KR101375038B1

KR101375038B1 - 신규 세균 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR101375038B1
Application number: KR1020137005437A
Authority: KR
Inventors: 비요른 다니엘 헤이스트라; 에프게니아 케른; 미카엘 쾨프케; 사이몬 세고비아; 풍민 리유
Original assignee: 란자테크 뉴질랜드 리미티드
Priority date: 2010-07-28
Filing date: 2011-07-28
Publication date: 2014-03-14
Anticipated expiration: 2031-07-28
Also published as: AU2011283282C1; JP2013532481A; EP2598630A1; CA2786903A1; CN103415612A; CA2786903C; JP5922657B2; ZA201300612B; AU2011283282B2; EP2598630B1; BR112013003644B1; EP2598630A4; EA025778B1; BR112013003644A2; US20160017276A1; KR20130097174A; US10494600B2; AU2011283282A1; WO2012015317A1; EA201390179A1

Abstract

본 발명은 대체로 가스의 미생물 발효 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 일산화탄소(CO)를 함유하는 기질의 혐기 발효에 의한 에탄올 생산 효능이 증대된 신규한 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) 세균에 관한 것이다.

Description

신규 세균 및 그의 제조방법{NOVEL BACTERIA AND METHODS OF USE THEREOF}

에탄올은 전세계적으로 수소가 풍부한 주요한 액체 운송 연료가 되고 있다. 전세계적으로 2005년 에탄올의 소비량은 122억 갤론에 달하였다. 유럽, 일본, 미국 및 기타 선진국에서의 에탄올에 대한 관심이 증가함에 따라, 에탄올 연료 산업의 전세계 시장은 장차 더 가파르게 성장할 것으로 예상되고 있다.

예를 들어, 미국에서는, 가솔린 중 에탄올 10% 혼합물인 E10을 제조하는데 에탄올이 사용되고 있다. E10 블렌드에서 에탄올 성분은 산소첨가제로서 작용하여 연소 효율을 증가시키고 공기오염 물질의 생산은 저감시킨다. 브라질에서는 에탄올이 운송 연료 수요의 약 30%를 감당하고 있으며, 여기서도 가솔린에 첨가되어 산소첨가제로서, 그리고 그 자체로 순수한 연료로서 사용되고 있다. 또한, 유럽에서는 온실가스(GHG: Green House Gas) 배출 결과를 둘러싼 환경문제에 대한 염려로 인해 유럽연합(EU)는 회원국으로 하여금 바이오매스 유래된 에탄올과 같은 지속적인 운송 연료의 소비를 의무화하고 있다.

연료 에탄올의 대부분은 사탕수수로부터 추출한 수크로스 또는 곡물로부터 추출한 전분과 같은 곡물 유래 탄수화물을 주요 탄소원으로 이용하는 전통적인 효모 기반 발효 공정을 통해 제조되고 있다. 그러나, 이러한 탄수화물 공급 원료의 가격은 인간용 식품 또는 동물 사료로서의 그 가치에 의해 영향을 받고, 에탄올 제조용 전분 또는 수크로스 함유 곡물의 재배가 모든 지역에서 경제적으로 실행가능한 것은 아니다. 따라서, 가격이 낮고 더욱 풍부한 탄소 자원을 연료 에탄올로 전환하는 기술을 개발하는 것이 중요하다.

CO는 석탄 또는 오일과 같은 유기 물질 및 오일 유래 제품의 불완전 연소의 주요하고도 공짜인, 에너지가 풍부한 부산물이다. 예컨대 호주의 철강 산업은 매년 500,000 톤 이상의 CO를 생성하여 대기중으로 방출하는 것으로 보고되고 있다.

촉매적 공정을 이용하여 CO 및/또는 CO 및 수소(H₂)로 주로 구성되는 가스를 연료 및 농약으로 전환할 수 있다. 또한, 미생물을 이용하여 상기 가스를 연료 및 농약으로 전환할 수 있다.

CO를 단독 탄소원으로 이용하여 성장하려는 미생물의 능력이 1903년에 최초로 발견되었다. 나중에 이는 독립영양 성장의 아세틸 조효소 A (아세틸 CoA) 생화학 경로(Woods-Ljungdahl 경로 및 일산화탄소 탈수소효소/아세틸 A 합성효소 (CODH/ACS) 경로라고도 함)을 이용하는 유기체의 특성인 것으로 확인되었다. 일산화탄소 영양, 광합성, 메탄생성 및 아세트산생성 유기체를 비롯한 다수의 혐기성 유기체들이 CO를 여러 가지 최종 생성물, 즉, CO₂, H₂, 메탄, n-부탄올, 아세테이트 및 에탄올로 대사하는 것으로 확인되어 왔다. CO를 단독 탄소원으로 이용하면서, 모든 이러한 유기체들은 상기 최종 생성물들 중 적어도 두 가지를 생성한다.

클로스트리듐(Clostridium) 속에서 유래한 것들과 같은 혐기성 세균은 아세틸 CoA 생화학 경로를 통해 CO, CO₂ 및 H₂로부터 에탄올을 생성하는 것으로 확인되어 왔다. 예를 들어, 가스로부터 에탄올을 생성하는 클로스트리듐 륭달리(Clostridium ljungdahlii)의 여러 가지 균주가 WO 00/68407호, EP 117309호, 미국 특허 제 5,173,429호, 5,593,886호 및 6,368,819호, WO 98/00558호 및 WO 02/08438호에 기재되어 있다. 또한, 세균인 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum sp )도 가스로부터 에탄올을 생성하는 것으로 알려져 있다(Abrini 외, Archives of Microbiology 161, pp 345-351 (1994)).

그러나, 가스의 미생물 발효를 통한 에탄올 제조는 언제나 아세테이트 및/또는 아세트산의 동시 제조와 관련이 있다. 이용 가능한 탄소 중 일부는 에탄올보다는 아세테이트/아세트산으로 전환되기 때문에, 이러한 발효 공정을 이용한 에탄올의 제조의 효율은 원하는 수준보다 낮을 수 있다. 또한, 상기 아세테이트/아세트산 부산물이 일부 다른 목적에 사용될 수 없다면, 폐기물 처리 문제를 야기할 수 있다. 아세테이트/아세트산은 미생물을 통해 메탄으로 전환되기 때문에, GHG 방출에 기여할 가능성이 있다.

H2 존재 하에서 CO를 미생물 발효시키면 탄소로부터 알코올로의 실질적으로 완전한 전환이 일어날 수 있다. 그러나, H2가 충분하게 존재하지 않으면, 아래 화학식에 나타낸 바와 같이, CO의 일부가 알코올로 전환되는 반면, 상당 부분은 CO2로 전환된다.

6CO + 3H₂O → C₂H₅OH + 4CO₂

12H₂ + 4CO₂ → 2C₂H₅OH + 6H₂O

CO₂가 생산되었다는 것은 전반적인 산소 포집이 비효율적임을 의미하며 이것은 배출될 경우 온실가스 배출이라는 잠재적인 문제를 야기하게 된다.

WO2007/117157은 일산화탄소를 함유하는 가스를 혐기 발효시킴으로써, 알코올, 특히 에탄올을 생산하는 방법을 설명하고 있다. 발효 과정의 부산물로서 생산된 아세테이트는 수소 가스와 이산화탄소 가스로 전환되며 이들 중 어느 하나 또는 두가지 모두는 혐기 발효 공정에 사용될 수 있다.

WO2008/115080에는 다단계 발효 공정을 이용해서 알코올(들)을 생산하는 방법이 설명되어 있다. 제1 바이오리액터에서 혐기 발효의 결과로서 생산된 부산물은 제2 바이오리액터에서 생성물을 생산하는데 이용될 수 있다. 뿐만 아니라, 제2 발효 단계의 부산물을 제1 바이오리액터로 리사이클링시켜 생성물을 얻을 수도 있다.

WO2009/064200에는 일산화탄소를 함유하는 기질의 혐기 발효에 의한 에탄올 생산시 효율이 개선된 새로운 부류의 세균이 설명되어 있다.

일산화탄소를 함유하는 가스를 증가된 효율로 에탄올로 발효시킬 수 있는 미생물, 즉, 일산화탄소의 흡수 효율이 증가되고, 에탄올을 더 많이 생산할 수 있으며, 및/또는 종래기술의 미생물보다 동일한 기질로부터 얻어지는 에탄올 대 아세테이트의 비율이 더 높은 새로운 미생물을 제공할 수 있으면 매우 유익할 것이다.

본 발명의 한가지 목적은 전술한 종래기술의 한가지 이상의 제약 사항이 극복된 새로운 부류의 세균을 제공하거나 적어도 공중에게 유용한 선택을 제공함에 있다.

발명의 개요

첫번째 측면에서 본 발명은 CO를 함유하는 기질을 혐기 발효시킴으로써 에탄올 및 임의로 아세테이트를 함유하는 생성물을, 적어도 약 2g 에탄올/발효 브로쓰 1L/바이오매스 1그램/1일의 비생산성(specific productivity)로 생산할 수 있는 세균의 생물학적으로 순수한 단리물을 제공하는 것이다.

또 다른 구체예에서, 세균은 에탄올을 적어도 약 3g 에탄올/발효 브로쓰 1L/바이오매스 1그램/1일, 적어도 약 4g 에탄올/발효 브로쓰 1L/바이오매스 1그램/1일, 적어도 약 5g 에탄올/발효 브로쓰 1L/바이오매스 1그램/1일, 적어도 약 6g 에탄올/발효 브로쓰 1L/바이오매스 1그램/1일 또는 적어도 약 7g 에탄올/발효 브로쓰 1L/바이오매스 1그램/1일의 비생산성으로 생산할 수 있는 것이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 CO를 함유하는 기질의 혐기 발효에 의해, 에탄올과 임의로 아세ㅔㅌ이트를 포함하는 생성물을 적어도 약 10g 에탄올/발효 브로쓰 1L/1일의 생산성으로 생산할 수 있는 세균의 생물학적으로 순수한 단리물을 제공한다.

또 다른 구체예에서, 이 세균은 에탄올을 적어도 약 20g 에탄올/발효 브로쓰 1L/1일, 적어도 약 30g 에탄올/발효 브로쓰 1L/1일, 적어도 약 40g 에탄올/발효 브로쓰 1L/1일 또는 적어도 약 50g 에탄올/발효 브로쓰 1L/1일, 또는 적어도 약 60g 에탄올/발효 브로쓰 1L/1일, 또는 적어도 약 70g 에탄올/발효 브로쓰 1L/1일의 생산성으로 생산할 수 있는 것이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 CO를 함유하는 기질의 혐기 발효에 의해 에탄올 및 임의로 아세테이트를 포함하는 생성물을 생산할 수 있는 세균의 생물학적으로 순수한 단리물을 제공하며, 여기서 상기 세균은 CO의 비흡수율(specific uptake)이 적어도 약 1.0 mMol CO/1분/바이오매스 1g인 것이다.

한가지 구체예에서 세균은 CO의 비흡수율이 적어도 약 1.2mMol CO/1분/바이오매스 1g, 적어도 약 1.4 mMol CO/1분/바이오매스 1g, 적어도 약 1.6 mMol CO/1분/바이오매스 1g, 적어도 약 1.8 mMol CO/1분/바이오매스 1g, 또는 적어도 약 2.0 mMol CO/1분/바이오매스 1g일 수 있는 것이다. 특정한 한가지 구체예에서, 세균은 CO의 비흡수율이 적어도 약 1.2mMol CO/1분/바이오매스 1g일 수 있다.

또 다른 측면에서 본 발명은 CO를 포함하는 기질의 혐기 발효에 의해, 에탄올 및 임의로 아세테이트를 포함하는 생성물을 생산할 수 있는, 세균의 생물학적으로 순수한 단리물을 제공하는데, 여기서 상기 세균은 비성장률(specific growth rate)가 적어도 약 0.8일^-1인 것이다.

특정 구체예에서, 세균은 비성장률이 적어도 약 1.0일^-1, 적어도 약 1.2일^-1, 적어도 약 1.4일^-1, 적어도 약 1.6일^-1, 적어도 약 1.8일^-1 또는 적어도 약 2.0일^-1일 수 있다.

또 다른 측면에서 본 발명은 세균의 생물학적으로 순수한 단리물을 제공하는데, 여기서 상기 세균은 CO를 포함하는 기질의 혐기 발효에 의해, 에탄올 및 임의로 아세테이트를 포함하는 생성물을 생산할 수 있는 것이고, 여기서 상기 세균은 에탄올 대 아세테이트의 비율이 적어도 약 2:1이 되도록 에탄올을 생산할 수 있는 것이다.

특정 구체예에서 세균은 에탄올 대 아세테이트의 비율이 적어도 약 3:1, 적어도 약 4:1, 적어도 약 5:1, 적어도 약 7:1 또는 적어도 약 10:1이 되는 비율로 에탄올을 생산할 수 있다.

한가지 구체예에서, 세균은 실질적으로 아세테이트 없이 에탄올을 생산할 수 있다.

또 다른 측면에서 본 발명은 세균의 생물학적으로 순수한 단리물을 제공하는데 여기서 상기 세균은 CO를 포함하는 기질의 혐기 발효에 의해, 에탄올 및 임의로 아세테이트를 포함하는 생성물을 생산할 수 있는 것이고, 여기서 상기 세균은 알코올을 최대 약 30g/발효 브로쓰 1L 까지 관용(tolerating)할 수 있는 것이다.

특정 구체예에서, 세균은 알코올을 최대 약 40g/발효 브로쓰 1L, 최대 약 50g/발효 브로쓰 1L, 최대 약 60g/발효 브로쓰 1L, 또는 약 70 g/발효 브로쓰까지 관용할 수 있다.

또 다른 측면에서 본 발명은 세균의 생물학적으로 순수한 단리물을 제공하는데 여기서 상기 세균은 CO를 포함하는 기질의 혐기 발효에 의해, 에탄올 및 임의로 아세테이트를 포함하는 생성물을 생산할 수 있으며, 여기서 상기 세균은 다음 중 2 이상의 특징을 갖는 것이다:

- CO를 포함하는 기질의 혐기 발효에 의해,에탄올 및 임의로 아세테이트를 포함하는 생성물을 적어도 약 2g의 에탄올/발효 브로쓰 1L/바이오매스 1그램/1일의 비생산성으로 생산할 수 있음;

- 에탄올을 적어도 약 10g 에탄올/발효 브로쓰 1L/일의 농도로 생산할 수 있음;

- CO의 비흡수율이 적어도 약 1.0mMol CO/1분/바이오매스 1g일 수 있음;

- 성장률이 적어도 약 1.0 g/일일 수 있음;

- 에탄올을 에탄올 대 아세테이트의 비율이 적어도 약 2:1이 되는 비율로 생산할 수 있음; 및,

- 알코올을 최대 약 30g/브로쓰 1L까지 관용할 수 있음.

한 가지 구체예에서, 본 발명의 세균은 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum)으로부터 유래한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세균은 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) 균주이다.

특정 구체예에서 세균은 DSMZ에 수탁번호 DMS23693으로 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum)의 정의된 특징들을 갖는다. 한 가지 구체예에서 본 발명의 세균은 DSMZ에 수탁번호 DMS23693으로 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum)이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 DSMZ에 수탁번호 DMS23693으로 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) 균주의 생물학적으로 순수한 단리물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 전술한 바와 같은 세균을 이용하여 CO를 포함하는 기질을 발효시키는 것을 포함하여 이루어지는, 1종 이상의 알코올의 생산 방법을 제공한다.

일 구체예에서 본 발명의 방법은:

(a) 본 발명의 세균의 배양체를 함유하는 바이오리액터에 CO를 포함하는 기질을 제공하는 단계; 및

(b) 바이오리액터에서 배양체를 혐기 발효시켜 1종 이상의 알코올을 생산하는 단계

를 포함하여 이루어진다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 산업 공정으로부터 나오는 총 대기 탄소 배출량을 저감시키는 방법을 제공하며, 이 방법은:

(a) 산업 공정의 결과로서 생성되는 CO-함유 가스를 이 가스가 대기중으로 배출되기 전에 포집하는 단계;

(b) 본 발명의 1종 이상의 세균을 함유하는 배양체에 의해 1종 이상의 알코올을 생산하기 위해 CO-함유 가스를 혐기 발효시키는 단계

를 포함하여 이루어진다.

본 발명의 일 구체예 측면에서, 발효는 약 34℃ 내지 약 37℃의 온도에서 수행된다. 바람직한 일 구체예에서, 발효는 약 34℃에서 수행된다.

본 발명의 방법의 특정 구체예에서는 아세테이트가 발효 부산물로서 생성된다. 좋기로는 생산된 1종 이상의 알코올에 에탄올이 포함되는 것이 좋다.

본 발명의 방법의 특정 구체예에서, 세균은 수성 배양 배지에서 유지된다.

본 발명의 방법의 특정 구체예에서, 기질의 발효는 바이오리액터에서 일어난다.

특정 구체예에서, 기질은 적어도 약 25 부피% CO, 적어도 약 30 부피% CO, 적어도 약 40 부피% CO, 적어도 약 50 부피% CO, 적어도 약 65 부피% CO 또는 적어도 약 70 부피% CO를 포함한다. 특정 구체예에서 기질은 적어도 약 75 부피% CO, 적어도 약 80 부피% CO, 적어도 약 85 부피% CO, 적어도 약 90 부피% CO 또는 적어도 약 95 부피% CO를 포함한다.

일 구체예에서 기질은 약 30 부피% 이하의 H₂를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 기질은 약 20 부피% 이하의 H₂, 또는 약 15 부피% 이하의 H₂, 또는 약 10 부피% 이하의 H₂, 또는 약 5 부피% 이하의 H₂, 또는 약 4 부피% 이하의 H₂, 또는 약 3 부피% 이하의 H₂, 또는 약 2 부피% 이하의 H₂, 또는 약 1 부피% 이하의 H₂를 함유하거나 또는 H₂를 실질적으로 아예 함유하지 않을 수도 있다.

한 가지 구체예에서 기질은 약 20 부피% 이하의 CO₂를 함유한다. 특정 구체예에서 기질은 약 15% CO₂ 부피% 이하의 CO₂, 또는 약 10% CO₂ 부피% 이하의 CO₂, 또는 약 5% CO₂ 부피% 이하의 CO₂를 함유하거나 실질적으로 CO₂를 아예 함유하지 않을 수도 있다.

특정 구체예에서 CO를 포함하는 기질은 CO를 함유하는 가스상 기질이다.

특정 구체예에서, 가스상 기질은 산업 공정에서 부산물로서 얻은 가스를 포함한다.

특정 구체예에서, 산업 공정은 철금속 제조 공정, 비철금속 제조 공정, 석유정제 공정, 바이오매스의 가스화 공정, 석탄의 가스화 공정, 전기전력 발전 공정, 카본 블랙 생산 공정, 암모니아 생산 공정, 메탄올 생산 공정 및 코크스 제조 공정으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 가스상 기질은 스틸 밀 (steel mill)로부터 얻어지는 가스를 포함할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 가스상 기질은 자동차 배기가스를 포함할 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에서, 알코올은 세균 세포 및 알코올을 포함하는 수성 배양 배지인 발효 브로쓰로부터 회수된다.

특정 구체예에서, 아세테이트는 발효 부산물로서 생산된다.

특정 구체예에서, 알코올과 아세테이트는 브로써로부터 회수된다.

비록 본 발명을 상기와 같이 개괄적으로 정의하였으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며 후술되는 구체예들도 본 발명에 포함된다.

발명의 상세한 설명

본 발명자들은 신규한 세균을 개발하였다. 이 세균은 예기치 못한 몇가지 특성들 중 하나 이상을 가지며 (이하에 개괄한다) 바람직한 일 구체예에서는 이러한 특성을 모두 갖는다. 이들 신규한 세균을 혐기 발효 공정에 사용함으로써 기존 균주에 비해 예기치 못한 장점을 거둘 수 있으며 따라서 에탄올 및/또는 아세테이트와 같은 생성물을 생산하기 위한 발효 공정의 전체적인 효능을 증가시킬 수 있다.

따라서, 광범위한 용어로 한가지 측면에서 본 발명은 혐기 발효 공정에서 개선된 효능을 갖는 신규한 세균 및 세균의 생물학적으로 순수한 단리물(isolate)에 관한 것이다. 한가지 측면에서, 세균은 CO를 포함하는 기질로부터 알코올, 좋기로는 에탄올을 생산할 수 있는 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 세균에 의해, CO-함유 기질을 혐기 발효시킴으로써, 알코올, 좋기로는 에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 다음의 용어들은 본 발명에서 다음과 같이 정의된다:

"CO를 함유하는 기질", "CO를 포함하는 기질" 등의 용어는 예컨대 세균이 성장 및/또는 발효하는데 필요한 일산화탄소가 들어있는 기질을 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 특정 구체예에서 "CO를 함유하는 기질"은 가스상이다. 이러한 기질은 본 발명에서 "CO를 함유하는 가스상 기질", "CO를 포함하는 가스상 기질" 등으로 표현한다.

후술하는 내용에서, 본 발명의 구체예들은 "CO를 함유하는 가스상 기질"을 전달 및 발효하는 등의 용어로 설명되었다. 그러나, 가스상 기질은 다른 형태로 제공될 수 있음도 이해하여야 한다. 예컨대, CO를 함유하는 가스상 기질은 액체에 용해되어 제공될 수 있다. 기본적으로, 액체는 일산화탄소를 함유하는 가스로 포화되니 다음 그 기체를 바이오리액터에 첨가하게 된다. 이것은 표준 방법론을 이용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 미세기포 분산 발생기(Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3 / October , 2002)를 이용할 수 있다. 또 다른 예로서, CO를 함유하는 가스상 기질은 고체 지지체 상에 흡착될 수 있다. 이러한 또 다른 방법은 "CO를 함유하는 기질"이라는 용어로 포괄된다.

"효율/효능을 증가시키다", "효율/효능이 증가된" 등의 표현은 발효 공정과 관련하여 사용될 경우, 비제한적인 예로서 다음 중 1 이상을 증가시킨 것을 의미한다: 발효를 촉매하는 미생물의 성장 속도, 미생물에 의한 CO의 흡수 또는 소비량, 소비된 기질(예컨대 CO)의 단위 부피 당 생산된 목적하는 생성물의 부피, 배양 배지 중에 생산된 목적하는 생성물 (예컨대 알코올)의 농도, 목적하는 생성물의 생산 속도 또는 생산 수준, 발효의 다른 부산물에 대한, 생산된 목적 생성물의 상대적 비율.

"아세테이트"라는 용어에는 예컨대 본 발명에 설명된 발효 브로쓰에 존재하는 아세테이트 염과 유리 아세트산과의 혼합물과 같은 분자상 또는 유리된 아세트산 및 아세테이트 염과의 혼합물과, 아세테이트 염 단독의 양쪽 모두가 포함된다. 발효 브로쓰 중의 분자상 아세트산 대 아세테이트의 비율은 계의 pH에 따라 달라진다.

"바이오리액터"라는 용어는 연속 교반식 탱크 리액터 (CSTR:Continuous Stirred Tank Reactor), 고정형 셀 리액터 (ICR: Immobilized Cell Reactor), 살수층 리액터 (TBR: Trickle Bed Reactor), 유동상 생물막 리액터 (moving bed biofilm reactor), 기포 컬럼, 가스 리프트 발효조, 막 리액터, 예컨대 중공 섬유막 바이오리액터 (HFMBR: Hollow Fibre Membrane Bioreactor), 정전식 믹서, 또는 가스-액체 접촉에 적합한 기타의 용기나 장치를 비롯한, 1 이상의 용기 및/또는 탑 또는 파이프 배관으로 이루어진 발효 장치를 포함한다.

본 발명에서 "알코올 관용성(alcohol tolerance)"이라는 용어는 세균 또는 세균 집단이 생존, 성장 및/또는 목적 생성물을 적어도 어느 수준으로 생산하는 동안 관용할 수 있는 알코올, 좋기로는 에탄올의 수준을 가리킨다.

본 발명의 세균 또는 그의 배양체 또는 단리물은 "단리되거나(isolated)" 또는 "생물학적으로 순수한" 형태로 설명될 수 있다. 이 용어들은 만일 자연 등에서발견되었을 경우 이 세균들과 한데 회합되어 있었을 수 있는, 세포성 또는 다른 1종 이상의 성분들이나 주변환경으로부터 세균이 분리되었음을 의미하는 것이다. "분리된" 또는 "생물학적으로 순수한"이라는 용어는 그 세균이 정제된 정도를 나타내는 것으로 이해되어서는 아니된다. 그러나, 일 구체예에서 세균의 단리물 또는 배양체는 본 발명의 세균을 주로 함유한다.

본 발명은 CO를 함유하는 기질의 혐기 발효에 의해 에탄올 및 임의로 아세테이트를 포함하는 생성물을 생산할 수 있는 세균의 생물학적으로 순수한 단리물을 제공하며 여기서 상기 세균은 다음 중 1 이상이 가능하다:

- 약 2g 에탄올/발효 브로쓰 1L/바이오매스 1그램/1일의 비생산성(specific productivity)로 에탄올을 생산함;

- 적어도 약 10g /발효 브로쓰 1L/일의 생산성으로 에탄올을 생산함;

- CO의 비흡수율(specific uptake)이 적어도 약 1.0mMol CO/1분/바이오매스 1g임;

- 비성장률(specific growth rate)이 적어도 약 0.8일^-1임;

- 에탄올 대 아세테이트의 비율이 적어도 약 2:1가 되는 비율로 에탄올을 생산함; 및

- 알코올 관용성이 최대 약 30g/브로쓰 1L임.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 세균은 전술한 특성 중 2개, 3개, 4개 또는 5개가 가능하다.

특정 구체예에서, 세균은 적어도 약 3g 에탄올/발효 브로쓰 1L/바이오매스 1그램/1일, 적어도 약 4g 에탄올/발효 브로쓰 1L/바이오매스 1그램/1일, 적어도 약 5g 에탄올/발효 브로쓰 1L/바이오매스 1그램/1일, 적어도 약 6g 에탄올/발효 브로쓰 1L/바이오매스 1그램/1일 또는 적어도 약 7g 에탄올/발효 브로쓰 1L/바이오매스 1그램/1일의 비생산성으로 에탄올을 생산할 수 있다.

특정 구체예에서, 세균은 적어도 약 20g 에탄올/발효 브로쓰 1L/일, 적어도 약 30g 에탄올/발효 브로쓰 1L/일, 적어도 약 40g 에탄올/발효 브로쓰 1L/일 또는 적어도 약 50g 에탄올/발효 브로쓰 1L/일의 생산성으로 에탄올을 생산할 수 있다. 최대값은 화학양론,CO 흡수량 및 에탄올 스트리핑을 고려한 값이다.

특정 구체예에서, 세균은 CO의 비흡수율이 적어도 약 1.2mMol CO/1분/바이오매스 1g, 적어도 약 1.4 mMol CO/1분/바이오매스 1g, 적어도 약 1.6 mMol CO/1분/바이오매스 1g, 적어도 약 1.8 mMol CO/1분/바이오매스 1g, 또는 적어도 약 2.0 mMol CO/1분/바이오매스 1g일 수 있다. 특정 구체예에서, 세균은 CO의 비흡수율이 적어도 약 1.2mMol CO/1분/바이오매스 1g일 수 있다.

특정 구체예에서 세균은 비성장률이 적어도 약 1.0일^-1, 적어도 약 1.2일^-1, 적어도 약 1.4일^-1, 적어도 약 1.6일^-1, 적어도 약 1.8일^-1 또는 적어도 약 2.0일^-1일 수 있다.

특정 구체예에서 세균은 에탄올 대 아세테이트의 비율이 적어도 약 3:1, 적어도 약 4:1, 적어도 약 5:1, 적어도 약 7:1 또는 적어도 약 10:1인 비율로 에탄올을 생산할 수 있다. 어떤 구체예에서 발효 중 아세테이트의 순 생산(net production)이 일어나지 않을 수도 있다.

특정 구체예에서 세균은 최대 약 40g/발효 브로쓰 1L, 최대 약 50g/발효 브로쓰 1L, 또는 최대 약 60g/발효 브로쓰 1L로 알코올을 관용할 수 있다. 한가지 특정 구체예에서, 세균은 알코올을 최대 약 70g/발효 브로쓰 1L까지 관용할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 세균은 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum)으로부터 유래된다. 본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서 세균은 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) 균주DSM19630 (DSMZ, 독일) (WO2009/064200에 개시되어 있음)은 유래된다.

바람직한 구체에에서, 본 발명의 세균은 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum)이다.

클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum)은 예컨대 문헌 [Albrin et al; Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide, Arch Microbiol (1994) 161:345-351]에 설명되어 있다.

본 발명의 특정 구체예에서, 세균은 2010년 6월 7일 부다페스트 협약에 따라 독일 DSMZ에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) 균주의 정의된 특징들을 갖는다. 특정 구체예에서, 세균은 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) 균주 DSM23693이다.

본 발명은 또한 본 발명의 세균으로부터 유래된 세균에 관한 것이기도 하다.

본 발명의 특정 구체예의 세균은 증가된 알코올 생산 속도, 증가된 성장속도, 증가된 CO 소비량 또는 흡수율, 보다 높은 알코올 대 산 생산 비율 및/또는 알코올에 대한 증가된 관용성으르 갖는다. 이에 따라 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum)을 비롯한 클로스트리디아(Clostridia) 종의 다른 균주보다 이롭다. 따라서, 본 발명의 균주를 사용함으로써 아세테이트 및/또는 에탄올과 같은 생성물의 생산을 위한 발효 공정의 전반적인 효율을 증가시킬 수 있다.

특정 구체예에서 본 발명의 세균은 가스상 기질 중 CO의 상승된 수준으로 전술한 생산성, 성장속도, 알코올 대 산의 비율, CO 소비량 및 알코올 관용성과 관련한 개선을 이룰 수 있다. 예컨대 가스상 기질은 적어도 약 80 부피% CO, 또는 적어도 약 85 부피% CO, 또는 적어도 약 90 부피% CO 또는 적어도 약 95 부피% CO를 함유할 수 있다.

마찬가지로, 전술한 생산성, 성장속도, 알코올 대 산의 비율, CO 소비량 및 알코올 관용성과 관련한 개선이 가스상 기질 중 H₂ 수준이 낮거나 부재하는 수준에서의 특정 구체예에서 달성될 수 있다. 가스상 기질은 약 30 부피% 이하로 H₂를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서 가스상 기질은 H₂를 약 20 부피% 이하, 약 15 부피% 이하, 약 10 부피% 이하, 약 5 부피% 이하,약 4 부피% 이하, 약 3 부피% 이하, 약 2 부피% 이하, 약 1 부피% 이하로 함유하거나 실제로 아예 H₂를 함유하지 않는다.

특정 구체예에서, 본 발명의 세균은 비교적 적은 양의 CO₂를 포함하는 가스상 기질이 공급된 경우 전술한 생산성, 성장속도, 알코올 대 산의 비율, CO 소비량 및 알코올 관용성과 관련한 개선을 달성할 수 있다. 일 구체예에서 가스상 기질은 약 20 부피% 이하로 CO₂를 포함한다. 특정 구체예에서, 가스상 기질은 CO₂를 약 15 부피% 이하, 또는 약 10 부피% 이하, 또는 약 5 부피% 이하로 함유한다. 특정 구체예에서 가스상 기질은 실제로 CO₂를 전혀 함유하지 않는다.

특정 구체예에서 본 발명의 세균 배양체는 수성 배양 배지에서 유지된다. 좋기로는 수성 배양 배지는 혐기성 미생물 성장을 위한 최소 배지이다. 적절한 배지는 종래기술에 잘 알려져 있고 예컨대 미국 특허 5,173,429 및 5,593,886, 그리고 WO 02/08438, 및 Klasson et al [(1992). Bioconversion of Synthesis Gas into Liquid 또는 Gaseous Fuels. Enz. Microb. Technol. 14:602-608.], Najafpour and Younesi [(2006). Ethanol and acetate synthesis from waste gas using batch culture of Clostridium ljungdahlii. Enzyme and Microbial Technology, Volume 38, Issues 1-2, p. 223-228] and Lewis et al [(2002). Making the connection-conversion of biomass-generated producer gas to ethanol. Abst. Bioenergy, p. 2091-2094] 등의 문헌에 설명되어 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 혐기성 미생물 성장을 위한 최소 배지는 실시예 섹션 다음에 설명된 바와 같다.

본 발명은 또한 CO를 포함하는 가스상 기질로부터 1종 이상의 알코올을 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 1종 이상의 세균 단리물의 배양체를 기질의 존재 하에 유지시키고 1종 이상의 세균 단리물에 의해 기질을 혐기 발효시켜 1종 이상의 알코올을 얻는 것을 포함하여 이루어진다.

본 발명은 또한 산업 공정으로부터의 총 대기 탄소 배출량을 저감시키는 방법도 제공하며, 이 방법은:

(a) 산업 공정의 결과로 생성된 CO-함유 가스를 이 가스가 대기 중으로 배출되기 전에 포집하는 단계;

(b) 본 발명의 1종 이상의 세균 단리물을 함유하는 배양체를 이용하여 CO-함유 가스를 1종 이상의 알코올을 생산하도록 혐기 발효시키는 단계

를 포함하여 이루어진다.

본 발명의 특정 구체에에서, 아세테이트는 발효 부산물로서 생산된다. 생산된 알코올은 에탄올이다.

특정 구체예에서, 배양체는 액상 영양 배지에서 유지된다.

발효는 예컨대 연속 교반식 탱크 리액터 (CSTR:Continuous Stirred Tank Reactor), 기포 컬럼 리액터 (BCR: bubble column reactor) 또는 살수층 리액터 (TBR: Trickle Bed Reactor)와 같은 적절한 바이오리액터에서 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 몇몇 바람직한 구체예에서, 바이오리액터는 미생물이 배양되는 제1 리액터, 즉 성장 리액터 및 성장 리액터로부터의 발효 브로쓰가 주입되고 대부분의 발효 생성물(에탄올 및 아세테이트)이 생산되는 제2 리액터, 즉 발효 리액터를 포함할 수 있다.

전술한 바와 같이, 발효 반응을 위한 탄소 공급원은 CO를 함유하는 가스상 기질이다. 가스상 기질은 산업 공정의 부산물로서 수득되는 CO-함유 폐가스(waste gas), 또는 자동차 배기가스와 같은 다른 공급원으로부터 얻은 것일 수 있다. 특정 구체예에서, 산업 공정은 스틸 밀과 같은 철금속 제품 제조업, 비철금속 제품 제조업, 석유 정제공정, 석탄의 가스화, 전기전력 생산, 카본 블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산 및 코크스 제조업일 수 있다. 이들 구체예에서, CO-함유 가스는 대기중으로 배출되기에 앞서서 통상적인 방법에 의해 미리 포집될 수 있다. 가스상 CO-함유 기질의 조성에 따라, 이것이 발효 공정에 도입되기 전에 분진 입자와 같은 바람직하지 못한 불순물들을 제거하도록 미리 처리하는 것이 바람직할 수도 있다. 예컨대, 가스상 기질은 공지 방법을 이용하여 여과 또는 스크럽 처리될 수 있다.

이에 더해, 기질 스트림의 CO 농도 (또는 가스상 기질 중의 CO 분압)을 증가시켜 CO가 기질인 발효 반응의 효능을 증가시키는 것이 종종 요망된다. 가스상 기질 중의 CO 분압 증가는 발효 배지로의 CO 매스의 전달을 증가시킨다. 발효 반응에 주입되는데 사용되는 가스 스트림의 조성은 그 반응의 효율 및/또는 단가에 큰 영향을 미칠 수 있다. 예컨대, O2는 혐기 발효 공정의 효율을 저하시킬 수 있다. 발효전 또는 발효 후발효 공정 단계들에서 불필요하거나 원치 않는 가스를 처리하는 것은 그러한 단계들의 부담을 증가시킬 수 있다 (예컨대 가스 스트림이 바이오리액터 내로 유입되기 전에 압축될 경우, 발효에는 필요하지 않ㅇ든 불필요한 에너지가 가스를 압축하는데 이용될 수 있음). 따라서, 원치않는 성분들을 제거하고 목적하는 성분들의 농도를 증가시키기 위해 기질 스트림, 특히 산업 공급원으로부터 유래하는 기질 스트림을 처리하는 것이 요망될 수 있다.

산업 공급원으로부터 유래된 기질 스트림은 일반적으로 그 조성이 다양할 수 있다. 뿐만 아니라, CO 농도가 높은 (예컨대 적어도 40% CO, 적어도 50% CO 또는 적어도 65% CO) 산업 공급원으로부터 유래된 기질 스트림은 종종 H2 성분량이 낮다 (예컨대 20% 이하 또는 10% 이하 또는 실제로 0%). 따라서, 미생물이 어떤 범위의 CO 및 H2 농도, 특히 높은 CO 농도와 낮은 H2 농도를 갖는 기질을 혐기 발효시킴으로써 생성물을 생산할 수 있는 것이 특히 요망된다. 본 발명의 세균은 놀랍게도 CO를 함유(H2는 함유하지 않음)하는 기질을 발효시키는 한편 높은 성장 속도와 에탄올 생산량을 나타낸다.

기질 스트림 중에 수소가 존재하면 전체적인 탄소 포집 및/또는 에탄올 생산성의 효율을 증가시킬 수 있다. 예컨대, WO02/08438은 다양한 조성의 가스 스트림을 이용하여 에탄올을 생산하는 것에 관하여 설명하고 있다. WO02/08438은 미생물의 성장과 에탄올 생산을 촉진하기 위해 63% H2, 32% CO 및 5% CH4를 포함하는 기질 스트림을 C. ljungdahlii 배양체에 제공하는 것에 관하여 보고하고 있다. 배양체가 정상상태에 도달하고 미생물 성장이 더 이상 주목적이 아니게 되면, CO를 약간 과량으로 제공하고 에탄올 생산을 촉진하기 위해 기질 스트림을 15.8% H2, 36.5% CO, 38.4% N2 및 9.3% CO2로 스위치시켰다. 이 문헌은 또한 CO 및 H2 농도가 이보다 낮거나 높은 가스 스트림도 기재하고 있다.

산업 공정의 결과로 생성된 CO-함유 가스를 포집하여 이를 본 발명에 설명된 발효 공정의 기질로 사용함으로써 산업 공정으로부터의 총 대기 탄소 배출량을 저감시키는데, 본 발명의 공정을 사용할 수 있다.

별법으로, 본 발명의 다른 구체예에서 CO-함유 가스상 기질은 바이오매스의 가스화로부터 얻을 수도 있다. 가스화 공정은 공기 또는 산소 공급이 제한된 상태로 바이오매스를 부분 연소시키는 것을 포함한다. 얻어지는 가스는 대체로 대량의 CO 및 H₂와 소량의 CO₂, 메탄, 에틸렌 및 에탄으로 이루어진다. 예컨대, 사탕수수로부터 설탕, 옥수수나 곡물로부터 전분과 같은 식품을 추출 및 가공하는 동안 수득된 바이오매스 부산물, 또는 임업 분야에서 발생하는 비식품 바이오매스를 가스화시켜, 본 발명에서 사용하는데 적합한 CO-함유 가스를 생산할 수 있다.

CO-함유 가스상 기질은 CO를 대부분 함유하는 것이 바람직하다. 특정 구체예에서, 가스상 기질은 부피 기준으로 CO를 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70% 내지 약 95 부피%의 양으로 함유한다. 가스상 기질은 수소를 함유할 필요가 없다. 가스상 기질은 또한 임의로 약간의 CO₂, 예컨대 부피 기준으로 약 1% 내지 약 30%, 예컨대 약 5% 약 10%의 CO₂를 함유한다.

CO-함유 기질 가스에 더해서, 세균의 성장 및 CO로부터 에탄올로의 발효가 일어나도록 하기 위해, 바이오리액터에 주입될 적절한 액체 영양 배지가 필요하다. 영양 배지는 사용된 미생물이 성장하는데 충분한 비타민과 미네랄을 함유한다. 유일한 탄소 공급원으로서 CO를 이용하는 에탄올 발효에 적합한 혐기성 배지는 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예컨대 US 특허 5,173,429 및 5,593,886 그리고 WO 02/08438, 그 밖에 기타 본 발명에 인용된 문헌에 적합한 배지에 관한 설명을 찾아볼 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서 배지는 실시예 섹션 이후에 설명되어 있다.

발효는 CO로부터 에탄올로의 발효(CO-to-ethanol fermentation)가 일어나는데 적절한 조건 하에서 수행되는 것이 바람직하다. 고려되어야 할 반응 조건으로는 압력, 온도, 가스 유속, 액체 유속, 배지의 pH, 배지의 레독스 전위, 교반 속도 (연속식 교반 탱크 리액터를 사용하는 경우), 접종 농도, 액상 CO가 제한 요소로 되지 않도록 하는 최대 가스 기질 농도, 및 생산 억제를 회피하는 생성물의 최대 농도 등을 들 수 있다.

최적 반응 조건은 부분적으로는 본 발명에서 사용되는 특정 미생물에 달려 있다. 그러나, 일반적으로, 발효는 주변 압력보다 높은 압력에서 수행되는 것이 좋다. 높은 압력에서 시행하면 가스상의 CO로부터, 미생물이 에탄올을 생성하기 위하여 탄소원으로 흡수할 수 있게 되는 액체상으로의 CO 전환률이 유의적으로 증가하게 된다. 이것은 결국 바이오리액터가 대기압보다는 높은 압력에서 유지되는 경우에 체류 시간 (바이오리액터 내의 액체 부피를 가스 유량으로 나눈 것으로 정의)이 감소한다는 것을 의미한다.

또한, 주어진 CO로부터 에탄올로의 주어진 전환률은 부분적으로는 기질 체류 시간의 함수이고, 원하는 체류 시간의 달성은 곧 바이오리액터의 요구되는 용량을 가리키는 것이므로, 가압 장치의 사용은 요구되는 바이오리액터의 체적을 크게 감소시켜, 그 결과, 발효 장비에 드는 자본 비용을 크게 감소시킬 수 있다. US 5,593,886호에 제시된 실시예에 따르면, 리액터 작업 압력 증가에 따라 리액터의 체적을 줄일 수 있다. 즉, 10 기압에서 작동하는 바이오리액터는 1 기압에서 작동하는 바이오리액터 체적의 단지 1/10만을 필요로 한다.

고압 하에서 가스를 에탄올로 발효시키는 공정의 장점은 다른 문헌에도 설명되어 있다. 예를 들어, WO 02/08438호는 30 psig와 75 psig의 압력 하에서 수행된 가스로부터 에탄올로의 발효는, 에탄올 생산량이 각각 150 g/l/1일 및 369 g/l/1일이었다고 설명하고 있다. 그러나, 대기압에서 유사한 배지와 주입 가스 조성물을 사용하여 발효시킨 실시예에서는 1일 1리터당 에탄올 생산량이 10분의 일 내지 20분의 일 정도로 감소한 것으로 나타났다.

CO를 함유하는 가스상 기질의 도입 속도는 액상 CO의 농도가 제한적이 되지 않게 할 정도인 것이 바람직하다. 이는 CO-제한 조건 결과, 에탄올 생성물이 배양체에 의해 소비될 수 있기 때문이다.

특정 구체예에서, 본 발명에 따른 전술한 발효 공정에 의해 수성 배양 배지 중 세균 세포 뿐만 아니라 에탄올을 포함하는 발효 브로쓰가 얻어질 것이다. 본 발명의 방법의 바람직한 구체예에서 에탄올은 발효 브로쓰로부터 회수된다.

특정 구체예에서, 에탄올의 회수는 브로쓰의 일부분을 연속적으로 제거하여 브로쓰의 ㅈ제거 부분으로부터 알코올을 회수하는 것을 포함하여 이루어진다.

특정 구체예에서, 에탄올의 회수는 에탄올을 함유하는 브로쓰의 제거된 부분을 분리 유닛에 통과시켜 브로쓰로부터 세균 세포를 분리하여, 무세포 알코올-함유 삼출물을 얻은 다음 세균 세포를 바이오리액터로 되돌리는 것을 포함한다.

특정 구체예에서 본 발명의 방법은 연속식 공정이다.

특정 구체예에서는, 아세테이트가 발효 부산물로서 생산된다.

특정 구체예에서, 에탄올과 아세테이트는 브로쓰로부터 회수된다.

특정 구체예에서, 에탄올과 아세테이트의 회수는 브로쓰의 일부를 연속적으로 제거하고 브로쓰의 제거된 부분으로부터 에탄올과 아세테이트를 따로따로 회수하는 것을 포함하여 이루어진다.

몇몇 구체예에서, 에탄올과 아세테이트의 회수는 에탄올과 아세테이트를 함유하는 브로쓰의 제거된 부분을 분리 유닛에 통과시켜 에탄올 및 아세테이트로부터 세균 세포를 분리하여, 무세포 에탄올- 및 아세테이트-함유 삼출물을 얻고 세균 세포를 바이오리액터로 되돌리는 것을 포함하여 이루어진다.

전술한 구체예에서, 에탄올 및 아세테이트의 회수는 좋기로는 먼저 무세포 삼출물로부터 에탄올을 제거한 다음 무세포 삼출물로부터 아세테이트를 제거하는 것을 포함한다. 좋기로는 그 다음에 무세포 삼출물을 바이오리액터로 되돌리는 것이 바람직하다.

에탄올이 발효의 바람직하고 요망되는 최종 생성물이다. 에탄올은 분별 증류 또는 증발, 및 추출식 발효와 같은 기술 분야의 공지 방법에 의해 발효 배지로부터 회수될 수 있다. 발효 배지로부터 에탄올을 증류시키면 에탄올과 물의 공비 혼합물 (즉 95% 에탄올 및 5% 물)이 생산된다. 이어서, 역시 기술 분야에 공지인 분자체 에탄올 탈수 기술을 이용함으로써 무수 에탄올을 수득할 수 있다.

추출식 발효 공정은 묽은 발효 배지로부터 에탄올을 회수하기 위하여, 발효 미생물에 대한 독성 위험이 낮은 수혼화성 용매를 사용한다. 예컨대, 이러한 유형의 추출 공정에 사용할 수 있는 용매는 올레일 알코올이다. 이 공정에서, 올레일 알코올은 발효조 내로 연속 도입되고, 이 용매는 발효조 최상부에 층을 형성하여, 연속적으로 추출되어 원심분리기로 주입되게 된다. 이렇게 되면 물과 세포가 올레일 알코올로부터 용이하게 분리되어 발효조로 반송되는 한편, 에탄올이 많이 들어있는 용매는 플래쉬 증기화 유닛 내로 주입된다. 에탄올의 대부분은 기화 및 응축되는 한편 비휘발성인 올레일 알코올은 회수되어 발효에 재사용된다.

아세테이트 역시도 공지 방법에 따라 발효 브로쓰로부터 회수될 수 있다. 아세테이트의 회수 방법은 WO2007/117157 및 WO2008/115080에 상세히 설명되어 있다.

본 발명의 특정 구체예에서, 에탄올과 아세테이트는 발효 바이오리액터로부터 브로쓰의 일부를 연속적으로 제거하고 상기 브로쓰로부터 (간편하게 여과에 의해) 미생물 세포들을 분리한 다음, 브로쓰로부터 먼저 에탄올을 회수하고 이어서 아세테이트를 회수함으로써, 발효 브로쓰로부터 회수한다. 전술한 방법을 이용하여 에탄올은 간편하게는 증류에 의해 회수될 수 있으며 아세테이트는 활성탄 상에 흡착시켜 회수할 수 있다. 분리된 미셍물 세포들은 발효 바이오리액터로 되돌리는 것이 바람직하다. 에탄올과 아세테이트가 제거된 후에 잔존하는 무세포 삼출물 역시도 발효 바이오리액터로 되돌려보낼 수 있다. 무세포 삼출물을 바이오리액터로 되돌려 보내기 전에 부가적인 영양물질(예컨대 비타민 B)을 영양 배지에 첨가할 수 있다. 또한, 활성탄에 대한 아세트산의 흡착을 증가시키기 위해 전술한 바와 같이 발효 브로쓰의 pH가 조정된 경우에는, 바이오리액터에 되돌려보내기 전에, pH를 발효 바이오리액터 중의 브로쓰의 pH와 유사하게 맞추어야 한다.

반응 화학양론

본 발명의 방법에서 CO로부터 에탄올(a)로의 화학 반응 및 아세트산으로의 화학 반응 (b)은 다음과 같을 것으로 여겨진다:

(a) 6CO + 3H₂O => CH₃CH₂OH + 4CO₂

(b) 4CO + 2H₂O => 1CH₃COOH + 2CO₂

이하에 다음의 비제한적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

이하에 첨부된 도면을 참조로 본 발명을 상세히 설명한다:
도 1: DSM19630 및 DSM23693의 CO 소비량을 도시한다.
도 2: DSM19630 (도 2a) 및 DSM23693 (도 2b)의 대사물질 생산량을 도시한다.
도 3: 실시예 2에 설명된 바와 같은 DSM23693의 대사물질 생산량 및 최적화된 바이오매스 누적량을 도시한다.
도 4: 신규 균주인 씨. 오토에타노게눔(C. autoethanogenum) 균주 LZ1561 (DSM23693)의 유전자 지도를 도시한 도면으로서, LZ1560 (DSM19630) 균주와에 대한 변동 사항을 나타낸다.
도 5: Seq.ID.1: 균주 LZ1561에 있어서 DNA 미스맷치 복구 단백질 MutS 유전자의 뉴클레오타이드 서열.
도 6: Seq.ID.2: 균주 LZ1560에 있어서 DNA 미스맷치 복구 단백질 MutS 유전자의 뉴클레오타이드 서열.
도 7: Seq.ID.3: 균주 LZ1561에 있어서 DNA 미스맷치 복구 단백질 MutS 유전자의 아미노산 서열.
도 8: Seq.ID.4: 균주 LZ1560에 있어서 DNA 미스맷치 복구 단백질 MutS 유전자의 아미노산 서열.
도 9: Seq.ID.5: 균주 LZ561 및 LZ1560에 있어서 재정렬된 것으로 밝혀진 뉴클레오타이드 서열.
도 10: Seq.ID.6: 균주 LZ1561에 있어서 F₁F_O ATP 합성효소 오페론의 추정 프로모터 대역의 뉴클레오타이드 서열.
도 11: Seq.ID.7: 균주 LZ1560에 있어서 F₁F_O ATP 합성효소 오페론의 추정 프로모터 대역의 뉴클레오타이드 서열.
도 12: Seq.ID.8: 균주 LZ1561에 있어서 Rnf 컴플렉스 오페론의 추정 프로모터 대역의 뉴클레오타이드 서열.
도 13:Seq.ID.9: 균주 LZ156에 있어서 Rnf 컴플렉스 오페론의 추정 프로모터 대역의 뉴클레오타이드 서열.
도 14: Seq.ID.10: 균주 LZ1561에 있어서 탄소 고갈 (carbon starvation) 단백질의 추정 프로모터 대역의 뉴클레오타이드 서열.
도 15: Seq.ID.11: 균주 LZ1560에 있어서 탄소 고갈 단백질의 추정 프로모터 대역의 뉴클레오타이드 서열.
도 16: Seq.ID.12: 균주 LZ1561에 있어서 CO 데히드로게나제/CO-메틸화 아세틸-CoA 합성효소 컴플렉스 베타 서브유닛 유전자의 뉴클레오타이드 서열.
도 17: Seq.ID.13: 균주 LZ1560에 있어서 CO 데히드로게나제/CO-메틸화 아세틸-CoA 합성효소 컴플렉스 베타 서브유닛 유전자의 뉴클레오타이드 서열.
도 18: Seq.ID.14: 균주 LZ1561에 있어서 CO 데히드로게나제/CO-메틸화 아세틸-CoA 합성효소 컴플렉스 베타 서브유닛 유전자의 아미노산 서열.
도 19: Seq.ID.15: 균주 LZ1560에 있어서 CO 데히드로게나제/CO-메틸화 아세틸-CoA 합성효소 컴플렉스 베타 서브유닛 유전자의 아미노산 서열.
도 20: Seq.ID.16: 균주 LZ1561에 있어서 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트 환원효소 유전자의 뉴클레오타이드 서열.
도 21: Seq.ID.17: 균주 LZ1560에 있어서 5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트 환원효소 유전자의 뉴클레오타이드 서열.

실시예

재료 및 방법:

Cr ( II ) 용액의 제조

1 리터 용량의 삼구목 플라스크에 가스가 샐 수 없는 입구 및 출구를 장착하여 비활성 가스하에서의 작업 및 나중에 원하는 생성물의 적당한 저장 용기로의 운반을 가능하게 하였다. 상기 플라스크에 CrCl₃.6H₂0 (4O g, 0.15 mol), 아연 분말 [20 메시] (18.3 g, 0.28 mol), 수은 (13.55 g, 1 mL, 0.0676 mol) 및 500 mL의 증류수를 채웠다. N₂를 이용하여 1 시간 동안 플러싱한 후, 그 혼합물을 약 80℃까지 가열하여 반응을 개시했다. 일정한 N₂ 흐름하에서 2 시간 동안 교반한 후, 그 혼합물을 실온으로 냉각하고 반응 혼합물이 진한 청색 용액이 될 때까지 48 시간 동안 연속적으로 교반했다. 그 용액을 N₂로 퍼지한 혈청병에 옮기고 장래 사용시까지 냉장고에서 보관했다.

세균:

사용된 2가지 유형의 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum)을 독일생물자원센터(DSMZ)에 기탁하고 수탁번호 DSM 19630 및 23693을 부여받았다. DSM 23693은 반복적인 선별 공정을 통해 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum) 균주 DSM 19630으로부터 얻은 것이었다.

샘플 채취 및 분석 방법

각 발효기간의 간격을 두고 CSTR 리액터로부터 배지 시료를 취했다. 배지로부터 샘플을 채취할 때마다 가스가 리액터로 유입되거나 유출되지 않도록 주의하였다.

HPLC :

HPLC System Agilent 1100 Series. 이동상: 0.0025 N 황산. 유량 및 압력: 0.800 mL/min. 컬럼: Alltech IOA; Catalog # 9648, 150 x 6.5 mm, 입자크기 5 ㎛. 컬럼의 온도: 60℃. 검출기: Refractive Index. 검출기의 온도: 45℃.

샘플 제조 방법:

400 ㎕의 시료 및 50 ㎕의 0.15 M ZnSO₄ 및 50 ㎕의 0.15M Ba(OH)₂를 에펜도르프 튜브에 로딩한다. 상기 튜브를 12,000 rpm 및 4℃에서 10 분간 원심분리한다. 200 ㎕의 상등액을 HPLC 바이알에 옮기고, 5 ㎕를 HPLC 기기에 주입한다.

헤드스페이스 ( Headspace ) 분석:

측정은 두 개의 채널이 설치된 Varian CP-4900 micro GC 상에서 수행했다. 채널 1은 70℃, 20O kPa 아르곤 및 4.2 초의 백플러시 시간 (backflush time)으로 작동하는 10m Mol-sieve 컬럼인 반면, 컬럼 2는 백플러시없이 90℃, 15O kPa 헬륨에서 작동하는 10m PPQ 컬럼이었다. 두 채널에 대한 주입 온도는 70℃였다. 런타임은 120 초로 설정하였지만, 모든 중요 피크는 일반적으로 100초 전에 용리하였다.

세포 밀도:

세포 밀도는 발효 브로쓰의 소정 분취액(defined aliquot)에서 세균 수를 계수함으로써 구하였다. 별법으로, 샘플의 흡수도를 600 nm (분광광도계)에서 측정하고 공개된 공정에 따라 계산하여 건조 질량(dry mass)을 구하였다.

서열결정( Sequencing ):

게놈을 서열결정한 결과, 씨. 오토에타노게눔(C. autoethanogenum) 균주 LZ1560 (DSM19630)와 새로운 균주 LZ1561 (DSM23693) 간에 개선된 성능에 기여하는 것으로 여겨지는 몇가지 변화가 있는 것으로 나타났다.

두 가지 균주 모두 광학 밀도(OD_600nm)가 1이 될 때까지 PETC 배지에서 혐기적으로 성장시켰으며 게놈 DNA를 100ml 오버나잇 배양체로부터 분리하였다. 세포들을 원심분리(6,000 x g, 15 min, 4℃)로 수확하고 인산칼륨 완충액(10 mM; pH 7.5)으로 세척한 다음 1.9 ml STE 완충액 (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM 수크로스; pH 8.0)에 현탁시켰다. 이 현탁액을 300 ㎕ 리소자임 (~ 100,000 U; 30분, 37℃) 및 280 ㎕의 SDS 용액 (10 % (w/v); 10분)으로 처리하였다. RNA를 240 ㎕의 EDTA 용액 (0.5 M; pH 8), 20 ㎕ Tris-HCl (1 M; pH 7.5), 및 10 ㎕ RNase A (50,000 U)로 1시간 동안 처리하였다. 100 ㎕ Proteinase K (0.5 U)를 37℃에서 1- 3시간 첨가하여 단백질 가수분해를 수행하였다. 마지막으로, 600 ㎕의 소듐 퍼클로레이트(5 M)를 첨가한 다음, 페놀-클로로포름 추출하고 이소프로판올 침전시켰다. DNA의 순도 및 양을 NanoDrop

1000 분광광도계 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 및 겔 전기영동에 의해 검정하였다.

454 GS (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)를 이용하여 샷건 게놈 시퀀싱을 실시하였다. LZ1560(10x 커버리지)의 경우, 총 길이 44,424,523 염기로 191,368 싱글 리드를 생성한 반면, LZ1561 (47.5x 커버리지)의 경우에는 총 길이 202,591,572 bp로 579,545 페어드-엔드 리드를 생성하였다. Newbler 패키지 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)를 이용하여 리드를 어셈블리하고 Geneious (Biomatters Ltd., Auckland, NZ) 및 MAUVE 패키지 (Darling et al., 2004, Genome Res . 14: 1394-1403), 그리고 Artemis Comparison Tool (Carver et al., 2008, Bioinformatics 24:2672-6)을 이용하여 서열들을 비교하였다.

LZ1560 (DSM19630) 및 새로운 균주 LZ1561 (DSM23693)의 정렬된 게놈 서열에서 총 64개의 변화가 발견되었다. (도 4). 대부분의 변화는 단일 염기 변이였으나, 21 bp 결실 (추정 DNA 미스맷치 복구 단백질 MutS를 코딩하는 유전자; Seq.ID.1-4)과 11개의 유전자 (질소 고정, 당 대사, 당 전달 및 이화 조절과 관련됨)를 함유하는 15,408 bp 대역(Seq.ID.5)에서 재정렬 이벤트가 일어난 것이 밝혀졌다. 62개의 단일 염기 변이 중 22개는 점 돌연변이였고 40개는 삽입/결실 변이였다. 이 변이들 중 18개는 유전자간 영역에서 발견되었고 44개는 코딩 영역에서 발견되었다. 코딩 영역의 변이들 중 5개는 침묵하는 변이로서 아미노산 서열의 변화를 일으키지 않은 반면, 14개는 단일 아미노산 변화를 일으키고 25개는 프레임시프트를 야기하였다.

가장 두드러진 것은 위치 212,530 (F₁F_O ATP 합성효소 오페론의 추정 프로모터 영역, Seq.ID.6-7), 1,171,874 (Rnf 컴플렉스 오페론의 추정 프로모터 영역, Seq.ID.8-9), 3,717,495 (탄소 고갈 단백질의 추정 프로모터 영역, Seq.ID.10-11)에 있어서의 변화 및 위치 3,741,730 (CO 데히드로게나제/CO-메틸화 아세틸-CoA 합성효소 컴플렉스 베타 서브유닛, Seq.ID.12-15) 및 3,748,058 (5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트 환원효소 유전자, Seq.ID.16-17)에서의 Wood-Ljungdahl-유전자 클러스터였는데, 이것은 CO/H₂ 상에서의 성장 및 에너지 대사로 직접 역추적될 수 있다.

실시예 1:

A: CSTR 에서의 회분식 발효

대략 1500mL의 용액 A를 1.5L 발효조에 넣고 질소를 살포하였다. 레사주린(Resazurin: 1.5mL의 2g/L 용액) 및 H₃PO₄ (85% 용액, 2.25mL)을 첨가하고 진한 NH₄OH(aq)를 이용하여 pH를 5.3으로 맞추었다. 1.5ml의 용액 C에 앞서서 니트릴로트리아세트산 (0.3ml의 0.15M 용액)을 첨가하였다. 그 후에 NiCl2 (0.75ml의 0.1M 용액) 및 Na₂WO₃ (1.5mL의 0.01M 용액)을 첨가하였다. 15ml의 용액 B를 첨가하고 70 mL/분으로 용액에 N2를 살포한 다음 이를 CO 함유 가스 (50% CO; 28% N2, 2%H2, 20% CO2)로 스위치시켰다. 이어서 발효조에 200 ml의 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) 19630 배양체를 접종하였다. 발효조를 37℃로 유지하고 300 rpm에서 교반하였다. 이 실험 동안 Na2S 용액 (0.2M 용액)을 약 0.3 ml/시간의 속도로 첨가하였다. 미생물 배양의 요구사항에 따라 기질 공급을 증가시켰다.

세균 배양체는 사용된 실험 조건에서는 증식하지 않았다. 배양체는 48시간 성장시킨 후 350 mM CO 흡수를 나타낸 반면 (도 1a 및 표 2), 배양체의 배가 시간 (doubling time)은 40.8 시간이었다 (도 2a). 이것은 0.41일^-1의 비성장률에 달하였다. CO 비흡수율은 실험 기간 동안 증가하여 최대치 0.54 mM CO/1분/바이오매스 1g에 달하였다. 제1.0일 비흡수율: 0.28 mM CO/1분/바이오매스 1g (표 1). 제2.0일 비흡수율: 0.54 mM CO/1분/바이오매스 1g (표 2).

B: CSTR 에서의 회분식 발효

대략 1500mL의 용액 A를 1.5L 발효조에 넣고 질소를 살포하였다. 레사주린(Resazurin: 1.5mL의 2g/L 용액) 및 H₃PO₄ (85% 용액, 2.25mL)을 첨가하고 진한 NH₄OH(aq)를 이용하여 pH를 5.3으로 맞추었다. 1.5ml의 용액 C에 앞서서 니트릴로트리아세트산 (0.3ml의 0.15M 용액)을 첨가하였다. Na₂WO₃ (1.5mL의 0.01M 용액)을 첨가하였다. 15ml의 용액 B를 첨가하고 이 용액에 N2를 살포한 다음 CO 함유 가스 (50% CO; 50% N2)로 60mL/분으로 스위치하였다. 이어서 발효조에 180ml의 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) 23693 배양체를 접종하였다. 이 실험 동안 Na2S 용액 (0.5M 용액)을 약 0.12 ml/시간의 속도로 첨가하였다. 미생물 배양의 요구사항에 따라 기질 공급을 증가시켰다.

실험 조건에서 증식된 세균 배양체를 이용하였다. 이 배양체는 43시간 성장 후 8400 mM CO 흡수를 나타낸 반면 (도 2b), 배양체의 배가 시간은 9.6 시간이었다 (도 2b). 이것은 1.73일^-1의 비성장률에 달하였다. CO 비흡수율은 실험 기간 동안 증가하여 최대치 1.17 mMol CO/1분/바이오매스 1g에 달하였다. 제1.0일 비흡수율: 1.17 mM CO/1분/바이오매스 1g (표 1). 제2.0일 비흡수율: 1.03 mM CO/1분/바이오매스 1g (표 2). 이 발효 조건은 실시예 1A에 사용된 조건과 동일하거나 적어도 고도로 유사하였다. 배지들은 동일 성분들이 유사한 농도로 함유되었으나 두 가지 가스는 모두 CO를 적어도 50% (v/v)로 함유하였다. 발효 조건이 유사한 것에 비해 CO 흡수율이 크게 차이가 난다는 것은 모균주인 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) 19630에 비해 개발된 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) 23693 배양체의 효율이 개선됨으로 해서 배양체 성능도 달라짐을 가리키는 것이다.

결과:

실시예 2

대략 1500mL의 용액 A를 1.5L 발효조에 넣고 질소를 살포하였다. 레사주린(Resazurin: 1.5mL의 2g/L 용액) 및 H₃PO₄ (85% 용액, 2.25mL)을 첨가하고 진한 NH₄OH(aq)를 이용하여 pH를 5.3으로 맞추었다. 용액 C (1.5mL)를 첨가한 후 Na₂WO₃ (1.5mL의 0.01M 용액)를 첨가하였다. 15ml의 용액 B를 첨가하고 이 용액에 N2를 살포한 후 60mL/분으로 CO 함유 가스 (50% CO; 50% N2)로 스위칭하였다. 이어서 발효조에 100ml의 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) 23693 배양체를 접종하였다. 발효조를 37℃로 유지하고 300 rpm으로 교반하였다. 이 실험 동안, Na2S 용액 (0.5M 용액)을 약 0.15 ml/시간의 속도로 첨가하였다. 기질 공급을 미생물 요구 사항에 따라 증가시켰다.

실험 조건에서 증식한 미생물 배양체를 사용하였다. 발효 조건들은 실시예 1A + B에서 사용된 조건과 동일하거나 적어도 고도로 유사하고 두 가지 가스 모두 CO를 적어도 50% (v/v) 함유하였다. 배양체는 정상 상태까지 성장하였으며, 여기서 최대 에탄올 농도값을 HPLC로 측정하였다 (55.8 g/L).

전술한 특정 방법과 조성은 바람직한 구체예를 나타내는 것으로 어디까지나 예시적인 것들이며 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 명세서를 참조로 다른 목적, 측면 및 구체예들이 당업자에게 가능할 것이며 이들 역시 본 발명의 범위와 정신에 포함된다. 당업자들에게는 본 발명의 정신과 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 치환과 변형이 가해질 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 이와 같이 예시적으로 설명된 본 발명은 본 발명에 필수적인 것으로 개시되지 않은 어떤 구성요소나 구성요소들 없이, 또는 제한이나 여러 제한없이 적절히 실시될 수 있다. 따라서, 예컨대, 각각의 경우에서, 본 발명의 구체예나 실시에에서, "포함하다", "함유하다", "함유하는", 등의 표현은 확장적으로, 그리고 한정없이 이해되어야 한다. 뿐만 아니라, 제목, 표제 등은 본 명세서를 읽는 독자의 이해를 돕기 위해 제공된 것으로, 본 발명의 범위를 어떤 의도로든 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본 명세서에서 인용된 모든 출원, 특허 및 공개 간행물들은 본 발명에 참조 병합된다. 그러나, 본 명세서에 여하한 출원, 특허 및 공개문헌이 인용되었다고 해서 이들 문헌이 본 발명의 타당한 종래기술이라거나 전세계 어느 국가에서든 일반 상식의 일부를 형성하는 것으로 인정하는 것도 아닐 뿐더러 그러한 주장도 받아들여져서는 아니될 것이다.

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

DSM19630

20071019

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

DSM23693

20100614

서열목록 전자파일 첨부

Claims

독일생물자원센터(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures:DSMZ)에 수탁번호 DSM23693으로 기탁된 균주인 단리된 미생물로서, 미생물이 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum)에서 유래한 것인 단리된 미생물.
제1항에 있어서, 미생물은 CO를 포함하는 기질의 혐기 발효에 의해 에탄올과 아세테이트를 포함하는 생성물을 생산하는 능력을 특징으로 하는 것인 단리된 미생물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 미생물은 CO를 포함하는 기질을 에탄올을 포함하는 생성물로 발효시키고, 상기 미생물의 비생산성(specific productivity)은 4g 이상의 에탄올/발효 브로쓰 1L/바이오매스 1그램/1일인 것인 단리된 미생물.
제3항에 있어서, 비생산성은 7g 이상의 에탄올/발효 브로쓰 1L/바이오매스 1그램/1일인 것인 단리된 미생물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 생성물은 에탄올과 아세테이트를 포함하는 것인 단리된 미생물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 미생물은 10 g 이상의 에탄올/발효 브로쓰 1L/1일의 생산성으로, CO를 포함하는 기질을 발효시켜 에탄올을 생산하는 것인 단리된 미생물.
제6항에 있어서, 미생물의 생산성은 50 g 이상의 에탄올/발효 브로쓰 1L/1일인 것인 단리된 미생물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 미생물은 에탄올 대 아세테이트의 비율이 2:1 이상이도록 에탄올과 아세테이트를 생산하는 것인 단리된 미생물.
제8항에 있어서, 미생물은 에탄올 대 아세테이트의 비율이 7:1 이상이도록 에탄올과 아세테이트를 생산하는 것인 단리된 미생물.
제9항에 있어서, 미생물은 에탄올 대 아세테이트의 비율이 10:1 이상이도록 에탄올과 아세테이트를 생산하는 것인 단리된 미생물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 미생물은 비흡수율(specific uptake)이 1.0mMol 이상의 CO/1분/바이오매스 1g인 것인 단리된 미생물.
제11항에 있어서, 미생물은 비흡수율이 2.0mMol 이상의 CO/1분/바이오매스 1g인 것인 단리된 미생물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 미생물은 비성장률(specific growth rate)이 0.8일^-1 이상인 것인 단리된 미생물.
제13항에 있어서, 미생물은 비성장률이 2.0일^-1 이상인 것인 단리된 미생물.
제1항에 있어서, 미생물은 최대 30g/발효 브로쓰 1L의 알코올 농도를 관용하는 것인 단리된 미생물.
제1항에 있어서, 미생물은 최대 70g/발효 브로쓰 1L의 알코올 농도를 관용하는 것인 단리된 미생물.
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