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WO2024214274A1 - 化学修飾された多糖類を含むポリマー材料 - Google Patents

化学修飾された多糖類を含むポリマー材料 Download PDF

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WO2024214274A1
WO2024214274A1 PCT/JP2023/015143 JP2023015143W WO2024214274A1 WO 2024214274 A1 WO2024214274 A1 WO 2024214274A1 JP 2023015143 W JP2023015143 W JP 2023015143W WO 2024214274 A1 WO2024214274 A1 WO 2024214274A1
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WO
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polysaccharide
polymer material
chitosan
group
polymeric material
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/015143
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English (en)
French (fr)
Inventor
デニス ズフル
カテリーナ カイルリナ
Original Assignee
Ｓｍａｒｔ Ｔｉｓｓｕｅｓ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to PCT/JP2023/015143 priority Critical patent/WO2024214274A1/ja
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F299/00—Macromolecular compounds obtained by interreacting polymers involving only carbon-to-carbon unsaturated bond reactions, in the absence of non-macromolecular monomers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus

Definitions

  • the present invention relates to polymeric materials comprising chemically modified polysaccharides that form antibacterial hydrogels by crosslinking with each other, bioprinting matrices comprising the polymeric materials, and other uses.
  • Bacterial infections have become one of the world's largest public healthcare challenges. Specifically, wound infections, one of the most commonly occurring infections, are a major cause of morbidity and mortality. Meanwhile, contamination in cell cultures by bacteria and other microorganisms remains a major concern for researchers, especially in 3D culture systems where detection by visual tracking is more complicated than in regular 2D cultures.
  • One of the most common means to prevent bacterial contamination in vitro is the use of antibiotics. However, previous studies have raised concerns that antibiotics may induce changes in gene expression and regulation in cells.
  • Chitosan a cationic polysaccharide derived from chitin
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1, etc.
  • most of the sugar units of chitosan contain primary amino groups, it is insoluble in water, organic solvents, and alkaline solutions, although it is soluble in dilute acids.
  • the present invention aims to provide a biomaterial, particularly a hydrogel material, that uses chitosan and has mechanical properties that can be used for a variety of purposes while maintaining the antibacterial properties of chitosan.
  • the inventors discovered that by using a polymer material containing two types of polysaccharides, a hydrophilic chitosan derivative and a neutral hydrophilic polysaccharide capable of forming intermolecular hydrogen bonds with the hydrophilic chitosan derivative, it is possible to obtain a hydrogel that has mechanical properties applicable to a variety of uses by means of photocrosslinking and the like while maintaining the antibacterial properties of chitosan, and thus completed the present invention.
  • the present invention provides ⁇ 1> A polymer material comprising: a) a first polysaccharide having a repeating unit including two types of sugar units, d-glucosamine and N-acetyl-d-glucosamine, the first polysaccharide having a structure in which at least a portion of the amino groups in the d-glucosamine are substituted with a site having a carboxyl group to form an amide bond; and b) a second polysaccharide having a structure in which at least a portion of the hydroxyl groups in the repeating unit are substituted with a functional group selected from the group consisting of an acryl group and a methacryl group, the first polysaccharide and the second polysaccharide both being water-soluble, and the first polysaccharide and the second polysaccharide being capable of forming a hydrogel by crosslinking with each other; ⁇ 2> The polymer material according to claim 1, wherein a hydrogen bond is formed
  • the present invention relates to a bioprinting matrix comprising the above gel material and a use thereof, ⁇ 24> A matrix for bioprinting, comprising the polymer material according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 23> above, wherein the first polysaccharide and the second polysaccharide are crosslinked with each other during bioprinting to form a hydrogel; ⁇ 25> The bioprinting matrix according to ⁇ 24> above, which has antibacterial activity and low toxicity; and ⁇ 26> use of the polymer material according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 23> above or the matrix according to ⁇ 24> or ⁇ 25> above in bioprinting; encapsulation of proteins, particles, or exosomes; or drug delivery.
  • an antibacterial composite hydrogel that has mechanical properties applicable to various applications by means of photocrosslinking or the like while maintaining the antibacterial properties of chitosan.
  • the mechanical properties of such a hydrogel are improved by the formation of hydrogen bonds between the two types of polysaccharides contained in the polymer material.
  • the polymer material of the present invention is biocompatible, water-soluble, and antibacterial, and can be easily gelled by light irradiation, etc., making it useful as a matrix for 3D bioprinting. These properties make it applicable to a wide range of applications, including encapsulation of proteins and drug delivery, tissue engineering, cell culture, drug discovery and screening, in vitro research, tissue regeneration, and regenerative medicine.
  • FIG. 1 shows the FTIR spectra of chitosan (CH) and modified chitosan (LACH).
  • Figure 2 is a graph showing the inhibition activity of E. coli growth in the presence of chitosan (CH) and modified chitosan (LACH). The final concentration of polysaccharide in the graph is in % wt/v.
  • FIG. 3A is a graph showing the growth rate of bacteria in the presence of polysaccharides
  • FIG. 3B is an image of CFUs on an agar plate after 24 hours of incubation.
  • FIG. 4 is a graph showing the decomposition behavior of a hydrogel by an enzyme.
  • FIG. 5 shows the printing properties of the LACH/DEXMA solution: FIG.
  • FIG. 5A is an image of continuous filament formation (shear thinning action) as the precursor polymer solution is extruded;
  • FIG. 5B is a screenshot of the print preview;
  • FIG. 5C is an image of the bioprinting process;
  • FIG. 5D is an image of the printed construct; and
  • FIG. 5E is an image of the square area used to calculate the printing properties.
  • FIG. 6 is a graph showing cell viability in gel-forming polysaccharides (gel precursor polymers).
  • FIG. 7 is a graph showing cell viability in photocrosslinked gels.
  • FIG. 8 is a flow diagram showing the procedure of the protein release assay in Example 7.
  • FIG. 9 is a graph showing the kinetic profile of protein release from photocrosslinked gels.
  • the polymer material of the present invention is characterized in that it contains a) a first polysaccharide and b) a second polysaccharide defined below, both of which are water-soluble and capable of forming a hydrogel by crosslinking with each other.
  • the first polysaccharide of the present invention is a polysaccharide having repeating units containing two types of sugar units, d-glucosamine and N-acetyl-d-glucosamine.
  • the first polysaccharide has a structure in which at least a part of the amino groups in the d-glucosamine is substituted with a site having a carboxyl group to form an amide bond. This chemical modification can increase the water solubility of the first polysaccharide.
  • the "site having a carboxyl group” includes a sugar acid formed by oxidizing a monosaccharide and/or a disaccharide.
  • a sugar acid may preferably include a galactosyl group.
  • the sugar acid may be selected from the group consisting of lactobionic acid, threonic acid, xylonic acid, and gluconic acid derivatives having one or more sugar structures.
  • the first polysaccharide can be a modified cationic polysaccharide.
  • cationic polysaccharides can typically include, but are not limited to, chitosan or chitosan derivatives. In terms of having antibacterial activity, chitosan or chitosan derivatives are preferred.
  • a non-limiting example of the first polysaccharide is a galactosylated chitosan that at least partially comprises the following repeating units:
  • the introduction rate of the carboxyl group-containing moiety in the first polysaccharide can be preferably 1 to 10%. This can increase the water solubility of the first polysaccharide while maintaining the inherent properties of the first polysaccharide, such as antibacterial activity.
  • introduction rate refers to the proportion of amino groups in the first polysaccharide that are substituted by the carboxyl group-containing moiety.
  • the first polysaccharide preferably has a weight average molecular weight (Mw) in the range of 50 to 2000 kDa.
  • the second polysaccharide in the present invention has a structure in which at least a part of the hydroxyl groups in the repeating unit is substituted with a functional group selected from the group consisting of an acrylic group and a methacrylic group.
  • the functional group is a methacrylic group.
  • the second polysaccharide is preferably a modified polysaccharide of a neutral water-soluble polysaccharide. That is, the first polysaccharide is preferably a cationic polysaccharide, whereas the second polysaccharide is preferably neutral and uncharged. This is preferable from the viewpoint of preventing electrostatic interactions with the first polysaccharide and avoiding pH dependency in solubility.
  • the neutral water-soluble polysaccharide may be, for example, a polysaccharide containing a repeating unit selected from the group consisting of glucose, galactose, mannose, and combinations thereof. More specifically, the second polysaccharide may be selected from the group consisting of dextran, chitosan, locust bean gum, carrageenan, and derivatives thereof, and may have the above-mentioned functional groups. Preferably, the second polysaccharide may be dextran, chitosan, or a derivative thereof.
  • a non-limiting example of the second polysaccharide may be a methacrylated dextran that includes, at least in part, the following repeating units: (In the formula, n is a natural number from 2 to 1000.)
  • the second polysaccharide may include, but is not limited to, methacrylated chitosan, which at least in part comprises the following repeating units:
  • the second polysaccharide may preferably have a weight average molecular weight (Mw) in the range of 4 to 2000 kDa.
  • the first polysaccharide and the second polysaccharide are both water-soluble polysaccharides.
  • the first polysaccharide is the above-mentioned galactosylated chitosan; and the second polysaccharide is methacrylated dextran or methacrylated chitosan.
  • the first polysaccharide is a chitosan and the second polysaccharide is a dextran
  • hydrogen bonds can be formed between the amino groups of the chitosan and the hydroxyl groups of the dextran. These hydrogen bonds are weaker than the electrostatic interactions of other polyanionic polymers.
  • the antibacterial properties of chitosan are derived from the electrostatic interactions between the amino groups of the sugar moiety and the negatively charged cell walls of bacterial cells, so the antibacterial properties of chitosan can be maintained by using a neutral dextran or the like as the first polysaccharide.
  • first polysaccharide and the second polysaccharide have the same polymer backbone and may have different chemical modifications.
  • the first polysaccharide may be a galactosylated chitosan and the second polysaccharide may be a methacrylated chitosan.
  • the molar ratio of the first polysaccharide to the second polysaccharide in the polymer material of the present invention is preferably in the range of 1:0.1 to 1:10.
  • the molar ratio can be changed appropriately depending on the type of polysaccharide, etc., from the viewpoint of ease of forming a hydrogel, which will be described later.
  • the first polysaccharide can have a concentration typically in the range of 10 to 100 mg/ml, preferably 25 to 50 mg/ml
  • the second polysaccharide can have a concentration typically in the range of 30 to 200 mg/ml, preferably 50 to 100 mg/ml.
  • the first polysaccharide and the second polysaccharide have the same polymer backbone and, optionally, different chemical modifications.
  • the first polysaccharide and the second polysaccharide contained in the polymer material of the present invention can form a hydrogel by crosslinking with each other. Therefore, the polymer material of the present invention can contain an optional crosslinking agent in addition to the first and second polysaccharides.
  • the crosslinking agent can be added at a concentration of preferably 1 to 10 mg/ml, more preferably 2 to 5 mg/ml.
  • any agent known in the art can be used, for example, a photopolymerization initiator or a water-soluble azo polymerization initiator such as 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure 2959) or 2,2'-azobis[2-methyl-N-(2-hydroxyethyl)propionamide (VA-086) can be used.
  • a photopolymerization initiator or a water-soluble azo polymerization initiator such as 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure 2959) or 2,2'-azobis[2-methyl-N-(2-hydroxyethyl)propionamide (VA-086) can be used.
  • the crosslinking agent contained in the polymer material of the present invention is preferably a water-soluble photocrosslinking agent.
  • the light irradiation time for photocrosslinking is not particularly limited, but typically can be in the range of 1 to 30 minutes.
  • gel generally refers to a dispersion system of polymers that has high viscosity and has lost fluidity, and in which the storage modulus G' and loss modulus G" satisfy the relationship G' ⁇ G".
  • a gel that uses water as a solvent is called a "hydrogel”.
  • the polymeric material of the present invention can be applied to a wide range of applications, such as tissue engineering, cell culture, drug discovery and screening, in vitro research, tissue regeneration and regenerative medicine, etc. More specifically, such applications can include, for example, matrices in bioprinting; encapsulation of proteins, particles, or exosomes; or drug delivery.
  • the polymer material of the present invention is biocompatible, water-soluble, and antibacterial, and can be easily gelled by light irradiation or the like, making it useful as a matrix for 3D bioprinting. Therefore, the present invention also provides a matrix for bioprinting that includes the above-mentioned polymer material and forms a hydrogel by crosslinking the first polysaccharide and the second polysaccharide with each other during bioprinting.
  • the matrix is characterized by having antibacterial activity and low toxicity.
  • the present invention provides the use of the polymeric material or matrix in bioprinting; encapsulation of proteins, particles or exosomes; or drug delivery.
  • the polymer material of the present invention was prepared and a hydrogel was formed from the polymer material according to the following procedure.
  • reaction 1 Synthesis of water-soluble chitosan
  • a water-soluble chitosan material corresponding to the first polysaccharide was prepared by introducing a hydrophilic functional group into chitosan. Specifically, as shown in Scheme 1, chitosan was reacted with lactobionic acid (galactosylation reaction) to modify the amino groups in the chitosan molecule. This reaction yielded a soluble galactosylated chitosan that was soluble up to 60 mg/ml in a buffer in the physiological pH range.
  • FIG. 1 shows the FTIR spectra of chitosan before (left panel: CH) and after modification (right panel: LACH) with lactobionic acid (LA).
  • the most representative changes that confirm the successful implementation of chemical modification are the shift of the absorption band from 1653 cm -1 to 1625 cm -1 , corresponding to the stretching of the C-O bond of the acetamide group of chitosan, and the shift of the absorption band from 1597 cm -1 to 1532 cm -1 , corresponding to the amino group of the polysaccharide. These changes are due to the formation of new amide bonds between the amino group of CH and the carboxyl group of LA.
  • the second polysaccharide of the present invention includes methacrylation by reaction of hydroxyl groups present in the starting polysaccharide with methacrylic anhydride (MA) or glycidyl methacrylate (GMA), which introduces double bond moieties into the second polysaccharide that can be converted to crosslinks by UV light activation.
  • MA methacrylic anhydride
  • GMA glycidyl methacrylate
  • dextran (DEX) was reacted with glycidyl methacrylate (GMA) to obtain methacrylated dextran (DEXMA) as shown in Scheme 2.
  • GMA glycidyl methacrylate
  • the reaction was confirmed by NMR.
  • reaction 4 Addition of photocrosslinker
  • a water-soluble photocrosslinker was added to the mixture of the first and second polysaccharides, and the mixture was gelled by short-term irradiation with light.
  • the photocrosslinker can be a compound that is activated by UV or visible light wavelengths.
  • Chitosan is known to have antibacterial properties.
  • LACH modified chitosan
  • E. coli Escherichia coli
  • the optical density (OD) measurement method of bacterial culture was used to estimate the density of cells in liquid culture in the presence or absence of polysaccharide samples at various time points. Specifically, bacteria were resuspended in LB medium at a concentration of 1x108 CFU/ml, and 300 ⁇ l aliquots of bacterial broth were added to 2700 ⁇ l of medium containing CH, LACH or control. The cultures were incubated at 37°C with moderate agitation.
  • Hydrogels used in vivo must be degraded in a controlled manner to allow the target tissue to regenerate to its natural structure, morphology, and function.
  • Chitosan is easily degraded by enzymes, particularly lysozyme, which is naturally present in various parts of the human body, via cleavage of glycosidic bonds.
  • dextran is known to be susceptible to enzymatic degradation by lysozyme. Therefore, the degradability of the LACH/DEXMA gel of the present invention was examined in the presence of lysozyme.
  • Hydrogels were formed by irradiating a gel precursor solution containing LACH/DEXMA with 5 mW/ cm2 UV light (365 nm) for 2 minutes at a distance of 5 cm from the light source.
  • Low and medium molecular weight LACH were used.
  • the composition of the gel precursor solution is as shown in Table 1 above.
  • VA-086 (2 mg/ml) was added to the gel precursor solution (PBS solution) prior to UV crosslinking.
  • a hydrogel consisting of only DEXMA without LACH was prepared.
  • the degree of decomposition of the gel was calculated from the measured weight change of the gel sample according to the following formula.
  • %DD is the degree of decomposition of the gel
  • W0 is the initial weight of the gel
  • W(t) is the weight of the gel at the time of measurement.
  • hydrogel-based inks with shear-thinning properties are used to prevent excessive shear stress during the bioprinting process, which may affect cell viability.
  • the LACH/DEXMA composite solution (gel precursor) of the present invention has a lower viscosity than the final hydrogel after gelation and exhibits shear-thinning behavior at an optimal composition, as shown in Figure 5A.
  • the bioprinting test was carried out as follows: Bioprinting was performed using a 3d Cultures Tissue Scribe bioprinter. A polymer solution (composition 7 in Table 1) containing modified chitosan (LACH), modified dextran (DEXMA) and VA-086 was loaded into a 3 ml syringe (BD Luer-LokTM) with a nozzle (inner diameter 0.8 mm). A square object of 30 x 30 mm with a height of 5 mm was designed and loaded into the Repeater Host program (Figure 5B). The height was adjusted by scaling the Z axis to 0.1.
  • composition 7 in Table 1 A polymer solution (composition 7 in Table 1) containing modified chitosan (LACH), modified dextran (DEXMA) and VA-086 was loaded into a 3 ml syringe (BD Luer-LokTM) with a nozzle (inner diameter 0.8 mm).
  • the nozzle was 0.8 mm, the layer thickness was 0.8 mm, the initial layer and the filling layer were 0.5 mm, the filling speed was 2 mm/s and the filling rate was 60%.
  • a printing temperature of 25 °C was used. A representative photograph of the printing process is shown in Figure 5C.
  • the structures would exhibit a perfect square shape and the printing characteristic Pr would have a value of 1.
  • a higher Pr value would result in a greater degree of gelation of the bioink, whereas a lower Pr value would result in a lesser degree of gelation of the bioink.
  • a printing characteristic Pr in the range of 0.9 to 1.1 indicates that the bioink is suitable for use in bioprinting applications.
  • the polymer material of the present invention has been demonstrated to be suitable as a bioink for 3D bioprinting applications.
  • LACH modified chitosan
  • DEXMA modified dextran
  • Cells were plated in 96-well plates at a final density of 5x103 cells per well in 100 ⁇ L of DMEM containing 10% FBS and allowed to attach to the bottom of the well overnight. The medium was then replaced with DMEM containing 0.5% w/ v of the polymer sample (same concentration as in Example 3) under serum-free conditions. The cells were incubated for 48 hours at 37°C in 5% CO2. After the incubation period, XTT reagent (BIOTIUM, Cat: 10060y Lot: 17X0824) was added and the cells were incubated for another 2 hours.
  • XTT reagent (BIOTIUM, Cat: 10060y Lot: 17X0824) was added and the cells were incubated for another 2 hours.
  • a polymer material (precursor solution) containing LACH and DEXMA was prepared according to the composition in Table 1, and mesenchymal stem cells were encapsulated (1 x 106 /ml). Then, 30 ⁇ l droplets were dispensed into wells of a 96-well plate. As a comparative example, the same cell density was resuspended in methacrylated gelatin (Gelma), the most common photocrosslinking polymer used as bioink. Finally, the plate was irradiated with 5 mW/ cm2 UV light (365 nm) for 2 minutes at a distance of 5 cm from the light source. The cell viability was evaluated using the XXT assay described above.
  • the obtained dynamic release profile is shown in Figure 9.
  • a strong release of protein occurs, known as the burst effect.
  • a sustained protein release is observed from 24 to 168 hours.
  • the release of BSA becomes stable after 48 hours.
  • the result of a burst effect value of approximately 30% suggests that the hydrogel of the present invention can provide both the targeted initial delivery of the drug at the required dose and the subsequent long-term maintenance of a constant therapeutic concentration in the internal environment.
  • MACH methacrylated chitosan
  • LACH (medium molecular weight) and MACH were dissolved in PBS and photocrosslinked in the presence of the crosslinker VA-086.
  • Photocrosslinking was performed by irradiating a 30 ⁇ l drop of the polymer mixture with 365 nm light at an intensity of 5 mW/ cm2 and a distance of 5 cm to the light source. The results obtained using various polymer ratios are shown in Table 2.

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Abstract

【課題】　キトサンの抗菌性を維持しつつ、種々の用途に適用可能な機械的特性を備えた、キトサンを利用した生体材料、特にハイドロゲル材料を提供することを課題とする。 【解決手段】 親水性のキトサン誘導体と、これと分子間で水素結合を形成し得る中性の親水性多糖類の２種類の多糖類を含むポリマー材料を用いることで、キトサンの抗菌性を維持しつつ、光架橋等の手段により種々の用途に適用可能な機械的特性を有するハイドロゲルが得られることを見出した。

Description

化学修飾された多糖類を含むポリマー材料
　本発明は、互いに架橋することにより抗菌性ハイドロゲルを形成する化学修飾された多糖類を含むポリマー材料、当該ポリマー材料を含むバイオプリンティング用マトリクス、及びその他の用途に関する。
　細菌感染は世界最大の公的医療の課題の１つとなっている。具体的には、最も一般的に発症する感染症の１つである創傷感染症は、罹患率と死亡率の主要な原因である。一方で、細菌やその他の微生物による細胞培養における汚染は、特に視覚追跡による検出が通常の２次元培養よりも複雑な３次元培養システムにおいて、研究者にとって依然として大きな懸念事項である。ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける細菌汚染を防ぐための最も一般的な手段の１つは抗生物質の使用である。しかし、これまでの研究では、抗生物質によって遺伝子の発現と調節の変化が細胞内で誘発される可能性が懸念されている。
　キチン由来のカチオン性多糖類であるキトサンは、生分解性、生体適合性、非毒性、抗菌性を有する再生可能なポリマーであり、医学、化粧品、食品産業、農業の分野などで応用が期待されている（非特許文献１等）。しかしながら、キトサンは、ほとんどの糖単位に一級アミノ基が存在するため、希酸には溶解するものの、水、有機溶媒、アルカリ性溶液には不溶性である。 
　そのため、従来は、キトサンの抗菌性を維持しつつ、溶媒として水を含むハイドロゲル等の材料を構築することは困難であった。
Dashら, Progress in Polymer Science, Vol. 36, 981-1014, 2011
　そこで、本発明は、キトサンの抗菌性を維持しつつ、種々の用途に適用可能な機械的特性を備えた、キトサンを利用した生体材料、特にハイドロゲル材料を提供することを課題とするものである。
　本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討の結果、親水性のキトサン誘導体と、これと分子間で水素結合を形成し得る中性の親水性多糖類の２種類の多糖類を含むポリマー材料を用いることで、キトサンの抗菌性を維持しつつ、光架橋等の手段により種々の用途に適用可能な機械的特性を有するハイドロゲルが得られることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は、一態様において、
＜１＞　ポリマー材料であって、ａ）ｄ－グルコサミン及びＮ-アセチル－ｄ－グルコサミンの２種の糖単位を含む繰り返しユニットを有する第１の多糖類であって、ｄ－グルコサミンにおけるアミノ基の少なくとも一部がカルボキシル基を有する部位で置換されてアミド結合を形成している構造を有する、前記第１の多糖類；及びｂ）第２の多糖類であって、繰り返しユニットにおけるヒドロキシル基の少なくとも一部が、アクリル基及びメタクリル基よりなる群から選択される官能基で置換されている構造を有する、前記第２の多糖類を含み、前記第１の多糖類及び前記第２の多糖類が、いずれも水溶性であり、及び前記第１の多糖類及び前記第２の多糖類が、互いに架橋することによりハイドロゲルを形成可能である、前記ポリマー材料；
＜２＞前記前記第１の多糖類と前記第２の多糖類との間で水素結合が形成される、請求項１に記載のポリマー材料；
＜３＞前記第１の多糖類における前記カルボキシル基を有する部位が、単糖類及び／又は二糖類が酸化された糖酸を含む、上記＜１＞に記載のポリマー材料；
＜４＞前記糖酸が、ガラクトシル基を含む、上記＜２＞に記載のポリマー材料；＜５＞前記糖酸が、ラクトビオン酸、トレオン酸、キシロン酸、及び、１以上の糖構造を有するグルコン酸誘導体よりなる群から選択される、上記＜２＞に記載のポリマー材料；
＜６＞前記第１の多糖類における前記カルボキシル基を有する部位による導入率が、１～１０％である、上記＜１＞に記載のポリマー材料；
＜７＞前記第２の多糖類における前記官能基が、メタクリル基である、上記＜１＞に記載のポリマー材料；
＜８＞前記第１の多糖類が、５０～２０００ｋＤａの範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、上記＜１＞に記載のポリマー材料；
＜９＞前記第２の多糖類が、４～２０００ｋＤａの範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、上記＜１＞に記載のポリマー材料；
＜１０＞前記第１の多糖類が、抗菌活性を有する、上記＜１＞に記載のポリマー材料；
＜１１＞前記第１の多糖類が、カチオン性多糖類の修飾多糖類である、上記＜１＞に記載のポリマー材料；
＜１２＞前記カチオン性多糖類が、キトサン又はキトサン誘導体である、上記＜１０＞に記載のポリマー材料；
＜１３＞前記第１の多糖類が、以下の繰り返しユニット：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 を少なくとも部分的に含むガラクトシル化キトサンである、上記＜１＞に記載のポリマー材料；
＜１４＞前記第２の多糖類が、中性の水溶性多糖類の修飾多糖類である、上記＜１＞に記載のポリマー材料；
＜１５＞前記中性の水溶性多糖類が、グルコース、ガラクトース、マンノース、及びそれらの組み合わせよりなる群から選択される繰り返しユニットを含む、上記＜１３＞に記載のポリマー材料；
＜１６＞前記第２の多糖類が、デキストラン、キトサン、ローカストビーンガム、カレギーナン、及びそれらの誘導体よりなる群から選択される、上記＜１＞に記載のポリマー材料；
＜１７＞前記第２の多糖類が、以下の繰り返しユニット：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 を少なくとも部分的に含むメタクリル化デキストランである、上記＜１＞に記載のポリマー材料；
＜１８＞前記第２の多糖類が、以下の繰り返しユニット：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 を少なくとも部分的に含むメタクリル化キトサンである、上記＜１＞に記載のポリマー材料；
＜１９＞前記第１の多糖類と前記第２の多糖類のモル比が、１：０．１～１：１０の範囲である、上記＜１＞に記載のポリマー材料；
＜２０＞前記第１の多糖類及び前記第２の多糖類が、同じポリマー骨格を有しており、場合により互いに異なる化学修飾を有する、上記＜１＞に記載のポリマー材料；
＜２１＞架橋剤をさらに含む、上記＜１＞に記載のポリマー材料；
＜２２＞前記架橋剤が、水溶性の光架橋剤である、上記＜２１＞に記載のポリマー材料；及び
＜２３＞バイオプリンティングにおけるマトリクス；タンパク質、粒子、若しくはエクソソームのカプセル化；又は、ドラッグデリバリーに用いるための、上記＜１＞に記載のポリマー材料
を提供するものである。
　また、別の態様において、上記ゲル材料を含むバイオプリンティング用マトリクス及びその使用にも関し、
＜２４＞上記＜１＞～＜２３＞のいずれか１に記載のポリマー材料を含み、バイオプリンティングにおいて前記第１の多糖類と前記第２の多糖類が互いに架橋することによりハイドロゲルを形成する、バイオプリンティング用マトリクス；
＜２５＞抗菌活性を有し及び低毒性である、上記＜２４＞に記載のバイオプリンティング用マトリクス；及び
＜２６＞バイオプリンティング；タンパク質、粒子、若しくはエクソソームのカプセル化；又は、ドラッグデリバリーにおける、上記＜１＞～＜２３＞のいずれか１に記載のポリマー材料又は上記＜２４＞若しくは上記＜２５＞に記載のマトリクスの使用
を提供するものである。
　本発明によれば、キトサンの抗菌性を維持しつつ、光架橋等の手段により種々の用途に適用可能な機械的特性を有する抗菌性複合ハイドロゲルを得ることができる。かかるハイドロゲルは、ポリマー材料に含まれる２種の多糖類が互いに水素結合を形成することで、その機械的特性が向上している。
　また、本発明のポリマー材料は、生体適合性及び水溶性を有し、かつ抗菌性をも有するものであり、光照射等により容易にゲル化し得るため、３Ｄバイオプリンティング用マトリクスとして有用である。かかる特性により、タンパク質等のカプセル化やドラッグデリバリーなどを含む、組織工学、細胞培養、薬物発見および薬物スクリーニング、インビトロ研究、組織再生および再生医療などの幅広い用途に適用可能である。
図１は、キトサン（ＣＨ）及び修飾キトサン(ＬＡＣＨ)のＦＴＩＲスペクトルである。 図２は、キトサン（ＣＨ）及び修飾キトサン(ＬＡＣＨ)の存在下における大腸菌増殖の阻害活性を示すグラフである。グラフ中の多糖類の最終濃度は％ｗｔ／ｖである。 図３Ａは、多糖類の存在下での細菌の増殖率を示すグラフであり、図３Ｂは、２４時間のインキュベーション後の寒天プレートにおけるＣＦＵの画像である。 図４は、酵素によるハイドロゲルの分解挙動を示すグラフである。 図５は、ＬＡＣＨ／ＤＥＸＭＡ溶液の印刷特性を示すものであって、図５Ａは、前駆体ポリマー溶液が押し出されるときの連続フィラメント形成(ずり減粘動作)の画像；図５Ｂは、印刷プレビューのスクリーンショット；図５Ｃは、バイオプリンティングプロセスの画像；図５Ｄは、印刷された構造物の画像；及び、図５Ｅは、印刷特性の計算に使用した正方形領域の画像である。 図６は、ゲルを形成する多糖類（ゲル前駆体ポリマー）における細胞生存率を示すグラフである。 図７は、光架橋ゲルにおける細胞生存率を示すグラフである。 図８は、実施例７のタンパク質放出アッセイの手順を示すフロー図である。 図９は、光架橋ゲルからのタンパク質放出の動態プロファイルを示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
１．本発明のポリマー材料
　本発明のポリマー材料は、以下に規定されるａ）第１の多糖類とｂ）第２の多糖類を含み、第１及び第２の多糖類はいずれも水溶性であり、かつ、互いに架橋することによりハイドロゲルを形成可能であることを特徴とする。
１－１．第１の多糖類
　本発明における第１の多糖類は、ｄ－グルコサミン及びＮ-アセチル－ｄ－グルコサミンの２種の糖単位を含む繰り返しユニットを有する多糖類である。そして、当該ｄ－グルコサミンにおけるアミノ基の少なくとも一部がカルボキシル基を有する部位で置換されてアミド結合を形成している構造を有するものである。かかる化学修飾により、第１の多糖類の水溶性を高めることができる。
　好ましい態様において、上記「カルボキシル基を有する部位」は、単糖類及び／又は二糖類が酸化された糖酸を含む。かかる糖酸は、好ましくは、ガラクトシル基を含むことができる。例えば、当該糖酸としては、ラクトビオン酸、トレオン酸、キシロン酸、及び、１以上の糖構造を有するグルコン酸誘導体よりなる群から選択されるものを挙げることができる。
　好ましい態様において、第１の多糖類は、カチオン性多糖類の修飾多糖類であることができる。そのようなカチオン性多糖類としては、典型的には、キトサン又はキトサン誘導体を挙げることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。抗菌活性と有するという点では、キトサン又はキトサン誘導体が好適である。
　第１の多糖類の非限定的な具体例としては、以下の繰り返しユニットを少なくとも部分的に含むガラクトシル化キトサンを挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　ここで、第１の多糖類における上記カルボキシル基を有する部位による導入率は、好ましくは、１～１０％であることができる。これにより、第１の多糖類の水溶性を高めつつ、第１の多糖類が本来的に有する抗菌活性等の特性を維持したものとすることができる。ここで、「導入率」とは、第１の多糖類におけるアミノ基のうち、上記カルボキシル基を有する部位によって置換されたものの割合を意味する。
　また、第１の多糖類は、好ましくは、５０～２０００ｋＤａの範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。
１－２．第２の多糖類
　本発明における第２の多糖類は、繰り返しユニットにおけるヒドロキシル基の少なくとも一部が、アクリル基及びメタクリル基よりなる群から選択される官能基で置換されている構造を有するものである。当該官能基は、メタクリル基である。かかる官能基を有することにより、第２の多糖類の水溶性を高めることができる。
　第２の多糖類は、好ましくは、中性の水溶性多糖類の修飾多糖類である。すなわち、上記第１の多糖類はカチオン性多糖類であることが好ましいが、これに対して、第２の多糖類は電荷を有しない中性であることが好ましい。これは、第１の多糖類との静電相互作用を防ぎ、溶解度におけｐＨ依存性を回避する観点で好ましい。
　中性の水溶性多糖類としては、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、及びそれらの組み合わせよりなる群から選択される繰り返しユニットを含む多糖類を挙げることができる。より具体的には、第２の多糖類は、デキストラン、キトサン、ローカストビーンガム、カラギーナン、及びそれらの誘導体よりなる群から選択され、かつ上記官能基を有するものであることができる。好ましくは、第２の多糖類は、デキストラン、キトサン、又はそれらの誘導体であることができる。
　第２の多糖類の非限定的な具体例としては、以下の繰り返しユニットを少なくとも部分的に含むメタクリル化デキストランを挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、ｎは２～１０００の自然数である。）
　別の好ましい態様では、第２の多糖類の非限定的な具体例としては、以下の繰り返しユニットを少なくとも部分的に含むメタクリル化キトサンを挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　第２の多糖類が、好ましくは、４～２０００ｋＤａの範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有することができる。
　本発明において、第１の多糖類及び第２の多糖類が、いずれも水溶性の多糖類である。典型的には、第１の多糖類は、上記ガラクトシル化キトサンであり；第２の多糖類は、メタクリル化デキストラン又はメタクリル化キトサンである。
　例えば、第１の多糖類がキトサン類であり、第２の多糖類がデキストラン類である場合、キトサンのアミノ基とデキストランのヒドロキシル基との間で水素結合を形成することができる。この水素結合は、他のポリアニオン性ポリマーの静電相互作用と比較して弱い結合となる。ここで、キトサンの抗菌特性は、糖部分のアミノ基と細菌細胞の負に帯電した細胞壁との間の静電相互作用に由来するため、第１の多糖類として中性のデキストラン等を用いることにより、キトサンの抗菌性を維持することができる。
　別の好ましい態様では、第１の多糖類及び第２の多糖類は、同じポリマー骨格を有しており、場合により互いに異なる化学修飾を有することもできる。具体的には、第１の多糖類がガラクトシル化キトサンであり、第２の多糖類がメタクリル化キトサンの組合せを用いることができる。
　好ましい態様において、本発明のポリマー材料中に第１の多糖類と前記第２の多糖類のモル比は、好ましくは、１：０．１～１：１０の範囲である。ただし、当該モル比は、後述のハイドロゲルの形成のし易さ等の観点から、多糖類の種類等に応じて適宜変更することができる。例えば、第１の多糖類は、典型的には１０～１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２５～５０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度であり、第２の多糖類は、典型的には３０～２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５０～１００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度であることができる。
　また、好ましい態様では、第１の多糖類及び第２の多糖類は、同じポリマー骨格を有しており、場合により互いに異なる化学修飾を有する。
１－３．その他の成分
　本発明のポリマー材料に含まれる第１の多糖類と第２の多糖類は、互いに架橋することによりハイドロゲルを形成可能である。そのため、本発明のポリマー材料は、上記第１及び第２の多糖類の他に、任意の架橋剤を含むことができる。当該架橋剤は、好ましくは１～１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは２～５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加することができる。
　そのような架橋剤としては、当該技術分野において公知の物を用いることができるが、例えば、2-ヒドロキシ-4′-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノン（Irgacure 2959）や2,2'-アゾビス[2-メチル-N-(2-ヒドロキシエチルl)プロピオンアミド（VA-086）などの光重合開始剤又は水溶性アゾ重合開始剤を用いることができる。
　好ましくは、本発明のポリマー材料に含まれる架橋剤は、水溶性の光架橋剤である。光架橋を行う際の光照射時間は、特に限定されるものではないが、典型的には、１～３０分の範囲で行うことができる。
　なお、本明細書中において、「ゲル」とは、一般に、高粘度で流動性を失った高分子の分散系であり、貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ”においてＧ’≧Ｇ”の関係性を有する状態をいう。水を溶媒とするゲルを「ハイドロゲル」という。
１－４．用途
　本発明のポリマー材料は、組織工学、細胞培養、薬物発見および薬物スクリーニング、インビトロ研究、組織再生および再生医療などの幅広い用途に適用可能である。より具体的には、そのような用途としては、例えばバイオプリンティングにおけるマトリクス；タンパク質、粒子、若しくはエクソソームのカプセル化；又は、ドラッグデリバリーなどを挙げることができる。
　特に、本発明のポリマー材料は、生体適合性及び水溶性を有し、かつ抗菌性をも有するものであり、光照射等により容易にゲル化し得るため、３Ｄバイオプリンティング用マトリクスとして有用である。したがって、本発明は、上記ポリマー材料を含み、バイオプリンティングにおいて前記第１の多糖類と前記第２の多糖類が互いに架橋することによりハイドロゲルを形成する、バイオプリンティング用マトリクスを提供するものでもある。当該マトリクスは、抗菌活性を有し、かつ低毒性であることを特徴とする。
　別の観点において、本発明は、バイオプリンティング；タンパク質、粒子、若しくはエクソソームのカプセル化；又は、ドラッグデリバリーにおける、上記ポリマー材料又は上記マトリクスの使用を提供するものでもある。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
１．ポリマー材料の調製
　以下の手順で、本発明のポリマー材料の調製及び、当該ポリマー材料にからハイドロゲルを形成した。
［反応１：水溶性キトサンの合成］
　キトサンに親水性官能基を導入して、第１の多糖類に対応する水溶性キトサン材料を調製した。具体的には、スキーム１に示すように、キトサンをラクトビオン酸と反応させて（ガラクトシル化反応）、キトサン分子中のアミノ基を修飾した。この反応により、生理的ｐＨ範囲のバッファーに６０ｍｇ/ｍｌまで溶解可能な可溶性のガラクトシル化キトサンが得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
　ＦＴＩＲによってガラクトシル化キトサンの生成を確認した。測定に用いた波数領域は４０００～１０００ｃｍ－１の範囲である。図１は、ラクトビオン酸（ＬＡ）によるキトサンの修飾前 (左図：ＣＨ) と修飾語（右図：ＬＡＣＨ）におけるＦＴＩＲスペクトルである。化学修飾の実行が成功したことを確認する最も代表的な変化は、キトサンのアセトアミド基のＣＯ結合の伸縮に対応する１６５３ｃｍ－１から１６２５ｃｍ－１への吸収バンドの変位、及び、多糖類のアミノ基に対応する１５９７ｃｍ－１から１５３２ｃｍ－１への吸収バンドの変位である。これらの変化はＣＨのアミノ基とＬＡのカルボキシル基の間の新しいアミド結合の形成によるものである。
［反応２：第２の多糖類の修飾］
　本発明の第２の多糖類は、原料多糖類に存在するヒドロキシル基とメタクリル酸無水物（ＭＡ)又はグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ)との反応によるメタクリル化が含まれる。この反応は、第２の多糖類に二重結合部分を導入するものであり、当該二重結合部分はＵＶ光活性化によって架橋結合に変換され得る。
　具体的には、スキーム２に示すように、デキストラン（ＤＥＸ）とグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ)を反応させ、メタクリル化デキストラン（ＤＥＸＭＡ）を得た。反応をＮＭＲにより確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
　反応を１Ｈ-ＮＭＲにより確認した（溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）。その結果、δ５～４．４ｐｐｍの領域のプロトンピークは、デキストランの無水グルコース単位におけるアノマープロトンを表している。修飾前のデキストランには存在しないアクリル基 (-CH=CH2) のピークがδ５．６－６．３ｐｐｍの範囲に現れたことから、メタクリル化デキストランが得られたことが分かった。
［反応３：第１及び第２の多糖類の混合］
　次いで、上記で合成した水溶性キトサン（ＬＡＣＨ：第１の多糖類）とメタクリル化デキストラン（ＤＥＸＭＡ：第２の多糖類）を混合した。これにより、スキーム３に示すように、ＬＡＣＨのアミノ基と、ＤＥＸＭＡのヒドロキシル基との間で水素結合が形成される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
［反応４：光架橋剤の添加］
　第１及び第２の多糖類の混合物に、水溶性光架橋剤を添加した後、光を短時間照射することで、ゲル化させた。光架橋剤は、ＵＶ 又は可視光の波長によって活性化される化合物を用いることができる。
２．ゲル化条件の検討
上記で合成した第１及び第２の多糖類であるＬＡＣＨ及びＤＥＸＭＡをＰＢＳに溶解し、架橋剤としてＩｒｇａｃｕｒｅ ２９５９又はＶＡ－０８６（2,2'-アゾビス[2-メチル-N-(2-ヒドロキシエチル)プロピオンアミド]）の存在下で光架橋を行った。光架橋は、３０ｕｌのポリマー滴に、３６５ｎｍの光を５ｍＷ／ｃｍ２の強度で光源まで５ｃｍの距離で照射した。種々の分子量のＬＡＣＨについて複数の濃度を用い、また種々の濃度のＤＥＸＭＡを用いて光架橋した場合の結果を表１に示す。なお、Ｉｒｇａｃｕｒｅ ２９５９及びＶＡ－０８６は、全ての濃度において同じ結果であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１に示すように、ＬＡＣＨの原料となるキトサンの分子量は、ゲル化に影響しないことが分かった。実験で用いたＬＡＣＨの条件では、ゲル形成が得られたＤＥＸＭＡ濃度の最小値は５０ｍｇ／ｍｌであった。光開始剤が低濃度の場合、又はＤＥＸＭＡが低濃度の場合には、ゲル化のために要する曝露時間が長くなる傾向がみられた。光開始剤の最高濃度(５ｍｇ／ｍｌ)の条件では、ほぼすべてのＬＡＣＨ／ＤＥＸＭＡ比において１分以内にゲルの形成が得られた。表１における最適な条件（７番目）は、光開始剤の潜在的な毒性、ゲル化時間、及びポリマー比率を考慮して選択されたものである。
３．抗菌特性の検討
　キトサンが抗菌特性を有することが知られている。上記で合成した修飾キトサン(ＬＡＣＨ)も抗菌特性を維持していることを確認するため、グラム陰性菌大腸菌(E.coli)に対する殺菌活性を検証した。細菌培養の光学密度(ＯＤ)測定法を使用して、種々の時点における多糖類試料の存在下または非存在下において液体培養中の細胞の密度を推定した。具体的には、細菌を１ｘ１０８ＣＦＵ/ｍｌの濃度でＬＢ培地に再懸濁し、３００μｌのバクテリアブロスのアリコートを、ＣＨ、ＬＡＣＨ又は対照を含む２７００μｌの培地に添加した。培養物を適度に攪拌しながら３７℃でインキュベートした。その後、１時間間隔で(時間ゼロを含む最初の６時間)、１００ｕＬの培養液を採取し、分光光度計により６４０ｎｍの吸光度を測定した。培地が濁っている場合は、採取した培養液をＰＢＳで希釈した。
　図２に測定結果を示す。その結果、キトサン（ＣＨ）と修飾キトサン(ＬＡＣＨ)は、どちらも大腸菌の増殖に対する阻害活性を有することが確認された。また、それら多糖類の濃度が高いほど、より強い抗菌効果が得られた。
　次に、グラム陰性菌(大腸菌)およびグラム陽性菌(黄色ブドウ球菌)に対するＣＨ、ＬＡＣＨ、ＤＥＸＭＡ、及びＬＡＣＨ／ＤＥＸＭＡ複合材料(０．５％ｗｔ／ｖ)の殺菌効果の評価を行った。多糖類存在下で菌のインキュベーションを行い、２４時間後に光学密度を測定した（図３Ａ）。測定結果は、時間ゼロで測定された光学密度(１００％培養細菌)に対して正規化した。１００μｌの各培養ブロスを希釈し（１：１０００００）、栄養寒天上にプレーティングし、２４間培養した後の細菌コロニー形成単位(ＣＦＵ)の画像を撮影した（図３Ｂ）。
　図３に示すように、ＣＨ、ＬＡＣＨ、及びＬＡＣＨ／ＤＥＸＭＡ複合材料は、大腸菌と黄色ブドウ球菌の両方に対して抗菌効果を示すことが分かった。一方、対照試料（多糖類を含まない）とＤＥＸＭＡでは、高い細菌増殖率を示し、抗菌効果は見られなかった。この結果は、ＬＡＣＨとＬＡＣＨ／ＤＥＸＭＡ複合材料のいずれも、臨床環境で見られる最も一般的な２つの細菌に対して抗菌活性を有していることを実証するものである。
４．インビトロにおける分解試験
　生体内で用いられるハイドロゲルは、制御された方法で分解され、標的組織がその自然な構造、形態、および機能に再生できるようにする必要がある。キトサンは、酵素、特に人体のさまざまな部分に自然に存在するリゾチームによって、グリコシド結合の切断を介して容易に分解される。さらに、デキストランは、リゾチームの酵素分解を受けやすいことが知られている。そのため、本発明のＬＡＣＨ／ＤＥＸＭＡゲルについて、リゾチームの存在下で分解性を検証した。
　ＬＡＣＨ／ＤＥＸＭＡを含むゲル前駆体溶液に、光源から５ｃｍの距離で５ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ光 (３６５ｎｍ)を２分間照射することによって、ハイドロゲルを形成した。低分子量および中分子量のＬＡＣＨを用いた。ゲル前駆体溶液の組成は、上述の表１に示したとおりである。ＵＶ架橋の前に、ゲル前駆体溶液（ＰＢＳ溶液)にＶＡ－０８６(２ｍｇ/ｍｌ)を添加した。比較例として、ＬＡＣＨを含まない、ＤＥＸＭＡのみからなるハイドロゲルを作製した。
　分解実験では、１００ｕｌの滴を２４ウェルプレートにおいて架橋した。ゲル化後、４ｍｇ/ｍｌのリゾチームを含む５００ｕｌのＰＢＳを各ウェルに添加し、穏やかに攪拌しながら３７℃でインキュベートした。所定の時間間隔でリゾチーム溶液を除去し、ゲル試料からの余分な表面液体を濾紙で乾燥させた。ゲル試料の重量を記録した後、ゲル試料を新たに調製したリゾチーム溶液とともにウェルに戻した。
　ゲルの分解度（％ＤＤ）は、測定したゲル試料の重量変化を用いて以下の式により算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000014
　当該式において、「％ＤＤ」はゲルの分解度であり、「Ｗ０」はゲルの初期重量、及び、「Ｗ（ｔ）」は測定時点におけるゲルの重量である。
　リゾチーム活性によるヒドロゲルの分解挙動の結果を図４に示す。ＬＡＣＨを含むヒドロゲルは、ＤＥＸＭＡ単独とのゲルと比較して、経時的により分解し易いことが分かった。また、４８時間経過後では、低分子量のＬＡＣＨを含むゲルと、中程度の分子量のＬＡＣＨを含むゲルとの間で、異なる分解挙動が観察された。すなわち、低分子量のキトサン由来のハイドロゲルは、中分子量のものと比較して加速された分解挙動を示した。ただし、１４４時間のインキュベーション後では、これらのゲルは、いずれも約５０％分解された。これらの結果によれば、本発明のハイドロゲルは、組織工学に適した分解プロファイルを有し、かつＬＡＣＨの分子量によって分解特性を調節可能であることが確認された。
５．プリント特性の評価
　次に、本発明のＬＡＣＨ／ＤＥＸＭＡ複合材料を用いて、３Ｄバイオプリンティング試験を行った。
　一般に、バイオプリンティングプロセス中に細胞の生存に影響を与える可能性がある過度のせん断応力を防ぐ観点から、せん断減粘特性を持つハイドロゲルベースのインクが使用される。この点、本発明のＬＡＣＨ／ＤＥＸＭＡ複合材料溶液（ゲル前駆体）は、図５Ａに示すように、ゲル化後の最終的なハイドロゲルよりも低い粘度を持ち、最適な組成でずり減粘挙動を示す。
　バイオプリンティング試験は以下の手順で行った。3d Cultures Tissue Scribeのバイオプリンターを使用して、バイオバイオプリンティング実施した。修飾キトサン（ＬＡＣＨ）、修飾デキストラン（ＤＥＸＭＡ）及びＶＡ－０８６を含むポリマー溶液(表１の７番目の組成)を、ノズル(内径０．８ｍｍ) 付きの３ｍｌシリンジ(ＢＤ Ｌｕｅｒ－Ｌｏｋ（商標）)にロードした。高さ５ｍｍ、 ３０ x ３０ｍｍの正方形のオブジェクトが設計され、これをＲｅｐｅｔｉｅｒ　Ｈｏｓｔプログラムに読み込ませた（図５Ｂ）。高さは、Ｚ軸を０．１にスケーリングすることによって調整した。ノズルは０．８ｍｍ、層の厚さは０．８ｍｍ、初期層と充填層は０．５ｍｍ、充填速度は２ｍｍ/ｓ、充填率は６０％とした。印刷温度は25℃を用いた。プリンティングプロセスの代表的な写真を図５Ｃに示す。
　プリンティング工程が完了した後、得られたグリッド領域に、光源から５ｃｍの距離で５ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ光(３６５ｎｍ) を２分間照射し、光架橋によりゲルを形成した（図５Ｄ）。印刷された構造物をデジタルカメラにより撮影し、印刷特性を以下の式により評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000015
　当該式において、「Ａ’」は印刷構造物における正方形様領域の面積の測定値であり、「Ａ」は当初設計した正方形の面積の理論値である。バイオインク（ＬＡＣＨ／ＤＥＸＭＡ溶液）が理想的なゲル化状態にある場合、押し出されたフィラメントは、３次元的に滑らかな表面と一定の幅を有する明確な形態を示し、印刷後の構造物により、規則的なグリッドと正方形の穴が形成される。本発明のＬＡＣＨ／ＤＥＸＭＡゲルを用いて印刷された構造物を図９Ｅに示す。この場合の印刷特性は、Ｐｒ＝０．９３±０．０５であった。
　理想的なプリンティング工程においては、構造体は完全な正方形の形状を示し、印刷特性Ｐｒの値は１となる。Ｐｒの値が高いほど、バイオインクのゲル化の程度が大きくなり、一方、Ｐｒの値が低いほど、バイオインクのゲル化の程度が低くなる。一般に、印刷特性Ｐｒが０．９～１．１の範囲である場合、バイオプリンティング用途に適切に用いられることを意味する。したがって、本発明のポリマー材料はは、３Ｄバイオプリンティング用途におけるバイオインクとして好適であることが実証された。
６．細胞培養における細胞毒性の評価
　次に、本発明のポリマー材料について、細胞毒性の評価を行った。具体的には、修飾キトサン(ＬＡＣＨ)及び修飾デキストラン(ＤＥＸＭＡ)の多糖類について、これらを個々に又は組み合わせて使用して、ヒト皮膚線維芽細胞(ＨＤＦａ、ＡＴＣＣ)に対する細胞毒性試験を実施した。標準的な比色アッセイであるＸＴＴアッセイを用いて、細胞生存率、増殖および細胞毒性を評価した。
　細胞を、９６ウェルプレートに１０％ＦＢＳを含む１００μＬのＤＭＥＭ中、ウェル当たり５×１０３細胞の最終密度でプレーティングし、ウェルの底面に一晩付着させた。その後、無血清条件下で、培地を０．５％ｗ／ｖのポリマー試料を含有するＤＭＥＭ（実施例３と同じ濃度）と交換した。細胞を５％ＣＯ ２中、３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、ＸＴＴ試薬（ＢＩＯＴＩＵＭ、Ｃａｔ：１００６０ｙ Ｌｏｔ：１７Ｘ０８２４）を添加し、細胞をさらに２時間インキュベートした。これにより、代謝的に活性な細胞のみが黄色のテトラゾリウム塩 (ＸＴＴ：ナトリウム3'-[1-(フェニルアミノカルボニル)-3,4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホン酸水和物)をオレンジ色のホルマザン染料に還元する。得られた色の変化を、プレートリーダーを使用して４６０ｎｍ(参照６５０ｎｍ)で測定した。データは、未処理のウェル(１００％の生存率)に対して正規化した。
　図６に示すように、本発明のポリマー材料で処理した細胞は、インキュベーション期間後にほぼ１００％の生存率を示し、グループ間に有意差は見られなかった。この結果は、本発明のポリマー材料（ゲル前駆体ポリマー）が、個別に又は組み合わせた場合でも細胞毒性を示さないことを示すものである。
　次に、カプセル化された細胞が、光架橋後のハイドロゲル内で生存および増殖できるかについて検証を行った。ＬＡＣＨ及びＤＥＸＭＡを含むポリマー材料（前駆体溶液）を表１の組成に従い調製し、間葉系幹細胞を封入した（１×１０６／ｍｌ）。次いで、３０μl滴を９６ウェルプレートのウェルに分注した。比較例として、同じ細胞密度で、バイオインクとして使用されている最も一般的な光架橋ポリマーであるメタクリル化ゼラチン(Ｇｅｌｍａ)に再懸濁した。最後に、光源から５ｃｍの距離で、プレートを５ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ光(３６５ｎｍ)で２分間照射した。上述のＸＸＴアッセイを使用して、細胞の生存率を評価した。
　図７に示すように、比較例のメタクリル化ゼラチン(Ｇｅｌｍａ)と比べて、本発明のポリマー材料を架橋させたハイドロゲルに再懸濁された細胞に有意差は見られなかった。いずれの試料も、インキュベーション期間後にほぼ１００％の生存率を示しました。この結果は、本発明のＬＡＣＨ／ＤＥＸＭＡハイドロゲルが細胞毒性を有さず、生細胞のバイオプリンティングに適した材料であることを示している。
７．タンパク質の放出能の評価
　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて、タンパク質放出アッセイを行った。手順を図８に示す。所定の時間の経過後、収集された全ての試料をＰＢＳ中の既知濃度のＢＳＡによって処理し、標準曲線を用いてタンパク質濃度を決定した。
得られた動的放出プロファイルを図９に示す。最初の２４時間は、バースト効果として知られるタンパク質の強力な放出が生じている。その後、２４～１６８時間まで、持続的なタンパク質放出が観察された。特に ４８時間経過後からＢＳＡの放出は安定した挙動となった。約３０％のバースト効果の値を持つという結果は、本発明のハイドロゲルが必要な用量での薬物の目標初期送達と、内部環境での一定の治療濃度のその後の長期維持の両方を提供できることを示唆している。
８．他の多糖類の組合せを用いた光架橋ゲルの形成 
　他のメタクリル化誘導体を使用した系の利用可能性を示すために、第２の多糖類をメタクリル化キトサン(ＭＡＣＨ)に変えてハイドロゲルを形成し、そのゲル化特性と細胞生存率を評価した。ＭＡＣＨは、中程度の分子量のキトサンをメタクリル酸無水物と反応させることによって合成した。
　ＭＡＣＨは、中程度の分子量のキトサンをメタクリル酸無水物と反応させることによって合成した。反応生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルのピークを解析し、ＭＡＣＨの生成を確認した。キトサンの特徴的なピークは、δ２．０　ｐｐｍ(キトサンのアセチル化部分の－ＣＨ３)と、グルコサミン環からのプロトンを表すδ３．１－４ｐｐｍ に見られた。修飾前のキトサンには存在しないアクリル基(-ＣＨ＝ＣＨ２)のピークが、δ５．６－６．３ｐｐｍに見られたことから、メタクリル化されたキトサンＭＡＣＨの生成が確認された。
　ＬＡＣＨ（中程度の分子量）とＭＡＣＨをＰＢＳに溶解し、架橋剤ＶＡ－０８６の存在下で光架橋した。光架橋は、ポリマー混合物の３０μｌ滴中に、３６５ｎｍの光を５ｍＷ／ｃｍ２の強度で光源まで５ｃｍの距離で照射した。種々のポリマー比率を用いて行った結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表２に示すように、第２の多糖類としてＭＡＣＨを用いた場合も、第１の多糖類のＬＡＣＨと組み合わせることで、広範囲の濃度比率においてＵＶ光暴露の数分以内にハイドロゲルを形成することが実証された。さらに、ここで得られたゲルは透明であり、硝子体代替物などのいくつかの生物医学的用途に好適であると考えられる。

Claims (26)

  1. 　ポリマー材料であって、
    ａ）ｄ－グルコサミン及びＮ-アセチル－ｄ－グルコサミンの２種の糖単位を含む繰り返しユニットを有する第１の多糖類であって、ｄ－グルコサミンにおけるアミノ基の少なくとも一部がカルボキシル基を有する部位で置換されてアミド結合を形成している構造を有する、前記第１の多糖類；及び
    ｂ）第２の多糖類であって、繰り返しユニットにおけるヒドロキシル基の少なくとも一部が、アクリル基及びメタクリル基よりなる群から選択される官能基で置換されている構造を有する、前記第２の多糖類
    を含み、
    　前記第１の多糖類及び前記第２の多糖類が、いずれも水溶性であり、及び
    　前記第１の多糖類及び前記第２の多糖類が、互いに架橋することによりハイドロゲルを形成可能である、
    前記ポリマー材料。
  2. 　前記前記第１の多糖類と前記第２の多糖類との間で水素結合が形成される、請求項１に記載のポリマー材料。
  3. 　前記第１の多糖類における前記カルボキシル基を有する部位が、単糖類及び／又は二糖類が酸化された糖酸を含む、請求項１に記載のポリマー材料。
  4. 　前記糖酸が、ガラクトシル基を含む、請求項３に記載のポリマー材料。
  5. 　前記糖酸が、ラクトビオン酸、トレオン酸、キシロン酸、及び、１以上の糖構造を有するグルコン酸誘導体よりなる群から選択される、請求項３に記載のポリマー材料。
  6. 　前記第１の多糖類における前記カルボキシル基を有する部位による導入率が、１～１０％である、請求項１に記載のポリマー材料。
  7. 　前記第２の多糖類における前記官能基が、メタクリル基である、請求項１に記載のポリマー材料。
  8. 　前記第１の多糖類が、５０～２０００ｋＤａの範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、請求項１に記載のポリマー材料。
  9. 　前記第２の多糖類が、４～２０００ｋＤａの範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、請求項１に記載のポリマー材料。
  10. 　前記第１の多糖類が、抗菌活性を有する、請求項１に記載のポリマー材料。
  11. 　前記第１の多糖類が、カチオン性多糖類の修飾多糖類である、請求項１に記載のポリマー材料。
  12. 　前記カチオン性多糖類が、キトサン又はキトサン誘導体である、請求項１１に記載のポリマー材料。
  13. 　前記第１の多糖類が、以下の繰り返しユニット：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     を少なくとも部分的に含むガラクトシル化キトサンである、請求項１に記載のポリマー材料。
  14. 　前記第２の多糖類が、中性の水溶性多糖類の修飾多糖類である、請求項１に記載のポリマー材料。
  15. 　前記中性の水溶性多糖類が、グルコース、ガラクトース、マンノース、及びそれらの組み合わせよりなる群から選択される繰り返しユニットを含む、請求項１４に記載のポリマー材料。
  16. 　前記第２の多糖類が、デキストラン、キトサン、ローカストビーンガム、カラギーナン、及びそれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項１に記載のポリマー材料。
  17. 　前記第２の多糖類が、以下の繰り返しユニット：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     を少なくとも部分的に含むメタクリル化デキストランである、請求項１に記載のポリマー材料。
  18. 　前記第２の多糖類が、以下の繰り返しユニット：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     を少なくとも部分的に含むメタクリル化キトサンである、請求項１に記載のポリマー材料。
  19. 　前記第１の多糖類と前記第２の多糖類のモル比が、１：０．１～１：１０の範囲である、請求項１に記載のポリマー材料。
  20. 　前記第１の多糖類及び前記第２の多糖類が、同じポリマー骨格を有しており、場合により互いに異なる化学修飾を有する、請求項１に記載のポリマー材料。
  21. 　架橋剤をさらに含む、請求項１に記載のポリマー材料。
  22. 　前記架橋剤が、水溶性の光架橋剤である、請求項２１に記載のポリマー材料。
  23. 　バイオプリンティングにおけるマトリクス；タンパク質、粒子、若しくはエクソソームのカプセル化；又は、ドラッグデリバリーに用いるための、請求項１に記載のポリマー材料。
  24. 　請求項１～２３のいずれか１に記載のポリマー材料を含み、バイオプリンティングにおいて前記第１の多糖類と前記第２の多糖類が互いに架橋することによりハイドロゲルを形成する、バイオプリンティング用マトリクス。
  25. 　抗菌活性を有し及び低毒性である、請求項２４に記載のバイオプリンティング用マトリクス。
  26. 　バイオプリンティング；タンパク質、粒子、若しくはエクソソームのカプセル化；又は、ドラッグデリバリーにおける、請求項１～２３のいずれか１に記載のポリマー材料又は請求項２４若しくは２５に記載のマトリクスの使用。
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