KR101374448B1 - 피부 재생을 촉진하는 의료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 광범위한 전층 피부 결손에 있어서도 상피 형성을 유도할 수 있는 유일한 수단인 자가 피부 이식에 있어서, 자가 피부 이식편을 간편하게 고정화시킬 수 있고, 상피화의 효율을 높여 피부 재생을 재촉할 수 있는 의료용 조성물을 제공한다. 본 발명은, 광 가교성 키토산 유도체와, 아미노산 및/또는 당류를 함유하는 것을 특징으로 하는 의료용 조성물에 관한 것이다. 당해 아미노산은 필수 아미노산인 것이 바람직하고, 당류는 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스에서 선택되는 중성당인 것이 바람직하다.

Description

피부 재생을 촉진하는 의료용 조성물{MEDICAL COMPOSITION FOR PROMOTION OF SKIN REGENERATION}

본 발명은, 광 가교성 키토산 유도체와 글루코오스 등의 당류 및/또는 글리신 등의 아미노산을 함유하는 피부 재생을 촉진할 수 있는 의료용 조성물에 관한 것이다.

피부에는 원래 자기 수복 기능이 구비되어 있고, 단순 외상 등의 경도의 창상이면 자기 수복 기능에 의해 피부가 재생되지만, 중증 화상, 방사선 피폭 복합 창상, 욕창 등의 난치성 창상은 완전한 수복이 곤란하다 (비특허 문헌 1).

창상 치유의 기서는, (1) 염증성 세포, 다음으로 결합 조직의 세포, 표피 세포에 의한 손상부의 인식, (2) 창상부의 수축, 그리고 (3) 육아(肉芽) 형성 및 상피화라는 순서로 진행하는 것으로 되어 있고, 각 단계에 있어서 관여하는 세포, 각종 인자, 사이토카인, 분비물 등이 해명되어 오고 있다.

피부의 수복을 인공적으로 실시하는 피부 창상 치유의 연구도, 창면의 일시적 보호를 목적으로 하는 창상 피복제의 재료 개질에서 시작하여, 창상 치유와 관련된 사이토카인이나 증식 인자 등의 약제 이용에 의한 적극적인 치유를 유도하는 시도에까지 이르렀다. 그러나, 단순 창상에서 난치성 창상에 이르는 다양한 정 도의 피부 창상에 유효한 피복제나 단일 성분의 약제는 아직 존재하지 않고, 특히 중증 화상이나 광범위한 외상에 있어서 중요한 상피 형성까지를 촉진ㆍ유도할 수 있는 기술은 전무하다.

이러한 상황에서, 전(全)층 피부 결손된 환자의 치료에 피부 대체물이 사용되도록 되었다. 표피 세포를 삽입한 피부 대체물은 배양 표피, 진피의 선유아 세포를 삽입한 피부 대체물은 배양 진피, 이들 모두를 삽입한 것은 배양 피부라고 불리고 있다.

예를 들어, 심달성 II도 화상의 치료에는 동결 배양 표피가 이용되고 있고, 동종 배양 표피에서 자기 세포로 치환되어 간다. 그러나, 작은 전층 결손인 경우, 전층 피부 퇴궤양이나 III도 화상에서도 육아 형성의 촉진으로부터 상피화하되는 경우도 있는데, 광범위한 전층 결손에서는 배양 표피의 생착이 나빠, 최종적으로는 자가 피부 이식에 의지하지 않을 수 없다.

현재, 배양 진피로는, 선유아 세포가 삽입되는 매트릭스 소재가 상이한 TransCyte 나 Dermagraft 등의 제품이 Smith & Nephew 사로부터 판매되고 있다. 그러나, 배양 진피도 배양 표피와 동일하게 광범위한 창상으로 상피화를 유도하는 능력은 없고, 기능적 창상 피복제의 범주로부터 일탈하지 않는 것이라고 말할 수 있다.

한편, 표피 세포와 선유아 세포가 삽입된 배양 피부로서, Apligraf (NOVARTIS사) 나 VivoDerm (Convatec사) 등이 시판되고 있다. 그러나, 현실적으로는, 배양 상피층과 진피층의 친화성의 문제나 감염창에서의 임상 효과를 얻을 수 없다는 문제가 있고, 자가 피부로 치환 가능한 피부 대체물의 완성까지는 머나 먼 것이 있다.

또, 종래의 피부 대체물은 동물성 콜라겐이나 인간 혈장 성분의 이용 의존도가 높고, 그 안전성도 염려되고 있다.

또한, 중증 화상에 대해 인공 진피도 사용되도록 되어 있지만, 최종적으로 상피화시키기 위해서는, 재차의 자가 피부 이식이 필요하다. 또, 배양 피부 단독의 중증 화상에 대한 이식은 유효성이 부족하고, 무세포성의 진피와 합한 하이브리드형의 배양 피부를 연구하고 있는 시설도 있는데, 그 임상 평가는 아직 결정되어 있지 않다.

즉, 가장 기능적인 피부 재생ㆍ치료 기술을 필요로 하는 것은, 광범위한 중증 화상 등으로 대표되는 피부 부속기가 남아 있지 않은 전층 피부 결손이고, 그 치유의 열쇠는 신속한 진피 형성과 상피 형성이 잡고 있다. 그러나, 종래의 피부 대체물에서는, 상피 형성에 이르게 할 정도의 능력을 갖는 것은 얻지 못하고 있다. 따라서, 유일하게, 상피화 유도를 기대할 수 있는 것은 자가 피부 이식만이라는 것이 된다. 그러나, 광범위하게 화상을 당한 경우, 자가 피부 이식을 위해 채취할 수 있는 피부의 범위가 한정되어, 창면 전체의 상피화에 필요한 양을 확보하는 것은 곤란하다. 또한, 이식 조직을 피하 조직에 강고하게 고착하기 위한 봉합 혹은 스테이플러 등에 의한 처치는 시간을 필요로 할 뿐만 아니라, 수술 후 붕대 교환 처치의 진통이나 재장해의 위험을 수반하여, 환자 및 의사에게 주는 부담이 큰 것으로 되어 있다.

비특허 문헌 1 : 타카야나기 켄지, 쿠마가이 노리오, 「단백질 핵산 효소」 제45권, 제13호, 2283-2287페이지, 2000년

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

따라서 본 발명에 있어서의 과제는, 중증 화상 등의 광범위한 전층 피부 결손에 있어서의 유일한 상피 재생법인 자가 피부 이식에 있어서, 자가 피부 이식편을 간편하게 고정화시킬 수 있고, 상피화의 효율을 높여 피부 재생을 재촉할 수 있는 의료용 조성물을 제공하는 것에 있다. 특히, 중증 화상의 치료에 있어서는, 조기에 육아의 형성을 촉진시키는 것이 자가 피부 이식 축편의 정착에 크게 관여하는 것으로 알려져 있고, 육아 형성을 재촉하는 단순 고분자 피부 제제의 개발은, 지금까지 많은 화상 전문의에게 기대되어 왔다.

과제를 해결하기 위한 수단

이러한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은, 기재와 당류 및/또는 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 의료용 조성물을 제공한다. 상기 기재로는, 창상 등에 사용되고, 상처의 수복이나 조직 치유ㆍ재생을 서포트하는, 이른바 피복 재료가 바람직하게 사용된다. 예를 들어, 각종 하이드로겔, 하이드로콜로이드, 콜라겐, 젤라틴제제 등을 들 수 있다. 특히, 후술하는 광 가교성 키토산 유도체로 형성되는 하이드로겔을 사용하는 것이 바람직하다.

발명의 효과

본 발명에서 사용되는 광 가교성 키토산 유도체 (PRC : Photo-Crosslinkable Chitosan) 는, 예를 들어, WO00/27889 팜플렛에 기재되어 있는 것에서 선택되고, 400nm 부근의 안전한 자외선에서 접착성의 하이드로겔이 되는 기능성 폴리머로서, 의료용 접착제로서 바람직하게 사용되는 것이다. 따라서, 당해 PRC 를 함유하는 본 발명의 조성물은, 간편한 조작에 의해 자가 이식편 등의 이식 조직을 고정ㆍ밀폐하면서 환부의 감염을 예방하고, 생체가 갖는 활발한 육아 형성능을 보전한다는 PRC 가 갖는 기본적 특징에 추가하고, 또한 조기 분해함으로써 교환시의 재장해에 대한 우려가 없다는 화상 치유를 포함하는 본원 발명의 용도에 특별히 적합한 특성을 갖고 있다.

또한, 놀랍게도, PRC 를 용해시키는 매체에, 아미노산 및/또는 당류를 공존 시킴으로써, 호중구를 중심으로 하는 다핵구가 신속하게 키토산층에 침윤되고, 다핵구에 의한 VEGF 발현 항진, 그것에 수반하는 신생 혈관 형성, 육아 형성 및 상피 형성의 촉진이, 조직의 상해 부위뿐만 아니라 서포트 소재로서의 키토산 겔 내에서도 (PRC 의 분해를 수반하여) 관찰되었다.

PRC 에 세포 증식 인자 등의 창상 치유 촉진제를 함유시킴으로써, 그 창상 치유 활성을 높일 수 있는데 (WO03/090765 팜플렛 참조), 본 발명의 조성물은, 증식 인자 등을 함유하지 않아도, 자가 피부 이식편이나 다른 피부 대체물을 창상 부위에 생착시킬 수 있고, 중증 화상 등의 피부 창상에 있어서 피부 이식편을 서포트하는 소재로서 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 피부 이식편이나 피부 대체물이 존재하지 않아도 상피화를 재촉하여 치유를 촉진시키는 효과가 있어, 피부 창상 치료 약으로서 사용할 수도 있다.

또, 본 발명의 조성물은, 종래의 접착제인 피브린 접착제나 콜라겐 제제 등과 같이 인간 조직 유래의 제제가 아닌 점에서 감염의 위험이 없다는 이점도 갖고 있다.

도 1 은 실시예에 있어서의 자가 피부 이식 실험의 수법의 개략을 나타내는 설명도이다.

도 2 는 실시예 2 에 있어서 본 발명의 조성물 (A) 를 사용했을 때의 창상 부위의 조직 변화를 나타내는 현미경 사진이다.

도 3 은 실시예 2 에 있어서 아미노산 및 당류를 함유하지 않는 조성물 (B) 를 사용했을 때의 창상 부위의 조직 변화를 나타내는 현미경 사진이다.

도 4 는 실시예 3 에 있어서 본 발명의 조성물 (A) 를 사용했을 때에, 창상 부위 조직의 항-VEGF 염색한 단면을 나타내는 현미경 사진이다.

도 5 는 실시예 3 에 있어서 본 발명의 조성물 (A) 를 사용했을 때에, 창상 부위 조직의 항-VEGF 염색한 단면을 나타내는 현미경 사진이다.

도 6 은 실시예 6 에 있어서, 인위적 화상의 형성 및 처치 방법을 나타내는 사진이다.

도 7 은 실시예 6 에 있어서, 화상 부위의 육아 조직의 두께 변화를 나타내는 그래프이다.

도 8 은 실시예 6 에 있어서, 화상 부위의 모세 혈관수의 변화를 나타내는 그래프이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 의료용 조성물에서 사용되는 광 가교성 키토산 유도체 (PRC) 는, 일반적으로 키틴ㆍ키토산류라고 불리는 고분자 골격에 광 반응성 치환기와 당사슬 구조를 도입한 구조를 갖고 있고, 그 중에서도, 적어도 일부가 탈아세틸화된 키틴ㆍ키토산류를 구성하는 글루코사민 단위의 2위치 아미노기의 적어도 일부에 환원성 말단을 갖는 당류를 도입하고, 다른 적어도 일부에 광 반응성 관능기를 도입하여 이루어지는 것인 것이 바람직하다.

통상, 키틴ㆍ키토산류는, 새우 껍데기이나 게 껍데기 등의 갑각류 유래의 키틴질 (폴리-N-아세틸글루코사민) 을 알칼리 처리함으로써 얻어지는 탈아세틸화한 산 가용성 획분으로서, 일반적으로 하기 식 (1), (2) 에서 나타나는 구성 단위를 갖는 것이다. 그 밖에, 오징어 연골, 곤충이나 식물 유래의 원료이어도 아무런 문제는 없다.

이들의 키틴ㆍ키토산류 중탈 아세틸화도가 낮은 것 (통상 40% 미만의 것) 을 「키틴」, 그리고 탈아세틸화도가 높은 것 (통상 40% 이상의 것) 을 「키토산」이 라고 부르는 경우도 있지만, 이하, 본 명세서에서는, 적어도 일부가 탈아세틸화된 키틴ㆍ키토산류를 총칭하여 「키토산」이라고 한다. 또한, 본 발명에 있어서의 키토산은 천연 유래된 것에 한정되지 않고, 화학적, 효소적, 또는 발효 공학적으로 합성된 유사 구조를 갖는 화학 수식 당사슬이어도 된다.

여기서, 「탈아세틸화도」란, 키토산 (혹은, 폴리-N-아세틸글루코사민) 을 구성하는 당 단위의 2위의 아세틸아미노기가 탈아세틸화에 의해 유리 아미노기로 변환되어 있는 비율이다. 본 명세서에서는, 탈아세틸화도는, 「건강 식품 규격 규준집 (그 4)」재단법인 일본 건강ㆍ영양 식품 협회 (1996년) 55페이지에 기재된 「콜로이드 적정법」에 따라 정량된다.

본 발명의 키토산 유도체는, 이 키토산을 더욱 화학적으로 수식함으로써 기능화된 것이고, 원료로서 사용되는 키토산으로는, 탈아세틸화도가 적어도 40%, 특히 60 ∼ 100%, 특히 더 65 ∼ 95% 의 범위에 있는 것이 바람직하다. 또한, 탈아세틸화도가 100% 인 키토산은, 상기 식 (1) 의 구성 단위만으로 이루어지고, 식 (2) 의 구성 단위는 포함하지 않는다.

또, 그 키토산의 분자량에는 특별히 제한은 없고, 최종의 키토산 유도체의 사용 목적에 따라 넓은 범위로 변경할 수 있는데, 일반적으로는, 수평균 분자량이 5,000 ∼ 2,000,000, 바람직하게는 10,000 ∼ 1,800,000, 보다 바람직하게는 40,000 ∼ 1,500,000 의 범위인 것이 적합하다.

본 발명에서 바람직한 키토산 유도체는, 상기 키토산을 구성하는 식 (1) 의 글루코사민 단위의 2위의 아미노기의 적어도 일부에 환원성 말단을 갖는 당류를 도 입하고, 다른 일부에 광 반응성 관능기를 도입한 것이다. 이러한 키토산 유도체의 상세한 설명에 대해서는, WO00/27889호 팜플렛을 참조하기 바란다.

키토산 유도체에 도입되는 환원성 말단을 갖는 당류로는, 알도스류, 케토스류가 함유되고, 그 중에서도, 구성 당 단위의 수 20개 이하, 특히 1 ∼ 7개인 것이 바람직하게 사용된다. 구체적으로는, 예를 들어, 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 푸코오스, 만노오스, 아라비노스, 크실로오스, 에리트로오스, 헵투로오스, 헥시로오스 등의 펜타오스나 헥사오스 ; 글루코사민, N-아세틸글루코사민, 갈락토사민 등의 아미노 당류 ; 우론산류나 데옥시 당류 등의 당 유도체 ; 이들의 단당류를 조합시킨 당사슬로 이루어지는, 말토오스, 이소말토오스, 락토오스, 멜리비오스, 말토트리오스 등의 2 혹은 3 당류 ; 각종 올리고당류 등을 들 수 있는데, 그 중에서도 말토오스, 락토오스, 멜리비오스 등의 중성 이당류가 바람직하다. 특히 글루코오스가 바람직하다.

상기 당류 대신에, 폴리에테르, 다가 알코올 등의 유기 화합물을 키토산으로 유도할 수도 있지만, 생체 적합성 등의 면에서 천연의 당사슬을 이용하는 것이 바람직하다.

키토산의 상기 식 (1) 의 글루코사민 단위의 2위치 아미노기로의 상기의 당류의 도입은, 그 자체가 이미 알려진 방법을 사용하여 실시할 수 있고, 예를 들어, 당류의 환원성 말단을 카르복실화한 후, 그 2위치 아미노기에 아미드 결합에 의해 결합시키는 방법 (예를 들어, 일본 공개특허공보 평10-120705호 참조) 이나, 당류의 환원성 말단을 알데히드화 또는 카르보닐화한 후, 글루코사민 단위의 2위치 아 미노기에, 시프 염기를 경유하는 환원 알킬화법에 의해 결합시키는 방법 (예를 들어, 키틴ㆍ키토산 연구회편 「키틴ㆍ키토산의 응용」 53-56페이지, 1990년 2월 20일, 기호우토 출판 (주) 발행 참조) 등이 포함된다.

본 발명에서 키토산에 도입되는 당류는 1종에만 한정되는 것이 아니고, 2종 이상을 조합하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 키토산 유도체를 구성하는 당측사슬의 구체예로는, 이하의 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

(i) 락토오스로부터 유도되는 당사슬 :

및

(ⅱ) 말토오스로부터 유도되는 당사슬 :

및

(ⅲ) 멜리비오스로부터 유도되는 당사슬 :

및

(ⅳ) 셀로비오스로부터 유도되는 당사슬 :

및

(ⅴ) 라미나리비오스로부터 유도되는 당사슬 :

및

(ⅵ) 만노비오스로부터 유도되는 당사슬 :

및

(ⅶ) N-아세틸키토비오스로부터 유도되는 당사슬 :

및

상기 (i) ∼ (ⅶ) 의 당측사슬 중, 좌측에 기재된 것이 당의 카르복실기와 키토산의 2위치 아미노기의 축합에 의해 도입되는 잔기를 나타내고, 우측에 기재된 것이 시프 염기를 통하여 결합시킨 잔기를 나타낸다.

이와 같이 하여, 키토산의 글루코사민 단위의 2위치 아미노기를 당류로 치환 함으로써, 키토산의 산 의존적 용해성이 완화되어 중성 영역에서의 가용화가 달성된다.

키토산의 글루코사민 단위의 2위치 아미노기의 당측사슬에 의한 치환도는, 최종 키토산 유도체에 요망되는 물성 등에 의해 바꿀 수 있지만, 치환도가 일반적으로는 0.1 ∼ 80%, 특히 0.5 ∼ 60%, 특히 더 1 ∼ 40% 의 범위내에 있는 것이 바람직하다. 여기서, 당측사슬의 「치환도」는, 키토산을 구성하는 당 단위의 2위의 아미노기가 당측사슬로 치환되어 있는 정도로서, 키토산을 구성하는 당 단위의 2위의 유리 아미노기와 치환 아미노기의 합계에 대한 치환 아미노기의 비율로 서 나타낸다. 본 명세서에서는, 당측사슬의 치환도는, 황산 중에서 당사슬이 페놀과 반응하는 것에 기초하는 특징적인 발색을 490nm 의 흡광도로 검지하는 「페놀-황산법」에 따라 측정된다 (J.E.Hodge, B.T.Hofreiter, "Methods in Carbohydrate Chemistry", ed.by R.L.Whistler, M.L.Wolfrom, vol.1, p388, Academic Press, New York (1962) 참조).

또, 본 발명의 키토산 유도체는, 키토산을 구성하는 상기 식 (1) 의 글루코사민 단위의 2위치 아미노기의 적어도 일부에 광 반응성 관능기를 도입함으로써, 광 조사에 의한 자기 가교성이 부여되어 있다.

본 발명에 따라 키토산의 화학 수식에 사용되는 광 반응성 관능기는, 자외선, 특히 약 200 ∼ 380nm 의 근자외 영역을 포함하는 자외선의 조사에 의해 그 광 반응성 관능기끼리 및/또는 키토산 중에 존재하는 아미노기 혹은 수산기 등과 반응하여 가교 결합을 형성하는 것과 같은 기를 포함하고, 예를 들어, 벤조페논류, 계피산류, 아지드류, 디올레핀류, 비스안트라센과 같은 고리형 불포화 화합물 등에서 유도되는 것이 포함되고, 특히, 카르보닐아지드기, 술포닐아지드기, 방향족 아지드기를 갖는 것이 바람직하다.

또, 광 반응성 관능기는, 약 400 ∼ 500nm 정도의 가시광의 조사에 의해 반응하는 치환기이어도 된다. 이러한 관능기로는, 예를 들어, 하기 식에서 나타나는 바과 같은, Journal of Polymer Science : Polymer Chemistry Edition, Vol.20, 1419-1432(1982) 에 기재된 포르밀스티릴 화합물 등을 들 수 있다.

(상기 식 중 Ar 은, 피리딘, 알킬피리디니움염, 퀴놀린, 알킬퀴놀리늄염 등의 복소환을 나타낸다.)

키토산의 글루코사민 단위의 2위의 아미노기에 대한 이러한 광 반응성 관능기의 도입은, 그 자체로 이미 알려진 방법에 의해 실시할 수 있고, 예를 들어, 카르복실기를 갖는 아지드 화합물을 축합제의 존재하에 그 2위의 아미노기에 결합시키는 방법 (일본 공개특허공보 평10-120705호 참조) ; 산 클로라이드기, 알데히드기, N-히드록시숙신산 이미드에스테르기 또는 에폭시기를 통하여 아지드 화합물을 그 2위치의 아미노기와 반응시키는 방법 (키틴ㆍ키토산 연구회편 「키틴, 키토산의 응용」 45 ∼ 65 페이지, 1990년 2월 20일, 기호우토 출판 (주) 발행, 참조) 등의 방법에 의해 실시할 수 있다. 상기의 포르밀스티릴 화합물의 포르밀기를 키토산의 아미노기와 커플링시킴으로써도 바람직하게 도입할 수 있다.

또한, 종래, 아지드기의 가교 반응에 있어서, 비스아지드 이상의 다관능성 화합물이 유효한 것으로 되어 있는데 (일본 공개특허공보 평9-103481호 참조), 본 발명에서는 그 필요는 없고, 모노아지드 화합물의 도입에 의해서도, 충분히 자기 가교성을 갖는 키토산 유도체를 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명의 키토산 유도체 (PRC) 를 구성하는 광 반응성 관능기의 구체예로는, 예를 들어, 자외선의 경우에는, 하기 식 (A) 내지 (D) 로 표시되는 것을 들 수 있다. 식 (A) 의 기는, p-아지드벤조산으로부터 유도되는 것이고, 식 (B) 의 기는, p-아지드벤즈아르데히드로부터 유도되는 것이며, 식 (C) 의 기는, p-벤조일벤조산으로부터 유도되는 것이며, 식 (D) 의 기는, 계피산으로부터 유도되는 것이고, 그리고 식 (E) 는, 1-메틸-4-[2-(포르밀페닐)에테닐]피리디니움으로부터 유도되는 것이다.

이들의 광 반응성 관능기의 도입 정도는, 최종의 키토산 유도체에 요망되는 가교 반응에 기초하는 겔화 (불용화) 의 정도 등에 따라 바꿀 수 있지만, 광 반응성 관능기의 치환도가 0.1% ∼ 80%, 특히 0.5 ∼ 50%, 특히 더 1 ∼ 30% 의 범위내로 하는 것이 바람직하다. 여기서, 광 반응성 관능기의 「치환도」는, 키토 산을 구성하는 당 단위의 2위의 아미노기가 광 반응성 감응기로 치환되어 있는 정도로서, 키토산을 구성하는 당 단위의 2위의 유리 아미노기와 치환 아미노기의 합계에 대한 치환 아미노기의 비율이다. 본 명세서에서는, 광 반응성 관능기, 예를 들어 아지드기의 치환도는, 4-아지드벤조산의 270nm 에 있어서의 특성 흡수로부터 얻어지는 검량선에 기초하여 결정할 수 있다.

본 발명의 키토산 유도체에 있어서의 당측사슬과 광 반응성 관능기의 합계의 치환도는, 특별히 제한되는 것은 아니고, 넓은 범위에 걸쳐 바꿀 수 있지만, 일반적으로는 0.2 ∼ 80%, 바람직하게는 1.5 ∼ 65%, 더욱 바람직하게는 3 ∼ 50% 의 범위내로 할 수 있다.

또, 본 발명의 키토산 유도체에서는, 키토산을 구성하는 상기 식 (1) 의 당 단위의 2위의 아미노기나, 식 (1) 또는 (2) 의 당 단위의 3위치 혹은 6위치의 수산기가 적어도 일부에, 양쪽친매성 기를 도입해도 되고, 그것에 의해 가교 후의 매트릭스에 비약적으로 향상된 함수성을 부가할 수 있다. 이 양쪽친매성 기는, 소수성기를 구비하는 소수 블록과 친수기를 구비하는 친수 블록을 갖는 기이며, 일반적으로 계면활성제 기능을 갖는 경우가 많다. 그 중에서도, 소수 블록 (X) 과 친수 블록 (Y) 의 분자량의 비율이, X : Y = 1 : 5 ∼ 5 : 1 인 것이 바람직하게 사용되고, 해리성의 이온기를 갖지 않는 비이온성의 기를 보다 바람직하게 사용할 수 있다. 특히, 소수성의 알킬 블록과 친수성의 폴리옥시알킬렌 블록으로 구성된 분자량이 적어도 90 이상, 보다 바람직하게는 500 ∼ 10,000 의 폴리옥시알킬렌알킬에테르가 바람직하다. 소수 블록을 갖지 않는 폴리에테르류도 사용할 수 있지만, 소수 블록과 친수 블록의 양방 모두를 갖는 폴리옥시알킬렌알킬에테르가 함수성 향상 면에서 바람직하다.

이러한 양쪽친매성 기의 키토산으로의 도입은, 예를 들어, 양쪽친매성 기의 친수 블록 또는 소수 블록의 어느 일방의 말단에, 아미노기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 기, 예를 들어, 알데히드기나 에폭시기 등을 갖는 화합물을 도입한 후, 키토산의 글루코사민의 2위치 아미노기와 반응시키는 방법이나, 카르복실기를 갖는 폴리옥시알킬렌알킬에테르 유도체와 키토산을 축합제의 존재하에서 반응시키는 방법, 또한 산 클로라이드기를 갖는 폴리옥시알킬렌알킬에테르 유도체와 키토산의 수산기나 아미노기와 반응시키는 방법 등을 사용하여 실시할 수 있다.

예를 들어, 말단에 에폭시기를 유도한 폴리옥시알킬렌알킬에테르기 혹은 말단에 알데히드기를 유도한 폴리옥시알킬렌알킬에테르기를 키토산의 아미노기에 도입한 경우, 키토산 골격에 결합한 측사슬은 하기 식 (a) 혹은 (b) 로 표시된다. 또, 말단에 산 클로라이드기를 유도한 폴리옥시알킬렌알킬에테르기를 키토산의 3위치 또는 6위치의 수산기에 결합시켰을 경우, 키토산 골격에 결합한 측사슬은, 하기 식 (c) 로 표시된다. 단, 하기 식 (a) ∼ (c) 에 있어서의 n 및 m 은 1 이상의 반복 단위수이다.

본 발명의 키토산 유도체에 있어서의 양쪽친매성 기의 도입 정도는, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 도입 후의 키토산 유도체의 중량 변화에 기초하여, 통상 5 ∼ 70%, 바람직하게는 15 ∼ 55% 의 범위내로 할 수 있다.

이상 상세하게 서술한 바와 같이, 본 발명의 의료용 조성물에 사용되는 광 가교성 키토산 유도체에서는, 키토산 골격에 환원성 말단을 갖는 당류 및 광 반응성 관능기가 도입되어도 되고, 임의로 양쪽친매성 기가 도입되어 있어도 된다. 당류를 도입함으로써, 키토산 유도체는 중성 영역에서의 가용성이 우수하고, 생리적 완충액이나 배지 등으로 용액화할 수 있고, 단백질 등의 산이나 알칼리로 변성될 가능성이 있는 약물의 활성을 잃지 않고 혼합할 수 있다. 또한, 광 반응성 관능기를 도입함으로써, 임의의 부위에 적용한 후에 광 조사함으로써 즉시 불용성 겔체를 형성하므로, 피부 대체물 등의 이식편을 조직에 고착시킴과 함께, 상피화를 촉진하여 피부를 재생시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 광 가교성 키토산 유도체의 골격을 이루는 고분자로서, 키토산에 대신하여 히알루론산 등의 다당류나 콜라겐 등의 단백질, 그 외의 합성 고분자 등 어떠한 것을 사용해도 되는데, 창상이나 조직을 밀폐할 수 있고 약물 유지 성이나 적당한 생분해성을 갖고, 지나치게 빠르지 않은 속도로 약물의 컨트롤릴리스가 발생하는 당류가 바람직하고, 그 중에서도, 그 자체가 생체가 높은 창상 치유 활성을 보전하면서 항균성을 갖는 키토산, 혹은 히알루론산 등의 당류, 특히 원재료의 공급이나 코스트 등의 면에서 키토산이 바람직하다.

또, 광 반응성 관능기에 대신하여 화학적 가교성을 갖는 관능기를 도입해도 되지만, 조속한 분자내 가교가 가능하고 그 스위칭이 용이한 것인 것이 바람직하고, 스위칭이 용이하고 반응성도 높으며 미반응의 활성 부위가 남는 것도 적다는 점에서, 광 반응성 관능기가 바람직하게 사용될 수 있다. 또, 2위치에 아미노기를 갖는 키토산은, 광 반응성 관능기의 도입 반응에서도 유리하기 때문에, 이 점에서도 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은, 상기의 광 가교성 키토산 유도체 (PRC) 에 추가하여, 당류 및/ 또는 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하고 있다.

본 발명에서 사용되는 당류는, 특히 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스 또는 푸코오스 등의 중성의 단당류, 이당류, 올리고당류 등의 비교적 저분자량의 당류가 바람직하다. 특히 글루코오스가 바람직하다. 음이온성의 당류를 사용한 경우, 키토산 유도체와의 사이에서 폴리 이온 컴플렉스를 형성하여 광 조사하지 않아도 겔화되어 버리는 경우가 있다.

한편, 본 발명에서 사용되는 아미노산은, 글루타민, 알라닌, 세린 등의 일반적으로 알려진 아미노산이어도 되고, 특별히 한정되지 않지만, 특히 필수 아미노산 (페닐알라닌, 로이신, 발린, 히스티딘, 메티오닌, 이소로이신, 리신, 트레오닌, 트립토판, 아르기닌, 글리신) 을 사용하는 것이 바람직하다

본 발명의 의료용 조성물은, 광 가교성 키토산 유도체 (PRC) 및 아미노산 및/또는 당류, 그리고 다른 임의 성분을, 용매, 바람직하게는 수성 매체에, 바람직하게는 중성의 pH 로 용해시킴으로써 조제할 수 있다. 예를 들어, PRC 의 증류수 또는 인산 완충액 (PBS) 용액에, 아미노산 또는 당류를 첨가해도 되고, PRC 용액을 아미노산 및/또는 당류를 함유하는 세포 배양액과 혼합하여 조제해도 된다. 본 발명에 있어서 특히 바람직하게 사용되는 세포 배양액은, 둘베코의 변성 이글 배지 (D-MEM) 와 햄의 F12 배지의 혼합 배지 (DMEM/F12) 이지만, 기능성 펩티드 연구소나 닛스이 제약에서 시판되고 있는 것이나 리켄 셀 뱅크 등에서 사용되어 있는 인간 세포주의 배양용 배지 등이어도, 원하는 분해 특성 (다핵구 침윤 특성) 을 얻을 수 있다. 그 외의 배지로는, 예를 들어 http ://func-p.co.jp/hitoseihin.html 및 http ://www.brc.riken.jp/l ab/cell/distribution/med_table.shtml 를 참조할 수 있다.

본 발명의 의료용 조성물에 있어서의 광 가교성 키토산 유도체 (PRC) 의 함유량은, 피부 이식편 주변부에 대한 주입성을 확보하고, 가교 후의 겔에 의한 피부 이식편의 담지를 확실하게 하기 위해, 일반적으로는 0.01 ∼ 100mg/ml, 보다 바람직하게는 적어도 1 ∼ 50mg/ml, 더욱 바람직하게는 5 ∼ 30mg/ml, 특히 20mg/ml 정도가 된다.

한편, 아미노산 및/또는 당류의 함유량은 특별히 한정되지 않지만, 아미노산으로는 약 0.01 ∼ 50mg/ml, 보다 바람직하게는 약 0.1 ∼ 25mg/ml, 더욱 바람직하게는 약 0.2 ∼ 200mg/ml 로 원하는 분해성을 얻을 수 있고 또, 당류로는 약 0.1 ∼ 250mg/ml 이고, 보다 바람직하게는 약 1.0 ∼ 200mg/ml, 더욱 바람직하게는 약 1.5 ∼ 150mg/ml 로 원하는 분해성을 얻을 수 있다. 이들의 아미노산류나 당류의 첨가 효과는, PRC 용액으로서 광 조사 전에 불용화되지 않는 한, 단독 첨가든 혼합 첨가든 동일하게 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 조제된 본 발명의 의료용 조성물은, 광 가교성 키토산 유도체 (PRC) 를 함유하고 있기 때문에, 소정 강도의 광 (자외선 및 가시광 등) 을 소정 시간 조사함으로써, 단시간에서 가교하여 불용성의 겔을 형성하고, 피부 이식편을 고정화시킬 수 있다.

광에 의한 가교 조건은, 사용하는 광 가교성 키토산 유도체에 도입한 광 반응성 관능기의 종류나 치환도, 조성물에 함유되는 키토산 유도체의 양이나, 사용하는 조성물의 양에 따라 변화할 수 있는데, 400nm 이하의 파장의 자외선에 의한 소정의 적산 광량이 얻어지면 가교 반응이 신속하게 달성되고, 실용적인 키토산 하이드로겔체를 얻을 수 있다.

예를 들어, 365nm 검출 타입의 시판되는 조도계 (UIT-150, 우시오 전기) 에 의한 광량 측정에 있어서, 50-300mj/㎠ 의 적산 광량으로 당해 조성물은 양호한 가교 하이드로겔 형성을 달성한다. 당해 조성물은 400nm 이하의 파장의 UV-LED, 엑시머레이져, 수은 램프 등에 의한 자외선으로 가교 반응하고, 조사 시간은 조사 강도를 높이면 필요한 적산 광량을 얻을 때까지의 시간을 단축시킬 수 있고, 1초 이하의 조사 시간에서 원하는 하이드로겔체를 얻을 수도 있다.

키토산 매트릭스의 광 반응성기의 가교 반응도는 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 가교 키토산 매트릭스는, 적어도 30%, 바람직하게는 40 ∼ 100%, 보다 바람직하게는 50 ∼ 100%, 보다 바람직하게는 60 ∼ 100%, 더욱 바람직하게는 70 ∼ 100% 의 가교 반응도를 갖는다. 여기서, 본 발명에서 말하는 「가교 반응도 (또는 가교도)」는, 광 가교성 키토산 유도체에 존재하는 광 반응성 관능기 중에서 다른 관능기 등과 결합된 것의 비율을 가리키는 것으로 한다.

본 발명의 의료용 조성물을 사용한 경우, 키토산 겔층에 글루코오스나 아미노산이 첨가되어 있음으로써, 광 가교 반응 후의 키토산 분자의 분자간 거리가 확대되어, 세포의 침윤이 용이하게 되어 있는 것이라고 생각할 수 있다.

또, 아미노산의 첨가에 의해 세포의 침윤이 촉진된 것은, 아미노산의 코팅 효과로 추찰된다. 즉, 시알산으로 덮인 산성 입자인 세포의 진입을 방해하고 있는 키토산의 아미노기를, 아미노산류가 중화함으로써, 세포의 모빌러티가 용이하게 이루어진 것으로 생각된다. 이러한, 키토산 겔 내로의 세포 침윤을 용이하게 하는 첨가물 효과는, 당류나 아미노산류를 단독으로 사용하거나 복합하여 사용해도 유효하고, 그 효과를 감소시키는 경우에는 없다.

글루코오스와 글루타민산은 백혈구 세포의 증식을 자극하는 것이 알려져 있다. 본원 발명자들은, 본 발명에서 관찰된 효과의 주요한 원인이, 당류 또는 아미노산에 의한 세포의 에너지 효과로 생각한다. 즉, 하기의 실시예에 있어서는, 기재로서 광 가교성 키토산 겔을 사용하고 있지만, 당해 키토산 겔을 다른 하이드로겔이나 콜라겐, 혹은 젤라틴제제 등의 기재로 치환해도, 글루코오스 등의 당류 또는 아미노산을 병용함으로써 본 발명의 효과가 얻어지고, 그러한 기재와 당류 및/또는 아미노산을 함유하는 의료용 조성물도 본 발명의 범위내에 있다.

이하, 본 발명을 구체예를 사용하여 더욱 상세하게 설명하지만, 이들의 구체예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

(합성예 1)

광 가교성 키토산 유도체 (PRC) 의 합성

키토산 골격에 자외선 반응성 관능기 및 당사슬을 도입한 PRC 를, WO00/27889 에 기재된 방법에 준하여 합성하였다. 구체적으로는, 새우 유래의 800 ∼ 1000kDa 의 분자량 및 85 의 탈아세틸화도를 갖는 키토산 (야이즈 수산 공업 (주) 제조) 의 아미노기에, 아지드 (p-아지드벤조산) 및 락토오스 (락토비온산) 를 축합 반응에 의해 도입하였다. 락토오스의 도입에 의해 중성 영역의 pH 로 가용성이며, p-아지드벤조산 및 락토비온산의 치환도가, 각각 약 2.5% 및 5.0% 인 것이 확인되었다.

또, 게 껍데기 및 오징어 연골 유래의 키토산 소재를 사용한 경우도, 동일한 유도체를 합성할 수 있었다.

(합성예 2)

광 (가시광) 경화성 키토산 유도체 (VL-RC) 의 합성

하기 식으로 표시되는 메틸-4-[2-(4-포르밀페닐)에테닐]피리딘메트술포네이트 (FPP) 를, Journal of Polymer Science : Polymer Chemistry Edition, Vol.20, 1419-1432(1982) 기재의 방법에 준하여 합성하였다.

구체적으로는, γ-피콜린 (3.07g, 33mmol) 의 메탄올 (8.3ml) 용액을 빙랭 하, 황산 디메틸 (4.16g, 33mmol) 에 첨가하였다. 용액을 실온에서 1시간 방치한 후, 테레프탈알데히드 (13.4g, 100mmol) 를 첨가하여 가열하여 용해시켰다. 이어서 피페리딘 (0.47ml) 을 첨가하여 5시간 환류하였다. 석출물을 뜨거울 때에 여과에 의해 제거하였다. 온로(溫爐)액은 에탄올 (50ml) 과 아세톤 (16.7ml) 의 혼합 용매와 합하여 실온에서 하룻밤 방치하였다. 황색 석출물을 여과에 의해 분리 채취하고, 에탄올 및 아세톤으로 세정 후, 감압 건조시켜 FPP 를 얻었다. 수량(收量) 4.81g (46%), 융점 210 ∼ 213℃ 이었다.

(실시예 1)

래트의 등에 3cm × 3cm 의 크기의 피부 전층 결손을 인위적으로 제조하였다. 그 때, 절제된 피부를 자가 피부 이식편으로 하고, 당해 이식편에 직경 5mm 의 구멍을 12개 형성하였다.

다음으로, 상기 피부 전층 결손 부위에 구멍을 형성한 이식편을 정치(靜置)하고, (A) 그대로 방치한 경우, (B) 이식편을 봉합한 경우, (C) 구멍에 종래의 의료용 접착제 (시아노아크릴아미드계, 상품명 : 다마본드 (J & J사 제조)) 를 충전한 경우, 및 (D) 구멍에 본 발명의 조성물을 충전하고, 자외선을 조사한 경우 (파장 330nm × 15초간) 에 대해, 이하의 항목에 대해 평가하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다.

표 1 에서 명확한 바와 같이, 미처리된 이식편 (A) 에서는 생착률이 현격히 낮고, 이식편을 봉합한 경우 (B) 에는 생착률은 향상되지만, 처리에 10분 이상의 시간을 필요로 한다. 한편, 시아노아크릴아미드계 접착제를 사용한 경우 (C) 에는, 처리 시간 및 생착률 면에서 우수하지만, 이식편 주변에 있어서의 육아 형성이 보이지 않았다. 그러나, 본 발명의 조성물을 사용한 경우 (D) 에는, 처리 시간, 생착률, 및 육아 형성의 모든 점에서 우수하였다.

(실시예 2)

PRC 의 4% 수용액 (증류수) 을 조제하고, 등량의 배지 (DMEM/F12, Invitrogen사 제조) 와 혼합하여 본 실시예의 조성물 (A) 로 하였다. 또, 상기 배지 대신에 등량의 PBS 와 혼합하여 비교 조성물 (B) 를 조제하였다. 조성물 (A) 에서 사용한 배지 (DMEM/F12) 는, 각종 아미노산, 글루코오스, 및 그 외의 성분을 함유하는 무혈청 조직 배양 배지이다.

실시예 1 과 마찬가지로, 마우스의 피부 전층 결손 부위에 자가 피부 이식편을 정치하고, 상기 조성물 (A) 및 (B) 를 충전하여 자외선 조사하였다. 그 후, 이식 부위의 단면 조직을 관찰한 결과를 도 2 및 3 에 나타낸다.

도 2 에 나타내는 바와 같이, 본 발명에 관련된 조성물 (A) 를 사용한 경우에는, 키토산층에 호중구가 고밀도로 침윤하고 (2일째), 이어서 키토산층이 소실됨과 함께 혈관 신생, 육아 형성이 보이고 (4일째), 나아가 상피화가 관찰되었다 (8일째). 그에 대해, 도 3 에 나타내는 아미노산이나 글루코오스를 함유하지 않은 조성물 (B) 를 사용한 경우에는, 키토산층에 대한 세포의 침윤이 보이지 않고, 8일째가 되어 키토산층의 수축이 확인되지만, 키토산층 바로 아래의 조직에 있어서의 침윤은 현저하고 (2일째), 선유아 세포 등에 의한 육아의 형성은 활발하였다.

(실시예 3)

실시예 2 와 동일한 실험을 실시하고, 소정 시간 (4일째) 후, PRC 겔층을 함유하는 조직을 꺼내어, 항-VEGF 항체로 면역 염색하였다. 아미노산, 글루코오스 등을 함유하는 배지를 사용한 실시예 (A) 및 PBS 를 사용한 비교예 (B) 에서 얻어진 결과를 각각 도 4 및 5 에 나타낸다.

도 4 에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 조성물을 사용한 실시예 (A) 에서는, PRC 겔층 내부에 강한 염색이 확인되었다 (도 4(A)). 특히, 겔층의 상층부에 많은 호중구를 포함하는 선유화된 층이 존재하고, 강한 VEGF 염색이 관찰되었다 (도 4(B)).

한편, PBS 에 용해된 비교예 (B) 에서는, PRC 겔층의 분해는 보이지 않고, PRC 겔층이 피하 조직과 접하는 최하층에 강한 염색이 확인되었다 (도 5(A)). 당해 계면 영역에서는 PRC 겔이 선유상으로 변성되고, VEGF 이 강한 염색이 관찰되었다.

(실시예 4)

PRC 를 PBS 에 용해시킨 조성물 (A), (A) 에 50mg/ml 의 D-글루코오스를 첨가한 조성물 (B), 및 (A) 에 5mg/ml 의 글루타민을 첨가한 조성물 (C) 를 조제하였다. 또, 조성물 B 및 C 와 동일한 농도의 글루코오스와 아미노산을 첨가한 조성물 (D) 를 조제하였다.

실시예 2 및 3 과 마찬가지로 마우스의 등부에 피부 전층 결손 부위를 만들고, 당해 부위에 자가 피부 이식편을 정치하고, 상기 조성물 (A), (B), (C) 또는 (D) 를 충전하여 자외선 조사에 의해 경화시켰다. 처리 후 5일째에 조직을 채취하고, 현미경 관찰에 의해 키토산 겔층에 대한 과립구의 침윤 정도를 비교하였다. 결과를 표 2 에 나타낸다.

실시예 2 및 3 에서 확인된 배지에 의한 첨가물 효과는, 글루코오스나 아미노산 단독으로도 관찰되는 것이 명확하다. 또, 첨가하는 아미노산을 필수 아미노산 혼합물로 해도, 동일하게 유효한 과립구 침윤을 관찰할 수 있었다 (데이터는 나타내지 않음).

(실시예 5)

마우스 등부에 2cm 의 피부 전층 결손을 형성하고, 본 발명의 조성물 또는 시판되는 인공 진피인 콜라겐막 (테루다미스 ; 데루모사 제조) 으로 처리하였다 (자가 피부 이식은 하고 있지 않음).

처리 후 6일째에는, 본 발명의 조성물로 처리한 창상 (A) 에서는, 키토산 겔이 이미 소실되고, 육아 형성이 빠르게 주변 조직으로부터의 상피화가 진행되고 있었다. 한편, 콜라겐막으로 처리된 창상 (B) 에서는, 창상 주변 조직으로부터의 상피화는 관찰되지만, 콜라겐막이 잔존되어 있었다. 또, (A) 에서는, 자외선 경화시킨 키토산 겔을 가제 등의 피복재로 덮을 필요는 없지만, (B) 에서는 콜라겐막을 고정시키는 데에 봉합이 필요하고, 실을 뽑을 때에 재차 창상이 발생한다는 문제가 수반하였다.

(실시예 6)

래트의 등부에 인위적으로 III 도 화상을 형성시켜, 괴사 조직을 절제하였다 (도 6a). 다음으로, 당해 부위를 서포트재로서의 본 발명의 조성물 (도 6a) 또는 콜라겐스펀지 (테루다미스 ; 데루모사 제조)(도 6c) 로 처리하였다. 즉, 본 발명의 조성물 (DMEM/F12 함유 PRC 수용액) 을 창상 부분에 충전하여 광경화시킨 예와 콜라겐 스펀지를 사용하여 처리한 예를 비교하였다.

본 발명의 조성물로 처리한 경우에는, 이식 후 6일째 무렵부터 신생 혈관의 발현이 확인되었다. 그에 대해, 콜라겐 스펀지를 사용한 경우에는, 6일째에는 혈류량이 적고, 신생 혈관의 발현은 이식 후 12일 이후에 피크에 도달하였다. 창상 부위에 있어서의 육아 조직의 두께 및 현미경 관찰했을 때의 모세 혈관수의 변화를 도 7 및 8 에 나타낸다. 본 발명의 조성물에 의해, 육아 형성 및 혈관 신생이 현저히 촉진된 것을 알 수 있다.

이식 후 32일에 있어서의 상피의 두께는, 본 발명의 조성물로 처리한 예에서는 평균 67.1㎛ 에 도달했다는 것에 대해, 콜라겐 스펀지로 처리한 예에서는 55.8㎛ 이었다.

즉, 본 실시예의 결과에서, 본 발명의 의료용 조성물을 사용함으로써, 자가 피부 이식편을 사용하지 않아도, 키토산 겔층에 대한 과립구의 침윤에 이어서 신생 혈관의 증가, 나아가서는 상피 형성이 유도된다는 놀랄 만한 결과를 얻을 수 있었다.

Claims (8)

1. 하기 식 (1) 및 (2) :

   [화학식 1]

   

   로 표시되는 구성 단위를 함유하여 이루어지는 키틴ㆍ키토산류의 글루코사민 단위 (1) 의 2 위치 아미노기의 적어도 일부에 환원성 말단을 갖는 당사슬을 도입하고, 다른 적어도 일부에 광 반응성기를 도입하여 이루어지는 고분자인 광 가교성 키토산 유도체로부터 형성된 기재와, 단당류, 이당류 및 올리고당류에서 선택되는 당류를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 재생 촉진용 의료용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,

   아미노산을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 당류가 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스에서 선택되는 중성당인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 2 항에 있어서,

   상기 아미노산이 필수 아미노산인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1 항에 있어서,

   광 가교성 키토산 유도체를 적어도 1mg/ml 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

   창상 치유 촉진약을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 삭제
8. 삭제

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