시킨다. 예를 들면, 증상의 감소 또는 개선은 효과적인 치료 및/또는 예방을 구성하며, 이와 같은 증상의 감소 또는 개선은 10%, 20%, 30% 또는 그 이상의 감소, 또는 안정적인 질환 상태의 유지를 포함한다.
IX. 약학적 제제 또는 조성물
WDRPUH 발현이 정상 조직에 비해서 간세포암에서 특이적으로 증가됨으로(상향 조절됨으로)(Silva et al., Neoplasia 2005 Apr;7(4):348-55), 상기 펩티드 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 암 또는 종양의 치료 및/또는 예방, 및/또는 수술 후 재발을 방지하기 위해서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 암 또는 종양의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 방지하는 약학적 제제 또는 조성물을 제공하며, 이는 하나 또는 다수의 상기 펩티드, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 활성 성분으로 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 펩티드는 상기 엑소솜 또는 약학적 제제 또는 조성물로서 사용되는 항원 제시 세포와 같은 세포의 임의의 표면에서 발현될 수 있다. 추가로, 상기 언급한 상기 발명의 임의의 펩티드를 표적으로 하는 CTL는 또한 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물의 활성 성분으로서 사용될 수 있다.
또한, 또 다른 실시예에서, 본 발명은 암 또는 종양의 치료를 위한 약학적 조성물 또는 약제를 제조하는데 있어서, 하기 중 선택되는 활성 성분의 용도를 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 기재된 펩티드를 암호화하는 핵산;
(c) 본 발명의 펩티드를 그 표면에 제시하는 항원 제시 세포 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 CTL.
대안적으로, 본 발명은 암 또는 종양을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위해 하기 중 선택되는 활성 성분을 추가로 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 기재된 펩티드를 암호화하는 핵산;
(c) 본 발명의 펩티드를 그 표면에 제시하는 항원 제시 세포 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 CTL.
대안적으로, 본 발명은 활성 성분으로서 하기 중 선택되는 활성 성분과 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 제형화하는 단계를 포함하는, 암 또는 종양을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물 또는 제제를 제조하는 방법 또는 과정을 추가로 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 기재된 펩티드를 암호화하는 핵산;
(c) 항원 제시 세포 또는 본 발명의 펩티드를 그 표면으로 제시하는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 CTL.
또한, 또 다른 실시예에서, 본 발명은 하기 중 선택되는 활성 성분과 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 상기 활성 성분과 혼합하는 단계를 포함하는, 암 또는 종양을 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 약제를 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공한다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 기재된 펩티드를 암호화하는 핵산;
(c) 본 발명의 펩티드를 그 표면에 제시하는 항원 제시 세포 또는 엑소솜; 및
(d) 본 발명의 CTL.
대안적으로, 상기 본 발명의 약학적 조성물 또는 약제는 암 또는 종양의 예방 및 이의 수술 후 재발을 방지하기 위한 방법 중 어느 하나 또는 둘 모두를 위해서 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 백신으로서의 용도를 확인하였다. 본 발명의 문맥에 있어서, 상기 구문 "백신"("면역원성 조성물"도 의미함)은 동물에 주사되어 항종양 면역력을 유도하는 기능을 갖는 물질을 일컫는다.
상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 암 또는 종양의 치료 및/또는 방지에 사용될 수 있으며, 및/또는 개체 또는 인간을 포함한 환자 및 특히 산업적으로 중요한 동물 또는 가축 동물인, 마우스, 쥐, 기니아 피그(guinea-pig), 토끼, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 원숭이, 비비원숭이(baboon), 및 침팬지에 한정하지 않지만, 이를 포함하는 임의의 다른 포유류 동물에서 이의 수술 후 재발을 방지하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 및 61 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 각각, HLA-A24 또는 HLA-A2 제한적 에피토프 펩티드 또는 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 후보자라는 것을 발견하였다. 따라서, 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 및 61의 아미노산 서열을 갖는 이러한 임의의 펩티드를 포함하는 본 발명의 약학적 제제는 특히 HLA 항원이 HLA-A24 또는 HLA-A2인 개체에 투여되는 것이 더욱 적합하다. 특히, 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16 및 17의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 제제는 HLA-A24형의 개체에 투여되는 것이 적합하고, 서열번호: 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 및 61의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 제제는 HLA-A2형의 개체에 투여되는 것이 적합하다. 동일한 것이 이러한 임이의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 약학적 제제 및 조성물에 적용된다.
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물에 의해서 치료될 수 있는 암 또는 종양은 WDRPUH가 관련된, 예를 들면, 간세포암을 포함하는 모든 종류의 암 또는 종양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 추가로 상기 언급한 활성 성분, 암성 세포에 대하여 CTL을 유도할 수 있는 능력이 가진 다른 펩티드, 상기 다른 펩티드를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드, 상기 다른 펩티드를 제시하는 다른 세포 등을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 암성 세포에 대하여 CTL을 유도할 수 있는 능력을 갖는 상기 다른 펩티드는 암 특이적 항원(예를 들면, 동정된 TAA)에 의해서 예시화되나, 이에 한정되지 않는다.
만약 필요하다면, 본 발명의 상기 약학적 제제 또는 조성물은 예를 들면, 본 발명의 임의의 펩티드와 같이, 물질이 활성 성분의 항종양 효과를 저해하지 않는 한, 선택적으로 활성 성분으로서 다른 치료학적 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 제형은 항염증성 약제, 진통제, 화학요법제 등을 포함할 수 있다. 약제 자체 내의 다른 치료학적 물질을 포함하는 것에 추가로, 본 발명의 상기 약제는 또한 하나 또는 다수의 다른 약학적 제제와 연속적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 약제 및 약학적 제제의 양은 예를 들면, 어떤 종류의 약학적 제제(들)가 사용되었는지, 치료되어야 할 질환, 및 투여 일정 및 경로 등에 따른다.
특히, 본 명세서에 언급된 성분에 추가로, 본 발명의 상기 약학적 제제 또는 조성물은 논의가 되는 형태의 제형을 갖는 당 업계의 종래 다른 제제를 포함할 수 있다고 이해된다.
본 발명의 하나의 실시예에서, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 제조의 물품 및 예를 들면, 암과 같은 치료될 질환의 병리학적인 조건을 치료하는데 유용한 물질을 포함하는 키트에 포함될 수 있다. 상기 제조의 물품은 라벨(label)을 갖는 본 발명의 임의의 약학적 제제의 용기(container)를 포함할 수 있다. 적합한 용기는 병, 바이얼(vial), 및 테스트 튜브를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플리스틱과 같은, 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 상기 용기 위의 라벨은 상기 약제 또는 조성물이 하나 또는 다수 조건의 질병의 치료 또는 예방을 위해서 사용된다는 것을 나타내야 한다. 또한, 상기 라벨은 투여 등에 대한 지시를 나타낼 수 있다.
상기 기재된 용기에 추가적으로, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물을 포함하는 키트는 약학적으로 허용가능한 희석제가 들어 있는 두 번째 용기를 선택적으로 추가하여 포함할 수 있다. 이는 다른 버퍼(buffer), 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 이용을 위한 지시가 있는 사용 설명서를 포함하는 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 제제 또는 조성물은, 가능하다면, 활성 성분을 포함하는 하나 또는 다수의 유닛 복용량 형태를 포함하는 팩(pack) 또는 디스펜서(dispenser) 장치에 제시될 수 있다. 상기 팩은, 예를 들면, 금속 또는 브리스터 팩(blister pack)과 같은, 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여를 위한 지시서와 수반될 수 있다.
(1) 활성 성분으로서 상기 펩티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물
본 발명의 상기 펩티드는 약학적 제제 또는 조성물로서, 만약 필요하다면, 종래의 제형 방법에 의해서 제형화된 것으로 직접적으로 투여될 수 있다. 후자의 경우, 본 발명의 펩티드에 추가로, 약물에 일반적으로 사용되는 담체, 첨가제 등을 특정한 제한 없이 포함할 수 있다. 이러한 담체의 예는 멸균수, 생리식염수, 인산 완충액, 배양액 등이 있다. 더욱이, 상기 약학적 제제 또는 조성물은 필요에 따라, 안정화제(stabilizer), 현탁액(suspension), 보존제(preservative), 계면활성제(surfactant) 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 제제 또는 조성물은 항암 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 생체 내(in vivo)에서 CTL을 유도하기 위하여, 본 발명의 상기 펩티드 둘 또는 그 이상으로 구성된 조합으로서 제조될 수 있다. 상기 펩티드 조합은 칵테일(cocktail)의 형태를 취할 수 있으며 또는 표준 기술을 이용하여 서로 결합될 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드는 화학적으로 연결되거나 또는 단일 융합 폴리펩티드 서열로서 발현될 수 있다. 상기 조합 내의 펩티드는 동일하거나 다를 수 있다. 본 발명의 펩티드를 투여함으로써, 상기 펩티드는 항원 제시 세포의 HLA 항원에 의하여 높은 농도로 제시된 뒤, 상기 나타난 펩티드와 HLA 항원 사이에 형성된 복합체에 대하여 특이적으로 반응하는 CTL이 유도된다. 대안적으로, 본 발명의 펩티드로 개체로부터 유래된 항원 제시 세포(예를 들면, DC)의 자극에 의해 수득될 수 있는, 본 발명의 임의의 펩티드를 그 세포 표면에 제시하는 항원 제시 세포는 개체에 투여될 수 있고, 그 결과, CTL이 개체 내에서 유도되고, 암 세포에 대한 공격성이 증가할 수 있다.
또한, 본 발명의 펩티드를 활성 성분으로 포함하는, 암 또는 종양의 치료 및/또는 예방을 위한 약학적 제제 또는 조성물은, 세포의 면역력을 효과적으로 확립시킨다고 알려진 보조제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 약학적 제제 또는 조성물은 다른 활성 성분과 함께 투여되거나 또는 과립으로 제조되어 투여될 수 있다. 보조제는 면역학적 활성을 갖는 단백질과 함께(또는 연속적으로) 투여되었을 때 상기 단백질에 대한 면역 반응을 강화시키는 화합물을 일컫는다. 본 명세서에서 보조제는 하기의 문헌에 기재된 바를 포함한다(Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). 적합한 보조제의 예로는 인산 알루미늄(aluminum phosphate), 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxide), 명반(alum), 콜레라 독소(cholera toxin), 살모넬라 독소(salmonella toxin) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
더욱이, 상기 펩티드가 미세한 마이크로미터 직경의 비드에 결합되어 있는 리포솜(liposome) 제형, 과립 제형, 및 지질이 상기 펩티드에 결합되어 있는 제형이 일반적으로 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 CTL을 개시하는(prime) 성분을 추가로 포함할 수 있다. 지질은 생체 내에서 바이러스 항원에서 CTL을 개시할 수 있는 제제로서 확인되었다. 예를 들면, 팔미트산(palmitic acid) 잔기는 엡실론(epsilon) -및 라이신 잔기의 알파-아미노 그룹에 붙을 수 있으며, 그 뒤 본 발명의 펩티드에 연결될 수 있다. 상기 리피드 펩티드는 그런 다음 리포솜에 결합되거나, 또는 보조제에 유화되어 미셀(micelle) 또는 입자(particle)로 직접적으로 투여될 수 있다. CTL 반응의 리피드 제조의 또 다른 예로서, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테인리세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl-seryl-serine, P3CSS)과 같은 E. coli 지질단백질은 적절한 펩티드에 공유 결합되었을 때, CTL을 개시하는데 사용될 수 있다(예를 들면, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4 참조).
투여의 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 등, 및 표적 위치에 근접한 곳에 전신 투여 또는 국소 투여할 수 있다. 상기 투여는 단일 투여 또는 다수의 투여에 의해서 부스팅되어 수행될 수 있다. 본 발명의 펩티드의 복용량은 치료되는 질병, 환자의 나이, 체중, 투여 방법 등에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 보통 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎, 예를 들면, 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎, 예를 들면, 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎이며, 며칠 내지 몇 달에 한 번씩 투여될 수 있다. 당업자는 적합한 복용량을 적절하게 선택할 수 있다.
(2) 유효 성분으로서 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물
또한, 상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 본 명세서에 기재된 발현할 수 있는 형태의 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 여기서, 상기 구문 "발현할 수 있는 형태"는 상기 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되었을 때, 항종양 면역력을 유도하는 폴리뉴클레오티드로서 생체 내(in vivo)에서 발현할 수 있음을 의미한다. 예시된 실시예에서, 관심있는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 상기 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 조절 요소(regulatory element)를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드(들)는 표적 세포의 게놈 내에 안정적으로 삽입되기 위하여 구비될 수 있다(예를 들면, 상동성 재조합 카세트 벡터에 대한 기술을 위한 Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 참조). 예를 들면, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; 미국 특허 제 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; 및 WO 98/04720을 참조한다. DNA 기반한 전달 기술의 예로는 "네이키드 DNA(naked DNA)", 촉진된(부피바카인(bupivacaine), 폴리머(polymer), 펩티드-매개) 전달, 양이온성 지질 복합체, 및 입자-매게("유전자 총(gene gun)") 또는 압력-매개 전달(예를 들면, 미국 출원 제 5,922,687호 참조)을 포함한다.
또한, 상기 발명의 펩티드는 바이러스 또는 박테리아 벡터에 의해서 발현될 수 있다. 발현 벡터의 예는 백시니아(vaccinia) 또는 계두(fowlpox)와 같은 강화된 바이러스 숙주를 포함한다. 이러한 접근은, 예를 들면, 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터와 같은, 백시니아 바이러스의 이용을 수반한다. 숙주에 도입한 후, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 상기 면역원성 펩티드를 발현하고, 이로 인하여 면역 반응이 유발된다. 면역화 프로토콜에 있어서 유용한 백시니아 벡터 및 방법은 예를 들면, 미국 특허 제 4,722,848호에 기재된다. 또 다른 벡터는 BCG(Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60에 기재된다. 치료학적 투여 또는 면역화에 유용한 다양한 다른 벡터, 예를 들면, 아데노(adeno) 및 아데노 관련(adeno-associated) 바이러스 벡터, 레트로바이러스(retroviral) 벡터, 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 벡터, 무독화시킨 탄저균 독소(detoxified anthrax toxin) 벡터 등이 명백할 것이다. 예를 들면, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85를 참조한다.
폴리뉴클레오티드의 개체로의 전달은, 상기 개체가 폴리뉴클레오티드를 운반하는 벡터에 직접적으로 노출시키는 직접적, 또는 세포가 우선 시험관 내에서 관심있는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 형질전환된 후, 상기 세포를 개체에게 이식하는 간접적으로 이루어질 수 있다. 이러한 두 가지 접근은 각각 생체 내(in vivo) 및 생체 외(ex vivo) 유전자 치료법으로서 알려져 있다.
유전자 치료 방법에 대한 일반적인 리뷰는, Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215를 참조한다. 본 발명에서 또한 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야의 일반적으로 알려진 방법은 eds. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; 및 Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990에 기재된다.
투여의 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 주사 등을 할 수 있으며, 표적 위치에 근접한 곳에 전신 투여 또는 국소 투여의 용도를 발견한다. 상기 투여는 단일 투여 또는 다수의 투여에 의해서 부스팅되어 수행될 수 있다. 적합한 수용체 내 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포의 양은 치료되는 질병, 환자의 나이, 체중, 투여 방법 등에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 보통 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎이며, 예를 들면, 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎, 예를 들면, 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎이며, 며칠 내지 몇 달에 한 번씩 투여될 수 있다. 당업자는 적합한 복용량을 적절하게 선택할 수 있다.
X. 펩티드, 엑소솜 , APCs 및 CTLs 을 사용한 방법
본 발명의 펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 항원 제시 세포 및 CTL을 유도하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 엑소솜 및 항원 제시 세포는 CTL을 유도하는데 사용될 수 있다. 상기 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소솜 및 항원 제시 세포는 화합물이 이들의 CTL 유도성을 억제하지 않는 한, 임의의 다른 화합물과 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 언급한 임의의 약학적 제제 또는 조성물은 CTL을 유도하는데 사용될 수 있으며, 이에 추가적으로, 상기 펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물은 또한 하기 기재된 항원 제시 세포를 유도하는데 사용될 수 있다.
(1) 항원 제시 세포(APCs)를 유도하는 방법
본 발명은 상기 펩티드 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 이용하는 높은 CTL 유도성을 가진 항원 제시 세포를 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 방법은 생체 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 또는 시험관 내(in vivo)에서 본 발명의 펩티드를 가진 항원 제시 세포를 접촉하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 생체 외(ex vivo)에서 펩티드를 가진 항원 제시 세포를 접촉하는 방법은 상기 단계를 포함할 수 있다.:
a: 개체로부터 항원 제시 세포를 수집하는 단계; 및
b: 펩티드와 함께 단계 (a)의 항원 제시 세포를 접촉하는 단계.
상기 항원 제시 세포는 특정 종류의 세포에 한정되지 않으나, 림프구에 의해서 인식되기 위하여 그들의 세포 표면에 단백질 항원을 제시하는 것으로 알려져 있는, 수지상 세포(DCs), 랑게르한스 세포(Langerhans cell), 대식세포, B 세포, 및 활성화된 T 세포를 포함한다. 가급적으로, 수지상 세포는 항원 제시 세포 가운데 강력한 CTL 유도성을 가지기 때문에 사용될 수 있다. 본 발명의 임의의 펩티드는 본 발명의 다른 펩티드와 함께 또는 그들 자신에 의해 사용될 수 있다.
대안적으로, 항원 제시 세포는 생체 내(in vivo)에 항원 제시 세포를 가진 펩티드와 접촉하는 개체에 본 발명의 펩티드를 투여함으로써 유도될 수 있고, 결과적으로 개체의 체내에 높은 CTL 유도성을 가진 항원 제시 세포를 유도한다. 따라서, 본 발명은 또한 항원 제시 세포를 유도하기 위한 개체에 본 발명의 펩티드를 투여하는 것을 고려한다. 또 다른 방법으로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 생체 내(in vivo)에 항원 제시 세포를 가진 펩티드와 접촉하거나 본 발명의 펩티드를 발현하는 발현 형태(expressible form)에 개체를 투여할 수도 있다. 본 발명의 펩티드의 투여와 유사하게, 높은 CTL 유도성을 가진 항원 제시 세포는 개체의 체내에서 유도된다. 따라서, 본 발명은 또한 항원 제시 세포를 유도하기 위한 개체에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것이 고려된다. "발현 형태(expressible form)"의 구 설명에 대해서는 "IX. 약학적 제제 (2) 활성 성분으로서 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 제제" 부분을 참조하라.
더욱이, 본 발명 또한 CTL 유도성을 가진 항원 제시 세포를 유도하기 위해 항원 제시 세포 안으로 본 발명의 폴리펩티드를 유입하는 것을 고려한다. 예를 들면, 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
a: 개체로부터 항원 제시 세포를 수집하는 단계; 및
b: 수집된 항원 제시 세포 안으로 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유입하는 단계.
상기 단계 (b)는 "VI. 항원 제시 세포" 부분에 기재된 바에 따라 수행될 수 있다.
(2) CTL을 유도하는 방법
더욱이, 본 발명은 상기 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 엑소솜 또는 본 발명의 항원 제시 세포를 이용하는 CTL를 유도하는 방법을 제공한다.
개체에 본 발명의 상기 펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드, 항원 제시 세포, 또는 엑소솜의 투여 후 CTL은 암 세포를 표적하는 면역 반응을 강화하기 위해서 개체의 체내에 유도된다. 따라서, 개체에 본 발명의 상기 펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드, 항원 제시 세포 또는 엑소솜을 투여하는 단계를 포함하는 방법인 CTL를 유도하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 다른 목적이다.
대안적으로, CTL은 또한 생체 외(ex vivo)에서 유도될 수 있고, 유도된 후에, 활성화된 CTL는 개체에 돌아갈 수도 있다. 예를 들면, 상기 방법은 다음의 단계를 포함할 수도 있다:
a: 개체로부터 항원 제시 세포를 수집하는 단계;
b: 단계 a의 항원 제시 세포와 본 발명의 펩티드를 접촉하는 단계; 및
c: 단계 b의 항원 제시 세포와 CD8-양성 세포를 공동 배양하는 단계.
위의 단계 c에서 CD8-양성 세포와 공동 배양된 항원 제시 세포는 상기 "VI. 항원 제시 세포" 부분에 기재된 바와 같이 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 항원 제시 세포 내로 전이시킴으로써 제조될 수 있으나; 이에 한정되지 않고 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이것의 표면에 효율적으로 제시하는 임의의 항원 제시 세포는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
앞에 언급한 항원 제시 세포 대신에, 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 그것들의 표면에 제시하는 엑소솜 또한 사용될 수 있다. 즉, CTL를 유도하는 본 발명 방법은 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 이것의 표면에 제시하는 엑소솜을 공동 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기의 엑소솜은 "V. 엑소솜" 부분에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다.
게다가, CTL는 CD8-양성 세포 안으로 본 발명의 펩티드와 결합하는 TCR 소단위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유입함으로써 유도될 수 있다. 상기의 형질도입은 "VIII. T 세포 수용체(TCR)" 부분에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
(3) 면역 반응을 유도하는 방법
나아가 본 발명은 개체의 암에 반하여 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 방법은 다음을 포함하는 본 발명의 백신의 투여를 포함한다:
(a) 하나 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드 또는 상기의 면역적으로 활성된 단편;
(b) 하나 또는 그 이상의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 (a)의 면역적으로 활성된 단편;
(c) 하나 또는 그 이상의 본 발명의 분리된 CTL; 또는
(d) 하나 또는 그 이상의 본 발명의 분리된 항원-제시 세포.
본 발명에서, WDRPUH를 과 발현하는 암은 그것들의 활성 성분으로 치료될 수 있다. 따라서, 활성 성분을 구성하는 약학적 성분 또는 백신의 투여 이전에, 치료된 암 세포 또는 조직의 WDRPUH의 발현 정도가 같은 장기의 정상 세포와 비교해서 향상되었는지를 확인하는 것이 선호된다. 따라서, 하나의 전형에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함할 수 있는 WDRPUH를 발현하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
i) 치료된 암을 지닌 개체로부터 수득한 암 세포 또는 조직에서 WDRPUH의 발현 정도를 알아내는 단계;
ii) 정상 대조군과 함께 WDRPUH의 발현 정도를 비교하는 단계; 및
iii) 정상 대조군과 비교하여 WDRPUH를 과발현하는 암을 지닌 개체에 상기에 설명된 (a) 내지 (d)를 구성하는 그룹으로부터 선별된 적어도 하나의 성분을 투여하는 단계.
대안적으로 본 발명은 또한 WDRPUH를 과발현하는 암을 가진 개체에 투여하는 것에 이용하기 위한 상기에 설명된 (a) 내지 (d)를 구성하는 그룹으로부터 선별된 적어도 하나의 성분을 구성하는 약학적 성분 또는 백신을 제공한다. 다시 말해서, 더 나아가 본 발명은 본 발명의 WDRPUH 폴리펩티드로 치료된 개체를 확인하기 위한 방법을 제공하고, 그 방법은 개체로부터 유래된 암 세포 또는 조직의 WDRPUH의 발현 정도를 결정하는 단계를 포함할 수 있고, 그 점에서 유전자의 정상 대조군 수준과 비교된 정도의 증가는 개체가 본 발명의 WDRPUH 폴리펩티드로 치료될 수 있는 암을 가진다는 것을 나타낸다. 본 발명의 암 치료 방법은 하기에 좀 더 상세히 설명할 것이다.
본 발명에 의해 치료된 개체는 포유동물이 선호된다. 모범적인 포유동물은 예를 들어, 인간, 인간이 아닌 영장류, 마우스, 쥐, 개, 고양이, 말, 및, 소를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 의하면, 개체로부터 수득한 암 세포 또는 조직의 WDRPUH의 발현 수준이 측정된다. 발현 수준은 당 업계에 밝혀진 방법을 이용하여 전사 (핵산) 생산물 정도로 측정될 수 있다. 예를 들면, WDRPUH의 mRNA는 혼성화 방법 (예를 들면, 노던 혼성화(Northern hybridization))으로부터 프로브(probe)를 이용하여 수량화할 수 있다. 이 검출은 어레이(array) 또는 칩(chip)으로 수행될 수 있다. 어레이의 이용은 WDRPUH의 발현 수준을 검출하는 것에 선호된다. 이러한 당 업계의 기술은 WDRPUH의 서열 정보를 이용하는 다음과 같은 프로브를 제시할 수 있다. 예를 들면, WDRPUH의 cDNA는 프로브로서 사용될 수 있다. 필요하면, 프로브는 염색제(dye), 형광 물질 및 이소토프(isotope)과 같은 적당한 라벨(label)로 라벨될 수 있고, 유전자 발현 수준은 혼성화된 라벨의 강도로서 검출될 수 있다. 게다가, WDRPUH (서열번호: 63)의 전사 생산물은 증폭-기본의(amplification-based) 검출 방법(예를 들면, RT-PCR)에 의해 프라이머(primer)를 이용하여 수량화할 수 있다. 이와 같은 프라이머는 유전자의 이용 가능한 서열 정보에 기초를 두고 제시될 수 있다.
특별히, 본 방법에 이용된 프로브 또는 프라이머는 WDRPUH의 mRNA의 엄격한, 적정히 엄격한, 또는 낮은 엄격한 조건 아래 혼성화한다. 여기에 사용된 것으로서, "엄격한 (혼성화) 조건" 구문은 아래에 조건을 언급한다. 프로브 또는 프라이머는 이에 한정하지 않지만, 이것의 표적 서열을 혼성화할 것이다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 다른 상황 아래에 다를 것이다. 긴 서열의 특이적 혼성화는 짧은 서열의 혼성화보다 높은 온도에서 관찰되었다. 일반적으로, 엄격한 조건의 온도는 정의된 이온의 강도, pH의 특이적 서열을 위한 열의 녹는점(Tm)보다 섭씨 5도 낮은 것으로 선별되었다. Tm은 (정의된 이온의 강도, pH 및 핵산 농도 아래에) 표적 서열에 상보적인 프로브의 50%는 평형 상태의 표적 서열로 혼성화하는 온도이다. 표적 서열은 일반적으로 초과량, Tm을 제시하기 때문에 프로브의 50%는 평형상태를 차지한다. 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도는 나트륨 이온 1.0 M보다 낮아야하고, 전형적으로 pH 7.0 에서 8.3의 0.01 에서 나트륨 이온 1.0 M(또는 다른 염)이고 온도는 짧은 프로브 또는 프라이머 (예를 들면, 10 에서 50의 뉴클레오티드)에선 적어도 섭씨 30도이고, 긴 프로브 또는 프라이머는 적어도 섭씨 60도일 것이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드(formamide)와 같은, 불안정한 제제의 첨가로 성취될 수 있다.
대안적으로, 번역 생산물은 본 발명의 진단에 의해 검출될 수 있다. 예를 들면, WDRPUH 단백질 (서열번호: 64)의 양은 측정될 수 있다. 번역 생산물에서 단백질의 양을 측정하는 방법은 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하는 면역분석 방법을 포함한다. 항체는 단일 클론일 수도 있다. 게다가, 단편 또는 변형된 항체가 WDRPUH 단백질과 결합할 수 있는 능력을 유지하는 한 임의의 단편 또는 항체의 변형(예를 들면, 중미 항체(chimeric antibody), scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등.)은 검출에 이용될 수 있다. 단백질 검출을 위한 항체의 이러한 종류를 제시하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있고, 임의의 방법은 다음과 같은 항체 및 그것의 동등한 것을 제시하기 위해 본 발명에 이용될 수 있다. 이것의 번역 생산물을 기초로 WDRPUH 유전자의 발현 수준을 검출하는 다른 방법으로서, 염색의 강도는 WDRPUH 단백질에 반하는 항체를 이용한 면역조직화학(immunohistochemical) 분석을 통해 관찰될 수도 있다. 즉, 강한 염색의 관찰은 단백질의 증가된 제시, 동시에, WDRPUH 유전자의 높은 발현 수준을 나타낸다.
만일 예를 들면, 10%, 25%, 또는 50%로 표적 유전자에 상응하는 대조군 수준으로부터 증가하거나; 또는 1.1 폴드(fold) 이상, 1.5 폴드 이상, 2.0 폴드 이상, 5.0 폴드 이상, 10.0 폴드 이상, 또는 그 이상으로 증가하면 암 세포에서 WDRPUH 유전자를 포함하는 표적 유전자의 발현 수준은 증가하는 것으로 고려될 수 있다.
대조군 수준은 개체의 질병 상태(암에 걸렸거나 또는 암에 걸리지 않았거나)가 알려진 개체로부터 이전에 수집되거나 저장되어 있는 표본을 이용함으로써 암 세포와 동시에 측정될 수 있다. 게다가, 정상 세포는 정상 대조군으로 사용할 수 있는 치료된 암을 지닌 장기의 암에 걸리지 않은 부분으로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 대조군 수준은 질병 상태가 알려진 개체로부터 표본의 WDRPUH 유전자의 이전에 측정된 발현 수준을 분석하는 것에 의해 수득된 결과를 기초로 하는 통계적 방법에 의해 측정될 수 있다. 더욱이, 대조군 수준은 이전에 실험된 세포로부터 발현 양상의 데이터베이스(database)가 될 수 있다.
게다가, 본 발명의 양상에 의하면, 생물학적 표본의 WDRPUH 유전자의 발현 수준은 다수의 참고 표본으로부터 측정된 대조군 수준인 다수의 대조군 수준과 비교되될 수 있다. 개체 유래된 생물학적 표본의 것과 비슷한 조직 유형으로부터 유래된 참고 표본으로부터 측정된 대조군 수준을 이용하는 것이 선호된다. 게다가, 알려진 질병 상태를 지닌 인구의 WDRPUH 유전자의 발현 수준의 기준치를 이용하는 것이 선호된다. 기준치는 당 업계에 알려진 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 평균 +/- 2의 기준치 또는 평균 +/- 3의 기준치의 범위가 기준치로 이용될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 암이 갖지 않은 것으로 알려진 생물학적 표본으로부터 측정된 대조군 수준은 "정상 대조군 수준"으로 언급한다. 반대로, 만일 대조군 수준이 암을 갖는 생물학적 표본으로부터 측정된다면, 이것은 "암을 갖는 대조군 수준"으로 언급한다.
WDRPUH 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 수준과 비교하여 증가하거나 암을 갖는 대조군 수준과 비슷하게 나오면, 개체는 치료된 암으로 진단될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 WDRPUH 폴리펩티드로 치료할 수 있는 암을 앓고 있는 개체를 측정하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 또한 암의 면역치료의 효율성을 평가 및/또는 관찰하는데 유용할 수 있다. 가급적으로, 암은 간세포암이다. 좀더 특별히, 키트는 선호적으로 적어도 개체 유래된 암 세포의 WDRPUH 유전자의 발현을 검출하기 위한 하나의 시약을 포함한다. 이 시약은 다음의 그룹으로부터 선별될 수 있다.:
(a) WDRPUH 유전자의 mRNA를 검출하기 위한 시약;
(b) WDRPUH 단백질을 검출하기 위한 시약; 및
(c) WDRPUH 단백질의 생물학적 활성을 검출하기 위한 시약.
WDRPUH 유전자의 mRNA를 검출하기 위한 적합한 시약은 WDRPUH mRNA의 부분에 상보적 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 같은 WDRPUH mRNA을 특이적으로 확인하거나 또는 결합하는 핵산을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 이러한 종류는 WDRPUH mRNA에 특이적인 프라이머 및 프로브로부터 예시화될 수 있다. 필요하다면, WDRPUH mRNA를 검출하기 위한 시약은 고체 매트릭스(matrix)에 고정화될 수 있다. 게다가, WDRPUH mRNA를 검출하기 위한 하나 이상의 시약은 키트에 포함될 수 있다.
반면에, WDRPUH 단백질을 검출하기 위한 적합한 시약은 WDRPUH 단백질에 대한 항체를 포함한다. 항체는 단일 클론 또는 다 클론일 수 있다. 더욱이, 항체의 변형(예를 들면, 중미 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등.) 또는 임의의 단편은 단편 또는 변형된 항체가 WDRPUH 단백질과 결합 능력을 유지하는 한 시약으로서 이용될 수 있다. 단백질을 검출하기 위한 항체의 이러한 종류를 제시하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있고, 임의의 방법은 다음과 같은 항체 및 그것의 동등한 것을 제시하기 위해 본 발명에 이용될 수 있다. 더욱이, 항체는 직접적 연결 또는 간접적인 라벨링(labeling) 기술을 통하여 신호 발생(generating) 분자로 라벨될 수 있다. 라벨 및 항체에 라벨링하는 방법 및 그들의 표적에 항체의 결합을 검출하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있고, 임의의 라벨 및 방법은 본 발명에 이용할 수 있다. 게다가, WDRPUH 단백질을 검출하기 위한 하나 이상의 시약은 상기 키트 안에 포함될 수 있다.
상기 키트는 앞서 언급한 시약의 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 조직 표본이 암을 앓고 있는 개체로부터 수득 되거나 또는 유용한 대조군 시약으로서 역할을 못 할 수도 있다. 본 발명의 키트는 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 이용을 위한 지시가 있는 사용 설명서(예를 들면, 서면, 테이프(tape), CD-ROM, 등.)를 포함하는 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 시약 및 상기 언급한 것은 라벨이 있는 용기에 유지될 수 있다. 적합한 용기(container)는 병, 바이얼(vial), 및 테스트 튜브(test tube)를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은, 다양한 물질로부터 형성될 수 있다.
본 발명의 전형으로서 시약이 WDRPUH mRNA에 대한 프로브일 때 시약은 적어도 하나의 검출 위치를 형성하기 위해 다공성 스트립(strip)과 같은 고체 매트릭스에 고정화될 수 있다. 다공성 스트립의 측정 또는 검출 부분은 각 핵산(프로브)를 포함하는 다수의 위치를 포함할 수 있다. 또한, 실험 스트립(test strip)은 음성 및/또는 양성 대조군의 위치를 포함할 수 있다. 대안적으로, 대조군 위치는 실험 스트립으로부터 분리된 스트립에 위치할 수 있다. 추가적으로, 다른 검출 위치는 고정화된 핵산의 다른 양 즉, 첫 번째 검출 위치는 좀 더 많은 양을 그리고 다음 위치는 적은 양을 포함할 수 있다. 실험 표본의 많은 추가로, 검출 가능한 신호를 나타내는 위치의 수는 표본에 있는 WDRPUH mRNA의 양적인 표시를 제공한다. 검출 위치는 임의의 적합하게 검출 가능한 모양으로 구성될 수 있고 그 모양은 실험 스트립의 넓이에 걸치는 막대기 또는 점의 모양이 전형적이다.
본 발명의 키트는 더 나아가 양성 대조군 표본 또는 WDRPUH 기준 표본을 포함할 수 있다. 본 발명의 양성 대조군 표본은 WDRPUH 양성 표본을 연결하는 것에 의해 제시될 수 있고 그런 다음 이들 WDRPUH 수준은 분석될 수 있다. 대안적으로, 정제된 WDRPUH 단백질 또는 폴리뉴클레오티드는 양성 표본 또는 WDRPUH 기준을 이루기 위해 WDRPUH를 발현하지 않는 세포를 첨가할 수 있다. 본 발명에서, 정제된 WDRPUH는 재조합된 단백질일 수 있다. 양성 대조군 표본의 WDRPUH 수준은, 예를 들면, 차단된 가치 이상이다.
하기 실시예들은 본 발명을 예시하고, 당업자가 이를 만들고 사용하는 것을 도와주기 위하여 제시된다. 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 어느 방법으로든 한정하려는 의도가 아니다.
[실시예]
재료 및 방법
세포주
A24 림포블라스토이드 세포주(A24 lymphoblastoid cell line, A24LCL)는 엡스테인 바(Epstein-bar) 바이러스를 HLA-A24 양성 인간 B 림프구에 형질전환함으로써 확립하였다. T2(HLA-A2), COS7, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주(african green monkey kidney cell line)는 ATCC에서 구입하였다.
WDRPUH 로부터 유래된 펩티드의 후보자 선택
HLA-A*2402 및 HLA-A*0201 분자에 결합하는 WDRPUH로부터 유래된 9머(9-mer) 및 10-머(10-mer) 펩티드는 결합 예측 소프트웨어 "BIMAS"(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind) (Parker et al.(J Immunol 1994, 152(1): 163-75), Kuzushima et al.(Blood 2001, 98(6): 1872-81))를 사용하여 측정되었다. 이러한 펩티드는 표준 고체상 합성 방법에 따라 Sigma(Sapporo, Japan) 또는 Biosynthesis Inc.(Lewisville, TX)에 의해서 합성되었으며, 역상 고속액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatographym, HPLC)에 의해서 정제되었다. 상기 펩티드의 순도(>90%) 및 동정은 각각 분석적인 HPLC 및 질량분석법 분석에 의하여 측정되었다. 펩티드는 20 mg/㎖ 디메틸폭시화물(dimethylsulfoxide, DMSO)에 녹인 뒤 -80℃에 보관하였다.
시험관 내( In vitro ) CTL 유도
단핵구 유래 수지상 세포(DC)는 인간 백혈구 항원(HLA)에 제시된 펩티드에 대하여 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 유도하기 위하여, 항원 지시 세포(APC)로서 사용되었다. DC는 하기 기재된 바와 같이 시험관 내에서 생성되었다(Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8). 구체적으로, 정상 지원자(HLA-A*2402 양성 및 HLA-A*0201 양성)로부터 피콜-플라크(Ficoll-Plaque)(Pharmacia) 용액에 의해서 분리된 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)는 단핵구 분획을 강화시키기 위하여, 플라스틱 조직 배양 디쉬(Becton Dickinson)에 부착에 의해서 분리하였다. 상기 단핵구가 강화된 집단은 2% 열-불활성화 자가조직 유래의 혈청(AS)을 포함하는 AIM-V 배지(Invitrogen)에서 과립구-대식세포 콜리니-자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)(R&D System) 1000 U/㎖ 및 인터루킨(interleukin, IL)-4(R&D System) 1000 U/㎖의 존재하에 배양되었다. 배양 7일 후, 상기 사이토카인 유도된 DC는 37℃에서 3시간 동안 베타 2-마이크로불린(beta2-microglobulin) 3 icro-g/㎖의 존재하에 AIM-V 배지에서 20 icro-g/㎖의 각각의 합성된 펩티드를 사용하여 펄스되었다. 상기 생성된 세포는 이러한 세포의 표면에, CD80, CD83, CD86 및 HLA 클래스 Ⅱ와 같은 DC-관련된 분자를 발현한다고 나타났다(결과는 보이지 않음).
그리고 이러한 펩티드 펄스된 DCs는 미토마이신 C(Mitomycin C, MMC)(30분 동안 30 icro-g/㎖) 또는 X-irradiation (20 Gy)에 의해서 비활성화되었으며 CD8 양성 분리 키트(Dynal)를 이용한 양성 선택에 의해서 획득된, 자가 조직의 CD8+ T 세포와 1:20의 비율로 혼합되었다. 이러한 배양은 48-웰 플레이트(Corning)에 셋팅되었다; 각각의 웰에는 1.5 × 104 펩티드 펄스된 DCs, 3 × 105 CD8+ T 세포 및 10 ng/㎖ IL-7(R&D System)이 있는 0.5 ㎖ AIM-V/2% AS 배지가 포함되었다. 3일이 지난 후, 이러한 배양은 최종 농도가 20 IU/㎖이 되도록 IL-2(CHIRON)을 첨가하였다. 7일 및 14일에, 상기 T 세포는 상기 자가의 펩티드 펄스된 DCs를 사용하여 추가적으로 자극되었다. 상기 DC는 상기 기재된 단계를 따라서 매번 제조되었다. CTL은 21일째 펩티드 자극 3회 이후, 펩티드 펄스된 A24LCL 또는 T2 세포에 대하여 실험하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).
CTL 증폭 과정
CTLs은 Riddell et al.에 의해서 기재된 방법과 유사한 방법을 사용하여, 배양액에서 증폭되었다(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23). 전체 5 × 104 CTLs은 항-CD3 단일클론 항체(Pharmingen) 40 ng/㎖의 존재하에서, 미토마이신 C에 의해서 비활성화된 2 종류의 인간 B-림포블라스토이드(lymphoblastoid) 세포주를 이용하여 AIM-V/5% AS 배지 25 ㎖에 현탁하였다. 상기 배양 시작 이후 첫째 날, IL-2 120 IU/㎖을 상기 배양액에 첨가하였다. 상기 배양액은 5, 8 및 11일에, IL-2 30 IU/㎖을 포함하는 신선한 AIM-V/5% AS 배지가 공급되었다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).
CTL 클론의 확립
96 둥근 바닥 마이크로 타이터 플레이트(96 round-bottomed micro titer plate)(Nalge Nunc International)에 0.3, 1, 및 3 CTLs/웰이 되도록 희석하였다. CTLs은 5% AS가 포함된 총 150 micro-l/웰의 AIM-V 배지에서 1 × 104 세포수/웰의 2 종류의 인간 B-림포블라스토이드 세포주, 항-CD3 항체 30 ng/㎖ 및 IL-2 125 U/㎖과 함께 배양하였다. 125 U/㎖ IL-2로 최종 농도를 맞추기 위하여 10일 뒤 50 micro-l/웰의 IL-2를 상기 배지에 첨가하였다. CTL 활성은 14일째 날에 측정하였고, CTL 클론은 상기 기재된 같은 방법을 사용하여 증폭하였다(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).
특이적 CTL 활성
특이적 CTL 활성을 검사하기 위하여, 인터페론(IFN)-감마 효소-결합 면역스팟(ELISPOT) 분석 및 IFN-감마 효소-결합 면역흡착검사(ELISA)를 수행하였다. 구체적으로, 펩티드 펄스된 A24LCL(1 × 104/웰) 또는 T2(1 × 104/웰)는 자극(stimulator) 세포로서 제조되었다. 48 웰에서 배양된 세포는 반응(responder) 세포로서 사용되었다. IFN-감마 ELISPOT 분석 및 IFN-감마 ELISA 분석은 제조사의 추천된 과정에 따라 수행되었다.
플라스미드 형질도입( Plasmid transfection )
표적 유전자의 open reading frames을 암호화 하는 cDNA, HLA-A24 및 HLA-A*0201은 PCR에 의해 증폭되었다. 표적 유전자의 PCR-증폭된 생산물 및 HLA-A24 또는 HLA-A*0201은 pIRES 벡터(vector) (Clontech Laboratories, Inc., Cat. No. 631605) 안으로 복제되었다. 상기 플라스미드(plasmid)는 HLA-A24-null 세포주 및 표적 유전자인 COS7안으로 제조사의 추천 과정에 따라 lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 형질도입되었다. 형질도입한 것으로부터 이틀 후, 형질도입된 세포는 versene (Invitrogen)으로 수거하였고 CTL 활성 분석을 위해 표적 세포(5 × 104 세포/웰)을 사용하였다.
결과
WDRPUH 로부터 유래된 HLA -A24 및 HLA -A2 결합 펩티드의 예측
표 1은 높은 결합 친화성을 위해 WDRPUH의 펩티드와 결합한 HLA-A24를 보여준다. 잠재적 HLA-A24 결합 능력을 가진 총 25 펩티드는 에피토프 펩티드(표 1)를 측정하기 위해 선별되고 검사되었다. 표 2는 높은 결합 친화성을 위해 WDRPUH의 9을 가진 총 36 펩티드는 에피토프 펩티드(표 2)를 측정하기 위해 선별되고 검사되었다.
Figure 112011047207422-pct00001
시작 위치는 WDRPUH의 N-말단으로부터의 아미노산 잔기의 수를 나타낸다.
결합 수치는 "BIMAS"로부터 유래한다.
Figure 112011047207422-pct00002
시작 위치는 WDRPUH의 N-말단으로부터의 아미노산 잔기의 수를 나타낸다.
결합 수치는 "BIMAS"로부터 유래한다.
HLA -A*2402에 의해 제한된 WDRPUH 로부터 예측되는 펩티드에 의한 CTL 유도 및 WDRPUH 유래 펩티드로 자극된 CTL 라인 확립
이러한 WDRPUH로부터 유래된 펩티드에 대한 CTL은 "재료 및 방법"에 기재된 프로토콜에 따라 생성되었다. 펩티드 특이적 CTL 활성은 IFN-감마 ELISPOT 분석(도 1a~f)에 의해 결정되었다. WDRPUH-A24-9-40 (서열번호: 1)로 자극된 번호 #3 및 #6 (a), WDRPUH-A24-9-314 (서열번호: 2)로 자극된 번호 #8 (b), WDRPUH-A24-9-509 (서열번호: 3)로 자극된 번호 #2 및 #6 (c), WDRPUH-A24-9-339 (서열번호: 4)로 자극된 번호 #1, #2 및 #5 (d), WDRPUH-A24-10-409 (서열번호: 16)로 자극된 번호 #2, #3, #4, #6, #7 및 #8 (e) 및 WDRPUH-A24-10-40 (서열번호: 17)로 자극된 번호 #5, #6 및 #8 (f)는 대조군 웰에 비하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타냄을 보였다.
더욱이 서열번호: 1로 자극된 양성 웰 번호 #6, 서열번호: 2로 자극된 양성 웰 번호 #8, 서열번호: 3로 자극된 양성 웰 번호 #2, 서열번호: 4로 자극된 양성 웰 번호 #5, 서열번호: 16로 자극된 양성 웰 번호#4 및 서열번호: 17로 자극된 양성 웰 번호 #6의 세포는 증폭되어 CTL 라인을 확립하였다. 상기 CTL 라인의 CTL 활성은 IFN-감마 ELISA 분석에 의해 측정되었다(도 2a-f). 모든 CTL 라인이 펩티드 펄스 하지 않은 표적 세포에 비하여, 이에 상응하는 펩티드로 펄스된 표적 세포에 대하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타내었다. 반면에, 상기 펩티드가 HLA-A*2402과 결합 활성을 가질 것으로 예견되어 있음에도 불구하고, 표 1에서 나타낸 다른 펩티드를 이용한 자극에 의해서는 CTL 라인이 확립되지 않았다(결과는 보여주지 않음). 결과적으로, WDRPUH로부터 유래된 6개의 펩티드 는 강력하게 CTL 라인을 유도할 수 있는 펩티드로서 스크린 되었다.
WDRPUH 및 HLA -A*2402를 외인성으로 발현하는 표적 세포에 반하는 특이적 CTL 활성
본 발명의 펩티드에 반하여 발생한 상기 확립된 CTL은 WDRPUH 및 HLA-A*2402 분자를 내인성으로 발현하는 표적 세포를 인식하는 그들의 능력에 대해 검사하였다. 전장의 WDRPUH 및 HLA-A*2402 분자 유전자(WDRPUH 및 HLA-A*2402 유전자를 외인성으로 발현하는 표적 세포를 위한 특이적 모델) 모두를 형질 도입한 COS7 세포에 반한 특이적 CTL 활성은 상응하는 펩티드에 의해 발생한 CTL 라인을 이펙터 세포(the effecter cell)로서 이용하여 시험하였다. 전장의 WDRPUH 유전자 또는 HLA-A*2402 중 하나로 형질도입된 COS7 세포는 대조군으로써 제작되었다. 도 3에 있어서, 서열번호: 2로 자극된 CTL은 WDRPUH 및 HLA-A*2402를 모두 발현하는 COS7 세포에 반하여 강력한 CTL 활성을 나타냈다. 반면에, 상기 대조군에 반하여는 유의적인 특이적 CTL 활성이 검출되지 않았다. 따라서 이러한 데이터는 HLA-A*2402 분자와 함께 표적 세포의 표면에 자연적으로 프로세스되고 제시되고 CTL에 의해 인식된다는 것을 나타낸다. 상기 결과는 WDRPUH로부터 발생한 이러한 펩티드가 WDRPUH가 발현되는 종양을 갖는 환자에 위한 암 백신으로 적용할 수 있음을 나타낸다.
HLA -A*0201로 제한된 WDRPUH 로부터, 예견된 펩티드의 CTL 유도성
WDRPUH로부터 유래된 펩티드를 인식하는 CTL는 "재로 및 방법"에 설명된 프로토콜(the protocol)에 따라 만들었다. 펩티드 특이적 CTL 활성은 IFN-감마 ELISPOT 분석(도 4a-1)으로 측정했다. WDRPUH-A2-9-39 (서열번호: 30)로 자극된 웰 번호 #2 및 #7 (a), WDRPUH-A2-9-407 (서열번호: 31)로 자극된 웰 번호 #2 (b), WDRPUH-A2-9-288 (서열번호: 34)로 자극된 웰 번호 #3 (c), WDRPUH-A2-9-237 (서열번호: 36)로 자극된 웰 번호 #6 (d), WDRPUH-A2-9-543 (서열번호: 37)로 자극된 웰 번호 #4 (e), WDRPUH-A2-10-570 (서열번호: 40)로 자극된 웰 번호 #4 (f), with WDRPUH-A2-10-263 (서열번호: 41)로 자극된 웰 번호 #2 및 #8 (g), WDRPUH-A2-10-78 (서열번호: 45)로 자극된 웰 번호 #5 (h), WDRPUH-A2-10-10 (서열번호: 49)로 자극된 웰 번호 #2 (i), WDRPUH-A2-10-411 (서열번호: 55)로 자극된 웰 번호 #6 (j), WDRPUH-A2-10-287 (서열번호: 57)로 자극된 웰 번호 #7 (k) 및 WDRPUH-A2-10-265 (서열번호: 61)로 자극된 웰 번호 #6 (l)은 대조군 웰에 비하여 강력한IFN-감마 생산을 나타냈다. 반면, 이들 펩티드가 HLA-A*0201과 결합 활성을 갖는 것으로 예견된 사실에도 불구하고 강력한 IFN-감마 생산은 표 2에 보여진 다른 펩티드의 자극에 의해 검출될 수 없었다(결과는 보여주지 않음).
WDRPUH 특이적 펩티드에 대한 CTL 라인 및 클론( clone )의 형성
서열번호: 30로 자극된 웰 번호 #7 및 서열번호: 34로 자극된 웰 번호 #3으로 IFN-감마 ELISPOT 분석에 의해 펩티드 특이적 CTL 활성을 보여주는 세포는 CTL 라인으로서 설립되고 확장되었다. 이들 CTL 라인의 CTL 활성은 IFN-감마 ELISA 분석 (도 5a 및 b)에 의해 측정되었다. 양쪽 CTL 라인은 펩티드 펄스 없는 표적 세포에 비하여 상응하는 펩티드로 펄스된 표적 세포에 대하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타냈다. 더욱이, CTL 클론(clone)은 CTL 라인으로부터 제한된 희석에 의해 만들어졌고, 상응한 펩티드와 펄스된 표적 세포에 대한 CTL 클론으로부터 IFN-감마 생산은 IFN-감마 ELASA 분석에 의해 측정되었다. 서열번호: 30 및 서열번호: 34로 자극된 CTL 클론으로부터 강력한 IFN-감마 생산은 도 5c 및 d에 나타내었다.
WDRPUH 및 HLA -A*0201을 외인성으로 발현하는 표적 세포에 대한 특이적 CTL 활성
본 발명의 펩티드에 반하여 발생한 상기 확립된 CTL은 WDRPUH 및 HLA-A*2402 분자를 내인성으로 발현하는 표적 세포를 인식하는 그들의 능력에 대해 검사하였다. 전장의 WDRPUH 및 HLA-A*2401 분자 유전자(WDRPUH 및 HLA-A*2401 유전자를 내인성으로 발현하는 표적 세포를 위한 특이적 모델) 모두를 형질 도입한 COS7 세포에 반한 특이적 CTL 활성은 상응하는 펩티드에 의해 발생한 CTL 라인을 이펙터 세포(the effecter cell)로서 이용하여 시험하였다. 전장의 WDRPUH 유전자 또는 HLA-A*2401 중 하나로 형질도입된 COS7 세포는 대조군으로써 제작되었다. 도 5e에 있어서, 서열번호: 34로 자극된 CTLs은 WDRPUH 및 HLA-A*0201를 모두 발현하는 COS7 세포에 반하여 강력한 CTL 활성을 나타냈다. 반면에, 상기 대조군에 반하여는 유의적인 특이적 CTL 활성이 검출되지 않았다. 따라서 이러한 데이터는 WDRPUH-A02-9-288 (서열번호: 34)의 펩티드가 HLA-A*2401 분자와 함께 표적 세포의 표면에 내인성으로 프로세스되고 제시되고 CTL에 의해 인식된다는 것을 나타낸다. 상기 결과는 WDRPUH로부터 발생한 이러한 펩티드가 WDRPUH가 발현되는 종양을 갖는 환자에 위한 암 백신으로 적용할 수 있음을 나타낸다.
항원 펩티드의 상동성 분석
WDRPUH-A24-9-40 (서열번호: 1),
WDRPUH-A24-9-314 (서열번호: 2),
WDRPUH-A24-9-509 (서열번호: 3),
WDRPUH-A24-9-339 (서열번호: 4),
WDRPUH-A24-10-409 (서열번호: 16),
WDRPUH-A24-10-40 (서열번호: 17),
WDRPUH-A02-9-39 (서열번호: 30),
WDRPUH-A02-9-407 (서열번호: 31),
WDRPUH-A02-9-288 (서열번호: 34),
WDRPUH-A02-9-237 (서열번호: 36),
WDRPUH-A02-9-543 (서열번호: 37),
WDRPUH-A02-10-570 (서열번호: 40),
WDRPUH-A02-10-263 (서열번호: 41),
WDRPUH-A02-10-78 (서열번호: 45),
WDRPUH-A02-10-10 (서열번호: 49),
WDRPUH-A02-10-411 (서열번호: 55),
WDRPUH-A02-10-287 (서열번호: 57) 및
WDRPUH-A02-10-265 (서열번호: 61)
으로 자극된 CTL는 유의적이고 특이적인 CTL 활성을 나타냈다. 이러한 결과는 이들의 펩티드 서열이 인간 면역 체계를 민감하게 하는 것으로 알려진 다른 분자로부터 유래된 펩티드와 상동적인 사실 때문일 수 있다.
이러한 가능성을 배제하기 위하여, 상동성 분석은 이러한 펩티드 서열에 대하여 유의한 상동성을 가진 서열이 없다는 것을 밝힌 BLAST 알고리즘(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)을 쿼리(query)로 사용하여 수행하였다. 이러한 상동성 분석의 결과는
WDRPUH-A24-9-40 (서열번호: 1),
WDRPUH-A24-9-314 (서열번호: 2),
WDRPUH-A24-9-509 (서열번호: 3),
WDRPUH-A24-9-339 (서열번호: 4),
WDRPUH-A24-10-409 (서열번호: 16),
WDRPUH-A24-10-40 (서열번호: 17),
WDRPUH-A02-9-39 (서열번호: 30),
WDRPUH-A02-9-407 (서열번호: 31),
WDRPUH-A02-9-288 (서열번호: 34),
WDRPUH-A02-9-237 (서열번호: 36),
WDRPUH-A02-9-543 (서열번호: 37),
WDRPUH-A02-10-570 (서열번호: 40),
WDRPUH-A02-10-263 (서열번호: 41),
WDRPUH-A02-10-78 (서열번호: 45),
WDRPUH-A02-10-10 (서열번호: 49),
WDRPUH-A02-10-411 (서열번호: 55),
WDRPUH-A02-10-287 (서열번호: 57) 및
WDRPUH-A02-10-265 (서열번호: 61)
의 서열은 유일하고, 따라서 본 출원인이 아는바, 이러한 분자들은 몇몇의 관련되지 않은 분자들에 대한 의도하지 않은 면역 반응을 유발할 가능성이 거의 없다는 것을 의미한다.
결과적으로, 정상 HLA-A24 및 A2 에피토프 펩티드가 동정되었으며, 암 면역 치료법으로서 활용될 수 있다는 것을 증명하였다.
본 발명은 신규한 TAA, 구체적으로 강력하고 특이적인 항-종양 면역 반응을 유도하고 간세포암과 같은 암 형태에 적용가능한 WDRPUH로부터 유래한 TAA에 대해서 기술하고 있다. 이와 같은 TAA는 더 나아가 암의 펩티드 백신 접종 계획의 임상 적용의 발전을 보증한다.
본 발명은 상세하고, 이의 특이적인 실시예를 참조로 기재되어 있으나, 앞서 기술한 설명은 본질적으로 예시 및 설명이며, 본 발명과 이의 바람직한 실시예를 예시하는 바로 이해될 수 있다. 일반적인 실험을 통해, 당업자는 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 위의 설명에 의하지 않고, 첨부된 청구항 및 그와 동일한 것에 의해 정의 되는 것이 의도된다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> WDRPUH EPITOPE PEPTIDES AND VACCINES CONTAINING THE SAME <130> 11fpi-05-06 <150> US 61/200,962 <151> 2008-12-05 <150> US 61/209,704 <151> 2009-03-09 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide <400> 1 Ile Tyr Pro Leu Gly Cys Thr Val Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 2 Ile Tyr Arg Val Ser Phe Thr Asp Phe 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 3 Cys Tyr His Pro Glu Glu Phe Gln Ile 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 4 Val Phe Pro Phe Gly Thr Ala Glu Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 5 Ser Phe Thr Asp Phe Lys Glu Thr Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> 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synthesized peptide <400> 25 His Phe Asp Ala Val Glu Asp Ile Val Phe 1 5 10 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 26 Phe Leu Gln Gly His Gly Asn Asn Val 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 27 Ile Leu Ala Asn Thr Leu Phe Gln Cys 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 28 Ile Thr Gln Glu Gly Val His Phe Val 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 29 Lys Met Asn Pro Arg Thr Lys Leu Leu 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 30 Met Ile Tyr Pro Leu Gly Cys Thr Val 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 31 Arg Leu Met Tyr Val Ile Asn Asn Ala 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 32 Leu Leu Val Gly Ser Gly Ala Gly Leu 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 33 Lys Ile Trp Pro Thr Glu Cys Gln Thr 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 34 Gln Leu Gln Gly Gly Ile Thr Ser Ile 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 35 Ala Leu Ala Phe Ser Pro Asn Asp Leu 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 36 Lys Leu Leu Thr Asp Val Gly Pro Ala 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 37 Ser Leu Ser Gly Ser Ile Asn Gly Met 1 5 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 38 Ile Leu Trp Asp Tyr Lys Asn Arg Glu Leu 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 39 Ile Leu Ala Asn Thr Leu Phe Gln Cys Val 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 40 Lys Val Trp Asp Tyr Asn Glu Gly Glu Val 1 5 10 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 41 Gly Leu Leu Val Gly Ser Gly Ala Gly Leu 1 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 42 Gly Leu Asn Val Gly Asn Ala Thr Asn Val 1 5 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 43 Met Ile Leu Ala Asn Thr Leu Phe Gln Cys 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 44 Phe Leu Val Gly Thr Glu Glu Ser His Ile 1 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 45 Tyr Ile Ala Ser Gly Gln Val Thr Phe Met 1 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 46 Ala Ile Leu Arg Trp Lys Tyr Pro Tyr Thr 1 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 47 Phe Met Gly Phe Lys Ala Asp Ile Ile Leu 1 5 10 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 48 Thr Leu Ile Ala Thr Cys His Phe Asp Ala 1 5 10 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 49 Gln Val Ala Glu Leu Glu Leu Asp Ala Val 1 5 10 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 50 Phe Val Thr Gly Gly Asn Asp His Leu Val 1 5 10 <210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 51 Ser Leu His Lys Gly Lys Ile Glu Ala Leu 1 5 10 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 52 Asn Met Thr Cys His Gly Ile Asp Phe Met 1 5 10 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 53 Tyr Leu Gly Thr Thr Thr Gly Asp Ile Leu 1 5 10 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 54 Lys Met Asn Pro Arg Thr Lys Leu Leu Thr 1 5 10 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 55 Val Ile Asn Asn Ala His Arg Ile Gly Val 1 5 10 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 56 Ala Ile Asn Thr Lys Glu Gln Asn Phe Leu 1 5 10 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 57 Ile Gln Leu Gln Gly Gly Ile Thr Ser Ile 1 5 10 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 58 Leu Ile Ala Thr Cys His Phe Asp Ala Val 1 5 10 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 59 Gly Glu Gly Glu Val Arg Val Trp Gln Ile 1 5 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 60 Ile Val Phe Pro Phe Gly Thr Ala Glu Leu 1 5 10 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 61 Leu Val Gly Ser Gly Ala Gly Leu Leu Val 1 5 10 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized peptide <400> 62 Leu Ala Phe Ser Pro Asn Asp Leu Tyr Leu 1 5 10 <210> 63 <211> 2207 <212> DNA <213> Homo sapiens Sequence <220> <221> CDS <222> (70)..(1929) <400> 63 gttaccataa cgaccagaag acgctgcagc cactagggag gagagcaaag taatcagaac 60 ctcccaagg atg gat aac aaa att tcg ccg gag gcc caa gtg gcg gag ctg 111 Met Asp Asn Lys Ile Ser Pro Glu Ala Gln Val Ala Glu Leu 1 5 10 gaa ctt gac gcc gtg atc ggc ttc aat gga cat gtg ccc act ggt ctc 159 Glu Leu Asp Ala Val Ile Gly Phe Asn Gly His Val Pro Thr Gly Leu 15 20 25 30 aaa tgc cat cct gac cag gag cat atg att tat cct ctt ggt tgc aca 207 Lys Cys His Pro Asp Gln Glu His Met Ile Tyr Pro Leu Gly Cys Thr 35 40 45 gtc ctc att cag gca ata aat act aaa gag cag aac ttc cta cag ggt 255 Val Leu Ile Gln Ala Ile Asn Thr Lys Glu Gln Asn Phe Leu Gln Gly 50 55 60 cat ggc aac aac gtc tcc tgc ttg gcc atc tcc agg tct gga gag tac 303 His Gly Asn Asn Val Ser Cys Leu Ala Ile Ser Arg Ser Gly Glu Tyr 65 70 75 atc gcc tcc gga caa gtc aca ttc atg ggg ttc aag gca gac atc att 351 Ile Ala Ser Gly Gln Val Thr Phe Met Gly Phe Lys Ala Asp Ile Ile 80 85 90 ttg tgg gat tat aag aac aga gag ctg ctt gct cgg ctg tcc ctt cac 399 Leu Trp Asp Tyr Lys Asn Arg Glu Leu Leu Ala Arg Leu Ser Leu His 95 100 105 110 aaa ggc aaa att gaa gct ctg gcc ttt tct cca aat gat ttg tac ttg 447 Lys Gly Lys Ile Glu Ala Leu Ala Phe Ser Pro Asn Asp Leu Tyr Leu 115 120 125 gta tca cta gga ggc cca gat gac gga agt gtg gtg gtg tgg agc ata 495 Val Ser Leu Gly Gly Pro Asp Asp Gly Ser Val Val Val Trp Ser Ile 130 135 140 gcc aag aga gat gcc atc tgt ggc agc cct gca gcc ggc ctc aat gtt 543 Ala Lys Arg Asp Ala Ile Cys Gly Ser Pro Ala Ala Gly Leu Asn Val 145 150 155 ggc aat gcc acc aat gtg atc ttc tcc agg tgc cgg gat gag atg ttt 591 Gly Asn Ala Thr Asn Val Ile Phe Ser Arg Cys Arg Asp Glu Met Phe 160 165 170 atg act gct gga aat ggg aca att cga gta tgg gaa ttg gat ctt cca 639 Met Thr Ala Gly Asn Gly Thr Ile Arg Val Trp Glu Leu Asp Leu Pro 175 180 185 190 aat aga aaa atc tgg cca act gag tgc caa aca gga cag ttg aaa aga 687 Asn Arg Lys Ile Trp Pro Thr Glu Cys Gln Thr Gly Gln Leu Lys Arg 195 200 205 ata gtc atg agt att gga gtg gat gat gat gat agc ttt ttc tac ctt 735 Ile Val Met Ser Ile Gly Val Asp Asp Asp Asp Ser Phe Phe Tyr Leu 210 215 220 ggc acc acg act gga gat att cta aaa atg aac ccc agg act aaa ctg 783 Gly Thr Thr Thr Gly Asp Ile Leu Lys Met Asn Pro Arg Thr Lys Leu 225 230 235 ctg aca gat gtt ggg cct gcg aag gac aaa ttc agt ttg gga gtg tca 831 Leu Thr Asp Val Gly Pro Ala Lys Asp Lys Phe Ser Leu Gly Val Ser 240 245 250 gct atc agg tgc ctg aag atg ggg ggt ttg ttg gtg ggc tct gga gcc 879 Ala Ile Arg Cys Leu Lys Met Gly Gly Leu Leu Val Gly Ser Gly Ala 255 260 265 270 gga ctg ctg gtc ttc tgt aaa agc cct ggc tac aaa ccc atc aag aag 927 Gly Leu Leu Val Phe Cys Lys Ser Pro Gly Tyr Lys Pro Ile Lys Lys 275 280 285 att cag tta caa ggc ggc atc act tct atc aca ctt cga gga gaa gga 975 Ile Gln Leu Gln Gly Gly Ile Thr Ser Ile Thr Leu Arg Gly Glu Gly 290 295 300 cac cag ttt ctc gta gga aca gaa gaa tcg cac att tat cgt gtc agc 1023 His Gln Phe Leu Val Gly Thr Glu Glu Ser His Ile Tyr Arg Val Ser 305 310 315 ttc acg gat ttc aaa gag acg ctc ata gcg act tgt cac ttt gat gct 1071 Phe Thr Asp Phe Lys Glu Thr Leu Ile Ala Thr Cys His Phe Asp Ala 320 325 330 gtc gag gat att gtc ttt cca ttt ggc act gct gag cta ttt gca acc 1119 Val Glu Asp Ile Val Phe Pro Phe Gly Thr Ala Glu Leu Phe Ala Thr 335 340 345 350 tgt gcc aag aag gat atc agg gtg tgg cac aca tca tcc aac agg gag 1167 Cys Ala Lys Lys Asp Ile Arg Val Trp His Thr Ser Ser Asn Arg Glu 355 360 365 ctg ctg cgg atc acc gtg ccc aac atg acc tgc cac ggc atc gac ttc 1215 Leu Leu Arg Ile Thr Val Pro Asn Met Thr Cys His Gly Ile Asp Phe 370 375 380 atg agg gac ggc aaa agc atc att tca gca tgg aac gac ggt aaa atc 1263 Met Arg Asp Gly Lys Ser Ile Ile Ser Ala Trp Asn Asp Gly Lys Ile 385 390 395 cga gcc ttc gcc cca gag aca ggc cga ctg atg tat gtc att aac aat 1311 Arg Ala Phe Ala Pro Glu Thr Gly Arg Leu Met Tyr Val Ile Asn Asn 400 405 410 gct cac agg atc ggc gtc acc gcc atc gcc acc acc agt gac tgt aaa 1359 Ala His Arg Ile Gly Val Thr Ala Ile Ala Thr Thr Ser Asp Cys Lys 415 420 425 430 agg gtc atc agt ggc ggt ggg gaa ggg gag gtg agg gta tgg cag ata 1407 Arg Val Ile Ser Gly Gly Gly Glu Gly Glu Val Arg Val Trp Gln Ile 435 440 445 ggc tgt cag acc cag aag ctg gag gag gcc ctg aag gaa cac aag tca 1455 Gly Cys Gln Thr Gln Lys Leu Glu Glu Ala Leu Lys Glu His Lys Ser 450 455 460 tca gtg tcc tgc att agg gtg aag agg aac aac gag gag tgt gtc acc 1503 Ser Val Ser Cys Ile Arg Val Lys Arg Asn Asn Glu Glu Cys Val Thr 465 470 475 gcc agc acc gat ggg act tgt atc att tgg gac ctt gtg cgt ctc agg 1551 Ala Ser Thr Asp Gly Thr Cys Ile Ile Trp Asp Leu Val Arg Leu Arg 480 485 490 agg aat cag atg ata cta gcc aac acc tta ttc cag tgt gtg tgc tat 1599 Arg Asn Gln Met Ile Leu Ala Asn Thr Leu Phe Gln Cys Val Cys Tyr 495 500 505 510 cac cct gag gag ttc cag atc atc acc agc gga aca gac aga aag att 1647 His Pro Glu Glu Phe Gln Ile Ile Thr Ser Gly Thr Asp Arg Lys Ile 515 520 525 gct tac tgg gaa gta ttt gat ggg aca gta atc aga gaa ttg gaa ggt 1695 Ala Tyr Trp Glu Val Phe Asp Gly Thr Val Ile Arg Glu Leu Glu Gly 530 535 540 tcc ctg tct ggg tcg ata aat ggc atg gat atc aca cag gaa ggg gtg 1743 Ser Leu Ser Gly Ser Ile Asn Gly Met Asp Ile Thr Gln Glu Gly Val 545 550 555 cac ttt gtc aca ggt gga aat gac cat ctg gtc aaa gtt tgg gat tat 1791 His Phe Val Thr Gly Gly Asn Asp His Leu Val Lys Val Trp Asp Tyr 560 565 570 aat gag ggt gaa gtg act cac gtt ggg gtg gga cac agt ggc aac atc 1839 Asn Glu Gly Glu Val Thr His Val Gly Val Gly His Ser Gly Asn Ile 575 580 585 590 aca cgc atc cgc ata agt cca gga aat caa tat att gtt agt gta agt 1887 Thr Arg Ile Arg Ile Ser Pro Gly Asn Gln Tyr Ile Val Ser Val Ser 595 600 605 gcc gat gga gcc att ttg cga tgg aag tac cca tat acc tcc t 1930 Ala Asp Gly Ala Ile Leu Arg Trp Lys Tyr Pro Tyr Thr Ser 610 615 620 gaagctgatg agatgtctct gagccttggc gttgcacgca gtcctgttga agactgagtt 1990 tagataactc caacactagt cttcatttct cacagctctg tttttgttct tgagtcaatt 2050 tttctctttt tctttataga atgcatttta tattcttaaa ttgcatatta aaattgaagt 2110 atgttcaaga ataatttgtg cagactctaa ttagaacttt taacattttg aataaattct 2170 tagttgttgg ttttctgtta taaaaaaaaa aaaaaaa 2207 <210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 65 gtctaccagg cattcgcttc at 22 <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 66 tcagctggac cacagccgca gcgt 24 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 67 tcagaaatcc tttctcttga c 21 <210> 68 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 68 ctagcctctg gaatcctttc tctt 24

Claims (19)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 하기 구성된 군으로부터 선택된, 15개 아미노산 미만의 분리된 펩티드:
    (a) 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 및 61로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 펩티드; 및
    (b) 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 및 61로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 펩티드에 있어서 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 두 개의 치환을 가지는 펩티드;
    (b-1) 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16 또는 17의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 타이로신(tyrosine), 메티오닌(methionine) 및 트립토판(tryptophan)으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환;
    (b-2) 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16 또는 17의 아미노산 서열의 C-말단 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 트립토판(tryptophan) 및 메티오닌(methionine)으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환;
    (b-3) 서열번호: 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 또는 61의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 류신 또는 메티오닌으로 치환; 및
    (b-4) 서열번호: 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 또는 61의 아미노산 서열의 C-말단 아미노산이 발린 또는 류신으로 치환.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 4항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호: 1, 2, 3, 4, 16, 17, 30, 31, 34, 36, 37, 40, 41, 45, 49, 55, 57 및 61로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 펩티드인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  9. 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  10. 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 하나 이상의 펩티드, 또는 그 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시험관 내(in vitro)에서 CTL 유도하기 위한 제제.
  11. 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 하나 이상의 펩티드 또는 그 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 암의 치료 또는 예방, 또는 수술 후 재발의 예방용 약학적 제제.
  12. 제 11항에 있어서, HLA 항원이 HLA-A24 또는 HLA-A2인 개체에 투여하기 위해 제형화되는 것을 특징으로 하는 약학적 제제.
  13. 하기로부터 선택된 단계를 포함하는, 시험관 내(in vitro)에서 CTL 유도성을 갖는 항원 제시 세포(APC)의 유도 방법:
    (a) 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드와 APC를 접촉시키는 단계; 및
    (b) APC 내로 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 단계.
  14. 하기로부터 선택된 단계를 포함하는 시험관 내에서 CTL의 유도 방법:
    (a) HLA 항원과 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 APC를 CD8-양성 T 세포와 공동 배양하는 단계;
    (b) HLA 항원과 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 엑소솜을 CD8-양성 T 세포와 공동 배양하는 단계; 및
    (c) 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드와 결합하는 T 세포 수용체(TCR) 소단위(subunit) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포 내로 도입시키는 단계.
  15. HLA 항원과 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그것의 표면에 제시하는 분리된 APC.
  16. 하기로부터 선택된 단계를 포함하는 CTL 유도성을 갖는 항원 제시 세포(APC)를 유도하기 위한 시험관 내(in vitro) 방법으로 유도되는, HLA 항원과 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그것의 표면에 제시하는 분리된 APC:
    (a) 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드와 APC를 접촉시키는 단계; 및
    (b) APC 내로 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 단계.
  17. 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드를 표적화하는 분리된 CTL.
  18. 하기로부터 선택된 단계를 포함하는 CTL을 유도하기 위한 시험관 내 방법으로 유도되는, 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드를 표적화하는 분리된 CTL:
    (a) HLA 항원과 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 APC를 CD8-양성 T 세포와 공동 배양하는 단계;
    (b) HLA 항원과 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 엑소솜을 CD8-양성 T 세포와 공동 배양하는 단계; 및
    (c) 암의 치료 또는 예방, 또는 수술 후 재발의 예방용 약학적 제제 어느 한 항의 펩티드와 결합하는 T 세포 수용체(TCR) 소단위(subunit) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포 내로 도입시키는 단계.
  19. 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 활성 성분을 포함하는 암의 치료 또는 예방, 또는 수술 후 재발의 예방용 약학적 조성물:
    (a) HLA 항원과 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그것의 표면에 제시하는 하나 이상의 분리된 항원-제시 세포(APC), 또는
    하기로부터 선택된 단계를 포함하는 CTL 유도성을 갖는 항원 제시 세포(APC)를 유도하기 위한 시험관 내(in vitro) 방법으로 유도되는, HLA 항원과 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그것의 표면에 제시하는 하나 이상의 분리된 APC:
    (i) 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드와 APC를 접촉시키는 단계; 및
    (ii) APC 내로 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 단계; 및
    (b) 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드를 표적화하는 하나 이상의 분리된 CTL, 또는
    하기로부터 선택된 단계를 포함하는 CTL을 유도하기 위한 시험관 내 방법으로 유도되는, 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드를 표적화하는 하나 이상의 분리된 CTL:
    (i) HLA 항원과 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 APC를 CD8-양성 T 세포와 공동 배양하는 단계;
    (ii) HLA 항원과 제 4항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 엑소솜을 CD8-양성 T 세포와 공동 배양하는 단계; 및
    (iii) 암의 치료 또는 예방, 또는 수술 후 재발의 예방용 약학적 제제 어느 한 항의 펩티드와 결합하는 T 세포 수용체(TCR) 소단위(subunit) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 T 세포 내로 도입시키는 단계.
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