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CN103415612B - 新细菌及其使用方法 - Google Patents

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CN103415612B CN201180046882.XA CN201180046882A CN103415612B CN 103415612 B CN103415612 B CN 103415612B CN 201180046882 A CN201180046882 A CN 201180046882A CN 103415612 B CN103415612 B CN 103415612B
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Abstract

本发明广义上涉及气体的微生物发酵领域。本发明更具体地涉及具有提高的通过厌氧发酵含一氧化碳（CO）的底物进行的乙醇生产效率的新自产乙醇梭菌细菌。

Description

新细菌及其使用方法
技术领域
本发明广义上涉及气体的微生物发酵领域。更具体地涉及具有提高的通过厌氧发酵含一氧化碳（CO）的底物进行的乙醇生产效率的一类新细菌。
背景技术
乙醇正迅速地成为全球主要的富含氢的液体运输燃料。2005年，全球的乙醇消耗估计为122亿加仑。因为欧洲、日本、美国和几个发展中国家对乙醇的兴趣增加，燃料乙醇工业的全球市场也被预测会在未来急剧增长。
例如，在美国，乙醇被用于生产E10——乙醇在汽油中的10%的混合物。在E10掺混物中，乙醇组分作为氧合剂起作用，提高燃烧效率并且降低空气污染的产生。在巴西，乙醇作为混合在汽油中的氧合剂以及自身即可作为纯燃料，满足了约30%的运输燃料需求。同样，在欧洲，关于温室气体（GHG）排放后果的环境问题已经成为欧盟（EU）为成员国设置消费可持续运输燃料（例如生物质衍生的乙醇）的强制目标的动力。
燃料乙醇的绝大部分是通过传统的基于酵母的发酵方法生产的，所述方法使用源自作物的碳水化合物（例如从甘蔗提取的蔗糖或从谷类作物提取的淀粉）作为主要的碳源。然而，这些碳水化合物原料的费用受到它们作为人类食物或动物饲料的价值的影响，并且培养用于乙醇生产的产淀粉或蔗糖的作物并不是在所有的地理区域中都是经济上可持续的。因此，需要开发将更低成本的和/或更充足的碳源转变为燃料乙醇的技术。
CO是有机材料（例如煤或者油和油衍生产物）不完全燃烧的主要的、无成本的、富含能量的副产物。例如，有报道称，澳大利亚的钢铁工业每年产生并向大气中排放超过500,000吨CO。
可使用催化方法将主要包含CO和/或CO和氢气（H2）的气体转变为多种燃料和化学制品。还可以使用微生物将这些气体转变为燃料和化学制品。
微生物将CO作为唯一碳源而生长的能力于1903年首次被发现。后来确定这是使用自养生长的乙酰辅酶A（乙酰CoA）生物化学途径（也被称作Woods-Ljungdahl途径和一氧化碳脱氢酶/乙酰CoA合酶（CODH/ACS）途径）的生物的特性。已证明包括一氧化碳营养生物（carboxydotrophicorganism）、光合生物（photosyntheticorganism）、产甲烷生物（methanogenicorganism）和产乙酸生物（acetogenicorganism）的大量厌氧生物可将CO代谢为多种终产物，即CO2、H2、甲烷、正丁醇、乙酸盐和乙醇。当使用CO作为唯一碳源时，所有这样的生物均产生至少两种这些终产物。
已经证明厌氧细菌（例如来自梭菌属（Clostridium）的那些厌氧细菌）可通过乙酰CoA生物化学途径从CO、CO2和H2产生乙醇。例如，WO00/68407、EP117309、美国专利5,173,429、5,593,886和6,368,819、WO98/00558和WO02/08438中描述了从气体产生乙醇的多个扬氏梭菌（Clostridiumljungdahlii）菌株。还已知自产乙醇梭菌（Clostridiumautoethanogenumsp）这种细菌从气体产生乙醇（Abrinietal.,ArchivesofMicrobiology161,pp345-351(1994)）。
但是由微生物通过发酵气体进行的乙醇生产一直伴随着乙酸盐（acetate）和/或乙酸的共同产生。因为一些可用的碳被转变为乙酸盐/乙酸而不是乙醇，使用这种发酵方法生产乙醇的效率可能低于所希望的。并且除非所述乙酸盐/乙酸副产物可被用于某些其他目的，否则还将面临废弃物处理的问题。乙酸盐/乙酸可被微生物转变为甲烷，因此可能会增加GHG排放。
存在H2的条件下微生物发酵CO可导致基本上完全地将碳转变为醇。但是，当没有足够H2时，一些CO被转变为醇，而很大一部分被转变为CO2，如以下方程式所示：
6CO+3H2O→C2H5OH+4CO2
12H2+4CO2→2C2H5OH+6H2O
产生CO2表示总的碳捕获效率低，并且如果其被释放还可能增加温室气体排放。
WO2007/117157描述了通过对含一氧化碳的气体进行厌氧发酵产生醇，尤其是乙醇的方法。作为发酵过程的副产物产生的乙酸盐被转变为氢气和二氧化碳气体，它们各自或者两者一起都可被用于厌氧发酵过程。
WO2008/115080描述了在多个发酵阶段中产生醇的方法。在第一生物反应器中由于气体厌氧发酵产生的副产物能够用于在第二生物反应器中产生产物。此外，第二发酵阶段的副产物可被回收至第一生物反应器以产生产物。
WO2009/064200描述了一类新细菌，其具有提高的通过厌氧发酵含一氧化碳的底物来产生乙醇的效率。
提供与现有技术的微生物相比能够以增加的效率发酵含一氧化碳的气体来产生乙醇（即能够提高一氧化碳摄取）、产生更多的乙醇和/或更高的乙醇比乙酸盐比例的微生物是有益的。
本发明的目的是提供一类新细菌，其可克服在含CO的气体源到乙醇的转变中现有技术的一种或多种局限，或者至少为公众提供一种有用的选择。
发明内容
本发明第一方面提供一种生物纯的细菌分离株，其中所述细菌能够通过厌氧发酵含CO的底物而以至少约2g乙醇/L发酵液/g生物质/天的单位产率（specificproductivity）而产生包括乙醇和任选的乙酸盐的产物。
在其他实施方案中，所述细菌能够以至少约3g乙醇/L发酵液/g生物质/天、至少约4g乙醇/L发酵液/g生物质/天、至少约5g乙醇/L发酵液/g生物质/天、至少约6g乙醇/L发酵液/g生物质/天或者至少约7g乙醇/L发酵液/g生物质/天的单位产率产生乙醇。
本发明的另一方面提供生物纯的细菌分离株，其中所述细菌能够通过厌氧发酵含CO的底物而以至少约10g乙醇/L发酵液/天的产率产生包括乙醇和任选的乙酸盐的产物。
在其他实施方案中，所述细菌能够以至少约20g乙醇/L发酵液/天、至少约30g乙醇/L发酵液/天、至少约40g乙醇/L发酵液/天、至少约50g乙醇/L发酵液/天、至少约60g乙醇/L发酵液/天或至少约70g乙醇/L发酵液/天的产率产生乙醇。
本发明的另一方面提供生物纯的细菌分离株，其中所述细菌能够通过厌氧发酵含CO的底物产生包括乙醇和任选的乙酸盐的产物，并且其中所述细菌能够以至少约1.0mMCO/min/g生物质的单位摄取量摄取CO。
在一个实施方案中，所述细菌能够以至少约1.2mMCO/min/g生物质、至少约1.4mMCO/min/g生物质、至少约1.6mMCO/min/g生物质、至少约1.8mMCO/min/g生物质或至少约2.0mMCO/min/g生物质的单位摄取量摄取CO。在一个具体的实施方案中，所述细菌能够以至少约1.2mMCO/min/g生物质的单位摄取量摄取CO。
本发明的另一方面提供生物纯的细菌分离株，其中所述细菌能够通过厌氧发酵含CO的底物产生包括乙醇和任选的乙酸盐的产物，并且其中所述细菌能够具有至少约0.8天-1的单位生长速率。
在某些实施方案中，所述细菌能够具有的单位生长速率为至少约1.0天-1、至少约1.2天-1、至少约1.4天-1、至少约1.6天-1、至少约1.8天-1或至少约2.0天-1。
本发明的另一方面提供生物纯的细菌分离株，其中所述细菌能够通过厌氧发酵含CO的底物产生包括乙醇和任选的乙酸盐的产物，并且其中所述细菌能够以至少约2:1的乙醇比乙酸盐比例产生乙醇。
在某些实施方案中，所述细菌能够以至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约7:1或者至少约10:1的乙醇比乙酸盐比例产生乙醇。
在一个实施方案中，所述细菌能够产生乙醇而基本上无乙酸盐。
本发明的另一方面提供生物纯的细菌分离株，其中所述细菌能够通过厌氧发酵含CO的底物产生包括乙醇和任选的乙酸盐的产物，并且其中所述细菌能够耐受最高达约30g/L发酵液的醇。
在某些实施方案中，所述细菌能够耐受最高达约40g/L发酵液、最高达约50g/L发酵液、最高达约60g/L发酵液或最高达约70g/L发酵液的醇。
本发明的另一方面提供生物纯的细菌分离株，其中所述细菌能够通过厌氧发酵含CO的底物产生包括乙醇和任选的乙酸盐的产物，并且其中所述细菌具有两种或多种下述特征：
能够通过厌氧发酵含CO的底物而以至少约2g乙醇/L发酵液/g生物质/天的单位产率产生包括乙醇和任选的乙酸盐的产物；
能够以至少约10g乙醇/L发酵液/天的浓度产生乙醇；
能够以至少约1.0mMCO/min/g生物质的单位摄取量摄取CO；
能够具有至少约1.0g/天的生长速率；
能够以至少约2:1的乙醇比乙酸盐比例产生乙醇；并且
能够耐受最高达约30g/L发酵液的醇。
在一个实施方案中，本发明的细菌源自自产乙醇梭菌。在一个优选的实施方案中，本发明的细菌是自产乙醇梭菌菌株。
在一个具体的实施方案中，所述细菌具有保藏在DSMZ的保藏号为DMS23693的自产乙醇梭菌菌株的定义性特征。在一个实施方案中，所述细菌是保藏在DSMZ的保藏号为DMS23693的自产乙醇梭菌菌株。
本发明另一方面提供保藏在DSMZ的保藏号为DMS23693的自产乙醇梭菌菌株的生物纯分离株。
另一方面，本发明提供用于产生一种或多种醇的方法，其包括使用本文上述的细菌发酵含CO的底物。
在一个实施方案中，所述方法包含以下步骤：
（a）向含有本发明的细菌培养物的生物反应器中提供含CO的底物；并且
（b）在所述生物反应器中厌氧发酵所述培养物以产生一种或多种醇。
另一方面，本发明提供用于减少工业过程中总的大气碳排放的方法，该方法包括：
（a）在工业过程所产生的含CO气体释放到大气中之前捕获所述气体；
（b）通过含有一种或多种本发明的细菌的培养物厌氧发酵所述含CO的气体以产生一种或多种醇。
在所述方法方面的一个实施方案中，所述发酵是在约34℃到约37℃的温度下进行。在一个优选的实施方案中，所述发酵是在约34℃的温度下进行。
在所述方法方面的某些实施方案中，乙酸是作为发酵的副产物产生的。优选地，所产生的一种或多种醇包括乙醇。
在所述方法方面的具体实施方案中，所述细菌被维持在水性培养基中。
在所述方法方面的具体实施方案中，所述底物的发酵是在生物反应器中进行的。
在某些实施方案中，所述底物包含至少约25体积%的CO、至少约30体积%的CO、至少约40体积%的CO、至少约50体积%的CO、至少约65体积%的CO或至少约70体积%的CO。在具体的实施方案中，所述底物包含至少约75体积%的CO、至少约80体积%的CO、至少约85体积%的CO、至少约90体积%的CO或至少约95体积%的CO。
在一个实施方案中，所述底物包含约30体积%或更少的H2。在另一个实施方案中，所述底物包含约20体积%或更少的H2、约15体积%或更少的H2、约10体积%或更少的H2、约5体积%或更少的H2、约4体积%或更少的H2、约3体积%或更少的H2、约2体积%或更少的H2、约1体积%或更少的H2或者基本不含H2。
在一个实施方案中，所述底物包含小于或等于约20体积%的CO2。在具体的实施方案中，所述底物包含小于或等于约15体积%的CO2、小于或等于约10体积%的CO2、小于或等于约5体积%的CO2或者基本不含CO2。
在某些实施方案中，所述含CO的底物是含CO的气态底物。
在某些实施方案中，所述气态底物包含作为工业过程副产物所得的气体。
在某些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品生产、非铁产品生产、石油精炼过程、生物质的气化、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产。
在一个实施方案中，所述气态底物可包含从钢铁厂获得的气体。
在另一个实施方案中，所述气态底物可包含汽车废气。
在所述方法方面的某些实施方案中，所述醇是从所述发酵液中回收的。所述发酵液是包含细菌细胞和所述醇的水性培养基。
在某些实施方案中，乙酸盐是作为发酵的副产物产生的。
在另外的实施方案中，所述醇和乙酸盐是从所述发酵液中回收的。
尽管本发明广义上如上文所限定，但是本发明不限于此并且还包括实施方案，所述实施方案中以下描述提供了实施例。
附图说明
现在参考附图详细描述本发明，其中：
图1:示出DSM19630和DSM23693的CO消耗。
图2:示出DSM19630（图2a）和DSM23693（图2b）的代谢产物生产。
图3:示出如实施例2所述DSM23693的优化的生物质积累和代谢物生产。
图4:示出新的自产乙醇梭菌LZ1561（DSM23693）菌株的遗传图谱，示出了与LZ1560（DSM19630）菌株的不同。
图5:Seq.ID.1:LZ1561菌株中DNA错配修复蛋白MutS基因的核苷酸序列。
图6:Seq.ID.2:LZ1560菌株中DNA错配修复蛋白MutS基因的核苷酸序列。
图7:Seq.ID.3:LZ1561菌株中DNA错配修复蛋白MutS基因的氨基酸序列。
图8:Seq.ID.4:LZ1560菌株中DNA错配修复蛋白MutS基因的氨基酸序列。
图9:Seq.ID.5:在LZ1561和LZ1560菌株中所发现的重排的核苷酸序列。
图10:Seq.ID.6:LZ1561菌株中推定的F1FOATP合酶操纵子的启动子区的核苷酸序列。
图11:Seq.ID.7:LZ1560菌株中推定的F1FOATP合酶操纵子的启动子区的核苷酸序列。
图12:Seq.ID.8:LZ1561菌株中推定的Rnf复合体操纵子的启动子区的核苷酸序列。
图13:Seq.ID.9:LZ1560菌株中推定的Rnf复合体操纵子的启动子区的核苷酸序列。
图14:Seq.ID.10:LZ1561菌株中推定的碳饥饿蛋白(carbonstarvationprotein)的启动子区的核苷酸序列。
图15:Seq.ID.11:LZ1560菌株中推定的碳饥饿蛋白的启动子区的核苷酸序列。
图16:Seq.ID.12:LZ1561菌株中CO脱氢酶/CO-甲基化乙酰-CoA合酶复合体β亚基基因的核苷酸序列。
图17:Seq.ID.13:LZ1560菌株中CO脱氢酶/CO-甲基化乙酰-CoA合酶复合体β亚基基因的核苷酸序列。
图18:Seq.ID.14:LZ1561菌株中CO脱氢酶/CO-甲基化乙酰-CoA合酶复合体β亚基基因的氨基酸序列。
图19:Seq.ID.15:LZ1560菌株中CO脱氢酶/CO-甲基化乙酰-CoA合酶复合体β亚基基因的氨基酸序列。
图20:Seq.ID.16:LZ1561菌株中5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因的核苷酸序列。
图21:Seq.ID.17:LZ1560菌株中5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因的核苷酸序列。
具体实施方式
本发明人开发了新的细菌。所述细菌的特征在于其具有多种意想不到的特性（如下所示）中的一个或多个，并且在一个优选的实施方案中其具有所有的这些特性。在厌氧发酵过程中使用这些新细菌可提供与现有的细菌菌株相比意想不到的益处，这可使得增加用于产生诸如如乙醇和/或乙酸盐的产物的发酵过程的总效率。
相应地，在广义上，一方面，本发明涉及具有增加的厌氧发酵过程效率的新细菌和生物纯的细菌分离株。一方面，所述细菌能够从含CO的底物产生醇，优选乙醇。
另一方面，本发明涉及通过使用本发明的细菌厌氧发酵含CO的底物而产生醇优选乙醇的方法。
定义
除非另有定义，否则本说明书通篇中使用的下述术语定义如下：
“含CO的底物”、“包含CO的底物”及类似术语应被理解为包括任何这样的底物，即细菌可从所述底物中获得CO用于例如生长和/或发酵。在本发明的具体实施方案中，“含CO的底物”是气态的。这种底物在本文中可称为“含CO的气态底物”、“包含CO的气态底物”等。
在如下描述中，在递送和发酵“含CO的气态底物”方面描述本发明的实施方案。但是，应该理解的是可以其他形式提供所述气态底物。例如，可将所述含CO的气态底物以溶于液体中的形式提供。必要地，将液体用含CO的气体饱和，然后将所述液体加入到生物反应器中。这可使用标准方法实现。例如，可使用微泡分散发生器（Hensirisaket.al.Scale-upofmicrobubbledispersiongeneratorforaerobicfermentation;AppliedBiochemistryandBiotechnology Volume101,Number3/October,2002）。又例如，可将含CO的气态底物吸附到固体载体上。通过使用术语“含CO的底物”可包括这些备选方法。
当与发酵方法关联使用时，术语“增加效率”、“增加的效率”等包括但不限于增加下述的一种或多种：催化发酵的微生物的生长速率、微生物对CO的摄取或消耗、消耗每体积底物（例如CO）产生的所需产物（例如醇）的体积、在培养基中产生的所需产物（例如醇）的浓度、所需产物的产率或产生水平，以及与所述发酵的其他副产物相比所产生的所需产物的相对比例。
术语“乙酸盐”包括仅乙酸盐，以及分子的或游离的乙酸与乙酸盐的混合物，例如如本文描述的存在于发酵液中的乙酸盐和游离乙酸的混合物。所述发酵液中分子乙酸与乙酸盐的比例依赖于所述系统的pH。
所述术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道布置组成的发酵设备，其包括连续搅拌釜反应器（CSTR）、固定化细胞反应器（ICR）、滴流床反应器（TBR）、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器或者适合气体-液体接触的其他容器或其他装置。
本文所用的术语“醇耐受”应被理解为，细菌或细菌群体能够耐受并继续存活、生长和/或产生至少一定水平的所需产物时的醇（优选乙醇）的水平。
本发明的细菌或者其培养物或分离株可被描述为“分离的”或“生物纯的”形式。这些术语意欲指，已从环境或者一种或多种组分中分离的细菌（细胞的或其他形式），如果在自然界或其他地方存在时所述细菌与所述环境或一种或多种组分是相关的。术语“分离的”或“生物纯的”不应被认为是指所述细菌已被纯化的程度。但是，在一个实施方案中，所述细菌的分离株或培养物包含占优势的本发明的细菌。
本发明提供生物纯的细菌分离株，其中所述细菌能够通过厌氧发酵含CO的底物产生包括乙醇和任选的乙酸盐的产物，并且其中所述细菌能够具有下述一种或多种特征：
以约2g乙醇/L发酵液/g生物质/天的单位产率产生乙醇;
以至少约10g/L发酵液/天的产率产生乙醇;
以至少约1.0mMCO/min/g生物质的单位摄取量摄取CO；
至少约0.8天-1的单位生长速率；
以至少约2:1的乙醇比乙酸盐比例产生乙醇；并且
可耐受最高达约30g/L发酵液的醇。
在一个优选的实施方案中，本发明的细菌具有2、3、4或5种上述特征。
在某些实施方案中，所述细菌能够以至少约3g乙醇/L发酵液/g生物质/天、至少约4g乙醇/L发酵液/g生物质/天、至少约5g乙醇/L发酵液/g生物质/天、至少约6g乙醇/L发酵液/g生物质/天或者至少约7g乙醇/L发酵液/g生物质/天的单位产率产生乙醇。
在某些实施方案中，所述细菌能够以至少约20g乙醇/L发酵液/天、至少约30g乙醇/L发酵液/天、至少约40g乙醇/L发酵液/天或至少约50g乙醇/L发酵液/天的产率产生乙醇。最大值考虑了化学计量、CO摄取和乙醇汽提。
在某些实施方案中，所述细菌能够以至少约1.2mMCO/min/g生物质、至少约1.4mMCO/min/g生物质、至少约1.6mMCO/min/g生物质、至少约1.8mMCO/min/g生物质或至少约2.0mMCO/min/g生物质的单位摄取量摄取CO。在一个具体的实施方案中，所述细菌能够以至少约1.2mMCO/min/g生物质的单位摄取量摄取CO。
在某些实施方案中，所述细菌的单位生长速率为至少约1.0天-1、至少约1.2天-1、至少约1.4天-1、至少约1.6天-1、至少约1.8天-1或至少约2.0天-1。
在某些实施方案中，所述细菌能够以至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约7:1或者至少约10:1的乙醇比乙酸盐比例产生乙醇。在一个具体的实施方案中，发酵过程中没有乙酸盐的净产生。
在某些实施方案中，所述细菌能够耐受最高达约40g/L发酵液、高达约50g/L发酵液或高达约60g/L发酵液的醇。在一个具体的实施方案中，所述细菌能够耐受最高达约70g/L发酵液的醇。
在一个优选的实施方案中，本发明所述的细菌源自自产乙醇梭菌。在本发明的一个更优选的实施方案中，所述细菌源自自产乙醇梭菌菌株DSM19630（DSMZ，德国微生物和细胞培养物保藏中心，保藏日期2007年10月19日）（记载于WO2009/064200中）。
在一个优选的实施方案中，本发明所述的细菌是自产乙醇梭菌菌株。
自产乙醇梭菌被记载于例如Abrinietal;Clostridiumautoethanogenum,sp.nov.,ananaerobicbacteriumthatproducesethanolfromcarbonmonoxide,ArchMicrobiol(1994)161:345-351中。
在本发明的某些实施方案中，所述细菌具有根据布达佩斯条约于2010年6月7日保藏在德国DSMZ（德国微生物和细胞培养物保藏中心）的保藏号为DSM23693的自产乙醇梭菌菌株的定义性特征。在一个具体的实施方案中，所述细菌是自产乙醇梭菌菌株DSM23693。
本发明还涉及源自本发明所述细菌的细菌。
本发明的某些实施方案中所述的细菌具有增加的醇产率、增加的生长速率、增加的CO消耗或更新（update）速率、更高的醇比酸的产生比例和/或增加的对醇的耐受。这提供了超过其他梭菌属菌株（包括自产乙醇梭菌）的益处。因此，使用本发明的细菌可增加用于产生产物（例如乙酸和/或乙醇盐）的发酵过程的总效率。
在某些实施方案中，本发明所述的细菌在具有提高的CO水平的气态底物中具有本文中如上所述的产率、生长速率、醇比酸的比例、CO消耗和醇耐受。例如，所述气态底物可包含至少约50体积%的CO、至少约65体积%的CO或至少约70体积%的CO。在某些实施方案中，所述气态底物包含至少约80体积%的CO、至少约85体积%的CO、至少约90体积%的CO或至少约95体积%的CO。
同样地，在某些实施方案中，在含有低H2水平至不存在的H2水平的气态底物中可达到本文中上述的产率、生长速率、醇比酸的比例、CO消耗和醇耐受。所述气态底物可包含约30体积%或更低的H2。在具体的实施方案中，所述气态底物包含约20体积%或更少的H2、约15体积%或更少的H2、约10体积%或更少的H2、约5体积%或更少的H2、约4体积%或更少的H2、约3体积%或更少的H2、约2体积%或更少的H2、约1体积%或更少的H2或者基本不含H2。
在某些实施方案中，当提供含有相对少的CO2的气态底物时，本发明所述的细菌也具有本文中如上所述的产率、生长速率、醇比酸的比例、CO消耗和醇耐受。在一个实施方案中，所述气态底物包含小于或等于约20体积%的CO2。在某些实施方案中，所述气态底物包含小于或等于约15体积%的CO2、小于或等于约10体积%的CO2、小于或等于约5体积%的CO2。在一个优选的实施方案中，所述气态底物基本不含CO2。
在某些实施方案中，本发明细菌的培养物被维持在水性培养基中。优选地，所述水性培养基是厌氧微生物生长基本培养基。适合的培养基是本领域中已知的，并且其被记载于例如美国专利5,173,429和5,593,886和WO02/08438中，以及Klassonetal[(1992).BioconversionofSynthesisGasintoLiquidorGaseousFuels.Enz.Microb.Technol.14:602-608.]、NajafpourandYounesi[(2006).EthanolandacetatesynthesisfromwastegasusingbatchcultureofClostridiumljungdahlii.EnzymeandMicrobialTechnology,Volume38,Issues1-2,p.223-228]和Lewisetal[(2002).Makingtheconnection-conversionofbiomass-generatedproducergastoethanol.Abst.Bioenergy,p.2091-2094]中。在本发明具体的实施方案中，所述厌氧微生物生长基本培养基如下文中实施例部分所述。
本发明还提供用于从含CO的气态底物产生一种或多种醇的方法，所述方法包括在存在所述底物的条件下维持一种或多种本发明的细菌分离株的培养物，并通过所述一种或多种细菌分离株厌氧发酵所述底物产生一种或多种醇。
本发明还提供用于减少工业过程中总的大气碳排放的方法，该方法包括：
（a）在工业过程所产生的含CO气体释放到大气中之前捕获所述气体；
（b）通过含有一种或多种本发明的细菌分离株的培养物厌氧发酵所述含CO气体以产生一种或多种醇。
在本发明的方法的某些实施方案中，乙酸盐是作为发酵的副产物产生的。所产生的醇是乙醇。
在某些实施方案中，所述培养物被维持在液体营养培养基中。
所述发酵可以在任何合适的生物反应器中进行，例如连续搅拌釜反应器（CTSR）、鼓泡塔反应器（BCR）或滴流床反应器（TBR）。并且，在本发明的一些优选的实施方案中，所述生物反应器可包括第一生长反应器，在其中培养所述微生物；和第二发酵反应器，来自所述生长反应器的发酵液被加入其中并且在其中产生大部分的发酵产物（乙醇和乙酸盐）。
如上所述，用于所述发酵反应的碳源为含CO的气态底物。所述气态底物可以是作为工业过程副产物获得的含CO废气，或来自其他来源（例如来自汽车废气）的含CO废气。在某些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品生产（例如钢铁厂）、非铁产品生产、石油精炼过程、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产。在这些实施方案中，可使用任意合适的方法，在所述含CO气体被释放到大气中之前将其从所述工业过程中捕获。根据所述含CO气态底物的组成，还可能需要在将其引入所述发酵之前对其进行处理以除去任何不需要的杂质，例如尘粒。例如，可使用已知方法过滤或洗涤所述气态底物。
此外，经常需要增加底物流的CO浓度（或者气态底物中CO的分压力），从而增加CO作为底物时的发酵反应的效率。增加气态底物中CO的分压力可增加向发酵培养基中的CO质量转移。用于加入到发酵反应中的气流的组成可对所述反应的效率和/或成本有显著的影响。例如，O2可降低厌氧发酵过程的效率。在发酵之前或之后的发酵过程的阶段中处理不需要的或者不必要的气体能够增加这些阶段的负担（例如，如果在所述气流进入生物反应器之前对其进行压缩，则可能会使用非必需的能量来压缩所述发酵中不需要的气体）。相应地，可能需要处理底物流尤其是来自工业来源的底物流，以移除不需要的组分并增加所需要的组分的浓度。
来自工业来源的底物流的组成通常是可变的。此外，来自工业来源的含有高CO浓度（例如至少40%CO、至少50%CO或至少65%CO）的底物流经常具有低H2含量（例如小于20%或小于10%或基本为0%）。因此，尤其需要，微生物能够通过厌氧发酵含有一系列CO和H2浓度的底物（特别是具有高CO浓度和低H2浓度的底物）来产生产物。在发酵含CO（不含H2）的底物时，本发明所述的细菌具有出乎意料的高生长速率和乙醇产率。
底物流中存在氢可使总的碳捕获和/或乙醇产生的效率提高。例如，WO02/08438描述了使用具有各种组成的气流进行的乙醇生产。WO02/08438公开了将含有63%H2、32%CO和5%CH4的底物流提供给生物反应器中的扬氏梭菌培养物以促进微生物生长和乙醇产生。当所述培养物到达稳定期并且微生物生长不再是主要目标时，将所述底物流转变为15.8%H2、36.5%CO、38.4%N2和9.3%CO2以提供略微过量的CO并促进乙醇产生。该文献还描述了具有更高或更低的CO和H2浓度的气流。
应理解，本文所述的方法可被用于通过捕获工业过程产生的含CO气体并将其用作本文所述发酵过程的底物以减少这些过程中总的大气碳排放。
或者，在本发明的其他实施方案中，所述含CO的气态底物可以源自生物质的气化。所述气化过程涉及生物质在空气或氧气的限制供应下的部分燃烧。所得到的气体一般主要包含CO和H2，还有少量体积的CO2、甲烷、乙烯和乙烷。例如，可将在食品的提取和加工（例如，从甘蔗中得到糖，或从玉米或谷物中得到淀粉）中得到的生物质副产物或者由林业产业产生的非食物生物质废物气化，以产生适合用于本发明的含CO气体。
所述含CO气态底物一般优选地含有较大比例的CO。在具体的实施方案中，所述气态底物包含至少约25体积%、至少约30体积%、至少约40体积%、至少约50体积%、至少约65体积%或者至少约70体积%到约95体积%的CO。所述气态底物中可以不必含有任何氢。所述气态底物还可任选地含有一些CO2，例如约1体积%到约30体积%，例如约5体积%到约10体积%的CO2。
应理解，为了所述细菌生长和CO到乙醇的发酵的发生，除了所述含CO底物气体外，还需要向所述生物反应器加入合适的液体营养培养基。营养培养基包含足以使所用的微生物生长的维生素和矿物质。适合用于使用CO作为唯一碳源进行的乙醇发酵的厌氧培养基是本领域中已知的。例如，合适的培养基记载于美国专利5,173,429和5,593,886、WO02/08438以及上述所引用的其他出版物。在本发明的一个实施方案中，所述培养基如下文中实施例部分所述。
所述发酵应该理想地在适合于所述CO到乙醇的发酵发生的条件下进行。应该考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅拌速率（如果使用连续搅拌釜反应器）、接种物水平、确保所述液相中的CO不成为限制的最大气体底物浓度以及避免产物抑制的最大产物浓度。
所述最佳反应条件部分取决于本发明所用的具体微生物。但是，通常，所述发酵优选在高于环境压力的压力下进行。在增加的压力下操作可使CO从气相向液相的传递速率显著增加，在所述液相中CO可被微生物摄取作为产生乙醇的碳源。这又意味着，当生物反应器维持在提高的压力而非大气压力下时，保留时间（定义为所述生物反应器中的液体体积除以输入气体流速）可减少。
而且，因为给定的CO到乙醇的转化率部分地是所述底物保留时间的函数，而实现需要的保留时间又规定了生物反应器的需要的体积，因此使用增压系统可以大大减少所需要的生物反应器体积，从而减少所述发酵设备的资金成本。根据美国专利5,593,886中给出的实例，反应器体积可相对于反应器内操作压力的增加以线性比例减少，即以10个大气压操作的生物反应器仅需具有以1个大气压操作的那些生物反应器的十分之一的体积。
在他处也已经描述了在提高的压力下进行气体到乙醇的发酵的益处。例如，WO02/08438描述了在30psig和75psig的压力下进行气体到乙醇的发酵，分别得到150g/l/天和369g/l/天的乙醇产率。但是，在大气压下使用相似的培养基和输入气体组成进行的示例性发酵被发现每天每升仅产生1/20到1/10的乙醇。
还需要的是，所述含CO气态底物的引入速率能够确保液相中CO的浓度不会成为限制。这是因为CO受限的条件可能导致所述培养物消耗乙醇产物。
在某些实施方案中，上述本发明的发酵过程将产生在水性培养基中含有乙醇和细菌细胞的发酵液。在所述方法的优选实施方案中，乙醇被从所述发酵液中回收。
在某些实施方案中，回收乙醇包括持续地移出部分发酵液并从所述移出的部分发酵液中回收所述醇。
在具体的实施方案中，所述乙醇回收包括使所移出的含有乙醇的部分发酵液通过分离装置以将细菌细胞从所述发酵液中分离，产生无细胞的含醇的过滤物，并将所述细菌细胞返回至所述生物反应器。
在某些实施方案中，本发明的方法是连续的过程。
在具体的实施方案中，乙酸盐是作为发酵的副产物产生的。
在另一个实施方案中，所述乙醇和乙酸盐被从所述发酵液中回收。
在某些实施方案中，回收乙醇和乙酸盐包括持续地移出部分发酵液并从所述移出的部分发酵液中分别回收乙醇和乙酸盐。
在一些实施方案中，所述回收乙醇和乙酸盐包括使所移出的含乙醇和乙酸盐的部分发酵液通过分离装置以从所述乙醇和乙酸盐中分离细菌细胞，产生无细胞的含乙醇和乙酸盐的过滤物，并将所述细菌细胞返回至所述生物反应器。
在上述实施方案中，所述回收乙醇和乙酸盐优选地包括：首先从所述无细胞的过滤物中分离出乙醇，然后从所述无细胞的过滤物中分离出乙酸盐。优选地然后将所述无细胞过滤物返回至所述生物反应器。
乙醇是所述发酵的优选的且需要的终产物。可通过本领域中已知的方法（例如分级分馏或蒸发以及萃取发酵）而从所述发酵液中回收乙醇。从发酵液中蒸馏乙醇会产生乙醇和水（即，95%乙醇和5%水）的共沸点混合物。随后还可通过使用本领域中熟知的分子筛乙醇脱水技术得到无水乙醇。萃取发酵方法涉及到使用对所述发酵生物具有低毒性风险的水混溶性溶剂，以从稀发酵液中回收乙醇。例如，油醇是可用于此类型萃取方法的溶剂。将油醇持续引入到发酵罐中，于是该溶剂上升并在所述发酵罐的顶部形成一层溶剂层，通过离心机将其连续萃取并进料。因此水和细胞被很容易地从所述油醇中分离出来并返回到所述发酵罐中，而溶有乙醇的溶剂被进料至闪蒸装置中。大部分乙醇被蒸发并凝结，而油醇不易挥发，并被回收以在所述发酵中再利用。
乙酸盐也可使用本领域中已知的方法从所述发酵液中回收。回收乙酸盐的方法在WO2007/117157和WO2008/115080中有详细描述。
在某些实施方案中，通过以下方式从所述发酵液中回收乙醇和乙酸：从所述发酵生物反应器中连续地移出部分发酵液，（便利地通过过滤）将微生物细胞从所述发酵液中分离，并从所述发酵液中首先回收乙醇然后回收乙酸盐。使用上文描述的方法，乙醇可通过蒸馏被方便地回收，而乙酸盐可通过活性炭吸附来回收。分离的微生物细胞优选地被送回至所述发酵生物反应器。已移除乙醇和乙酸盐后的所述无细胞过滤物也优选地被送回至所述发酵生物反应器。可将另外的营养物（例如B族维生素）加入到所述无细胞过滤物中以补充所述营养培养基，之后将其返回到所述生物反应器中。并且，如果如上文所述的对所述发酵液的pH进行调节以增加活性炭对乙酸的吸附，那么应将所述pH重新调节至与所述发酵生物反应器中发酵液相近的pH，之后再将其返回至所述生物反应器中。
反应的化学计量
不希望囿于任何理论，在本发明的方法中发酵CO产生乙醇（a）和乙酸（b）的化学反应被认为如下式：
(a)6CO+3H2O＝>CH3CH2OH+4CO2
(b)4CO+2H2O＝>1CH3COOH+2CO2
以下将参考非限制性实施例对本发明进行更详细的描述。
实施例
材料和方法:
Cr(II)溶液的制备
给1L的三颈烧瓶装配气密入口和出口以使得可在惰性气体下工作，并使得随后可将所需要的产物转移至合适的储存烧瓶。向所述烧瓶中装入CrCl3.6H20（40g,0.15mol）、锌颗粒[20目]（18.3g，0.28mol）、汞（13.55g，1mL，0.0676mol）和500ml蒸馏水。用N2吹洗1小时后，将所述混合物加热至约80℃以起始所述反应。在恒定N2流中搅拌2小时之后，将所述混合物冷却至室温，并且连续搅拌另外48小时，此时所述反应混合物已变成深蓝色溶液。将所述溶液转移至经N2吹扫的血清瓶中并储存在冰箱中备用。
细菌：
所使用的两种类型的自产乙醇梭菌是保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心（GermanCollectionofMicroorganismsandcellcultures,DSMZ）、保藏号为DSM19630和DSM23693的自产乙醇梭菌。DSM23693是由自产乙醇梭菌DSM19630菌株（DSMZ,德国）通过迭代选择方法开发的。
取样和分析步骤
在每个发酵过程中的多个间隔从CSTR反应器中取培养基样本。每次对培养基取样时，小心确保没有气体进入所述反应器或从所述反应器中逸出。
HPLC:
HPLCSystemAgilent1100系列。流动相：0.0025N硫酸。流速和压力：0.800mL/min。柱：AlltechIOA；目录#9648，150×6.5mm，颗粒大小5μm。柱温度：60℃。检测器：折射率。检测器的温度：45℃。
样品制备方法：
将400μL样本、50μL0.15MZnSO4和50μL0.15MBa(OH)2加入微量离心管中。将所述管在4℃下以12000rpm离心10分钟。将200μL上清液转移至HPLC小瓶中，并将5μL注射至所述HPLC仪器中。
顶空分析：
在带有两个已安装的通道的VarianCP-4900microGC上进行测量。通道1是在70℃下，200kPa氩和4.2s回洗时间的条件下运行的10mMol-筛柱，而通道2是在90℃下，150kPa氦且无回洗的条件下运行的10mPPQ柱。两个通道的注射器温度都是70℃。运行时间被设置为120s，但是所有目的峰一般都在100s之前洗脱。
细胞密度：
通过对发酵液的确定等分试样中的细菌细胞计数来测定细胞密度。或者，在600nm（分光光度计）处测量所述样本的吸光度，并根据公开的方法通过计算确定干重。
测序：
基因组测序发现了自产乙醇梭菌菌株LZ1560（DSM19630）的基因组和新菌株LZ1561（DSM23693）的基因组之间的几个变化，这可能有助于改善性能。
两种菌株均在PETC培养基中厌氧生长到光密度（OD600nm）为1，并从100ml过夜培养物中分离基因组DNA。通过离心（6,000×g,15min,4℃）收获细胞，用磷酸钾缓冲液（10mM;pH7.5）洗涤并悬浮于1.9mlSTE缓冲液（50mMTris-HCl,1mMEDTA,200mM蔗糖;pH8.0）中。将所得悬液用300μl溶菌酶（～100,000U;30min,37℃）和280μlSDS溶液（10%(w/v);10min）处理。通过加入240μlEDTA溶液（0.5M;pH8）、20μlTris-HCl（1M;pH7.5）和10μlRNaseA（50,000U）将RNA消化1小时。通过加入100μl蛋白酶K（0.5U）在37℃下进行蛋白酶解，持续1-3h。最后，加入600μl高氯酸钠（5M），然后进行酚氯仿提取和异丙醇沉淀。使用1000分光光度计（ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA）和通过凝胶电泳验证DNA的纯度和数量。
使用454GS（RocheAppliedScience,Indianapolis,IN,USA）进行鸟枪基因组测序。从LZ1560中得到191,368个单个读段，总长度为44,424,523个碱基（10×覆盖），而从LZ1561中得到579,545个配对末端读段，总长度为202,591,572bp（47.5×覆盖）。使用Newbler程序包（RocheAppliedScience,Indianapolis,IN,USA）拼装所述读段，并使用具有MAUVE程序包的Geneious（BiomattersLtd.,Auckland,NZ）（Darlingetal.,2004,GenomeRes.14:1394-1403）以及通过Artemis比较工具（Carveretal.,2008,Bioinformatics24:2672-6）比较序列。
在拼接的LZ1560（DSM19630）和新菌株LZ1561（DSM23693）的基因组序列中共发现64处变化（图4）。虽然大多数变化是单碱基变异，但是发现一处21bp的缺失（在编码推定的DNA错配修复蛋白MutS的基因中；Seq.ID.1-4）和一个含有11个基因（参与氮固定、糖代谢、糖转运和分解代谢物控制）的15,408bp区域（Seq.ID.5）的重排事件。所述62处单碱基变异中，22处为点突变、40处为插入/缺失。这些变异中的18处位于基因间区域，44处位于编码区。虽然所述编码区中的5处变异是沉默的并且不会导致氨基酸序列的改变，但是14处导致单个氨基酸改变和25处会导致移码改变。
最值得关注的是位点212,530（推定的F1FOATP合成酶操纵子的启动子区，Seq.ID.6-7）、1,171,874（推定的Rnf复合体操纵子的启动子区，Seq.ID.8-9）、3,717,495（推定的碳饥饿蛋白的启动子区，Seq.ID.10-11）的改变以及Wood-Ljungdahl-基因簇在3,741,730位点（CO脱氢酶/CO-甲基化乙酰-CoA合酶复合体β亚基，Seq.ID.12-15）及3,748,058位点（5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因，Seq.ID.16-17）的两处变异，其可被直接追溯到依靠CO/H2的生长和能量代谢。大多数受影响的其他基因是未表征的基因。
实施例1:
A:在CSTR中分批发酵
将约1500mL溶液A转移到1.5L发酵罐中并用氮气鼓泡。加入刃天青（1.5mL2g/L的溶液）和H3PO4（85%的溶液，2.25mL），并用浓NH4OH（aq）将pH调到5.3。加入氮川三乙酸（0.3ml0.15M溶液），然后加入1.5ml溶液C。然后加入NiCl2（0.75ml0.1M溶液）和Na2WO3（1.5mL0.01M溶液）。加入15ml溶液B，并将所得溶液用N2鼓泡，然后换为70mL/min的含CO气体（50%CO;28%N2,2%H2,20%CO2）。然后向所述发酵罐接种200ml自产乙醇梭菌19630培养物。使所述发酵罐保持在37℃，并以300rpm搅拌。在该实验过程中，以约0.3ml/h的速率加入Na2S溶液（0.2M溶液）。底物供给依据微生物培养物的需求而增加。
在所用的实验条件下，所述细菌培养物不增殖。在生长48小时后，所述培养物显示出350mMCO摄取（图1a和表2），所述培养物的倍增时间是40.8小时（图2a）。这对应于0.41天-1的单位生长速率。在所述实验过程中，单位CO摄取量增加，最大值为0.54mMCO/min/g生物质。第1.0天的单位摄取量：0.28mMCO/min/g生物质（表1）。第2.0天的单位摄取量：0.54mMCO/min/g生物质（表2）。
B:在CSTR中分批发酵
将约1500mL溶液A转移到1.5L发酵罐中并用氮气鼓泡。加入刃天青（1.5mL2g/L的溶液）和H3PO4（85%的溶液，2.25mL），并用浓NH4OH（aq）将pH调到5.3。加入氮川三乙酸（0.3ml0.15M溶液），然后加入1.5ml溶液C。加入Na2WO3（1.5mL0.01M溶液）。加入15ml溶液B，并将所得溶液用N2鼓泡，然后换为60mL/min的含CO气体（50%CO;50%N2）。然后向所述发酵罐中接种180ml自产乙醇梭菌23693培养物。使所述发酵罐保持在37℃，并以300rpm搅拌。该实验过程中，以约0.12ml/h的速率加入Na2S溶液（0.5M溶液）。底物供给依据微生物培养物的需求而增加。
在所用的实验条件下，所述细菌培养物增殖。在生长43小时后，所述培养物显示出8400mMCO摄取（图2b），所述培养物的倍增时间是9.6小时（图2b）。这对应于1.73天-1的单位生长速率。在所述实验过程中，所达到的最大单位CO摄取量为1.17mMCO/min/g生物质。第1.0天的单位摄取量：1.17mMCO/min/g生物质（表1）。第2.0天的单位摄取量：1.03mMCO/min/g生物质（表2）。所述发酵条件与实施例1A中所用条件一致或者至少高度相似。培养基制品具有相同的组分和相似的浓度，同时两种气体都含有至少50%（v/v）的CO。CO摄取有很大的差异但是发酵条件相似表明，由于与亲代自产乙醇梭菌19630菌株相比所开发的自产乙醇梭菌23693培养物具有提高的效率而导致所述培养物的性能不同。
结果:
表1：第1天
菌株 DSM19630 DSM23693
CO消耗mM/L 113mM 3700mM
乙醇生产g/L 0.48g/L 7.98g/L
乙酸盐生产g/L 4.58g/L 4.06g/L
生物质g/L 0.29g/L 1.83g/L
单位摄取量 0.28CO/min/g生物质 1.17CO/min/g生物质
单位乙醇产生量 2.5g/L/g生物质/天 4.3g/L/g生物质/天
表2：第2天
菌株 DSM19630 DSM23693
CO消耗mM/L 350mM 8150mM
乙醇产生g/L 1.84g/L 26.14g/L
乙酸盐产生g/L 4.5g/L 3.47g/L
生物质g/L 0.41g/L 5.42g/l
单位摄取量 0.54CO/min/g生物质 1.03CO/min/g生物质
单位乙醇产生量 3.0g/L/g生物质/天 6.5g/L/g生物质/天
实施例2
将约1500mL溶液A转移到1.5L发酵罐中，并用氮气鼓泡。加入刃天青（1.5mL2g/L的溶液）和H3PO4（85%的溶液，0.56mL），并用浓NH4OH（aq）将pH调到5.3。加入Na2WO3（1.5mL0.01M的溶液），然后加入溶液C（1.5mL）。加入15ml溶液B，并将所得溶液用N2鼓泡，然后换为60mL/min的含CO气体（50%CO;50%N2）。然后向所述发酵罐中接种100ml自产乙醇梭菌23693培养物。所述发酵罐保持在37℃，并以300rpm搅拌。该实验中，以约0.15ml/h的速率加入Na2S溶液（0.5M溶液）。底物供应依据所述微生物培养物的需求而增加。
在所用的实验条件下，所述细菌培养物增殖。发酵条件与实施例1A+B中所用的条件一致或者至少高度相似，两种气体都含有至少50%（v/v）的CO。使所述培养物生长到稳定期，其中通过HPLC测定最大的乙醇浓度（55.8g/L）。
本文所述的具体方法和组合物代表优选的实施方案，并且是示例性的、不意图限制本发明的范围。本领域技术人员在考虑本发明后可能会想到其他的目标、方面和实施方案，这些其他的目标、方面和实施方案也被包含在本发明的范围和精神中。对本领域技术人员而言非常明显的是，在不背离本发明的范围和精神的前提下，可对本文所公开的发明进行多种替换和修饰。本文所说明性地描述的本发明可在不存在本文中未作为必要因素而具体公开的任何一种或多种要素或者一种或多种限定的条件下适当地实施。因此，例如，在本文中的各种情况下，在本发明的实施方案或实施例中，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被理解为可扩展的和不受限制的。此外，提供题目、标题等以增强读者对本文的理解，而不应当被理解为限制本发明的范围。
如果有的话，上文和下文引用的所有申请、专利和出版物的公开内容均以引用方式纳入本文。但是，本说明书中对任何申请、专利和出版物的引用不是，也不应被理解为承认或任何形式的暗示它们在全世界任何国家可构成有效的现有技术或者形成公知常识的一部分。

Claims (1)

1.一种以保藏号DSM23693保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)的微生物自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)的生物纯分离株。
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Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110256600A1 (en) * 2011-02-02 2011-10-20 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant Microorganisms and Methods of Use Thereof
US8673603B2 (en) 2011-03-31 2014-03-18 Lanzatech New Zealand Limited Fermentation process for controlling butanediol production
WO2013115659A2 (en) * 2012-01-31 2013-08-08 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms and methods of use thereof
US8735115B2 (en) * 2012-03-30 2014-05-27 Lanzatech New Zealand Limited Method for controlling the sulphur concentration in a fermentation method
US20130316364A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 Lanzatech New Zealand Limited Selection Method and Recombinant Microorganisms and uses Therefor
US10233478B2 (en) 2012-09-19 2019-03-19 Ineos Bio Sa Process for reducing CO2 emissions and increasing alcohol productivity in syngas fermentation
US9850503B2 (en) 2013-06-10 2017-12-26 Ineos Bio Sa Control of conductivity in anaerobic fermentation
CN105940100A (zh) * 2014-01-28 2016-09-14 朗泽科技新西兰有限公司 对丁酸具有增加的耐受性的细菌
JP6783658B2 (ja) 2014-01-30 2020-11-11 ランザテク・ニュージーランド・リミテッド 組換え微生物及びその使用方法
US9617566B2 (en) * 2014-07-11 2017-04-11 Lanzatech New Zealand Limited Control of bioreactor processes
KR102390716B1 (ko) 2015-05-27 2022-04-26 란자테크 엔지, 인크. 코리스메이트-유도된 산물의 생산을 위한 유전적으로 조작된 미생물들
US10995347B2 (en) 2015-12-03 2021-05-04 Lanzatech New Zealand Limited Arginine supplementation to improve efficiency in gas fermenting acetogens
JP2018153152A (ja) * 2017-03-21 2018-10-04 積水化学工業株式会社 有機化合物生産システム、並びに、有機化合物の生産方法
US10808263B2 (en) 2017-09-08 2020-10-20 Lanzatech, Inc. Processes and systems for metabolite production using hydrogen rich C1-containing substrates
US11355849B2 (en) * 2017-09-29 2022-06-07 Intel Corporation Antenna package using ball attach array to connect antenna and base substrates
WO2019126400A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Lanzatech, Inc. Microorganisms and methods for the biological production of ethylene glycol
EA202091884A1 (ru) 2018-02-12 2020-10-16 Ланцатек, Инк. Способ повышения эффективности конверсии углерода
WO2019204029A1 (en) 2018-04-20 2019-10-24 Lanzatech, Inc. Intermittent electrolysis streams
KR102549843B1 (ko) 2018-11-19 2023-06-29 란자테크, 인크. 발효와 가스화의 통합
JP7212791B2 (ja) 2019-01-29 2023-01-25 ランザテク，インコーポレイテッド バイオベースの液化石油ガスの生成
MY196166A (en) 2019-02-08 2023-03-17 Lanzatech Inc Process For Recovering Close Boiling Products
US12157908B2 (en) 2019-02-25 2024-12-03 Northwestern University Cell-free protein synthesis platforms derived from clostridia extracts
CN112955560A (zh) 2019-07-11 2021-06-11 朗泽科技有限公司 优化气体利用的方法
US11932818B2 (en) 2020-03-16 2024-03-19 Lanzatech, Inc. Tail gas of gas fermentation to dry gasification feedstock
AU2021237368A1 (en) 2020-03-18 2022-10-06 Lanzatech, Inc. Fermentative production of 2-phenylethanol from gaseous substrates
EP4143325A4 (en) 2020-04-29 2024-09-11 Lanzatech, Inc. FERMENTATIVE PRODUCTION OF BETA-KETOADIPATE FROM GASEOUS SUBSTRATES
EP4162056A4 (en) 2020-06-06 2024-05-29 Lanzatech, Inc. MICROORGANISM WITH TARGETED SEQUENCE INSERTION AT THE ACETOLACTATE DECARBOXYLASE GENE LOCUS
EP4208554A4 (en) 2021-02-08 2024-03-20 Lanzatech, Inc. RECOMBINANT MICROORGANISMS AND THEIR USES
WO2023004293A1 (en) 2021-07-20 2023-01-26 Lanzatech, Inc. Recombinant microorganisms and uses therefor
TW202307202A (zh) 2021-08-06 2023-02-16 美商朗澤科技有限公司 用於改良乙二醇之生物產生的微生物及方法
US12077800B2 (en) 2022-06-16 2024-09-03 Lanzatech, Inc. Liquid distributor system and process of liquid distribution
WO2025016799A1 (de) 2023-07-17 2025-01-23 Basf Se Neue kühlmittelzusammensetzungen

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009064200A2 (en) * 2007-11-13 2009-05-22 Lanzatech New Zealand Limited Novel bacteria and methods of use thereof

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173429A (en) 1990-11-09 1992-12-22 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Clostridiumm ljungdahlii, an anaerobic ethanol and acetate producing microorganism
US5807722A (en) 1992-10-30 1998-09-15 Bioengineering Resources, Inc. Biological production of acetic acid from waste gases with Clostridium ljungdahlii
US5593886A (en) 1992-10-30 1997-01-14 Gaddy; James L. Clostridium stain which produces acetic acid from waste gases
UA72220C2 (uk) 1998-09-08 2005-02-15 Байоенджініерінг Рісорсиз, Інк. Незмішувана з водою суміш розчинник/співрозчинник для екстрагування оцтової кислоти, спосіб одержання оцтової кислоти (варіанти), спосіб анаеробного мікробного бродіння для одержання оцтової кислоти (варіанти), модифікований розчинник та спосіб його одержання
KR100634835B1 (ko) 1999-05-07 2006-10-17 엠마우스 파운데이션 인코퍼레이티드 기질-함유가스로부터 에탄올을 생산하는 클로스트리디움 균주
JP4883872B2 (ja) 2000-07-25 2012-02-22 エモース・フアンデーシヨン・インコーポレーテツド 微生物発酵によるエタノール生産を向上させる方法
US20130252083A1 (en) * 2004-01-13 2013-09-26 John E. Stauffer Lead-zinc battery
NZ546496A (en) 2006-04-07 2008-09-26 Lanzatech New Zealand Ltd Gas treatment process
US7704723B2 (en) * 2006-08-31 2010-04-27 The Board Of Regents For Oklahoma State University Isolation and characterization of novel clostridial species
NZ553984A (en) 2007-03-19 2009-07-31 Lanzatech New Zealand Ltd Alcohol production process
EA018720B1 (ru) 2008-06-09 2013-10-30 Ланзатек Нью Зиленд Лимитед Способ получения бутандиола с помощью анаэробной микробной ферментации
WO2010064932A1 (en) 2008-12-01 2010-06-10 Lanzatech New Zealand Limited Optimised fermentation media
US20110300593A1 (en) * 2008-12-01 2011-12-08 Lanzatech New Zealand Limited Optimised fermentation media
WO2011078709A1 (en) * 2009-12-23 2011-06-30 Lanzatech New Zealand Limited, Alcohol production process
AU2011249140B2 (en) * 2010-05-04 2013-10-03 Lanzatech Nz, Inc. Improved fermentation of waste gases
US8809015B2 (en) * 2010-10-22 2014-08-19 Lanzatech New Zealand Limited Methods and systems for the production of hydrocarbon products
US20130224839A1 (en) * 2011-02-02 2013-08-29 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant Microorganism and Methods of Production Thereof
US9410130B2 (en) * 2011-02-25 2016-08-09 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms and uses therefor
US20130236941A1 (en) * 2012-03-12 2013-09-12 Cobalt Technologies Inc. Integrated Biorefinery
JP5842701B2 (ja) * 2012-03-27 2016-01-13 信越化学工業株式会社 希土類元素が拡散された酸化物セラミック蛍光材料

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009064200A2 (en) * 2007-11-13 2009-05-22 Lanzatech New Zealand Limited Novel bacteria and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
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JP2013532481A (ja) 2013-08-19
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EP2598630A1 (en) 2013-06-05

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