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KR101186140B1 - 페길화된 인자 ｖｉｉ 글리코형태 - Google Patents

페길화된 인자 ｖｉｉ 글리코형태 Download PDF

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KR101186140B1
KR101186140B1 KR1020047020875A KR20047020875A KR101186140B1 KR 101186140 B1 KR101186140 B1 KR 101186140B1 KR 1020047020875 A KR1020047020875 A KR 1020047020875A KR 20047020875 A KR20047020875 A KR 20047020875A KR 101186140 B1 KR101186140 B1 KR 101186140B1
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노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트
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Abstract

본 발명은 다수의 인자 VII 폴리펩티드 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드를 포함하는 제제에 관한 것으로, 폴리펩티드는 아스파라긴-결합 및/또는 세린-결합 올리고당 사슬을 포함하고, 하나 이상의 올리고당 기는 하나 이상의 중합체 기에 공유 부착된다. 중합체 기는 폴리알킬렌 옥사이드 (PAO), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)일 수 있다.
인자 VII 폴리펩티드, 인자 VII-관련 폴리펩티드, FVII-변이체, 페길화, 올리고당 사슬, 아스파라긴, 세린, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리에틸렌 글리콜, 혈액 응고, 조직 인자.

Description

페길화된 인자 ＶＩＩ 글리코형태{PEGYLATED FACTOR VII GLYCOFORMS}
본 발명은 예정된 글리코실화 패턴을 가지고 있는 인자 VII 포합체를 포함하고 있는 조성물에 관한 것이다.
인자 VII (FVII)은 간에서 합성되는 비타민 K-의존성 혈장 단백질로, 대략 50 kDa의 분자량을 가지는 단일 사슬 당단백질로서 혈액으로 분비된다. FVII 효소원은 단백질 가수 분해 절단에 의해 활성화된 형태 (FVIIa)로 전환된다. 조직 인자 (TF)와의 복합체로서 FVIIa는 그것의 활성화된 형태인 인자 IX와 인자 X로 전환될 수 있으며, 계속해서 신속한 트롬빈 생성 및 피브린 형성을 유도하는 반응이 이어진다.
응고 캐스케이드에 포함된 단백질은 예컨대 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 및 단백질 C는 다양한 병인학적 질환을 치료하기 위한 유용한 치료 제제인 것으로 증명되고 있다. 따라서 이들 단백질을 포함하고, 약제학적으로 허용될 수 있으며 균질하고 예정된 임상 효과를 나타내는 제형에 대한 필요성이 증가하고 있다.
사람 혈장을 약제학적 제품의 공급원으로서 사용하는 것에 따르는 많은 단점 때문에 이들 단백질을 재조합 시스템으로 제조하는 것이 바람직하다. 그러나 응고 단백질은 예컨대 아스파라긴-결합 (N-결합) 글리코실화; O-결합 글리코실화; 및 glu 잔기의 γ-카르복실화를 포함한 다양한 공동- 및 후-번역 변형이 수행되어야 한다. 이들 변형은 이종성 세포가 단백질의 대규모 제조에 대한 숙주로서 사용될 때 질적으로 또는 양적으로 다를 수 있다. 특히 이종성 세포의 제조는 때로 상이하게 공유 결합된 올리고당 구조를 가지고 있는 동일한 폴리펩티드인 글리코형태의 상이한 배열을 초래한다.
상이한 시스템에서 치료 단백질의 올리고당 구조는 무엇보다도 면역원성 및 생체내 제거 (clearance)의 변화에 연결되어 있다.
생체내 제거 외에도 생체내 기능적인 반감기 또한 화합물이 신체내에서 "치료적으로 활용가능한" 시간 기간에 중요하다.
rFVIIa의 순환하는 반감기는 약 2.3 시간이다 ("Summary Basis for Approval for NovoSevenⓒ", FDA reference number 96-0597).
사람 재조합 FVIIa의 상업적인 제제는 NovoSevenR로서 시판된다. NovoSevenR은 시판중인 효과적이고 믿을만한 출혈 에피소드의 치료에 대한 유일한 rFVIIa이다. 그러나 원하는 치료적 또는 예방적 효과에 도달하고 그것을 유지하기 위해서는 상대적으로 높은 용량 및 빈번한 투여가 필요하다. 그 결과로서 적절한 용량 조절이 얻어지기 어렵고, 빈번한 정맥내 투여의 필요성이 환자의 샐활 패턴에 제한을 가하게 된다.
더 긴 순환 반감기를 가지고 있는 분자는 필요한 투여 횟수를 감소시킬 것이 다. 만약 현재의 FVIIa 제품과 빈번한 주사가 결합된다면 분명히 개선된 FVII 분자에 대한 필요가 있다.
순환을 개선시키는 한가지 방법은 신체로부터의 제거 속도를 확실하게 감소시키는 것이다. 말한 바와 같이 치료적 단백질의 올리고당 구조의 변화는 무엇보다도 생체내 제거와 관련이 있다. 나아가 화학적 부분의 폴리펩티드에 대한 부착은 폴리펩티드에 대한 신장에서의 감소된 제거를 수반할 것이다.
FVII의 비활성 형태는 보고되어 있다. 비활성화 형태는 조직 인자에 대한 결합 및 응고 활성의 억제에 대하여 야생형 FVII 또는 FVIIa와 경합할 수 있다. FVIIa의 비활성 형태는 심근 경색 또는 혈전증 발작의 위험이 있는 응고성이 매우 높은 상태에 있는 환자, 예컨대 패혈증 환자의 치료에 사용될 수 있을 것으로 제안된다.
WO 98/32466에는 다른 많은 단백질 중에서도 FVII가 페길화될 수 있지만 그 점에 있어서는 어떠한 추가의 정보를 함유하지 않는다는 것이 시사되어 있다.
WO 01/58935에서는 아미노산 서열이 비-펩티드성 부분에 대한 부착 기를 포함하고 있는 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되었거나 제거되어 있다는 점에서 야생형 FVII의 아미노산 서열과 상이한 폴리펩티드와의 비-폴리펩티드 부분 (예컨대 PEG)의 포합체가 청구된다.
US 4847325에는 콜로니 자극 인자-1 (CSF-1)이 PEG 유도체와 산화된 CSF-1과의 반응에 의하여 PEG에 부착될 수 있다는 것이 시사된다.
그러므로 당해 기술분야에는 응고 단백질 제제, 특히 개선된 재조합 사람 인 자 VII, 변형된 인자 VII, 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드를 포함하고 있는 제제를 제공하는 조성물 및 방법이 필요하다.
본 발명자들에 의하여 하나 이상의 중합체 기에 공유 결합된 하나 이상의 올리고당 기를 함유하는 글리코형태 패턴을 가지고 있는 인자 VII 폴리펩티드의 제제가 개선된 작용 성질을 나타내는 것이 발견되었다. 따라서 본 발명은 이들 포합체 단백질 제제를 제공하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
따라서 본 발명은 첫번째 측면으로 다수의 인자 VII 폴리펩티드 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드를 포함하고 있는 제제에 관한 것으로, 폴리펩티드는 아스파라긴-결합 및/또는 세린-결합 올리고당 사슬을 포함하며, 하나 이상의 올리고당 기가 하나 이상의 중합체 기에 공유적으로 부착되어 있다.
한 구체예에서 중합체 기는 시알산 부분에 공유적으로 부착된다. 다른 구체예에서 중합체 기는 갈락토스 부분에 공유적으로 부착된다.
한 구체예에서 올리고당 사슬의 약 94 내지 100 %는 하나 이상의 시알산 부분을 포함한다.
한 구체예에서 올리고당 사슬의 약 94 내지 100 %는 하나 이상의 시알산 부분을 포함하고, 올리고당 사슬의 약 25 % 미만은 하나 이상의 캡핑되지 않은 안테나를 함유한다.
한 구체예에서 올리고당 사슬의 약 10 % 미만은 하나 이상의 캡핑되지 않은 안테나를 함유한다.
한 구체예에서 올리고당 사슬의 약 5, 바람직하게는 약 2 % 미만은 하나 이상의 캡핑되지 않은 안테나를 함유한다.
한 구체예에서 올리고당 사슬의 약 96 내지 100 %는 하나 이상의 시알산 부분을 포함한다.
한 구체예에서 올리고당 사슬의 약 98 내지 100 %는 하나 이상의 시알산 부분을 포함한다.
한 구체예에서 아스파라긴-결합 올리고당 사슬은 야생형 사람 FVIIa의 아미노산 잔기 Asn-145 및 Asn-322에 상응하는 위치에 위치한다 (도:1).
한 구체예에서 세린-결합 올리고당 사슬은 야생형 사람 FVIIa의 아미노산 잔기 Ser-52 및 Ser-60에 상응하는 위치에 위치한다 (도:1).
한 구체예에서 중합체는 폴리알킬렌 옥사이드 (PAO), 예를 들면 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 분지된 PEG, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리-비닐피롤리돈, 폴리에틸렌-공동-말레산 무수물, 폴리스티렌-공동-말레산 무수물, 및 덱스트란, 예컨대 카르복시메틸-덱스트란, 폴리우레탄, 폴리에스테르 및 폴리아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 구체예에서 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이고; 한 구체예에서 폴리에틸렌 글리콜은 분자량이 300 내지 100,000 Da, 예컨대 약 500 내지 20,000 Da, 또는 약 500 내지 15,000 Da, 또는 2 내지 15 kDa, 또는 3 내지 15 kDa, 또는 3 내지 12 kDa, 또는 약 10 kDa인 PEG이다.
한 구체예에서 폴리펩티드는 야생형 인자 FVII의 아미노산 서열을 갖는다 (도:1). 한 구체예에서 폴리펩티드는 야생형 인자 VIIa이다.
한 구체예에서 인자 VII 폴리펩티드는 다음의 것들로 이루어지는 것으로부터 선택된다: S52A-인자 VII, S60A-인자 VII, 잔기 290과 291 사이에서 단백질 가수분해적으로 절단된 인자 VII; 잔기 315와 316 사이에서 단백질 가수분해적으로 절단된 인자 VII; 산화된 인자 VII, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, S336G-FVII ; 위치 290 및/또는 291, 바람직하게는 290에 있는 아미노산 잔기가 대체되어 있는 인자 VII-서열 변이체; 및 위치 315 및/또는 316, 바람직하게는 315에 있는 아미노산 잔기가 대체되어 있는 인자 VII-서열 변이체. 다른 구체예에서 인자 VII 폴리펩티드는 다음의 것들로 이루어지는 목록으로부터 선택된다: WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/77218, WO 03/27147, 및 WO 03/37932에 개시되어 있는 것과 같은 야생형 FVIIa에 비교하여 생물학적 활성이 증가된 인자 Factor VII 변이체; L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII, 316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296VN158T-FVII, F374Y/L305V/E296WS314E-FVII, F374Y/L305V/M298QN158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/5314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298QN158D-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296WS314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M 298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-인자 VII, S60A-인자 VII; 및 P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; 233Thr 내지 240Asn의 아미노산 서열에 치환, 첨가 또는 결실을 가지고 있는 FVII, 304Arg 내지 329Cys의 아미노산 서열에 치환, 첨가 또는 결실을 가지고 있는 FVII, 및 아미노산 서열 Ile153-Arg223에 치환, 결실 또는 첨가를 가지고 있는 FVII.
한 구체예에서 인자 VII-결합 폴리펩티드는 R152E-인자 VII, S344A-인자 VII, FFR-인자 VII 및 Gla 도메인이 없는 인자 VIIa로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
한 구체예에서 인자 VII-결합 폴리펩티드는 본 명세서에서 설명되는 것과 같은 하나 또는 그 이상의 응고 분석, 단백질 가수분해 분석, 또는 TF 결합 분석에서 시험될 때, 동일한 세포 유형에서 생성된 야생형 인자 VIIa의 특이적 활성의 최소 한 약 25 %, 바람직하게는 최소한 약 50 %, 보다 바람직하게는 최소한 약 75 %, 가장 바람직하게는 최소한 약 90 %의 특이적 활성을 나타낸다.
한 구체예에서 인자 VII-결합 폴리펩티드는 본 명세서에서 설명되는 것과 같은 하나 또는 그 이상의 응고 분석, 단백질 가수분해 분석, 또는 TF 결합 분석에서 시험될 때, 동일한 세포 유형에서 생성된 야생형 인자 VIIa의 특이적 활성의 약 25 % 미만, 바람직하게는 약 10 % 미만, 보다 바람직하게는 약 5 % 미만, 가장 바람직하게는 약 1 % 미만의 특이적 활성을 나타낸다.
다른 구체예에서 포합된 폴리펩티드는 예컨대 대조 제제의 생체내 활용성의 최소한 약 120 %, 또는 최소한 약 130 %, 또는 최소한 약 140 %와 같이, 대조 제제의 생체내 활용성의 최소한 약 110 %의 생체내 활용성을 나타낸다.
한 구체예에서 포합된 폴리펩티드는 예컨대 대조 제제의 반감기의 최소한 약 150 %, 또는 최소한 약 200 %, 또는 최소한 약 250 %와 같이, 대조 제제의 반감기의 최소한 약 125 %인 반감기를 나타낸다.
한 구체예에서 포합된 폴리펩티드는 폴리펩티드의 시알 또는 갈락토스 부분의 효소적 변형에 의해 제조된다.
추가의 측면으로, 본 발명은 청구범위 제 1항의 제제의 제조 방법에 관한 것으로, 이 방법은 올리고당-함유 폴리펩티드를 중합체 분자와, 하나 이상의 중합체 분자가 폴리펩티드의 하나 이상의 올리고당 사슬에 공유적으로 부착되는 조건하에서 접촉시키는 것을 포함한다.
추가의 측면으로, 본 발명은 청구범위 제 1항 내지 22항에서 규정되는 것과 같은 제제와 약제학적으로 허용될 수 있는 담체 또는 보조제를 포함하고 있는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
추가의 또 다른 측면으로, 본 발명은 인자 VII-반응성 증후군을 치료하기 위한 의약의 제조를 위해 사용되는 다수의 인자 VII 폴리펩티드 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드를 포함하는 제제의 용도에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는 아스파라긴-결합 및/또는 세린-결합 올리고당 사슬을 포함하고, 하나 이상의 올리고당 기는 하나 이상의 중합체 기에 공유 부착된다.
추가의 측면으로, 본 발명은 인자 VII-반응성 증후군의 치료 방법에 관한 것으로, 이 방법은 출혈의 감소 및/또는 혈액 응고의 증가가 초래되는 조건 하에서, 그러한 치료가 필요한 환자에게 청구범위 제 1항 내지 22항에서 설명되는 것과 같은 제제를 포함하는 약제학적 제형을 투여하는 것으로 이루어진다.
한 구체예에서 증후군은 혈우병 A, 혈우병 B, 인자 XI 결핍증, 인자 VII 결핍증, 혈소판 감소증, 폰 빌레프란트병, 응고 인자 억제제의 존재, 수술, 외상, 항응고 요법, 예컨대 용혈 이상, 두개골내 출혈, 간세포 이식, 상부 위장 출혈, 및 간 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면으로 본 발명은 원하지 않는 출혈을 방지하는 방법에 관한 것으로, 그 방법은 출혈의 감소 및/또는 혈액 응고의 증가가 초래되는 조건 하에서, 그러한 치료가 필요한 환자에게 청구범위 제 1항 내지 22항에서 설명되는 것과 같은 제제를 포함하는 약제학적 제형을 투여하는 것으로 이루어진다.
또 다른 측면으로 본 발명은 원하지 않는 혈액 응고를 방지하는 방법에 관한 것으로, 그 방법은 응고를 억제하기에 효과적인 조건 하에서, 그러한 치료가 필요한 환자에게 청구범위 제 1항 내지 22항에서 설명되는 것과 같은 제제를 포함하는 약제학적 제형을 투여하는 것으로 이루어진다.
한 구체예에서 원하지 않는 혈액 응고는 혈관형성, 깊은 정맥 혈전증, 폐의 색전증, 발작, 확산된 혈관내 응고 (DIC), 그람-네가티브 내독소혈증과 관련된 폐 및 신장의 피브린 침착, 및 심근 경색으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환과 관련된다.
추가의 측면으로 본 발명은 조직 인자가 매개된 반응을 방지하는 방법에 관한 것으로, 그 방법은 응고를 억제하기에 효과적인 조건 하에서, 그러한 치료가 필요한 환자에게 청구범위 제 1항 내지 22항에서 설명되는 것과 같은 제제를 포함하는 약제학적 제형을 투여하는 것으로 이루어진다.
한 구체예예서 조직 인자가 매개된 반응은 염증, 암, 종양 성장, 전이, 혈관형성, SIRS, ALI, ARDS, MOF, HUS, 및 TTP로 이루어지는 군으로부터 선택된 질환과 관련된다.
본 발명자들은 하나 이상의 올리고당 기가 예컨대 PEG와 같은 하나 이상의 중합체 기에 공유적으로 결합되어 있는 글리코형태 패턴을 가지는 응고 단백질의 제제가 개선된 작용 성질을 나타내는 것을 발견하였다. 따라서 본 발명은 이들 포합체 단백질 제제를 제공하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명은 하나 이상의 중합체 기에 공유적으로 부착된 아스파라긴-결합 (N-결합) 및 세린-결합 (O-결합) 올리고당의 패턴을 가지는 인자 VII 폴리펩티드 및 인자 VII-관련 폴리펩 티드를 포함하고 있는 제제에 관한 것이다. 본 발명의 제제는 제한 없이 개선된 약리역학적 성질, 및 개선된 임상 효능을 포함하여 변경된 성질을 나타낸다. 본 발명은 또한 이들 제제를 포함하는 약제학적 제형과, 그 제형을 활용하는 치료적 방법을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "공유 부착"은 올리고당 부분과 중합체 분자가 상호간에 직접 공유적으로 결합되거나, 또는 그렇지 않으면 그 사이에 있는 부분 또는 부분들, 예컨대 가교, 스페이서, 또는 연쇄 부분 또는 부분들을 통하여 상호간에 간접적으로 공유적으로 결합되는 것을 포함하는 것을 의미한다.
용어 "포합체", 또는 상호교환적으로 "포합체 폴리펩티드"는 하나 또는 그 이상의 중합체 분자에 대한 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드의 공유 부착에 의하여 형성된 이종성 (혼성체 또는 키메릭체의 관점에서) 분자를 가리키는 것으로 의도된다.
용어 "중합체 분자", 또는 상호교환적으로 "중합체 기" 또는 "중합체 부분" 또는 "중합체 분자"는 폴리펩티드의 부착 기에 포합할 수 있는 분자를 포함한다. 본 발명의 포합체의 맥락에서 사용될 때 중합체 분자 (또는 부분)은 당단백질의 올리고당 사슬의 부착 기를 통하여 포합체의 폴리펩티드 부분에 결합되는 것, 바람직하게는 중합체 분자가 올리고당을 캡핑하는 시알산 부분 ("시알산 캡핑기")에 또는 갈락토스 부분에 부착되는 것이 인지될 것이다.
중합체 분자는 단량체중 어느 것도 아미노산 잔기가 아닌 둘 또는 그 이상의 단량체의 공유 연결에 의해 형성된 분자이다. 바람직한 중합체는 폴리알킬렌 옥사 이드 (PAO), 예를 들면 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 분지된 PEG, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리-비닐피롤리돈, 폴리에틸렌-공동-말레산 무수물, 폴리스티렌-공동-말레산 무수물, 및 덱스트란, 예컨대 카르복시메틸-덱스트란으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중합체 분자이며, 특히 PEG가 바람직하다.
용어 "부착기"는 중합체 분자를 부착할 수 있는 올리고당 부분의 작용기를 가리키는 것으로 의도된다. 유용한 부착기는 예를 들면 아민, 히드록실, 카르복실, 알데히드, 케톤, 술프히드릴, 숙신이미딜, 말레이미드, 비닐 술폰 또는 할로아세테이트이다.
올리고당 부분 상의 부착기는 중합체와의 반응 전에 활성화될 수 있다. 또는 달리 중합체 상에 존재하는 기는 올리고당 부분과의 반응 전에 활성화될 수 있다. 활성화된 기는 그것이 올리고당 부분에 존재하든 중합체 부분에 존재하든 활성화된 이탈기의 형태일 것이다.
용어 활성화된 이탈기는 유기-또는 효소-조절된 치환 반응에서 쉽게 대치될 수 있는 그런 부분들을 포함한다. 활성화된 이탈기는 당해 기술분야에 공지되어 있다 (Vocadlo et al., In Carbohydrate Chemistry and Biology, Vol 2, Wiley-VCH Verlag, Germany (2000); Kodama et al., Tetrahedron Letters 34:6419 (1993); Lougheed et al., J. Biol. Chem. 274:37717 (1999)).
중합체의 활성화에 대한 방법 및 화학은 문헌에 설명되어 있다. 중합체의 활성화를 위해 통상적으로 사용되는 방법은 시아노겐 브롬화물, 과요오드산염, 글루 타르알데히드, 비에폭시드, 에피클로로히드린, 디비닐술폰, 카르보디이미드, 술포닐 할로겐화물, 트리클로로트리아진, 등을 사용하여 작용기를 활성화하는 것을 포함한다 (Taylor (1991), Protein Immobilization, Fundamental and Applications, Marcel Dekker, N. Y.; Wong (1992), Chemistry of protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton; Hermanson et al., (1993), Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, N. Y.; Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, 1991).
본 발명을 실시하는데 유용한 반응성 기 및 반응의 부류는 일반적으로 상대적으로 온건한 조건하에서 진행되는 것들이다. 그런 것들로는 친핵성 치환 (예컨대 아민 및 알코올과 아실 할로겐화물, 활성 에스테르와의 반응), 친전자성 치환 (예컨대 엔아민 반응) 및 탄소-탄소 및 탄소-헤테로원자 결합에 대한 첨가 (예컨대 미셸 반응, 디엘스-알더 첨가)가 있으며, 그것들에 한정되는 것은 아니다. 이들 및 다른 유용한 반응은 문헌에 설명되어 있다 (March, Advanced Organic Chemistry, 3rd edition, John Wiley & Sons, N. Y. 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; Feeney et al, Modifications of Proteins, Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, 1982).
반응성 작용기는 그것들이 올리고당 및 중합체 부분을 조립하는 데 필요한 반응에 참여하거나, 또는 간섭하지 않도록 선택될 수 있다. 또는 달리 반응성 작용기는 보호기의 존재에 의하여 반응에 참여되는 것으로부터 보호될 수 있다. 유용한 보호기의 실예는 문헌에 예시되어 있다 (Greene et al., Protective groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, N. Y. , 1991).
탄수화물을 다른 분자에 결합시키는 일반적인 접근법은 문헌에 공지되어 있다 (Lee et al., Biochemistry 28:1856 (1989); Bhatia et al., Anal. Biochem. 178:408 (1989); Janda et al., J. Am. Chem. Soc. 112:8886 (1990); 및 Bednarski et al., WO 92/18135).
용어 "자연적으로 발생하는 글리코실화 부위"는 위치 Asn-145 (N145), Asn-322 (N322), Ser-52 (S52) 및 Ser-60 (S60)에 있는 글리코실화 부위를 가리키는 것으로 의도된다. 유사한 방식으로 용어 "자연적으로 발생하는 생체내 O-글리코실화 부위"는 위치 S52와 S60을 포함하는 한편, "자연적으로 발생하는 생체내 N-글리코실화 부위"는 위치 N145와 N322를 포함한다.
용어 "기능적인 생체내 반감기"는 그것의 원래 의미, 즉 폴리펩티드 또는 포합체의 생물학적 활성의 50 %가 신체/표적 기관에 여전히 존재하는 시간, 또는 폴리펩티드 또는 포합체의 활성이 그것의 초기 값의 50 %가 되는 시간으로 사용된다. 기능적인 생체내 반감기를 측정하는 대체 방법으로서, "혈청 반감기", 즉 폴리펩티드 또는 포합체 분자의 50 %가 제거되기 전에 혈장 또는 혈류중에서 순환하는 시간이 측정될 수 있다. 혈청 반감기의 측정은 때로는 기능적인 반감기의 측정보다 더 단순하며, 혈청 반감기의 크기는 통상 기능적인 생체내 반감기의 크기에 대한 좋은 표시이다. 혈청 반감기를 대체하는 용어로는 혈장 반감기, 순환하는 반감기, 순환적 반감기, 혈청 제거, 혈장 제거, 및 제거 반감기가 있다. 폴리펩티드 또는 포합체는 하나 또는 그 이상의 망상-내피 시스템 (RES), 신장, 비장, 또는 간의 작용에 의해, 조직 인자, SEC 수용체, 또는 다른 수용체-매개된 제거에 의해, 또는 특이적이거나 비특이적인 단백질 가수분해에 의해 제거된다. 정상적으로 제거는 크기 (신사구체 여과에 대한 컷-오프와 비교하여), 전하, 부착된 탄수화물 사슬, 및 단백질에 대한 세포성 수용체의 존재에 좌우된다. 보유되어야 할 기능성은 보통 선구 응고제, 단백질 가수분해적, 공동-인자 결합 또는 수용체 결합 활성으로부터 선택된다. 기능적인 생체내 반감기 및 혈청 반감기는 아래에서 논의되는 바와 같이 문헌에 공지되어 있는 어떠한 적절한 방법에 의해 측정될 수 있다 (인자 VII 제제의 기능적 성질 단원 참조).
기능적인 생체내 반감기 또는 혈장 반감기에 관하여 사용된 용어 "증가된"은 폴리펩티드 또는 포합체의 관련된 반감기가 비교할만한 조건 하에서 측정되는 바 포합되지 않은 인자 VIIa (예컨대 야생형 FVIIa)와 같은 대조 분자의 반감기와 비교하여 통계학적으로 상당히 증가된 것을 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어 관련된 반감기는 최소한 약 25 %, 예컨대 최소한 약 50 %, 예를 들면 최소한 약 100 %, 150 %, 200 %, 250 %, 또는 500 % 만큼 증가될 수 있다.
제제의 "면역원성"은 사람에게 투여될 때 그것이 체액성이든, 세포성이든, 또는 두 가지 다이든 해로운 면역 반응을 유도하는 제제의 능력을 말한다. 인자 VIIa 폴리펩티드 및 인자 VIIa-관련 폴리펩티드는 사람에게서 검출가능한 면역 반 응을 유도하지는 않는 것으로 알려져 있다. 그럼에도 불구하고 어떠한 사람 하위-집단에서는 투여된 특정 단백질에 대하여 민감성을 나타내는 개체가 존재할 수 있다. 면역원성은 당해 기술분야에 공지되어 있는 종래의 방법들을 사용하여 민감한 개체에서 항-인자 VII 항체 및/또는 인자 VII-반응성 T-세포의 존재를 정량함으로써 측정될 수 있다. 어떤 구체예에서는 본 발명의 제제가 민감한 개체에서 대조 제제의 그 개체에 대한 면역원성에 비교하여 최소한 약 10 %, 바람직하게는 최소한 약 25 %, 보다 바람직하게는 최소한 약 40 %, 및 가장 바람직하게는 최소한 약 50 %의 면역원성의 감소를 나타낸다.
용어 "도:1 (FVII wt.)의 아미노산 잔기 S52, S60, N145, N322에 상응하는 아미노산 잔기"는 서열이 배열될 때 야생형 인자 VII (도:1)의 서열에 상응하는 Asn 및 Ser 아미노산 잔기를 나타내는 것으로 의도된다. 아미노산 서열 상동성/동일성은 편리하게도 배열된 서열로부터, 예컨대 ClustalW 프로그램, 버전 1.8, 1999와 같은 서열 배열에 대한 적당한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다 (Thompson et al., 1994, Nucleic Acid Research, 22:4673-4680).
인자 VII 폴리펩티드 및 인자 VII-관련 폴리펩티드
본 발명은 사람 인자 VII 폴리펩티드, 예컨대 미국 특허 제 4,784,950호에 개시되어 있는 아미노산 서열을 가지는 것 (야생형 인자 VII)을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "인자 VII" 또는 "인자 VII 폴리펩티드"는 야생형 인자 VII, 및 실질적으로 야생형 인자 VII과 비교하여 동일하거나 개선된 생물학적 활성을 나타내는 인자 VII의 변이체를 포함한다. 용어 "인자 VII"은 그것들의 절단되지 않은 ( 효소원) 형태의 인자 VII 폴리펩티드뿐 아니라 단백질 가수분해적으로 처리되어 인자 VIIa로 표시될 수 있는 그것들의 각각의 생체내 반응성 형태로 된 것들까지 포함한다. 전형적으로 인자 VII은 잔기 152와 153 사이에서 절단되어 인자 VIIa가 생성된다.
본원에서 사용되는 "인자 VII-관련 폴리펩티드"는 변이체를 포함하여, 인자 VIIa의 생물학적 활성이 야생형 인자 VIIa의 활성과 비교하여 실질적으로 변형되거나 감소된 폴리펩티드를 포함한다. 이들 폴리펩티드로는 제한 없이 화학적으로 변형된 인자 VII 또는 인자 VIIa 및 특이한 아미노산 서열 변경이 도입되어 폴리펩티드의 생체내 활성이 변형되거나 파괴된 인자 VII 변이체를 들 수 있다.
인자 VIIa의 혈액 응고시의 생물학적 활성은 (i) 조직 인자 (TF)에 대한 결합 능력 및 (ii) 인자 IX 또는 인자 X의 단백질 가수분해적 절단을 촉매하여 활성화된 인자 IX 또는 X (각각 인자 IXa 또는 Xa)를 생성하는 능력으로부터 유래된다. 본 발명의 목적을 위해 인자 VIIa의 생물학적 활성은 예컨대 미국 특허 제 5,997,864호에서 설명된 바와 같이 인자 VII-결핍성 혈장 및 트롬보플라스틴을 사용하여 혈액 응고를 촉진하는 제제의 능력을 측정함으로써 정량될 수 있다. 이 분석에서 생물학적 활성은 대조 샘플에 비교하여 응고 시간의 감소로서 나타내고, 1 유니트/ml 인자 VII 활성을 함유하고 있는 모아진 사람 혈청 표준과의 비교에 의해 "인자 VII 유니트"로 전환된다. 또는 달리 인자 VIIa의 생물학적 활성은 (i) 지질 막에 삽입된 TF 및 인자 X를 포함하고 있는 시스템에서 인자 Xa를 생성하는 인자 VIIa의 능력을 측정하고 (Persson, J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ii) 수성 시스템에서 인자 X의 가수분해를 측정하고 (하기의 실시예 5 참조); (iii) 표면 플라스몬 공명을 기초로 한 기기를 사용하여 TF에 대한 물리적 결합을 측정하고 (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997), (iv) 합성 기질의 가수분해를 측정하고 (하기의 실시예 4 참조); 그리고 (v) 시험관내 시스템에서 TF-독립적인 트롬빈의 생성을 측정함으로써 정량될 수 있다.
야생형 인자 VIIa와 비교하여 실질적으로 동일하거나 개선된 생물학적 활성을 가지고 있는 인자 VII 변이체는 상술된 바와 같이 하나 또는 그 이상의 응고 분석, 단백질 가수분해 분석, 또는 TF 결합 분석에서 시험될 때, 동일한 세포 유형에서 생성된 야생형 인자 VIIa의 특이한 활성의 최소한 약 25 %, 바람직하게는 최소한 약 50 %, 보다 바람직하게는 최소한 약 75 %, 가장 바람직하게는 최소한 약 90 %의 특이한 활성을 나타내는 것들을 포함한다. 야생형 인자 VIIa와 비교하여 실질적으로 감소된 생물학적 활성을 가지고 있는 인자 VII 변이체는 상술된 바와 같이 하나 또는 그 이상의 응고 분석, 단백질 가수분해 분석, 또는 TF 결합 분석에서 시험될 때, 동일한 세포 유형에서 생성된 야생형 인자 VIIa의 특이한 활성의 약 25 % 미만, 바람직하게는 약 10 % 미만, 보다 바람직하게는 약 5 % 미만, 가장 바람직하게는 약 1 % 미만의 특이한 활성을 나타내는 것들을 포함한다. 야생형 인자 VII과 비교하여 실질적으로 변형된 생물학적 활성을 가지고 있는 인자 VII 변이체로는 제한 없이, TF-독립적인 인자 X 단백질 가수분해 활성을 나타내는 인자 VII 변이체 및 TF에는 결합하지만 인자 X는 절단하지 못하는 것들이 있다.
야생형 인자 VII과 비교하여 실질적으로 동일하거나 더 나은 생체내 활성을 나타내는 것이든, 또는 달리 야생형 인자 VII과 비교하여 실질적으로 변형되거나 감소된 생체내 활성을 나타내는 것이든 인자 VII의 변이체로는 제한 없이, 야생형 인자 VII의 서열과 하나 또는 그 이상의 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환에 의해 상이한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드가 있다.
야생형 인자 VII과 비교하여 실질적으로 동일하거나 개선된 생물학적 활성을 가지고 있는 인자 VII 변이체의 비-제한적인 실예로는 다음과 같은 것들이 있다: S52A-FVII, S60A-FVII (Iino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352:182-192, 1998) ; L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L3051-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, 및 S336G-FVII; 미국 특허 제 5,580,560호에서 개시된 바와 같은 증가된 단백질 가수분해적 안정성을 나타내는 FVIIa 변이체; 아미노산 잔기 290과 291 사이 또는 잔기 315와 316 사이에서 단백질 가수분해적으로 절단된 인자 VIIa (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505,1995); 인자 VIIa의 산화된 형태 (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54,1999), 위치 290 및/또는 291 (도:1의), 바람직하게는 290에 있는 아미노산 잔기가 대체되어 있는 인자 VII-서열 변이체, 및 위치 315 및/또는 316 (도:1의), 바람직하게는 315에 있는 아미노산 잔기가 대체되어 있는 인자 VII-서열 변이체.
야생형 인자 VII과 비교하여 실질적으로 동일하거나 개선된 생물학적 활성을 가지고 있는 인자 VII 변이체의 추가의 비-제한적인 실예로는 다음과 같은 것들이 있다: WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/77218, WO 03/27147, 및 WO 03/37932에서 개시된 바와 같은 야생형 FVIIa와 비교하여 증가된 생물학적 활성을 가지고 있는 FVII 변이체, 예를 들면 제한 없이, L305V- FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L3051-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296WM298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, 및 S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337AN158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, 5314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, 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F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVIl, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V1 58T/5314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, 374Y/L305V/V58D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-인자 VII, S60A-인자 VII; 및 P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; 233Thr 으로부터 240Asn 까지의 아미노산 서열에 치환, 첨가 또는 결실을 가지고 있는 FVII, 304Arg 에서 329Cys 까지의 아미노산 서열에 치환, 첨가 또는 결실을 가지고 있는 FVII, 및 아미노산 서열 Iie153 내지 Arg223에 치환, 첨가 또는 결실을 가지고 있는 FVII.
야생형 인자 VII와 비교하여 실질적으로 감소되거나 변형된 생물학적 활성을 가지고 있는 인자 VII-관련 폴리펩티드의 비-제한적 실예로는 R152E-FVIIa (Wildgoose et al., Biochem. 29: 3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998), Gla 도메인이 없는 인자 VIIa (Nicolaisen et al., FE8S Letts. 317: 245-249,1993), 및 Lys341이 Ala으로 대체되어 있는 인자 VII이 있다. 화학적으로 변형된 인자 VII 폴리펩티드 및 서열 변이체들의 비-제한적 실예들은 예컨대 미국 특허 제 5,997,864호에 기재되어 있다.
글리코실화
본원에서 사용되는 글리코실화의 "패턴" 또는 글리코형태 "패턴", "분포" 또는 "스펙트럼"은 인자 VII 폴리펩티드 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드의 주어진 집단 내에서 특정한 올리고당 구조의 표시라는 것을 의미한다. 그러한 패턴의 비-제한적인 실예로는 (i) 하나 이상의 시알산 잔기를 가지고 있거나; (ii) 어떠한 시알 산 잔기가 부족하거나 (즉 중성의 전하); (iii) 하나 이상의 말단 갈락토스 잔기를 가지고 있거나; (iv) 하나 이상의 말단 N-아세틸갈락토사민 잔기를 가지고 있거나; (v) 하나 이상의 "캡핑되지 않은" 안테나를 가지고 있거나, 즉 하나 이상의 말단 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기를 가지고 있거나, 또는 (v) 안테나같은 N-아세틸글루코사민 잔기에 α1→3 결합된 하나 이상의 푸코스를 가지고 있는 올리고당 사슬의 상대적인 비율을 포함한다.
본원에서 사용되는 "올리고당 사슬"은 단일 아미노산 잔기에 공유적으로 결합된 전체 올리고당 구조를 말한다. 인자 VII은 정상적으로 Asn145와 Asn322에서 글리코실화되며 (N-결합 글리코실화) Ser-52와 Ser-60에서 글리코실화된다 (O-결합 글리코실화). 사람에게서 제자리 생성된 인자 VII 상에 존재하는 N-결합 올리고당 사슬은 2-, 3-, 또는 4-안테나를 가질 수 있으며, 각각의 안테나는 Man(β1→4)GlcNAc (β1→4)GlcNAc-Asn에 연결된 (α1→3 또는 6)Man 잔기에 대해 연결된 (β1→2,4 또는 6)Neu5Ac(α2→3 또는 α2→6)Gal(β1→4)GlcNAc 를 가지고 있다. (Neu5Ac는 N-아세틸뉴라민산 (시알산)을 나타내고, Gal은 갈락토스를 나타내며. GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 나타내고, Man은 만노스를 나타낸다.) 올리고당 사슬은 또한 푸코스 잔기를 포함할 수 있는데, 그것은 GlcNAc에 α1→6 연결될 수 있다.
사람에게서 제자리 생성된 인자 VII 상에 존재하는 O-결합 올리고당 사슬은 Xyl-Xyl-Glc-Ser 또는 Glc-Ser 구조를 가지는 Ser-52 안테나, 및 Neu5Ac(α2→3 또는 α2→6)Gal(β1→4)GlcNAc-Fuc-Ser 또는 Fuc-Ser (Fuc는 푸코스를 나타내고, Glc는 글루코스를 나타내며, Xyl은 크실로스를 나타낸다) 구조를 가지는 Ser-60 안테나의 단일 안테나이다.
인자 VII이 사람에서 제자리 생성될 때 일부의 N-결합 올리고당 사슬은 중심의 푸코스 잔기가 부족하며; 모든 사슬은 안테나 역할을 하는 푸코스 잔기가 부족하고; N-결합된 사슬의 두 개는 거의 완전히 시알화되며, 즉 각 안테나의 말단 당이 α2→3 또는 α2→6 연결을 통해 갈락토스에 연결된 N-아세틸뉴라민산이다.
그러나 다른 환경에서 생성될 때 인자 VII은 그것이 가지고 있는 하나 또는 그 이상의 안테나상에 상이한 말단 구조를 가지고 있는 올리고당 사슬을 함유할 수 있다, 예컨대 시알산 잔기가 부족하거나; N-글리콜리뉴라민산 (Neu5Gc) 잔기를 함유하거나; 갈락토스 대신에 말단 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 잔기를 함유하는 등이다. 예컨대 소의 혈청의 존재하에 배양된 BHK 세포에서 생성될 때 인자 VII 제제는 다음의 올리고당 패턴을 나타낸다: 올리고당 사슬의 87 내지 93 %는 하나 이상의 시알산 잔기를 함유하고; 7 내지 13 %는 중성이다 (어떠한 시알산도 결핍되어 있다); 9 내지 16 %는 하나 이상의 말단 갈락토스 잔기를 함유하고; 19 내지 29 %는 초소한 하나의 말단 N-아세틸갈락토사민 잔기를 함유하며; 30 내지 39 %는 하나 이상의 캡핑되지 않은 안테나를 함유한다, 즉 하나 이상의 말단 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민 잔기를 함유한다.
다른 유형의 세포에서 생성되거나 다른 배양 조건 (혈청-유리, 또는 전체가 화학적으로 구정된 배지에서 배양)하에 생성될 때 인자 VII 제제는 다음의 올리고당 패턴을 나타낼 수 있다 (WO 02/29025에도 개시되어 있음):
(i) 올리고당 사슬의 약 94 내지 100 %, 예컨대 약 94 내지 99 %, 약 95 내지 98 %, 또는 약 96 내지 97 %는 하나 이상의 시알산 잔기를 함유한다. 다른 구체예에서 올리고당 사슬의 최소한 약 94 %, 95 %, 96 %, 또는 97 %는 하나 이상의 시알산 잔기를 함유한다;
(ii) 올리고당 사슬의 6 % 또는 그 미만, 예컨대 약 1.5 내지 6 % 또는 약 2 내지 4 %는 중성이다;
(iii) 올리고당 사슬의 약 16 % 미만, 바람직하게는 약 10 % 미만, 예컨대 약 6 내지 10 % 또는 약 8 내지 9 %는 하나 이상의 말단 갈락토스를 함유한다;
(iv) 올리고당 사슬의 약 25 % 미만, 바람직하게는 약 10 % 미만, 예컨대 약 6 내지 9 % 또는 약 7 내지 8 %는 하나 이상의 말단 GalNAc 잔기를 함유한다;
(v) 올리고당 사슬의 약 30 % 미만, 바람직하게는 약 25 % 미만, 예컨대 약 11 내지 23 % 또는 약 12 내지 18 %는 하나 이상의 캡핑되지 않은 안테나를 함유한다; 그리고
(vi) 올리고당 사슬의 최소한 약 2 %, 바람직하게는 최소한 약 5 %, 보다 바람직하게는 최소한 약 10 % 또는 20 %, 가장 바람직하게는 최소한 약 40 %는 안테나성 N-아세틸글루코사민 잔기 (즉 Man 잔기에 β1→2,4, 또는 6으로 연결된 N-아세틸글루코사민 잔기)에 α1→3으로 연결된 하나 이상의 푸코스를 함유한다.
나아가 시알화 정도 (즉 각 올리고당 사슬에 부착된 시알산 잔기의 수)는 발현된 인자 VII 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드-제제에 대하여 예컨대 미국 특허 6,399,336호에 설명되어 있는 것과 같이 시알릴트랜스페라제 및 시알산 공여 분자 를 사용하여 시험관내에서 효소적 처리를 함으로써 개선될 수 있다. 이 방식으로 올리고당 사슬 상에 있는 실질적으로 모든 안테나가 시알화될 수 있다 (즉 시알산 잔기로 "캡핑된다"). 어떤 경우에는 FVII 또는 FVII 관련된 폴리펩티드 상의 N-글루칸이 또한 완전하게 갈락토실화되지 않으며, 시알화 단계 전에 갈락토실 트랜스페라제 및 UDP-갈락토스 공여 기질을 포함하는 갈락토실화 단계가 생성물의 시알산 함량을 개선시킬 것이다.
본 발명자들은 하나 이상의 올리고당 기에 공유적으로 부착되어 있는 하나 이상의 중합체 기를 함유하는 올리고당 패턴을 함유하는 인자 VII 제제를 제조하였다. 한 구체예에서 제제는 하나 또는 그 이상의 다음의 글리코형태 패턴을 나타내는 인자 VII 폴리펩티드 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드를 포함한다:
(i) 올리고당 사슬의 약 94 내지 100 %, 예컨대 약 94 내지 99 %, 약 95 내지 98 %, 또는 약 96 내지 97 %는 하나 이상의 시알산 잔기를 함유한다. 다른 구체예에서 올리고당 사슬의 최소한 약 94 %, 95 %, 96 %, 또는 97 %는 하나 이상의 시알산 잔기를 함유한다;
(ii) 올리고당 사슬의 6 % 또는 그 미만, 예컨대 약 1.5 내지 6 % 또는 약 2 내지 4 %는 중성이다;
(iii) 올리고당 사슬의 약 16 % 미만, 바람직하게는 약 10 % 미만, 예컨대 약 6 내지 10 % 또는 약 8 내지 9 %는 하나 이상의 말단 갈락토스를 함유한다;
(iv) 올리고당 사슬의 약 25 % 미만, 바람직하게는 약 10 % 미만, 예컨대 약 6 내지 9 % 또는 약 7 내지 8 %는 하나 이상의 말단 GalNAc 잔기를 함유한다;
(v) 올리고당 사슬의 약 30 % 미만, 바람직하게는 약 25 % 미만, 예컨대 약 11 내지 23 % 또는 약 12 내지 18 %는 하나 이상의 캡핑되지 않은 안테나를 함유한다; 그리고
(vi) 올리고당 사슬의 최소한 약 2 %, 바람직하게는 최소한 약 5 %, 보다 바람직하게는 최소한 약 10 % 또는 20 %, 가장 바람직하게는 최소한 약 40 %는 안테나성 N-아세틸글루코사민 잔기 (즉 Man 잔기에 β1→2,4, 또는 6으로 연결된 N-아세틸글루코사민 잔기)에 α1→3으로 연결된 하나 이상의 푸코스를 함유한다.
상기 (i) 내지 (vi)의 각각은 본 발명의 구체예에 의하여 포함되는 분명한 글리코형태 패턴을 대표한다는 것, 즉 하나 이상의 중합체 기가 하나 이상의 올리고당에 공유적으로 부착되는 본 발명에 따르는 제제의 글리코형태 패턴이 (i) 내지 (vi)중 오직 하나에 의해서만 설명될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 또는 달리 본 발명에 의해 포함되는 제제의 글리코형태 패턴은 (i) 내지 (vi)중 하나 이상에 의해 설명될 수도 있다.
나아가 본 발명에 의해 포함되는 제제는 하나 또는 그 이상의 다른 구조적 특징과 조합되어 (i) 내지 (vi)중 하나 또는 그 이상에 의해 설명될 수 있다. 예를 들어 본 발명은 시알산 잔기 (Neu5Ac 또는 Neu5Gc)가 갈락토스에 독점적으로 α2→3 배치로 연결되어 있는 인자 VII 폴리펩티드 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드를 포함하는 제제를 포함한다. 본 발명은 또한 중심 N-아세틸글루코사민에 α1→6 으로 연결된 푸코스 및/또는 안테나 모양의 N-아세틸글루코사민에 α1→3 으로 연결된 푸코스를 함유하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드를 포함하 고 있는 제제를 포함한다. 일련의 한 구체예에서 본 발명의 제제는 올리고당 사슬의 99 % 이상이 하나 이상의 시알산 잔기를 함유하고 (a) 시알산 잔기가 배타적으로 α2→3 배치로 연결되고 및/또는 (b) 중심 N-아세틸글루코사민에 연결된 푸코스 잔기가 있으며 및/또는 (c) 안테나의 검출가능한 수가 N-아세틸갈락토사민에서 끝나는 인자 VII 폴리펩티드 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서 본 발명은 올리고당 사슬의 99 % 이상이 하나 이상의 시알산 잔기를 함유하고 있고, 시알산 잔기는 독점적으로 α2→3 배치로 갈락토스에 연결되어 있는 야생형 인자 VIIa를 포함하고 있는 제제를 포함한다. 다른 구체예에서 본 발명은 올리고당 사슬의 99 % 이상이 하나 이상의 시알산 잔기를 함유하고 있고, 올리고당 사슬의 최소한 일부는 N-아세틸갈락토사민을 포함하는 야생형 인자 VIIa를 포함하고 있는 제제를 포함한다.
N-결합 및/또는 O-결합 올리고당의 패턴은 당해 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 방법이든지 사용하여 측정될 수 있고, 그러한 방법으로는 제한 없이 다음과 같은 것들이 있다: 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC); 모세관 전기영동 (CE); 핵 자기 공명 (NMR); 빠른 원자 폭발, 전기분무, 또는 매트릭스-보조 레이저 탈착 (MALDI)과 같은 이온화 기법을 사용하는 질량 분광학; 가스 크로마토그래피 (GC); 및 음이온-교환 (AIE)-HPLC, 크기-축출 크로마토그래피 (SEC), 질양 분광학 (MS), 겔 전기영동 (SDS-PAGE, CE-PAGE), 등전점 포커싱 겔, 또는 등전점 포커싱 모세관 전기영동 (CE-IEF)과 결부된 엑소글리코시다제를 이용한 처리 (Weber et al., Anal. Biochem. 225:135 (1995); Klausen et al., J. Chromatog. 718:195 (1995); Morris et al., in Mass Spectrometry of Biological Materials, McEwen et al., eds., Marcel Dekker, (1990), pp 137-167; Conboy et al., Biol. Mass Spectrom. 21:397,1992; Hellerqvist, Meth. Enzymol. 193:554 (1990); Sutton et al., Anal. Biohcem. 318:34 (1994); Harvey et al., Organic Mass Spectrometry 29:752 (1994)).
상기 방법들 중 어느 것 (또는 상이한 구조를 가지고 있는 올리고당 사슬을 분해하는 다른 어떠한 방법)을 사용하여 인자 VII-유도된 올리고당 사슬을 분해한 후에, 분해된 종들은 예컨대 그룹 (i) 내지 (vi)중 하나에 배당된다. (i) 내지 (vi)의 각각의 상대적인 함량은 샘플중의 올리고당 사슬의 총 함량에 비교하여 그 그룹에 배정된 올리고당의 합으로서 계산된다.
예를 들어 AIE-HPLC를 사용하여 BHK 세포에서 생성된 재조합 인자 VII 제제로부터 13 또는 그 이상의 N-결합 올리고당 피크를 분해할 수 있다 (Klausen et al., Mol. Biotechnol. 9:195, 1998). 피크중 5 개 (상기 Klausen의 문헌에서 1 내지 5로 표시됨)는 시알산을 함유하지 않았고, 피크중 8 개 (6, 7 및 10 내지 15로 표시됨)는 시알산을 함유하였다.
주어진 분석에서 시알산 함유 및 시알산-결핍 사슬의 수 및 분포는 (a) 발현되는 폴리펩티드; (b) 세포 유형 및 배양 조건; (c) 발현 후의 화학적 및/또는 효소적 처리에 의한 글리코형태 패턴의 어떠한 변형; 및 (d) 사용되는, 그리고 그 결과의 패턴이 따라서 달라질 수 있는 분석 방법에 좌우될 수 있음이 인지될 것이다.
어떤 경우든지 일단 시알산-함유 올리고당이 비-시알산-함유 올리고당으로부터 분해되고 나면, 종래의 데이터 분석 프로그램이 사용되어 각 피크 하의 면적, 총 피크 면적, 및 특정 피크에 의해 표시되는 총 피크 면적의 백분율이 계산된다. 이런 방법으로 주어진 제제에 대하여 시알산-함유 피크의 면적의 합/총 피크 면적 × 100배 % 시알화 값 (즉 하나 이상의 시알산 잔기를 가지고 있는 올리고당 사슬이 비율)이 본 발명에 따르는 제제에 대해 산출된다. 유사한 방식으로 시알산이 없거나 하나 이상의 갈락토스 또는 N-아세틸글루코사민을 가지고 있는 사슬의 %가 계산될 수 있다.
중합체
폴리펩티드에 커플될 중합체 분자는 어떠한 적당한 분자, 예를 들면 전형적으로 분자량이 약 300 내지 100,000 Da, 예컨대 약 500 내지 20,000 Da, 또는 약 500 내지 15,000 Da, 또는 2 내지 15 kDa, 또는 3 내지 15 kDa, 또는 3 내지 12 kDa, 또는 약 10 kDa인 천연 또는 합성 단일-중합체 또는 헤테로-중합체일 수 있다. 용어 "약"이 본원에서 특정 분자량과 관련되어 사용될 때, 단어 "약"은 주어진 중합체 제제에서 대략적인 평균 분자량 분포를 가리킨다.
단일 중합체의 실예로는 폴리알코올 (즉 폴리-OH), 폴리아민 (즉 폴리-NH2) 및 폴리카르복실산 (즉 폴리-COOH)이 있다. 헤테로중합체는 히드록실기와 아민 기와 같은 상이한 커플링기를 포함하는 중합체이다.
적절한 중합체 분자의 실예로는 폴리알킬렌 옥사이드 (PAO), 예를 들면 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 분지된 PEG, 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리-비닐피롤리돈, 폴리에틸렌-공동-말레산 무수물, 폴리스티렌-공동-말레산 무수물, 및 덱스트란, 예컨대 카르복시메틸-덱스트란, 폴리우레탄, 폴리에스테르 및 폴리아미드, 또는 면역원성을 감소시키고 및/또는 기능적인 생체내 반감기 및/또는 혈청 반감기를 증가시키기에 적절한 어떠한 다른 중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중합체 분자를 포함한다. 일반적으로 폴리알킬렌글리콜-유도된 중합체가 생체에 적합하며, 비독성이고, 비항원성이며, 비면역원성이고, 다양한 용해도 성질을 가지며, 살아있는 유기체로부터 쉽게 분비된다.
PEG가 바람직한 중합체 분자인데, 왜냐 하면 그것이 예컨대 덱스트란과 같은 폴리당에 비교하여 교차결합할 수 있는 반응성 기를 단지 소수 가지고 있기 때문이다. 특히 단일-기능성의 PEG, 예컨대 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)이 그것의 커플링 화학이 상대적으로 간단하기 때문에 중요하다 (단지 하나의 반응성 기가 올리고당의 부착기와 포합체를 이룰 수 있다). 결과적으로 교차 결합의 위험이 제거되며, 그 결과 생성되는 폴리펩티드 포합체는 보다 더 동종성이고, 중합체 분자와 폴리펩티드와의 반응은 보다 더 조절하기가 쉽다.
중합체 분자(들)의 폴리펩티드에 대한 공유 부착을 이루기 위하여 중합체 분자의 히드록실 단부 기는 활성화된 형태, 즉 반응성 작용기를 가지고 있는 채로 제공되어야 한다 (반응성 작용기의 실예로는 일차 아미노기, 히드라지드 (HZ), 티올, 숙시네이트 (SUC), 숙신이미딜 숙시네이트 (SS), 숙신이미딜 숙신아미드 (SSA), 숙신이미딜 프로프리오네이트 (SPA), 숙신이미딜 카르복시메틸레이트 (SCM), 벤조트 리아졸 카보네이트 (BTC), N-히드록시숙신이미드 (NHS), 알데히드, 니트로페닐카보네이트 (NPC), 및 트레실레이트 (TRES)가 있다). 적절한 활성화된 중합체 분자는 상업적으로 예를 들면 Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA로부터, 또는 PolyMASC Pharmaceuticals plc, UK로부터 활용가능하다. 또는 달리 중합체 분자는 예컨대 WO 90/13540에 개시되어 있는 바와 같은 당해 기술분야에 공지되어 있는 종래 방법에 의해 활성화될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 활성화된 선형 또는 분지된 중합체 분자의 특정 실예는 Shearwater Polymers, Inc. 1997 및 2000 카탈로그 (연구 및 약제학을 위한 기능화된 생체 적합한 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 유도체)에 기재되어 있다.
활성화된 PEG 중합체의 특정 실예로는 다음의 선형 PEG: NHS-PEG (예컨대 SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, 및 SCM-PEG), 및 NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG, 및 MAL-PEG와, 분지된 PEG, 예컨대 PEG2-NHS 및 미국 특허 제 5,932,462호 및 5,643,575호에 기재되어 있는 것들이 있다. 나아가, 다음의 공보물은 유용한 중합체 분자 및/또는 페길화 (PEGylation) 화학을 개시한다: US 5,824,778, US 5,476,653, WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, US 4,902,502, US 5,281,698, US 5,122,614, US 5,219,564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W0 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, US 5,736,625, WO 98/05363, EP 809 996, US 5,629,384, WO 96/41813, WO 96/07670, US 5,473,034, US 5,516,673, EP 605 963, US 30 5,382,657, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 및 EP 154 316.
폴리펩티드의 올리고당 사슬과 활성화된 중합체 분자와의 포합은 종래의 어떠한 방법을 사용함으로써 수행된다. 종래의 방법은 당업자들에게 공지이다.
숙련가는 사용될 활성화 방법 및/또는 포합 화학이 올리고당(들)의 부착기(들) 뿐 아니라 중합체 분자의 기능기들 (예컨대 아민, 히드록실, 카르복실, 알데히드, 케톤, 술프히드릴, 숙신이미딜, 말레이미드, 비닐술폰 또는 할로아세테이트)에 좌우된다는 것을 인지할 것이다.
중합체 포합은 부착되는 중합체 분자의 수, 그러한 분자의 크기 및 형태 (예컨대 그것들이 선형이든 분지된 것이든 관계없이), 및 올리고당 사슬(들)의 부착 부위(들)와 관련하여 최적 분자를 생성하기 위해 디자인된다. 사용될 중합체의 분자량은 예컨대 이루고자 하는 원하는 효과를 토대로 하여 선택될 수 있다. 예를 들어 만약 포합의 일차 목적이 큰 분자량을 가지는 포합체를 이루기 위한 것이라면 (예컨대 신장에서의 제거를 위하여) 통상 가능한 한 큰 분자량의 중합체 분자를 소수 포합시켜서 원하는 분자량을 얻는 것이 바람직하다.
또한 본 발명에 따르면 중합체 분자를 링커를 경유하여 중합체 분자에 커플시키는 것이 예상된다. 적절한 링커는 당업자에게 잘 알려져 있다. 바람직한 실예로는 염화 시아누르산이 있다 (Abuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; US 4,179,337; Shafer et al., (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378). 포합에 이어서 잔류하는 활성화된 중합체 분자들은 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법에 따라, 예컨대 반응 혼합물에 일차 아민을 첨가함으로써 차단되고, 그 결과 비활성화된 중합체 분자들은 적절한 방법에 의해 제거된다. 그러한 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있다 (예컨대 March, Advanced Organic Chemistry, 3rd edition, John Wiley & Sons, N. Y. 1985; Greene et al., Protective groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, N. Y., 1991; Taylor (1991), Protein Immobilization, Fundamentals and Applications, Marcel Dekker, N. Y.; Wong (1992), Chemistry of protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton; Hermanson et al., (1993), Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, N. Y.; Dunn et al., Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, 1991 참조).
환경, 예컨대 폴리펩티드의 아미노산 서열, 사용되는 활성화된 PEG 화합물의 성질 및 폴리펩티드에 대한 PEG의 몰비를 포함한 특정 페길화 조건에 따라, 다양한 정도의 페길화가 얻어질 수 있는데, 일반적으로 폴리펩티드에 대한 PEG의 비율이 높을 수록 얻어지는 페길화 정도가 크다는 것을 이해할 것이다. 그러나 어떠한 주어진 페길화 공정으로부터 발생되는 페길화된 폴리펩티드는 약간 상이한 정도의 페길화를 가지고 있는 폴리펩티드 포합체의 확률론적인 분포를 정상적으로 포함할 것 이다.
본 발명의 흥미로운 구체예에서 본 발명의 폴리펩티드 포합체는 인자 VII 폴리펩티드의 올리고당 기의 말단부에 위치한 시알산 기중 하나에 공유적으로 부착된 중합체 분자를 포함하며, 상기 중합체 분자는 폴리펩티드에 부착된 유일한 중합체 분자이다. 다른 구체예에서는 두개의 중합체 분자가 인자 VII 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 올리고당 기(들)에 공유 결합되며; 또 다른 구체예에서는 3, 4, 5, 6, 또는 7 개의 중합체 분자들이 인자 VII 폴리펩티드에 공유 부착된다.
한 구체예에서 인자 VII 폴리펩티드는 도:1에 도시된 것과 같은 야생형 FVII 또는 FVIIa 폴리펩티드이고; 다른 구체예에서는 인자 VII 폴리펩티드는 인자 VII-관련 폴리펩티드이며; 또 다른 한 구체예에서는 인자 VII-관련 폴리펩티드는 인자 VII 아미노산 서열 변이체이다.
바람직한 것은 그러한 폴리펩티드 포합체가 단일 PEG 분자를 포함하는 것인 것이다. 특히 최소한 약 5 kDa, 특히 약 10 내지 25 kDa, 예컨대 약 15 내지 25 kDa, 예컨대 약 20 kDa 또는 약 10 kDa의 분자량을 가지고 있는 선형 또는 분지된 PEG가 바람직하다.
바람직하게는 본 발명의 포합체에서 중합체 분자의 수 및 분자량은, 중합체 분자에 의해 첨가된 총 분자량이 5 내지 25 kDa의 범위, 예컨대 10 내지 25 kDa의 범위, 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 15 kDa, 또는 약 20 kDa가 되도록 선택된다.
예정된 올리고당 패턴을 가지고 있는 중합체-부착된 인자 VII 제제의 제조 방법
인자 VII 제제의 제조 방법: 인자 VII, 인자 VII 변이체, 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드는 글리코실화된 인자 VII 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드를 발현하는 적절한 어떠한 숙주 세포 (즉 폴리펩티드의 글리코실화 부위에 올리고당 기를 부착할 수 있는 숙주 세포)를 사용하여 제조될 수 있다. 인자 VII는 또한 사람 또는 다른 종으로부터 얻어지는 혈장으로부터도 분리될 수 있다.
어떤 구체예에서는 숙주 세포는 내인성 인자 VII 유전자를 발현하는 사람 세포이다. 이들 세포에서 내인성 유전자는 무상일 수 있거나 제자리 변형될 수 있고, 또는 인자 VII 유전자 밖에 있는 서열이 제자리 변형되어서 내인성 인자 VII 유전자의 발현을 변경시킬 수도 있다. 어떠한 사람 세포든지 내인성 인자 VII 유전자를 발현시킬 수 있으면 사용될 수 있다.
다른 구체예에서는 이종성 숙주 세포가 재조합 유전자로부터 사람 인자 VII을 발현하도록 프로그램된다. 숙주 세포는 척추동물, 곤충, 또는 진균류 세포일 수 있다. 바람직한 것은 세포가 포유류의 N-결합 글리코실화; O-결합 글리코실화; 및 γ-카르복실화를 모두 담을 수 있는 포유류 세포인 것이 좋다 (미국 특허 제 4,784,950호 참조). 바람직한 포유류 셀라인으로는 CHO (ATCC CCL 61), COS-1 (ATCC CRL 1650), 어린 햄스터 신장 (BHK) 및 HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) 셀라인이 있다. 바람직한 BHK 셀라인은 tk- ts13 BHK 셀라인 (Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982)이며, 이하 BHK 570 세포로 명명한다. BHK 570 셀라인은 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852)으로부터 ATCC 승인 번호 CRL 10314로 활용가능하다. tk- ts13 BHK 셀라인은 또한 ATCC로부터 승인 번호 CRL 1632로 활용가능하다. 또한 다른 많은 셀라인도 사용될 수 있는데, 예를 들면 Rat Hep I (쥐의 간종양; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (쥐의 간종양; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), 사람 폐 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) 및 DUKX 세포 (CHO 셀라인) (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980) (DUKX 세포는 또한 CXB11 세포로도 언급된다), 및 DG44 (CHO 셀라인) (Cell, 33:405, 1983, 및 Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555, 1986)가 있다. 또한 유용한 것은 3T3 세포, Namalwa 세포, 골수종 및 골수종과 다른 세포와의 융합물이다. 특히 바람직한 구체예에서 숙주 세포는 BHK 21 세포로, 그것은 혈청의 부재시에 성장하도록 적응되었고, 인자 VII을 발현하도록 프로그램되었다. 어떤 구체예에서는 세포는 그것들이 유도되는 세포 유형과는 글리코실화 효소 (예컨대 글리코실 트랜스페라제 및/또는 글리코시다제)의 스펙트럼이 정성적으로나 정량적으로 상이한 스펙트럼을 발현하는 돌연변이 또는 재조합 세포일 수 있다. 세포는 또한 다른 이종성 펩티드 또는 단백질, 예컨대 인자 VII의 절단된 형태를 포함하는 것들을 발현하도록 프로그램될 수 있다. 한 구체예에서 숙주 세포는 관심의 인자 VII 폴리펩티드 (즉 인자 VII 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드)와 다른 이종성 펩티드 또는 폴리펩티드, 예컨대 변형 효소 또는 인자 VII 단편을 공동-발현하도록 프로그램된 CHO 세포이다.
상기에서 (i) 내지 (vi)로 설명된 글리코형태 패턴중 어느 것을 포함하는 인자 VII의 제제를 제조하는 방법 및 인자 VII 및 인자 VII-관련 폴리펩티드의 글리코형태 분포를 최적화하는 방법은 다음의 단계들에 의해 수행될 수 있다:
(a) 인자 VII 및 인자 VII-관련 폴리펩티드를 발현하는 세포를 예정된 배양 조건의 첫번째 세트하에서 배양하는 단계;
(b) 배양물로부터 인자 VII 및 인자 VII-관련 폴리펩티드를 회수하여 폴리펩티드를 포함하고 있는 제제를 얻는 단계; 그리고
(c) 폴리펩티드에 연결된 올리고당의 구조를 분석하여 글리코형태 패턴을 측정하는 단계.
방법은 추가로 다음 단계들을 포함한다:
(d1) 단계 (a)의 배양 조건을 변경함으로써 두번째 세트의 예정된 배양 조건을 수립하는 단계;
(e1) 원하는 글리코형태 패턴이 이루어질 때 까지 단계 (b) 내지 (d1)을 반복하는 단계;
(f1) 인자 VII 및 인자 VII-관련 폴리펩티드를 중합체 분자와, 중합체 분자가 폴리펩티드의 올리고당 기에 공유 부착되는 조건하에서 접촉시키는 단계.
또는 달리 방법은 추가로 다음 단계들을 포함한다:
(d2) 올리고당 구조를 변경시키기 위하여 제제를 화학적으로 및/또는 효소적으로 처리하는 단계;
(e2) 원하는 글리코형태 패턴이 이루어질 때 까지 단계 (b) 내지 (d2)를 반 복하는 단계.
이들 방법은 추가로 예정된 글리코형태 패턴을 가지고 있는 제제에 대하여 하나 이상의 생체 활성 (예컨대 응고, 인자 X 단백질 가수분해, 또는 TF 결합) 시험 또는 다른 기능성 (예컨대 약리역학적 프로필 또는 안정성) 시험을 수행하는 단계와, 특정 글리코형태 패턴을 특정한 생체 활성 또는 기능성 프로필과 상관지어서 원하는 글리코형태 패턴을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
단계 (d1)에서 변경될 수 있는 배양 조건의 변수로는 제한 없이 다음과 같은 것들이 있다: 기원 세포, 예컨대 원래 사용된 것과는 상이한 종으로부터 유도된 세포; 또는 하나 또는 그 이상의 글리코실트랜스페라제 또는 글리코시다제에 변경을 가지고 있거나 또는 글리코실화 장치의 다른 성분을 가지고 있는 돌연변이 또는 재조합 세포 (Grabenhorst et al., Glycoconjugate J. 16:81, 1999; Bragonzi et al., Biochem. Biophys. Acta 1474:273, 2000; Weikert, Nature Biotechnol. 17:1116, 1999); 폴리펩티드의 발현 수준; 글루코스 또는 글루타민 농도와 같은 대사 조건; 혈청의 존재 또는 부재; 비타민 K의 농도; 단백질 가수분해물, 호르몬, 미량 금속, 염, 및 온도, 용해된 산소 수준 및 pH와 같은 처리과정 매개변수.
제제의 올리고당 패턴을 변형시키기 위하여 단계 (d2)에서 사용될 수 있는 효소적 처리로는 제한 없이, 특정한 말단 구조를 가지고 있는 올리고당 사슬의 분포에 원하는 변형을 이루는 조건하에서 및 서열에서 하나 또는 그 이상의 시알리다제 (뉴라미니다제), 갈락토시다제, 푸코시다제; 갈락토실 트랜스페라제, 푸코실 트랜스페라제, 및/또는 시알릴트랜스페라제를 사용하는 처리가 있다. 글리코실 트랜 스페라제는 Calbiochem (La Jolla, CA)로부터 시판되는 것을 이용할 수 있으며, 글리코시다제는 Glyko, Inc., (Novato, CA)로부터 시판되는 것을 이용할 수 있다.
일련의 한 구체예에서 인자 VII 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포는, 그것들이 상기에서 (i) 내지 (vi)중 하나로서 설명된 올리고당 구조의 원하는 패턴을 가지고 있는 글리코실화된 인자 VII 폴리펩티드를 분비하는 특이한 배양 조건하에 놓이게 된다. 그러한 배양 조건에는 제한 없이 혈청의 감소 또는 완전한 부재가 포함된다. 바람직하게는 숙주 세포는 혈청 없이 성장하고 성장 단계에서나 생성 단계에서 혈청이 없이 배양되도록 적응되는 것이다. 그러한 적응 과정은 문헌에 기재되어 있다 (Scharfenberg, et al., Animal Cell Technology Developments towards the 21 st Century, E. C. Beuvery et al. (Eds.), Kluwer Academic Publishers, pp. 619-623, 1995 (BHK and CHO 세포); Cruz, Biotechnol. Tech. 11:117-120, 1997 (곤충 세포); Keen, Cytotechnol. 17:203-211, 1995 (골수종 세포); Berg et al., Biotechniques 14:972-978, 1993 (사람 신장 293 세포). 바람직한 구체예에서 세포에 첨가되는 성장 배지에는 동물 조직 또는 동물 세포 배양액으로부터 분리된 단백질 또는 다른 성분이 함유되어 있지 않다 (예컨대 하기의 실시예 1 참조). 전형적으로 인자 VII을 생성하기에 적절한 배지는 종래의 성분 외에 인자 VII의 글루타민 잔기의 γ-카르복실화에 필요한 비타민 K를 0.1 내지 50 mg/l의 농도로 함유한다.
다른 일련의 구체예에서 글리코형태는, 인자 VII 또는 인자 VII-관련 폴리펩 티드의 제제에 대해 그 안에 N-결합 및/또는 O-결합 올리고당이 포함되는 효소적 및/또는 화학적 변형을 수행함, 예컨대 제제에 예를 들면 미국 특허 제 6,399,336호에 기재되어 있는 것과 같은 시알릴트랜스페라제 또는 갈락토실 트랜스페라제에 의한 변형을 수행함으로써 제조된다. 바람직하게는 N-결합 올리고당이 변형된다. 시알릴트랜스페라제는 당단백질 상에 있는 수용체 기 (예컨대 말단 갈락토스)를 높은 백분율로 시알화할 수 있다. 원하는 결과는 통상 당단백질의 mg 당 약 50 mU 또는 그 이하의 시알릴트랜스페라제를 사용함으로써 얻어진다. 전형적으로 이 방법에 의하여 변경된 글리코형태 패턴을 가지고 있는 당단백질 상의 올리고당은 그 결과로서 변경되지 않은 폴리펩티드보다 더 큰 백분율의 시알화된 말단 갈락토스 잔기를 가질 것이다. 본질적으로 100 %의 말단 갈락토스 잔기가 이들 방법을 사용한 후에 시알화될 수 있다. 방법은 전형적으로 약 48 시간 또는 그 이하의 시간에 원하는 수준의 시알화를 이룰 수 있다. 바람직한 것은 당단백질의 N-결합 탄수화물의 글리코실화를 위해서는 시알릴트랜스페라제가 완전히 시알화된 탄수화물 구조상의 말단 시알산 아래 놓여있는 가장 통상적인, 끝에서 두번째의 서열인 서열 Galβ1→4)GlcNAc-로 시알산을 이동시킬 수 있다는 것이다. 수용체 기로서 Galβ1→4)GlcNAc-을 사용하는 시알릴트랜스페라제의 실예로는 ST3Gal III, ST3Gal IV, 및 ST3Gal V (α2→3 연쇄에 의해 NeuAc를 부착한다) 및 ST6Gal I 및 ST6Gal II (α2→6 연쇄에 의해 NeuAc를 부착한다)가 있다 (US 6,399,336 참조). (시알릴트랜스페라제 명명법은 Tsuji et al., Glycobiology 6:v-xiv (1996)에 기재되어 있다).
그러므로 2 효소의 혼합물은 만약 두 개의 연쇄가 최종 생성물에 있기를 원 한다면 가치있는 것이다. 간단히 말해서 당단백질의 시알화는 예를 들면 CMP-시알산 합성효소를 포함하는 시알릴트랜스페라제 사이클을 사용하여 이루어진다. 이 사이클에서 CMP-재생 시스템은 시티딘 모노포스페이트 (CMP), 누클레오시드 트리포스페이트, 포스페이트 공여체, 포스페이트 공여체로부터 누클레오시드 디포스페이트로 포스페이트를 전달할 수 있는 키나아제 및 누클레오시드 트리포스페이트로부터 CMP로 말단 포스페이트를 전달할 수 있는 누클레오시드 모노포스페이트 키나아제를 포함한다. 재생 시스템은 또한 시알산을 CMP에 전달하는 CMP-시알산 합성효소를 사용한다. 시알릴화 사이클에서 CMP는 첨가된 ATP의 존재 하에 누클레오시드 모노포스페이트 키나아제에 의해 CDP로 전환된다. ATP는 그것의 부산물인 ADP로부터 첨가된 포스포에놀피루브산염 (PEP)의 존재 하에 피루브산염 키나아제 (PK)에 의해 촉매적으로 재생된다. CDP는 계속해서 CTP로 전환되는데, 이러한 전환은 PEP의 존재 하에 PK에 의해 촉매된다. CTP는 시알산과 반응하여 무기 피로포스페이트 (PPi) 및 CMP-시알산을 형성하는 데, 후자의 반응은 CMP-시알산 합성효소에 의해 촉매된다. 갈락토실 글루코시드의 시알화에 이어서 방출된 CMP는 다시 재생 시스템에 유입되어 CDP, CTP 및 CMP-시알산을 형성한다. 형성된 PPi는 제거되어 부산물로서 무기 포스페이트를 형성한다. 피루브산염 또한 부산물이다. 방법의 자체-함유 및 순환적인 특성 때문에 일단 모든 반응물과 효소가 존재하면, 반응은 첫번째 기질 (예컨대 유리 NeuAc 및 PEP, 또는 수용체)이 다 소모될 때까지 계속된다. 시알트랜스페라제 사이클에 대해서는 예컨대 미국 특허 제 5,374,541호 및 6,399,336호에 설명되어 있다.
시알릴트랜스페라제에 대한 수용체는 변형될 당단백질 상에 존재할 것이다. 적절한 수용체로는 예를 들면 Gal(β1→4)GlcNAc-, Gal(β1→4)GalNAc-, Gal(β1→3)GalNAc-, Gal(β1→3)GlcNAc-, Gal(β1→6)GlcNAc-, Gal(β1→4)Glc- 및 당업자들에게 공지되어 있는 다른 수용체들이 있다 (Paulson et al. (1978) J. Biol. Chem. 253:5617-5624). 전형적으로 수용체는 폴리펩티드에 존재하는 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌 잔기에 부착된 올리고당 사슬에 포함된다.
당단백질은 전체적으로 또는 부분적으로 "트림 (trim)"되어 시알릴트랜스페라제에 대한 수용체 또는 하나 또는 그 이상의 적절한 잔기가 첨가되어 적당한 수용체가 얻어질 수 있는 부분이 노출될 수 있다. 글리코실트랜스페라제 및 엔도글리코시다제와 같은 효소들이 부착과 반응의 트리밍에 유용하다. 예를 들어 당단백질은 그것을 시알리다제로 처리하여 말단 갈락토스 기를 생성한 후에 그 단백질에 대하여 시알릴트랜스페라제 사이클을 수행함으로써, 또는 추가로 갈락토시다제로 처리함으로써 N-아세틸-글루코사민 수준을 추가로 떨어뜨림으로써 "트림"될 수 있다. 시알릴화에 적절한 수용체를 가지고 있는 폴리펩티드를 얻는 방법에 대해서는 예컨대 미국 특허 5,272,066호를 참조한다.
인자 VII 폴리펩티드에 대한 중합체 분자의 공유 부착 방법:
본 발명을 작동시키는 데 사용된 중합체 분자와 같은 다양한 화학적 부분은 폴리펩티드를 예컨대 변형된 시알산으로 효소적 처리하거나 또는 화학적 합성에 의해 인자 VII 폴리펩티드상의 올리고당에 공유적으로 부착될 수 있다. 중합체 분자는 또한 링커를 통하여 올리고당에 커플될 수 있다. 적절한 링커는 당업자에게 잘 알려져 있다. 실예로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, N-(4-아세틸페닐)말이미드, 숙신이미딜 에스테르 활성화된 말이미도 유도체, 예컨대 시판되는 것을 이용할 수 있는 숙신이미딜 4-말이미도부타노에이트, 1,6-비스말이미도헥산이 있다.
본 발명을 작동시키는 데 사용된 중합체 분자와 같은 다양한 화학적 부분은 시알산에 공유 부착될 수 있고, 그로써 "변형된" (또는 포합된) 시알산이 계속해서 시알릴트랜스페라제 사이클에 통합되고, 그 결과 중합체 분자가 당단백질에 공유 부착된다. 포합된 시알산은 숙련된 기술자들에게 공지되어 있는 종래 방법들에 의해 제조될 수 있다. 중합체 분자는 또한 링커를 통하여 시알산에 커플될 수 있다.
FVII 및 FVII 유사체의 화학효소적 유도
본 발명을 실시하는데 사용되는 변형된 당 포스포 누클레오티드는 일반식 I과 II에 따라 치환될 수 있다:
Figure 112004060352093-pct00001
Figure 112004060352093-pct00002
상기 식에서
-X는 독립적으로 S, O, NH, 또는 원자가 결합으로부터 선택된 구성원이고;
-R1, R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 H, 중합체 및 중합체 분자에 공유 부착된 링커 분자, 아실 (아세틸 및 히드록시아세틸 포함), 및 알킬로부터 선택된 구성원이며;
-M+는 Na+, K+, Li+, 삼차 암모늄 또는 유사한 양이온으로부터 선택된 양이온이다.
바람직한 구체예에서 R1과 R2는 독립적으로 질량이 1 내지 40,000 kDa인 PEG-기초 중합체이다.
다른 바람직한 구체예에서 R1은 독립적으로 질량이 1 내지 40,000 kDa인 PEG-기초 중합체이다.
개략도 1로 설명된 예시적인 구체예에서 아민-, 2-히드록시- 및 카르복실 보호된 뉴라민산은 초기에 문헌에 설명된 방법에 따라 그것의 9-아미노 유도체로 전환된 후 (Isecke, R.; Brossmer, R., Tetrahedron 1994, 50(25), 7445-7460), 계속해서 표준 커플링 조건을 사용하여 PEG-COOH로 유도된다. 그런 다음 PEG 유도된 생성물은 완만한 산 조건하에 탈보호된후, 효소적으로 상응하는 누클레오티드 당으로 전환된다.
개략도 1:
Figure 112004060352093-pct00003
개략도 2로 설명된 또 다른 예시적인 구체예에서, N-아세틸 뉴라민산은 미쯔노부 조건하에서 PEG-유도된 티오산으로 처리되어 PEG-유도된 N-아세틸 뉴라민산이 생성되고, 그것이 당 누클레오티드로 전환된다.
개략도 2:
Figure 112004060352093-pct00004
개략도 3으로 설명된 또 다른 예시적인 구체예에서, 변형된 갈락토스의 티올은 말레이미드 부분을 함유하고 있는 PEG와 반응한다. 그런 다음 PEG-갈락토스 화합물은 효소적 또는 화학적 방법에 의해 상응하는 누클레오티드 당으로 전환될 수 있다.
개략도 3:
Figure 112004060352093-pct00005
개략도 4로 설명된 또 다른 예시적인 구체예에서, 6-아미노 갈락토스 (Fernandez, J. et al., J. Org. Chem. 1993, 58(19), 5192-5199)는 보호된 아미노산 부분을 함유하고 있는 PEG와 반응한다. 그런 다음 PEG-갈락토스 화합물은 효소적 또는 화학적 방법에 의해 상응하는 누클레오티드 당으로 전환될 수 있다.
개략도 4
Figure 112004060352093-pct00006
개략도 5로 설명된 또 다른 예시적인 구체예에서, 보호된 6-브로모-갈락토스 (Hodosi, G., Podanyi, B. and Kuszmann, J., Carbohydr. Res., 1992, 230(2), 327-342)는 티올 부분을 함유하고 있는 PEG와 반응한다. 이소프로필리덴 기는 산성 조건하에서 제거된다. 그런 다음 PEG-갈락토스 화합물은 효소적 또는 화학적 방법에 의하여 상응하는 누클레오티드 당으로 전환될 수 있다.
개략도 5
Figure 112004060352093-pct00007
개략도 6으로 설명된 또 다른 예시적인 구체예에서, 보호된 갈락투론산 (Godage, Y. S. and Fairbanks, A. J., Tetrahedron Lett., 2000, 41(39), 7589-7594)은 아민 부분을 함유하고 있는 PEG와 반응한다. 이소프로필리덴 기는 산성 조건하에서 제거된다. 그런 다음 PEG-갈락토스 화합물은 효소적 또는 화학적 방법에 의하여 상응하는 누클레오티드 당으로 전환될 수 있다.
개략도 6
Figure 112004060352093-pct00008
일반적으로 상술된 것들과 같은 당 누클레오티드들은 효소적으로 천연 또는 돌연변이된 글리코실 트랜스페라제를 사용하여 적절한 당단백질, 예컨대 FVII 또는 FVII-관련 폴리펩티드로 전달되는데, 그러한 효소의 예를 들면 α2,3-시알릴 트랜스페라제, α2,6-시알릴 트랜스페라제 또는 β1,4-갈락토실 트랜스페라제가 있고, 그것들에 제한되는 것은 아니다. PEG-유도된 당 누클레오티드의 선택에 따라 (CMP-SA-PEG 또는 UDP-Gal-PEG), 바람직하게는 글리코실 트랜스페라제 및 PEG-유도된 당 누클레오티드와 반응 전에 FVII-관련 폴리펩티드를 시알리다제, 갈락토시다제 또는 둘 다로 처리할 수 있다.
그로써 바람직한 한 구체예에서 FVII 유사체는 시알리다제로 처리되어 아시알로 FVII 유사체가 생성되며, 그것은 계속해서 시알릴트랜스페라제 및 일반식 I에 따르는 CMP-SA-PEG로 처리되어 PEG-유도된 FVII 유사체가 생성된다.
다른 구체예에서 FVII-관련 폴리펩티드는 먼저 시알리다제로 처리되고, 두번째로 갈락토시다제로 처리되어 아시알로 아갈락토 FVII-관련 폴리펩티드가 생성된 다. 이 유사체는 그런 다음 갈락토실트랜스페라제와 일반식 II에 따르는 UDP-Gal-PEG 유사체로 처리되어 PEG-유도된 FVII 유사체가 생성된다.
일련의 구체예에서 직접 또는 링커 부분을 사용하여 중합체에 공유 부착되어 있는 변형된 갈락토스 화합물이 사용된다. 당업자는 폴리펩티드에 대하여 더 낮은 수준의 중합체를 얻기 위하여 또는 먼저 인자 VII 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드를 시알리다제로 처리하기 위하여, 펩티드 당 중합체의 더 높은 수준을 얻기 위하여 말단 시알산을 제거하기 위하여 직접 인자 VII 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 폴리펩티드를 갈락토시다제로 처리함으로써 변형된 갈락토스 화합물에 대한 부착점을 알 수 있게 된다. 변형된 갈락토스 화합물과 처리된 폴리펩티드 사이의 결합은 변형된 갈락토스 화합물의 UDP 활성화된 형태와 갈락토실트랜스페라제를 사용함으로써 형성될 수 있다. 이런 유형의 예시적인 구체예는 개략도 7에 예시되는데, 개략도에서 검은 점은 인자 VII 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드를 나타내며, 소수의 탄수화물의 말단 부분이 예시되어 있다.
개략도 7
Figure 112004060352093-pct00009
FVII 및 FVII 유사체의 화학적 유도
과요오드산 나트륨을 사용하여 탄수화물 잔기를 화학적으로 산화시키는 것은 FVII-PEG 포합체의 대체 제조 방법이다. 탄수화물의 화학적 산화는 일반적으로 다수의 반응성 알데히드기를 생성할 것이고, 각각의 반응기는 PEG-히드라지드, PEG-히드록실아민 및 PEG-아민과 같은 PEG-누클레오필과 반응할 수 있다.
PEG-히드라지드와 PEG-O-히드록실아민을 각각 사용하여 안정한 FVII-PEG-아실히드라존과 FVII-PEG-옥심 포합체가 제조될 수 있다. PEG-아민을 사용하면 덜 안정한 쉬프 (Shiff) 염기 포합체가 형성된다. 그러나 이 포합체는 추가로 나트륨 시아노보로하이드라이드를 사용한 환원에 의해 안정화될 수 있음으로써, 2차 아민 연쇄가 형성된다. FVII-PEG-아실히드라존 포합체는 또한 나트륨 시아노보로하이드라이드로 환원될 수 있고, 그로써 N,N'-결합 히드라진 포합체가 형성된다.
글리코-포합된 인자 VII 제제의 정제
본원에서 사용되는 "인자 VII 제제"는 그것들이 합성된 세포 또는 반응 매질로부터 분리된 다수의 인자 VII 폴리펩티드, 인자 VIIa 폴리펩티드, 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드와, 그것들의 변이체 및 화학적으로 변형된 형태를 말한다.
인자 VII 제제 및 포합체의 정제:
재조합으로 제조된 폴리펩티드를 그것들의 기원 세포로부터 분리하는 것은, 그것들에 제한되는 것은 아니지만 원하는 생성물을 함유하고 있는 세포 배양 배지로부터 고유의 세포 배양물의 제거; 비-고유 세포를 제거하기 위한 원심분리 또는 여과; 등을 포함한, 당해 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 방법에 의해서든지 이루어질 수 있다.
임의로 인자 VII 폴리펩티드는 추가로 정제될 수 있다. 정제는 그것들에 제한되는 것은 아니지만 친화성 크로마토그래피, 예컨대 항-인자 VII 항체 칼럼상에서의 친화성 크로마토그래피 (Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; 및 Thim et al., Biochem. 27:7785, 1988); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 이온 교환 크로마토그래피; 크기 축출 크로마토그래피; 전기영동 과정 (예컨대 예비 등전점 포커싱 (IEF), 차등 용해도 (예컨대 황산 암모늄 침전), 또는 추출 등을 포함한, 당해 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 일반적인 것은 문헌을 참고한다 (Scopes, Protein Purification, Springer- Verlag, New York, 1982; 및 Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishes, New York, 1989). 정제 후에 제제는 바람직하게는 약 10 중량 % 미만, 보다 바람직하게는 약 5 중량 % 미만, 가장 바람직하게는 약 1 중량 % 미만의 숙주 세포로부터 유도된 비-인자 VII 단백질을 함유한다.
인자 VII 및 인자 VII-관련 폴리펩티드는 인자 XIIa 또는 트립신-유사 특이성을 가지고 있는 다른 프로테아제, 예컨대 인자 IXa, 칼리크레인, 인자 Xa, 및 트롬빈을 사용한 단백질 가수분해적 절단에 의해 활성화될 수 있다 (Osterud et al., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, 미국 특허 제 4,456,591호; 및 Hedner et al., J. Clin. Invest. 71: 1836 (1983)). 또는 달리 인자 VII은 그것을 이온-교환 크로마토그래피 칼럼, 예컨대 Mono QR (Pharmacia) 등을 통하여 통과시킴으로써 활성화될 수 있다. 그 결과의 활성화된 인자 VII은 다음 단계로 하기에서 설명되는 바와 같이 제형되고 투여될 수 있다.
인자 VII 제제의 기능적 성질
중합체 분자가 공유 부착되어 있는 예정된 올리고당 패턴을 가지고 있는 인자 VII 및 인자 VII-관련 폴리펩티드의 본 발명에 따르는 제제는 대조 제제와 비교하여 개선된 기능적 성질을 나타낸다. 개선된 기능적 성질로는 제한 없이, a) 예컨대 저장 안정성과 같은 물리적 성질; b) 예컨대 생체내 활용성 및 반감기와 같은 약리역학적 성질; 및 c) 사람에서의 면역원성을 포함한다.
대조 제제란 그것과 비교될 본 발명의 제제에 함유된 것과 동일한 아미노산 서열을 가지고 있지만 본 발명의 제제에서 발견되는 어떠한 중합체 분자(들)에 포합되지 않은 폴리펩티드 (예컨대 야생형 인자 VII의 포합되지 않은 형태 또는 특정 한 변이체 또는 화학적으로 변형된 형태)를 포함하고 있는 제제를 말한다. 예를 들어 대조 제제는 전형적으로 포합되지 않은 야생형 인자 VII 또는 포합되지 않은 인자 VII-관련 폴리펩티드를 포함한다.
인자 VII 제제의 저장 안정성은 (a) 25 ℃에서 건조 분말로서 저장될 때 제제의 생체내 활성의 20 %가 자연 붕괴되는 데 필요한 시간 및/또는 (b) 제제에서 인자 VIIa 응집체의 비율을 2배로 하는 데 필요한 시간을 측정함으로써 평가될 수 있다.
어떤 구체예에서 본 발명의 제제는 대조 제제와 같이 25 ℃에서 건조 분말로서 저장될 때, 대조 제제에서 동일한 현상에 필요한 시간에 비교하여 생체내 활성의 20 %가 자연붕괴되는 데 필요한 시간을 최소한 약 30 %, 바람직하게는 최소한 약 60 %, 보다 바람직하게는 최소한 약 100 % 증가시키는 효과를 나타낸다. 응집체의 함량은 다음과 같이 Protein Pak 300 SW 칼럼 (7.5×300 mm)(Waters, 80013)상에서의 겔 투과 HPLC에 의해 측정된다. 칼럼은 용출액 A (0.2 M의 황산 암모늄, 5 %의 이소프로판올, 인산으로 2.5로 조정된 pH, 후에는 트리에틸아민으로 7로 조정된 pH)로 평형된 후, 25 ㎍의 샘플이 칼럼에 적용된다. 용출은 용출액 A를 사용하여 0.5 ml/분의 유속으로 30분 동안 수행한 후, 검출은 215 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 행한다. 응집체의 함량은 인자 VII 응집체의 피크 면적/인자 VII 피크의 총 면적 (단량체 및 응집체)으로서 계산된다.
"생체내 활용성"은 투여 후 예정된 시간에 혈장에서 검출될 수 있는 인자 VII 또는 인자 VII-관련 제제의 투여된 용량의 비율을 말한다. 전형적으로 생체내 활용성은 시험 동물에서 약 25 내지 250 ㎍/kg 용량의 제제를 투여하고; 투여 후 예정된 시간에 혈장 샘플을 얻고; 하나 또는 그 이상의 응고 분석 (또는 어떠한 생물학적 정량), 면역분석, 또는 동등한 기법을 사용하여 샘플중의 인자 VII 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드의 함량을 측정함으로써 측정된다. 데이터는 전형적으로 [인자 VII] 대 시간으로서 그래프로 표시되고, 생체내 활용성은 곡선 아래의 면적 (AUC)으로서 표시된다. 시험 제제의 상대적인 생체내 활용성은 시험 제제의 AUC와 대조 제제의 AUC 사이의 비율을 말한다.
어떤 구체예에서 본 발명의 제제는 대조 제제의 생체내 활용성의 최소한 약 110 %, 바람직하게는 최소한 약 120 %, 보다 바람직하게는 최소한 약 130 %, 가장 바람직하게는 최소한 약 140 %의 상대적인 생체내 활용성을 나타낸다. 생체내 활용성은 어떠한 포유류 종, 바람직하게는 개에서 측정될 수 있고, AUC를 계산하기 위하여 사용된 예정된 시간은 10 분에서 8 시간으로 상이한 일정량의 증가분을 포함할 수 있다.
"반감기"는 인자 VII 폴리펩티드 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드의 혈장 농도를 특정 값으로부터 그 값의 절반으로 감소시키는 데 필요한 시간을 말한다. 반감기는 생체내 활용성에 대한 것과 동일한 과정을 사용하여 측정될 수 있다. 어떤 구체예에서 본 발명의 제제는 대조 제제와 비교하여 최소한 약 0.25 시간, 바람직하게는 최소한 약 0.5 시간, 보다 바람직하게는 최소한 약 1 시간, 가장 바람직하게는 최소한 약 2 시간의 반감기 증가를 나타낸다.
제제의 "면역원성"은 사람에게 투여될 때, 해로운 면역 반응을, 그것이 체액 성이든 세포성이든, 또는 두 가지 모두이든 유도하는 제제의 능력을 말한다. 인자 VIIa 폴리펩티드 및 인자 VIIa-관련 폴리펩티드는 사람에서 검출가능한 면역 반응을 유도하는 것으로는 알려져 있지 않다. 그럼에도 불구하고 어떠한 사람 하위-집단에서는 투여된 특정 단백질에 대하여 민감성을 나타내는 개체가 존재할 수 있다. 면역원성은 당해 기술분야에 공지되어 있는 종래의 방법을 사용하여 민감한 개체에서 항-인자 VII 항체 및/또는 인자 VII-반응성 T-세포의 존재를 정량함으로써 측정될 수 있다. 어떤 구체예에서 본 발명의 제제는 민감한 개체에서 대조 제제의 그 개체에 대한 면역원성과 비교하여 최소한 약 10 %, 바람직하게는 최소한 약 25 %, 보다 바람직하게는 최소한 약 40 %, 가장 바람직하게는 최소한 약 50 % 감소된 면역원성을 나타낸다.
약제학적 조성물
본 발명의 제제는 어떠한 인자 VII-반응성 증후군, 예를 들면 출혈 장애, 예컨대 제한 없이, 응고 인자 결핍으로 발생되는 장애 (예를 들면 혈우병 A 및 B 또는 응고 인자 XI 또는 VII의 결핍증); 혈소판 감소증 또는 폰 빌레브란트 병에 의해 발생되는 장애, 또는 응고 인자 억제제에 의해 발생되는 장애, 또는 어떠한 원인으로든 과잉 출혈되는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 제제는 또한 수술 또는 다른 외상과 관련되어 있는 환자에게 또는 항응고 치료를 받고 있는 환자에게 투여될 수 있다.
야생형 인자 VII과 비교하여 실질적으로 감소된 생체내 활성을 가지고 있는 본 발명에 따르는 인자 VII-관련 폴리펩티드를 포함하고 있는 제제는 항응고제로 서, 예컨대 재협착증에서와 같이 혈전증 또는 혈관 폐색의 위험이 증가될 수 있는 혈관형성술 또는 다른 수술 과정이 진행되고 있는 환자에서 사용될 수 있다. 항응고제가 처방되는 다른 의학적 징후로는 그것들에 제한되지는 않으나, 깊은 정맥 혈전증, 폐 색전증, 발작, 확산된 혈관내 응고 (DIC), 그람-네가티브 내독소혈증과 관련된 폐 및 신장의 피브린 침착, 심근 경색; 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 전신성 염증 반응 증후군 (SIRS), 용혈성 요독 증후군 (HUS), MOF 및 TTP가 있다.
본 발명에 따르는 인자 VII 및 인자 VII-관련 제제를 포함하고 있는 약제학적 조성물은 기본적으로 예방학적 및/또는 치료적 처리를 위해 비경구 투여용인 것으로 의도된다. 바람직하게는 약제학적 조성물은 비경구로, 즉 정맥내로, 피하로, 또는 근육내로 투여된다. 조성물은 연속적으로 또는 박동에 따른 주입에 의해 투여될 수 있다.
약제학적 조성물은 본 발명에 따르는 제제를 바람직하게는 약제학적으로 허용될 수 있는 담체, 바람직하게는 수성 담체 또는 희석제에 용해된 상태로 그것들과 조합하여 포함한다. 다양한 수성 담체, 예컨대 물, 완충수, 0.4 % 식염수, 0.3 % 글리신 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 제제는 또한 손상 부위로의 전달 또는 손상 부위의 표적화를 위해 리포솜 제제로 제형될 수 있다. 리포솜 제제는 일반적으로 미국 특허 제 4,837,028호, 4,501,728호 및 4,975,282호에서 설명된다. 조성물은 종래의 잘 알려져 있는 멸균 기법에 의해 멸균될 수 있다. 그 결과의 수용액은 사용을 위해 포장되거나 무균 조건하에서 여과되고 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 멸균 수용액과 조합된 후 투여된다.
조성물은 약제학적으로 허용될 수 있는 보조제 물질 또는 보조약, 예를 들면 제한 없이, pH 조정 및 완충제 및/또는 등장성 조정제, 예컨대 아세트산 나트륨, 락트산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘 등을 함유할 수 있다.
이들 제형에서 인자 VII 또는 인자 VII-관련 폴리펩티드의 농도는 광범위하게, 즉 약 0.5 중량 % 미만으로부터, 통상 1 중량 %에서 또는 최소한 약 1 중량 %에서 많게는 15 또는 20 중량 %까지 다양할 수 있고, 기본적으로는 선택된 특정 투여 방식에 따라 유체 부피, 점도 등에 의해 선택될 것이다.
그러므로 정맥내 주입에 대해 전형적인 약제학적 조성물은 250 ml의 멸균 링거액 및 10 mg의 제제를 함유하도록 구성될 수 있다. 비경구로 투여될 수 있는 조성물을 제조하는 실제적인 방법은 당업자에게 알려져 있거나 분명하며 문헌에 보다 상세하게 설명되어 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)).
본 발명의 제제를 함유하고 있는 조성물은 예방 및/또는 치료적 처리를 위해 투여될 수 있다. 치료적 적용시에 조성물은 이미 상술된 바와 같은 질병으로 고생하고 있는 개체에게, 그 질병 및 그것의 합병증을 치료하고, 완화시키거나 또는 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 이것을 이루기에 적당한 양은 "치료적으로 유효량"으로서 규정된다. 각 목적에 대해 효과적인 양은 질병 또는 손상의 심각도 뿐 아니라 개체의 중량 및 일반적인 상태에 따라 좌우된다. 그러나 일반적으로 유효량은 70 kg의 개체에 대해 1일 당 약 0.05 mg 내지 약 500 mg의 범위일 것이며, 통상 1일 당 약 1.0 mg 내지 약 200 mg의 제제로 이루어진 1회 용량이 사용된다. 적절한 용량의 투여는 기본적인 실험을 사용하여, 가치있는 매트릭스를 구성하고 그 매트릭스에서 상이한 점을 시험함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 제제의 국소적 전달, 예를 들면 국소 적용은 예컨대 분무, 관류, 이중 풍선 카테테르, 스텐트, 혈관 이식편 또는 스텐트 안으로의 통합, 풍선 카테테르를 코팅하기 위해 사용된 하이드로겔, 또는 잘 정립된 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 어떠한 경우든지 약제학적 조성물은 개체를 효과적으로 치료하기에 충분한 양의 제제를 제공해야 한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 추가로 다른 생체 활성 제제, 예컨대 비-인자 VII-관련 응고제 또는 항응고제를 포함할 수 있다.
지속성 방출 제제
지속성 방출 제제의 실예로는 폴리펩티드 또는 포합체를 함유하고 있는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스, 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 적절한 형태를 가지고 있는 매트릭스가 있다. 지속성 방출 매트릭스의 실예로는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예컨대 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드, L-글루탐산과 에틸-L-글루탐산염의 공중합체, 비-분해성 에틸렌비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 ProLeaseR technology 또는 Lupron DepotR (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프로라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 있다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 정도 또는 그 이상의 긴 기 간 동안 분자의 방출을 가능하게 하는 한편, 특정 하이드로겔은 더 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 폴리펩티드가 신체에 장시간 보유될 때, 그 폴리펩티드는 37 ℃에서 습기에 대한 노출의 결과로서 변성되거나 응집될 수 있으며, 그 결과 생물학적 활성이 손실되고 면역원성에 변화가 일어날 가능성이 있다. 포함된 메카니즘에 따라 안정화를 위한 타당한 전략이 고안될 수 있다. 예를 들면, 만약 응집 메타니즘이 티오-술파이드 상호교환을 통하여 분자간 S-S 결합이 형성되는 것으로 발견되면, 술프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 습기 함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특이한 중합체 조성물을 개발함으로써 안정화가 이루어질 수 있다.
다음의 비-제한적인 실시예는 본 발명의 특정 측면을 예시한다.
실시예 1
시알산 함량이 높은 생성물의 글리코페길화
폴리에틸렌 글리콜-CMP-시알산 (PEG-CMPSA)을 분자량이 10,000 Da인 PEG를 시알산에 공유 부착시킴으로써 제조한다.
시알산 함량이 87 내지 99 %인 인자 VIIa를 시알리다제로, 예컨대 미국 특허 제 5,272,066호에 설명된 바와 같이 처리하고, 공여 분자로서 PEG-CMPSA를 사용하여 시알릴트랜스페라제로 다시 시알릴화한다 (예컨대 미국 특허 제 6,399,336호에서 설명된 바와 같이). 페길화 후에 반응은 최대 통합에 도달하고, CMPSA를 반응 혼합물에 첨가하여 노출된 모든 말단 갈락토스를 캡핑한다.
페길화된 시알산의 통합은 SDS-PAGE, CE-PAGE, 등전점 포커싱 겔, 및 CE-IEF에 의해 분석한다.
94 내지 100 %의 시알산이 통합되었고; 평균 1 내지 4 개의 PEG 기가 통합되었다.
실시예 2
시알산 함량이 중간 정도인 생성물의 글리코페길화
폴리에틸렌 글리콜-CMP-시알산 (PEG-CMPSA)을 분자량이 10,000 Da인 PEG를 시알산에 공유 부착시킴으로써 제조한다.
시알산 함량이 87 내지 93 %인 인자 VIIa를, 공여 분자로서 PEG-CMPSA를 사용하여 시알릴트랜스페라제로 처리한다 (예컨대 미국 특허 제 6,399,336호에서 설명된 바와 같이). 페길화 후에 반응은 최대 통합에 도달하고, CMPSA를 반응 혼합물에 첨가하여 노출된 모든 말단 갈락토스를 캡핑한다.
페길화된 시알산의 통합은 SDS-PAGE, CE-PAGE, 등전점 포커싱 겔, 및 CE-IEF에 의해 분석한다.
87 내지 100 %의 시알산이 통합되었고; 평균 0.1 내지 0.5 개의 PEG 기가 통합되었다.
실시예 3
페길화된 시티딘 5'-모노포스포-시알산 유도체 (CMP-SA-PEG):N-아세틸-O 2-메틸-9-아미노-9-데옥시-뉴라민산 메틸 에스테르 (10 mg, 0.031 mmol, Isecke, R.; Brossmer, R., Tetrahedron 1994,50(25), 7445-7460에 따라 제조됨)를 물 (2 ml)에 녹이고, mPEG-SBA (170 mg, 0.03 mmol, 5 kDa, Shearwater 2M450H01)를 첨가한다. 그 혼합물을 주변 온도에서 TLC에 따라 완료될 때까지 교반한다. 용매를 동결건조에 의해 제거하고 잔류물을 메탄올과 0.1 M NaOH 용액 (5 ml)의 1:1 혼합물에 다시 녹인다. 그 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반한 후, 4 ℃에서 Dowex 50W-X8 (H+) 수지의 칼럼을 통하여 통과시키고 동결건조시킨다. 그런 다음 잔류물을 물 (5 ml)에 다시 녹이고, Dowex 50W-X8 (H+) 수지를 첨가한 후 혼합물을 TLC에 의해 완료될 때까지 교반한다.
일반식 I의 시알산 유도체의 시티딘 5'-모노포스포 유사체는 일반적으로 다음 방식으로 설명되는 바와 같이 문헌에 따라 제조된다 (E. S. Simon, M. D. Bednarski and G. M. Whitesides, J. Am. Chem. Soc., 1998, 110, 7159-7163): 시티딘 5'-모노포스포뉴라민산 합성효소를 9-페길화된 N-아세틸-9-아미노-9-데옥시-뉴라민산 용액 (상술된 바와 같이 제조함)에 녹이고, 그것을 CTP 용액에 첨가한다. 그 혼합물을 pH 8.5로 조정하고, MgCl2.6H2O를 첨가한다. 반응물을 실온에서 교반하고, 1N NaOH를 페리스탈틱 (peristaltic) 펌프를 경유하여 첨가하여 pH를 8.5 근처로 유지한다. 일정 분취액에 대한 1H-NMR이 완료를 나타낼 때, 생성물을 표준 이온-교환 크로마토그래피에 의해 분리한다.
실시예 4
0.1 M 아세트산 나트륨 pH 5.5 용액 1 ml에 녹인 FVIIa (1 mg)를 실온에서 30분 동안 10 mM의 과요오드산 나트륨을 사용하여 그것의 글리칸 수준으로 산화시킨다. 그런 다음 용액을 100 mM 아세트산 나트륨 pH 5.5에 대해 투석한다. 투석 후에 PEG-C(O)-NHNH2 (mPEG-SBA (2 mg, 5 kDa, Shearwater 2M450H01)의 히드라진 분해에 의해 제조함)를 산화된 FVIIa와 혼합하고, 밤새 실온에서 반응되도록 부드럽게 진동시키면서 방치한다. 그로써 얻어진 FVIIa-PEG 포합체 용액을 100 mM의 트리스-HCl 완충액, pH 7.5에 대해 투석 (10 kDa 컷-오프의 투석 멤브레인)하고, 4 ℃에서 보관한다.
약리학적 방법
다음의 분석들은 인자 VII 및 인자 VII-관련 폴리펩티드의 생물학적 활성, 반감기 및 생체내 활용성을 측정하는 데 유용하다.
분석 (I)
시험관내 가수분해 분석
다음의 방법은 인자 VIIa의 생체내 활성을 분석하는 데 사용될 수 있다. 분석은 미소적정 플레이트 (MaxiSorp, Nunc, Denmark)에서 수행된다. 발색성 기질인 D-Ile-Pro-Arg-p-니트로아닐리드 (S-2288, Chromogenix, Sweden)를 최종 농도 1 mM로, 0.1 M의 NaCl, 5 mM의 CaCl2 및 1 mg/ml의 우혈청 알부민이 함유되어 있는 50 mM Hepes, pH 7.4 중의 인자 VIIa (최종 농도 100 nM)에 첨가한다. 405 nm 에서의 흡광도를 SpectraMaxTM 340 플레이트 판독기 (Molecular Devices, USA)에서 연속해 서 측정한다. 효소를 함유하지 않은 비어있는 웰에서의 흡광도를 뺀 후에 20분 인큐베이션하는 동안 전개된 흡광도를 사용하여 시험 및 대조 인자 VIIa 사이의 비율을 계산한다.
분석 (II)
시험관내 단백질 가수분해 분석
다음의 방법은 인자 VIIa의 생체내 활성을 분석하는 데 사용될 수 있다. 분석은 미소적정 플레이트 (MaxiSorp, Nunc, Denmark)에서 수행된다. 0.1 M의 NaCl, 5 mM의 CaCl2 및 1 mg/ml의 우혈청 알부민이 함유되어 있는 100 ㎕의 50 mM Hepes, pH 7.4 중의 인자 VIIa (10 nM) 및 인자 X (0.8 μM)를 15분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 인자 X의 절단을 0.1 M의 NaCl, 20 mM의 EDTA 및 1 mg/ml의 우혈청 알부민이 함유되어 있는 50 ㎕의 50 mM Hepes, pH 7.4 를 첨가함으로써 중지시킨다. 생성된 인자 Xa의 양을 발색성 기질인 Z-D-Arg-Gly-Arg-p-니트로아닐리드 (S-2765, Chromogenix, Sweden)를 최종 농도 1 mM로 첨가함으로써 측정한다. 405 nm 에서의 흡광도를 SpectraMaxTM 340 플레이트 판독기 (Molecular Devices, USA)에서 연속해서 측정한다. FVIIa를 함유하지 않은 비어있는 웰에서의 흡광도를 뺀 후에 10분 동안 전개된 흡광도를 사용하여 시험 및 대조 인자 VIIa의 단백질 가수분해적 활성 사이의 비율을 계산한다.
분석 (III)
기능적인 생체내 반감기의 측정
기능적인 생체내 반감기의 측정은 문헌에서 설명되는 것과 같은 많은 방법으로 수행될 수 있다. rFVIIa 및 그것의 변이체의 생체내 반감기의 측정을 위한 분석의 실예는 FDA 참조 제 96-0597호에서 설명된다. 간단히 설명하면 FVIIa 응고 활성은 포합체, 폴리펩티드 또는 조성물을 투여하기 전, 투여하는 동안 및 투여후 24 시간 후에 혈장에서 측정된다. 안정적인 상태에서의 분포의 평균의 외관상 부피가 측정되고 평균적인 제거가 측정된다.
분석 (IV)
인자 VII 폴리펩티드의 생체내 활용성
생체내 활용성을 예를 들면 다음과 같이 개 모델에서 측정할 수 있다: 네 그룹으로 나눈 12 마리의 비글 개에서 4 다리의 교차 연구로서 실험을 수행하였다. 모든 동물에게 시험 제제 A와 대조 제제 B를, 염화 나트륨 (2.92 mg/ml), 염화 칼슘 2수화물 (1.47 mg/ml), 만니톨 (30 mg/ml) 및 폴리소르베이트 80을 함유하고 있는 글리실글리신 완충액 (pH 5.5)중의 약 90 ㎍/kg의 용량으로 주었다. 초기 투여 후 10, 30, 및 60분 시점과 2, 3, 4, 6 및 8 시간 째에 혈액 샘플을 취하였다. 혈장은 샘플로부터 얻고 인자 VII을 ELISA에 의해 정량한다.
각 샘플의 생체내 활용성을 인자 VII에 대한 혈장 농도 곡선 아래의 용량-조정된 면적 (AUC/용량)으로서 표시한다. 상대적인 생체내 활용성은 시험 및 대조 제제의 평균 AUC/용량×100 사이의 비율로서 표시하고, 상대적인 생체내 활용성의 90 % 신뢰도 한계를 계산한다.
본 발명에 의하면 개선된 약리 작용을 나타내는, 하나 이상의 중합체 기에 공유 결합된 하나 이상의 올리고당 기를 함유하는 글리코형태 패턴을 가지고 있는 인자 VII 및 인자 VII-관련 폴리펩티드를 함유하고 있는 약제학적 제제를 이용함으로써 심근 경색 또는 혈전증 발작의 위험이 있는 응고성이 매우 높은 상태에 있는 환자, 예컨대 패혈증 환자의 치료 등에 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk Health Care AG <120> PEGYLATED FACTOR VII GLYCOFORMS <130> 6527.204-WO <140> PCT/DK2003/000420 <141> 2003-06-20 <150> PA 2002 00964 <151> 2002-06-21 <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 406 <212> PRT <213> Human coagulation Factor VII <220> <223> Xaa means 4-carboxyglutamic acid (gamma-carboxyglutamate) <400> 1 Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

Claims (38)

  1. 인자VIIa 폴리펩티드를 포함하고 있는 제제로서,
    상기 폴리펩티드는 아스파라긴-결합 및/또는 세린-결합 올리고당 사슬을 포함하고, 하나 이상의 올리고당기 내의 시알산 부분이 하나 이상의 중합체기인 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 공유 부착되어 있는 것을 특징으로 하는,
    혈우병 A, 혈우병 B, 인자 XI 결핍증, 인자 VII 결핍증, 혈소판 감소증, 폰 빌레브란트 병, 출혈, 외상, 두개골내 출혈, 간세포 이식, 상부 위장 출혈, 깊은 정맥 혈전증, 폐 색전증, 발작, 확산된 혈관내 응고(DIC), 그람-네가티브 내독소혈증, 심근 경색, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 전신성 염증 반응 증후군(SIRS), 용혈성 요독 증후군(HUS), 다발성 기관 발작(MOF), 및 트롬빈성 혈소판 감소성 자반병(TTP)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환 또는 증상의 치료, 예방 또는 경감용 제제.
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  9. 제 1 항에 있어서, 아스파라긴-결합 올리고당 사슬이 야생형 사람 인자VIIa 의 아미노산 잔기 Asn-145(도 1a)와 Asn-322(도 1b)에 상응하는 위치에 위치하고 있는 것을 특징으로 하는 제제.
  10. 제 1 항에 있어서, 세린-결합 올리고당 사슬이 야생형 사람 인자VIIa의 아미노산 잔기 Ser-52(도 1a)와 Ser-60(도 1a)에 상응하는 위치에 위치하고 있는 것을 특징으로 하는 제제.
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  13. 제 1 항, 제 9 항 또는 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 분자량이 300 내지 100,000 Da인 것을 특징으로 하는 제제.
  14. 제 1 항, 제 9 항 또는 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 야생형 사람 인자VIIa (도 1a 및 1b)의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 제제.
  15. 제 1 항, 제 9 항 또는 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 혈장-유래의 사람 인자VIIa인 것을 특징으로 하는 제제.
  16. 제 1 항, 제 9 항 또는 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제제:
    서열번호 1에 있어서의 S52A-인자VIIa, S60A-인자VIIa, 잔기 290과 291 사이에서 단백질 가수분해적으로 절단된 인자VIIa; 잔기 315와 316 사이에서 단백질 가수분해적으로 절단된 인자VIIa; L305V-인자VIIa, L305V/M306D/D309S-인자VIIa, L305I-인자VIIa, L305T-인자VIIa, F374P-인자VIIa, V158T/M298Q-인자VIIa, V158D/E296V/M298Q-인자VIIa, K337A-인자VIIa, M298Q-인자VIIa, V158D/M298Q-인자VIIa, L305V/K337A-인자VIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V-인자VIIa, V158D/E296V/M298Q/K337A-인자VIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-인자VIIa, K157A-인자VIIa, E296V-인자VIIa, E296V/M298Q-인자VIIa, V158D/E296V-인자VIIa, V158D/M298K-인자VIIa, 및 S336G-인자VIIa.
  17. 제 1 항, 제 9 항 또는 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제제:
    서열번호 1에 있어서의 L305V/K337A-인자VIIa, L305V/V158D-인자VIIa, L305V/E296V-인자VIIa, L305V/M298Q-인자VIIa, L305V/V158T-인자VIIa, L305V/K337A/V158T-인자VIIa, L305V/K337A/M298Q-인자VIIa, L305V/K337A/E296V-인자VIIa, L305V/K337A/V158D-인자VIIa, L305V/V158D/M298Q-인자VIIa, L305V/V158D/E296V-인자VIIa, L305V/V158T/M298Q-인자VIIa, L305V/V158T/E296V-인자VIIa, L305V/E296V/M298Q-인자VIIa, L305V/V158D/E296V/M298Q-인자VIIa, L305V/V158T/E296V/M298Q-인자VIIa, L305V/V158T/K337A/M298Q-인자VIIa, L305V/V158T/E296V/K337A-인자VIIa, L305V/V158D/K337A/M298Q-인자VIIa, L305V/V158D/E296V/K337A-인자VIIa, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-인자VIIa, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-인자VIIa, S314E/K316H-인자VIIa, S314E/K316Q-인자VIIa, S314E/L305V-인자VIIa, S314E/K337A-인자VIIa, S314E/V158D-인자VIIa, S314E/E296V-인자VIIa, S314E/M298Q-인자VIIa, S314E/V158T-인자VIIa, K316H/L305V-인자VIIa, K316H/K337A-인자VIIa, K316H/V158D-인자VIIa, K316H/E296V-인자VIIa, K316H/M298Q-인자VIIa, K316H/V158T-인자VIIa, K316Q/L305V-인자VIIa, K316Q/K337A-인자VIIa, K316Q/V158D-인자VIIa, K316Q/E296V-인자VIIa, K316Q/M298Q-인자VIIa, K316Q/V158T-인자VIIa, S314E/L305V/K337A-인자VIIa, S314E/L305V/V158D-인자VIIa, S314E/L305V/E296V-인자VIIa, S314E/L305V/M298Q-인자VIIa, S314E/L305V/V158T-인자VIIa, S314E/L305V/K337A/V158T-인자VIIa, S314E/L305V/K337A/M298Q-인자VIIa, S314E/L305V/K337A/E296V-인자VIIa, S314E/L305V/K337A/V158D-인자VIIa, S314E/L305V/V158D/M298Q-인자VIIa, S314E/L305V/V158D/E296V-인자VIIa, S314E/L305V/V158T/M298Q-인자VIIa, S314E/L305V/V158T/E296V-인자VIIa, S314E/L305V/E296V/M298Q-인자VIIa, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-인자VIIa, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-인자VIIa, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-인자VIIa, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-인자VIIa, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-인자VIIa, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-인자VIIa, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-인자VIIa, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-인자VIIa, K316H/L305V/K337A-인자VIIa, K316H/L305V/V158D-인자VIIa, K316H/L305V/E296V-인자VIIa, K316H/L305V/M298Q-인자VIIa, K316H/L305V/V158T-인자VIIa, K316H/L305V/K337A/V158T-인자VIIa, K316H/L305V/K337A/M298Q-인자VIIa, K316H/L305V/K337A/E296V-인자VIIa, K316H/L305V/K337A/Vl58D-인자VIIa, K316H/L305V/V158D/M298Q-인자VIIa, K316H/L305V/V158D/E296V-인자VIIa, K316H/L305V/V158T/M298Q-인자VIIa, K316H/L305V/V158T/E296V-인자VIIa, K316H/L305V/E296V/M298Q-인자VIIa, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-인자VIIa, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-인자VIIa, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-인자VIIa, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-인자VIIa, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-인자VIIa, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-인자VIIa, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-인자VIIa, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-인자VIIa, K316Q/L305V/K337A-인자VIIa, K316Q/L305V/V158D-인자VIIa, K316Q/L305V/E296V-인자VIIa, K316Q/L305V/M298Q-인자VIIa, K316Q/L305V/V158T-인자VIIa, K316Q/L305V/K337A/V158T-인자VIIa, K316Q/L305V/K337A/M298Q-인자VIIa, K316Q/L305V/K337A/E296V-인자VIIa, K316Q/L305V/K337A/V158D-인자VIIa, K316Q/L305V/V158D/M298Q-인자VIIa, K316Q/L305V/V158D/E296V-인자VIIa, K316Q/L305V/V158T/M298Q-인자VIIa, K316Q/L305V/V158T/E296V-인자VIIa, K316Q/L305V/E296V/M298Q-인자VIIa, K316Q/L305V/V 158D/E296V/M298Q-인자VIIa, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-인자VIIa, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-인자VIIa, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-인자VIIa, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-인자VIIa, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-인자VIIa, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-인자VIIa, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-인자VIIa, F374Y/K337A-인자VIIa, F374Y/V158D-인자VIIa, F374Y/E296V-인자VIIa, F374Y/M298Q-인자VIIa, F374Y/V158T-인자VIIa, F374Y/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V-인자VIIa, F374Y/L305V/K337A-인자VIIa, F374Y/L305V/V158D-인자VIIa, F374Y/L305V/E296V-인자VIIa, F374Y/L305V/M298Q-인자VIIa, F374Y/L305V/V158T-인자VIIa, F374Y/L305V/S314E-인자VIIa, F374Y/K337A/S314E-인자VIIa, F374Y/K337A/V158T-인자VIIa, F374Y/K337A/M298Q-인자VIIa, F374Y/K337A/E296V-인자VIIa, F374Y/K337A/V158D-인자VIIa, F374Y/V158D/S314E-인자VIIa, F374Y/V158D/M298Q-인자VIIa, F374Y/V158D/E296V-인자VIIa, F374Y/V158T/S314E-인자VIIa, F374Y/V158T/M298Q-인자VIIa, F374Y/V158T/E296V-인자VIIa, F374Y/E296V/S314E-인자VIIa, F374Y/5314E/M298Q-인자VIIa, F374Y/E296V/M298Q-인자VIIa, F374Y/L305V/K337A/V158D-인자VIIa, F374Y/L305V/K337A/E296V-인자VIIa, F374Y/L305V/K337A/M298Q-인자VIIa, F374Y/L305V/K337A/V158T-인자VIIa, F374Y/L305V/K337A/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/V158D/E296V-인자VIIa, F374Y/L305V/V158D/M298Q-인자VIIa, F374Y/L305V/V158D/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/E296V/M298Q-인자VIIa, F374Y/L305V/E296V/V158T-인자VIIa, F374Y/L305V/E296V/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/M298Q/V158T-인자VIIa, F374Y/L305V/M298Q/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/V158T/S314E-인자VIIa, F374Y/K337A/S314E/V158T-인자VIIa, F374Y/K337A/S314E/M298Q-인자VIIa, F374Y/K337A/S314E/E296V-인자VIIa, F374Y/K337A/S314E/V158D-인자VIIa, F374Y/K337A/V158T/M298Q-인자VIIa, F374Y/K337A/V158T/E296V-인자VIIa, F374Y/K337A/M298Q/E296V-인자VIIa, F374Y/K337A/M298Q/V158D-인자VIIa, F374Y/K337A/E296V/V158D-인자VIIa, F374Y/V158D/S314E/M298Q-인자VIIa, F374Y/V158D/S314E/E296V-인자VIIa, F374Y/V158D/M298Q/E296V-인자VIIa, F374Y/V1 58T/S314E/E296V-인자VIIa, F374Y/V158T/S314E/M298Q-인자VIIa, F374Y/V158T/M298Q/E296V-인자VIIa, F374Y/E296V/S314E/M298Q-인자VIIa, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-인자VIIa, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-인자VIIa, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-인자VIIa, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-인자VIIa, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-인자VIIa, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-인자VIIa, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/V1158D/E296V/M298Q-인자VIIa, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-인자VIIa, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-인자VIIa, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-인자VIIa, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-인자VIIa, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-인자VIIa, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-인자VIIa, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-인자VIIa, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-인자VIIa, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-인자VIIa, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-인자VIIa, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-인자VIIa, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-인자VIIa, F374Y/L305V/E296V/K337A/V1 58T/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-인자VIIa, F374Y/L305V/V1 58D/E296V/K337A/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-인자VIIa, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-인자VIIa, S52A-인자 VII, S60A-인자 VII; 및 P11Q/K33E-인자VIIa, T106N-인자VIIa, K143N/N145T-인자VIIa, V253N-인자VIIa, R290N/A292T-인자VIIa, G291N-인자VIIa, R315N/V317T-인자VIIa, K143N/N145T/R315N/V137T-인자VIIa.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 제 1 항, 제 9 항, 또는 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 중합체 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함하지 않는 대조 제제의 생체내 활용성의 최소한 110%를 나타내는 것을 특징으로 하는 제제.
  22. 제 1 항, 제 9 항, 또는 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 중합체 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함하지 않는 대조 제제 반감기의 최소한 125%의 혈청 반감기를 나타내는 것을 특징으로 하는 제제.
  23. 제 1 항, 제 9 항, 또는 제 10 항 중 어느 한 항의 제제를 제조하는 방법으로서,
    상기 방법이 폴리펩티드를 중합체 PEG 분자와, 하나 이상의 중합체 PEG 분자가 폴리펩티드의 하나 이상의 올리고당 사슬 내의 시알산 부분에 공유적으로 부착되는 조건 하에서, 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항, 제 9 항, 또는 제 10 항 중 어느 한 항의 제제와 약제학적으로 허용될 수 있는 담체 또는 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    혈우병 A, 혈우병 B, 인자 XI 결핍증, 인자 VII 결핍증, 혈소판 감소증, 폰 빌레브란트 병, 출혈, 외상, 두개골내 출혈, 간세포 이식, 상부 위장 출혈, 깊은 정맥 혈전증, 폐 색전증, 발작, 확산된 혈관내 응고(DIC), 그람-네가티브 내독소혈증, 심근 경색, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 전신성 염증 반응 증후군(SIRS), 용혈성 요독 증후군(HUS), 다발성 기관 발작(MOF), 및 트롬빈성 혈소판 감소성 자반병(TTP)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환 또는 증상의 치료, 예방 또는 경감용 약학적 제제.
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