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WO2004024766A1 - Kdrペプチド及びこれを含むワクチン - Google Patents

Kdrペプチド及びこれを含むワクチン Download PDF

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WO2004024766A1
WO2004024766A1 PCT/JP2003/011722 JP0311722W WO2004024766A1 WO 2004024766 A1 WO2004024766 A1 WO 2004024766A1 JP 0311722 W JP0311722 W JP 0311722W WO 2004024766 A1 WO2004024766 A1 WO 2004024766A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
cells
hla
seq
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/011722
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hideaki Tahara
Satoshi Wada
Takuya Tsunoda
Original Assignee
Oncotherapy Science, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to JP2004571938A priority patent/JP3971769B2/ja
Priority to DK03795432T priority patent/DK1548032T3/da
Priority to AT03795432T priority patent/ATE432291T1/de
Priority to US10/527,496 priority patent/US7514084B2/en
Priority to AU2003264419A priority patent/AU2003264419A1/en
Priority to EP03795432A priority patent/EP1548032B9/en
Priority to SI200331649T priority patent/SI1548032T1/sl
Application filed by Oncotherapy Science, Inc. filed Critical Oncotherapy Science, Inc.
Publication of WO2004024766A1 publication Critical patent/WO2004024766A1/ja
Priority to US12/355,616 priority patent/US7695720B2/en
Priority to US12/711,159 priority patent/US8206719B2/en
Priority to US13/494,933 priority patent/US8574586B2/en
Priority to US13/494,930 priority patent/US8574585B2/en

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Definitions

  • the present invention relates to a novel peptide which is very effective as a cancer vaccine, and a medicament for treating and preventing a tumor containing the peptide.
  • cancer immunotherapy using it has been developed.
  • CD8-positive T cells in the anti-tumor immune response
  • CTLs tumor-specific cytotoxic T cells
  • endothelial cells have almost no problems such as decreased expression or disappearance of banded C-Class I, and non-uniformity.Therefore, if CTLs targeting tumor blood vessels can be induced, regardless of the type of tumor, Class I disappear It is possible to surpass the causes of problems with conventional cancer vaccine therapy, such as deficiency and target molecule deficiency, and to expect a great therapeutic effect.
  • Research on neovascularization in cancer began with the pioneering hypothesis of Folkraan et al. In the 1970s, and has been studied from various angles. Above all, much research has not been done on VEGF-VEGF receptor (VEGFR). Its significance in tumor neovascularization has been evaluated.
  • VEGFR is expressed in normal cells and is considered to be immunotolerant.
  • KDR cancer vaccine therapy targeting VEGFR2
  • VEGF signal vascular endothelial cell proliferation by VEGF signal and is strongly expressed in tumor tissue endothelial cells. Focusing on their properties, they searched for peptides that can be used effectively as vaccines, studied their specificity, and completed the present invention.
  • the present invention provides the following (1) to (22).
  • a nonapeptide selected from peptides having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 3, 5, 8, 11, or 12.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 3, 5, 8, 11, or 12 has one or two or several amino acids substituted or added, and has an ability to induce cytotoxic T cells. Having a peptide.
  • a medicament for treating and / or preventing or treating a tumor comprising at least one peptide according to any one of the above (1) to (8).
  • a medicament for treating diabetic retinopathy, rheumatoid arthritis, psoriasis, and atherosclerosis comprising at least one peptide according to any one of the above (1) to (8).
  • a cytotoxic T comprising transfecting a gene containing a polynucleotide encoding the peptide according to any one of the above (1) to (8) into antigen-presenting cells.
  • a vaccine for inhibiting angiogenesis at a diseased site comprising the peptide according to any one of (1) to (8) as an active ingredient.
  • FIG. 1 shows the cytotoxic activity of the CTL clone on target cells.
  • FIG. 2 shows the results of HLA-tetramer analysis of the established CTL clone.
  • FIG. 3 shows the effect of vaccination with the peptide of the present invention on survival of BALB mice inoculated with colon26.
  • FIG. 4 shows the effect of peptide inoculation with the peptides of the present invention on the growth of colon26-derived tumors.
  • FIG. 5 shows the effect of vaccination with the peptides of the invention on the survival of mice inoculated with B16.
  • FIG. 6 shows the effect of vaccination with the peptides of the invention on the growth of tumors derived from B16 melanoma.
  • FIG. 7 shows the cell killing effect of CTL clone C29-169 on HLA-A24-positive cells displaying the peptide of the present invention.
  • FIG. 8 shows the cell killing effect of CTL clone C29-169 on HLA-A24-positive cells displaying the peptide of the present invention.
  • FIG. 9 shows the cell killing effect of the CTL clone KDR C85-775 (KWC85-775) on HLA-A0201-positive cells displaying the peptide of the present invention.
  • FIG. 10 shows the cell killing effect of the CTL clone KDR C85-775 (KWC85-775) on HLA-A0201-positive cells displaying the KDR peptide.
  • FIG. 11 shows the cell killing effect of CTL clone KDR C51-1328 (KWC51) on HLA-A0201-positive cells displaying the peptide of the present invention.
  • FIG. 12 shows the cell killing effect of the CTL clone KDR C51-1328 (K C51) on HLA-A0201-positive cells displaying the KDR peptide.
  • FIG. 13 shows the cell killing effect of CTL clone KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L) on HLA-A0201-positive cells displaying the peptide of the present invention.
  • FIG. 14 shows the cell killing effect of CTL clone KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L) on HLA-A0201-positive cells displaying the peptide of the present invention.
  • FIG. 15 shows the cell killing effect of the CTL clone KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L) on HLA-A0201-positive cells displaying the KDR peptide.
  • FIG. 16 shows the inhibitory effect of various antibodies on the cell killing effect of the CTL clone.
  • FIG. 17 shows the inhibitory activity of the peptides of the present invention on the angiogenic response induced by B16 cells in A2 / Kb TGM. Mice were vaccinated twice with HBSS, unpulsed DC, or DC pulsed with an epitope peptide of the invention (KDR190, 772, 773, 773-2L, 775, or 1084). The arrows point to the characteristic zigzag, newly formed vessels.
  • FIG. 18 shows the inhibitory effect of the peptides of the present invention on the increase in human tumor volume in transgenic mice.
  • FIG. 19 shows the cell killing effect of CTL clone KWC65-190 on HLA-A0201-positive cells displaying the peptide of the present invention.
  • Hidden in the presence of the peptide, Mouth: in the absence of the peptide
  • FIG. 20 shows the cell killing effect of CTL clone KWC72-772 on HLA-A0201-positive cells presenting the peptide of the present invention.
  • FIG. 22 shows the cell killing effect of CTL clone C7-1318 on HLA-A24-positive cells displaying the peptide of the present invention.
  • Country In the presence of peptide
  • Mouth In the absence of peptide
  • FIG. 23 shows the cell killing effect of CTL clone KWC46 on HLA-A24-positive cells displaying the peptide of the present invention. Picture: in the presence of peptide, mouth: in the absence of peptide
  • FIG. 24 shows the cell killing effect of CTL clone C18-189 on HLA-A24-positive cells displaying the peptide of the present invention.
  • FIG. 25 shows the cell killing effect of CTL clone C65-826 on HLA-A24-positive cells displaying the peptide of the present invention.
  • FIG. 26 shows the cell killing effect of CTL clone C7-1318 on HLA-A24-positive cells displaying the peptide of the present invention.
  • FIG. 27 shows the cell killing effect of CTL clone KWC46 on HLA-A24-positive cells displaying the peptide of the present invention.
  • ⁇ HT29-VEGFR2
  • ⁇ HT29-EGFP
  • FIG. 28 shows the cell killing effect of CTL clone C18-189 on HLA-A24-positive cells displaying the peptide of the present invention.
  • FIG. 29 shows the cell killing effect of CTL clone C65-826 on HLA-A24-positive cells displaying the peptide of the present invention.
  • HT29-VEGFR2 HT29-EGFP
  • FIG. 30 shows the inhibitory activity of the peptides of the present invention on the angiogenic response induced by colon26 cells in BALB. Mice were inoculated twice with HBSS, unpulsed DC, or DC pulsed with the inventive epitope peptides (KDR189 or 826). Arrows indicate newly formed blood vessels that go into a characteristic zigzag.
  • FIG. 31 shows the inhibition of the peptide of the invention on the angiogenic response induced by colon26 cells in BALB. Columns indicate average, and vertical bars indicate standard error.
  • FIG. 32 shows HLA-A24-positive cells by CTLs from a patient stimulated with the peptide of the present invention.
  • 1 shows the cell killing effect on ⁇ : In the presence of peptide, Mouth: In the absence of peptide
  • the present inventors first considered that various proteins are presented after being decomposed into 9-mer peptides (nonapeptides) when presented on antigen-presenting cells in vivo.
  • the binding affinity of the 10-mer or 10-mer partial peptide to HLA antigen, a human major histocompatibility antigen (MHC antigen) was examined.
  • MHC antigen human major histocompatibility antigen
  • the amino acid sequence of human KDR protein is known and is described, for example, in US Pat. No. 5,861,301, and can be easily obtained by those skilled in the art.
  • 9-mer and 10-mer peptides can be obtained by synthesizing a peptide from any position based on the entire amino acid sequence of the obtained KDR protein.
  • the peptide can be synthesized according to a method used in ordinary peptide chemistry. Commonly used synthesis methods include, for example, Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 197; Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; Basics and Experiments, Maruzen Co., Ltd., 1985; Pharmaceutical Development, Vol.
  • the binding to the HLA antigen can be measured by isolating cells having the HLA antigen on the cell surface, for example, dendritic cells, and binding the peptide to the cells using a commonly used technique.
  • binding affinities of various peptides and HLA antigens can also be calculated in silico.
  • the binding affinity to the HLA antigen can be measured, for example, as described in Parker, KC, J. Immunol., 152, 1994; Nukaya, I., Int. J. Cancer, 80, 1999 and the like. .
  • the HLA antigen it is preferable to use, for example, A-type 24 or A-type 02, which is said to be highly expressed in Japanese, in order to obtain effective results, and more preferably, A-240 type. It is a subtype such as 2, A—0201.
  • A-type 24 or A-type 02 which is said to be highly expressed in Japanese, in order to obtain effective results
  • A-240 type It is a subtype such as 2, A—0201.
  • CTL cytotoxic T cells
  • one, two or several amino acids may be substituted or substituted based on the amino acid sequence of the KDR partial peptide present in heaven. Additions can also be made.
  • "several” means 5 or less, preferably 3 or less.c
  • sequence rule of the peptide already bound to the HLA antigen and presented are known (J. Immunol., 152, 3913, 1994; Immunogenetics. 41: 178, 1995; J. Immunol. 155: 4307, 1994). Modifications based on this may be made.
  • those with a high HLA-24 binding affinity have the second amino acid from the N-terminal of the peptide replaced with phenylalanine, tyrosine, methionine or tryptophan, or the C-terminal amino acid with phenylalanine, leucine, isoleucine, Peptides substituted with tryptophan or methionine can also be suitably used.
  • peptides in which the second amino acid from the N-terminus of the peptide is substituted with leucine or methionine, or in which the C-terminal amino acid is substituted with valine or leucine are also suitable.
  • 1-2 amino acids may be added to the N-terminal and / or C-terminal of the peptide.
  • the sequence of the peptide is identical to a part of the amino acid sequence of an endogenous or exogenous protein having another function, side effects such as an autoimmune disease may occur, or a specific substance May cause allergic symptoms, perform a homology search using available databases and It is preferable to avoid a match with the amino acid sequence of the protein. Furthermore, if it is clear from the homology search that no peptide differs by one or two amino acids, the above amino acid sequence for enhancing the binding affinity to HLA antigen and / or the ability to induce CTL can be determined. Modification is unlikely to cause such a problem.
  • peptides with high binding affinity to HLA antigens are expected to be highly effective as cancer vaccines, but candidates selected with high binding affinity as an index It is necessary to examine whether a peptide actually has the ability to induce CTL.
  • antigen-presenting cells for example, B-lymphocytes, macrophages, dendritic cells
  • human MHC antigen specifically dendritic cells derived from human peripheral blood mononuclear cells
  • the cells are mixed with CD8-positive cells, and the cytotoxic activity on target cells is measured.
  • transgenic animals prepared to express human HLA antigen for example, Hum. Immunol.
  • HLA class II restricted T (H) response BenMohamed L., Krishnan R., Longmate J., Auge C., Low L., Primus J. , Diamond DJ.
  • the cytotoxic activity can be calculated, for example, from radioactivity released from the target cells by radiolabeling the target cells with 51 Cr or the like. Alternatively, it can be observed by measuring the inhibition circle visualized on the medium by IFN- y and anti-IFN-T monoclonal antibodies produced and released by CTL in the presence of peptide-restricted antigen-presenting cells. .
  • VYSSEEAEL SEQ ID NO: 2
  • GYRIYDVVL SEQ ID NO: 3
  • SYMISYAGM SEQ ID NO: 5
  • RFVPDGNRI SEQ ID NO: 8
  • KWEFPRDRL SEQ ID NO: 11
  • DFLTLEHLI non-peptide selected from the peptide consisting of the amino acid sequence, and AMFFWLLLV (SEQ ID NO: 29), VIAMFFWLL (SEQ ID NO: 30),
  • the present invention further relates to an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 3, 5, 8, 11, or 12, wherein one, two, or several amino acids are substituted or added. Also provided are peptides having inducibility. Based on the amino acid sequence consisting of nine amino acids shown in SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 8, 11, or 12, substitution, addition of one, two or several amino acids is As long as there is no match with the sequence, it may have the ability to induce CTL.
  • amino acid substitutions include substitution of the second amino acid from the N-terminus with phenylalanine, tyrosine, methionine or tryptophan, and substitution of the C-terminal amino acid with phenylalanine, oral isin, isoleucine, tryptophan or methionine.
  • substitution and addition of amino acids include addition of one or two amino acids to the N-terminal and / or C-terminal.
  • the present invention also relates to amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 29, 30, 33, 34, 40, or 46, wherein one, two or several amino acids are substituted or added. Also provided is a peptide having the ability to induce cytotoxic T cells. Substitution of one, two or several amino acids based on the amino acid sequence consisting of 9 or 10 amino acids shown in SEQ ID NO: 29, 30, 30, 33, 34, 40 or 46 Alternatively, the addition may be capable of inducing CTL as long as there is no match with the amino acid sequence of another protein.
  • amino acid substitutions include substitution of the second amino acid from the N-terminus with leucine or methionine, substitution of a C-terminal amino acid with valine or leucine, and addition of an amino acid with 1- to N-terminal and Z or C-terminal
  • modified peptides include, but are not limited to, a peptide in which the second amino acid from the N-terminal of the peptide of SEQ ID NO: 30 has been converted to leucine (SEQ ID NO: 54). CTL clones obtained by stimulation with these modified peptides can recognize the peptide before modification and can damage it.
  • the above-described peptide of the present invention can be used as one or a combination of two or more thereof as a cancer vaccine capable of inducing CTL in vivo.
  • the petit of the present invention By administering the peptide, the peptide is presented at a high density to the HLA antigen of the antigen-presenting cell, and CTLs that specifically react with the complex of the presented peptide and the HLA antigen are induced, and the target cell
  • the attack power on vascular endothelial cells in the tumor cells to be increased is increased.
  • dendritic cells are removed from a subject and stimulated with the peptide of the present invention, whereby antigen-presenting cells having the peptide of the present invention restricted on the cell surface are obtained. Can be induced to increase the aggressiveness against target cells.
  • the present invention provides a medicament for treating a tumor or preventing tumor growth or metastasis, which comprises one or more peptides of the present invention.
  • angiogenesis at the site of disease is closely linked to tumors as well as diseases such as diabetic retinopathy, rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, and metastasis of solid tumors (Folkman, J., Nature Med. 1: 27-31 (1995); Bicknell, R., Harris, AL, Curr. Opin. Oncol. 8: 60-65 (1996)). Therefore, the peptide of the present invention can be used for treatment of diseases such as tumor, diabetic retinopathy, rheumatoid arthritis, psoriasis, atherosclerosis, and metastasis of solid cancer.
  • the peptide of the present invention was formed in malignant tumor tissue and was confirmed to inhibit the formation of tortuous blood vessels morphologically different from normal blood vessels, it was found to inhibit wound healing and fertility in mice inoculated with Pectin. The analysis confirmed that it had no adverse effect on normal physiological angiogenesis. Furthermore, when the cytotoxicity to non-proliferating or proliferating endothelial cells was tested in vitro using CTL clones recognizing the peptide of the present invention, these clones were found to proliferate endothelial cells more than non-proliferating endothelial cells It also became clear that the compound showed strong activity against. That is, it can act very specifically in diseases in which proliferating endothelial cells are observed, particularly in cancer.
  • the stimulation of dendritic cells by the peptide of the present invention is caused by the presence of a high concentration of the peptide in the cell, whereby the exchange with the peptide previously bound to the cell occurs. , easily done.
  • the peptide used in the present invention is required to have a binding affinity to the HLA antigen higher than a certain level.
  • the medicament of the present invention may be directly administered with the peptide of the present invention alone, It may be administered as a pharmaceutical composition formulated by the given pharmaceutical method.
  • carriers, excipients, and the like that are usually used in medicine can be appropriately included, and there is no particular limitation.
  • the medicament of the present invention can be used for the treatment and prevention of various tumors such as gastric cancer, duodenal cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, and brain tumor.
  • the peptide of the present invention targets endothelial cells of new blood vessels newly formed in the tumor tissue, not the tumor cells themselves, and therefore, the target of treatment is a wide range of tumors, and its use is particularly limited. Not something.
  • compositions for treating and / or preventing tumors comprising the peptide of the present invention as an active ingredient are administered together with an adjuvant so that cell-mediated immunity is effectively established, or together with other active ingredients such as other anticancer agents.
  • an adjuvant those described in the literature (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994) can be applied.
  • ribosome preparations, particulate preparations linked to beads having a diameter of several zm, and preparations linked to lipids are also conceivable.
  • the present invention provides an intracellular vesicle called exosome, which displays a complex of the peptide of the present invention and an HLA antigen on the surface.
  • Exosomes can be prepared using the methods described in detail in, for example, JP-T-11-510507 and JP-T-2000-5121161, but are preferably treated and targeted for Z or prevention. Is prepared using antigen-presenting cells obtained from a subject.
  • the exosome of the present invention can be inoculated as a cancer vaccine in the same manner as the above-mentioned peptide of the present invention.
  • the HLA antigen must be of the same type as the HLA antigen of the subject in need of treatment and / or prevention.
  • HLA—AO 2 especially HLA—A 2402 or HLA—0201 2003/011722 This is often preferred.
  • the present invention also provides a method for inducing antigen-presenting cells using the peptide of the present invention.
  • dendritic cells After dendritic cells are derived from peripheral blood monocytes, they can be contacted (stimulated) with the peptide of the present invention in vitro or in vivo to induce antigen-presenting cells.
  • antigen-presenting cells in which the peptide of the present invention is restricted are induced in the subject.
  • the peptide of the present invention can be bound to antigen-presenting cells in vitro and then administered to a subject as a vaccine.
  • the present invention also provides an antigen-presenting cell having high ability to induce cytotoxic T cells, which comprises introducing a gene containing the polynucleotide encoding the peptide of the present invention into an antigen-presenting cell in vitro.
  • the gene to be introduced may be in the form of DNA or RNA.
  • the method of introduction may be any of various methods commonly used in the art, such as lipofection, electoral portation, and calcium phosphate method, and is not particularly limited. Specifically, for example, as described in Cancer Res., 56: 5672, 1996; J. Immunol., 161: 5607, 1998; J. Exp. Med., 184: 465, 1996; You can do it.
  • the gene By introducing a gene into an antigen-presenting cell, the gene is subjected to transcription, translation, and other processing in the cell, and the resulting protein is displayed through a MHC class I or class II processing and presentation pathway, and a partial peptide is displayed. Is done.
  • the present invention further provides a method for inducing CTL using the above-described peptide of the present invention.
  • CTL is induced in the subject, and immunity targeting endothelial cells of neovascularization in tumor tissue is enhanced.
  • ex vivo treatment in which antigen-presenting cells and CD8-positive cells or peripheral blood mononuclear cells from a subject are contacted (stimulated) with the peptide of the present invention in vitro to induce CTL and then return to the subject.
  • the method can also be used.
  • the present invention further provides isolated cytotoxicity induced using the peptides of the present invention.
  • the cytotoxic T cells induced based on stimulation by the antigen-presenting cells presenting the peptide of the present invention are preferably derived from a subject to be treated and treated or prevented, or used alone or in the present invention. It can be administered for the purpose of antitumor effect together with other drugs including the peptide of the present invention, exosomes and the like. Get The resulting cytotoxic T cells act specifically on target cells presenting the peptide of the invention, preferably the same peptides used for the induction.
  • the target cells are
  • It may be a cell that expresses KDR endogenously or a cell that forcibly expresses KDR, and a cell that presents the peptide on the cell surface by stimulation of the peptide of the present invention. Can also be the target of an attack.
  • the present invention further provides an antigen-presenting cell which presents a complex of the HLA antigen and the peptide of the present invention.
  • the antigen-presenting cells obtained by contacting the peptide of the present invention or a nucleotide encoding the peptide of the present invention are preferably derived from a subject to be treated and / or prevented, alone or It can be administered as a vaccine together with other drugs, including the peptide of the present invention, exosomes, cytotoxic ⁇ cells and the like.
  • HIV peptides (ILKEPVHGV (SEQ ID NO: 55) and RYLRDQQLL (SEQ ID NO: 56)) were used as negative control peptides.
  • Peptides were prepared according to standard solid phase synthesis methods using Cleaved PepSet (Mimotope, San).
  • HPLC and mass spectrometry C determined each tides of purity (> 95%) and the type of
  • EBV Ebstein-Bar virus immortalized B cell lines, TISI (HLA-A24 / 24) and EHM (HLA-A3 / 3), were provided by Takara Shuzo Bio Research Institute.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • human GM-CSF Keratin
  • AIM-V Invitrogen
  • 1,000 U / ml and human IL-4 (Genzyme) 1,000 U / ml were added, and the cells attached to the flask were cultured. Five days later, the cells were cultured at 0 K-432 (provided by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) at 10 ⁇ g / ml for 48 hours and used as antigen-presenting cells for CTL induction.
  • DCs Dendritic cells
  • CD80 FITC-labeled anti-Class II, CD80, CD86 antibodies
  • PE-labeled anti-Classl, CDllc, CD40 all Beckton-Dickinson
  • CD83 Immunotech
  • Cytotoxic activity was measured by the 51 Cr release method for 4 hours.
  • Target cells that pulsed the peptides were pulsed at a concentration of 20 g / ml.
  • Target cells were washed 3 times with 100 ⁇ Ci Na 2 51 Cr0 4 in hand 37 ° C, 1 hour labeled after RPMI1640 of target cells (1 X 10 4/100 in 96-well U-type microplate (Corning) mu 1) and the effector cells at various concentrations 100 1 was added 4 hours the total amount 200, and cultured in C0 2 incubator one 37 ° C. After the completion of the culture, 100 ⁇ l of the supernatant was collected from each well and measured with a gamma counter. Spontaneous dissociation was performed with target cells and medium, and maximum dissociation was radioactivity obtained with target cells and 1M HCL. The cytotoxic activity (percentage of specific lysis) was calculated by the following equation.
  • Example 2 Six types of CTL lines established in Example 2 were diluted in a 96-well U-shaped plate to 0.31 or 3 cells / well. Then, 5% autologous serum was added to AIM-V so that the concentration of PBMC was 7 ⁇ 10 4 cells / well, EHM 1 ⁇ 10 4 cells / well, anti-CD3 antibody 30 ng / ml IL-2 125 U / ml. It was added to make a total of 150 ⁇ 1 / well. Ten days later, IL-2 supplemented medium adjusted to a final concentration of 125 U / ml of IL-2 was added at 50 ⁇ l / well. On the 14th day, perform CTL functional analysis and cultivate active ones in large quantities
  • the intensity of the cytotoxic activity of the ten CTL clones established in Example 3 was examined by changing the ratio to the target cells (E: T ratio) (FIG. 1).
  • HLA-A * 2402 and SEQ ID NO: 8 (Amino acid starting position KDR1 6 9). That is, plasmid vectors expressing the H chain (about 35 kDa) and the L chain (about llkDa) were respectively prepared, and these recombinant proteins were expressed using Escherichia coli.
  • the H chain plasmid vector is composed of only the extracellular domain, and the carboxyl terminal side is replaced with a biotinase recognition sequence.
  • the H chain and the L chain form an HLA peptide complex by refolding together with the antigen peptide.
  • the HLA peptide complex was biotinylated with a biotinylating enzyme, excess biotin was removed by gel filtration chromatography and ion exchange chromatography, and the biotinylated HLA peptide complex was separated and purified.
  • the obtained biotinylated HLA peptide complex was reacted with streptavidin (streptavidin; SA) at a molar ratio of 4: 1 to be tetramerized to synthesize an HLA-tetramer.
  • streptavidin streptavidin
  • SA streptavidin
  • tetramerization was performed using SA (SA-PE) fluorescently labeled with phycoerythrin (PE).
  • the CD8 molecule is known to bind to alanine, which is the 245-amino acid of the 3 domain.
  • alanine which is the 245-amino acid of the 3 domain.
  • Established CTL clones were detected by the synthesized mutant HLA-A24 KDR169-tetramer.
  • the established CTL clone is a CTL that strongly stains the tetramer-positive and CD8-positive fraction, and specifically recognizes the complex of the peptide and the HLA antigen of the present invention. It became clear that it was.
  • the signals of the tetramer-negative and CD8-negative fractions are derived from feeder cells.
  • HLA peptide was obtained from the entire amino acid sequence of the KDR protein.
  • CEA588 (SEQ ID NO: 53) in the table is one of the epitopes of the tumor antigen CEA (carcinoembryonic antigen) reported by Tanaka, H. et al. (Poster presentation, AACR # 3669, vol. 42, p681 ⁇ 682, March 2001).
  • a transgenic mouse expressing human HLA (A202) was used for the 16 types of 9-mer or 10-mer peptides (SEQ ID NOs: 26-41) predicted in Example 6.
  • H HLA class II restricted T
  • mice 6 - 8-week-old BALB / C (H - 2 d ) mice were placed in a hand from CLEA Japan.
  • A2 / Kb transgenic mice (TGM) were kindly provided by F Jim Primus Ph. D. Vanderbilt-Ingram Cancer Center.
  • T2 cells (TAP-deficient cells, HLA-A * 0201 positive) were provided by Professor Miku University Tertiary Internal Medicine Professor Shukuyo.
  • Bone marrow is collected from mouse femur and tibia, and lymphocytes and granulocytes are removed using anti-CD4, CD8, Gr-l (Beckton-Dickinson), B220 (bioscience) antibodies, and egret complement (PeL-Freez) did.
  • the cells are cultured in a 6-well plate, and the following day, the floating cells are collected, and a mouse GM-CSF (provided by Kirin Brewery) is added to a culture solution containing 10% FBS in RPMI 1640 (Invitrogen) in another 6-well plate.
  • OOOU / ml and mouse IL_4 (PEPR0 TECH) 1,000 U / ml were added and cultured.
  • DC was reacted with FITC-labeled anti-Class II and CD40 antibodies and PE-labeled anti-Classl, CDl lc, CD80, and CD86 (all Beckton-Dickinson) antibodies and used Cell Quest software. Surface antigen was analyzed using a FACS-Calibur (Becton-Dickinson), and it was confirmed that it was DC.
  • each peptide lOO ⁇ ug HbcAgl20-140 helper peptide was mixed with 100 ⁇ l of IFA (200 ⁇ l in total), and subcutaneously ingested on the right flank on day 0, on the right flank on day 0, and on the left flank on dayll.
  • the spleen of a mouse vaccinated on Day 21 was collected, erythrocytes were hemolyzed and removed with a red lysis buffer (sigma), and a part of the cells was used as a responder cell in an IFN- ⁇ ELISP0T assay.
  • the remaining cells were restimulated with a feeder cell at a ratio of 3: 1 in a 24 well plate (Corning) at 6 ⁇ 10 6 cells / well, and the cytotoxic activity was measured 5 days later. .
  • the feeder cells used were spleen cells from which the erythrocytes of the same type of mouse had been removed and cultured for 3 days in the presence of lipopolysaccharide (LPS) 25 ⁇ g / ml.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the IFN- ⁇ ELISP0T method was used, in which the ability to induce CTL was evaluated by SPOT produced by cells producing IFN- ⁇ .
  • dendritic cells were added and cultured to prepare dendritic cells.
  • the dendritic cells in SEQ ID NO: 5 peptide (amino acid initiation position KDR189) which were pulsed with (1 X 1 0 6/7 mice) were administered twice right lower quadrant at 7 day intervals nine BALB / c mice , colon cancer cell lines Colon26 (Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.) to (5 X 1 0 5 pieces) were inoculated in the right abdomen in the 7 days after, were examined survival and tumor growth in mice.
  • KDR expression was confirmed by RT-PCR. As shown in Figure 3, Colon26 cells Although the system alone did not express KDR, expression of KDR was confirmed from tumor tissue of mice inoculated with Colon26. That is, it was confirmed that the tumor blood vessels appeared in the tumor tissue and formed a tumor.
  • Figure 3 shows the survival curve of mice inoculated with Colon26. HBSS as control
  • FIG. 4 shows the effect on the growth of Colon26-derived tumors in mice. Compared with the control, a suppressive effect on tumor growth was observed when dendritic cells were inoculated, and a remarkable suppressive effect was observed on dendritic cells pulsed with the peptide of SEQ ID NO: 5.
  • a peptide of the present invention (SEQ ID NO: 2 (amino acid start position KDR1318); SEQ ID NO: 3
  • TGM bone marrow of 6-8-week-old male 8 / 13 ⁇ 4 transgenic mice (TGM) expressing human HLA-AO201 was collected and GM-CSF (Kirin Brewery) as in Example 8.
  • mice (ATCC) (1 ⁇ 10 6 ) was inoculated into the right abdomen, and the survival and tumor growth of the mice were examined.
  • Figure 5 shows the survival rate of mice inoculated with B16.
  • HBSS alone 100 1
  • 8 out of 12 mice survived 35 days after tumor inoculation, and 11 out of 12 animals inoculated with dendritic cells not peptide-pulsed
  • a total of 12 mice survived and were resected.
  • FIG. 6 shows the effect on the growth of tumors derived from B16 mice in mice. Compared with controls, inoculation of ⁇ cells showed a suppressive effect on tumor growth, 2003/011722 A remarkable inhibitory effect was observed in dendritic cells pulsed with the peptide of SEQ ID NO: 30.
  • HT29 strain in which EGFP (see Leukemia 1999 Apr; 13 (4): 605-13) was forcibly expressed by an adenovirus was used.
  • the HT29 strain which forcibly expressed KDR and EGFP, may display its partial peptides on the cell surface.
  • Example 3 Using the CTL clone C29-169 described in Example 3 derived from the peptide of SEQ ID NO: 8 that binds to HLA-A24 (amino acid start position KDR169), killed cells against HLA-A24-positive HT29 cells by forcibly expressing KDR The effect was measured on a chrome release atsey.
  • Fig. 7 shows the results.
  • Cytotoxic activity was measured by the 51 Cr release method for 4 hours.
  • Target cells were incubated for 24 hours at a concentration of 1 X 10 6 ce lls / we ll in 6 well plate, Adenou-virus was introduced KDR or EGFP - infected with (Ad KDR or Ad_EGFP) at M0i 50, 4 Used after 8 hours.
  • the CTL clone C29-169 showed a remarkably higher cell killing effect on HLA-A24-positive # 29 that forcibly expressed KDR as compared with cells that forcibly expressed EGFP.
  • Cytotoxic activity against cells expressing endogenously KDR The HUVEC KT5 strain derived from HLA-A24-positive human umbilical cord vascular endothelial cells expressing endogenous KDR described in Example 3 The cell killing effect of CTL clone C29-169 was examined using KDR positive, HLA-A24 negative HUVEC strain P8 as a control. These cells present a partial peptide of KDR on the cell surface.
  • Cytotoxic activity was measured by the 51 Cr release method for 4 hours.
  • the target cells in Ci of Na 2 51 Cr0 4 at 37 ° C, 1 hour labeled after RPMI1640 washed three times, target cells (1 X 10 4 cells / 100 in 96-well U-type micro plates (Corning) ⁇ 1) and effect cells of various concentrations 100 1 force! ]
  • target cells (1 X 10 4 cells / 100 in 96-well U-type micro plates (Corning) ⁇ 1
  • effect cells of various concentrations 100 1 force! For example, 4 hours as the total amount 200 ⁇ 1, and cultured in C0 2 incubator one 37 ° C.
  • 100 ⁇ l of the supernatant was collected from each well and measured with a ⁇ counter, and the cytotoxic activity was calculated in the same manner as in Example 2.
  • CTL clone C29-169 exhibited a cell killing effect on HLA-A24-positive HUVEC expressing endogenous KDR and was low on HLA-A24-negative HUVEC. A cell killing effect was shown.
  • KDR1328), and SEQ ID NO: 33 KDR772
  • KDR172 two types
  • KWC14_190, KWC65-190 two types
  • KWC44_773-2L, KWC76-773-2L, KWC129-L four types
  • KWC44_773-2L, KWC76-773-2L, KWC129-L in the same manner as in Example 3.
  • 773-2L, KWC134- 773-2 I 2 types (KWC81-775, KWC85-775), 12 types
  • the peptide of SEQ ID NO: 29 (amino acid start position KDR775) was added to the HLA-A0201-positive T2 strain.
  • the cell killing effect of CTL clone (KDR C85-775 (KWC85-775)) obtained from the peptide of SEQ ID NO: 29 in Example 13 was examined using a chromium release assay. .
  • the CTL clone C85-775 (KWC85-775) clearly showed a cell-killing effect on HLA-A0201-positive cells displaying the peptide of SEQ ID NO: 29.
  • no cell killing effect was observed for control cells that did not display the peptide of SEQ ID NO: 29.
  • the cell killing effect of the CTL clone (KDR C85-775 KWC85-775) on the hepatocellular carcinoma strain HLA-A0201-positive HePG2 in which KDR was forcibly expressed by an adenovirus was examined using a chromium release assay.
  • HLA-A0201-positive HePG2 in which EGFP was forcibly expressed was used.
  • the CTL clone C85-775 (KWC85-775) compared the KDR peptide-displayed HLA-A0201-positive cells with the EGFP peptide-displayed cells. Remarkably high, showing a cell killing effect.
  • the HLA-A0201-positive T2 strain was supplemented with the peptide of SEQ ID NO: 34 (amino acid start position KDR1328) and used as a target cell.
  • the cell killing effect of -1328 (KWC51)) was examined using chromium-release.
  • the CTL clone KDR C51-1328 clearly showed a cell-killing effect on HLA-A0201-positive cells displaying the peptide of SEQ ID NO: 34.
  • no cell killing effect was observed on control cells that did not display the peptide of SEQ ID NO: 34.
  • the cell killing effect of the CTL clone (KDR C51-1328 (KWC51)) against the hepatocellular carcinoma strain HLA-A0201-positive HePG2 in which KDR was forcibly expressed by an adenovirus was examined using chromium release assay.
  • EGFP forced expressed was the HLA-A0201-positive HePG2 c result that was used as a control, as shown in FIG. 1 2,
  • CTL clone KDR C51 - 1328 (KWC51) is, KDR Bae HLA-A0201-positive cells displaying the peptide on the surface showed a remarkably higher cell killing effect than cells displaying the EGFP peptide.
  • a peptide of SEQ ID NO: 54 (KDR773-2L) obtained by converting the second peptide of SEQ ID NO: 30 into leucine was added to obtain target cells.
  • SEQ ID NO: 34 The cell killing effect of a CTL clone (KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L)) obtained from the above peptide was examined using a chromium release assay. The results are shown in FIG.
  • the CTL clone KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L) showed a clear cell killing effect on HLA-A0201-positive cells displaying KDR773-2L.
  • control cells that did not display KDR773-2L did not show any cell killing effect.
  • a CTL clone (KDR C44-773-2L (KWC44) obtained from the peptide shown in SEQ ID NO: 54 (KDR773-2L) obtained by converting the second peptide of SEQ ID NO: 30 into leucine in the HLA-A0201-positive T2 strain -773-2L)) was examined for the cell killing effect of chromium release assay using the peptide shown in SEQ ID NO: 30 (amino acid start position KDR773) which had not been modified to T2 as a target cell.
  • the CTL clone obtained by stimulation with the modified peptide was able to recognize and damage the peptide before modification.
  • the CTL clone KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L) showed that the EGFP peptide was present on the HLA-A0201-positive cells displaying the KDR peptide on the surface.
  • the cell killing effect was significantly higher than that of
  • Example 21 The cell killing effect of the CTL clone (KDR C51-1328 (KWC51)) obtained from the peptide of SEQ ID NO: 34 against the hepatocellular carcinoma strain HLA-A0201-positive HePG2 in which KDR was forcibly expressed by an adenovirus shows various antibodies We examined whether it would be blocked.
  • Example 22 Investigation of angiogenesis inhibitory activity by Dorsal Air Sac assay (DAS) The actual angiogenesis inhibitory activity of peptide epitope was determined by DAS assay in mice.
  • DAS Dorsal Air Sac assay
  • Membrane filters were fixed on both sides of the chamber ring, and sterilized with ethylene oxide gas.
  • B 16 melanoma cells were adjusted to 5 ⁇ 10 5 cells / 0.15 ml and injected into the chamber.
  • a mouse (A2 / kb transgenic mouse (derived from B16)) was fixed in a prone position, and 5-1 O ml of air was injected subcutaneously into the back of the mouse with a syringe to prepare an air sac. An incision was made about 1 cm below the Sac, a ring of the chamber filled with the cell suspension was implanted subcutaneously in the back, and the skin was closed with a skin stapler.
  • the mouse skin was peeled off from the entire chamber and fixed in an extended state. Marking was performed with black rubber rings, and the number of new blood vessels was measured using a stereoscopic microscope.
  • the blood vessels newly formed by angiogenic factors released from malignant tumor cells are characterized by progression in a zigzag manner, and are morphologically different from the originally existing background blood vessels. Therefore, new blood vessels were judged to be meandering blood vessels in the rubber ring and had a length of three or more thighs, and were counted as angiogenesis index (AI).
  • AI angiogenesis index
  • the peptide shown in SEQ ID NO: 40 (amino acid start position KDR190), the peptide shown in SEQ ID NO: 33 (KDR772), and the peptide shown in SEQ ID NO: 30
  • the group vaccinated with the peptide (KDR773), the peptide (KDR773-2L) shown in SEQ ID NO: 54, the peptide (KDR775) shown in SEQ ID NO: 29, and the peptide (KDR1084) shown in SEQ ID NO: 46 Compared with the DC alone administration group, the formation of tortuous blood vessels was clearly suppressed, and had an angiogenesis inhibitory effect with statistical significance.
  • Example 22 The in vivo antitumor effect in a treatment model using HLA-A * 0201-restricted epitope peptide (KDR773) was evaluated by the tumor area by the same method of inoculating a pectin as in Example 2. As a result, as apparent from FIG. 18, a significant tumor growth inhibitory effect was confirmed by vaccination with the peptide of SEQ ID NO: 30 and the peptide of SEQ ID NO: 34.
  • the HLA-A0201-positive T2 strain was supplemented with the peptide of SEQ ID NO: 40 (amino acid start position KDR190) to obtain target cells, and the CTL clone obtained from the peptide of SEQ ID NO: 40 (KWC65- 190) was examined using chromium-release.
  • the CTL clone KWC65-190 clearly showed a cell killing effect on HLA-A0201-positive cells displaying the peptide of SEQ ID NO: 40.
  • no cell killing effect was observed for control cells that did not display the peptide of SEQ ID NO: 40.
  • the HLA-A0201-positive T2 strain was added with the peptide of SEQ ID NO: 33 (amino acid start position KDR772) and used as a target cell.
  • the CTL clone obtained from the peptide of SEQ ID NO: 33 was examined using chromium-release atsushi.
  • the CTL clone KWC72-772 clearly showed a cell killing effect on HLA-A0201-positive cells displaying the peptide of SEQ ID NO: 33.
  • no cell killing effect was observed on control cells that did not display the peptide of SEQ ID NO: 33.
  • the cell killing effect of the CTL clone (KWC72-772) on the hepatocellular carcinoma strain HLA-A0201-positive HePG2 in which KDR was forcibly expressed by an adenovirus was examined using chromium release assay.
  • HLA-A0201-positive HePG2 in which EGFP was forcibly expressed was used.
  • the CTL clone KWC72-772 showed significantly higher cell killing of HLA-A0201-positive cells displaying the KDR peptide compared to cells displaying the EGFP peptide. The effect was shown.
  • HLA-A24-positive human B-lymphoblast cell line A24-LCL (HLA-A24 / 24, manufactured by Takara Shuzo) has SEQ ID NO: 2 (amino acid start position KDR1318), 3 (KDR220), 5 (KDR189), In addition, a peptide of 11 (amino acid start position KDR826) was added to obtain target cells, and the cell killing effect of CTL clones C7-1318, KWC46 C18-189, and C65-826 described in Example 3 was determined. It was examined using Release Atsushi.
  • the CTL clones C7-1318, KWC46, C18-189, and C65-826 exhibited the peptides of SEQ ID NOs: 2, 3, 5, and 11, respectively.
  • -It showed a clear cell killing effect on A24 positive cells.
  • control cells that did not display each peptide had no or almost no cell killing effect.
  • Example 11 In the same manner as in Example 1, CTL clones C7-1318, KWC46, C18-189, and C65-826 described in Example 3 against human colon cancer HT29 strain (ATCC) in which KDR was forcibly expressed by an adenovirus. The cell killing effect of was investigated using chromium release. As a control, an HLA-A24-positive HT29 strain in which EGFP was forcibly expressed was used.
  • CTL clones C7-1318, KWC46, C18-189, and C65 826 all inhibited EGFP against HLA-A24-positive HT29 that forcibly expressed KDR. It showed a remarkably higher cell killing effect as compared with the expressed cells.
  • various epitope peptides peptides having high HLA-24 binding affinity, SEQ ID NO: 8 (amino acid start position KDR169), SEQ ID NO: 5 (KDR189), sequence No. 3 (KDR220), SEQ ID No. 11 (KDR826), and SEQ ID No. 17 (KDR1318), and SEQ ID NO: 40 (KDR190), SEQ ID NO: 33 (KDR772) as peptides having high HLA-A0201 binding affinity , SEQ ID NO: 30 (KDR773), SEQ ID NO: 29 (KDR775), and SEQ ID NO: 34 (KDR1328)), and the CTL response to each peptide after stimulation was examined.
  • Peptide-specific CTLs in PBMC were detected using the method described in Maeda, Y. et al., Br. J. Cancer 87, 796-804 (2002). It was first incubated in Ueru 9 6 ⁇ El plates u bottom mold which was taken from the patient PBMC with (1 X 1 0 5 cells) the medium was placed in 1 with each peptide 1 0 mu Micromax. The medium consists of 45% RPMI-1640 medium, 45% AIM-V medium, 10% FBS, 100U / ml interleukin-2 (IL-2), and 0.1 MEM non-essential amino acid solution . Every three days, half of the medium was removed and replaced with fresh medium containing the corresponding peptide (20 ⁇ ).
  • CTL precursors were produced in HLA-A2 and -A24 cancer patients as well as healthy donors (Table 9).
  • patients A, B and C are HLA-A24 patients
  • patient D is an HLA-A02 patient.
  • Patients A and D are colon cancer patients
  • patients B and C are melanoma patients.
  • CMV is a cytomegalovirus-derived peptide used as a positive control.
  • these peptides those having high A-124 binding affinity are described, for example, in Kuzushima, K. et al., Blood 2001, 98 ( 6): pl872-1881, and those having high A-2 binding affinity are described, for example, in Solache A. et al., J. of Immunol. 1999, 163 (10); p5512-5518, respectively.
  • KDR 826 11 32 3 32 0 24 KDR 775 2 24 DR 1318 0 32 9 32 1 24 KDR 1328 0 24
  • the present invention induces cytotoxic T cells by targeting endothelial cells formed in a wide range of tumor tissues, and is very effective as a cancer vaccine for treating and preventing tumors containing the same.
  • cytotoxic T cells by targeting endothelial cells formed in a wide range of tumor tissues, and is very effective as a cancer vaccine for treating and preventing tumors containing the same.

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Abstract

　配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチド、配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチドまたはデカペプチド、及びこれらのアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド、並びにこれらのペプチドを含む腫瘍の治療または予防のための医薬を提供する。本発明のペプチドはワクチンとして使用することができる。

Description

明 細 書
KDRぺプチド及ぴこれを含むワクチン 技術分野
本発明は、 癌ワクチンとして非常に有効な新規ペプチド、 及ぴ該ペプチドを含 む腫瘍の治療及び予防のための医薬に関する。 背景技術
腫瘍拒絶抗原遺伝子が悪性黒色腫を中心に同定されるに従って、 それを応用し た癌免疫療法が開発されている。 とりわけ、 抗腫瘍免疫応答における CD8陽性 T細 胞の重要性が認識されるに伴い、 腫瘍特異的 CD8陽性 T細胞を生体内で惹起させる 癌ワクチン療法が着目され、 種々の臨床応用が行われている。 また、 10個前後の アミノ酸残基からなるぺプチドが種々の共刺激分子の補助により Classl経路を介 して T細胞を活性化し、 腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞（CTL)を誘導する機序が解明 され、 さらに個々の HLA分子に拘束性を示すぺプチドの同定も精力的に進んでい る。
しかしながら、 腫瘍を制御する事は未だ完全に出来ていないのが現状である。 その原因として、 腫瘍細胞の不均一性、 腫瘍細胞における MHC-Class Iの発現低 下や消失、 さらに腫瘍細胞における標的分子の欠落が考えられる。 また、 現在同 定されている腫瘍抗原ぺプチドはある種の腫瘍に存在するが、 全ての腫瘍を網羅 できるものではない。 そこで、 これらの問題点を解決するため、 標的細胞を腫瘍 細胞ではなく、 腫瘍血管における内皮細胞に着目した。 すなわち、 内皮細胞は 匪 C - Class Iの発現低下や消失、 また不均一性といった問題がほとんどないので、 腫瘍血管を標的にする CTLが誘導できれば、 腫瘍の種類に関係なく、 また Class I の消失や標的分子の欠損といった従来の癌ワクチン療法で問題となっていた原因 を凌駕でき、 治療効果が大いに期待できると考えられる。 癌における新生血管の 研究は 1970年代の Folkraanらの先駆的な仮説の提唱に始まり、 様々な角度から研 究がなされている。 なかでも、 VEGF- VEGF受容体（VEGFR)において多くの検討がな され、 腫瘍新生血管におけるその意義が評価されている。 特に癌治療においては、 target-oriented drugとして新生血管阻害剤の開発が精力的に進められ、 すでに 臨床治験も行われているが、 この考え方を癌ワクチン療法に生かした治療は未だ 行われていない。 一つの理由として VEGFRが正常細胞に発現しているため免疫寛 容状態になっていると考えられた。 しかしながら、 1990年代の Plate, Mil lauer, Risauらの研究により腫瘍組織における内皮細胞において VEGFRが強発現している 事が確認され、 また、 CEA，HER/neuのように正常細胞でも発現している自己抗原 に対する免疫応答が必ずしも免疫寛容状態になっていないことが明らかになった 事により、 VEGFR が癌ワクチン療法の標的に成り得るのではないかと考えた。 最近、 VEGFRに対する能動免疫を行うことにより、 腫瘍における血管新生及び 転移を抑制できることが報告された （The Journal of experimental medicine 2002年 第 195卷 第 12号 p. 1575 - 1584) 。 しかし、 この文献では可溶性の VEGFRタンパク質を用いているに過ぎず、 有効なぺプチドのァミノ酸配列につい ての検討は何らなされていない。 発明の開示
本発明者等は、 VEGFシグナルにおいて内皮細胞の増殖に関与すると考えられ、 腫瘍組織内皮細胞において強発現している VEGFR2 (KDR/flk- 1、 以下 KDRという） を標的とした癌ワクチン療法の可能性に着目し、 ワクチンとして有効に用いるこ とができるペプチドの探索を行い、 その特異性について検討を行い、 本発明を完 成するに到った。
すなわち、 本発明は、 以下の （1 ) 〜 （2 2 ) を提供する。
( 1 ) 配列番号 2、 3、 5、 8、 1 1または 1 2に示すアミノ酸配列からな るぺプチドから選ばれるノナぺプチド。
( 2 ) 配列番号 2、 3、 5、 8、 1 1または 1 2に示すアミノ酸配列におい て 1個、 2個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、 細胞傷害性 T 細胞の誘導能を有するぺプチド。
( 3 ) N末端から 2番目のアミノ酸がフエ二ルァラニン、 チロシン、 メチォ ニンまたはトリブトファンである、 上記 （2 ) に記載のペプチド。 (4) C末端のアミノ酸がフエ二ルァラニン、 ロイシン、 イソロイシン、 ト リプトフアンまたはメチォニンである、 上記 （2) または （3) に記載のぺプチ ド、。
(5) 配列番号 29、 30、 3 3、 34、 40、 または 46に示すアミノ酸 配列からなるぺプチドから選ばれるノナぺプチドまたはデカぺプチド。
(6) 配列番号 29、 30、 3 3、 34、 40、 または 46に示すアミノ酸 配列において 1個、 2個または数個のアミノ酸が置換ま は付加されており、 細 胞傷害性 T細胞の誘導能を有するぺプチド。
(7) N末端から 2番目のアミノ酸がロイシンまたはメチォニンである、 上 記 （6) に記載のペプチド。
(8) C末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンである、 上記 （6) または (7) に記載のペプチド。
(9) 上記 （1) 〜 （8) のいずれかに記載のペプチドを 1種以上含む、 腫 瘍の治療及び Zまたは予防のための医薬。
(1 0) 上記 （1) 〜 （8) のいずれかに記載のペプチドを 1種以上含む、 糖尿病性網膜症、 慢性関節リウマチ、 乾癬、 ァテローム性動脈硬化症の治療のた めの医薬。
(1 1) 上記 （1) 〜 （8) のいずれかに記載のペプチドと HL A抗原とを 含む複合体を表面に提示しているェキソソーム。
(1 2) ^[1 抗原が111 ー 24または HL A— AO 2である、 上記 (1 1) に記載のェキソソーム。
(1 3) HL A抗原が HL A— A 2402または H LA— 0 20 1である、 上記 （1 2) に記載のェキソソーム。
(1 4) 上記 （1) 〜 （8) のいずれかに記載のペプチドを用いて CTL誘 導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
(1 5) 上記 （1) 〜 （8) のいずれかに記載のペプチドを用いて CTLを 誘導する方法。
(1 6) 上記 （1) 〜 （8) のいずれかに記載のペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含む遺伝子を抗原提示細胞に導入することを含む、 細胞傷害性 T 細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
(1 7) 上記 （1) 〜 （8) のいずれかに記載のペプチドを用いて誘導され る、 単離された細胞傷害性 T細胞。
(1 8) HLA抗原と上記 （1) 〜 （8) のいずれかに記載のペプチドとの 複合体を提示してなる抗原提示細胞。
(1 9) 上記 （14) または （1 5) に記載の方法によって誘導される、 上 記 （1 8) に記載の抗原提示細胞。
(20) 上記 （1) 〜 （8) のいずれかに記載のペプチドを有効成分とする、 病態部位における血管新生阻害のためのワクチン。
(2 1) 111^ 抗原が ]： ー八24または HL A— AO 2である被験者に 対して投与するための、 上記 （20) に記載のワクチン。
(22) 悪性腫瘍の増殖及び Zまたは転移を抑制するために使用される、 上 記 （20) または （2 1) に記載のワクチン。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2002- 267285、 2003 - 062003、 2003 - 167042号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 標的細胞に対する CTLクローンによる細胞傷害活性を示す。
図 2は、 樹立した CTLクローンの HLA-テトラマー解析の結果を示す。
(a) 本発明のぺプチドによって誘導された CTLクローン及びフィーダ一細胞
(b) フィーダ一細胞 （対照）
図 3は、 colon26を接種した BALBんマウスの生存に対する本発明のぺプチドを 用いたヮクチン接種の効果を示す。
図 4は、 colon26由来の腫瘍の増殖に対する本発明のぺプチドを用いたヮクチ ン接種の効果を示す。
図 5は、 B16を接種したマウスの生存に対する本発明のぺプチドを用いたワク チン接種の効果を示す。
図 6は、 B16メラノーマ由来の腫瘍の増殖に対する本発明のぺプチドを用いた ワクチン接種の効果を示す。 A2/Kb TGMに対して B16腫瘍細胞を皮下注射でチヤレ ンジする前に、 KDR773でパルスした DC (秦） 、 DC単独 （△) 、 または HBSS (□) で 1週間の間隔をおいて 2回ワクチン接種した。 平均の腫瘍増殖を図示した。 P < 0. 01。
図 7は、 本発明のぺプチドを提示した HLA- A24陽性細胞に対する CTLクローン C29- 169の殺細胞効果を示す。
図 8は、 本発明のぺプチドを提示した HLA- A24陽性細胞に対する CTLクローン C29- 169の殺細胞効果を示す。
図 9は、 本発明のぺプチドを提示した HLA- A0201陽性細胞に対する CTLクローン KDR C85-775 (KWC85- 775)の殺細胞効果を示す。
図 1 0は、 KDRペプチドを提示した HLA- A0201陽性細胞に対する CTLクローン KDR C85-775 (KWC85-775)の殺細胞効果を示す。
図 1 1は、 本発明のぺプチドを提示した HLA- A0201陽性細胞に対する CTLクロー ン KDR C51-1328 (KWC51)の殺細胞効果を示す。
図 1 2は、 KDRペプチドを提示した HLA- A0201陽性細胞に対する CTLクローン KDR C51-1328 (K C51)の殺細胞効果を示す。
図 1 3は、 本発明のペプチドを提示した HLA - A0201陽性細胞に対する CTLクロー ン KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L)の殺細胞効果を示す。
図 1 4は、 本発明のぺプチドを提示した HLA- A0201陽性細胞に対する CTLクロー ン KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L)の殺細胞効果を示す。
図 1 5は、 KDRぺプチドを提示した HLA - A0201陽性細胞に対する CTLクローン KDR C44-773-2L (KWC44- 773- 2L)の殺細胞効果を示す。
図 1 6は、 CTLクローンの殺細胞効果に対する各種抗体の阻害作用を示す。 図 1 7は、 A2/Kb TGMにおいて B16細胞によって誘導される血管新生応答に対す る本発明のペプチドの阻害活性を示す。 マウスを HBSS、 パルスしていない DC、 ま たは本発明のェピトープペプチド （KDR190、 772、 773、 773- 2L、 775、 または 1084) でパルスした DCで 2回ワクチン接種した。 矢印は特徴的なジグザグに進む 新たに形成された血管を示す。
図 1 8は、 本発明のぺプチドのトランスジエニックマウスにおけるヒ ト腫瘍体 積の増加に対する抑制効果を示す。 3 011722 図 1 9は、 本発明のぺプチドを提示した HLA- A0201陽性細胞に対する CTLクロー ン KWC65- 190の殺細胞効果を示す。 隱 ：ぺプチド存在下、 口 ：ぺプチド不存在下 図 2 0は、 本発明のぺプチドを提示した HLA-A0201陽性細胞に対する CTLクロー ン KWC72-772の殺細胞効果を示す。 園 ：ぺプチド存在下、 口 ：ぺプチド不存在下 図 2 1は、 KDRぺプチドを提示した HLA- A0201陽性細胞に対する CTLクローン KWC72- 772の殺細胞効果を示す。 國 ： HePG2- VEGFR2、 □ ： HePG2- EGFP
図 2 2は、 本発明のぺプチドを提示した HLA- A24陽性細胞に対する CTLクローン C7- 1318の殺細胞効果を示す。 國 ：ぺプチド存在下、 口 ：ぺプチド不存在下
図 2 3は、 本発明のペプチドを提示した HLA- A24陽性細胞に対する CTLクローン KWC46の殺細胞効果を示す。 画 ：ぺプチド存在下、 口 ：ぺプチド不存在下
図 2 4は、 本発明のぺプチドを提示した HLA - A24陽性細胞に対する CTLクローン C18-189の殺細胞効果を示す。 園 ：ぺプチド存在下、 口 ：ぺプチド不存在下
図 2 5は、 本発明のぺプチドを提示した HLA- A24陽性細胞に対する CTLクローン C65- 826の殺細胞効果を示す。 園 ：ぺプチド存在下、 口 ：ぺプチド不存在下
図 2 6は、 本発明のぺプチドを提示した HLA- A24陽性細胞に対する CTLクローン C7 - 1318の殺細胞効果を示す。 翻 ： HT29- VEGFR2、 □ ： HT29- EGFP
図 2 7は、 本発明のぺプチドを提示した HLA- A24陽性細胞に対する CTLクローン KWC46の殺細胞効果を示す。 酾 ： HT29- VEGFR2、 □ ： HT29- EGFP
図 2 8は、 本発明のぺプチドを提示した HLA - A24陽性細胞に対する CTLクローン C18- 189の殺細胞効果を示す。 画 ： HT29-VEGFR2, □ ： HT29- EGFP
図 2 9は、 本発明のペプチドを提示した HLA- A24陽性細胞に対する CTLクローン C65- 826の殺細胞効果を示す。 騸 ： HT29- VEGFR2、 □ ： HT29-EGFP
図 3 0は、 BALBんにおいて colon26細胞によって誘導される血管新生応答に対 する本発明のペプチドの阻害活性を示す。 マウスを HBSS、 パルスしていない DC、 または本発明のェピトープぺプチド （KDR189または 826) でパルスした DCで 2回 ヮクチン接種した。 矢印は特徴的なジグザグに進む新たに形成された血管を示す。 図 3 1は、 BALBんにおいて colon26細胞によって誘導される血管新生応答に対 する本発明のペプチドの阻害を示す。 柱は平均を、 縦棒は標準誤差を示す。
図 3 2は、 本発明のぺプチドで刺激した患者由来の CTLによる HLA-A24陽性細胞 に対する殺細胞効果を示す。 ♦ ：ぺプチド存在下、 口 ：ぺプチド不存在下
( A) 配列番号 8 (アミノ酸開始位置 KDRI69) で刺激して得られた結腸癌患者由 来の CTLの殺細胞効果
( B ) 配列番号 5 (アミノ酸開始位置 KDR189) で刺激して得られた結腸癌患者由 来の CTLの殺細胞効果
( C ) 配列番号 3 (アミノ酸開始位置 KDR220) で刺激して得られた結腸癌患者由 来の CTLの殺細胞効果 発明の実施の形態
本発明者等はまず、 in vivoにおいて抗原提示細胞上に提示される場合に、 種々のタンパク質が 9量体のペプチド （ノナペプチド） に分解されてから提示さ れることを考慮し、 KDRタンパク質の 9量体または 1 0量体の部分ペプチドにつ いて、 ヒ ト主要組織適合抗原 （MH C抗原） である H L A抗原との結合親和性を 検討した。 尚、 表 1の右側のペプチドにおいて、 小文字は 5番目のアミノ酸を示 す。
ヒ ト KDRタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、 例えば米国特許第 5, 861, 301 号に記載されており、 当業者であれば容易に入手することができる。 9量体及び 1 0量体ペプチドは、 得られた KDRタンパク質の全アミノ酸配列に基づいて、 任 意の位置からのペプチドを合成して得ることができる。 ペプチドの合成は、 通常 のぺプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。 通常用いら れる合成方法は、 例えば、 Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966； The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc. , New York, 197り； ペプチド合成、 丸善 （株） 、 1975 ; ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 （株） 、 1985 ; 医薬品の開 発 続 第 1 4卷 ， ペプチド合成、 広川書店、 1991等の文献や、 国際公開 W099/67288号等の公報に記載されている。 H L A抗原との結合は、 細胞表面に H L A抗原を有する細胞、 例えば樹状細胞を単離して、 細胞へのペプチドの結合を 通常行われる手法を用いて測定することができる。
あるいはまた、 最近ィンターネット上で利用可能となっているソフトウエア、 例えば Parker K. C. , J. Immunol. 152, 1994に記載されているもの等を用いて、 2003/011722 種々のぺプチドと H L A抗原との結合親和性を in silicoで計算することもでき る。 尚、 H L A抗原との結合親和性は、 例えば Parker, K. C. , J. Immunol. , 152， 1994； Nukaya, I. , Int. J. Cancer, 80， 1999等に記載のように測定することが できる。
H L A抗原としては、 例えば日本人において多く発現しているといわれる A— 2 4型または A— 0 2型等を用いることが有効な結果を得るために好ましく、 更 に好ましくは A— 2 4 0 2、 A— 0 2 0 1等のサブタイプである。 しかしながら、 臨床においては、 治療を必要とする患者の H L A抗原の型を予め調べることによ り、 これとの結合親和性、 あるいは抗原提示による細胞傷害性 T細胞 （C T L ) 誘導能の高いペプチドを適宜選択することができる。 更に、 結合親和性及び C T L誘導能の高いぺプチドを得るために、 天^^に存在する KDR部分べプチドのァミ ノ酸配列に基づいて 1個、 2個または数個のアミノ酸の置換または付加を行うこ ともできる。 ここで、 「数個」 とは、 5個以下、 好ましくは 3個以下を意味する c 更に、 天然において提示されるペプチド以外にも、 既に H L A抗原に結合して提 示されるペプチドの配列の規則性が知られているので （J. Immunol. , 152, 3913, 1994； Immunogenetics. 41： 178, 1995； J. Immunol. 155 : 4307， 1994) 、 得られ たペプチドに対してこれらの規則性に基づいた改変を行っても良い。 例えば、 H L A - 2 4結合親和性の高いものはぺプチドの N末端から 2番目のアミノ酸をフ ェニルァラニン、 チロシン、 メチォニンまたはトリプトファンに置換したり、 C 末端のアミノ酸をフエ二ルァラニン、 ロイシン、 イソロイシン、 トリプトファン またはメチォニンに置換したペプチドも好適に使用することができる。 一方、 H L A— 0 2 0 1結合親和性の高いものは、 ぺプチドの N末端から 2番目のァミノ 酸をロイシンまたはメチォニンに置換したり、 C末端のアミノ酸をバリンまたは ロイシンに置換したペプチドも好適に使用することができる。 更に、 ペプチドの N末端及び/または C末端に 1〜 2個のアミノ酸が付加していても良い。
しかしながら、 ぺプチドの配列が他の機能を有する内在性または外来性のタン パク質のアミノ酸配列の一部と同一となる場合には、 自己免疫疾患等の副作用が 生じたり、 あるいは特定の物質に対するアレルギ一症状を引き起こしたりする可 能性があるため、 利用可能なデータベースを用いてホモロジ一検索を行い、 他の 3 011722 タンパク質のアミノ酸配列と一致することを避けるのが好ましい。 更に、 ホモ口 ジー検索において、 アミノ酸が 1個または 2個異なるぺプチドも存在しないこと が明らかであれば、 H L A抗原との結合親和性及び/または C T L誘導能を高め るための上記アミノ酸配列の改変もこのような問題を生じるおそれがない。
上記のようにして H L A抗原との結合親和性の高いぺプチドは、 癌ワクチンと して有効である可能性が高いことが予想されるが、 高い結合親和性を有すること を指標として選択した候補べプチドについて、 実際に C T L誘導能を有するか否 かを検討することが必要である。 C T L誘導能の確認は、 ヒ ト MH C抗原を有す る抗原提示細胞 （例えば B—リンパ球、 マクロファージ、 樹状細胞） 、 具体的に はヒ ト末梢血単核球由来の樹状細胞を誘導し、 ぺプチドで刺激した後に C D 8陽 性細胞と混合し、 標的細胞に対する細胞傷害活性を測定する。 反応系として、 ヒ ト H L A抗原を発現するように作製されたトランスジエニック動物 （例えば、 Hum. Immunol. 2000 Aug.；61 (8)： 764-79 Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice : dependence on HLA class II restricted T (H) response. , BenMohamed L.， Krishnan R. , Longmate J.， Auge C.， Low L. , Primus J.， Diamond DJ.に記載のもの） を用いることもできる。 細胞傷害活性は、 例えば標 的細胞を51 C r等で放射標識し、 標的細胞から遊離した放射活性から計算するこ とができる。 あるいはまた、 ペプチドを拘束した抗原提示細胞の存在下で C T L が産生 ·放出した IFN - y及び抗 IFN- T モノクローナル抗体によって培地上に可視 化される阻止円を測定することによって観察することもできる。
上記のようにしてぺプチドの C T L誘導能を検討した結果、 H L A抗原との結 合親和性が高いものが必ずしも誘導能が高いわけではないことが明らかとなった。 そして、 VYSSEEAEL (配列番号 2 ) 、 GYRIYDVVL (配列番号 3 ) 、 SYMISYAGM (配 列番号 5 ) 、 RFVPDGNRI (配列番号 8 ) 、 KWEFPRDRL (配列番号 1 1 ) 、 または
DFLTLEHLI (配列番号 1 2 ) に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる ノナぺプチド、 及び AMFFWLLLV (配列番号 2 9 ) 、 VIAMFFWLL (配列番号 3 0 ) 、
AVIAMFFWL (配列番号 3 3 ) 、 KLIEIGVQT (配列番号 3 4 ) 、 YMISYAGMV (配列番 号 4 0 ) または IQSDVWSFGV (配列番号 4 6 ) に示すアミノ酸配列からなるぺプチ ドから選ばれるノナぺプチドまたはデカぺプチドが特に高い C T L誘導能を有す ることが明らかとなった。
本発明は更に、 配列番号 2、 3、 5、 8、 1 1または 1 2に示すアミノ酸配列 において 1個、 2個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、 細胞傷 害性 T細胞の誘導能を有するペプチドも提供する。 配列番号 2、 3、 5、 8、 1 1または 1 2に示す 9個のアミノ酸からなるアミノ酸配列に基づいて、 1個、 2 個または数個のアミノ酸の置換または付加は、 他のタンパク質のアミノ酸配列と の一致がない限りにおいて、 C T L誘導能を有し得る。 特に、 アミノ酸の置換と して、 N末端から 2番目のアミノ酸のフエ-ルァラニン、 チロシン、 メチォニン またはトリプトファンへの置換、 C末端のアミノ酸のフエ二ルァラニン、 口イシ ン、 イソロイシン、 トリプトファンまたはメチォニンへの置換、 アミノ酸の付加 として、 N末端及び/または C末端への 1〜 2個のアミノ酸の付加は好適な例で める。
本発明はまた、 配列番号 2 9、 3 0、 3 3、 3 4、 4 0、 または 4 6に示すァ ミノ酸配列において 1個、 2個または数個のアミノ酸が置換または付加されてお り、 細胞傷害性 T細胞の誘導能を有するペプチドも提供する。 配列番号 2 9、 3 0、 3 3、 3 4、 4 0、 または 4 6に示す 9個または 1 0個のアミノ酸からなる アミノ酸配列に基づいて、 1個、 2個または数個のアミノ酸の置換または付加は、 他のタンパク質のアミノ酸配列との一致がない限りにおいて、 C T L誘導能を有 し得る。 特に、 アミノ酸の置換として、 N末端から 2番目のアミノ酸のロイシン またはメチォニンへの置換、 C末端のアミノ酸のバリンまたはロイシンへの置換、 アミノ酸の付加として、 N末端及び Zまたは C末端への 1〜 2個のァミノ酸の付 加は好適な例である。 こうした改変ぺプチドの例として、 限定するものではない が、 例えば配列番号 3 0のぺプチドの N末端から 2番目のァミノ酸をロイシンに 変換したペプチド （配列番号 5 4 ) が挙げられる。 これらの改変ペプチドによる 刺激によって得られる CTLクローンは改変前のぺプチドを認識し、 傷害すること ができる。
上記の本発明のペプチドは、 1種または 2種以上の組み合わせとして、 生体内 で C T Lを誘導し得る癌ワクチンとして使用することができる。 本発明のぺプチ ドの投与により、 抗原提示細胞の H L A抗原に該ぺプチドが高密度に提示され、 提示されたぺプチドと H L A抗原との複合体に対して特異的に反応する C T Lが 誘導され、 標的細胞となるべき腫瘍細胞内の血管内皮細胞に対する攻撃力が高ま る。 あるいは、 被験者から樹状細胞を取り出して本発明のペプチドで刺激するこ とにより、 細胞表面に本発明のペプチドを拘束した抗原提示細胞が得られ、 これ を再度被験者に投与することで被験者において C T Lを誘導し、 標的細胞に対す る攻撃力を高めることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明のペプチドを 1種以上含む、 腫瘍の治療または腫 瘍の増殖 .転移等の予防のための医薬を提供するものである。 更に、 病態部位に おける血管新生は、 腫瘍の他、 糖尿病性網膜症、 慢性関節リウマチ、 乾癬、 ァテ ローム性動脈硬化症のような疾患、 並びに固形癌の転移と深く結びついている (Folkman, J.， Nature Med. 1 : 27—31 (1995) ; Bicknell, R. , Harris, A. L. , Curr. Opin. Oncol. 8 : 60-65 (1996) ) 。 従って、 本発明のペプチドは、 腫瘍、 糖尿病性網膜症、 慢性関節リウマチ、 乾癬、 ァテローム性動脈硬化症のような疾 患、 並びに固形癌の転移の治療に用いることができる。
本発明のペプチドは、 悪性腫瘍組織において形成され、 正常な血管とは形態学 的に異なる蛇行性血管の形成を阻害することが確かめられたが、 ヮクチン接種し たマウスにおける創傷治癒及び受精能を解析した結果、 正常な生理的血管新生に 対しては悪影響を有さないことも確認した。 更に、 本発明のペプチドを認識する CTLクローンを用いて非増殖性または増殖性内皮細胞に対する細胞傷害性を in vitroで試験したところ、 これらのクローンは非増殖性内皮細胞よりも増殖性内 皮細胞に対して強い活性を示すことも明らかとなった。 すなわち、 増殖性内皮細 胞が観察される疾患、 特に癌において非常に特異的に作用することができる。
尚、 in vivo及び in vitroにおいて、 本発明のペプチドによる樹状細胞の刺激 は、 細胞に対して高濃度のペプチドを存在させることによって、 該細胞に予め拘 束されているペプチドとの交換が生じ、 容易に行われる。 このため、 本発明にお いて使用されるぺプチドは、 H L A抗原との結合親和性がある程度以上高いこと が必要とされる。
本発明の医薬は、 本発明のペプチドを単独で直接投与しても良いが、 通常用い られる製剤学的方法によって製剤化した医薬組成物として投与しても良い。 その 場合、 本発明のペプチドの他に、 通常医薬に用いられる担体、 賦形剤等を適宜含 むことができ、 特に限定されるものではない。 本発明の医薬の用途としては、 胃 癌、 十二指腸癌、 大腸癌、 肺癌、 乳癌、 前立腺癌、 脳腫瘍等の種々の腫瘍の治療 及び予防に用いることができる。 本発明のペプチドは、 腫瘍細胞そのものではな く、 腫瘍組織内に新たに形成される新生血管の内皮細胞を標的とするものであり、 従って、 治療対象の腫瘍は広範囲にわたり、 特に用途を限定するものではない。 本発明のペプチドを有効成分とする腫瘍の治療及ぴ Zまたは予防のための医薬 は、 細胞性免疫が効果的に成立するようにアジュバントと共に投与したり、 他の 抗癌剤等の有効成分と共に投与したり、 また粒子状の剤型にして投与することが できる。 アジュバントとしては、 文献 （Clin. Microbiol. Rev. , 7:277 - 289， 1994) に記載のものなどが応用可能である。 また、 リボソーム製剤、 直径数 zm のビーズに結合させた粒子状の製剤、 リピッドを結合させた製剤なども考えられ る。 投与方法としては、 経口投与、 皮内投与、 皮下投与、 静脈注射などが利用で き、 全身投与、 あるいは目的となる腫瘍の近傍に局所投与しても良い。 本発明の ペプチドの投与量は、 治療すべき疾患、 患者の年齢、 体重、 投与方法等により適 宜調整することができるが、 通常 0, 001mg〜1000mg、 好ましくは 0.001mg〜 lOOOmg, より好ましくは 0. lmg〜10mgであり、 数日ないし数月に 1回投与するの が好ましい。当業者であれば、 適当な投与量を適宜選択することが可能である。 あるいはまた、 本発明は、 本発明のペプチドと HL A抗原との複合体を表面に 提示している、 ェキソソームと呼ばれる細胞内小胞を提供する。 ェキソソームの 調製は、 例えば特表平 11— 510507号、 及び特表 2000— 5 1 2161 号に詳細に記載されている方法を用いて行うことができるが、 好ましくは治療及 び Zまたは予防の対象となる被験者から得た抗原提示細胞を用いて調製する。 本 発明のェキソソームは、 上記本発明のぺプチドと同様に癌ワクチンとして接種す ることができる。
HLA抗原としては、 治療及びノまたは予防を必要とする被験者の HLA抗原 と同じ型のものであることが必要である。 例えば、 日本人の場合には HL A— A
24または HLA— AO 2、 特に HLA— A 2402または HLA— 0201と 2003/011722 すると好適であることが多い。
本発明はまた、 本発明のぺプチドを用いた抗原提示細胞の誘導方法も提供する。 樹状細胞を末梢血単球から誘導した後、 in vitroまたは in vivoで本発明のぺプ チドと接触 （刺激） させ、 抗原提示細胞を誘導することができる。 本発明のぺプ チドを被験者に投与した場合、 被験者の体内で本発明のぺプチドを拘束した抗原 提示細胞が誘導される。 あるいは、 抗原提示細胞に本発明のペプチドを in vitro で拘束させた後に被験者にワクチンとして投与することもできる。
本発明はまた、 上記本発明のぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含む遺 伝子を in vitroで抗原提示細胞に導入することを含む、 細胞傷害性 T細胞誘導能 の高い抗原提示細胞を誘導する方法を提供する。 導入する遺伝子は D N Aの形態 であっても R N Aの形態であっても良い。 導入の方法は当分野において通常行わ れるリポフエクシヨン、 エレク ト口ポレーシヨン、 リ ン酸カルシウム法等の種々 の方法を用いれば良く、 特に限定するものではない。 具体的には、 例えば Cancer Res. , 56 : 5672， 1996； J. Immunol. , 161 : 5607， 1998； J. Exp. Med. , 184： 465, 1996； 特表 2000- 509281号に記載のようにして行うことができる。 遺伝子を抗原 提示細胞に導入することによって、 該遺伝子は細胞中で転写、 翻訳等の処理の後、 得られたタンパク質が MH Cクラス Iまたはクラス IIのプロセッシング及び提示 経路を経て、 部分ペプチドが提示される。
本発明は更に、 上記本発明のぺプチドを用いて C T Lを誘導する方法を提供す る。 本発明のペプチドを被験者に投与した場合、 被験者の体内で C T Lが誘導さ れ、 腫瘍組織内の新生血管の内皮細胞を標的とした免疫力が増強される。 あるい は、 被験者由来の抗原提示細胞及び C D 8陽性細胞、 または末梢血単核球を in vitroで本発明のペプチドと接触 （刺激） させ、 C T Lを誘導してから被験者に もどす ex vivoの治療方法にも用いることができる。
本発明は更に、 本発明のペプチドを用いて誘導される、 単離された細胞傷害性
T細胞を提供する。 本発明のぺプチドを提示した抗原提示細胞による刺激に基づ いて誘導された細胞傷害性 T細胞は、 好ましくは治療及び Zまたは予防の対象で ある被験者由来のものであり、 単独、 または、 本発明のペプチド、 ェキソソーム 等を含む、 他の医薬と共に抗腫瘍効果を目的として投与することができる。 得ら れた細胞傷害性 T細胞は、 本発明のペプチド、 好ましくは誘導に用いられたもの と同じべプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。 標的細胞は、
KDRを内在的に発現する細胞であっても、 強制的に KDRを発現させた細胞であって も良く、 また、 本発明のペプチドの刺激によって細胞表面に該ペプチドを提示す る細胞であっても攻撃の対象となり得る。
本発明は更に、 H L A抗原と本発明のぺプチドとの複合体を提示してなる抗原 提示細胞を提供する。 本発明のペプチド、 あるいは本発明のペプチドをコードす るヌクレオチドとの接触によって得られる該抗原提示細胞は、 好ましくは治療及 び/または予防の対象である被験者由来のものであり、 単独、 または、 本発明の ペプチド、 ェキソソーム、 細胞傷害性 Τ細胞等を含む、 他の医薬と共にワクチン として投与することができる。 実施例
以下、 実施例を挙げて本発明を更に説明するが、 本発明はこれら実施例に限定 されるものではない。
[実施例 1 ] VEGFR-2 (KDR)由来ぺプチドの予測一 1 (HLA- Α*2402)
KDR タンパク質の全アミ ノ酸配歹 IJ力、ら、 Biolnformatics & Molecular
Analysis Section (BIMAS) HLA Peptide Binding Prediction soft
(http : //bimas. dcrt. nih. gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)によ り、
HLA- A*2402に対する結合親和性の高いものから順に 9量体のぺプチドを 1 2種
(配列番号 1〜 1 2 ) 、 1 0量体のぺプチドを 1 2種 （配列番号 1 3〜 2 4 ) 予 測した （表 1 ) 。 表 1には、 9量体及ぴ 1 0量体のそれぞれについて結合親和性 の高い順に、 その N末端の KDR タンパク質のアミノ酸配列における位置と共に挙 げた。 尚、 表中の CE652 (配列番号 2 5 ) は Nukaya I.によって報告されている腫 瘍抗原 CEA (癌胎児性抗原） のェピトープの一つである （Int. J. Cancer 80,
1999) 。 また、 陰性対照ペプチドとして HIVペプチド （ILKEPVHGV (配列番号 5 5 ) 及び RYLRDQQLL (配列番号 5 6 ) ) を用いた。
ペプチドは、 標準的な固相合成法に従って Cleaved PepSet (Mimotope社、 San
Diego, LA) で合成し、 逆相 HPLCで精製した。 HPLC及び質量分析によって、 ぺプ チドの純度 （〉95%) 及び種類をそれぞれ決定した c
表 1
KDR由来ペプチドへの HLA-A*2402結合
(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bni/niolbio/keii_parker_comboforiii) 配列 AA配列 配列 AA配列
番号 開始位置 (9mers) 結合親和性 w 番号 開始位置 (lOmers) 結合親和性
YTCT.n-POPT, 240 13 DYVGalPVDL 420
2 KDR1318 VYSSEEAEL 220 14 KDE434 SYQYgTTQTL 360
3 DR220 GYRIYDVVL 200 15 KDR1058 DYVRkGDA L 300
4 KDR920 KFGNLSTYL 48 16 KDR304 LYTCaASSGL 200
5 KDR189 SYMISYAGM 38 17 KDR1318 VYSSeEAELL 200
6 KDR828 EFPEDRLKL 33 18 KDR734 LYTCqACSVL 200
7 KDR1152 TFSELVEHL 29 19 KDR926 TYLRsKRNEF 198
8 KDR169 RFVPDGNRI 22 20 KDE353 KYLGyPPPEI 165
9 KDR331 AFGSGMESL 20 21 KDEH6 VYVQdYRSPF 150
10 KDR604 KNLDTLWKL 16 22 KDR395 NYTViLTNPI 72
11 KDR826 KWEFPED L 12 23 KDR777 FFWL1LVIIL 24
12 KDR998 DFLTLEHLI 9 24 KDR 193 SYAGmVFCEA 9.2
25 CE652 *2 TYACFVSNL 200
*! Parker.KC:l994.J.Immunol 152
*2 Nukaya 1:1999 Int.J.Cancer 80
[実施例 2 ] 予測したペプチドを用いた CTL lineの樹立
Ebstein-Bar virus (EBV)不死化 B細胞株である TISI (HLA - A24/24)と EHM (HLA - A3/3)は宝酒造バイォ研究所より供与された。
健常人の末梢血 7 mlを採取し、 HLAの serotypingを行った。 HLA- A24陽性の末梢 血から、 Ficoll Paque (Pharmacia)を用いた比重遠沈法にて末梢血単核球 (PBMC) を分離した。
得られた PBMCを培養フラスコ （Corning, 43072) にて 10時間静置し、 浮遊細胞 を除去した後に AIM - V (Invitrogen) に 2 %自己血清を添加した培養液にヒ ト GM - CSF (キリンビールより供与） l，000U/ml、 ヒ ト IL- 4 (Genzyme) 1， 000U/mlを添加し フラスコに付着した細胞を培養した。 5日後に 0K- 432 (中外製薬より供与） 10 μ g/mlにて 48時間培養し、 CTLの誘導のための抗原提示細胞として使用した。 樹状 細胞 （Dendritic cell, DC) は FITCラベルした抗 ClassII， CD80， CD86抗体及び、 PEラ ベル した抗 Classl, CDllc, CD40 (いずれ も Beckton - Dickinson ) 、 CD83 (Immunotech)抗体を反応させて Cell Quest softwareを使用 した FACS- Cal ibur (Becton-Dickinson)にて表面抗原の解析を行い、 DCであることを確認し た。
あらかじめ誘導しておいた DCに、 実施例 1で結合親和性が高いとして予測され た 9量体のぺプチド 12種類 （配列番号 1〜： 1 2 ) (20 μ g/ml) を 3 μ g/mlの β 2- ミクログロブリンの存在下で 20° (：、 4時間パルスし、 その後 DCを PBMCから磁気ビ ーズ （Dynabeads M-450と Detachabeds ) にて選択された CD8陽性細胞に対して 1 : 20または 1 : 2の比で、 lOng/mlの ヒ ト IL- 7 (Genzyme)存在下で 48 well plate (Corning)にて混合培養を行った。 3日後に最終 10U/mlの IL- 2 (SIGMA) を加 えた。 7日後、 14日後に同様の DCにて刺激を加えて CTL誘導を行い、 20日後にぺプ チドをパルスした TISI細胞を標的として各 wellの細胞傷害活性を測定し、 陽性 wellのみをァロの PBMC、 EBV不死化 B細胞株（EHM)及ぴ抗 CD3抗体 30ng/mlにて刺激 する方法で培養し、 その 14日後に CTLの機能解析を行つた。
細胞傷害活性は 4時間51 Cr遊離法にて測定した。 ぺプチドをパルスする標的細 胞は 20 g/mlの濃度にてー晚パルスを行った。 標的細胞を 100 ^ Ciの Na2 51Cr04に て 37°C、 1時間ラベルした後 RPMI1640にて 3回洗浄し、 96穴 U型マイクロプレート (Corning)に標的細胞 ( 1 X 104/100 μ 1) と種々の濃度の効果細胞を 100 1加え、 総量 200 として 4時間、 37°Cの C02インキュベータ一にて培養した。 培養終了 後、 各 wellより上清を 100 μ ΐ採取し、 γカウンタ一にて測定した。 自然解離は標 的細胞と培地で、 最大解離は標的細胞と 1M HCLで得られる放射活性とした。 細胞 傷害活性 （特異的溶解のパーセンテージ） は次式により算出した。
細胞傷害活性（％ Cytotoxicity)
= (実験解離-自然解離） I (最大解離-自然解離） X loo その結果、 表 2に示すように 6種類の CTL lineが樹立でき、 配列番号 2 (アミ ノ酸開始位置 KDR1318) 、 配列番号 3 (KDR220) 、 配列番号 5 (KDR189) 、 配列 番号 8 (KDR169) 、 配列番号 1 1 (KDR826) 、 及ぴ配列番号 1 2 (KDR998) に示 すノナぺプチドがェピトープぺプチドとして特に有効であることが示された。 表 2
細胞傷害活性
配列 X 20 X 2—
番号 開始位置 AA 配列 結合親和性
Pej>(+) Pep (- -) Pep (+) Pep(--)
1 D R 583 YKLGPQPL 240 6% 4% 0% 0%
2 DR 1318 VYSSEEAEL 220 39% 21% 8% 3%
3 KDR220 GYRIYD VVL 200 57% 2% 20% 0%
4 KDR920 FGNLSTYL 48 3% 4% 0% 2%
5 KDR 189 SYM ISYAGM 38 41% 3% 20% 0%
6 KDR828 EFPRDRLKL 33 3% 2% 1% 0%
7 KDR 1152 TFSELVEHL 29 0% 0% 0% 0%
8 KDR 169 RFVPDGNRI 22 98% 2% 53% 0%
9 KDR331 AFGSGMESL 20 6% 6% 0% 0%
10 KDR604 NLDTLW L 16 3% 2% 1% 1%
11 DR826 KWEFPRDRL 12 23% 0% 11% 0%
12 KDR998 DFLTLEHLI 9 13% 4% 8% 0%
25 CE652*2 TYACFVSNL 200 29% 16% 7% 1%
*1 Parker.KC:i994.J.Immunol 152 *2 N ukaya 1:1999 Int. J. Cancer 80
[実施例 3] 予測したペプチドから誘導される CTL クローンの樹立
実施例 2において樹立した 6種類の CTL lineを 96穴 U型プレートに 0.3 1、 ま たは 3 cells/wellになるよ う に希釈した。 そこにァロ の PBMC 7 X 104 cells/well, EHM 1 X 104 cells/well, 抗 CD3抗体 30ng/ml IL— 2 125U/ml となる ようにして、 AIM- Vに 5%自己血清を添加して合計 150μ 1/wellになるようにし た。 10日後に IL- 2が最終濃度 125U/mlになるように調節した IL-2添加 mediumを 50 μ 1/wellにて加えた。 14日目に CTLの機能解析を行い、 活性のあるものを大量培
^し 7
その結果、 配列番号 8 (アミノ酸開始位置 KDR169) 、 配列番号 5 (KDR189) 配列番号 3 (KDR220) 、 配列番号 2 (KDR1318) 、 及び配列番号 1 1 (KDR826) の 5種のノナペプチドよりそれぞれ 8種類 （C13- 169 C19- 169 C29- 169 C53-
169 C72- 169 C61- 169 K5- 169及び K25- 169) 2種類 （C12- 189及び C18- 189)
11種類 （KWC3 23 25 26 36 42 46 58 61 70及び 77) 、 1種類 （C7- 1318
) 1種類 （C65 - 826) の CTL クローンを樹立した （表 3 ) 3 0H722 表 3
細胞傷害活性
X 20 X 2
クローン名 Pep + Pep (- -) Pe (+) Pep (- -)
C13-169 98% 2% 66% 2%
C19-169 94% 2% 50% 0%
C29-169 100% 1% 70% 0%
C53-169 100% 2% 91% 2%
C72-169 87% 1% 39% 0%
C61-169 88% 0% 38% 0%
K5-169 36% 0% 6% 0%
K25-169 27% 0% 5% 0%
C12-189 27% 18% 7% 3%
C18-189 67% 18% 28% 7%
KWC3 54% 2% 11% 1%
KWC23 95% 1% 49% 1%
KWC25 93% 1% 70% 1%
KWC26 87% 1% 34% 0%
KWC36 62% 2% 11% 2%
KWC42 67% 0%
KWC46 94% 1% 51% 0%
KWC58 76% 0%
KWC61 70% 2% 19% 1%
KWC70 92% 3% 64% 2%
KWC77 99% 3% 70% 2%
C65-826 38% 6% 8% 3%
C7-1318 84% 1% 62% 1%
[実施例 4 ] 樹立した CTLク口ーンの細胞傷害活性の測定
実施例 3において樹立した 10種類の CTL クローンの細胞傷害活性の強度を、 標 的細胞との比率 （E : T比） を変化させて検討した （図 1 ) 。
その結果、 配列番号 8のノナペプチド （アミノ酸開始位置 KDR169) から誘導さ れた C53-169が最も強力な細胞傷害活性を示した。 [実施例 5 ] 樹立した CTLクローンの HLA-テトラマー解析
HLA-A*2402と配列番号 8のぺプチド （ァミノ酸開始位置 KDR169) で HLA -テトラ マーを合成した。 すなわち、 H鎖 （約 35kDa) と L鎖 （約 l lkDa) を発現するプラス ミ ドベクターをそれぞれ作製し、 大腸菌を用いてこれらの組換えタンパク質を発 現させた。 H鎖のプラスミ ドベクターは細胞外ドメインのみで構成され、 カルボ キシル末端側はピオチン化酵素認識配列に置換してある。 H鎖および L鎖は抗原ぺ プチドと共にリフォールディングすることにより、 HLAぺプチド複合体を形成す る。 HLAぺプチド複合体をピオチン化酵素によりピオチン化し， ゲルろ過クロマ トグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィ一により過剰のビォチンを除去し， ビォチン化 HLAぺプチド複合体を分離精製した。 得られたビォチン化 HLAぺプチド 複合体をス トレプトアビジン（streptavidin; SA)と 4 : 1のモル比で反応させて四 量体化し、 HLA-テトラマーを合成した。 試料を解析する場合には， フィコエリ ス リ ン （phycoerythrin ; PE) で蛍光標識した SA (SA-PE) を使用し四量体化した。 CD8分子は HLA - A， B，Cの一部を除き， ひ 3ドメインの 245番目のーァミノ酸であるァ ラニンに結合することが解っており、 そこでァラニンをバリンへ置換した変異導 入 HLA-テトラマーを作製することで， CD8分子と α 3ドメインの結合に依存しない HLAぺプチド複合体に対し高い avidityをもつ CTLを選択的に検出することが可能 である変異導入 HLA-テトラマーを合成した。
合成した変異型 HLA- A24 KDR169-テトラマーにより、 樹立した CTL クローンを 検出した。 その結果、 図 2に示すように、 樹立した CTLクローンはテトラマー陽 性かつ CD8陽性のフラクションに強く染色する CTLであり、 本発明のぺプチド及ぴ H L A抗原の複合体を特異的に認識するものであることが明らかになった。 尚、 テトラマー陰性かつ CD8陰性のフラクションのシグナルはフィーダ一細胞による ものである。
[実施例 6 ] VEGFR-2 (KDR)由来ぺプチドの予測一 2 (HLA-A*0201)
実施例 1 と同様にして、 KDR タンパク質の全アミノ酸配列から、 HLA Peptide
Binding Prediction soft (http： //bimas. dcrt. mh. gov/cgi- bin/raolbio/ken_parker_comboform)により HLA- A*0201に対する結合親和性の高い ものから順に、 9量体のペプチドを 15種 （配列番号 2 6〜4 0 ) 、 1 0量体のぺ プチドを 1 2種 （配列番号 4；!〜 5 2 ) 予測した （表 4 ) 。 表 4には、 9量体及 び 1 0量体のそれぞれについて結合親和性の高い順に、 その N末端の KDR タンパ ク質のアミノ酸配列における位置と共に挙げた。 尚、 表中の CEA588 (配列番号 5 3 ) は Tanaka, H.らによって報告されている腫瘍抗原 CEA (癌胎児性抗原） のェ ピトープの一つである （ポスター発表、 AACR #3669, vol. 42, p681~682, March 2001) 。
表 4
KDR由来ペプチドへの HLA-A*0201結合
(http7/bim s,dcrt.nih.^ov/cgi-bin/moibio/ken_parker_comboform) 配列 AA配列
開始位置 *S a 配列 AA配列
開始位置 結合 番号 (9mers) 親和性 番号 (lOmers 親和性
26 KDR1093 VLLWEIFSL 1792 41 KDR1094 LLWBIFSLGA 1092
27 KDR 633 SLQDQGDYV 769 42 KDR 5 VLLAvALWLC 539
28 KDR 5 VLLAVALWL 739 43 KDR 313 LMTKkNSTFV 470
29 KDR 775 AMFFWLLLV 427 44 KDR 779 WLLLvIILRT 292
30 KDR 773 VIAMFFWLL 270 45 KDR 505 ALIEgKNKTV 285
31 KDR1034 ILLSEKNVV 179 46 KDR1084 IQSDvWSFGV 285
32 KDE 604 KNLDTLWKL 128 47 KDR 733 GLYTcQACSV 223
33 KDR 772 AVIAMFFWL 113 48 KDR 780 LLLVilLRTV 201
34 KDR1328 LIEIGVQT 107 49 KDR 6 LLAVaLWLCV 201
35 KDE, 698 IMWFKDNET 76 50 KDR 137 YITEn NKTV 180
36 KDR 608 TLWKLNATM 41 51 KDR1035 LLSBkNVVKI 167
37 DR 491 FQGGN IEV 32 52 KD 4 KVLLaVALWL 133
38 KDR 435 YQYGTTQTL 32
39 DE. 505 ALIEGKNKT 31 ".'
53
40 DR 190 YMISYAGMV 30 CEA 588*1 DVLYGPDTPI 0.25
*1 Tanaka H et al.:Poster presented at AACR 2001
[実施例 7 ] HLA-A*0201拘束性ェピトープぺプチドの決定
実施例 6において予測された 9量体または 1 0量体のぺプチド 16種類 （配列番 号 2 6〜4 1 ) を、 ヒ ト H L A (A 0 2 0 1 ) を発現するトランスジエニックマ ウス （Hum. Immunol. 2000 Aug. ; 61 (8) : 764- 79 Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice : dependence on HLA class II restricted T (H) response. , BenMohamed L.， Krishnan R.， Longraate J.， Auge C. , Low L. , Primus J. , Diamond DJ.に記載） を用い、 vaccination法にて CTLの誘導を行った。 . 6 - 8週令 BALB/C (H - 2d)マウスは日本クレア株式会社から手に入れた。 A2/Kb ト ランスジエニックマウス (TGM) は F Jim Primus Ph. D. Vanderbi lt-Ingram Cancer Centerより供与された。 また T2細胞 （TAP欠損細胞、 HLA- A*0201陽性） は 三重大学第三内科珠玖洋教授より供与された。
マウス大腿骨、 脛骨より骨髄を採取し、 抗 CD4，CD8, Gr-l (Beckton- Dickinson) , B220 (バイオサイエンス）抗体、 及びゥサギ補体 （PeL- Freez) にてリンパ球及び 顆粒球を除去した。 細胞は 6 well plateにて培養し、 翌日浮遊細胞を回収して別 の 6 well plateに RPMI 1640 (Invitrogen) に 10%FBSを加えた培溶液にマウス GM- CSF (キリンビールより供与） 1， OOOU/ml,マウス IL_4 (PEPR0 TECH) 1, 000U/mlを添 加し培養した。 その 3日後に上記培養液にて half medium changeを行い、 その 2 日後に 0K - 432 10 / g/mlにて 20時間培養し、 浮遊細胞を DCとして使用した。 DCは FITC ラ ベ ル し た 抗 ClassII, CD40 抗 体 及 ぴ 、 PE ラ ベ ノレ し た 抗 Classl, CDl lc, CD80, CD86 (いずれも Beckton - Dickinson) 抗体を反応させて Cell Quest softwareを使用した FACS-Cal ibur (Becton- Dickinson)にて表面抗原の解 析を行い、 DCであることを確認した。
次レヽで、 各ペプチド lOO ^u g HbcAgl20-140 helper pept ide 140 g、 IFA 100 μ ΐを混和（計 200 μ 1)し、 day 0に右側腹部に dayllに左側腹部に皮下摂取した。 Day 21 にワクチン接種したマウスの脾臓を採取し、 赤血球を red lysis buffer (sigma)にて溶血除去し、 その細胞の一部を IFN- γ ELISP0T assayの responder cellとして使用した。 また、 残りの細胞は 24 wel l plate (Corning)に 6 X 106 cel ls/wel lにてフィーダ一細胞と 3： 1の比率にて再刺激を加え、 5日後に細胞傷害 活性を測定した。 フィーダー細胞は同種別マウスの赤血球を除去した脾細胞を lipopolysaccharide (LPS) 25 μ g/ml存在下で 3日間培養したものを使用した。 本実施例においては、 C T Lの誘導能を IFN- γを産生する細胞が作る SPOTで評 価する IFN- γ ELISP0T法を用いた。 96穴平坦底マルチスク リーンプレート ΜΑΗΑ
S45 (ミリポア）を 4° ( 、 ー晚抗マウス IFN- /単クローン抗体（Pharmingen)にて処理 し、 翌日 0. 05% Tween 20を含んだ PBSにて洗浄し、 室温で 2時間 blocking buffer と反応させた。 その後、 ペプチドをパルスした T2細胞とパルスしていない T2細胞 を各 wel lに 105 cell/100 1ずつ散布した。 そこに、 ワクチンしたマウスの碑細 胞を最大 4 X 106 cell/100 μ 1散布して、 全 200 μ 1としてー晚 37°Cで培養した。 翌 日、 各 wellを洗浄後、 ピオチン化したラット抗マウス IFN- y抗体（Pharmingen)と 2時間反応させ、 十分に洗浄し、 Extravidinを加えて 2時間室温で反応させた。 プレー卜を洗净後、 Alkaline Phosphatase Conjugate Substrate (BIO- RAD)を加 えて 5分間室温で放置し、 IFN- γの産生による青色班を KS ELISPOT compact release (Carl Zeiss)にて計測した。 そして
特異的青色班 = (TISI (+) SP0T-TISI (-) SPOT)
で決定し、
TISI (+) SP0T/TISI (- ) SP0T≥2を満たしたものを有効とした。
その結果、 IFN- γ ELISPOT アツセィにて 5種類のェピトープペプチド、 配列番 号 2 9 (アミノ酸開始位置 KDR775) 、 配列番号 3 0 (KDR773) 、 配列番号 3 3 (KDR772) 、 配列番号 3 4 (KDR1328) 及び配列番号 4 0 (KDR190) を得た （表 5 ) 。
1722 表 5
ELISPOT 解析
ELISPOT解析 x 40(SFC)
配列 結合 マウス 1 マウス 2
開始位 H AA配列
番号 親和性 pe (+) pep (-) pep (+) pe (-)
26 ICDR1093 VLLWEIFSL 1792 5 8 7 1
41 KDR1094 LLWEIFSLGA 1092 0 0 0 0
27 KDR 633 SLQDQGDYV 769 0 0 0 0
28 KDR 5 VLLAVALWL 739 6 0 7 3
29 KDR 775 AMPFWLLLV 427 95 32 322 17
30 KDR 773 VIAMFFWLL 270 171 6 193 1
31 KDR1034 ILLSEKNW 179 0 0 0 0
32 KDR 604 KNLDTLWKL 128 0 7 0 0
33 KDR 772 AVIAMFFWL 113 88 19 143 31
34 KDR1328 KLIEIGVQT 107 0 0 81 s
35 KDR 698 IMWFKDNET 76 0 0 0 0
36 KDR 608 TLW LNATM, 41 0 0 0 0
37 KDR 491 FQGGNKIEV 32 0 0 0 0
38 KDR 435 YQYGTiQTL 32 0 0 0 0
39 KDR 505 ALIEGKNKT 31 0 0 0 0
40 KDR 190 YMISYAGMV 30 122 6 33 11
53 CEA 588*1 DVLYGPDTPI 0.25 229 2 230 6
*x Tanaka H et al.:Poster presented at AACR 2001
[実施例 8 ] in vivoにおける抗腫瘍効果の確認 1
ヒ ト H L A— A 2 4 0 2とアンカーモチーフが同じである 6〜 8週齢の雄
BALB/cマウス （CLEA Japan Inc. ) の骨髄を採取し、 実施例 7と同様に GM-CSF
(キリンビール） （lOOOU/ml) 及び IL-4 (Genzyme) (lOOOU/ml) を添加して培 養して、 樹状細胞を調製した。 この樹状細胞に配列番号 5のペプチド （アミノ酸 開始位置 KDR189) をパルスしたもの （ 1 X 1 0 6/7マウス） を BALB/cマウス 9匹 に 7日間隔で 2回右下腹部に投与し、 その 7日後に結腸癌細胞株 Colon26 (大鵬 薬品株式会社） （5 X 1 0 5個） を右腹部に接種し、 マウスの生存と腫瘍増殖を 検討した。
まず、 KDRの発現を RT- PCRで確認したところ、 図 3に示すように、 Colon26細胞 系単独では KDRを発現していないが、 Colon26を接種したマウスの腫瘍組織から KDRの発現が確認できた。 すなわち、 腫瘍血管が腫瘍組織に出現し、 腫瘍を形成 していることが確かめられた。
図 3に Colon26を接種されたマウスの生存曲線を示す。 対照である HBSS
(Hank' s Balanced Salt Solution) のみ （100 1) の投与の場合、 腫瘍接種か ら 3 5日後において、 9匹中 2匹の生存、 ペプチドをパルスしない樹状細胞の接 種では 9匹中 5匹の生存であつたが、 配列番号 5のぺプチドでパルスした樹状細 胞の接種の場合には全 9匹が生存していた。
図 4にマウスにおける Colon26由来の腫瘍の増殖に対する効果を示す。 対照と 比較して、 樹状細胞を接種した場合に腫瘍増殖に対する抑制効果が認められ、 配 列番号 5のぺプチドでパルスした樹状細胞の場合に顕著な抑制効果が認められた。
[実施例 9 ] 本発明のペプチドのホモロジ一検索
本発明のペプチド （配列番号 2 (アミノ酸開始位置 KDR1318) 、 配列番号 3
(KDR220 ) 、 配列番号 5 ( KDR189 ) 、 配列番号 8 (KDR169 ) 、 配列番号 1 1
(KDR826) 、 配列番号 3 0 (KDR773) 、 及ぴ配列番号 4 0 (KDR190) ) のホモ口 ジー検索を BLAST (http : //www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/blast· cgi) にて行った 結果、 いずれのぺプチドにおいても配列が完全に一致したものは認められなかつ た（表 6 )。 実施例 4において強い CTL活性を誘導できた配列番号 8の 9量体ぺプ チド （KDR169) に関しては、 2個のミスマッチ配列が 1つ （77. 8% homology) 、 3 個のミスマッチ配列が 2つ（66. 7% homology)あるのみであった。 実施例 8におい て in vivoにおける顕著な抗腫瘍効果が認められたぺプチド配列番号 5のぺプチ ド （KDR 189) に関しては、 3個のミスマッチ配列が 1つ（66. 7% homology)あるの みであった。 表 6 ホモロジ一解析
(BLAST) ("http：〃 www.ncbi.nlm.mh.gov/blast/Diastcgi)
KDR169 DR189 KDR826 KDR220 KDR1318 KDR773 KDR19 同- -性 (9/9) 0 0 0 0 0 0 0 同- -性（8/9) 0 0 3 0 0 0 0 同- -性（7/9) 1 0 2 0 2 2 0 同- -性（6/9) 2 1 0 2 0
[実施例 1 0] in vivoにおける抗腫瘍効果の確認 2
ヒ ト HLA— AO 20 1を発現する 6〜8週齢の雄八2/1¾トランスジヱニック マウス （TGM) の骨髄を採取し、 実施例 8と同様に GM- CSF (キリンビール）
(1000U/ml) 及び IL-4 (Genzyme) (1000U/ml) を添加して培養して、 樹状細胞 を調製した。 この樹状細胞に配列番号 30 (アミノ酸開始位置 KDR773) のぺプチ ドをパノレスしたもの (1 X 1 06ノマウス) を A2/Kbトランスジエニックマウス 1 2匹に 7 日間隔で 2回左下腹部に投与し、 その 7 日後に B16メラノ一マ細胞
(ATCC) (1 X 1 06個） を右腹部に接種し、 マウスの生存と腫瘍増殖を検討し た。
図 5に B16を接種されたマウスの生存率を示す。 対照である HBSSのみ （100 1) の投与の場合、 腫瘍接種から 3 5日後において、 1 2匹中 8匹の生存、 ぺプ チドをパルスしない樹状細胞の接種では 1 2匹中 1 1匹の生存であつたが、 配列 番号 3 0のペプチドでパルスした樹状細胞の接種の場合には全 1 2匹が生存して レヽた。
図 6にマウスにおける B16マウス由来の腫瘍の増殖に対する効果を示す。 対照 と比較して、 榭状細胞を接種した場合に腫瘍増殖に対する抑制効果が認められ、 2003/011722 配列番号 3 0のぺプチドでパルスした樹状細胞の場合に顕著な抑制効果が認めら れた。
[実施例 1 1 ] KDRを強制発現させた細胞に対する細胞障害活性
Miyake, S.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93， 1320 - 1324 (1996)に記載の 方法に従い、 HLA - A24陽性であるヒ ト大腸癌 HT29株 （ATCC) にアデノウイルスを 用いて KDR (J. Biol. Chem. 1994 Oct 28 ; 269 (43) : 26988- 95参照） を強制発現し た。 具体的には、 ヒ ト 293細胞のプラークアツセィによって決定した力価に基い て、 細胞を特定の多重度で感染させた。 HT29細胞を 60mmのディッシュ中に 1 0 5 個の細胞密度で接種し、 24時間インキュベートした。 次の日、 培地を捨て、 新し い培地で連続希釈したウィルス 200 1と交換した。 37°Cで 1時間ィンキュベーシ ョンした後、 増殖培地を添加し、 細胞を 48時間培養して標的細胞として使用した。 対照として EGFP (Leukemia 1999 Apr ; 13 (4)： 605- 13参照） をアデノウイルスに て強制発現した HLA - A24陽性 HT29株を用レ、た。 KDRと EGFPを強制発現した HT29株は、 細胞表面に各々その部分べプチドを提示している可能性がある。
HLA - A24に結合する配列番号 8のぺプチド （ァミノ酸開始位置 KDR169) から誘 導された実施例 3に記載の CTLクローン C29 - 169を用い、 KDR強制発現 HLA-A24陽性 HT29細胞に対する殺細胞効果をクロムリリースアツセィにて測定した。 結果を図 7に示す。
細胞障害活性は 4時間51 Cr遊離法にて測定した。 標的細胞は 6 well plate に 1 X 106 cells/wellの濃度にて 2 4時間培養し、 KDR又は EGFPを導入したアデノゥ ィルス （Ad - KDR又は Ad_EGFP) を M0I 50にて感染させ、 4 8時間後に使用した。 標的細胞を lOO ^ Ciの Na2 51Cr04にて 37°C、 1時間ラベルした後、 RPMI1640にて 3回 洗浄し、 96穴 U型マイクロプレート（Corning)に標的細胞 （ 1 X 104 cell s/100 z 1) と種々の濃度の効果細胞を 100 /2 1加え、 総量 200 1として 4時間、 37°Cの C02 インキュベータ一にて培養した。 培養終了後、 各 wellより上清を 100 1採取し、 γカウンタ一にて測定し、 実施例 2と同様にして細胞障害活性を算出した。
その結果、 図 7に示すように、 CTLクローン C29- 169は、 KDRを強制発現した HLA-A24陽性 ΗΤ29に対し、 EGFPを強制発現した細胞と比較して顕著に高い殺細胞 効果を示した。 [実施例 1 2 ] 内因的に KDRを発現している細胞に対する細胞障害活性 KDRを内因的に発現している HLA- A24陽性ヒ ト臍帯血管内皮細胞由来 HUVEC KT5 株に対する実施例 3に記載の CTLクローン C29- 169の殺細胞効果について、 KDR陽 性、 HLA - A24陰性 HUVEC株 P8を対照として検討した。 これらの細胞は KDRの部分ぺ プチドを細胞表面に提示する。
細胞障害活性は 4時間51 Cr遊離法にて測定した。 標的細胞を Ciの Na2 51Cr04 にて 37°C、 1時間ラベルした後 RPMI1640にて 3回洗浄し、 96穴 U型マイクロプレー ト（Corning)に標的細胞 （ 1 X 104 cells/100 μ 1) と種々の濃度の効果細胞を 100 1力！]え、 総量 200 ^ 1として 4時間、 37°Cの C02インキュベータ一にて培養した。 培養終了後、 各 wellより上清を 100 μ 1採取し、 γカウンタ一にて測定し、 実施例 2と同様にして細胞障害活性を算出した。
図 8の結果から明らかなように、 CTLクローン C29-169は、 内在的に KDRを発現 している HLA-A24陽性 HUVECに対して殺細胞効果を示し、 HLA - A24陰性 HUVECに対し ては低い殺細胞効果を示した。
[実施例 1 3 ] HLA-A0201結合性ぺプチドを用いた CTLクローンの樹立
実施例 7の ELISP0T解析において有効とされた HLA - A0201に結合する配列番号 4 0のぺプチド （ァミノ酸開始位置 KDR190) 、 配列番号 3 0のぺプチド （KDR773) の N末端から 2番目のアミノ酸をロイシンに変換したぺプチド KDR773 - 2L (配列番 号 5 4 ) 、 配列番号 2 9のペプチド （KDR775 ) 、 配列番号 3 4のペプチド
(KDR1328) 、 及び配列番号 3 3 (KDR772) を用いて、 実施例 3と同様にして、 それぞれ 2種類 （KWC14_190、 KWC65-190) 、 4種類 （KWC44_773-2L、 KWC76- 773- 2L、 KWC129- 773- 2L、 KWC134- 773- 2い 、 2種類 （KWC81- 775、 KWC85- 775 ) 、 12種類
(KWC16、 KWC21、 KWC22、 KWC47、 KWC51、 KWC108、 KWC117、 KWC132、 KWC151 , KWC153、 KWC156、 KWC159) 、 1種類 （KWC72-772) の CTLクローンを得た。 それぞ れの細胞傷害活性を表 7に示す。 表 7
細胞傷害活性
X20 X2
クローン名 Pep (+) Pep (- -) Pep (+) Pep (- -)
KWC14 -190 43% 0% 9% 0%
KWC65 -190 83% 0% 27% 0%
KWC44 -773 -2L 87% 0% 64% 0%
KWC76 -773 -2L 83% 2% 68% 1%
KWC129 -773 -2L 89% 0% 82% 1%
KWC134 -773 -2L 89% 2% 54% 2%
KWC81 -775 86% 0% 64% 0%
KWC85 -775 90% 0% 63% 0%
KWC16 95% 0% 85% 0%
KWC21 100% 0% 91% 0%
KWC22 93% 0% 77% 0%
KWC47 109% 2% 87% 1%
KWC51 101% 0% 93% 1%
KWC108 71% 2% 23% 2%
KWC117 83% 0% 42% 0%
KWC132 102% 0% 55% 0%
KWC151 102% 0% 101% 0%
KWC153 47% 0% 18% 0%
KWC156 64% 0% 23% 0%
KWC159 93% 0% 86% 0%
KWC72-772 101% 0% 67% 0% 表 7の結果から明らかなように、 配列番号 2 9、 3 3、 3 4、 または 4 0に示 すぺプチド、 及ぴ配列番号 3 0に示すぺプチドの N末端から 2番目のアミノ酸が ロイシンである配列番号 5 4に示すぺプチドのいずれも、 顕著な細胞傷害活性を 有する CTLを誘導することができ、 ェピトープぺプチドとして有効であることが 示された。
[実施例 1 4 ]
HLA- A0201陽性 T2株に配列番号 2 9のぺプチド （ァミノ酸開始位置 KDR775) を 加えて標的細胞とし、 実施例 1 3で配列番号 2 9のぺプチドから得られた CTLク ローン （KDR C85-775 (KWC85-775) ) の殺細胞効果をクロムリリースアツセィを用 いて検討した。
その結果、 図 9に示すように、 CTLクローン C85- 775 (KWC85- 775)は、 配列番号 2 9のぺプチドを提示した HLA-A0201陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示 した。 これに対して、 配列番号 2 9のペプチドを提示しない対照細胞に対しては、 全く殺細胞効果が見られなかった。
[実施例 1 5 ]
KDRをアデノウィルスで強制発現させた肝細胞癌株 HLA - A0201陽性 HePG2に対す る CTLクローン（KDR C85 - 775 KWC85- 775) )の殺細胞効果をクロムリ リースアツセ ィを用いて検討した。 対照として EGFPを強制発現させた HLA-A0201陽性 HePG2を用 いた。
その結果、 図 1 0に示すように、 CTLクローン C85- 775 (KWC85- 775)は、 KDRぺプ チドを表面に提示した HLA- A0201陽性細胞に対し、 EGFPぺプチドを提示した細胞 と比較して顕著に高レ、殺細胞効果を示した。
[実施例 1 6 ]
HLA- A0201陽性 T2株に配列番号 3 4のぺプチド （ァミノ酸開始位置 KDR1328) を 加えて標的細胞とし、 実施例 1 3で配列番号 3 4のぺプチドから得られた CTLク ローン （KDR C51-1328 (KWC51) ) の殺細胞効果をクロムリ リースアツセィを用い て検討した。
その結果、 図 1 1に示すように、 CTLクローン KDR C51- 1328 (KWC51)は、 配列番 号 3 4のぺプチドを提示した HLA - A0201陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を 示した。 これに対して、 配列番号 3 4のペプチドを提示しない対照細胞に対して は、 全く殺細胞効果が見られなかった。
[実施例 1 7 ]
KDRをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株 HLA-A0201陽性 HePG2に対す る CTLクローン（KDR C51- 1328 (KWC51) )の殺細胞効果をクロムリリースアツセィを 用いて検討した。 対照として EGFPを強制発現させた HLA- A0201陽性 HePG2を用いた c その結果、 図 1 2に示すように、 CTLクローン KDR C51 - 1328 (KWC51)は、 KDRぺ プチドを表面に提示した HLA- A0201陽性細胞に対し、 EGFPぺプチドを提示した細 胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
[実施例 1 8 ]
HLA- A0201陽性 T2株に配列番号 3 0の 2番目のぺプチドをロイシンに変換した配 列番号 5 4のペプチド （KDR773- 2L) を加えて標的細胞とし、 実施例 1 3で配列 番号 3 4のペプチドから得られた CTLクローン （KDR C44-773-2L (KWC44-773- 2L) ) の殺細胞効果をクロムリ リースアツセィを用いて検討した。 結果を図 1 3 に示す。
その結果、 図 1 3に示すように、 CTLクローン KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L) は、 KDR773- 2Lを提示した HLA-A0201陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示し た。 これに対して、 KDR773-2Lを提示しない対照細胞に対しては、 全く殺細胞効 果が見られなかった。
[実施例 1 9 ]
HLA-A0201陽性 T2株に配列番号 3 0の 2番目のぺプチドをロイシンに変換した配 列番号 5 4に示すペプチド （KDR773- 2L) より得られた CTLクローン （KDR C44- 773-2L (KWC44-773-2L) ) のクロムリリースアツセィでの殺細胞効果を、 標的細胞 として T2に改変していない配列番号 3 0に示すぺプチド （ァミノ酸開始位置 KDR773) をパルスしたもので検討した。
その結果、 図 1 4に示すように、 改変したペプチドで刺激し、 得られた CTLク ローンは改変前のぺプチドを認識し、 傷害することができた。
[実施例 2 0 ]
KDRをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株 HLA-A0201陽性 HePG2に対す る CTLクローン（KDR C44- 773_2L (KWC44- 773- 2L) )の殺細胞効果をクロムリ リース アツセィを用いて検討した。 対照として EGFPを強制発現させた HLA - A0201陽性 HePG2を用いた。
その結果、 図 1 5に示すように、 CTLクローン KDR C44-773-2L (KWC44-773-2L) は、 KDRペプチドを表面に提示した HLA- A0201陽性細胞に対し、 EGFPペプチドを提 示した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
[実施例 2 1 ] KDRをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株 HLA - A0201陽性 HePG2に対す る配列番号 3 4のぺプチドから得られた CTLクローン（KDR C51-1328 (KWC51) )の殺 細胞効果が各種抗体でプロックされるかどうかについて検討した。
その結果、 図 1 6に示すように、 標的細胞が提示する HLA抗原に対する抗 HLA Classl抗体と、 細胞傷害性 T細胞のマーカーとなる CD8に対する抗 CD8抗体がその 作用を阻害した。
[実施例 2 2 ] Dorsal Air Sac assay (DAS)による血管新生阻害活性の検討 ぺプチドエピトープの実際の血管新生阻害活性をマウスで DASアツセィ
( Clinical Cancer Research Vol. 5, 2185-2191， August 1999； Cancer Research 62， 6116-6123, November 1, 2002参照） にて評価した。
チャンバ一リングの両面にメンブレンフィルターを固定し、 エチレンォキサイ トガスで滅菌した。 B 1 6メラノーマ細胞を 5 X 105 cells/0. 15mlに調整し、 チ ヤンバー内に注入した。 マウス （A2/kbトランスジエニックマウス（B16由来）） を 腹臥位として固定し、 マウス背部皮下にシリンジにて 5〜1 O mlの空気を注入し air sacを作製した。 Sac下部を約 1 cm切開し、 細胞浮遊液で満たされたチャンバ 一リングを背部皮下に移植し、 皮膚をスキンステープラで閉じた。 移植日より 6 日目にマウス皮膚をチャンバ一ごと剥皮し、 伸展させた状態で固定した。 黒色ゴ ムリングでマーキングし、 実態顕微鏡を用いて新生血管を計測した。 悪性腫瘍細 胞から放出される血管新生因子によって新たに形成される血管は、 ジグザグに進 行する特徴があり、 本来存在するバックグラウンドの血管とは形態学的に異なつ ている。 従って、 新生血管の判定はゴムリング内の蛇行走行を示す血管で、 長さ が 3腿以上のものとし、 血管新生指数 （Angiogenes i s Index (AI) ) としてカウン トした。 AIは蛇行血管数に応じて 0〜 5までの 6段階で評価し、 蛇行血管が 5本 以上のものはすべて 5とした。
ワクチン接種はチャンパ一移植の 1 4日前に HBSS、 DC単独、 DCにペプチドパル スしたものをそれぞれ 5 X 1 0 4cel ls尾静脈に注入し、 それを 1週間後に再度行 い、 計 2回接種した。 結果を図 1 7及び以下の表 8に示す。 3 011722 表 8
DASアツセィの効果
Figure imgf000034_0001
図 1 7及ぴ表 8の結果から明らかなように、 DCに配列番号 4 0に示すペプチド (アミノ酸開始位置 KDR190) 、 配列番号 3 3に示すペプチド （KDR772) 、 配列番 号 3 0に示すぺプチド （KDR773) 、 配列番号 5 4に示すぺプチド （KDR773- 2L) 、 配列番号 2 9に示すぺプチド （KDR775) 、 及び配列番号 4 6に示すぺプチド (KDR1084) をワクチン接種した群において、 DC単独投与群と比較して、 蛇行血 管の形成が明らかに抑制され、 統計学的有意さをもって血管新生阻害効果があつ た。 ' 尚、 これらのェピトープぺプチドを用いたワクチン接種による正常な生理的血 管新生に対する悪影響を観察するために、 ワクチン接種したマウスにおける創傷 治癒及び受精能を解析した。 しかしながら、 ワクチン接種したマウスにおいて有 意な悪影響はなかった。 更に、 KDRペプチドを認識する CTLクローンを用いて非増 殖性または増殖性内皮細胞に対する細胞傷害性を in vitroで試験し、 ヒ トにおけ る悪影響を検討したところ、 これらのクローンは非増殖性内皮細胞よりも増殖性 内皮細胞に対して強い活性を示した。
[実施例 2 3 ]
ヒ ト HLA- A0201を発現する A2/Kbトランスジエニックマウスを用いて大腸癌株 MC38移植担癌マゥスに対する配列番号 3 0 (ァミノ酸開始位置 KDR773)と配列番号 3 4 (KDR1084) ペプチドを不完全フロイントアジュパントと混合させてそれぞ れ day3， 13に投与した場合の腫瘍体積の変化を示した。
実施例 2 2と同様のヮクチン接種方法で HLA-A*0201拘束性ェピトープぺプチド (KDR773)による治療モデルにおける in vivo抗腫瘍効果を腫瘍面積により評価し た。 その結果、 図 1 8から明らかなように、 配列番号 3 0のぺプチド及び配列番 号 3 4のペプチドのワクチン接種により、 有意な腫瘍増殖抑制効果が確認できた。
[実施例 2 4 ]
HLA- A0201陽性 T2株に配列番号 4 0のぺプチド （ァミノ酸開始位置 KDR190) を 加えて標的細胞とし、 実施例 1 3で配列番号 4 0のぺプチドから得られた CTLク ローン （KWC65- 190) の殺細胞効果をクロムリ リースアツセィを用いて検討した。 その結果、 図 1 9に示すように、 CTLクローン KWC65- 190は、 配列番号 4 0のぺ プチドを提示した HLA-A0201陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。 こ れに対して、 配列番号 4 0のペプチドを提示しない対照細胞に対しては、 全く殺 細胞効果が見られなかった。
[実施例 2 5 ]
HLA- A0201陽性 T2株に配列番号 3 3のぺプチド （ァミノ酸開始位置 KDR772) を 加えて標的細胞とし、 実施例 1 3で配列番号 3 3のぺプチドから得られた CTLク ローン （KWC72- 772) の殺細胞効果をクロムリ リースアツセィを用いて検討した。 その結果、 図 2 0に示すように、 CTLクローン KWC72-772は、 配列番号 3 3のぺ プチドを提示した HLA-A0201陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。 こ れに対して、 配列番号 3 3のペプチドを提示しない対照細胞に対しては、 全く殺 細胞効果が見られなかった。
[実施例 2 6 ]
KDRをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株 HLA - A0201陽性 HePG2に対す る CTLクローン (KWC72 - 772)の殺細胞効果をクロムリ リースアツセィを用いて検討 した。 対照として EGFPを強制発現させた HLA-A0201陽性 HePG2を用いた。
その結果、 図 2 1に示すように、 CTLクローン KWC72-772は、 KDRペプチドを表 面に提示した HLA-A0201陽性細胞に対し、 EGFPぺプチドを提示した細胞と比較し て顕著に高い殺細胞効果を示した。
[実施例 2 7 ] HLA- A24陽性であるヒ ト B -リ ンパ芽球細胞系 A24- LCL (HLA - A24/24、 宝酒造製） に配列番号 2 (アミノ酸開始位置 KDR1318) 、 3 (KDR220) 、 5 (KDR189) 、 及 ぴ 1 1 (ァミノ酸開始位置 KDR826) のぺプチドを加えて標的細胞とし、 実施例 3 に記載の CTLクローン C7-1318、 KWC46 C18- 189、 及ぴ C65 - 826の殺細胞効果をク ロムリリースアツセィを用いて検討した。
その結果、 図 2 2〜 2 5に示すように、 CTLクローン C7- 1318、 KWC46、 C18 - 189、 及び C65- 826は、 それぞれ配列番号 2、 3、 5、 及び 1 1のペプチドを提示した HLA-A24陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。 これに対して、 各ぺプ チドを提示しない対照細胞に対しては、 全く、 またはほとんど殺細胞効果が見ら れなかった。
[実施例 2 8 ]
実施例 1 1と同様にして、 KDRをアデノウイルスで強制発現させたヒ ト大腸癌 HT29株 （ATCC) に対する実施例 3に記載の CTLクローン C7- 1318、 KWC46、 C18-189、 及び C65 - 826の殺細胞効果をクロムリ リースアツセィを用いて検討した。 対照と して EGFPを強制発現させた HLA- A24陽性 HT29株を用いた。
その結果、 図 2 6〜 2 9に示すように、 CTLクローン C7 - 1318、 KWC46, C18 - 189、 及び C65 826は、 いずれも KDRを強制発現した HLA- A24陽性 HT29に対し、 EGFPを強 制発現した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
[実施例 2 9 ]
実施例 2 2と同様にして、 BALB/cマウスにおいて colon26細胞によって誘導さ れる血管新生応答に対するぺプチドエピトープの血管新生阻害活性を DASアツセ ィにて評価した。
図 3 0及び 3 1の結果から明らかなように、 DCに配列番号 5に示すぺプチド (アミノ酸開始位置 KDRI89) 及び配列番号 1 1に示すペプチド （KDR826) をワク チン接種した群において、 DC単独投与群と比較して、 蛇行血管の形成が明らかに 抑制され、 統計学的有意さをもつて血管新生阻害効果があつた。
[実施例 3 0 ]
癌患者の PBMCを用いて、 各種ェピトープペプチド （HLA- 24結合親和性の高いぺ プチドとして配列番号 8 (ァミノ酸開始位置 KDR169)、 配列番号 5 (KDR189)、 配列 番号 3 (KDR220)、 配列番号 1 1 (KDR826)、 及び配列番号 1 7 (KDR1318) , 並びに HLA- A0201結合親和性の高いぺプチドとして配列番号 4 0 (KDR190)、 配列番号 3 3 (KDR772) , 配列番号 3 0 (KDR773)、 配列番号 2 9 (KDR775)、 及び配列番号 3 4 (KDR1328) ) で刺激した後の各ぺプチドに対する CTL応答を調べた。
Maeda, Y.ら、 Br. J. Cancer 87， 796 - 804 (2002)に報告されている方法を用 いて PBMC中のペプチド特異的 CTLを検出した。 まず、 患者から採取した PBMC ( 1 X 1 0 5個） を 1の培地を入れた u底型の 9 6ゥエルプレートのゥエルで各 ぺプチド 1 0 μ Μと共にインキュベートした。 培地は 45 %の RPMI - 1640培地、 45%の AIM- V培地、 10%の FBS、 100U/mlのインターロイキン- 2 (IL - 2) 、 及び 0. 1 MEM非必須アミノ酸溶液から構成される。 3日ごとに培地の半分を除去し、 対 応するペプチド （20 μ Μ) を含有する新しい培地と交換した。 12日間のインキュ ベーシヨン後、 細胞を回収して各ペプチドに応答した IFN - γ産生能を試験した。 対応するぺプチドに応答してぺプチドで刺激した PBMCによって産生される IFN - γ の量が対照である HIVぺプチドに応答して産生される量の 2倍以上多い場合には 陽性と判定した。
その結果、 HLA- A2及び- A24の癌患者においても、 健康なドナーと同様に CTL前 駆体が産生されることが示された （表 9 ) 。 表中、 患者 A、 B及び Cは HLA - A24 型の患者であり、 患者 Dは HLA- A02型の患者である。 また患者 A及び患者 Dは結 腸癌患者、 患者 B及び患者 Cはメラノーマ患者である。 尚、 C MVは陽性対照と して用いたサイトメガロウィルス由来べプチドであり、 該ぺプチドについては A 一 2 4結合親和性の高いものは、 例えば Kuzushima, K. ら， Blood 2001, 98 (6) : pl872-1881に、 A— 2結合親和性の高いものは、 例えば Solache A.ら， J. of Immunol. 1999, 163 (10) ;p5512 - 5518にそれぞれ記載されている。 表 9
癌患者由来の CTL前駆体
患者 A 患者 B 患者 C 患者 D 陽性 ゥ 陽性 ゥ 陽性 ゥ 陽性 ゥ ゥェ 総数 ゥ ゥェ 総数 ゥェ
CMV 1 32 1 24 0 16 CMV 5 20
KDR 169 12 32 4 32 1 24 KDR 190 3 24 DR 189 3 32 1 32 0 24 KDR 772 3 24
KDR 220 0 32 3 32 0 24 KDR 773 1 24
KDR 826 11 32 3 32 0 24 KDR 775 2 24 DR 1318 0 32 9 32 1 24 KDR 1328 0 24
更に、 実施例 1 4等と同様にして標準的な 4時間の51 Cr遊離法を行い、 これら の CTL前駆体から CTL系を確立した （図 3 2 ) 産業上の利用可能性
本発明により、 広範囲にわたる腫瘍組織に形成される内皮細胞を標的として細 胞傷害性 T細胞を誘導し、 癌ワクチンとして非常に有効な新規ペプチド、 及びこ れを含有する腫瘍の治療及び予防のための医薬が提供される。'
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許おょぴ特許出願をそのまま参考として 本明細眷にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1. 配列番号 2、 3、 5、 8、 1 1または 1 2に示すアミノ酸配列からなる ぺプチドから選ばれるノナぺプチド。
2. 配列番号 2、 3、 5、 8、 1 1または 1 2に示すアミノ酸配列において 1個、 2個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、 細胞傷害性 T細 胞の誘導能を有するぺプチド。
3. N末端から 2番目のアミノ酸がフエ二ルァラニン、 チロシン、 メチォ二 ンまたはトリプトファンである、 請求項 2に記載のぺプチド。
4. C末端のアミノ酸がフエ二ルァラニン、 ロイシン、 イソロイシン、 トリ プトファンまたはメチォニンである、 請求項 2または 3に記載のぺプチド。
5. 配列番号 29、 30、 33、 34、 40、 または 46に示すアミノ酸配 列からなるぺプチドから選ばれるノナぺプチドまたはデカぺプチド。
6. 配列番号 29、 30、 33、 34、 40、 または 46に示すアミノ酸配 列において 1個、 2個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、 細胞 傷害性 T細胞の誘導能を有するペプチド。
7. N末端から 2番目のアミノ酸がロイシンまたはメチォニンである、 請求 項 6に記載のぺプチド。
8. C末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンである、 請求項 6または 7に 記載のぺプチド。
9. 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載のペプチドを 1種以上含む、 腫瘍の 治療及び Zまたは予防のための医薬。
1 0. 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載のぺプチドを 1種以上含む、 糖尿 病性網膜症、 慢性関節リウマチ、 乾癬、 ァテローム性動脈硬化症の治療のための
1 1. 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載のぺプチドと H L A抗原とを含む 複合体を表面に提示しているェキソソ一ム。
1 2. HLA抗原がHLA— A24または HL A— AO 2である、 請求項 1 1に記載のェキソソーム。
1 3. H LA抗原が H LA— A 240 2または H LA— 020 1である、 請 求項 1 2に記載のェキソソーム。
14. 請求項 1〜8のいずれか 1項に記載のペプチドを用いて細胞傷害性 T 細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
1 5. 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載のぺプチドを用いて細胞傷害性 T 細胞を誘導する方法。
1 6. 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載のぺプチドをコ一ドするポリヌク レオチドを含む遺伝子を抗原提示細胞に導入することを含む、 細胞傷害性 T細胞 誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
1 7. 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載のペプチドを用いて誘導される、 単離された細胞傷害性 T細胞。
1 8. HL A抗原と請求項 1〜8のいずれか 1項に記載のぺプチドとの複合 体を提示してなる抗原提示細胞。
1 9. 請求項 1 4または 1 5に記載の方法によって誘導される、 請求項 1 8 に記載の抗原提示細胞。
20. 請求項 1〜8のいずれか 1項に記載のペプチドを有効成分とする、 病 態部位における血管新生阻害のためのワクチン。
2 1. 111^ 抗原が《[1^ ー八24または HLA— AO 2である被験者に対 して投与するための、 請求項 20に記載のワクチン。
22. 悪性腫瘍の増殖及び/または転移を抑制するために使用される、 請求 項 20または 2 1に記載のワクチン。
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