KR101466222B1

KR101466222B1 - 정확도가 향상된 전기화학적 바이오센서

Info

Publication number: KR101466222B1
Application number: KR1020120059327A
Authority: KR
Inventors: 이명호; 김문환; 이웅기; 박한비; 정성권; 남학현; 차근식
Original assignee: 주식회사 아이센스
Priority date: 2012-06-01
Filing date: 2012-06-01
Publication date: 2014-12-01
Anticipated expiration: 2032-06-01
Also published as: KR20130135605A; CN104380095B; US9753004B2; WO2013180528A1; CN104380095A; EP2871470B1; EP2871470A1; JP5873215B2; EP2871470A4; JP2015518161A; US20150083613A1

Abstract

본 발명은 적혈구용적률 측정 정확도가 향상된 혈당 측정용 전기화학적 바이오센서에 관한 것으로, 본 발명에 따른 적혈구용적률 측정값 보정을 위한 제1전극부 및 글루코스 농도를 측정하기 위한 제2전극부를 포함하는 전기화학적 바이오센서는, 작동전극 및 보조전극의 두께보다 얇은 절연커버를 구비함으로써 혈액시료에 노출되는 제1전극부의 제1작동전극 및 제1보조전극의 면적이 동일해질 뿐만 아니라, 상기 제1작동전극 및 제1보조전극의 간격이 일정해지고, 전극 인쇄시 위치 오차가 발생하더라도 상기 절연커버에 의해서 항상 일정한 전극 면적과 전극 간격이 유지되므로, 적혈구용적률 측정값의 정확도가 향상되고, 상기 측정값을 보정에 이용하는 혈중 글루코스 농도 측정값의 정확도를 보다 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

정확도가 향상된 전기화학적 바이오센서{Electrochemical biosensor with improved accuracy}

본 발명은 전기화학적 바이오센서에 혈액시료의 특성, 특히 헤마토크릿의 영향을 보정할 수 있는 기능을 부여하여 측정의 정확도를 향상시킨 바이오센서에 관한 것이다.

최근 당뇨병을 진단하고 예방하는데 있어서 혈액 내의 포도당(혈당: blood glucose)의 양을 주기적으로 측정해야 할 필요성이 증대되고 있다. 이러한 혈당 측정은 손에 쥘 수 있는 휴대용 계측기를 이용하여 손쉽게 측정할 수 있으며, 구체적으로 환자 각자가 스트립 형태의 바이오 센서를 사용하여 손쉽게 측정할 수 있다. 이러한 혈당 측정을 위한 바이오 센서의 작동원리는 비색 방법 또는 전기화학적 방법에 기초하고 있다.

이 중 전기화학적 방법은 하기 반응식 1에 의해 설명되어지며, 가장 큰 특징으로 전자전달매개체를 사용하는 것이다. 상기 전자전달매개체로는 페로센(ferrocene), 페로센 유도체; 퀴논(quinones), 퀴논 유도체; 전이금속함유 유기 및 무기물(헥사아민 루테늄, 오스뮴 함유 고분자, 포타슘 페리시아나이드 등); 및 유기 전도성 염(organic conducting salt), 비오로겐(viologen)과 같은 전자전달 유기물 등을 사용한다.

[반응식 1]

(1) 포도당 + GOx-FAD→글루콘산 + GOx-FADH₂

(2) GOx-FADH₂ + 전자전달매개체(산화상태)→GOx-FAD + 전자전달매개체(환원상태)

(상기 반응식 1에서,

GOx는 당산화효소(Glucose oxidase)를 나타내고, GOx-FAD 및 GOx-FADH₂는 각각 당산화효소의 활성부위인 FAD(flavin adenine dinucleotide)의 산화상태 및 환원상태를 나타낸다)

상기 반응식 1에서 보는 바와 같이, (1) 먼저 혈액내의 포도당은 당산화효소의 촉매작용에 의해 글루콘산으로 산화되게 된다. 이때 당산화효소의 활성 부위인 FAD가 환원되어 FADH₂로 된다. (2) 그 후 환원된 FADH₂는 전자전달매개체와의 산화환원반응을 통하여 FADH₂는 FAD로 산화되고, 전자전달매개체는 환원되게 된다. 이렇게 형성된 환원상태의 전자전달매개체는 전극표면까지 확산되는데, 이때 작동 전극표면에서 환원상태의 전자전달매개체의 산화전위를 인가하여 생성되는 전류를 측정하여 혈당의 농도를 측정하게 된다.

종종 혈액시료 중 산소의 영향을 줄여야 할 필요가 있는 경우에는 GOx-FAD의 당산화효소 대신 GDH-FAD와 같은 당탈수소화 효소를 사용하기도 한다. 효소 종류의 차이가 있어도 전체적인 반응은 상기 반응식 1의 과정을 따른다.

상기와 같은 전기화학적 방법을 작동원리로 하는 바이오센서를 전기화학적 바이오센서라 한다. 이러한 전기화학적 바이오센서는 종래의 비색 방법에 의한 바이오센서와는 달리 산소에 의한 영향을 줄일 수 있고, 시료가 혼탁하더라도 시료를 별도 전처리 없이 사용 가능하다는 장점을 갖는다.

이러한 전기화학적 바이오센서는 혈당 양을 감시하고 제어하는데 일반적으로 편리하게 사용되지만, 센서의 정확성은 혈액시료에 존재하는 산화되기 쉬운 아스코르브산(ascorbic acid), 아세트아미노펜(acetaminophene) 및 요산(uric acid)과 같은 다양한 방해 종들에 의해 큰 영향을 받는다.

또한, 전기화학적 바이오센서의 측정 정확도에 심각한 오차를 유발하는 요인으로 적혈구용적률(적혈구가 전체 혈액에서 차지하는 부피의 비율; Hematocrit)이 중요하게 작용한다. 일회용 바이오센서 스트립을 사용하여 그들의 혈당 수준을 규칙적으로 측정하는 사람들에게 있어서, 적혈구용적률 수준에 큰 영향을 받는 바이오센서는 그 측정 결과에 있어서 틀린 판단을 가져오게 되고, 이러한 결과로 인해 심지어는 사용하는 사람들의 생명에 대한 위험을 초래할 수 있다.

따라서, 전기화학적 바이오센서에서 적혈구용적률 감지의 정확도는 결국 혈중 글루코스 농도의 측정 정확도에 직접적으로 영향을 주므로, 적혈구용적률 측정 정확도가 매우 중요하다.

특허문헌 1, 2 및 3에서는 적혈구를 분리하거나, 시약층 상에 적혈구를 제거하는 층을 도포하는 방법에 대하여 개시하고 있다.

특허문헌 4에서는 규소충진물(silica filler)을 포함하여 스크린 인쇄가 가능한 시약/혈구분리 일체형 기능을 갖는 감응막을 사용하는 방법을 개시하고 있다.

특허문헌 5에서는 적용 전위를 두 번 인가하여(the double excitation potentials) 나온 결과를 수학적으로 처리(chemometric method)하는 교정 방법을 개시하고 있다.

한편, 적혈구용적률을 전기전도도 또는 저항으로 직접 측정하는 전극을 효소 반응을 측정하는 전극과 별도로 구비하여 적혈구용적률을 따로 측정하고 이 결과를 이용하여 효소반응 측정 전극에서 얻어진 글루코즈 농도를 보정하여 측정의 정확도를 높일 수 있다. 적혈구용적률을 모세관형 시료셀에 장착된 작동전극과 보조전극을 갖춘 일회용 센서의 전도도로 측정할 수 있는 방법에 대하여는 이미 기존의 기술로 제시된 바 있고(특허문헌 6), 이를 혈당측정용 바이오센서에 적용한 예(특허문헌 7)도 있다.

본 발명은 센서의 대량 생산시 정확히 전도도를 측정할 수 있는 센서의 제작에 초점을 두고 있는데, 혈액의 전기전도도(G)는 다음과 같은 공식 (1)에 기반한다.

G = σA/L (1)

상기 공식 (1)에서 G는 단위가 Ω^-1인 전기전도도, σ는 단위가 Ω^-1cm^-1인 혈액의 전도도계수, A는 단위가 cm² 인 전극의 면적이며, L은 단위가 cm인 전극간의 거리를 나타낸다. 따라서, 일정한 전극간의 거리와 전극의 면적은 정확한 전도도측정을 위해서 중요하다.

그러나 선행기술들에서는 대량생산형 바이오센서에서 헤마토크릿의 측정을 위한 전도도 측정 전극의 면적과 전극간의 거리를 어떻게 일정하게 조절할 수 있는지에 대하여는 개시한 바가 없다.

전기화학적 바이오센서에서 전극은 인쇄방법을 통해 구성되는 경우가 많은데, 전극을 인쇄함에 있어서 그 구성물질에 따라 원하는 대로 정확하게 인쇄되지 않고 모서리 사면이 미세하게 흘러내리는 경향이 있어 전극의 면적과 전극간의 거리에 편차가 발생하는 경향이 있고, 인쇄된 전극이 두꺼워질수록 전극의 모서리 사면에서 일어나는 반응이 전체 측정에 미치는 영향 또한 커지게 된다. 또한, 전극을 인쇄할 경우 작은 오차라도 발생하면 작동전극과 보조전극의 면적이 크게 달라지는 문제가 있다. 이러한 전극 면적의 불균일성은 효소전극에서의 반응에서보다 직접 교류전류를 사용하여 전도도를 측정하는 전극에서 훨씬 크게 확대되어 나타나는 경향이 있고, 이러한 영향은 적혈구용적률을 보정인자로 사용하는 혈당 측정의 정확도 및 정밀도를 낮추게 만든다.

이에, 본 발명자들은 보다 향상된 적혈구용적률 측정 정확도를 갖는 전기화학적 바이오센서에 대하여 연구하던 중, 적혈구용적률 측정값 보정을 위한 제1전극부 및 글루코스 농도를 측정하기 위한 제2전극부를 포함하는 전기화학적 바이오센서에서, 작동전극 및 보조전극의 두께보다 얇은 절연커버를 구비함으로써 혈액시료에 노출되는 제1전극부의 제1작동전극 및 제1보조전극의 면적이 동일해질 뿐만 아니라, 전극 인쇄시 위치 오차가 발생하더라도 상기 절연커버에 의해서 항상 동일한 전극 면적이 유지되므로, 적혈구용적률 측정값의 정확도가 향상되는 것을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

특허문헌 1: JP 1134461 특허문헌 2: JP 2000338076 특허문헌 3: US 5658444 특허문헌 4: US 6241862 B1 특허문헌 5: WO 01/57510 A2 특허문헌 6: US 4301412 특허문헌 7: US 20110139634 A1

본 발명의 목적은 적혈구용적률 측정 정확도가 향상된 혈당 측정용 전기화학적 바이오센서를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이오센서를 이용하여 적혈구용적률 수치를 검정하여 혈중 글루코스 농도를 정밀하게 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

하판;

상기 하판 상에 형성되는 제1작동전극 및 제1보조전극을 포함하는 제1전극부;

상기 하판 상에 형성되는 제2작동전극 및 제2보조전극을 포함하는 제2전극부;

상기 제2작동전극 또는 제2보조전극에 형성되는 전자전달매개체를 포함하는 시약층;

제1작동전극에 위치하는 제1반응부, 제1보조전극에 위치하는 제2반응부 및 제2작동전극과 제2보조전극에 위치하는 제3반응부에 대응하는 영역이 각각 동공되어 구역을 구분하는 절연커버;

상기 제1전극부 및 제2전극부로 순차적으로 혈액시료를 유도하는 미세유로 시료셀부가 구비되는 중간기판; 및

상판;을 포함하되,

상기 절연커버에 의해서 제1반응부 및 제2반응부에서 노출되는 제1작동전극 및 제1보조전극의 면적과 전극 간격이 일정한 것을 특징으로 하는 혈당 측정용 전기화학적 바이오센서를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 바이오센서를 이용하여,

미세유로 시료셀부로 혈액시료를 유입하는 단계(단계 1);

제1전극부에서 혈액시료의 전기전도도를 측정하여 적혈구용적률 수치를 계산하는 단계(단계 2);

제2전극부에서 신호를 측정하여 글루코스 농도를 계산하는 단계(단계 3); 및

상기 제2전극부에서 계산한 글루코스 농도를 상기 제1전극부에서 계산한 적혈구용적률 수치를 반영하여 보정하는 단계(단계 4);를 포함하는 적혈구용적률 수치를 반영하여 혈중 글루코스 농도를 정밀하게 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 적혈구용적률 측정값 보정을 위한 제1전극부 및 글루코스 농도를 측정하기 위한 제2전극부를 포함하는 전기화학적 바이오센서는, 작동전극 및 보조전극의 두께보다 얇은 절연커버를 구비함으로써 혈액시료에 노출되는 제1전극부의 제1작동전극 및 제1보조전극의 면적이 동일해질 뿐만 아니라, 상기 제1작동전극 및 제1보조전극의 간격이 일정해지고, 전극 인쇄시 위치 오차가 발생하더라도 상기 절연커버에 의해서 항상 일정한 전극 면적과 전극 간격이 유지되므로, 적혈구용적률 측정값의 정확도가 향상되고, 상기 측정값을 보정에 이용하는 혈중 글루코스 농도 측정값의 정확도를 보다 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 전기화학적 바이오센서에서 혈액시료에 노출되는 제1작동전극 및 제1보조전극이 혈액이 유입되는 방향에 직각으로 위치하고 있으며, 이들 전극의 면적과 이들 전극간의 거리가 절연커버(6)에 의하여 동일하게 유지되는 평면형 전기화학적 바이오센서의 분해 사시도이다.
도 2는 도 1에서 전극부분을 확대한 그림이다.
도 3은 본 발명의 비교예 1에 따른 전기화학적 바이오센서에서 혈액시료에 노출되는 제1작동전극 및 제1보조전극이 절연커버에 의하여 면적이 규정되지 않은 것을 나타내는 확대도이다.
도 4는 본 발명의 비교예 2에 따른 전기화학적 바이오센서에서 혈액시료에 노출되는 제1작동전극 및 제1보조전극이 혈액이 유입되는 방향에 대하여 순차적으로 위치하는 평면형센서를 나타내는 확대도이다.
도 5는 도 1에서 제1작동전극 및 제1보조전극의 모서리 사면을 설명하기 위한 예시도이다.
도 6은 도 2에서처럼 전극의 일부가 절연커버에 의하여 규정된 부분을 현미경으로 본 사진이다.
도 7은 3에서처럼 전극이 절연커버에 의하여 규정되지 않은 부분을 현미경으로 본 사진이다.
도 8은 실시예 1에서 제작한 센서를 사용하여 적혈구용적률에 대하여 전기전도도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(여기서, "%Hct"는 %적혈구용적률을 의미한다).
도 9는 비교예 1에서 제작한 센서를 사용하여 적혈구용적률에 대하여 전기전도도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(여기서, "%Hct"는 %적혈구용적률을 의미한다).
도 10은 비교예 2에서 제작한 센서를 사용하여 적혈구용적률에 대하여 전기전도도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(여기서, "%Hct"는 %적혈구용적률을 의미한다).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은,

하판;

상판;을 포함하되,

상기 절연커버에 의해서 제1반응부 및 제2반응부에서 노출되는 제1작동전극 및 제1보조전극의 면적과 전극 간격이 일정한 것을 특징으로 하는 혈당 측정용 전기화학적 바이오센서를 제공한다(도 1 및 도 2 참조).

본 발명에 따른 바이오센서에 있어서, 상기 하판은 바이오센서의 기판 역할을 한다. 이때, 상기 하판의 소재로는 세라믹, 유리판 또는 고분자 재료를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 폴리에스테르, 폴리비닐클로라이드(polyvinyl chloride) 및 폴리카보네이트(polycarbonate) 등의 유기 고분자 재료를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 바이오센서에 있어서, 상기 제1전극부는 혈액시료의 전기전도도를 측정하여 적혈구용적률(hematocrit) 수치를 검정하는 역할을 한다.

일반적으로, 당뇨병 환자의 처방을 위해서는 매우 정확한 혈중 글루코스 농도 측정이 필요한데, 환자의 혈중 적혈구용적률 수치에 따라서 글루코스 농도의 측정값에 오차가 발생하기 때문에 이를 보정하는 작업이 필요하다.

구체적으로, 상기 제1전극부는 제1작동전극 및 제1보조전극을 포함하여 구성되며, 1 kHz 이상의 교류전압(AC) 등을 인가하여 측정되는 전기전도도로 혈액시료 중 적혈구용적률 수치를 검정하고, 이 측정값으로 혈액시료 중 글루코스 농도를 보정하여 보다 정확한 혈중 글루코스 농도를 측정할 수 있게 한다.

본 발명에 따른 바이오센서에 있어서, 상기 제2전극부는 혈액시료의 글루코스 농도를 측정하는 역할을 한다.

구체적으로, 상기 제2전극부는 제2작동전극 및 제2보조전극을 포함하여 구성되며, 직류전압(DC) 등을 인가하여 혈액시료 중 글루코스 농도를 측정한다.

본 발명에 따른 바이오센서에 사용되는 전극의 재료는 도전성 물질이면 특별히 제한되지 아니한다. 도전성 물질의 예로는 은 에폭시, 팔라듐, 구리, 금, 백금, 이리듐, 은/염화은, 탄소 및 특정한 산화-환원쌍 또는 기타 첨가제가 보강된 변형된 탄소 등을 들 수 있다. 상기 작동전극, 보조전극은 도전성 물질을 기판상에 스크린프린팅, 물리적 증기착상 또는 에칭하거나, 도체 테이프의 부착 등에 의해 형성될 수 있다.

본 발명에 따른 바이오센서에 있어서, 상기 전자전달매개체를 포함하는 시약층은 산화환원효소를 더 포함할 수도 있다.

이때, 상기 산화환원효소는 측정하고자 하는 글루코스와 반응하여 환원되는 것으로, 상기 환원된 효소는 전자전달매개체와 반응하여 글루코스를 정량하게 된다. 산화환원효소의 예를 들면, 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소효소(flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소효소(nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, NAD-GDH), 파이롤로퀴놀린 퀴논-글루코스탈수소효소(Pyrroloquinoline quinone-glucose dehydrogenase, PQQ-GDH), 당산화효소(glucose oxidase; GOx) 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 전자전달매개체는 글루코스와 반응하여 환원된 효소와 산화환원반응하여 환원되게 되며, 이렇게 형성된 환원상태의 전자전달매개체는 산화전위가 인가된 전극표면에서 전류를 발생시키는 역할을 수행한다.

이때, 상기 전자전달매개체로는 금속함유 착물과 티오닌 또는 이의 유도체를 함께 혼합하여 사용할 수 있으나, 종래에 사용된 염화헥사아민루세늄(Ⅲ)(hexaammineruthenium(Ⅲ)chloride), 포타슘페리시아나이드(potassium ferricyanide), 포타슘페로시아나이드(potassium ferrocyanide), 디메틸페로센(dimethylferrocene(DMF)), 페리시니움(ferricinium), 페로센모노카르복실산(ferocene monocarboxylic acid(FCOOH)), 7,7,8,8,-테트라시아노퀴노디메탄(7,7,8,8-tetracyanoquino-dimethane(TCNQ)), 테트라티아풀발렌(tetrathia fulvalene(TTF)), 니켈로센(nickelocene(Nc)), N-메틸아시디니움(N-methyl acidinium(NMA+)), 테트라티아테트라센(tetrathiatetracene(TTT)), N-메틸페나지니움(N-methylphenazinium (NMP+)), 하이드로퀴논(hydroquinone), 3-디메틸아미노벤조산(3-dimethylaminobenzoic acid(MBTHDMAB)), 3-메틸-2-벤조티오조리논하이드라존(3-methyl-2-benzothiozolinone hydrazone), 2-메톡시-4-알릴페놀(2-methoxy-4-allylphenol), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrin(AAP)), 디메틸아닐린(dimethylaniline), 4-아미노안티피렌(4-aminoantipyrene), 4-메톡시나프톨(4-methoxynaphthol), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine(TMB)), 2,2-아지노-디-[3-에틸-벤즈티아졸린 술포네이트] (2,2-azino- di-[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate]), o-디아니지딘(o-dianisidine), o-톨루이딘(o-toluidine), 2,4-디클로로페놀(2,4-dichlorophenol), 4-아미노페나존(4-amino phenazone), 벤지딘(benzidine), 프루시안 블루(prussian blue), 바이피리딘-오스뮴 복합체 화합물 등을 사용할 수 있다.

일반적으로, 적혈구용적률 수치를 검정할 경우에 작동전극과 보조전극의 면적을 동일하게 구비하는 것이 정확한 측정을 위한 중요 요소로 작용한다. 그러나, 대량생산용으로 바이오센서에 전극을 인쇄할 경우 그 구성물질(예를 들면, 탄소전극)에 따라 원하는 대로 정확하게 인쇄되지 않고 전극의 모서리 사면 부분이 미세하게 흘러내리는 경향이 있으며, 평면형 전극에서 인쇄된 전극이 두꺼워질수록 전극의 모서리 사면 면적이 늘어나, 특정되지 않은 면적에서 일어나는 반응이 커져 전극모서리 효과(edge effect)가 커지게 된다. 따라서, 적혈구용적률 수치 측정값의 정밀성 및 신뢰성이 떨어지는 문제점이 있다.

상술한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명에서는 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 절연커버를 사용하여 혈액시료에 노출되는 제1작동전극 및 제1보조전극의 면적이 최대한 일정하고 이들 전극간의 거리가 일정하게 구비되도록 하여, 측정오차를 줄인다.

더욱 구체적으로, 상기 절연커버의 두께는 하판의 상면으로부터 제1작동전극 및 제1보조전극의 상면까지 측정되는 두께보다 얇게 형성되어 인쇄 시 흘러내리는 현상에 의한 전기전도도 측정값 오차를 최소화할 수 있다(도 5 참조).

절연커버의 두께를 상기 전극의 두께보다 얇게 형성시키는 바람직한 일례로, 소수성 절연 잉크로 인쇄하는 방법을 사용할 수 있다. 여기서, 상기 소수성 절연 잉크로는 폴리 아크릴, 에폭시, 세라믹계열 등의 소수성 잉크를 사용할 수 있다.

또한, 상기 절연커버에 의해서 구역이 규정되는 제1작동전극에 위치하는 제1반응부와 제1보조전극에 위치하는 제2반응부는 미세유로 시료셀부로 혈액이 유입되는 길이방향에 직각인 선상에서 각각 적어도 일부가 겹쳐지는 형태로 위치할 수 있다.

이때, 상기 제1작동전극에 위치하는 제1반응부와 제1보조전극에 위치하는 제2반응부는 서로 동일한 형태인 것이 바람직하고, 직사각형, 정사각형, 원형, 타원형 등의 형태로 구비될 수 있으나, 제조과정의 편의상 직사각형 또는 정사각형이 바람직하다.

더욱 바람직하게, 제1작동전극에 위치하는 제1반응부와 제1보조전극에 위치하는 제2반응부는 미세유로 시료셀부로 혈액이 유입되는 길이방향에 직각인 선상에서, 길이방향 중앙선을 기준으로 하여 데칼코마니 형태로 위치할 수 있다.

한편, 도 3에 나타낸 방법처럼 제1작동전극과 제1보조전극 사이에 절연커버를 구성하지 않을 경우, 작동전극과 보조전극의 면적이 크게 달라지는 문제가 있다.

본 발명에 따른 바이오센서에 있어서, 상기 중간기판은 미세유로 시료셀부가 구비되어 제1전극부 및 제2전극부로 혈액시료가 순차적으로 유입되도록 하는 역할과 그 양면에 접착제가 코팅되어 상판과 하판을 접착시키는 역할을 한다.

이때, 상기 미세유로 시료셀부의 싸이즈는 0.5-2 ㎜의 너비와, 50-250 ㎛의 높이를 갖는 미세유로가 형성되는 것이, 혈액시료의 도입을 용이하게 한다는 관점에서 바람직하다.

본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서에 있어서, 상기 상판은 공기배출구가 구비되어 상술한 미세유로 시료셀부를 통해 혈액시료가 모세 현상으로 잘 유입되도록 하는 역할과 바이오센서의 마감재 역할을 한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 상기 바이오센서를 이용하여 적혈구용적률 수치를 반영하여 혈중 글루코스 농도를 정밀하게 측정하는 방법을 제공한다:

미세유로 시료셀부로 혈액시료를 유입하는 단계(단계 1);

상기 제2전극부에서 계산한 글루코스 농도를 상기 제1전극부에서 계산한 적혈구용적률 수치를 반영하여 보정하는 단계(단계 4).

이하, 본 발명에 따른 방법을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 1은 미세유로 시료셀부로 혈액시료를 유입하는 단계이다.

이때, 환자로부터 혈액시료를 채취할 때의 고통을 최소화하면서 채혈하기 위한 시료의 바람직한 양은 0.1-0.7 ㎕이며, 이들 시료가 전처리 과정없이 도입된다. 본 발명의 측정방법에 사용되는 바이오센서를 사용하면 상기 소량의 혈액시료로부터도 정확하고 빠르게 혈당을 측정할 수 있게 된다. 이는 상기 바이오센서의 미세유로 시료셀부에는 0.5-2 ㎜의 너비와, 50-250 ㎛의 높이를 갖는 미세유로가 형성되어 있어 혈액시료의 도입을 용이하게 하기 때문이다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 2는 제1전극부에서 혈액시료의 전기전도도를 측정하여 적혈구용적률 수치를 계산하는 단계이고, 상기 단계 3은 제2전극부에서 신호를 측정하여 글루코스 농도를 계산하는 단계이다.

구체적으로, 제1전극부 및 제2전극부의 작동전극과 보조전극 사이에 직류, 저주파 또는 고주파 교류, 고임피던스 또는 다양한 형태의 펄스, 바람직하게는 직사각형파, 삼각파, 반정현파, 가우스파 등을 사용하여 전체 측정 과정을 조절할 수 있다.

일례로, 본 발명에 따른 바이오센서가 이의 측정기에 삽입되면, 제1전극부 및/또는 제2전극부의 작동전극과 보조전극 사이에 미리 예정된 일정한 교류전압이 걸리게 된다. 이때 걸어주는 작동전극과 보조전극에 가해진 전압은 독립적이며, 전체 회로는 개방회로(open circuit)를 형성한다. 시료 주입에 의한 전기적 변화가 개방회로 상태에서 전위차로 나타나게 되고, 상기 전위차 신호를 바이오센서의 측정 과정의 시작 신호로 사용하게 된다.

이때, 전자전달매개체를 포함하는 시약층은 제2작동전극 또는 제2보조전극 중 어느 하나의 전극에만 형성되어 있고, 상기 전극간 간격은 20 ㎛ 내지 2 mm의 범위로 배열되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 전극 간격을 80 ㎛ 내지 0.5 mm의 범위로 배열할 수 있다. 나아가, 상기 시약층은 산화환원효소를 더 포함할 수 있고, 지방산과 4차 암모늄염을 부가적으로 더 포함할 수도 있다.

여기서, 상기 산화환원효소로는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소효소(flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소효소(nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, NAD-GDH), 파이롤로퀴놀린 퀴논-글루코스탈수소효소(Pyrroloquinoline quinone-glucose dehydrogenase, PQQ-GDH), 당산화효소(glucose oxidase; GOx) 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 전자전달매개체로는 금속함유 착물과 티오닌 또는 이의 유도체를 함께 혼합하여 사용할 수 있으나, 종래에 사용된 염화헥사아민루세늄(Ⅲ)(hexaammineruthenium(Ⅲ)chloride), 포타슘페리시아나이드(potassium ferricyanide), 포타슘페로시아나이드(potassium ferrocyanide), 디메틸페로센(dimethylferrocene(DMF)), 페리시니움(ferricinium), 페로센모노카르복실산(ferocene monocarboxylic acid(FCOOH)), 7,7,8,8,-테트라시아노퀴노디메탄(7,7,8,8-tetracyanoquino-dimethane(TCNQ)), 테트라티아풀발렌(tetrathia fulvalene(TTF)), 니켈로센(nickelocene(Nc)), N-메틸아시디니움(N-methyl acidinium(NMA+)), 테트라티아테트라센(tetrathiatetracene(TTT)), N-메틸페나지니움(N-methylphenazinium (NMP+)), 하이드로퀴논(hydroquinone), 3-디메틸아미노벤조산(3-dimethylaminobenzoic acid(MBTHDMAB)), 3-메틸-2-벤조티오조리논하이드라존(3-methyl-2-benzothiozolinone hydrazone), 2-메톡시-4-알릴페놀(2-methoxy-4-allylphenol), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrin(AAP)), 디메틸아닐린(dimethylaniline), 4-아미노안티피렌(4-aminoantipyrene), 4-메톡시나프톨(4-methoxynaphthol), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine(TMB)), 2,2-아지노-디-[3-에틸-벤즈티아졸린 술포네이트] (2,2-azino- di-[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate]), o-디아니지딘(o-dianisidine), o-톨루이딘(o-toluidine), 2,4-디클로로페놀(2,4-dichlorophenol), 4-아미노페나존(4-amino phenazone), 벤지딘(benzidine), 프루시안 블루(prussian blue), 바이피리딘-오스뮴 복합체 화합물 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 4는 상기 제2전극부에서 계산한 글루코스 농도에 상기 제1전극부에서 계산한 적혈구용적률 수치를 반영하여 보정하는 단계이다. 이때, 제1전극부 및 제2전극부의 측정 순서는 제한하지 않는다.

구체적으로, 제1전극부에서 측정된 전도도 측정값을 이용하여 측정기에 미리 입력된 적혈구용적률 보정식을 통해 측정된 적혈구용적률을 구하고, 제2전극부에서 측정된 혈당측정값을 미리 입력된 각 적혈구용적률 보정식을 이용하여 적혈구용적률의 영향이 보정된 값으로 계산해주어, 정확한 측정값을 나타내게 된다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 적혈구용적률 측정값 보정을 위한 제1전극부 및 글루코스 농도를 측정하기 위한 제2전극부를 포함하는 전기화학적 바이오센서는, 작동전극 및 보조전극의 두께보다 얇은 절연커버를 구비함으로써 혈액시료에 노출되는 제1전극부의 제1작동전극 및 제1보조전극의 면적이 동일해질 뿐만 아니라, 상기 제1작동전극 및 제1보조전극의 간격이 일정해지고, 전극 인쇄시 위치 오차가 발생하더라도 상기 절연커버에 의해서 항상 일정한 전극 면적과 전극 간격이 유지되므로, 적혈구용적률 측정값의 정확도가 향상되고, 상기 측정값을 보정에 이용하는 혈중 글루코스 농도 측정값의 정확도를 보다 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 적혈구용적률 측정을 위한 작동전극 및 보조전극의 면적이 절연커버에 의해 일정하게 규정된 평면형 바이오센서의 제조 1

평면형 바이오센서의 일례로서 도 1에 나타낸 것과 같이 평균값 0.5 ㎕ 시료도입부를 가진 평면형 바이오센서를 제조하였다. 본 평면형 바이오센서를 제조하는 상세한 방법은 대한민국 특허출원 10-2003-0036804호, 대한민국 특허출원 10-2005-0010720호, 대한민국 특허출원 10-2007-0020447호, 대한민국 특허출원 10-2007-0021086호, 대한민국 특허출원 10-2007-0025106호, 대한민국 특허출원 10-2007-0030346호, E. K. Bauman et al., Analytical Chemistry, vol 37, p 1378, 1965; K. B. Oldham in "Microelectrodes: Theory and Applications," Kluwer Academic Publishers, 1991. 등에 공지된 방법을 참조하여 제조하였다.

도 1에서,

1은 작동전극 및 보조전극이 형성되는 폴리에스테르로 만든 하판이고,

2 내지 5는 탄소/그라파이트를 스크린 프린트하여 만든 전극이되, 2는 제1작동전극이고, 3은 제1보조전극이며, 4는 제2작동전극이고, 5는 제2보조전극이며,

6은 제1전극부와 제2전극부를 규정하고, 상기 제1전극부의 제1작동전극과 제1보조전극의 면적을 동일하게 규정하는 절연커버이고,

7은 산화환원효소 및 전자전달매개체를 포함하는 시약층이며,

8은 미세유로 시료셀부가 구비되어 제1전극부 및 제2전극부로 순차적으로 혈액시료가 유입되도록 유도하고, 그 양면에 접착제가 코팅되어 있어 하판과 상판을 접착시키는 역할을 하는 0.10 mm 두께의 중간기판이고,

9는 혈액이 미세유로 시료셀부 안으로 스며들도록 하기 위한 공기배출구를 구비한, 폴리에스테르로 제조한 상판이며,

10은 공기배출구이다.

< 비교예 1> 적혈구용적률 측정을 위한 작동전극 및 보조전극의 면적이 규정되지 않은 평면형 바이오센서의 제조 1

도 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 바이오센서를 제조하되, 절연커버(6)가 제1작동전극과 제2작동전극 사이에 위치하지 않은 평면형 바이오센서를 제조하였다.

< 비교예 2> 적혈구용적률 측정을 위한 작동전극 및 보조전극의 면적이 규정되지 않은 평면형 바이오센서의 제조 2

도 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 바이오센서를 제조하되, 절연커버(6)가 제1작동전극과 제2작동전극이 혈액이 유입되는 방향에 대하여 순차적으로 위치하며 이들 전극이 절연커버에 의하여 규정되지 않은 평면형 바이오센서를 제조하였다.

< 실험예 1> 적혈구용적률에 대한 전도도 측정

실시예 1 및 비교예 1-2에서 제조한 바이오센서의 적혈구용적률 측정 정확도를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험하였다.

구체적으로, 제1 전극부에 AC 주파수 2.5 kHz, Peak-to-Peak 전압 81 mV를 인가하여 적혈구용적률이 0, 10, 20 30, 40, 50, 60 및 70%가 되도록 제조한 혈액의 전도도를 5회씩 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1, 도 8 내지 도 10에 나타내었다.

	실시예 1	비교예 1	비교예 2
표준편차의 평균 ( )	0.00056	0.00291	0.00251
기울기 (S_G)	-0.00080	-0.00110	-0.00120
/S_G	-0.703	-2.648	-2.094

도 8은 실시예 1에서 제작한 센서를 사용하여 적혈구용적률에 대하여 전기전도도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(여기서, "%Hct"는 %적혈구용적률을 의미한다).

도 9는 비교예 1에서 제작한 센서를 사용하여 적혈구용적률에 대하여 전기전도도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(여기서, "%Hct"는 %적혈구용적률을 의미한다).

도 10은 비교예 2에서 제작한 센서를 사용하여 적혈구용적률에 대하여 전기전도도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(여기서, "%Hct"는 %적혈구용적률을 의미한다).

도 8-10에 나타난 바와 같이, %적혈구용적률당 전도도의 기울기는 실시예 1의 경우 '-0.0008'이고, 비교예 1의 경우에는 '-0.0011'로 측정되었는데, 이는 제1작동전극과 제1보조전극간의 거리(d1)가 비교예 1에서의 거리(d2) 보다 길기 때문이다(배경기술에서 공식 (1) 참조).

표 1에 나타난 바와 같이, 표준편차의 평균을 기울기로 나눈 값[

/S_G]을 살펴보면, 실시예 1의 경우에는 '-0.703'이고 비교예 1의 경우에는 '-2.648'로 나타나므로 실시예 1의 바이오센서가 대략 3.8배[=(-2.648)/(-0.703)] 더 정밀한 성능을 보이는 것을 알 수 있다. 또한, 비교예 2의 경우 표준편차의 평균을 기울기로 나눈 값[

/S_G]이 '-2.094'로 나타나므로 실시예 1의 바이오센서가 대략 4.1배[=(-2.904)/(-0.703)] 더 정밀한 성능을 보이는 것을 알 수 있다. 아울러, 비교예 2의 경우 측정에 필요한 혈액의 양이 많아짐으로 사용자의 편리성측면에서 바람직한 구조가 아니다.

이러한 결과는 도 5에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 절연커버는 탄소/그라파이트 전극보다 두께에 있어서 두 배 이상 얇아서 더욱 정확한 면적을 규정하는 데 효과적임을 나타낸다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 탄소/그라파이트 전극을 프린트한 모서리 사면은 둥그스름하여 면적을 섬세히 규정하기 어려우나, 실제로 탄소/그라파이트 전극에 절연커버를 프린트한 도 6을 보면, 탄소/그라파이트 전극의 모서리 사면을 직각에 가깝게 규정할 수 있는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서는 절연커버에 의해서 제1반응부 및 제2반응부에서 노출되는 제1작동전극 및 제1보조전극의 면적과 전극 간격이 최대한 일정해짐으로써, 측정의 정확도가 현저히 향상되는 효과 있으므로, 전기화학적 바이오센서에 유용할 수 있다.

1: 하판
2: 제1작동전극
3: 제1보조전극
4: 제2작동전극
5: 제2보조전극
6: 절연커버
7: 시약층
8: 중간기판
9: 상판
10: 공기배출구

Claims

하판;
상기 하판 상에 형성되는 제1작동전극 및 제1보조전극을 포함하는 제1전극부;
상기 하판 상에 형성되는 제2작동전극 및 제2보조전극을 포함하는 제2전극부;
상기 제2작동전극 또는 제2보조전극에 형성되는 전자전달매개체를 포함하는 시약층;
제1작동전극에 위치하는 제1반응부, 제1보조전극에 위치하는 제2반응부 및 제2작동전극과 제2보조전극에 위치하는 제3반응부에 대응하는 영역이 각각 동공되어 구역을 구분하는 절연커버;
상기 제1전극부 및 제2전극부로 순차적으로 혈액시료를 유도하는 미세유로 시료셀부가 구비되는 중간기판; 및
상판;을 포함하되,
상기 절연커버에 의해서 제1반응부 및 제2반응부에서 노출되는 제1작동전극 및 제1보조전극의 전극 간격이 일정하고,
상기 제1전극부는 혈액시료의 전기전도도를 측정하여 적혈구용적률을 계산하는 것으로써, 전자전달매개체 및 산화환원효소를 포함하지 않으며,
제1반응부 및 제2반응부에서 노출되는 제1작동전극 및 제1보조전극의 면적이 동일하고,
상기 제1전극부는 혈액시료의 전기전도도를 측정하여 적혈구용적률을 계산하는 것을 특징으로 하는 혈당 측정용 전기화학적 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 절연커버는 제1반응부에서 노출되는 제1작동전극의 적어도 하나의 모서리 사면 및 제2반응부에서 노출되는 제1보조전극의 적어도 하나의 모서리 사면을 덮고 있는 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 절연커버의 두께는 전극의 두께보다 얇은 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 절연커버는 소수성 절연 잉크로 인쇄되는 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서.
제4항에 있어서,
상기 소수성 절연 잉크는 폴리아크릴계, 에폭시계 및 세라믹계로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 제1작동전극에 위치하는 제1반응부와 제1보조전극에 위치하는 제2반응부는 미세유로 시료셀부로 혈액이 유입되는 길이방향에 직각인 선상에서 각각 적어도 일부가 겹쳐지는 형태로 위치하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 제1작동전극에 위치하는 제1반응부와 제1보조전극에 위치하는 제2반응부는 서로 동일한 형태인 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 제1작동전극에 위치하는 제1반응부와 제1보조전극에 위치하는 제2반응부는 미세유로 시료셀부로 혈액이 유입되는 길이방향에 직각인 선상에서, 길이방향 중앙선을 기준으로 하여 데칼코마니 형태로 위치하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서.
삭제
제1항에 있어서,
상기 시약층은 산화환원효소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오 센서.
삭제
제1항에 있어서,
상기 제2전극부는 혈액시료 중의 글루코스 산화환원반응에 따른 전류를 측정하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 제1전극부에는 교류전압(AC)를 인가하여 전기전도도를 측정하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 제2전극부에는 직류전압(DC)를 인가하여 글루코스 산화환원반응에 따른 전류를 측정하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 제1전극부 또는 제2전극부는 유동감지전극을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서.
제1항의 바이오센서를 이용하여,
미세유로 시료셀부로 혈액시료를 유입하는 단계(단계 1);
제1전극부에서 혈액시료의 전기전도도를 측정하여 적혈구용적률 수치를 계산하는 단계(단계 2);
제2전극부에서 신호를 측정하여 글루코스 농도를 계산하는 단계(단계 3); 및
상기 제2전극부에서 계산한 글루코스 농도를 상기 제1전극부에서 계산한 적혈구용적률 수치를 반영하여 보정하는 단계(단계 4);를 포함하는 적혈구용적률 수치를 반영하여 혈중 글루코스 농도를 정밀하게 측정하는 방법.