JP2000338076A

JP2000338076A - バイオセンサ

Info

Publication number: JP2000338076A
Application number: JP11145549A
Authority: JP
Inventors: Yoshiko Miyamoto; 佳子宮本; Toshihiko Yoshioka; 俊彦吉岡; Shiro Nankai; 史朗南海
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1999-05-25
Filing date: 1999-05-25
Publication date: 2000-12-08

Abstract

(57)【要約】【課題】血液中に存在する赤血球による影響を抑制
し、被検物質を高精度に定量できるバイオセンサを提供
する。【解決手段】電気絶縁性基板上に作用極と対極からな
る電極、少なくとも酵素、電子受容体および赤血球吸着
剤を含む反応層を設ける。または、赤血球吸着剤からな
る層を、酵素および電子受容体を含む反応層と接触しな
い位置に設ける。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血液試料中の特定
成分について、迅速かつ高精度な定量を実施するための
バイオセンサに関する。

【０００２】

【従来の技術】試料液の希釈や撹拌などを行うことな
く、試料中の特定成分を簡易に定量しうる方式を利用し
た従来のバイオセンサとしては、例えば特開平３−２０
２７６４号公報に開示されたものがあげられる。このバ
イオセンサは、電気絶縁性基板の上にスクリーン印刷な
どの方法で作用極および対極からなる電極を形成し、さ
らに電気絶縁層を形成した後に、上記電極上に親水性高
分子、酸化還元酵素および電子受容体からなる酵素反応
層を形成して得られるものである。そして、試料中に被
検物質として基質を含む試料液を酵素反応層上へ滴下す
ると、酵素反応層が溶解し、ついて基質と酵素の反応に
より基質が酸化し、これにともなって電子受容体が還元
される。この酵素反応が終了した後、還元された電子受
容体を電気化学的に酸化し、このときに得られる酸化電
流値から試料液中の基質濃度が求められる。

【０００３】ところが、上記のような従来のバイオセン
サには、同じ濃度の基質を含むが基質以外の成分の濃度
が異なる血液試料について、その基質濃度を測定する場
合、センサの応答特性に差が生じるという問題がある。
なかでも、赤血球の量がセンサの応答特性に影響するこ
とがわかっている。この赤血球の存在に起因する応答特
性の変動を解消する手段として、反応層上に濾過層を設
け、血液試料中の被検物質以外の成分をトラップする方
法が考えられているが、濾過に時間を用意するため測定
に長時間を要するという問題がある。また、血液試料の
成分の相違による応答特性の差を緩和する方法として、
特定の希釈液を用いて血液試料を希釈する方法も有効で
あるが、工程が煩雑になり、基質濃度の測定に手間がか
かるという問題がある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、血液試料中の被検物質以外の成分の影響を受けず、
簡易で高精度の定量が可能なバイオセンサを提供するこ
とにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、電気絶縁性基
板、前記基板上に形成された作用極および対極を含む電
極、ならびに前記電極上に配置された少なくとも酵素、
電子受容体および赤血球吸着剤を含有する反応層を具備
するバイオセンサに関する。さらに、本発明は、電気絶
縁性基板、前記基板上に形成された作用極および対極を
含む電極、前記電極上に配置された少なくとも酵素およ
び電子受容体を含有する反応層、ならびに前記反応層に
接触しない赤血球吸着剤を含有する層を具備するバイオ
センサにも関する。これらの場合、赤血球吸着剤がデキ
ストランであるのが好ましい。

【０００６】

【発明の実施の形態】前述のように、血液試料中の基質
濃度を測定する場合、赤血球の存在がバイオセンサの応
答特性に悪影響を与える。この原因の一つとして、赤血
球が電極近傍に接近し、電極表面を覆うことが考えられ
る。そのため、電極面積が減少し、赤血球の存在量の違
いによって応答値が変化するのである。そこで、本発明
者らは、バイオセンサ中に赤血球吸着剤を含めて血液試
料中の赤血球を捕捉すれば、赤血球の電極表面への吸着
を抑制し、センサの応答特性の変動を抑制することがで
きる点に着目し、本発明を完成するに至った。すなわ
ち、本発明のバイオセンサは、赤血球吸着剤を酵素およ
び電子受容体とともに反応層に含ませる点、または反応
層とは別に、反応層に接触しない位置に赤血球吸着剤を
含有する層を設ける点に最大の特徴を有する。

【０００７】まず、本発明のバイオセンサは血液試料中
の被検物質である基質の濃度を測定するものである。こ
の被検物質としては、例えばグルコース、コレステロー
ル、乳酸、アスコルビン酸、ビリルビン、尿酸などがあ
げられる。つぎに、本発明のバイオセンサを構成する要
素は、概ね従来公知のものでよいが、以下に簡単に説明
する。

【０００８】本発明において用いる電気絶縁性基板は、
例えばポリエチレンテレフタレートなどから従来公知の
方法で作製すればよい。また、前記基板上に形成する作
用極および対極を含む電極は、例えば銀、白金などの金
属、もしくは炭素またはこれらの混合物などを用い、例
えばスクリーン印刷法などにより設ければよい。また、
作用極および対極を形成する二極電極系ではなく、より
精度の高い測定をするために参照極を設けて三極電極系
を採用してもよい。

【０００９】さらに、基板上に形成された電極の表面
を、後述する酵素などから保護するために、親水性高分
子で被覆するのが好ましい。このような親水性高分子と
しては、例えばカルボキシメチルセルロース、ヒドロキ
シエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、
カルボキシエチルメチルセルロース、ポリビニルピロリ
ドン、ポリビニルアルコール、ゼラチンもしくはその誘
導体、無水マレイン酸もしくはその塩の重合体などがあ
げられる。これらは、センサ応答性に悪影響を与えない
範囲で組み合わせて用いてもよい。

【００１０】つぎに、本発明のバイオセンサにおける反
応層は、少なくとも酵素、電子受容体を用いて、従来公
知の方法で形成する。前述のように、赤血球吸着剤をこ
の反応層に含ませてもよい。また、電極上に設けられる
反応層中の酵素および電子受容体と、赤血球吸着剤とを
接触しない構造により、電極への赤血球の接近をより有
効に阻止することができるという点から、赤血球吸着剤
を前記反応層に含ませず、赤血球吸着剤からなる層を、
前記反応層と別個に設けてもよい。ここで、赤血球吸着
剤としては、赤血球を捕捉するものであればよい。例え
ば血液中から白血球を分離するために用いられるデキス
トランなどがあげられる。

【００１１】本発明における反応層を構成する酵素は、
被検物質の種類に応じて適宜選択すればよいが、例えば
グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナー
ゼ、ピラノースオキシダーゼ、コレステロールオキシダ
ーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールデ
ヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、アスコルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ウリカーゼ
などがあげられる。これらの酵素は、被検物質の種類に
応じて組み合わせて用いてもよい。

【００１２】また、前記反応層を構成する電子受容体と
しては、例えばフェリシアン化ナトリウム、フェリシア
ン化カリウム、ｐ−ベンゾキノン、フェナジンメトサル
フェート、インドフェノールもしくはその誘導体、β−
ナフトキノン−４−スルホン酸ナトリウム、β−ナフト
キノン−４−スルホン酸カリウム、メチレンブルー、ま
たはフェロセンもしくはその誘導体などがあげられる。
なかでも、血液中の赤血球に変化を与える可能性が少な
いという点から、フェリシアン化ナトリウムを用いるの
が好ましい。

【００１３】前記親水性高分子、酵素および電子受容体
は、溶媒に溶解して本発明のバイオセンサの製造に供す
るが、この溶媒としては、例えば水、リン酸緩衝液、ク
エン酸緩衝液、酢酸緩衝液またはトリス塩酸緩衝液など
の緩衝液などを用いることができる。

【００１４】前記反応層中の酵素の含有量は、測定対象
となる試料中の基質の量に影響されることなく酵素反応
が行われる範囲であればよい。前記反応層中の電子受容
体の含有量は、試料中の基質濃度に応じた範囲であれば
よい。反応層中のその他の成分としては、例えば親水性
高分子や緩衝液の成分などを、本発明の効果を損なわな
い範囲で含んでいてもよい。

【００１５】また、前記赤血球吸着剤からなる層を設け
る場合は、赤血球吸着剤を水または溶媒に溶解した溶液
を用いて形成する。溶媒としては、前記反応層形成時に
用いたものと同じものを用いることができる。

【００１６】ここで、図１に示す本発明のバイオセンサ
の一実施の形態に代表させて、本発明のバイオセンサの
構造について説明する。図１は、本発明のバイオセンサ
の一実施の形態の構造を示す概略縦断面図である。な
お、図１においては、カバーおよびスペーサーは省略し
ている。図１に示すように、本発明のバイオセンサを得
るためには、まず、ポリエチレンテレフタレートからな
る電気絶縁性基板１上に、スクリーン印刷法などにより
銀ペーストなどを印刷してリード２および３を形成す
る。さらに、基板１上には、同様の印刷法により、樹脂
バインダーを含む導電性カーボンペーストなどからなる
作用極４および対極５を含む電極、ならびに電気絶縁性
ペーストなどからなる電気絶縁層６を形成する。電気絶
縁層６は、バイオセンサの性能を一定にして使い捨てに
適したものとするという点から、作用極４および対極６
の露出部分の面積を一定とし、かつリード２および３を
部分的に覆うように形成するのが好ましい。このように
電極を形成した電気絶縁性基板１上に、親水性高分子層
７、酵素、電子受容体および赤血球吸着剤を含む反応層
８を形成する。

【００１７】つぎに、図２は、図１に示す本発明のバイ
オセンサの概略分解斜視図を示す。図２に示すように、
カバー１２の内側となる部分には、試料の供給を容易に
するために、レシチン層１０を形成するのが好ましい。
なお、図１および図２に示す本発明のバイオセンサにお
いては、反応層８に酵素、電子受容体および赤血球吸着
剤を含めたが、赤血球吸着剤を反応層８に含めず、例え
ばカバー１２の内側となる部分に、赤血球吸着剤からな
る層９およびレシチン層１０を形成してもよい（図３参
照）。

【００１８】

【実施例】以下に、実施例を用いて本発明をより具体的
に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるもので
はない。《実施例１》ここでは、バイオセンサとして、図１に示
す構造を有するグルコースセンサを製造した。まず、絶
縁性基板１上に親水性高分子としてカルボキシメチルセ
ルロース（ＣＭＣ）の０．５重量％水溶液５μｌを電極
表面に滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥さ
せて親水性高分子層７を形成した。つぎに、酵素として
グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４、ＧＯ
Ｄ）２００ユニット、電子受容体としてフェリシアン化
ナトリウム４０μｍｏｌ、および赤血球吸着剤としてデ
キストラン３０ｍｇを、水１ｍｌに溶解して混合水溶液
を調製した。この混合水溶液５μｌを親水性高分子層７
の上に滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥さ
せて、酵素、電子受容体および赤血球吸着剤を含む反応
層８を形成した。また、レシチンの０．５重量％トルエ
ン溶液を調製し、カバー１２の内側に滴下乾燥させて、
レシチン層１０を形成した。上記のようにして基板上に
親水性高分子層７、ならびに酵素、電子受容体および赤
血球吸着剤を含む反応層８を形成し、レシチン層１０を
カバー側に形成した後、カバー１２およびスペーサー１
１を図２中の一点鎖線で示すような位置関係をもって絶
縁性基板１と接着してグルコースセンサを作製した。

【００１９】［評価方法］このグルコースセンサの血液
試料として、グルコース濃度が３００ｍｇ／ｄｌ、赤血
球容積比（ヘマトクリット値）が０％（血漿）、２５
％、３８％および５０％の血液を調製した。ヘマトクリ
ット値が０％の試料液３μｌを試料供給孔１３より供給
すると、血液試料は空気孔１４まで達し、反応層８が溶
解した。そして、試料を供給してから６０秒後に、電極
の対極５と作用極４の間に＋０．５Ｖの電圧を印加し、
５秒後の電流値を測定した。同様にして、ヘマトクリッ
ト値が２５％、３８％、５０％の試料液を用いて測定し
た。測定結果を図４に示す。図４は、ヘマトクリット値
（％）と電流値（μＡ）の関係を示す図である。図４よ
り、得られた電流値は、血液試料中のヘマトクリット値
に関わらず、一定であった。

【００２０】《実施例２》図３に示す構造を有するグル
コースセンサを製造した。これは、図１に示す構造を有
するグルコースセンサにおいて、反応層８に赤血球吸着
剤を含ませず、別途赤血球吸着剤からなる層を設けたも
のである。絶縁性基板１上にＣＭＣの０．５重量％水溶
液５μｌを電極表面に滴下し、５０℃の温風乾燥機中で
１０分間乾燥させて親水性高分子層７を形成した。つぎ
に、ＧＯＤ２００ユニットとフェリシアン化ナトリウム
４０μｍｏｌを水１ｍｌに溶解した混合水溶液を調製し
た。この混合水溶液を親水性高分子層７の上に５μｌ滴
下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥させて、酵
素および電子受容体を含む反応層８を形成した。つぎ
に、デキストランの３％水溶液を調製し、カバー１２の
内側となる部分に３μｌ滴下して５０℃の温風乾燥機中
で１０分間乾燥させ、赤血球吸着剤層９を形成した。さ
らに、レシチンの０．５重量％トルエン溶液を調製し、
赤血球吸着剤層９の上に滴下して乾燥させ、レシチン層
１０を形成した。上記のようにして絶縁性基板１上に親
水性高分子層７、ならびに酵素および電子受容体を含む
反応層８を形成し、赤血球吸着剤層９およびレシチン層
１０をカバー１２側に形成した後、カバー１２およびス
ペーサー１１を、図２中の一点鎖線で示すような位置関
係をもって絶縁性基板１と接着してグルコースセンサを
作製した。

【００２１】得られたグルコースセンサについて、実施
例１と同様にして評価を行った。ヘマトクリット値が０
％の試料液３μｌを試料供給孔１３より供給すると、血
液試料は空気孔１４まで達し、赤血球吸着剤層９と反応
層８が溶解した。そして、試料を供給してから６０秒後
に、電極系の対極５と作用極４の間に＋０．５Ｖの電圧
を印加し、５秒後の電流値を測定した。ヘマトクリット
値が２５％、３８％、５０％の試料液を用いて測定した
結果、得られた電流値は、試料中のヘマトクリット値に
関わらず、一定であった。

【００２２】《比較例１》電極上に親水性高分子層７な
らびに酵素および電子受容体を含む反応層８を形成し、
カバー１２の内側にレシチン層１０のみを形成したほか
は、実施例２と同様にして、比較用のグルコースセンサ
を作製した。得られたグルコースセンサについて、実施
例１と同様にしてセンサの応答特性を測定した。その結
果を図３に示す。図３より、電流値は、ヘマトクリット
値の増加にともなって減少した。この減少割合を表１に
示す。なお、ヘマトクリット値が０％のときの電流値を
１００とした。

【００２３】

【表１】

【００２４】《実施例３》本実施例においては、図１に
示す構造を採用し、グルコースオキシターゼ２００ユニ
ットの代わりにコレステロールオキシターゼ５００ユニ
ットを用いたほかは、実施例１と同様にしてコレステロ
ールセンサを作製し、その評価を行った。このコレステ
ロールセンサの血液試料として、コレステロール濃度が
３００ｍｇ／ｄｌ、赤血球容積比（ヘマトクリット値）
が０％（血漿）、２５％、３８％および５０％の血液を
調製し、実施例１と同様にセンサの応答特性を測定した
ところ、ヘマトクリット値に関わらず、電流値は一定で
あった。

【００２５】《実施例４》本実施例においては、図３に
示す構造を採用し、グルコースオキシターゼ２００ユニ
ットの代わりにコレステロールオキシターゼ５００ユニ
ットを用いたほかは、実施例２と同様にしてコレステロ
ールセンサを作製し、実施例３と同様にしてその評価を
行った。その結果、ヘマトクリット値に関わらず、電流
値は一定であった。

【００２６】《実施例５》本実施例においては、図３に
示す構造を採用し、グルコースオキシターゼ２００ユニ
ットの代わりに乳酸オキシターゼ５００ユニットを用い
たほかは、実施例２と同様にして乳酸センサを作製し、
その評価を行った。血液試料として、乳酸濃度が1０ｍ
ｇ／ｄｌ、赤血球容積比（ヘマトクリット値）が、０％
（血漿）、２５％、３８％、５０％の血液を調製した。
そして、実施例１と同様にして、センサの応答特性を測
定したところ、ヘマトクリット値に関わらず、電流値は
一定であった。

【００２７】

【発明の効果】以上のように、本発明によれば、血液試
料中の被検物質以外の成分、特に赤血球の影響を受け
ず、高精度の定量が可能なバイオセンサを提供すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のバイオセンサの一実施の形態の構造を
示す概略縦断面図である。

【図２】図１に示す本発明のバイオセンサの概略分解斜
視図である。

【図３】本発明のバイオセンサの別の一実施の形態の構
造を示す概略縦断面図である。

【図４】実施例１および比較例１におけるヘマトクリッ
ト値（％）と電流値（μＡ）の関係を示す図である。

【符号の説明】

１電気絶縁性基板２リード３リード４作用極５対極６電気絶縁層７親水性高分子層８反応層９赤血球吸着剤からなる層１０レシチン層１１スペーサー１２カバー１３試料供給路の開口部１４空気孔

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】電気絶縁性基板、前記基板上に形成され
た作用極および対極を含む電極、ならびに前記電極上に
配置された少なくとも酵素、電子受容体および赤血球吸
着剤を含有する反応層を具備するバイオセンサ。
【請求項２】電気絶縁性基板、前記基板上に形成され
た作用極および対極を含む電極、前記電極上に配置され
た少なくとも酵素および電子受容体を含有する反応層、
ならびに前記反応層に接触しない赤血球吸着剤を含有す
る層を具備するバイオセンサ。
【請求項３】赤血球吸着剤がデキストランである請求
項１または２記載のバイオセンサ。