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TW202307202A - 用於改良乙二醇之生物產生的微生物及方法 - Google Patents

用於改良乙二醇之生物產生的微生物及方法 Download PDF

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TW202307202A
TW202307202A TW111129389A TW111129389A TW202307202A TW 202307202 A TW202307202 A TW 202307202A TW 111129389 A TW111129389 A TW 111129389A TW 111129389 A TW111129389 A TW 111129389A TW 202307202 A TW202307202 A TW 202307202A
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clostridium
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TW111129389A
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柴克瑞 羅伯特 考登
靜 冷
麥可 科普克
拉斯穆斯 奧弗高 詹森
亞歷山大 保羅 穆勒
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美商朗澤科技有限公司
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Abstract

本公開提供了用於改良乙二醇及乙二醇前體的生物產生的經基因工程化的微生物及方法。本公開之該微生物經由5,10-亞甲基四氫葉酸鹽、草醯乙酸鹽、檸檬酸鹽、蘋果酸鹽及甘胺酸中之一種或多種產生乙二醇或乙二醇前體。本公開進一步提供了包括乙二醇或如聚對苯二甲酸乙二酯等乙二醇聚合物的組合物。

Description

用於改良乙二醇之生物產生的微生物及方法
本公開係關於經基因工程化之微生物及用於藉由微生物醱酵，尤其藉由氣態受質之微生物醱酵產生乙二醇及乙二醇前體的方法。
乙二醇，亦稱為單乙二醇（MEG），其目前市場價值超過330億美元，且為各種工業、醫療及消費產品之重要組成部分。乙二醇目前係使用需要大量的能量及水、產生許多不希望的副產物且依賴於石化原料的化學催化製程產生的。對可持續材料之需求帶來了一些技術進步，如自源自甘蔗之乙醇催化產生乙二醇。
乙二醇前體亦具有商業價值。例如，乙醇酸鹽用於皮膚護理、個人護理、染色、鞣製及作為清潔劑。乙醛酸鹽為香草醛、農藥、抗生素、尿囊素及錯合劑之中間體。
然而，沒有已知之微生物能夠生物地產生乙二醇，且尚未建立完全生物之乙二醇產生途徑。文獻中已描述了自糖至乙二醇之一些生物途徑。例如，Alkim等人, 《微生物細胞工廠（ Microb Cell Fact）》 14: 127, 2015證明了在大腸桿菌中自(D)-木糖產生乙二醇，但指出需要有氧條件才能獲得高產量。類似地，Pereira等人, 《代謝工程（ Metab Eng）》, 34: 第80-87頁, 2016實現了在大腸桿菌中自戊糖產生乙二醇。在釀酒酵母中亦進行了一些關於戊糖產生乙二醇之研究，但結果不一致。參見，例如Uranukul等人, 《代謝工程》, 51: 第20-31頁, 2018。
氣體醱酵提供了一條將各種容易獲得的低成本C1原料（例如工業廢氣、合成氣或重整甲烷）轉化為化學品及燃料的途徑。由於氣體醱酵代謝與糖醱酵代謝顯著不同，使用上述途徑係不實際的，因為此等途徑需要經由糖異生自氣體中產生糖前體（一種能量負過程）。迄今為止，尚無自氣態受質產生乙二醇之途徑。
在探索性實踐中，Islam等人, 《代謝工程》, 41: 173-181, 2017預測了數百種用於使用化學信息學工具由熱醋穆爾氏菌（ M. thermoacetica）中的合成氣產生乙二醇的假設路徑。然而，即使本領域中熟習此項技術者亦不可能將此等路徑結合至氣體醱酵生物中，因為許多路徑由於熱力學或其他限制因素而不可行。例如，Islam等人包含了近2,000個氧或氧自由基依賴反應，這在嚴格的厭氧系統中係不可行。Islam等人唯一確定的具有已知反應之假設路徑需要糖異生或乙醇作為中間體。因此，仍然需要能夠自氣態受質產生高產量之乙二醇及乙二醇前體的經過驗證的、能量上有利之重組產生系統。
在以上背景下，本公開提供了相對於現有技術之某些優勢及進步。
儘管本文公開之本公開不限於特定優勢或功能，但本公開提供了能夠由氣態受質產生乙二醇或乙二醇前體的經基因工程化之微生物。
在本文公開之微生物的一些方面，微生物經由包括在編碼二醇脫水酶之基因中之破壞性突變的一種或多種中間體產生乙二醇或乙二醇前體。
在本文公開之微生物的一些方面，微生物經由一種或多種中間體產生乙二醇或乙二醇前體，該一種或多種中間體選自由以下組成之群組：5,10-亞甲基四氫葉酸鹽、草醯乙酸鹽、檸檬酸鹽、蘋果酸鹽及甘胺酸。
在本文公開之微生物的一些方面，微生物包括以下一種或多種：能夠將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽之異源酶、能夠將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽之異源酶、能夠將異檸檬酸鹽轉化為乙醛酸鹽之異源酶及能夠將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之異源酶。
在本文公開之微生物的一些方面，能夠將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽之異源酶為檸檬酸[Si]-合酶[2.3.3.1]、ATP檸檬酸合酶[2.3.3.8]；或檸檬酸(Re)-合酶[2.3.3.3]；能夠將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽之異源酶為丙胺酸-乙醛酸轉氨酶[2.6.1.44]、絲胺酸-乙醛酸轉氨酶[2.6.1.45]、絲胺酸-丙酮酸轉氨酶[2.6.1.51]、甘胺酸-草醯乙酸轉氨酶[2.6.1.35]、甘胺酸轉氨酶[2.6.1.4]、甘胺酸脫氫酶[1.4.1.10]、丙胺酸脫氫酶[1.4.1.1]或甘胺酸脫氫酶[1.4.2.1]；能夠將異檸檬酸鹽轉化為乙醛酸鹽之異源酶為異檸檬酸裂解酶[4.1.3.1]；及/或能夠將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之異源酶為乙醇醛脫氫酶[1.2.1.21]、乳醛脫氫酶[1.2.1.22]、琥珀酸-半醛脫氫酶[1.2.1.24]、2,5-二氧戊酸脫氫酶[1.2.1.26]、醛脫氫酶[1.2.1.3/4/5]、甜菜鹼-醛脫氫酶[1.2.1.8]或醛鐵氧還蛋白氧化還原酶[1.2.7.5]。
在本文公開之微生物的一些方面，異源酶衍生自選自由以下組成之群組的屬：芽孢桿菌屬（ Bacillus）、梭菌屬（ Clostridium）、埃希氏菌屬（ Escherichia）、葡糖桿菌屬（ Gluconobacter）、生絲微菌屬（ Hyphomicrobium）、離胺酸芽胞桿菌屬（ Lysinibacillus）、類芽孢桿菌屬（ Paenibacillus）、假單胞菌屬（ Pseudomonas）、棲沈積物菌屬（ Sedimenticola）、芽孢八疊球菌屬（ Sporosarcina）、鏈黴菌屬（ Streptomyces）、熱硫桿狀菌屬（ Thermithiobacillus）、熱袍菌屬（ Thermotoga）及玉蜀黍屬（ Zea）。
在本文公開之微生物的一些方面，異源酶中之一種或多種異源酶經密碼子優化以在微生物中表現。
在本文公開之微生物的一些方面，微生物進一步包括以下中之一種或多種：能夠將乙醯輔酶A轉化為丙酮酸鹽之酶；能夠將丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶；能夠將丙酮酸鹽轉化為蘋果酸鹽之酶；能夠將丙酮酸鹽轉化為磷酸烯醇丙酮酸鹽之酶；能夠將草醯乙酸鹽轉化為檸檬醯輔酶A之酶；能夠將檸檬醯輔酶A轉化為檸檬酸鹽之酶；能夠將檸檬酸鹽轉化為烏頭酸鹽且將烏頭酸鹽轉化為異檸檬酸鹽之酶；能夠將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶；能夠將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為2-磷酸-D-甘油酸鹽之酶；能夠將2-磷酸-D-甘油酸鹽轉化為3-磷酸-D-甘油酸鹽之酶；能夠將3-磷酸-D-甘油酸鹽轉化為3-膦醯氧基丙酮酸鹽之酶；能夠將3-膦醯氧基丙酮酸鹽轉化為3-磷酸-L-絲胺酸之酶；能夠將3-磷酸-L-絲胺酸轉化為絲胺酸之酶；能夠將絲胺酸轉化為甘胺酸之酶；能夠將5,10-亞甲基四氫葉酸鹽轉化為甘胺酸之酶；能夠將絲胺酸轉化為羥基丙酮酸鹽之酶；能夠將D-甘油酸鹽轉化為羥基丙酮酸鹽之酶；能夠將蘋果酸鹽轉化為乙醛酸鹽之酶；能夠將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽之酶；能夠將羥基丙酮酸鹽轉化為乙醇醛之酶；及/或能夠將乙醇醛轉化為乙二醇之酶。
在本文公開之微生物的一些方面，微生物過表現能夠將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽之異源酶、能夠將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽之異源酶及/或能夠將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之異源酶。
在本文公開之微生物的一些方面，微生物過表現能夠將丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶、能夠將檸檬酸鹽轉化為烏頭酸鹽且將烏頭酸鹽轉化為異檸檬酸鹽之酶、能夠將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶、能夠將絲胺酸轉化為甘胺酸之酶、能夠將5,10-亞甲基四氫葉酸鹽轉化為甘胺酸之酶、能夠將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽之酶；及/或能夠將乙醇醛轉化為乙二醇之酶。
在本文公開之微生物的一些方面，微生物包括一種或多種選自由以下組成之群組的酶中的破壞性突變：異檸檬酸脫氫酶、甘油酸脫氫酶、乙醇酸脫氫酶、甘油酸脫氫酶、乙醇酸脫氫酶、醛鐵氧還蛋白氧化還原酶及醛脫氫酶。
在本文公開之微生物的一些方面，微生物選自由以下組成之群組的屬的成員：醋桿菌屬（ Acetobacterium）、嗜鹼菌屬（ Alkalibaculum）、布勞特氏菌屬（ Blautia）、丁酸桿菌屬（ Butyribacterium）、梭菌屬（ Clostridium）、貪銅菌屬（ Cupriavidus）、真桿菌屬（ Eubacterium）、穆爾氏菌屬（ Moorella）、產醋桿菌屬（ Oxobacter）、鼠孢菌屬（ Sporomusa）及熱厭氧桿菌屬（ Thermoanaerobacter）。
在本文公開之微生物的一些方面，微生物衍生自親本微生物，該親本微生物選自由以下組成之群組：伍氏醋酸桿菌（ Acetobacterium woodii）、巴氏嗜鹼菌（ Alkalibaculum bacchii）、生產布勞特氏菌（Blautia producta）、食甲基丁酸桿菌（ Butyribacterium methylotrophicum）、醋酸梭菌（ Clostridium aceticum）、產乙醇梭菌（ Clostridium autoethanogenum）、食一氧化碳梭菌（ Clostridium carboxidivorans）、克氏梭菌（ Clostridium coskatii）、德氏梭菌（ Clostridium drakei）、蟻酸醋酸梭菌（ Clostridium formicoaceticum）、永達爾梭菌（ Clostridium ljungdahlii）、馬氏梭菌（ Clostridium magnum）、拉氏梭菌（ Clostridium ragsdalei）、糞味梭菌（ Clostridium scatologenes）、鉤蟲貪銅菌（ Cupriavidus necator）、黏液真桿菌（ Eubacterium limosum）、熱自養穆爾氏菌（ Moorella thermautotrophica）、熱醋穆爾氏菌（ Moorella thermoacetica）、普氏產醋桿菌（ Oxobacter pfennigii）、卵形鼠孢菌（ Sporomusa ovata）、森林土壤醋酸鼠孢菌（ Sporomusa silvacetica）、球形鼠孢菌（ Sporomusa sphaeroides）及凱伍熱厭氧菌（ Thermoanaerobacter kiuvi）。
在本文公開之微生物的一些方面，微生物衍生自選自由以下組成之群組的親本細菌：產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌。
在本文公開之微生物的一些方面，微生物包括天然或異源伍德-永達爾路徑（Wood-Ljungdahl pathway）。
在本文公開之微生物的某些方面，微生物產生乙醛酸鹽或乙醇酸鹽作為乙二醇前體。
本公開進一步提供了一種產生乙二醇或乙二醇前體的方法，該方法包括在營養培養基中及在存在受質的情況下培養本文公開之微生物，由此該微生物產生乙二醇或乙二醇前體。
在本文公開之方法的一些方面，受質包括CO、CO 2及H 2中之一種或多種。
在本文公開之方法的一些方面，受質之至少一部分為工業廢氣、工業尾氣或合成氣。
在本文公開之方法的一些方面，微生物產生乙醛酸鹽或乙醇酸鹽作為乙二醇前體。
在本文公開之方法的一些方面，方法進一步包括自營養培養基中分離乙二醇或乙二醇前體。
在本文公開之方法的一些方面，微生物進一步產生乙醇、2,3-丁二醇及琥珀酸鹽中之一種或多種。
本公開進一步提供了一種包括藉由本文所述方法產生之乙二醇的組合物。在一些方面，組合物為防凍劑、防腐劑、脫水劑或鑽井液。
本公開進一步提供了一種包括藉由本文所述方法產生之乙二醇的聚合物。在一些方面，聚合物為均聚物或共聚物。在一些方面，聚合物為聚乙二醇（PEG）或聚對苯二甲酸乙二酯（PET）。
本公開進一步提供了一種由氣態受質產生聚對苯二甲酸乙二酯（PET）產物之方法，該方法包括1）形成至少一種PET組分，其中該至少一種PET組分選自單乙二醇、對苯二甲酸（PTA）或其任何組合；2）將該至少一種PET組分處理為PET；3）聚合該PET以形成PET樹脂；4）將該PET樹脂處理為PET產物。本公開規定PTA可衍生自化石來源，或者直接或間接來源於氣體醱酵。PET產物之實例可為在US 2020/0048665A1中公開之彼等，該文獻在此藉由引用以其整體併入。
本公開提供了一種用於由氣態受質產生PET聚合物之方法，該方法包括：1）提供至少一種二酸化合物，該至少一種二酸化合物包括對苯二甲酸酯化合物；2）提供至少一種二醇化合物，該至少一種二醇化合物包括單乙二醇；3）共聚該二酸化合物及該二醇化合物之混合物以獲得包括二酸組分及二醇組分之PET聚合物。
本公開進一步提供了一種包括本文所述之聚合物的組合物。在一些方面，組合物為纖維、樹脂、薄膜或塑膠。
自下面結合所附申請專利範圍之詳細描述中，將更全面地理解本公開之此等及其他特徵及優勢。注意，申請專利範圍之範圍由其中之敍述來限定，而非由本說明書中闡述之特徵及優勢的具體討論來限定。
相關申請之交叉參考
本申請案主張於2021年8月6日提交之美國臨時專利申請案第63/260,054號及於2021年9月14日提交之第63/261,185號的權益，其全部內容藉由引用併入本文。 對序列表之參考
本申請含有已以ASCII格式電子提交且特此藉由引用以其整體併入之序列表。創建於2021年8月9日之該ASCII副本命名為LT199US1-Sequences.txt且大小為215,003字節。
籠統地給出以下實施例描述。本公開由在以下本文中標題「實例」下給出的公開內容進一步闡明，其提供支持本公開之實驗性數據、本公開之各個方面的具體實例以及執行本公開之方式。
諸位發明人出人意料地能夠對一氧化碳營養型產乙酸微生物進行工程化以藉由包括CO及/或CO 2之受質的醱酵來產生乙二醇或乙二醇前體，該微生物包括編碼二醇脫水酶的基因中的破壞性突變。
除非另有定義，否則貫穿本規範所使用之以下術語定義如下：
本公開提供了用於生物產生乙二醇之微生物。「微生物」為微觀有機體，具體地為細菌、古菌、病毒或真菌。在一較佳實施例中，本公開之微生物為細菌。
當用於指微生物時，術語「非天然存在的」旨在意指微生物具有在所參考物種的天然存在之菌株（包含所參考物種的野生型菌株）中未發現的至少一種基因修飾。非天然存在之微生物通常在實驗室或研究機構中開發。本公開之微生物係非天然存在的。
術語「基因修飾」、「基因改變」或「基因工程化」廣泛地指藉由人工對微生物之基因組或核酸的操作。同樣，術語「經基因修飾的」、「經基因改變的」或「經基因工程化的」係指含有此類基因修飾、基因改變或基因工程之微生物。此等術語可用於區分實驗室產生的微生物與自然存在的微生物。基因修飾之方法包含例如異源基因表現、基因或啟動子插入或缺失、核酸突變、經改變之基因表現或失活、酶工程、定向進化、基於知識之設計、無規誘變方法、基因改組及密碼子優化。本公開之微生物係經基因工程化的。
「重組」指示核酸、蛋白質或微生物為基因修飾、基因工程或基因重組之產物。通常，術語「重組」係指含有衍生自多個來源，如兩種或更多種不同之微生物菌株或物種的基因材料或由其編碼的核酸、蛋白質或微生物。本公開之微生物通常係重組的。
「野生型」係指區別於突變形式或變體形式的有機體、菌株、基因或其存在於自然中時之特徵的典型形式。
「內源」係指在衍生出本公開之微生物的野生型或親本微生物中存在或表現的核酸或蛋白質。舉例而言，內源基因為天然存在於衍生出本公開之微生物的野生型或親本微生物中的基因。在一個實施例中，內源基因之表現可由外源調控元件，如外源啟動子控制。
「外源」係指起源於本公開之微生物之外的核酸或蛋白質。舉例而言，可人工或重組產生外源基因或酶且將其引入本公開之微生物中或在本公開之微生物中表現。亦可自異源微生物中分離外源基因或酶且將其引入本公開之微生物中或在本公開之微生物中表現。外源核酸可調整以整合至本公開之微生物的基因組中或在本公開之微生物中例如在質體中保持染色體外狀態。
「異源」係指在衍生出本公開之微生物的野生型或親本微生物中不存在的核酸或蛋白質。舉例而言，異源基因或酶可衍生自不同之菌株或物種且引入至本公開之微生物中或在本公開之微生物中表現。異源基因或酶可以其存在於不同菌株或物種中的形式引入本公開之微生物或在本公開之微生物中表現。可替代地，可某種方式修飾異源基因或酶，例如藉由對其進行密碼子優化以用於在本公開之微生物中表現或藉由對其進行工程化以改變功能，如以逆轉酶活性方向或改變受質特異性。
具體地，在本文所述之微生物中表現的異源核酸或蛋白質可衍生自芽孢桿菌（ Bacillus）、梭菌（ Clostridium）、貪銅菌（ Cupriavidus）、埃希氏菌（ Escherichia）、葡糖桿菌（ Gluconobacter）、生絲微菌（ Hyphomicrobium）、離胺酸芽孢桿菌（ Lysinibacillus）、類芽孢桿菌（ Paenibacillus）、假單胞菌（ Pseudomonas）、棲沈積物菌（ Sedimenticola）、芽孢八疊球菌（ Sporosarcina）、鏈黴菌（ Streptomyces）、熱硫桿狀菌（ Thermithiobacillus）、熱袍菌（ Thermotoga）、玉蜀黍、克雷伯氏菌（ Klebsiella）、分枝桿菌（ Mycobacterium）、沙門氏菌（ Salmonella）、類分枝桿菌（ Mycobacteroides）、葡萄球菌（ Staphylococcus）、伯克霍爾德氏菌（ Burkholderia）、李斯特氏菌（ Listeria）、不動桿菌（ Acinetobacter）、志賀氏菌（ Shigella）、奈瑟氏菌（ Neisseria）、博德特氏菌（ Bordetella）、鏈球菌（ Streptococcus）、腸桿菌（ Enterobacter）、弧菌（ Vibrio）、軍團菌（ Legionella）、黃單胞菌（ Xanthomonas）、沙雷氏菌（ Serratia）、克羅諾桿菌（ Cronobacter）、銅桿菌（ Cupriavidus）、螺桿菌（ Helicobacter）、耶爾森菌（ Yersinia）、角質細菌（ Cutibacterium）、弗朗西斯菌（Francisella）、果膠桿菌（ Pectobacterium）、弧桿菌（ Arcobacter）、乳桿菌（ Lactobacillus）、希瓦氏菌（ Shewanella）、歐文氏菌（ Erwinia）、硫脲螺旋菌（ Sulfurospirillum）、肽球菌科（ Peptococcaceae）、嗜熱球菌（ Thermococcus）、酵母菌（ Saccharomyces）、熱球菌（ Pyrococcus）、甘胺酸（ Glycine）、人屬（ Homo）、羅氏菌（ Ralstonia）、短桿菌（ Brevibacterium）、甲基桿菌（ Methylobacterium）、地芽孢桿菌（ Geobacillus）、牛屬（ bos）、原雞屬（ gallus）、厭氧球菌（ Anaerococcus）、非洲爪蟾屬（ Xenopus）、肺炎支氣管桿菌（ Amblyrhynchus）、鼠屬（ rattus）、家鼠屬（ mus）、豬屬（ sus）、紅球菌（ Rhodococcus）、球菌（ Rhizobium）、巨球菌（ Megasphaera）、根瘤菌（ Mesorhizobium）、消化球菌（ Peptococcus）、農桿菌（ Agrobacterium）、彎曲桿菌（ Campylobacter）、醋酸桿菌（ Acetobacterium）、嗜鹼菌（ Alkalibaculum）、布勞特氏菌、丁酸桿菌、真桿菌（ Eubacterium）、穆爾氏菌（ Moorella）、產醋桿菌（ Oxobacter）、鼠孢菌（ Sporomusa）、熱厭氧桿菌（ Thermoanaerobacter）、裂殖酵母屬（ Schizosaccharomyces）、類芽孢桿菌（ Paenibacillus）、擬芽孢桿菌（ Fictibacillus）、離胺酸芽孢桿菌（ Lysinibacillus）、鳥胺酸芽孢桿菌（ Ornithinibacillus）、鹽桿菌（ Halobacillus）、庫特氏菌（ Kurthia）、慢桿菌（ Lentibacillus）、厭氧桿菌（ Anoxybacillus）、土壤芽孢桿菌（ Solibacillus）、枝芽孢菌（ Virgibacillus）、脂環酸芽孢桿菌（ Alicyclobacillus）、芽孢八疊球菌（ Sporosarcina）、鹽生微生物（ Planococcus）、芽孢八疊球菌（ Sporosarcina）、平球菌（ Planococcus）、棒狀桿菌（ Corynebacterium）、嗜熱菌（ Thermaerobacter）、硫桿菌（ Sulfobacillus）或共生菌（ Symbiobacterium）。
術語「多核苷酸」、「核苷酸」、「核苷酸序列」、「核酸」及「寡核苷酸」可互換使用。該等術語係指任何長度之核苷酸（脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸）或其類似物之聚合形式。多核苷酸可具有任何三維結構且可執行任何已知或未知之功能。以下為多核苷酸的非限制性實例：基因或基因片段之編碼或非編碼區、由連鎖分析定義之基因座（loci）（基因座（locus））、外顯子、內含子、信使RNA（mRNA）、轉移RNA、核糖體RNA、短干擾RNA（siRNA）、短髮夾RNA（shRNA）、微RNA（miRNA）、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質體、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離之RNA、核酸探針及引物。多核苷酸可包括一個或多個經修飾之核苷酸，如甲基化核苷酸或核苷酸類似物。若存在，則對核苷酸結構之修飾可在組裝聚合物之前或之後進行。核苷酸序列可間雜有非核苷酸組分。多核苷酸可在聚合後如藉由與標記組分結合來進一步修飾。
如本文所使用，「表現」係指多核苷酸自DNA模板轉錄的過程（如轉錄為mRNA或其他RNA轉錄物）及/或經轉錄mRNA隨後轉譯成肽、多肽或蛋白質的過程。轉錄物及編碼之多肽可統稱為「基因產物」。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，係指任何長度的胺基酸聚合物。聚合物可為線性或支化的，其可包括經修飾胺基酸，且可由非胺基酸間斷。該術語亦包括已修飾之胺基酸聚合物；該修飾例如藉由二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作，如與標記成分的綴合來進行。如本文所用的，術語「胺基酸」包含天然及/或非天然或合成之胺基酸，包含甘胺酸及D或L光學異構體兩者，以及胺基酸類似物及肽模擬物。
「酶活性」或簡稱「活性」廣義上係指酶促活性，包含但不限於酶之活性、酶之量或酶催化反應之可用性。因此，「增加」酶活性包含增加酶之活性、增加酶之量或增加酶催化反應之可用性。類似地，「降低」酶活性包含降低酶之活性、降低酶之量或降低酶催化反應之可用性。
「突變的」係指與本公開之微生物所衍生的野生型或親本微生物相比，在本公開之微生物中已進行修飾的核酸或蛋白質。在一個實施例中，突變可為編碼酶之基因中的缺失、插入或取代。在另一個實施例中，突變可為酶中一個或多個胺基酸的缺失、插入或取代。
「破壞的基因」係指以某種方式經修飾以減少或消除基因表現、基因調節活性或經編碼蛋白或酶活性的基因。破壞可部分滅活、完全滅活或刪除基因或酶。破壞可為完全消除基因、蛋白質或酶的表現或活性的敲除（KO）突變。破壞亦可能為降低但不完全消除基因、蛋白質或酶的表現或活性的敲除。破壞可為減少、阻止或阻斷由酶產生之產物的生物合成的任何東西。破壞可包含例如編碼蛋白質或酶之基因中的突變、參與編碼酶之基因表現的基因調節元件中的突變、引入產生降低或抑制酶活性之蛋白質的核酸、或引入抑制蛋白質或酶表現的核酸（例如，反義核RNA、RNAi、TALEN、siRNA、CRISPR或CRISPRi）或蛋白質。可使用本領域已知之任何方法引入破壞。為了實現本公開之目的，破壞係實驗室產生的，而非自然發生的。
「親本微生物」為用於生成本公開之微生物的微生物。親本微生物可為天然存在之微生物（即，野生型微生物）或先前已經修飾之微生物（即，突變或重組微生物）。本公開之微生物可經修飾以表現或過表現在親本微生物中未表現或過表現的一種或多種酶。類似地，本公開之微生物可經修飾以含有親本微生物所不含的一個或多個基因。本公開之微生物亦可經修飾以不表現或表現在親本微生物中表現的較低量的一種或多種酶。
本公開之微生物可衍生自基本上任何親本微生物。在一個實施例中，本公開之微生物可衍生自選自由以下組成之群組的親本微生物：丙酮丁醇梭菌（ Clostridium acetobutylicum）、貝氏梭菌（ Clostridium beijerinckii）、大腸桿菌（ Escherichia coli）及釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）。在其他實施例中，微生物衍生自親本微生物，該親本微生物選自由以下組成之群組：伍氏醋酸桿菌、巴氏嗜鹼菌、生產布勞特氏菌、食甲基丁酸桿菌、醋酸梭菌、產乙醇梭菌、食一氧化碳梭菌、克氏梭菌、德可氏梭菌、蟻酸醋酸梭菌、永達爾梭菌、馬氏梭菌、拉氏梭菌、糞味梭菌、黏液真桿菌、熱自養穆爾氏菌、熱醋穆爾氏菌、普氏產醋桿菌、卵形鼠孢菌、森林土壤醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌及凱伍熱厭氧桿菌。在一較佳實施例中，親本微生物為產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌。在一個特別較佳實施例中，親本微生物為產乙醇梭菌LZ1561，該產乙醇梭菌於2010年6月7日根據《布達佩斯條約（Budapest Treaty）》的條款於2010年6月7日保藏在德國布倫瑞克省D-38124 Inhoffenstraße 7B的Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSMZ），且登錄號為DSM23693。此菌株在國際專利申請第PCT/NZ2011/000144號中進行了描述，該國際專利申請以WO 2012/015317公開。
術語「衍生自」表示核酸、蛋白質或微生物自不同之（如親本或野生型）核酸、蛋白質或微生物修飾或改造，從而產生新的核酸、蛋白質或微生物。此類修飾或改編通常包含核酸或基因的插入、缺失、突變或取代。通常，本公開之微生物衍生自親本微生物。在一個實施方案中，本公開之微生物衍生自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌。在較佳實施例中，本公開之微生物衍生自產乙醇梭菌LZ1561，其保藏在DSMZ登錄號DSM23693下。
本公開之微生物可基於功能特性進一步分類。例如，本公開之微生物可為或可衍生自C1固定型微生物、厭氧菌、產乙酸菌、產乙醇菌（ethanologen）、一氧化碳營養菌（carboxydotroph）及/或甲烷氧化菌。
表1提供了微生物的代表性列表並標識了其功能特性。
表 1 伍德-永達爾 C1固定型 厭氧菌 產乙酸菌 產乙醇菌 自養菌 一氧化碳營養菌
伍氏醋酸桿菌 + + + + +/ - 1 + -
巴氏嗜鹼菌 + + + + + + +
生產布勞特氏菌 + + + + - + +
食甲基丁酸桿菌 + + + + + + +
醋酸梭菌 + + + + - + +
產乙醇梭菌 + + + + + + +
食一氧化碳梭菌 + + + + + + +
克氏梭菌 + + + + + + +
德可氏梭菌 + + + + - + +
蟻酸醋酸梭菌 + + + + - + +
永達爾梭菌 + + + + + + +
馬氏梭菌 + + + + - + +/ - 2
拉氏梭菌 + + + + + + +
糞味梭菌 + + + + - + +
黏液真桿菌 + + + + - + +
熱自養穆爾氏菌 + + + + + + +
熱醋穆爾氏菌（先前稱為熱醋酸梭菌（ Clostridium thermoaceticum）） + + + + - 3 + +
普氏產醋桿菌 + + + + - + +
卵形鼠孢菌 + + + + - + +/ - 4
森林土壤醋酸鼠孢菌 + + + + - + +/ - 5
球形鼠孢菌 + + + + - + +/ - 6
凱伍熱厭氧菌（ Thermoanaerobacter kivui ） + + + + - + -
1 伍氏醋酸桿菌可由果糖產生乙醇，但不能由氣體產生乙醇。
2 尚未研究馬氏梭菌是否可依靠CO生長。
3 已報告，熱醋穆爾氏菌中之一種菌株穆爾氏菌HUC22-1自氣體中產生乙醇。
4 尚未研究卵形鼠孢菌是否可依靠CO生長。
5 尚未研究森林土壤醋酸鼠孢菌是否可依靠CO生長。
6 尚未研究卵形鼠孢菌是否可依靠CO生長。
「伍德-永達爾」係指碳固定的伍德-永達爾路徑，如例如由Ragsdale, 《生物化學與生物物理學報（Biochim Biophys Acta）》, 1784: 1873-1898, 2008所描述的。「伍德-永達爾微生物」可預見地指代含有伍德-永達爾路徑之微生物。一般而言，本公開之微生物含有天然伍德-永達爾路徑。在本文中，伍德-永達爾路徑可為天然的未經修飾之伍德-永達爾路徑，或者該伍德-永達爾路徑可為有一定程度之基因修飾（例如，過表現、異源表現、敲除等）的伍德-永達爾路徑，只要該伍德-永達爾路徑仍然起作用以將CO、CO 2及/或H 2轉化為乙醯輔酶A即可。
「C1」指一個碳分子，例如CO、CO 2、CH 4或CH 3OH。「C1含氧化合物」係指亦包括至少一個氧原子之單碳分子，例如CO、CO 2或CH 3OH。「C1碳源」係指充當本公開微生物之部分或唯一碳源的單碳分子。例如，C1碳源可包括以下中之一種或多種：CO、CO 2、CH 4、CH 3OH或CH 2O 2。較佳地，C1碳源包括CO及CO 2中之一種或兩種。「C1固定型微生物」係指具有由C1碳源產生一種或多種產物之能力的微生物。本公開之微生物通常為C1固定型細菌。在一較佳實施例中，本公開之微生物衍生自表1中標識之C1固定型微生物。
「厭氧菌」為不需要氧氣即可生長之微生物。若氧氣超過某一閾值存在，則厭氧菌可能會產生不良反應或甚至死亡。然而，一些厭氧菌能夠耐受低水平的氧（例如，0.000001-5%的氧），有時稱為「微氧條件」。通常，本公開之微生物為厭氧菌。在一較佳實施例中，本公開之微生物衍生自表1中標識之厭氧菌。
「產乙酸菌」為使用伍德-永達爾路徑作為其能量守恆及合成乙醯輔酶A以及乙醯輔酶A衍生產物（如乙酸酯）之主要機制的絕對厭氧細菌（Ragsdale, 《生物化學與生物物理學學報》, 1784: 1873-1898, 2008）。具體而言，產乙酸菌使伍德-永達爾路徑作為（1）用於自CO 2還原合成乙醯輔酶A之機制，（2）最終電子接收、能量保存過程，（3）在細胞碳之合成中固定（同化）CO 2的機制（Drake, 「產乙酸原核生物（Acetogenic Prokaryotes）」，見：《原核生物（The Prokaryotes）》, 第3版, 第354頁, 紐約州紐約（New York, NY）, 2006）。所有天然存在之產乙酸菌均為C1固定型、厭氧型、自養型及非甲烷氧化型。通常，本公開之微生物為產乙酸菌。在一較佳實施例中，本公開之微生物衍生自表1中標識之產乙酸菌。
「產乙醇菌」為產生或能夠產生乙醇之微生物。通常，本公開之微生物為產乙醇菌。在一較佳實施例中，本公開之微生物衍生自表1中標識之產乙醇菌。
「自養菌」為能夠在不存在有機碳的情況下生長之微生物。相反，自養菌使用無機碳源，如CO及/或CO 2。通常，本公開之微生物為自養菌。在一較佳實施例中，本公開之微生物衍生自表1中標識之自養菌。
「一氧化碳營養菌」為能夠利用CO作為碳及能量之唯一來源的微生物。通常，本公開之微生物為一氧化碳營養菌。在一較佳實施例中，本公開之微生物衍生自表1中標識之一氧化碳營養菌。
「甲烷氧化菌」為能夠利用甲烷作為碳及能量之唯一來源的微生物。在某些實施例中，本公開之微生物為甲烷氧化菌或衍生自甲烷氧化菌。在其他實施例中，本公開之微生物並非甲烷氧化菌或不衍生自甲烷氧化菌。
在一較佳實施例中，本公開之微生物衍生自包括物種產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌的梭菌簇。此等物種最初由Abrini, 《微生物學文獻集（ Arch Microbiol）》, 161: 345-351, 1994（產乙醇梭菌）；Tanner, 《國際系統細菌學雜誌（ Int J System Bacteriol）》, 43: 232-236, 1993（永達爾梭菌）；以及Huhnke, WO 2008/028055（拉氏梭菌）報導及表徵。
此三個物種有許多相似之處。具體地說，此等物種均為梭狀芽胞桿菌屬之C1固定型、厭氧型、產乙酸型、產乙醇型及羧基營養型成員。此等物種具有相似之基因型及表型以及相似之能量保存及醱酵代謝模式。此外，此等物種簇集於16S rRNA DNA超過99%相同之梭菌rRNA同源組I中，具有約22-30 mol%之DNA G+C含量，係革蘭氏陽性的，具有相似形態及大小（對數生長期細胞介於0.5-0.7 × 3-5 μm之間），係嗜溫性的（在30-37℃下生長最佳），具有約4-7.5之相似pH範圍（最佳pH為約5.5-6），缺乏細胞色素，且經由Rnf複合體保存能量。另外，在此等物種中已證明羧酸還原為其對應之醇（Perez, 《生物技術與生物工程（ Biotechnol Bioeng）》, 110:1066-1077, 2012）。重要的是，此等物種亦均示出依靠含CO氣體之強自養性生長，產生乙醇及乙酸鹽（或醋酸）作為主要醱酵產物，且在一定條件下產生少量之2,3-丁二醇及乳酸。
然而，此三種物種亦有許多不同之處。此等物種分離自不同之來源：來自兔腸道中之產乙醇梭菌、來自雞場廢物中之揚氏梭菌及來自淡水沈積物中之拉氏梭菌。此等物種之不同在於各種糖（例如，鼠李糖、阿拉伯糖）、酸（例如，葡萄糖酸、檸檬酸鹽）、胺基酸（例如，精胺酸、組胺酸）及其他受質（例如，甜菜鹼、丁醇）的利用。此外，此等物種之不同在於某些維生素（例如硫胺、生物素）營養缺陷。此等物種在伍德-永達爾路徑基因及蛋白質之核酸及胺基酸序列上存在差異，不過已發現所有物種中之此等基因及蛋白質的一般結構及數量相同（Köpke, 《生物技術最新觀點（ Curr Opin Biotechnol）》, 22: 320-325, 2011）。
因此，總之，產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌之多種特性並不對此等物種具有特異性，但梭狀芽胞桿菌屬之C1固定型、厭氧型、產乙酸型、產乙醇型及羧基營養型成員的此簇的一般特性卻對此等物種具有特異性。然而，由於此等物種實際上係不同的，所以此等物種之一的基因修飾或操縱在此等物種的另一種中可能不具有相同的作用。舉例而言，可觀察到生長、性能或產物產生之不同。
本公開之微生物亦可衍生自產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌的分離株或突變體。產乙醇梭菌的分離株及突變體包含JA1-1（DSM10061）（Abrini, 《微生物學文獻集》, 161: 345-351, 1994）、LBS1560（DSM19630）（WO 2009/064200）及LZ1561（DSM23693）（WO 2012/015317）。永達爾梭菌的分離物及突變體包含ATCC 49587（Tanner, 《國際系統細菌學雜誌（ Int J Syst Bacteriol）》, 43: 第232-236頁, 1993）、PETCT（DSM13528，ATCC 55383）、ERI‐2（ATCC 55380）（US 5,593,886）、C‐01（ATCC 55988）（US 6,368,819）、O‐52（ATCC 55989）（US 6,368,819）及OTA‐1（Tirado-Acevedo, 《使用永達爾梭菌由合成氣體產生生物乙醇（Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii）》, 北卡羅萊納州立大學博士論文（PhD thesis, North Carolina State University）, 2010）。拉氏梭菌的分離株及突變體包含PI 1（ATCC BAA-622、ATCC PTA-7826）（WO 2008/028055）。
然而，如上所述，本公開之微生物亦可衍生自基本上任何親本微生物，如選自由以下組成之群組的親本微生物：丙酮丁醇梭菌、貝氏梭菌、大腸桿菌及釀酒酵母。
本公開提供了能夠產生乙二醇、乙醛酸鹽及乙醇酸鹽之微生物以及產生乙二醇、乙醛酸鹽及乙醇酸鹽之方法，該方法包括在存在受質的情況下培養本公開之微生物，由此該微生物產生乙二醇。
本公開之微生物可包括將乙醯輔酶A（如藉由伍德-永達爾路徑徑產生的乙醯輔酶A）轉化為丙酮酸鹽（圖1的反應1）之酶。此酶可為丙酮酸合酶（PFOR）[1.2.7.1]或ATP:丙酮酸正磷酸磷酸轉移酶[1.2.7.1]。在一些實施例中，將乙醯輔酶A轉化為丙酮酸鹽之酶為內源酶。
本公開之微生物可包括將丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽（圖1的反應2）之酶。此酶可能為丙酮酸鹽:二氧化碳連接酶[ADP-形成][6.4.1.1]。在一些實施例中，將丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶為內源酶。在一些實施例中，將丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶過表現。
本公開之微生物可包括將草醯乙酸鹽轉化為檸檬醯輔酶A（圖1的反應3）之酶。此酶可為檸檬醯輔酶A裂解酶[4.1.3.34]。在一些實施例中，將草醯乙酸鹽轉化為檸檬醯輔酶A之酶為內源酶。
本公開之微生物可包括將檸檬醯輔酶A轉化為檸檬酸鹽（圖1的反應4）之酶。此酶可為檸檬酸輔酶A轉移酶[2.8.3.10]。在一些實施例中，將檸檬醯輔酶A轉化為檸檬酸鹽之酶為內源酶。
本公開之微生物可包括將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽（圖1的反應5）之酶。此酶可為檸檬酸[Si]-合酶[2.3.3.1]、ATP檸檬酸合酶[2.3.3.8]或檸檬酸(Re)-合酶[2.3.3.3]。在一些實施例中，將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽之酶為內源酶。在其他實施例中，將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽之酶為異源酶。例如，在一些實施例中，本公開之微生物包括來自枯草芽孢桿菌（ B. subtilis）的檸檬酸合酶1 [EC 2.3.3.16]，使得該微生物包括SEQ ID NO: 1中所示的編碼SEQ ID NO: 2中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自科氏梭菌（ C. kluyveri）的檸檬酸(Re)-合酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 3中所示的編碼SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自梭菌（ Clostridium sp.）的檸檬酸(Si)-合酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 5中所示的編碼SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自枯草芽孢桿菌的檸檬酸合酶2，使得該微生物包括SEQ ID NO: 7中所示的編碼SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽之酶過表現。
本公開之微生物可包括將檸檬酸鹽轉化為烏頭酸鹽且將烏頭酸鹽轉化為異檸檬酸鹽（圖1的反應6）之酶。此酶可能為烏頭酸水合酶[4.2.1.3]。在一些實施例中，將檸檬酸鹽轉化為烏頭酸鹽且將烏頭酸鹽轉化為異檸檬酸鹽之酶為內源酶。在一些實施例中，將檸檬酸鹽轉化為烏頭酸鹽且將烏頭酸鹽轉化為異檸檬酸鹽之酶過表現。
本公開之微生物可包括將異檸檬酸鹽轉化為乙醛酸鹽（圖1的反應7）之酶。此酶可為異檸檬酸裂解酶[4.1.3.1]。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自玉米黍的異檸檬酸裂解酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 9中所示的編碼SEQ ID NO: 10中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自大腸桿菌的異檸檬酸裂解酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 11中所示的編碼SEQ ID NO: 12中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中：
本公開之微生物可包括將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽（圖1的反應8）之酶。此酶可為甘油酸脫氫酶[1.1.1.29]、乙醛酸還原酶[1.1.1.26/79]或乙醇酸脫氫酶[1.1.99.14]。在一些實施例中，將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽之酶為內源酶。在一些實施例中，將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽之酶過表現。
本公開之微生物可包括將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛（圖1的反應9）之酶。此酶可為乙醇醛脫氫酶[1.2.1.21]、乳醛脫氫酶[1.2.1.22]、琥珀酸-半醛脫氫酶[1.2.1.24]、2,5-二氧戊酸脫氫酶[1.2.1.26]、醛脫氫酶[1.2.1.3/4/5]、甜菜鹼-醛脫氫酶[1.2.1.8]或醛鐵氧還蛋白氧化還原酶[1.2.7.5]。在一些實施例中，將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之酶為內源酶。在其他實施例中，將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之酶為異源酶。例如，在一些實施例中，本公開之微生物包括來自大腸桿菌的γ-氨基丁醛脫氫酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 49中所示的編碼SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自大腸桿菌的醛脫氫酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 51中所示的編碼SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自大腸桿菌的NADP依賴性琥珀酸-半醛脫氫酶I，使得該微生物包括SEQ ID NO: 53中所示的編碼SEQ ID NO: 54中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自氧化葡萄糖酸桿菌（ G. oxydans）的乳醛脫氫酶/乙醇醛脫氫酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 55中所示的編碼SEQ ID NO: 56中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自螢光假單胞菌的醛脫氫酶A，使得該微生物包括SEQ ID NO: 57或SEQ ID NO: 59中所示的分別編碼SEQ ID NO: 58或SEQ ID NO: 60中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之酶的額外非限制性實例可在GenBank登錄號WP_003202098、WP_003182567、ACT39044、ACT39074、WP_041112005及ACT40170中找到。在一些實施例中，將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之酶過表現。
本公開之微生物可包括將乙醇醛轉化為乙二醇（圖1的反應10）之酶。此酶可為乳醛還原酶[1.1.1.77]、醇脫氫酶[1.1.1.1]、醇脫氫酶（NADP+）[1.1.1.2]、甘油脫氫酶[1.1.1.72]、甘油-3-磷酸脫氫酶[1.1.1.8]或醛還原酶[1.1.1.21]。在一些實施例中，將乙醇醛轉化為乙二醇之酶為內源酶。在一些實施例中，將乙醇醛轉化為乙二醇之內源酶過表現。在其他實施例中，將乙醇醛轉化為乙二醇之酶為異源酶。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自糖產丁醇丙酮梭菌（ C. saccharoperbutylacetonicum）的乳醛還原酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 61中所示的編碼SEQ ID NO: 62中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自永達爾梭菌的乳醛還原酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 63中所示的編碼SEQ ID NO: 64中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自大腸桿菌的乳醛還原酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 65中所示的編碼SEQ ID NO: 66中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自貝氏梭菌的乳醛還原酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 67中所示的編碼SEQ ID NO: 68中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，將乙醇醛轉化為乙二醇之內源酶過表現。
本公開之微生物可包括將丙酮酸鹽轉化為蘋果酸鹽（圖1的反應11）之酶。此酶可為蘋果酸脫氫酶[1.1.1.37]、蘋果酸脫氫酶（草醯乙酸鹽脫羧）[1.1.1.38]、蘋果酸脫氫酶（脫羧）[1.1.1.39]、蘋果酸脫氫酶（草醯乙酸脫羧）（NADP+）[1.1.1.40]、蘋果酸脫氫酶（NADP+）[1.1.1.82]、D-蘋果酸脫氫酶（脫羧）[1.1.1.83]、二甲基蘋果酸脫氫酶[1.1.1.84]、3-異丙基蘋果酸脫氫酶[1.1.1.85]、蘋果酸脫氫酶[NAD(P)+] [1.1.1.299]或蘋果酸脫氫酶（醌）[1.1.5.4]。在一些實施例中，將丙酮酸鹽轉化為蘋果酸鹽之酶為內源酶。在其他實施例中，將丙酮酸鹽轉化為蘋果酸鹽之酶為異源酶。例如，在一些實施例中，本公開之微生物包括來自產乙醇梭菌的蘋果酸脫氫酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 23中所示的編碼SEQ ID NO: 24中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自產乙醇梭菌的NAD依賴性蘋果酸酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 25中所示的編碼SEQ ID NO: 26中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。
本公開之微生物可包括將蘋果酸鹽轉化為乙醛酸鹽（圖1的反應12）之酶。此酶可為蘋果酸合酶[2.3.3.9]或異檸檬酸裂解酶[4.1.3.1]。在一些實施例中，將蘋果酸鹽轉化為乙醛酸鹽之酶為異源酶。例如，在一些實施例中，本公開之微生物包括來自芽孢八疊球菌（ Sporosarcina sp.）的蘋果酸合酶G，使得該微生物包括SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 33中所示的分別編碼SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 34中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自芽孢桿菌（ Bacillus sp.）的蘋果酸合酶G，使得該微生物包括SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 35中所示的分別編碼SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 36中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自天藍色鏈黴菌（ S. coelicolor）的蘋果酸合酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 31中所示的編碼SEQ ID NO: 32中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自嬰兒芽孢桿菌（ B. infantis）的蘋果酸合酶G，使得該微生物包括SEQ ID NO: 37中所示的編碼SEQ ID NO: 38中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自匙形梭菌（ C. cochlearium）的蘋果酸合酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 39中所示的編碼SEQ ID NO: 40中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自巨大芽孢桿菌（ B. megaterium）的蘋果酸合酶G，使得該微生物包括SEQ ID NO: 41中所示的編碼SEQ ID NO: 42中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自類芽孢桿菌（ Paenibacillus sp.）的蘋果酸合酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 43中所示的編碼SEQ ID NO: 44中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自離胺酸芽孢桿菌（ Lysinibacillus sp.）的蘋果酸合酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 45中所示的編碼SEQ ID NO: 46中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自蠟樣芽孢桿菌（ B. cereus）的蘋果酸合酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 47中所示的編碼SEQ ID NO: 48中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。
本公開之微生物可包括將丙酮酸鹽轉化為磷酸烯醇丙酮酸鹽（圖1的反應13）之酶。此酶可為丙酮酸激酶[2.7.1.40]、丙酮酸磷酸二激酶[2.7.9.1]或丙酮酸水二激酶[2.7.9.2]。在一些實施例中，將丙酮酸鹽轉化為磷酸烯醇丙酮酸鹽之酶為內源酶。
本公開之微生物可包括將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為2-磷酸-D-甘油酸鹽（圖1的反應14）之酶。此酶可為磷酸丙酮酸水合酶[4.2.1.11]。在一些實施例中，將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為2-磷酸-D-甘油酸鹽之酶為內源酶。
本公開之微生物可包括將2-磷酸-D-甘油酸鹽轉化為3-磷酸-D-甘油酸鹽（圖1的反應15）之酶。此酶可為磷酸甘油酸變位酶[5.4.2.11/12]。在一些實施例中，將2-磷酸-D-甘油酸鹽轉化為3-磷酸-D-甘油酸鹽之酶為內源酶。
本公開之微生物可包括將3-磷酸-D-甘油酸鹽轉化為3-膦醯氧基丙酮酸鹽（圖1的反應16）之酶。此酶可為磷酸甘油酸脫氫酶[1.1.1.95]。在一些實施例中，將3-磷酸-D-甘油酸鹽轉化為3-膦醯氧基丙酮酸鹽之酶為內源酶。
本公開之微生物可包括將3-膦醯氧基丙酮酸鹽轉化為3-磷酸-L-絲胺酸（圖1的反應17）之酶。此酶可為磷酸絲胺酸轉氨酶[2.6.1.52]。在一些實施例中，將3-膦醯氧基丙酮酸鹽轉化為3-磷酸-L-絲胺酸之酶為內源酶。
本公開之微生物可包括將3-磷酸-L-絲胺酸轉化為絲胺酸（圖1的反應18）之酶。此酶可為磷酸絲胺酸磷酸酶[3.1.3.3]。在一些實施例中，將3-磷酸-L-絲胺酸轉化為絲胺酸之酶為內源酶。
本公開之微生物可包括將絲胺酸轉化為甘胺酸（圖1的反應19）之酶。此酶可為甘胺酸羥甲基轉移酶[2.1.2.1]。在一些實施例中，將絲胺酸轉化為甘胺酸之酶為內源酶。在一些實施例中，將絲胺酸轉化為甘胺酸之酶過表現。
本公開之微生物可包括將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽（圖1的反應20）之酶。此酶可為丙胺酸-乙醛酸氨基轉移酶/轉氨酶[2.6.1.44]、絲胺酸-乙醛酸氨基轉移酶/轉氨酶[2.6.1.45]、絲胺酸-丙酮酸氨基轉移酶/轉氨酶[2.6.1.51]、甘胺酸-草醯乙酸氨基轉移酶/轉氨酶[2.6.1.35]、甘胺酸轉氨酶[2.6.1.4]、甘胺酸脫氫酶[1.4.1.10]、丙胺酸脫氫酶[1.4.1.1]或甘胺酸脫氫酶[1.4.2.1]。在一些實施例中，將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽之酶為內源酶。在其他實施例中，將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽之酶為異源酶。例如，在一些實施例中，本公開之微生物包括來自嗜甲基生絲微菌（ H. methylovorum）的絲胺酸-乙醛酸氨基轉移酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 13中所示的編碼SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自硫牛磺酸棲沈積物菌（ S. thiotaurini）的丙胺酸-乙醛酸氨基轉移酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 15中所示的編碼SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自溫浴嗜熱硫桿菌（ T. tepidarius）的丙胺酸-乙醛酸氨基轉移酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 17中所示的編碼SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自尿酸梭菌（ C. acidurici）的V類氨基轉移酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 19中所示的編碼SEQ ID NO: 20中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，本公開之微生物包括來自海棲熱袍菌（ T. maritima）的絲胺酸-丙酮酸氨基轉移酶，使得該微生物包括SEQ ID NO: 21中所示的編碼SEQ ID NO: 22中所示之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽之酶過表現。
本公開之微生物可包括將絲胺酸轉化為羥基丙酮酸鹽（圖1的反應21）之酶。此酶可為絲胺酸-丙酮酸轉氨酶[2.6.1.51]、絲胺酸-乙醛酸轉氨酶[2.6.1.45]、丙胺酸脫氫酶[1.4.1.1]、L-胺基酸脫氫酶[1.4.1.5]、絲胺酸2-脫氫酶[1.4.1.7]、丙胺酸轉氨酶[2.6.1.2]、麩胺醯胺-丙酮酸轉氨酶[2.6.1.15]、D-胺基酸轉氨酶[2.6.1.21]、丙胺酸-乙醛酸轉氨酶[2.6.1.44]或絲胺酸-丙酮酸轉氨酶[2.6.1.51]。在一些實施例中，將絲胺酸轉化為羥基丙酮酸鹽之酶為內源酶。在其他實施例中，將絲胺酸轉化為羥基丙酮酸鹽之酶為異源酶。能夠將絲胺酸轉化為羥基丙酮酸鹽之酶的非限制性實例可在GenBank登錄號WP_009989311及NP_511062.1中找到。在一些實施例中，將絲胺酸轉化為羥基丙酮酸鹽之酶過表現。
本公開之微生物可包括將羥基丙酮酸鹽轉化為乙醇醛（圖1的反應22）之酶。此酶可為羥基丙酮酸脫羧酶[4.1.1.40]或丙酮酸脫羧酶[4.1.1.1]。此酶亦可為任何其他脫羧酶[4.1.1.-]。在一些實施例中，將羥基丙酮酸鹽轉化為乙醇醛之酶為異源酶。能夠將羥基丙酮酸鹽轉化為乙醇醛之酶的非限制性實例可在GenBank登錄號CCG28866、SVF98953、PA0096、CAA54522、KRU13460及KLA26356中找到。
本公開之微生物可包括將D-甘油酸鹽轉化為羥基丙酮酸鹽（圖1的反應23）之酶。此酶可為乙醛酸還原酶[EC 1.1.1.26]、甘油酸脫氫酶[EC 1.1.1.29]或羥丙酮酸還原酶[EC 1.1.1.81]。在一些實施例中，將D-甘油酸鹽轉化為羥基丙酮酸鹽之酶為異源酶。能夠將D-甘油酸鹽轉化為羥基丙酮酸鹽之酶的非限制性實例可在GenBank登錄號SUK16841、RPK22618、KPA02240、AGW90762、CAC11987、Q9CA90及Q9UBQ7中找到。
本公開之微生物可包括將5,10-亞甲基四氫葉酸鹽轉化為甘胺酸（圖1的反應24）之酶的複合物。5,10-亞甲基四氫葉酸鹽為伍德-永達爾路徑之還原分支中的輔因子，且在乙醯輔酶A之產生中充當支架。此複合物可為包括甘胺酸脫氫酶[1.4.4.2]、二氫脂醯脫氫酶[1.8.1.4]及氨基甲基轉移酶（甘胺酸合酶）[2.1.2.10]的甘胺酸切割系統。在一些實施例中，複合物的將5,10-亞甲基四氫葉酸鹽轉化為甘胺酸之酶為內源酶。在一些實施例中，甘胺酸切割系統之酶過表現。
本公開之微生物可包括將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽（圖1的反應25）之酶。此酶可為磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（ATP）[4.1.1.49]或（GTP）[4.1.1.32]。在一些實施例中，將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶為內源酶。在其他實施例中，將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶為異源酶。在一些實施例中，將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶過表現。
在一些實施例中，包括將乙醯輔酶A轉化為丙酮酸鹽（圖1的反應1）之酶、將丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽（圖1的反應2）之酶、將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽（圖1的反應5）之酶、將檸檬酸鹽轉化為烏頭酸鹽且將烏頭酸鹽轉化為異檸檬酸鹽（圖1的反應6）之酶、將異檸檬酸鹽轉化為乙醛酸鹽（圖1的反應7）之酶、將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽（圖1的反應8）之酶、將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛（圖1的反應9）之酶以及將乙醇醛轉化為乙二醇（圖1的反應10）之酶的微生物產生乙二醇。在一非限制性實例中，將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽之酶可為來自枯草芽孢桿菌（SEQ ID NO: 1-2）的檸檬酸合酶。在一非限制性實例中，將異檸檬酸鹽轉化為乙醛酸鹽之酶可為來自大腸桿菌（SEQ ID NO: 11-12）的異檸檬酸裂解酶。在一非限制性實例中，將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之酶可為來自氧化葡萄糖酸桿菌（SEQ ID NO: 55-56）的乙醇醛脫氫酶或來自螢光假單胞菌（SEQ ID NO: 57-58）的醛脫氫酶。催化如圖1所示之反應2、5、6、8、9及10的酶中之一種或多種酶可過表現。參見例如實例1及圖3B。
在一些實施例中，包括將乙醯輔酶A轉化為丙酮酸鹽（圖1的反應1）之酶、將丙酮酸鹽轉化為磷酸烯醇丙酮酸鹽（圖1的反應13）之酶、將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為2-磷酸-D-甘油酸鹽（圖1的反應14）之酶、將2-磷酸-D-甘油酸鹽轉化為3-磷酸-D-甘油酸鹽（圖1的反應15）之酶、將3-磷酸-D-甘油酸鹽轉化為3-膦醯氧基丙酮酸鹽（圖1的反應16）之酶、將3-膦醯氧基丙酮酸鹽轉化為3-磷酸-L-絲胺酸（圖1的反應17）之酶、將3-磷酸-L-絲胺酸轉化為絲胺酸（圖1的反應18）之酶、將絲胺酸轉化為甘胺酸（圖1的反應19）之酶、將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽（圖1的反應20）之酶、將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽（圖1的反應8）之酶、將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛（圖1的反應9）之酶以及將乙醇醛轉化為乙二醇（圖1的反應10）之酶的微生物產生乙二醇。在一非限制性實例中，將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽之酶可為來自硫牛磺酸棲沈積物菌（SEQ ID NO: 15-16）的丙胺酸-乙醛酸氨基轉移酶或來自尿酸梭菌（SEQ ID NO: 19-20）的V類氨基轉移酶。在一非限制性實例中，將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之酶可為來自氧化葡萄糖酸桿菌（SEQ ID NO: 55-56）的乙醇醛脫氫酶或來自螢光假單胞菌（SEQ ID NO: 57-58）的醛脫氫酶。催化如圖1所示之步驟19、20、8、9及10的反應的酶中之一種或多種酶可過表現。參見例如實例2-4及圖4B、5B及6B。
在一些實施例中，包括將乙醯輔酶A轉化為丙酮酸鹽（圖1的反應1）之酶、將丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽（圖1的反應2）之酶、將草醯乙酸鹽轉化為檸檬醯輔酶A（圖1的反應3）之酶、將檸檬醯輔酶A轉化為檸檬酸鹽（圖1的反應4）之酶、將檸檬酸鹽轉化為烏頭酸鹽且將烏頭酸鹽轉化為異檸檬酸鹽（圖1的反應6）之酶、將異檸檬酸鹽轉化為乙醛酸鹽（圖1的反應7）之酶、將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽（圖1的反應8）之酶、將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛（圖1的反應9）之酶以及將乙醇醛轉化為乙二醇（圖1的反應10）之酶的微生物產生乙二醇。在一非限制性實例中，將異檸檬酸鹽轉化為乙醛酸鹽之酶可為來自大腸桿菌（SEQ ID NO: 11-12）的異檸檬酸裂解酶。在一非限制性實例中，將異檸檬酸鹽轉化為乙醛酸鹽之酶可為來自大腸桿菌（SEQ ID NO: 11-12）的異檸檬酸裂解酶。在一非限制性實例中，將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之酶可為來自氧化葡萄糖酸桿菌（SEQ ID NO: 55-56）的乙醇醛脫氫酶或來自螢光假單胞菌（SEQ ID NO: 57-58）的醛脫氫酶。催化如圖1所示之反應2、6、8、9及10的酶中之一種或多種酶可過表現。
在一些實施例中，包括將乙醯輔酶A轉化為丙酮酸鹽（圖1的反應1）之酶、將丙酮酸鹽轉化為蘋果酸鹽（圖1的反應11）之酶、將蘋果酸鹽轉化為乙醛酸鹽（圖1的反應12）之酶、將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽（圖1的反應8）之酶、將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛（圖1的反應9）之酶及將乙醇醛轉化為乙二醇（圖1的反應10）之酶的微生物產生乙二醇。在一非限制性實例中，將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之酶可為來自氧化葡萄糖酸桿菌（SEQ ID NO: 55-56）的乙醇醛脫氫酶或來自螢光假單胞菌（SEQ ID NO: 57-58）的醛脫氫酶。催化如圖1所示之步驟8、9及10的反應的酶中之一種或多種酶可過表現。
在一些實施例中，包括將5,10-亞甲基四氫葉酸鹽轉化為甘胺酸（圖1的反應24）之酶、將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽（圖1的反應20）之酶、將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽（圖1的反應8）之酶、將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛（圖1的反應9）之酶及將乙醇醛轉化為乙二醇（圖1的反應10）之酶的酶複合物的微生物產生乙二醇。在一非限制性實例中，將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽之酶可為來自硫牛磺酸棲沈積物菌（SEQ ID NO: 15-16）的丙胺酸-乙醛酸氨基轉移酶或來自尿酸梭菌（SEQ ID NO: 19-20）的V類氨基轉移酶。在一非限制性實例中，將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之酶可為來自氧化葡萄糖酸桿菌（SEQ ID NO: 55-56）的乙醇醛脫氫酶或來自螢光假單胞菌（SEQ ID NO: 57-58）的醛脫氫酶。催化步驟8、9、10、20及24的反應的酶中之一種或多種酶可過表現。
在一些實施例中，包括將乙醯輔酶A轉化為丙酮酸鹽（圖1的反應1）之酶、將丙酮酸鹽轉化為磷酸烯醇丙酮酸鹽（圖1的反應13）之酶、將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽（圖1的反應25）之酶、將草醯乙酸鹽轉化為檸檬醯輔酶A（圖1的反應3）之酶、將檸檬醯輔酶A轉化為檸檬酸鹽（圖1的反應4）之酶、將檸檬酸鹽轉化為烏頭酸鹽且將烏頭酸鹽轉化為異檸檬酸鹽（圖1的反應6）之酶、將異檸檬酸鹽轉化為乙醛酸鹽（圖1的反應7）之酶、將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽（圖1的反應8）之酶、將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛（圖1的反應9）之酶以及將乙醇醛轉化為乙二醇（圖1的反應10）之酶的微生物產生乙二醇。在一非限制性實例中，將異檸檬酸鹽轉化為乙醛酸鹽之酶可為來自大腸桿菌（SEQ ID NO: 11-12）的異檸檬酸裂解酶。在一非限制性實例中，將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之酶可為來自氧化葡萄糖酸桿菌（SEQ ID NO: 55-56）的乙醇醛脫氫酶或來自螢光假單胞菌（SEQ ID NO: 57-58）的醛脫氫酶。催化如圖1所示之反應2、6、8、9、10及25的酶中之一種或多種酶可過表現。
在一些實施例中，包括將乙醯輔酶A轉化為丙酮酸鹽（圖1的反應1）之酶、將丙酮酸鹽轉化為磷酸烯醇丙酮酸鹽（圖1的反應13）之酶、將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽（圖1的反應25）之酶、將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽（圖1的反應5）之酶、將檸檬酸鹽轉化為烏頭酸鹽且將烏頭酸鹽轉化為異檸檬酸鹽（圖1的反應6）之酶、將異檸檬酸鹽轉化為乙醛酸鹽（圖1的反應7）之酶、將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽（圖1的反應8）之酶、將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛（圖1的反應9）之酶以及將乙醇醛轉化為乙二醇（圖1的反應10）之酶的微生物產生乙二醇。在一非限制性實例中，將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽之酶可為來自枯草芽孢桿菌（SEQ ID NO: 1-2）的檸檬酸合酶。在一非限制性實例中，將異檸檬酸鹽轉化為乙醛酸鹽之酶可為來自大腸桿菌（SEQ ID NO: 11-12）的異檸檬酸裂解酶。在一非限制性實例中，將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之酶可為來自氧化葡萄糖酸桿菌（SEQ ID NO: 55-56）的乙醇醛脫氫酶或來自螢光假單胞菌（SEQ ID NO: 57-58）的醛脫氫酶。催化如圖1所示之反應5、6、8、9、10及25的酶中之一種或多種酶可過表現。
在一些實施例中，包括將乙醯輔酶A轉化為丙酮酸鹽（圖1的反應1）之酶、將丙酮酸鹽轉化為磷酸烯醇丙酮酸鹽（圖1的反應13）之酶、將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為2-磷酸-D-甘油酸鹽（圖1的反應14）之酶、將2-磷酸-D-甘油酸鹽轉化為3-磷酸-D-甘油酸鹽（圖1的反應15）之酶、將3-磷酸-D-甘油酸鹽轉化為3-膦醯氧基丙酮酸鹽（圖1的反應16）之酶、將3-膦醯氧基丙酮酸鹽轉化為3-磷酸-L-絲胺酸（圖1的反應17）之酶、將3-磷酸-L-絲胺酸轉化為絲胺酸（圖1的反應18）之酶的微生物包括將絲胺酸轉化為羥基丙酮酸鹽（圖1的反應21）之酶、將羥基丙酮酸鹽轉化為乙醇醛（圖1的反應22）之酶以及將乙醇醛轉化為乙二醇（圖1的反應10）之酶，產生乙二醇。催化乙醇醛轉化為乙二醇之酶可過表現。
在一些實施例中，包括將D-甘油酸鹽轉化為羥基丙酮酸鹽（圖1的反應23）之酶、將羥基丙酮酸鹽轉化為乙醇醛（圖1的反應22）之酶及將乙醇醛轉化為乙二醇（圖1的反應10）之酶的微生物產生乙二醇。催化乙醇醛轉化為乙二醇之酶可過表現。
本公開之酶可經密碼子優化以在本公開之微生物中表現。「密碼子優化」係指核酸，例如基因之突變，用於優化或改良特定菌株或物種中之核酸轉譯。密碼子優化可帶來更快的轉譯速度或更高的轉譯準確性。在一較佳實施例中，本公開之基因經密碼子優化以在本公開之微生物中表現。儘管密碼子優化係指潛在的遺傳序列，但密碼子優化通常會使得轉譯得到改良，且因此提高酶的表現。因此，本公開之酶亦可描述為經密碼子優化的。
本公開之酶中之一種或多種酶可過表現。「過表現」係指與衍生出本公開之微生物的野生型或親本微生物相比本公開之微生物中的核酸或蛋白質的表現增加。過表現可藉由本領域已知之任何手段實現，包含修飾基因拷貝數、基因轉錄速率、基因轉譯速率或酶降解速率。如上所述，催化圖1的反應2、5、6、8、9、10、19、20、24或25的酶中之一種或多種可過表現。
本公開之酶可包括破壞性突變。「破壞性突變」係指減少或消除（即「破壞」）基因或酶的表現或活性的突變。破壞性突變可部分滅活、完全滅活或刪除基因或酶。破壞性突變可為敲除（KO）突變。破壞性突變可為減少、防止或阻斷酶產生之產物的生物合成的任何突變。破壞性突變可包含例如編碼酶之基因中的突變、參與編碼酶之基因表現的基因調節元件中的突變、引入產生降低或抑制酶活性之蛋白質的核酸、或引入抑制蛋白質或酶表現的核酸（例如，反義RNA、siRNA、CRISPR）。破壞性突變可使用本領域已知之任何方法引入。
在一個實施例中，本公開之微生物包括編碼二醇脫水酶之基因中的破壞性突變。
在一些實施例中，本公開之微生物包括異檸檬酸脫氫酶[1.1.1.41]中的破壞性突變。異檸檬酸脫氫酶將異檸檬酸鹽轉化為2-側氧基戊二酸鹽。如藉由缺失異檸檬酸脫氫酶的異檸檬酸脫氫酶破壞使異檸檬酸鹽的水平增加。
在一些實施例中，本公開之微生物包括甘油酸脫氫酶[1.1.1.29]中的破壞性突變。甘油酸脫氫酶將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽。如藉由缺失異檸檬酸脫氫酶的甘油酸脫氫酶破壞使乙醛酸鹽的水平增加。
在一些實施例中，本公開之微生物包括乙醇酸脫氫酶[1.1.99.14]中的破壞性突變。乙醇酸脫氫酶將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽。如藉由缺失乙醇酸脫氫酶的乙醇酸脫氫酶破壞使乙醛酸鹽的水平增加。
在一些實施例中，本公開之微生物包括在醛鐵氧還蛋白氧化還原酶[1.2.7.5]中的破壞性突變。醛鐵氧還蛋白氧化還原酶將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛。如藉由缺失醛鐵氧還蛋白氧化還原酶的醛鐵氧還蛋白氧化還原酶破壞使乙醇酸鹽的水平增加。
在一些實施例中，本公開之微生物包括醛脫氫酶[1.2.1.3/1.2.3.4/1.2.3.5]中的破壞性突變。乙醛脫氫酶將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛。如藉由缺失醛脫氫酶的醛脫氫酶破壞使乙醇酸鹽的水平增加。
破壞性突變之引入導致本公開之微生物不產生目標產物或基本上不產生目標產物，或者與衍生出本公開之微生物的親本微生物相比目標產物的量減少。舉例而言，本公開之微生物可能不產生目標產物，或者可能產生比親本微生物少至少約1%、3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的目標產物。舉例而言，本公開之微生物可能產生小於約0.001、0.01、0.10、0.30、0.50或1.0 g/L的目標產物。
儘管本文提供了酶之示例性序列及來源，但本公開決不侷限於此等序列及來源，本公開還涵蓋變體。術語「變體」包含序列不同於參考核酸及蛋白質序列的核酸及蛋白質，如現有技術中公開的或本文舉例說明的參考核酸及蛋白質序列。本公開可使用執行與參考核酸或蛋白質基本相同之功能的變體核酸或蛋白質實踐。例如，變體蛋白質可進行與參考蛋白質基本上相同之功能或催化與參考蛋白質基本上相同之反應。變體基因可編碼與參考基因相同或基本上相同之蛋白質。變體啟動子可具有與參考啟動子基本上相同之能力來促進一種或多種基因之表現。
此類核酸或蛋白質在本文中可稱為「功能等效變體」。舉例而言，核酸的功能等效變體可包含等位基因變體、基因片段、突變基因、多態性等。來自其他微生物之同源基因亦為功能等效變體的實例。此等基因包含如丙酮丁醇梭菌、貝氏梭菌或永達爾梭菌等物種之同源基因，其詳細信息可在如Genbank或NCBI等網站上公開獲得。功能等效變體亦包含其序列由於特定微生物之密碼子優化而變化的核酸。核酸的功能等效變體與參考的核酸較佳地將具有至少大約70%、大約80%、大約85%、大約90%、大約95%、大約98%或更高的核酸序列同一性（同源性百分比）。蛋白質之功能等效變體與參考之蛋白質較佳地將具有至少大約70%、大約80%、大約85%、大約90%、大約95%、大約98%或更高的胺基酸同一性（同源性百分比）。可使用本領域已知之任何方法評估變體核酸或蛋白質之功能等效性。
「互補性」係指一個核酸藉由傳統沃森-克里克（Watson-Crick）或其他非傳統類型與另一核酸序列形成一個或多個氫鍵的能力。互補性百分比表示核酸分子中能夠與第二個核酸序列形成氫鍵（例如沃森-克里克鹼基配對）之殘基的百分比（例如，10個中有5個、6個、7個、8個、9個、10個為50%、60%、70%、80%、90%及100%互補）。「完全互補」係指核酸序列之所有連續殘基將與第二核酸序列中相同數量的連續殘基氫鍵結合。如本文所用，「基本上互補」係指8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、30個、35個、40個、45個、50個或更多個核苷酸之區結構域內互補程度為至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%，或指在嚴格條件下雜交的兩種核酸。
「雜交」係指其中一個或多個多核苷酸反應形成經由在核苷酸殘基鹼基之間進行氫鍵結合穩定之複合物的反應。氫鍵合可藉由沃森克里克鹼基配對（Watson Crick base pairing）、胡格斯坦結合（Hoogstein binding）或任何其他序列特異性方式發生。複合物可包括形成雙鏈結構之兩條鏈、形成多鏈複合物之三條或多條鏈、單個自雜交鏈或此等的任意組合。雜交反應可構成更廣泛過程（如啟動PCR，或用酶切割多核苷酸）中之一個步驟。能夠與給定序列雜交之序列稱為給定序列之「互補序列」。
可使用本領域已知之任何方法將核酸遞送至公開之微生物。例如，核酸可以裸露之核酸形式遞送，或者可與一種或多種試劑（如脂質體）一起調配。適當時，核酸可為DNA、RNA、cDNA或其組合。在某些實施例中可使用限制性抑制劑。另外的載體可包含質體、病毒、噬菌體、黏粒及人工染色體。在一較佳實施例中，使用質體將核酸遞送至本公開之微生物。舉例而言，轉化（包含轉導或轉染）可藉由電穿孔、超聲波處理、聚乙二醇介導之轉化、化學或天然感受態、原生質體轉化、前噬菌體誘導或綴合來實現。在具有活性限制酶系統之某些實施例中，可能有必要在將核酸引入微生物中之前使核酸甲基化。
此外，可將核酸設計成包括調控元件（如啟動子）以增加或以其他方式控制特定核酸之表現。啟動子可為組成型啟動子或誘導型啟動子。理想地，啟動子為伍德-永達爾路徑啟動子、鐵氧還蛋白啟動子、丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶啟動子、Rnf複合操縱子啟動子、ATP合酶操縱子啟動子或磷酸轉乙醯酶/乙酸激酶操縱子啟動子。
應當理解，本公開可使用其序列與本文具體例示之序列不同的核酸來實施，條件為該等核酸執行基本上相同之功能。對於編碼蛋白質或肽之核酸序列，這意謂經編碼的蛋白質或肽具有基本上相同的功能。對於表示啟動子序列之核酸序列，變體序列將能夠促進一種或多種基因之表現。此類核酸在本文中可稱為「功能等效變體」。舉例而言，核酸之功能等效變體包含等位基因變體、基因之片段、包含突變（缺失、插入、核苷酸取代等）之基因及/或多態性等。來自其他微生物之同源基因亦可視為本文具體例示之序列的功能等效變體的實例。
此等同源基因包含如永達爾梭菌、嗜熱光全綠絲菌（Chloroflexus aurantiacus）、嗜酸熱古菌（Metallosphaera）或硫化葉菌（Sulfolobus）之物種中的同源基因，其詳細信息可在如Genbank或NCBI之網站上公開獲得。短語「功能等效變體」亦應包含其序列由於特定生物體之密碼子優化而變化的核酸。本文之核酸的「功能等效變體」與所標識之核酸將較佳地具有至少大約70%、較佳地大約80%、更佳地大約85%、較佳地大約90%、較佳地大約95%或更高的核酸序列同一性。
亦應當理解，本公開可使用其序列不同於本文具體例示之胺基酸序列的多肽來實施。此等變體在本文中可稱為「功能等效變體」。蛋白質或肽之功能等效變體包含與所標識之蛋白質或肽共享至少40%、較佳地50%、較佳地60%、較佳地70%、較佳地75%、較佳地80%、較佳地85%、較佳地90%、較佳地95%或更高的胺基酸同一性的彼等蛋白質或肽且與所關注之肽或蛋白質具有基本上相同之功能。此類變體在其範圍內包含蛋白質或肽之片段，其中該片段包括截短形式之多肽，其中缺失可為1個至5個、至10個、至15個、至20個、至25個胺基酸，且可在多肽的任一末端自殘基1至25延伸，且其中缺失可為區域內之任何長度；或者可在內部位置。本文之特定多肽的功能等效變體亦應視為包含由其他細菌物種中之同源基因表現的多肽，例如上一段中所例示的。
可使用任何數量的本領域已知的用於產生重組微生物之技術，由親本微生物及一種或多種外源核酸製備本公開之微生物。舉例而言，轉化（包含轉導或轉染）可藉由電穿孔、超聲處理、聚乙二醇介導之轉化、化學或天然感受態或綴合來實現。適合之轉化技術例如在Sambrook J、Fritsch EF、Maniatis T：《分子選殖：實驗室手冊（Molecular Cloning:  A laboratory Manual）》 冷泉港冷泉港出版社（Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour）, 1989中描述。
在某些實施例中，由於在要轉化之微生物中有活性的限制系統，需要將要引入至微生物中之核酸甲基化。這可使用多種技術來完成，包含以下描述之彼等技術，且進一步在下文之實例部分中例示。
舉例而言，在一個實施例中，本公開之重組微生物藉由包括以下步驟之方法產生：將（i）如本文所述的表現構建體/載體的及（ii）包括甲基轉移酶基因的甲基化構建體/載體引入至穿梭微生物（shuttle microorganism）中；表現甲基轉移酶基因；自穿梭微生物中分離一種或多種構建體/載體；以及將一種或多種構建體/載體引入至目的微生物中。
在一個實施例中，步驟B之甲基轉移酶基因組成型地表現。在另一實施例中，步驟B之甲基轉移酶基因的表現受到誘導。
穿梭微生物為促進構成表現構建體/載體之核酸序列甲基化的微生物，較佳地限制陰性微生物。在一具體實施例中，穿梭微生物為限制陰性大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。
甲基化構建體/載體包括編碼甲基轉移酶之核酸序列。
一旦表現構建體/載體及甲基化構建體/載體被引入至穿梭微生物中，存在於甲基化構建體/載體上之甲基轉移酶基因就會受到誘導。誘導可藉由任何適合之啟動子系統進行，但在本公開之一個特定實施例中，甲基化構建體/載體包括誘導型lac啟動子且藉由添加乳糖或其類似物，更佳地異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）來誘導。其他適合之啟動子包含ara、tet或T7系統。在本公開之另外的實施例中，甲基化構建體/載體啟動子為組成型啟動子。
在一具體實施例中，甲基化構建體/載體具有對穿梭微生物之身分有特異性的複製起點，使得甲基化構建體/載體上存在之任何基因在穿梭微生物中進行表現。較佳地，表現構建體/載體具有對目的微生物之身分具有特異性的複製起點，使得表現構建體/載體上存在之任何基因在目的微生物中進行表現。
甲基轉移酶之表現引起表現構建體/載體上存在的基因甲基化。表現構建體/載體然後可根據多種已知方法中之任何一種方法自穿梭微生物中分離。僅藉由實例，可使用下文描述之實例部分中描述的方法來分離表現構建體/載體。
在一個具體實施例中，構建體/載體兩者並行分離。
表現構建體/載體可使用任何多種已知方法引入至目的微生物中。然而，舉例而言，可使用下文之實例部分中描述的方法。由於表現構建體/載體被甲基化，因此表現構建體/載體上存在的核酸序列能夠摻入至目的微生物中且成功表現。
設想了可將甲基轉移酶基因引入至穿梭微生物中並過表現。因此，在一個實施例中，所得甲基轉移酶可使用已知方法收集且在體外使用以使表現質體甲基化。表現構建體/載體然後可引入至目的微生物中以進行表現。在另一實施例中，將甲基轉移酶基因引入至穿梭微生物之基因組中，然後將表現構建體/載體引入至穿梭微生物，自穿梭微生物中分離一種或多種構建體/載體，且然後將表現構建體/載體進入至目的微生物中。
設想了如以上定義的表現構建體/載體及甲基化構建體/載體可組合以提供物質的組合物。此類組合物在規避限制性屏障機制以產生本公開之重組微生物方面具有特別的效用。
在一個具體實施例中，表現構建體/載體及/或甲基化構建體/載體為質體。
本領域中一般熟習此項技術者將理解用於產生本公開之微生物的許多適合之甲基轉移酶。然而，舉例而言，可使用枯草芽孢桿菌噬菌體ΦT1甲基轉移酶及下文之實例中描述的甲基轉移酶。考慮到所需甲基轉移酶之序列及遺傳密碼，將容易理解編碼適合之甲基轉移酶的核酸。
可使用任何數量的適於允許甲基轉移酶基因表現之構建體/載體以產生甲基化構建體/載體。
在一個實施例中，受質包括CO。在一個實施例中，受質包括CO2及CO。在另一實施例中，受質包括CO2及H2。在另一實施例中，受質包含CO2及CO及H2。
「受質」係指本公開之微生物的碳源及/或能量源。通常，受質係氣態的且包括C1碳源，例如CO、CO 2及/或CH 4。較佳地，受質包括CO或CO + CO 2之C1碳源。受質可進一步包括其他非碳組分，如H 2、N 2或電子。然而，在其他實施例中，受質可為碳水化合物（如糖、澱粉、纖維、木質素、纖維素或半纖維素或其組合）。例如，碳水化合物可為果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖或其一些組合。在一些實施例中，受質不包括(D)-木糖（Alkim, 《微生物細胞工廠（ Microb Cell Fact）》, 14: 127, 2015）。在一些實施例中，受質不包括戊糖，如木糖（Pereira, 《代謝工程》, 34: 第80-87頁, 2016）。在一些實施例中，受質可包括氣態受質及碳水化合物受質（混合營養醱酵）。受質可進一步包括其他非碳組分，如H 2、N 2或電子。
氣態受質通常包括至少某種量的CO，如約1 mol%、2 mol%、5 mol%、10 mol%、20 mol%、30 mol%、40 mol%、50 mol%、60 mol%、70 mol%、80 mol%、90 mol%或100 mol%的CO。氣態受質可包括一定範圍的CO，如約20-80 mol%、30-70 mol%或40-60 mol%的CO。較佳地，氣態受質包括約40-70 mol%的CO（例如，鋼廠或高爐氣）、約20-30 mol%的CO（例如，鹼性氧氣爐氣）或約15-45 mol%的CO（例如，合成氣）。在一些實施例中，氣態受質可包含相對較低量的CO，如約1-10 mol%或1-20 mol%的CO。本公開之微生物通常將受質中之CO的至少一部分轉化為氣態受質。在一些實施例中，氣態受質不包括或基本上不包括（＜ 1 mol%）CO。
氣態受質可包括一定量的H 2。舉例而言，氣態受質可包括約1 mol%、2 mol%、5 mol%、10 mol%、15 mol%、20 mol%或30 mol%的H 2。在一些實施例中，氣態受質可包括相對較高量的H 2，如約60 mol%、70 mol%、80 mol%或90 mol%的H 2。在其他實施例中，氣態受質不包括或基本上不包括（＜ 1 mol%）H 2。
氣態受質可包括一定量的CO 2。舉例而言，氣態受質可包括約1-80 mol%或1-30 mol%的CO 2。在一些實施例中，氣態受質可包括小於約20 mol%、15 mol%、10 mol%或5 mol%的CO 2。在一些實施例中，氣態受質不包括或基本上不包括（＜ 1 mol%） CO 2。
氣態受質亦可以替代形式提供。例如，氣態受質可溶解在液體中或吸附在固體載體上。
氣態受質及/或C1碳源可為作為工業過程之副產物或自一些其他來源獲得的廢氣，例如來自汽車廢氣或生物質氣化。在某些實施例中，工業過程選自由以下組成之群組：黑色金屬產品製造（如鋼廠製造）、有色金屬產品製造、石油精煉、煤氣化、電力生產、炭黑生產、氨生產、甲醇生產及焦炭生產。在此等實施例中，氣態受質及/或C1碳源可在其被排放至大氣中之前使用任何適宜方法自工業製程中採集。
氣態受質及/或C1碳源可為合成氣，如藉由煤炭或精煉殘餘物之氣化、生物質或木質纖維素材料之氣化或天然氣之重整獲得的合成氣。在另一實施例中，合成氣可自市政固體廢物或工業固體廢物之氣化中獲得。
受質及/或C1碳源可為作為工業過程之副產物獲得的廢氣或來自另一種來源的廢氣，如汽車排煙、生物氣或填埋氣、直接空氣捕獲或來自電解的廢氣。受質及/或C1碳源可為藉由熱解、焙乾或氣化生成的合成氣。換言之，廢物材料中峰碳可藉由熱解、焙乾或氣化而再循環，以產生用作受質及/或C1碳源的合成氣。受質及/或C1碳源可為包括甲烷之氣體。
在某些實施例中，工業過程選自黑色金屬產物製造，如鋼鐵製造、有色金屬產物製造、石油精煉、電力生產、炭黑生產、紙及紙漿製造、氨生產、甲醇生產、焦炭製造、石化生產、碳水化合物醱酵、水泥製造、好氧消化、厭氧消化、催化製程、天然氣提取、纖維素醱酵、油提取、地質油藏、來自如天然氣煤及石油等化石資源的氣體或其任何組合。工業過程內之特定處理步驟的實例包含催化劑再生、流體催化劑裂化及催化劑再生。空氣分離及直接空氣捕獲為其他適合之工業過程。鋼鐵及鐵合金製造中的具體實例包含高爐煤氣、鹼性氧氣爐煤氣、焦爐煤氣、鐵爐爐頂煤氣之直接還原及來自冶鐵之殘餘氣體。在此等實施例中，可使用任何已知方法自工業過程中捕獲受質及/或C1碳源，然後將其排放至大氣中。
受質及/或C1碳源可為稱為合成氣的合成氣體，其可自重整、部分氧化或氣化過程中獲得。氣化過程之實例包含煤之氣化、煉油廠殘渣之氣化、石油焦之氣化、生物質之氣化、木質纖維素材料之氣化、廢木材之氣化、黑液之氣化、城市固體廢物之氣化、城市液體廢物之氣化、工業固體廢物氣化、工業液體廢物氣化、垃圾來源的燃料之氣化、下水之氣化、下水道污泥之氣化、來自廢水處理的污泥之氣化、生物氣之氣化。重整過程之實例包含蒸汽甲烷重整、蒸汽石腦油重整、天然氣重整、生物氣重整、填埋氣重整、石腦油重整及乾甲烷重整。部分氧化過程之實例包含熱及催化部分氧化過程、天然氣之催化部分氧化、烴之部分氧化。城市固體廢物之實例包含如鞋、服裝及紡織品中的輪胎、塑膠、纖維。城市固體廢物可能僅為填埋型廢物。城市固體廢物可為經分類的或未經分類的。生物質之實例可包含木質纖維素材料，且亦可包含微生物生物質。木質纖維素材料可包含農業廢物及森林廢物。
受質及/或C1碳源可為包括甲烷之氣體流。此類含甲烷之氣體可自化石甲烷排放，如在壓裂、廢水處理、牲畜、農業及城市固體廢物填埋期間中獲得。亦設想了可燃燒甲烷以產生電或熱，且C1副產物可用作受質或碳源。
氣態受質之組成可能對反應之效率及/或成本有顯著影響。例如，氧氣（O 2）的存在可能會降低厭氧醱酵過程的效率。取決於受質之組成，可能需要處理、擦洗或過濾該受質以移除任何不期望之雜質（如毒素、不期望之組分或灰塵顆粒）及/或增加期望組分之濃度。
在某些實施例中，在不存在碳水化合物受質（如糖、澱粉、木質素、纖維素或半纖維素）的情況下執行醱酵。
在一些實施例中，CO及H 2至乙二醇（MEG）的總能量學優於自葡萄糖至乙二醇的總能量學，如下所示，其中CO及H 2的吉布斯自由能（Gibbs free energy）ΔrG'm值越負，表明對乙二醇的驅動力越大。對作為受質之葡萄糖與CO的比較的總反應δG的計算係使用平衡儀（http://equilibrator.weizmann.ac.il/）進行的，平衡儀為用於評估生物系統中路徑或路徑中之單個步驟的總體可行性的標準方法（Flamholz、E. Noor、A. Bar-Even、R. Milo(2012), 「平衡儀—生化熱力學計算器（eQuilibrator - the biochemical thermodynamics calculator）」, 《核酸研究（Nucleic Acids Res）》，40: D770-5Noor、A. Bar-Even、A. Flamholz、Y. Lubling、D. Davidi、R. Milo (2012), 「結合準確性及覆蓋範圍的反應之熱力學集成開放框架（An integrated open framework for thermodynamics of reactions that combines accuracy and coverage）」, 《生物信息學（Bioinformatics）》 28:2037-2044；Noor、H.S.Haraldsdóttir、R. Milo、R.M.T.  Fleming (2013), 「使用分量貢獻對吉布斯能量進行一致估計」, 《PLoS計算生物學（PLoS Comput Biol）》, 9(7): e1003098；Noor、A. Bar-Even、A. Flamholz、E. Reznik、W. Liebermeister、R. Milo (2014), 「路徑熱力學凸顯中樞代謝的動力學障礙（Pathway Thermodynamics Highlights Kinetic Obstacles in Central Metabolism）」，《PLoS計算生物學》, 10(2): e1003483）。計算如下： 葡萄糖（aq）+3 NADH（aq） ⇌ 3 MEG（aq） + 3 NAD +（aq）         ΔrG'm -104 kJ/mol 6 CO（aq） + 3 H 2（aq） + 6 NADH（aq） ⇌ 3 MEG（aq） + 6 NAD +（aq） ΔrG'm -192 kJ/mol 生理條件：葡萄糖（aq） + 3 NADH（aq） ⇌ 3 MEG（aq） + 3 NAD +（aq）                ΔrG'm -70 kJ/mol 6 CO（aq） + 3 H 2（aq） + 6 NADH（aq） ⇌ 3 MEG（aq） + 6 NAD +（aq） ΔrG'm -295 kJ/mol
除了乙二醇、乙醛酸鹽及/或乙醇酸鹽之外，本公開之微生物可經培養以產生一種或多種副-產物。例如，除了2-苯乙醇之外，本公開之微生物亦可產生或亦可經工程化以產生乙醇（WO 2007/117157）、乙酸鹽（WO 2007/117157）、1-丁醇（WO 2008/115080、WO 2012/053905及WO 2017/066498）、丁酸鹽（WO 2008/115080）、2,3-丁二醇（WO 2009/151342及WO 2016/094334）、乳酸鹽（WO 2011/112103）、丁烯（WO 2012/024522）、丁二烯（WO 2012/024522）、甲基乙基酮（2-丁酮）（WO 2012/024522及WO 2013/185123）、乙烯（WO 2012/026833）、丙酮（WO 2012/115527）、異丙醇（WO 2012/115527）、脂質（WO 2013/036147）、3-羥基丙酸鹽（3-HP）（WO 2013/180581）、包含異戊二烯在內的萜烯（WO 2013/180584）、脂肪酸（WO 2013/191567）、2-丁醇（WO 2013/185123）、1,2-丙二醇（WO 2014/036152）、1-丙醇（WO 2017/066498）、1-己醇（WO 2017/066498）、1-辛醇（WO 2017/066498）、分支酸鹽衍生之產物（WO 2016/191625）、3-羥基丁酸鹽（WO 2017/066498）、1,3-丁二醇（WO 2017/066498）、2-羥基異丁酸鹽或2-羥基異丁酸（WO 2017/066498）、異丁烯（WO 2017/066498）、己二酸（WO 2017/066498）、1,3‑己二醇（WO 2017/066498）、3-甲基-2-丁醇（WO 2017/066498）、2-丁烯-1-醇（WO 2017/066498）、異戊酸鹽（WO 2017/066498）、異戊醇（WO 2017/066498）及/或單乙二醇（WO 2019/126400）。在一些實施例中，除了乙二醇，本公開之微生物亦產生乙醇、2,3-丁二醇及/或琥珀酸鹽。在某些實施例中，微生物生物質本身可視為產物。此等產物可經進一步轉化，以產生柴油、噴氣燃料及/或汽油的至少一種組分。在某些實施例中，可將2-苯乙醇用作香精、精油、調味劑及肥皂中的成分。此外，微生物生物質可藉由本領域已知的任何方法或方法之組合進一步處理以產生單細胞蛋白質（SCP）。除一種或多種目標產物外，本公開之微生物亦可產生乙醇、乙酸鹽及/或2,3-丁二醇。
「天然產物」為由未經基因修飾之微生物產生的產物。例如，乙醇、乙酸鹽及2,3-丁二醇為產乙醇梭菌、永達爾梭菌及拉氏梭菌的天然產物。「非天然產物」為由經基因修飾之微生物產生的產物，而非由衍生出經基因修飾之微生物的未經基因修飾之微生物產生的產物。眾所周知，乙二醇並非由任何天然存在之微生物產生的，因此其為所有微生物的非天然產物。
「選擇率」係指目標產物的產量與微生物所產生之全部醱酵產物的產量的比率。本公開之微生物可經工程化以便以特定選擇率或最小選擇率產生產物。在一個實施例中，如乙二醇等目標產物占由本公開之微生物產生的所有醱酵產物的至少約5%、10%、15%、20%、30%、50%或75%。在一個實施例中，乙二醇占由本公開之微生物產生的全部醱酵產物的至少10%，使得本公開之微生物的乙二醇的選擇率為至少10%。在另一實施例中，乙二醇占由本公開之微生物產生的全部醱酵產物的至少30%，使得本公開之微生物的乙二醇的選擇率為至少30%。
一種或多種醱酵產物中的至少一種可為藉由培養物產生之生物質。微生物生物質的至少一部分可轉化成單細胞蛋白質（SCP）。可利用單細胞蛋白質的至少一部分作為動物飼料之組分。
在一個實施例中，本公開提供了一種動物飼料，其包括微生物生物質及至少一種賦形劑，其中微生物生物質包括在包括CO、CO2及H2中之一種或多種的氣態受質上生長的微生物。
「單細胞蛋白質」（SCP）係指可用於富含蛋白質之人及/或動物飼料，通常置換蛋白質補充劑之常規來源，如豆粕或魚粉的微生物生物質。為了產生單細胞蛋白質或其他產物，製程可包括額外的分離、加工或處理步驟。舉例而言，方法可包括對微生物生物質進行滅菌，對微生物生物質進行離心及/或對微生物生物質進行乾燥。在某些實施例中，使用噴霧乾燥或槳葉乾燥對微生物生物質進行乾燥。該方法亦可包括使用本領域已知之任何方法來降低微生物生物質之核酸含量，因為攝取核酸含量高之飲食可能導致核酸降解產物之累積及/或胃腸不適。單細胞蛋白質可適合於餵養如牲畜或寵物等動物。特別地，動物飼料可適合於餵養一種或多種肉牛、奶牛、豬、綿羊、山羊、馬、騾、驢、鹿、水牛/野牛、駱馬、羊駝、馴鹿、駱駝、白臀野牛、大額牛、犛牛、雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、珍珠雞、雛鳥/鴿子、魚、蝦、甲殼類動物、貓、狗及嚙齒動物。動物飼料之組成可根據不同動物之營養要求定製。此外，製程可包括將微生物生物質與一種或多種賦形劑共混或組合。
「微生物生物質」係指包括微生物細胞的生物材料。舉例而言，微生物生物質可包括細菌、古菌、病毒或真菌的純培養物或基本上純之培養物或由其組成。當最初自醱酵培養液中分離時，微生物生物質通常含有大量的水。可藉由對微生物生物質進行乾燥或加工來移除或減少此水。
「賦形劑」可指代可添加至微生物生物質中以增強或改變動物飼料之形式、性質或營養含量的任何物質。舉例而言，賦形劑可包括以下中之一者或多者：碳水化合物、纖維、脂肪、蛋白質、維生素、礦物質、水、調味劑、甜味劑、抗氧化劑、酶、防腐劑、益生菌或抗生素。在一些實施例中，賦形劑可為乾草、稻草、青貯飼料、穀物、油或脂肪或其他植物材料。賦形劑可為在Chiba, 第18節：「飲食配料及普通飼料原料（Diet Formulation and Common Feed Ingredients）」, 動物營養手冊（Animal Nutrition Handbook）, 第3次修訂版, 第575-633頁, 2014中鑑定之任何飼料原料。
「生物聚合物」係指由活生物體之細胞產生的天然聚合物。在某些實施例中，生物聚合物為PHA。在某些實施例中，生物聚合物為PHB。
「生物塑膠」係指由可再生生物質來源產生的塑膠材料。生物塑膠可由可再生資源產生，如植物脂肪及油、玉米澱粉、稻草、木片、鋸末或回收的食物垃圾。
在本文中，提及酸（例如，乙酸或2-羥基異丁酸）應理解為亦包含對應的鹽（例如，乙酸鹽或2-羥基異丁酸鹽）。
通常，在生物反應器中進行培養。術語「生物反應器」包含由一個或多個容器、塔或管路佈置組成的培養/醱酵裝置，如連續攪拌槽反應器（CSTR）、固定化細胞反應器（ICR）、滴流床反應器（TBR）、氣泡柱、氣升式醱酵器、靜態混合器或適合氣液接觸之其他容器或其他裝置。在一些實施例中，生物反應器可包括第一生長反應器及第二培養/醱酵反應器。可向此等反應器中之一個或兩個反應器提供受質。如本文所用，術語「培養」及「醱酵」可互換使用。此等術語涵蓋培養/醱酵製程的生長階段及產物生物合成階段兩個。
培養通常在含有足以允許微生物生長之營養素、維生素及/或礦物質的水性培養基中維持。較佳地，水性培養基為厭氧微生物生長培養基，如基本厭氧微生物生長培養基。適合之培養基係所屬領域中眾所周知的。
培養/醱酵應該理想地在產生乙二醇之適當條件下進行。通常，培養/醱酵在厭氧條件下進行。要考慮的反應條件包括壓力（或分壓）、溫度、氣體流速、液體流速、培養基pH、培養基氧化還原電勢、攪拌速率（若使用連續攪拌槽反應器）、接種物水平、確保液相中之氣體不會變成限制因素的最大氣體受質濃度及避免產物抑制的最大產物濃度。具體而言，可控制受質之引入速率來確保液相中之氣體的濃度不會變成限制因素，因為在氣體限制條件下培養會消耗產物。
在高壓下操作生物反應器允許增加氣體自氣相至液相的傳質速率。因此，在高於大氣壓之壓力下執行培養/醱酵通常為較佳的。同樣，由於給定氣體轉化率部分地為受質保留時間的函數且保留時間指示生物反應器之所需體積，所以使用加壓系統可大大減小所需生物反應器之體積，且因此降低培養/醱酵設備之資金成本。這又意謂當在高壓而非大氣壓下維持生物反應器時，能夠縮短保留時間，保留時間定義為生物反應器中之液體體積除以輸入氣體流速。最優反應條件將部分取決於所使用的特定微生物。然而，一般而言，在高於大氣壓之壓力下操作醱酵為較佳的。同樣，由於給定氣體 轉化率部分地為受質保留時間的函數且實現期望的保留時間進而指示生物反應器之所需體積，所以使用加壓系統可大大減小所需生物反應器之體積，且因此降低醱酵設備之資金成本。
在某些實施例中，醱酵在沒有光的情況下或在存在不足以滿足光合微生物之能量需求的光量的情況下進行。在某些實施例中，本公開之微生物為非光合微生物。
可使用任何方法或技術領域中已知的方法之組合自醱酵培養液中分離或純化目標產物，該等方法包含例如分餾、蒸發、滲透蒸發、氣體剝離、相分離及萃取醱酵，包含例如液-液萃取。在某些實施例中，目標產物藉由以下自醱酵液中回收：自生物反應器中不斷取出醱酵液之一部分、自醱酵液分離微生物細胞（宜藉由過濾）以及自醱酵液中回收一種或多種目標產物。醇及/或丙酮可例如藉由蒸餾回收。可例如藉由吸附於活性炭來回收酸。分離的微生物細胞較佳地返回至生物反應器中。取出目標產物之後殘留的游離滲透物亦較佳地返回至生物反應器中。可在游離滲透物返回至生物反應器中之前向其中添加另外的營養素（如維生素B）來補充培養基。純化技術可包含親和標籤純化（例如，His、Twin-Strep及FLAG）、基於珠粒之系統、基於尖端之方法及用於更大規模自動化純化之FPLC系統。還公開了不依賴親和標籤之純化方法（例如鹽析、離子交換及尺寸排阻）。
本公開之方法可進一步包括自醱酵液中分離乙二醇。可使用本領域已知的任何方法或方法組合自醱酵液中分離或純化乙二醇，包含例如蒸餾、模擬移動床過程、膜處理、蒸發、滲透蒸發、氣提、相分離、離子交換或萃取醱酵（包含例如液-液萃取）。在一個實施例中，乙二醇可使用反滲透及/或滲透蒸發自醱酵液中濃縮（US 5,552,023）。可藉由蒸餾移除水，然後可使用蒸餾或真空蒸餾回收底部產物（含有高比例的乙二醇），以產生高純度的乙二醇流。可替代地，在藉由反滲透及/或滲透蒸發濃縮或不濃縮的情況下，乙二醇可藉由與醛之反應蒸餾（Atul, 《化學工程學（ Chem Eng Sci）》, 59: 第2881-2890頁, 2004）或使用烴之共沸蒸餾（US 2,218,234）進一步純化。在另一種方法中，乙二醇可自水性溶液中捕集在活性炭或聚合物吸收劑（使用或不使用反滲透及/或滲透蒸發）上，且使用低沸點有機溶劑回收（Chinn, 「藉由可再生吸附至活性炭上自稀水溶液中回收乙二醇、糖及相關之多OH化合物（Recovery of Glycols, Sugars, and Related Multiple -OH Compounds from Dilute-Aqueous Solution by Regenerable Adsorption onto Activated Carbons）」, 加利福尼亞大學伯克利分校（University of California Berkeley）, 1999）。然後可藉由蒸餾自有機溶劑中回收乙二醇。在某些實施例中，藉由自生物反應器中連續取出醱酵液的一部分、自醱酵液中分離微生物細胞（宜藉由過濾）、及自醱酵液中回收乙二醇自醱酵液中回收乙二醇。亦可自醱酵液中分離或純化出副產物（如醇或酸）。可例如藉由蒸餾回收醇。可例如藉由吸附於活性炭來回收酸。在某些實施例中，可將分離的微生物細胞返回生物反應器。取出目標產物後剩餘的無細胞滲透物亦較佳全部或部分返回生物反應器。可在游離滲透物返回至生物反應器中之前向其中添加另外的營養素（如維生素B）來補充培養基。
已證明有多種自含水介質中回收二醇的方法。已使用模擬移動床（SMB）技術自乙醇及相關含氧化合物之含水混合物中回收2,3-丁二醇（美國專利8,658.845）。亦證明反應性分離能有效回收二醇。在一些實施例中，藉由含二醇物流與醛之反應、二醇之分餾及再生、最終分餾以回收濃縮之二醇物流來進行乙二醇之回收。參見例如美國專利7,951,980。
本公開提供了包括由微生物且根據本文所述方法產生的乙二醇的組合物。例如，包括乙二醇之組合物可為防凍劑、防腐劑、脫水劑或鑽井液。
本公開亦提供了包括由微生物且根據本文所述方法產生的乙二醇的聚合物。此類聚合物可為例如均聚物，如聚乙二醇或共聚物（如聚對苯二甲酸乙二酯）。此等聚合物之合成方法在本領域中係眾所周知的。參見例如Herzberger等人, 《化學評論（ Chem Rev.）》, 116(4): 第2170-2243頁 (2016)及Xiao等人, 《工業與工程化學研究（ Ind Eng Chem Res.）》, 54(22): 第5862-5869頁 (2015)。
本公開進一步提供了包括聚合物之組合物，該等聚合物包括由微生物且根據本文所述方法產生的乙二醇。例如，組合物可為纖維、樹脂、薄膜或塑膠。
一個實施例係針對一種能夠由氣態受質產生乙二醇或乙二醇前體的經基因工程化之微生物，該經基因工程化之微生物包括：編碼二醇脫水酶之基因中的破壞性突變。
根據實施例所述之微生物，其中該微生物經由一種或多種中間體產生乙二醇或乙二醇前體，該一種或多種中間體選自由以下組成之群組：5,10-亞甲基四氫葉酸鹽、草醯乙酸鹽、檸檬酸鹽、蘋果酸鹽及甘胺酸。
根據實施例所述之微生物，其中該微生物包括以下中之一種或多種： a.  編碼能夠將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽之異源酶的核酸； b.  編碼能夠將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽之異源酶的核酸； c.  編碼能夠將異檸檬酸鹽轉化為乙醛酸鹽之異源酶的核酸；以及 d.  編碼能夠將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之異源酶的核酸。
根據實施例所述之微生物，其中： a.  該能夠將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽之異源酶為EC編號為2.3.3.1的檸檬酸[Si]-合酶、EC編號為2.3.3.8的ATP檸檬酸合酶；或者EC編號為2.3.3.3的檸檬酸(Re)-合酶； b.  該能夠將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽之異源酶為EC編號為2.6.1.44的丙胺酸-乙醛酸轉氨酶、EC編號為2.6.1.45的絲胺酸-乙醛酸轉氨酶、EC編號為2.6.1.51的絲胺酸-丙酮酸轉氨酶、EC編號為2.6.1.35的甘胺酸-草醯乙酸轉氨酶、EC編號為2.6.1.4的甘胺酸轉氨酶、EC編號為1.4.1.10的甘胺酸脫氫酶、EC編號為1.4.1.1的丙胺酸脫氫酶或EC編號為1.4.2.1的甘胺酸脫氫酶； c.  該能夠將異檸檬酸鹽轉化為乙醛酸鹽之異源酶為EC編號為4.1.3.1的異檸檬酸裂解酶；及/或 d.  該能夠將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之異源酶為EC編號為1.2.1.21的乙醇醛脫氫酶、EC編號為1.2.1.22的乳醛脫氫酶、EC編號為1.2.1.24的琥珀酸-半醛脫氫酶、EC編號為1.2.1.26的2,5-二氧戊酸脫氫酶、EC編號為1.2.1.3/4/5的醛脫氫酶、EC編號為1.2.1.8的甜菜鹼-醛脫氫酶或EC編號為1.2.7.5的醛鐵氧還蛋白氧化還原酶。
根據實施例所述之微生物，其中該異源酶中之一種或多種異源酶衍生自選自由以下組成之群組的屬：芽孢桿菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、埃希氏菌屬、葡糖桿菌屬、生絲微菌屬、離胺酸芽胞桿菌屬）、類芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、棲沈積物菌屬、芽孢八疊球菌屬、鏈黴菌屬、熱硫桿狀菌屬、熱袍菌屬、銅桿菌屬及玉蜀黍屬。
根據實施例所述之微生物，其中該異源酶中之一種或多種異源酶經密碼子優化以在該微生物中表現。
根據實施例所述之微生物，其中該微生物進一步包括以下中之一種或多種：能夠將乙醯輔酶A轉化為丙酮酸鹽之酶；能夠將丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶；能夠將丙酮酸鹽轉化為蘋果酸鹽之酶；能夠將丙酮酸鹽轉化為磷酸烯醇丙酮酸鹽之酶；能夠將草醯乙酸鹽轉化為檸檬醯輔酶A之酶；能夠將檸檬醯輔酶A轉化為檸檬酸鹽之酶；能夠將檸檬酸鹽轉化為烏頭酸鹽且將烏頭酸鹽轉化為異檸檬酸鹽之酶；能夠將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶；能夠將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為2-磷酸-D-甘油酸鹽之酶；能夠將2-磷酸-D-甘油酸鹽轉化為3-磷酸-D-甘油酸鹽之酶；能夠將3-磷酸-D-甘油酸鹽轉化為3-膦醯氧基丙酮酸鹽之酶；能夠將3-膦醯氧基丙酮酸鹽轉化為3-磷酸-L-絲胺酸之酶；能夠將3-磷酸-L-絲胺酸轉化為絲胺酸之酶；能夠將絲胺酸轉化為甘胺酸之酶；能夠將5,10-亞甲基四氫葉酸鹽轉化為甘胺酸之酶；能夠將絲胺酸轉化為羥基丙酮酸鹽之酶；能夠將D-甘油酸鹽轉化為羥基丙酮酸鹽之酶；能夠將蘋果酸鹽轉化為乙醛酸鹽之酶；能夠將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽之酶；能夠將羥基丙酮酸鹽轉化為乙醇醛之酶；以及能夠將乙醇醛轉化為乙二醇之酶。
根據實施例所述之微生物，其中該微生物過表現以下： a.  能夠將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽之異源酶； b.  能夠將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽之異源酶；及/或 c.  能夠將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之異源酶。
根據實施例所述之微生物，其中該微生物過表現以下： a.  能夠將丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶； b.  能夠將檸檬酸鹽轉化為烏頭酸鹽且將烏頭酸鹽轉化為異檸檬酸鹽之酶； c.  能夠將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶； d.  能夠將絲胺酸轉化為甘胺酸之酶； e.  能夠將5,10-亞甲基四氫葉酸鹽轉化為甘胺酸之酶； f.  能夠將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽之酶；及/或 g.  能夠將乙醇醛轉化為乙二醇之酶。
根據實施例所述之微生物，其中該微生物進一步包括以下中之一種或多種中的破壞性突變：異檸檬酸脫氫酶、甘油酸脫氫酶、乙醇酸脫氫酶、甘油酸脫氫酶、乙醇酸脫氫酶、醛鐵氧還蛋白氧化還原酶及醛脫氫酶。
根據實施例所述之微生物，其中該微生物為選自由以下組成之群組的屬的成員：醋酸桿菌屬、嗜鹼菌屬、布勞特氏菌屬、丁酸桿菌屬、梭菌屬、銅桿菌屬、真桿菌屬、穆爾氏菌屬、產醋桿菌屬、鼠孢菌屬及嗜熱厭氧桿菌屬。
根據實施例所述之微生物，其中該微生物衍生自親本微生物，該親本微生物選自由以下組成之群組：伍氏醋酸桿菌、巴氏嗜鹼菌、產生布勞特氏菌、甲基營養丁酸桿菌、醋酸梭菌、產乙醇梭菌、嗜一氧化碳梭菌、科斯卡塔梭菌、德氏梭菌、甲酸乙酸梭菌、永達爾梭菌、馬氏梭菌、拉氏梭菌、糞味梭菌、鉤蟲貪銅菌、黏液真桿菌、熱自養穆爾氏菌、熱醋穆爾氏菌、普氏產醋桿菌、卵形鼠孢菌、森林土壤醋酸鼠孢菌、球形鼠孢菌及凱伍熱厭氧桿菌。
根據實施例所述之微生物，其中該微生物衍生自選自由以下組成之群組的親本細菌：產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌。
根據實施例所述之微生物，其中該微生物包括天然或異源伍德-永達爾路徑。
根據實施例所述之微生物，其中該乙二醇前體為乙醛酸鹽或乙醇酸鹽。
另一實施例係針對一種產生乙二醇或乙二醇前體之方法，該方法包括在存在氣態受質的情況下在營養培養基中培養如技術方案1之微生物，由此該微生物產生乙二醇或乙二醇前體。
根據一個實施例所述之方法，其中該氣態受質包括CO、CO 2及H 2中之一種或多種。
根據一個實施例所述之方法，其中該乙二醇前體為乙醛酸鹽或乙醇酸鹽。
根據一個實施例所述之方法，其進一步包括自該營養培養基中分離乙二醇或乙二醇前體。
根據一個實施例所述之方法，其中該微生物進一步產生乙醇、2,3-丁二醇及琥珀酸鹽中之一種或多種。
另一實施例係針對一種由氣態受質產生聚對苯二甲酸乙二酯（PET）產物的方法，該方法包括1）形成至少一種PET組分，其中該至少一種PET組分選自單乙二醇（MEG）、對苯二甲酸（PTA）或其任何組合；2）將該至少一種PET組分處理為PET；3）聚合該PET以形成PET樹脂；4）將該PET樹脂處理為PET產物。 實例
以下實施例進一步說明本公開，但當然不應解釋為以任何方式限制其範圍。 實例 1 ： 構建包括枯草芽孢桿菌檸檬酸合酶、大腸桿菌異檸檬酸裂解酶及氧化葡萄糖酸桿菌乙醇醛脫氫酶的異源表現載體以在產乙醇梭菌中自 CO 及 / 或 CO 2 及 H 2 產生乙二醇。
編碼來自枯草芽孢桿菌（ citZ ；SEQ ID NO: 1-2）的檸檬酸合酶、來自大腸桿菌（ icl；SEQ ID NO: 11-12）的異檸檬酸裂解酶及來自氧化葡萄糖酸桿菌（ aldA1；SEQ ID NO: 55-56）的乙醇醛脫氫酶的基因係密碼子銜接的，且係合成的以在產乙醇梭菌中表現。使用標準BsaI金門（golden gate）選殖套組（馬薩諸塞州伊普斯威奇新英格蘭生物實驗室（New England Biolabs, Ipswich, MA））將銜接的基因選殖至表現穿梭載體pIPL12中。pIPL12包括大腸桿菌及產乙醇梭菌的複製起點，使其能夠複製且維持在兩個物種中；pIPL12在大多數梭狀芽孢桿菌中亦起作用。pIPL12亦包括向紅黴素/克拉黴素賦予用於陽性選擇之抗性的23S rRNA (腺嘌呤(2058)-N(6))-甲基轉移酶Erm（B）、用於自大腸桿菌之結合轉移的TraJ及用於異源基因之表現的啟動子。見圖2A。將 citZ、 icl及 aldA1選殖至pIPL12中產生的表現載體在本文中稱為pMEG042（圖2B）。 表2：用於構建pMEG042表現載體的寡核苷酸。
SEQ ID NO 名稱 序列
69 pIPL12-bb-F CACACCAGGTCTCAAACCATGGAGATCTCGAGGCCTG
70 pIPL12-bb-R CACACCAGGTCTCACATATGATAAGAAGACTCTTGGC
71 citZ_Bs1-F    CACACCAGGTCTCACATATGACAGCAACAAGGGGCC
72 citZ_Bs1-R CACACCAGGTCTCAATTGTAACACCTCCTTAATTAGTTATGCTCTTTCTTCTATAGGTACAAATTTTTG
73 Icl_Ec-F CACACCAGGTCTCACAATGAAAACAAGAACTCAACAAATAG
74 Icl_Ec-R CACACCAGGTCTCAGTGTTCCTCCTATGTGTTCTTAAAATTGAGATTCTTCAGTTGAACCTG
75 aldA1_Go-F CACACCAGGTCTCAACACATATGACTGAAAAAAATAATTTATTCATAAATGGATC
76 aldA1_Go-R CACACCAGGTCTCAGGTTATGCATTTAGATATATTGTTTTTGTCTGTACG
經由綴合將pMEG042構建體轉化至產乙醇梭菌中。表現載體首先使用標準熱激轉化而引入綴合供體菌株大腸桿菌HB101+R702（CA434）（Williams等人，1990）（供體）。將供體細胞在37℃之SOC培養基中恢復1小時，然後鋪板至包括100 µg/mL壯觀黴素及500 µg/mL紅黴素之LB培養基平板上，且在37℃孵育過夜。第二天，將包含100 µg/mL大觀黴素及500 µg/mL紅黴素的5 mL LB等分試樣與幾個供體菌落接種，且在37℃孵育，振盪約4小時或直至培養物明顯緻密但尚未進入固定相。藉由在4000 rpm及20-25℃下離心2分鐘收穫1.5 mL供體培養物，棄去上清液。將供體細胞輕輕重懸於500 µL無菌PBS緩衝液中，在4000 rpm下離心2分鐘，棄去PBS上清液。
將沈澱物引入厭氧室，且在產乙醇梭菌培養物（受體）的後期指數階段輕輕重懸於200 µL中。產乙醇梭菌DSM10061及DSM23693（DSM10061之衍生物）自DSMZ（德國微生物及細胞培養物保藏中心（The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）, Inhoffenstraße 7 B, 38124 布倫瑞克（Braunschweig），德國（Germany））獲得。使用標準厭氧技術（Hungate 1969；Wolfe 1971）使菌株在37℃下在pH 5.6之PETC培養基（參見美國專利第9,738,875號）中生長。
將綴合混合物（供體及受體細胞之混合物）點樣至PETC-MES + 果糖瓊脂平板上，使其乾燥。當斑點不再明顯濕潤時，將平板引入壓力罐中，用合成氣（50% CO、10% N 2、30% CO 2、10% H 2）加壓至25-30 psi，且在37℃下孵育約24小時。然後使用10 µL接種環藉由刮除將接合混合物自平板上取出。將取出的混合物懸浮在200-300 µL PETC培養基中。將綴合混合物的100 µL等份試樣鋪板至補充了5 µg/mL克拉黴素的PETC培養基瓊脂平板上，以選擇攜帶質體的轉化體。
將三個不同的攜帶pMEG042質體之產乙醇梭菌菌落接種至2 mL含有5 µg/mL克拉黴素之PETC-MES培養基中，且在37℃下用50% CO、10% N2、30% CO 2、10% H2及100 rpm的軌道振盪自養生長三天。將培養物用血清瓶中的5 µg/mL克拉黴素稀釋至OD 600為0.05（在10 mL PETC-MES培養基中），在37℃下用50% CO、10% N 2、30% CO 2、10% H2及100 rpm軌道振盪自養生長長達20天，每天取樣以測量生物量及代謝物（圖3A及3B）。使用氣相色譜質譜（GC-MS）測量乙二醇的產量，使用高效液相色譜（HPLC）測量其他代謝物，如下所述。
乙二醇濃度用配備有安捷倫（Agilent）VF-WAXms柱（15 m × 0.25 µm × 0.25 µm）及RSH自動進樣器的賽默飛世爾（Thermo Scientific）ISQ LT GCMS測量。藉由用200 µL甲醇稀釋200 µL醱酵液製備樣品。將樣品渦旋，然後在14,000 rpm下離心3分鐘；將200 µL上清液轉移至帶有稱墊的玻璃瓶中。將樣品轉移至自動進樣器中，使用1.0 µL進樣、5比1之分流比及240℃之入口溫度進行分析。色譜使用80℃之烤箱程序進行，保持0.5分鐘，以10℃/分鐘之斜升升至150℃，以25℃/分鐘之斜升升至220℃，最後保持3分鐘。柱流速為4.0毫升/分鐘，保持0.5分鐘，然後使用氦氣作為載氣以100毫升/分鐘/分鐘之速度降至1.5毫升/分鐘。MS離子源保持在260℃，傳輸線設置為240℃。使用線性外部標準校準進行定量，使用33.0 m/z作為定量峰，使用31.0 + 62.0 m/z作為確認峰。
乙醇、乙酸鹽、2,3-丁二醇、乙醛酸鹽及乙醇酸鹽的濃度藉由HPLC使用折光率（RI）偵測在35℃下在安捷倫1260 Infinity LC上測定。樣品係藉由在80℃下加熱5分鐘，然後在14,000 rpm下離心3分鐘製備的；將上清液轉移至玻璃瓶中進行分析。在等度條件下使用5 mM硫酸流動相在0.7毫升/分鐘及35°下將10 µL注射液注入至Phenomenex RezexTM ROA-有機酸H+（8%）柱（300 mm × 7.8 mm × 8 µm）中進行分離。
在大約3天的自養生長後，觀察到了乙二醇前體乙醇酸鹽，10天後，觀察到了乙二醇的產生（圖3B）。在自養生長並攜帶表現載體pMEG042的產乙醇梭菌中隨時間推移產生了乙醇酸鹽（圖3C）。 實例 2 ：構建包括硫牛磺酸棲沈積物菌丙胺酸 - 乙醛酸氨基轉移酶及螢光假單胞菌醛脫氫酶的異源表現載體以在產乙醇梭菌中由 CO 及 / 或 CO 2 及 H 2 產生乙二醇。
編碼來自硫牛磺酸棲沈積物菌（ pucG ；SEQ ID NO: 15-16）的丙胺酸-乙醛酸氨基轉移酶及來自螢光假單胞菌Q8r1-96（ aldA1；SEQ ID NO: 57-58）的醛脫氫酶的基因係密碼子銜接的，且係合成的以在產乙醇梭菌中表現。將密碼子銜接的基因選殖至pIPL12中（圖2A），且將得到的表現載體pMEG058引入至產乙醇梭菌中，如實例1中所述。參見圖2C。 表3：用於構建pMEG058表現載體的寡核苷酸。
SEQ ID NO 名稱 序列
69 pIPL12-bb-F CACACCAGGTCTCAAACCATGGAGATCTCGAGGCCTG
70 pIPL12-bb-R CACACCAGGTCTCACATATGATAAGAAGACTCTTGGC
77 PucG_Sthi1-F CACACCAGGTCTCACATATGCAATTTAGGCCTTTTAATCCACCA
78 PucG_Sthi1-R CACACCAGGTCTCAGTGTTCCTCCTATGTGTTCTTATGCTTGCGCAAGTGCCT
79 aldA1_Pfq8-F CACACCAGGTCTCAACACATATGTCTTCAGTGCCTGTATTCCAG
80 aldA1_Pfq8-R CACACCAGGTCTCAGGTTAAGACTGGAGATATACTGCATGAG
將兩個不同的攜帶pMEG058質體之產乙醇梭菌菌落接種至2 mL含有5 µg/mL克拉黴素之PETC-MES培養基中，且使其自養生長，如實例1所述。參見圖4A。在大約3天的自養生長後，觀察到了乙醇酸鹽，8天後觀察到了乙二醇的產生（圖4B）。 實例 3 ：構建包括硫牛磺酸棲沈積物菌丙胺酸 - 乙醛酸氨基轉移酶及氧化葡萄糖酸桿菌乙醇醛脫氫酶的異源表現載體以在產乙醇梭菌中由 CO 及 / 或 CO 2 及 H 2 產生乙二醇。
編碼來自硫牛磺酸棲沈積物菌（ pucG；SEQ ID NO: 15-16）的丙胺酸-乙醛酸氨基轉移酶及來自氧化葡萄糖酸桿菌（ aldA1；SEQ ID NO: 55-56）的乙醇醛脫氫酶的基因係密碼子銜接的，且係合成的以在產乙醇梭菌中表現。將密碼子銜接的基因選殖至pIPL12中（圖2A），且將得到的表現載體pMEG059引入至產乙醇梭菌中，如實例1中所述。參見圖2D。 表4：用於構建pMEG059表現載體的寡核苷酸。
SEQ ID NO 名稱 序列
69 pIPL12-bb-F CACACCAGGTCTCAAACCATGGAGATCTCGAGGCCTG
70 pIPL12-bb-R CACACCAGGTCTCACATATGATAAGAAGACTCTTGGC
77 PucG_Sthi1-F CACACCAGGTCTCACATATGCAATTTAGGCCTTTTAATCCACCA
78 PucG_Sthi1-R CACACCAGGTCTCAGTGTTCCTCCTATGTGTTCTTATGCTTGCGCAAGTGCCT
75 aldA1_Go-F CACACCAGGTCTCAACACATATGACTGAAAAAAATAATTTATTCATAAATGGATC
76 aldA1_Go-R CACACCAGGTCTCAGGTTATGCATTTAGATATATTGTTTTTGTCTGTACG
將兩個不同的攜帶pMEG059質體之產乙醇梭菌菌落接種至2 mL含有5 µg/mL克拉黴素之PETC-MES培養基中並使其自養生長，如實例1所述。參見圖5A。在大約3天的自養生長後，觀察到乙醇酸鹽，10天後，觀察到了乙二醇的產生（圖5B）。 實例 4 ：構建包括硫牛磺酸棲沈積物菌丙胺酸 - 乙醛酸氨基轉移酶及螢光假單胞菌醛脫氫酶的異源表現載體以在產乙醇梭菌中自 CO 及 / 或 CO 2 及 H 2 產生乙二醇。
編碼來自尿酸梭菌（ SgA；SEQ ID NO: 19、20）的V類氨基轉移酶及來自螢光假單胞菌Q8r1-96（ aldA1 ；SEQ ID NO: 57-58）的醛脫氫酶的基因係密碼子銜接的，且係合成的以在產乙醇梭菌中表現。將密碼子銜接的基因選殖至pIPL12中（圖2A），且將所得載體pMEG061引入至產乙醇梭菌中，如實例1中所述。參見圖2E。 表5：用於構建pMEG061表現載體的寡核苷酸。
SEQ ID NO 名稱 序列
69 pIPL12-bb-F CACACCAGGTCTCAAACCATGGAGATCTCGAGGCCTG
70 pIPL12-bb-R CACACCAGGTCTCACATATGATAAGAAGACTCTTGGC
81 SgaA_Caci1-F CACACCAGGTCTCACATATGAGAACTCCATTTATTATGAC
82 SgaA_Caci1-R CACACCAGGTCTCAGTGTTCCTCCTATGTGTTCCTAATCTACAAAGTGCTTG
79 aldA1_Pfq8-F CACACCAGGTCTCAACACATATGTCTTCAGTGCCTGTATTCCAG
80 aldA1_Pfq8-R CACACCAGGTCTCAGGTTAAGACTGGAGATATACTGCATGAG
將三個不同的攜帶pMEG061質體之產乙醇梭菌菌落接種至2 mL含5 µg/mL克拉黴素之PETC-MES培養基中，且使其自養生長，如實例1所述。參見圖6A。自養生長約3天後，觀察到了乙醇酸鹽，且在16天後，觀察到了乙二醇的產生（圖6B）。 實例 5 ：對獲得乙二醇之不同途徑的最大產率的建模
利用了產乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）之基因組級代謝模型（如Marcellin, 《綠色化學（ Green Chem）》, 18: 第3020-3028頁, 2016中描述的模型）來預測獲得乙二醇之不同途徑的最大產量。將異源代謝反應添加至野生型產乙醇梭菌模型結構中，以表示非天然化合物產生路徑的結合。儘管本文所述的用於實驗工作之模型係基於產乙醇梭菌，但由於代謝相似，因此可合理地預期結果亦適用於其他伍德-永達爾微生物。
如下模擬乙二醇產生：使用基於限制之計算建模技術通量平衡分析（FBA）及代謝調節之線性最小化（LMOMA）（Maia, 《GECCO ’17遺傳及進化計算會議論文集（ Proceedings of the Genetic and Evolutionary Computation Conference Companion on – GECCO ’ 17）》, 紐約州紐約ACM出版社（ACM Press）, 第1661-1668頁, 2017）利用cobrapy版本0.8.2（Ebrahim.，COBRApy：「基於限制的Python重構及分析（COnstraints-Based Reconstruction and Analysis for Python）」，《BMC系統生物學（ BMC Syst Biol）》, 7: 74, 2013）模擬乙二醇產生，且使用optlang版本1.2.3（Jensen，Optlang：「用於數學優化的代數建模語言（Algebraic Modeling Language for Mathematical Optimization）」，《開源軟件雜誌（The Journal of Open Source Software）》, 2, doi: 10.21105/joss.00139, 2017）作為求解器接口，使用Gurobi Optimizer版本7.0.2作為優化求解器。
模擬顯示，藉由本文實例1-4中所述之路徑獲得的預測產率為0.37 mol乙二醇/mol CO。此係Islam等人（《代謝工程（ Metab Eng）》, 41: 第173-181頁, 2017）描述的需要糖異生之假設路徑的預測產量的兩倍以上，發現最高的預測產量為約0.44 g乙二醇/g CO，等於約0.18 mol乙二醇/mol CO。 實例 6 ：乙二醇產生及二醇脫水酶敲除
產乙醇梭菌的兩種不同基因型的生物質水平（g乾細胞重量/L）：一種基因型含有所標識之天然二醇脫水酶（基礎），而一種基因型的二醇脫水酶基因缺失（KO）。每種菌株具有兩種變體，一種變體攜帶pMEG042表現載體，而一種變體不攜帶載體（陰性對照）。示出之值係根據3次技術重複之平均值計算的。參見圖7。在產乙醇梭菌的兩種不同基因型中隨時間推移產生的乙二醇（mg/L）：一種基因型含有所標識之天然二醇脫水酶（基礎），而一種基因型的二醇脫水酶基因缺失（KO）。每種菌株具有兩種變體，一種變體攜帶pMEG042表現載體，而一種變體不攜帶載體（陰性對照）。示出之值係根據3次技術重複之平均值計算的。參見圖8A。在產乙醇梭菌的兩種不同基因型中隨時間推移產生的乙二醇（mg/L/g乾細胞重量）：一種基因型含有所標識之天然二醇脫水酶（基礎），而一種基因型的二醇脫水酶基因缺失（KO）。每種菌株具有兩種變體，一種變體攜帶pMEG042表現載體，而一種變體不攜帶載體（陰性對照）。示出之值係根據3次技術重複之平均值計算的。參見圖8B。
本文引用之所有參考文獻（包含出版物、專利申請及專利）均藉由引用特此併入，其程度如同每篇參考文獻被單獨且具體地指出藉由引用併入且在本文中被整體闡述。本說明書中對任何現有技術的引用並非，亦不應視為承認現有技術形成任何國家所致力的領域中的公知常識的一部分。
除非本文中另外指明或明顯與上下文相矛盾，否則在描述本公開之上下文中（特別是在以下請求項的上下文中）使用的術語「一個/一種（a/an）」及「該/該等（the）」以及類似的指代詞應解釋為涵蓋單數及複數兩者。除非另外指出，否則術語「包括」、「具有」、「包含」及「含有」應解釋為開放式術語（即，意謂「包含但不限於」）。術語「基本上由……組成」將組合物、過程或方法的範圍限制在特定的材料或步驟，或者限制在彼等對組合物、過程或方法的基本及新穎特性沒有實質性影響的材料或步驟。替代方案（例如，「或」）的使用應理解為意指替代方案中的一個、兩個或其任何組合。如本文所使用的，術語「約」係指所指定範圍、值或結構的± 20%，除非另有指示。
除非本文中另有指示，否則本文中對值之範圍的敍述僅旨在用作單獨地指出落入該範圍內之每個單獨的值的速記方法且每個單獨的值併入本說明書中，如同該值在本文中被單獨地敍述一樣。例如，除非另有指示，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍、整數範圍、大小範圍或厚度範圍應理解為包含所敍述範圍內之任何整數的值且在適當的情況下包含其分數（如整數的十分之一及百分之一）。
除非本文中另有指示或明顯與上下文相矛盾，否則本文所描述之所有方法均可以任何適合之順序進行。除非另外聲明，否則本文提供之任何及所有實例或示範性語言（例如，「如」）的使用僅旨在更好地說明本公開，而不對本公開之範圍構成限制。本說明書中之任何語言均不應解釋為將任何未要求保護之元件指示為實踐本公開所必須的。
本文描述了本公開之較佳實施方式。在閱讀前文描述後，對本領域中一般熟習此項技術者而言，彼等較佳實施方式的變型可變得顯而易見。諸位發明人預期技術人員可在適當時採用此類變型，且諸位發明人旨在使本公開以與本文具體描述之方式不同的其他方式來進行實踐。因此，在適用法律允許的情況下，本公開包含所附請求項中敍述之主題的所有修改及等同物。此外，除非本文另有指示或明顯與上下文相矛盾，否則本公開涵蓋上述要素在其所有可能變型中的任何組合。
無
當結合以下附圖閱讀時，可最佳地理解以下對本公開之實施例的詳細描述，其中相似之結構用相似之附圖標記指示，且其中：
圖1為示出用於由包括CO、CO 2及/或H 2之氣態受質產生乙二醇、乙醇酸鹽及乙醛酸鹽之路徑的示意圖。
圖2A-2E為實例1-4中使用之質體的圖譜。圖2A為實例1中所述之表現穿梭載體pIPL12的圖譜。圖2B為質體pMEG042的圖譜，如實例1所述，該質體pMEG042包括枯草芽孢桿菌檸檬酸合酶、大腸桿菌異檸檬酸裂解酶及氧化葡萄糖酸桿菌乙醇醛脫氫酶。圖2C為質體pMEG058的圖譜，如實例2中所述，該質體pMEG058包括硫牛磺酸棲沈積物菌丙胺酸-乙醛酸氨基轉移酶（ S. thiotaurinialanine-glyoxylate aminotransferase）及螢光假單胞菌醛脫氫酶（ P. fluorescensaldehyde dehydrogenase）。圖2D為質體pMEG059的圖譜，如實例3所述，該質體pMEG059包括硫牛磺酸棲沈積物菌丙胺酸-乙醛酸氨基轉移酶及氧化葡萄糖酸桿菌醛脫氫酶。圖2E為質體pMEG061的圖譜，如實例4中所述，該質體pMEG061包括尿酸梭菌V類氨基轉移酶及螢光假單胞菌醛脫氫酶。
圖3A示出了表現pMEG042之產乙醇梭菌（ C. autoethanogenum）（純系1-3）或產乙醇梭菌野生型（陰性對照1或陰性對照2）的生物質水平（g乾細胞重量/L）。圖3B示出了相比於野生型（陰性對照1或陰性對照2）在自養生長且攜帶表現載體pMEG042之產乙醇梭菌中隨時間推移產生的乙二醇。圖3C示出了在自養生長且攜帶表現載體pMEG042之產乙醇梭菌中隨時間推移產生的乙醇酸鹽。參見實例1。
圖4A示出了表現pMEG058之產乙醇梭菌（純系1-2）或產乙醇梭菌野生型（陰性對照1）的生物質水平（g乾細胞重量/L）。圖4B示出了相比於野生型（陰性對照1）在自養生長並攜帶表現載體pMEG058之產乙醇梭菌中隨時間推移產生的乙二醇。參見實例2。
圖5A示出了表現pMEG059之產乙醇梭菌（純系1-3）或產乙醇梭菌野生型（陰性對照）的生物質水平（g乾細胞重量/L）。圖5B示出了相比於野生型（陰性對照）在自養生長且攜帶表現載體pMEG059之產乙醇梭菌中隨時間推移產生的乙二醇。參見實例3。
圖6A示出了表現pMEG061之產乙醇梭菌（純系1）或產乙醇梭菌野生型（陰性對照1）的生物質水平（g乾細胞重量/L）。圖6B示出了相比於野生型（陰性對照1）在自養生長且攜帶表現載體pMEG061的產乙醇梭菌中隨時間推移產生的乙二醇。參見實例4。
圖7示出了產乙醇梭菌之兩種不同基因型的生物質水平（g乾細胞重量/L）：一種基因型含有所標識之天然二醇脫水酶（基礎），而一種基因型之二醇脫水酶基因缺失（KO）。每種菌株具有兩種變體，一種變體攜帶pMEG042表現載體，而一種變體不攜帶載體（陰性對照）。示出之值係根據3次技術重複之平均值計算的。誤差條示出了標準偏差。
圖8A示出了在產乙醇梭菌的兩種不同基因型中隨時間推移產生的MEG（mg/L）：一種基因型含有所標識之天然二醇脫水酶（基礎），而一種基因型的二醇脫水酶基因缺失（KO）。每種菌株具有兩種變體，一種變體攜帶pMEG042表現載體，而一種變體不攜帶載體（陰性對照）。示出之值係根據3次技術重複之平均值計算的。誤差條示出了標準偏差。圖8B示出了在產乙醇梭菌之兩種不同基因型中隨時間推移產生的MEG（mg/g乾細胞重量）：一種基因型含有所標識之天然二醇脫水酶（基礎），而一種基因型之二醇脫水酶基因缺失（KO）。每種菌株具有兩種變體，一種變體攜帶pMEG042表現載體，而一種變體不攜帶載體（陰性對照）。示出之值係根據3次技術重複之平均值計算的。誤差條示出了標準偏差。
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Claims (20)

  1. 一種能夠由氣態受質產生乙二醇或乙二醇前體的經基因工程化之微生物，該經基因工程化之微生物包括：編碼二醇脫水酶的基因中的破壞性突變。
  2. 如請求項1之微生物，其中該微生物經由一種或多種中間體產生乙二醇或該乙二醇前體，該一種或多種中間體選自由以下組成之群組：5,10-亞甲基四氫葉酸鹽、草醯乙酸鹽、檸檬酸鹽、蘋果酸鹽及甘胺酸。
  3. 如請求項1之微生物，其中該微生物包括以下中之一種或多種： a.  編碼能夠將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽之異源酶的核酸； b.  編碼能夠將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽之異源酶的核酸； c.  編碼能夠將異檸檬酸鹽轉化為乙醛酸鹽之異源酶的核酸；以及 d.  編碼能夠將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之異源酶的核酸。
  4. 如請求項3之微生物，其中： a.  該能夠將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽之異源酶為EC編號為2.3.3.1的檸檬酸[Si]-合酶、EC編號為2.3.3.8的ATP檸檬酸合酶；或者EC編號為2.3.3.3的檸檬酸(Re)-合酶； b.  該能夠將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽之異源酶為EC編號為2.6.1.44的丙胺酸-乙醛酸轉氨酶、EC編號為2.6.1.45的絲胺酸-乙醛酸轉氨酶、EC編號為2.6.1.51的絲胺酸-丙酮酸轉氨酶、EC編號為2.6.1.35的甘胺酸-草醯乙酸轉氨酶、EC編號為2.6.1.4的甘胺酸轉氨酶、EC編號為1.4.1.10的甘胺酸脫氫酶、EC編號為1.4.1.1的丙胺酸脫氫酶或EC編號為1.4.2.1的甘胺酸脫氫酶； c.  該能夠將異檸檬酸鹽轉化為乙醛酸鹽之異源酶為EC編號為4.1.3.1的異檸檬酸裂解酶；及/或 d.  該能夠將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之異源酶為EC編號為1.2.1.21的乙醇醛脫氫酶、EC編號為1.2.1.22的乳醛脫氫酶、EC編號為1.2.1.24的琥珀酸-半醛脫氫酶、EC編號為1.2.1.26的2,5-二氧戊酸脫氫酶、EC編號為1.2.1.3/4/5的醛脫氫酶、EC編號為1.2.1.8的甜菜鹼-醛脫氫酶或EC編號為1.2.7.5的醛鐵氧還蛋白氧化還原酶。
  5. 如請求項3之微生物，其中該等異源酶中之一種或多種異源酶衍生自選自由以下組成之群組的屬：芽孢桿菌屬（ Bacillus）、梭菌屬（ Clostridium）、埃希氏菌屬（ Escherichia）、葡糖桿菌屬（ Gluconobacter）、生絲微菌屬（ Hyphomicrobium）、離胺酸芽胞桿菌屬（ Lysinibacillus）、類芽孢桿菌屬（ Paenibacillus）、假單胞菌屬（ Pseudomonas）、棲沈積物菌屬（ Sedimenticola）、芽孢八疊球菌屬（ Sporosarcina）、鏈黴菌屬（ Streptomyces）、熱硫桿狀菌屬（ Thermithiobacillus）、熱袍菌屬（ Thermotoga）、銅桿菌屬（ Cupriavidus）及玉蜀黍屬（ Zea）。
  6. 如請求項3之微生物，其中該等異源酶中之一種或多種異源酶經密碼子優化以在該微生物中表現。
  7. 如請求項3之微生物，其中該微生物進一步包括以下中之一種或多種：能夠將乙醯輔酶A轉化為丙酮酸鹽之酶；能夠將丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶；能夠將丙酮酸鹽轉化為蘋果酸鹽之酶；能夠將丙酮酸鹽轉化為磷酸烯醇丙酮酸鹽之酶；能夠將草醯乙酸鹽轉化為檸檬醯輔酶A之酶；能夠將檸檬醯輔酶A轉化為檸檬酸鹽之酶；能夠將檸檬酸鹽轉化為烏頭酸鹽且將烏頭酸鹽轉化為異檸檬酸鹽之酶；能夠將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶；能夠將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為2-磷酸-D-甘油酸鹽之酶；能夠將2-磷酸-D-甘油酸鹽轉化為3-磷酸-D-甘油酸鹽之酶；能夠將3-磷酸-D-甘油酸鹽轉化為3-膦醯氧基丙酮酸鹽之酶；能夠將3-膦醯氧基丙酮酸鹽轉化為3-磷酸-L-絲胺酸之酶；能夠將3-磷酸-L-絲胺酸轉化為絲胺酸之酶；能夠將絲胺酸轉化為甘胺酸之酶；能夠將5,10-亞甲基四氫葉酸鹽轉化為甘胺酸之酶；能夠將絲胺酸轉化為羥基丙酮酸鹽之酶；能夠將D-甘油酸鹽轉化為羥基丙酮酸鹽之酶；能夠將蘋果酸鹽轉化為乙醛酸鹽之酶；能夠將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽之酶；能夠將羥基丙酮酸鹽轉化為乙醇醛之酶；以及能夠將乙醇醛轉化為乙二醇之酶。
  8. 如請求項3之微生物，其中該微生物過表現以下： a.  該能夠將草醯乙酸鹽轉化為檸檬酸鹽之異源酶； b.  該能夠將甘胺酸轉化為乙醛酸鹽之異源酶；及/或 c.  該能夠將乙醇酸鹽轉化為乙醇醛之異源酶。
  9. 如請求項7之微生物，其中該微生物過表現以下： a.  該能夠將丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶； b.  該能夠將檸檬酸鹽轉化為烏頭酸鹽且將烏頭酸鹽轉化為異檸檬酸鹽之酶； c.  該能夠將磷酸烯醇丙酮酸鹽轉化為草醯乙酸鹽之酶； d.  該能夠將絲胺酸轉化為甘胺酸之酶； e.  該能夠將5,10-亞甲基四氫葉酸鹽轉化為甘胺酸之酶； f.  該能夠將乙醛酸鹽轉化為乙醇酸鹽之酶；及/或 g.  該能夠將乙醇醛轉化為乙二醇之酶。
  10. 如請求項1之微生物，其中該微生物進一步包括以下中之一種或多種中的破壞性突變：異檸檬酸脫氫酶、甘油酸脫氫酶、乙醇酸脫氫酶、甘油酸脫氫酶、乙醇酸脫氫酶、醛鐵氧還蛋白氧化還原酶及醛脫氫酶。
  11. 如請求項1之微生物，其中該微生物為選自由以下組成之群組的屬的成員：醋酸桿菌屬（ Acetobacterium）、嗜鹼菌屬（ Alkalibaculum）、布勞特氏菌屬（ Blautia）、丁酸桿菌屬（ Butyribacterium）、梭菌屬、銅桿菌屬、真桿菌屬（ Eubacterium）、穆爾氏菌屬（ Moorella）、產醋桿菌屬（ Oxobacter）、鼠孢菌屬（ Sporomusa）及嗜熱厭氧桿菌屬（ Thermoanaerobacter）。
  12. 如請求項1之微生物，其中該微生物衍生自親本微生物，該親本微生物選自由以下組成之群組：伍氏醋酸桿菌（ Acetobacterium woodii）、巴氏嗜鹼菌（ Alkalibaculum bacchii）、產生布勞特氏菌（ Blautia producta）、食甲基丁酸桿菌（ Butyribacterium methylotrophicum）、醋酸梭菌（ Clostridium aceticum）、產乙醇梭菌（ Clostridium autoethanogenum）、食一氧化碳梭菌（ Clostridium carboxidivorans）、克氏梭菌（ Clostridium coskatii）、德氏梭菌（ Clostridium drakei）、蟻酸醋酸梭菌（ Clostridium formicoaceticum）、永達爾梭菌（ Clostridium ljungdahlii）、馬氏梭菌（ Clostridium magnum）、拉氏梭菌（ Clostridium ragsdalei）、糞味梭菌（ Clostridium scatologenes）、鉤蟲貪銅菌（ Cupriavidus necator）、黏液真桿菌（ Eubacterium limosum）、熱自養穆爾氏菌（ Moorella thermautotrophica）、熱醋穆爾氏菌（ Moorella thermoacetica）、普氏產醋桿菌（ Oxobacter pfennigii）、卵形鼠孢菌（ Sporomusa ovata）、森林土壤醋酸鼠孢菌（ Sporomusa silvacetica）、球形鼠孢菌（ Sporomusa sphaeroides）及凱伍熱厭氧菌（ Thermoanaerobacter kiuvi）。
  13. 如請求項12之微生物，其中該微生物衍生自親本細菌，該親本細菌選自由以下組成之群組：產乙醇梭菌、永達爾梭菌或拉氏梭菌。
  14. 如請求項1之微生物，其中該微生物包括天然或異源伍德-永達爾路徑（Wood-Ljungdahl pathway）。
  15. 如請求項1之微生物，其中該乙二醇前體為乙醛酸鹽或乙醇酸鹽。
  16. 一種產生乙二醇或乙二醇前體的方法，該方法包括在存在氣態受質的情況下在營養培養基中培養如請求項1之微生物，由此該微生物產生乙二醇或該乙二醇前體。
  17. 如請求項16之方法，其中該氣態受質包括CO、CO 2及H 2中之一種或多種。
  18. 如請求項16之方法，其中該乙二醇前體為乙醛酸鹽或乙醇酸鹽。
  19. 如請求項16之方法，其進一步包括自該營養培養基中分離乙二醇或該乙二醇前體。
  20. 如請求項16之方法，其中該微生物進一步產生乙醇、2,3-丁二醇及琥珀酸鹽中之一種或多種。
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