CN101535339B

CN101535339B - 改性糖蛋白

Info

Publication number: CN101535339B
Application number: CN200780040932.7A
Authority: CN
Inventors: C·贝伦斯
Original assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Current assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Priority date: 2006-09-01
Filing date: 2007-09-03
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2027-09-03
Also published as: CN101535339A

Abstract

提供通过化学修饰方法缀合糖蛋白的方法，并提供新的改性糖蛋白。

Description

改性糖蛋白

发明领域

本发明涉及改进药物的制备，尤其是制备具有改善的药效学和药动学性质的改性糖蛋白。

发明背景

由于生物源蛋白通常对其天然配体具有高效力和高选择性，因此它们极有希望成为治疗药物。由于生物体已经拥有非常明确的代谢途径和清除机理可使用，生物源的本质提高了生物源蛋白无毒的可能性，从而比常规的小分子药物使用更加安全。将其与实际相结合，目前蛋白可以在许多不同的表达体系中使用重组DNA技术来制备，实现了大规模的制备，致使蛋白成为理想候选药物。然而，令人感兴趣的治疗蛋白如激素、可溶受体、细胞因子、酶等常常在体内循环半衰期较短，通常减弱了它们的治疗效用。

治疗蛋白通过许多途径从循环中被清除。对一些有药理活性的蛋白而言，存在介导其从循环中被除去的特定受体。糖基化蛋白可以被肝脏中的凝集素样受体清除，该受体仅对这些分子中的糖基部分具有特异性。已经证明蛋白和肽(特别是非糖基化的蛋白和肽)经肾脏的非特异性清除低于约50kDa。人们已经注意到无唾液酸糖蛋白比天然糖蛋白或无糖基化的蛋白在肾脏中清除更快(Bocci(1990)Advanced DrugDelivery Reviews 4：149)。在治疗蛋白与自体蛋白不完全相同的情况下，它们也可以通过免疫系统从循环中被清除，即使是氨基酸序列或三维结构的细小差别可导致治疗蛋白的免疫原性。由治疗蛋白引起的免疫反应除了使其加速从循环中被清除之外，还会有其他不同的副作用：接近治疗蛋白上结合位点的空间位阻使抗体可能干扰或阻碍治疗效果，人工抗体可与自体蛋白交叉反应，从而产生自身免疫反应等。人们对改性治疗蛋白感兴趣还在于使它们以特定细胞、组织或器官为目标。蛋白与对特定细胞中存在的分子具有高度亲和力的配体蛋白缀合或融合是达到该效果的已知方式之一。

因此，普遍需要提供制备改性(治疗)蛋白的方法，该蛋白具有延长的血清半衰期和/或降低的免疫原性和/或改善的药理性质。

发明概述

本发明提供可溶糖蛋白衍生物循环半衰期的延长，从而降低治疗或预防时维持循环糖蛋白治疗有效水平所需注射药物的剂量和注射频率。由于治疗或预防中可能需要的可溶蛋白的频率和数量，一些治疗活性的糖蛋白较短的血浆半衰期是不合乎要求的。本发明通过有效改变糖蛋白的结构和基本上维持生物活性来延长所述糖蛋白的循环半衰期。

本发明提供了合适的方法制备糖蛋白衍生物，在所述糖蛋白的糖基基团上引入聚合部分的肟基，所述改性糖蛋白相对于初始糖蛋白具有改善的药理性质。

因此，本发明涉及一种制备具有如下通式改性糖蛋白的方法：

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)

接头

其中M和任选的M’独立地为增加改性糖蛋白分子量的聚合部分，其中L和L’独立地代表二价接头(linker)，其中P代表糖蛋白，所述糖蛋白包含糖蛋白的一个或多个被氧化葡聚糖末端，O、N、C和H分别代表氧、氮、碳和氢原子，n为1-10，m为0-50，该方法包括以下步骤：

a)用高碘酸或高碘酸盐(periodate)离子氧化至少一个存在糖蛋白P^*上的聚糖末端，其中P^*代表多个糖型，以获得含有一个或多个醛基团的糖蛋白P-(CHO)_n+m，和

b)将P-(CHO)_n+m与M-L-O-NH₂反应以得到具有(M-L-O-N＝CH))_n-P-(CHO)_m结构的改性糖蛋白，和

c)任选地将具有结构(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CHO)_m的糖蛋白中任何没有反应的醛基团与M’-L’-O-NH₂反应，以得到具有结构(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m的改性糖蛋白，其中相对于糖蛋白上存在的未还原聚糖末端的数量，所述高碘酸或高碘酸盐离子以小于50当量的量存在，并且其中所述改性糖蛋白相对于起始糖蛋白P^*具有改善的药理性质并保持其功能活性。

可以理解的是，P-(CHO)_n+m中的醛基团可短暂的以它/它们的成对二醇形式或半缩醛形式存在。

还可以理解为P-和-P-是含有一个或多个氧化葡聚糖末端的糖蛋白，其中化学键与所述一个或多个葡聚糖末端相连。

本发明进一步涉及可通过本发明方法获得的改性糖蛋白。

因此，本发明进一步涉及具有以下通式的改性糖蛋白

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)

接头其中M和任选的M’独立地为增加改性糖蛋白分子量的聚合部分，其中L和L’独立地代表二价接头，其中P代表糖蛋白，所述糖蛋白包含糖蛋白的一个或多个被氧化葡聚糖末端，O、N、C和H分别代表氧、氮、碳和氢原子，n为1-10，m为0-50，其中所述改性糖蛋白相对于起始糖蛋白P^*具有改善的药理性质并保持其功能活性。

本发明还涉及包括多种具有以下通式的改性糖蛋白的制剂(preparation)

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)

发明详述

“多种改性糖蛋白”可以理解为制剂中可能不具有完全相同的化学结构的各种改性糖蛋白，各糖蛋白分子之间可能会有相当大的不同。起始糖蛋白P^*通常以不同糖型存在。“糖型”指通过转译后或翻译改性，相同蛋白与不同多糖相连接的蛋白质异形体。也有一些制剂的分子没有完全被改性，一些分子被改性一个以上的多聚体部分，然后在各个糖蛋白的不同聚糖末端再被改性。P^*因此被认为是多个蛋白P糖型。

术语“非还原聚糖末端”或“未还原聚糖末端”指低聚糖的端点或末端没有被例如费林溶液或Tollens试剂还原，与低聚糖的还原端不同，它们被这些试剂氧化。在糖蛋白中，低聚糖通常由其还原端通过糖苷或葡糖胺键与蛋白相连。该低聚糖的非还原末端包括例如但不限于N-和O-聚糖类复合物上的末端唾液酸残基；杂合N-聚糖上的末端唾液酸残基；高-甘露糖N-聚糖上的末端甘露糖残基；N-和O-聚糖复合物上的末端半乳糖残基；杂合N-聚糖的末端半乳糖残基；N-和O-聚糖复合物上的末端N-乙酰半乳糖残基；杂合N-聚糖上的末端N-乙酰半乳糖残基；全部或部分外露的三甘露糖核心残基上的末端甘露糖残基；末端海藻糖残基，包括核心海藻糖残基；末端葡萄糖和木糖残基。

如果优选特定聚糖基团末端与高碘酸或高碘酸盐反应，起始糖蛋白P^*可任选的被唾液酸酶、半乳糖苷酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、甘露糖苷酶或海藻糖苷酶修饰。可选择的，聚糖基团可以被例如用唾液酸转移酶、半乳糖转移酶、N-乙酰葡糖胺糖转移酶、甘露糖转移酶和各自的糖供体如CMP-Sia；UDP-Gal；GDP-Fu等改造。

使用高碘酸或高碘酸盐氧化糖蛋白的聚糖末端被充分证明，并且被用作制备蛋白缀合物的一般方法。公开号为WO 06/071801的国际专利申请描述了血管假性血友病因子聚糖末端的氧化，及其用于制备蛋白PEG化型。公开号为WO 00/23114的国际专利申请描述了制备干扰素-β-1a PEG化型的方法学，公开号为WO 92/16555的国际专利申请描述了将PEG基团与蛋白缀合的多种方法，其中涉及用高碘酸或高碘酸盐形成聚糖末端醛基团官能团。

除了裂解糖基的二醇，高碘酸或高碘酸盐同样已知用于氧化例如蛋氨酸(metheonine)的氨基酸侧链，裂解含有氨基醇基团例如丝氨酸和苏氨酸的N-端氨基酸。在某些情况中，蛋氨酸侧链的氧化会导致蛋白质生物学外形的改变，尤其是生物活性的改变。如Kornfelt，T；Persson，E.and Palm，L.；Archives of Biochemistry and Biophysics Vol.363，No.1pp.43-54(1999)所述，重组体凝结FVII因子(如FVIIa)的活性形式被证明对蛋氨酸氧化具有高度敏感性。用过氧化氢氧化蛋氨酸298和306后，FVIIa与可溶组织因子(TF)的结合被减弱，显示为解离常数增加三倍。与可溶TF形成复合物的蛋氨酸氧化FVIIa的酰氨分解活性也只有天然FVIIa-TF复合物的80％。

并不令人意外，与这些观察结果一致，我们发现当使用如这些文章中通常描述的使用高碘酸或高碘酸盐介导的缀合反应时，通过它裂解已知肽底物的能力判断，可以观察到FVIIa的肽分解活性明显的以及某些情况下完全的减弱。因此，当用于对氧化作用具有高度敏感性的糖蛋白时，高碘酸或高碘酸盐介导的共轭例如PEG基团的已知方法使用非常受限。本发明描述了解决该问题的通用方法，因此首次公开了能够制备保持功能活性的肟缀合糖蛋白的方法。

当使用低浓度，以当量的方式-高碘酸或高碘酸盐相对于糖蛋白中存在的非还原聚糖末端数量以接近于化学当量的量，可以保持生物活性。令人意外的，用化学当量的高碘酸或高碘酸盐离子，然后在可接受的时间内进行缀合化学作用，能够得到高纯度的生物功能蛋白缀合物，并具有中等至上等的收率。

本发明的一个实施方式涉及一种制备改性糖蛋白的方法，其中所述糖蛋白是N-糖基化的和/或O-糖基化的和/或含有唾液酸残基。

本发明进一步的实施方式涉及一种制备改性糖蛋白的方法，该方法包括进一步确认该改性糖蛋白相对于初始糖蛋白具有改善的药理性质的步骤。

在一个实施方式中改善的药理性质选自提高的生物利用度、延长的功能体内半衰期、延长的体内血浆半衰期、降低的免疫原性、提高的蛋白酶抗性、提高的白蛋白亲和力、改善的受体亲和力、提高的储存稳定性、缩短的功能体内半衰期、缩短的体内血浆半衰期。

在一个实施方式中，延长的半衰期通过M和/或M’作为增加分子量的基团降低或消除肾清除和/或通过M和/或M’作为掩蔽肝脏受体的结合配偶体的基团获得。

在一个实施方式中，降低的免疫原性通过M和/或M’作为阻断抗体与致免疫位点结合的基团获得。

在一个实施方式中，改善白蛋白亲和力通过M和/或M’作为与白蛋白具有高度亲和力的基团获得。

在一个实施方式中，改善受体亲和力通过M和/或M’作为与靶细胞表面受体特异性结合的基团获得。

进一步在一个实施方式中本发明涉及一种制备具有以下通式的改性糖蛋白的方法

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)，

其中M和/或M’选自：低分子量有机带电荷基团，其可含有一个或多个羧酸、胺、磺酸、膦酸或其组合；低分子量中性亲水分子，例如环糊精或任选支化的聚乙烯链；低分子量的亲脂分子，如脂肪酸或胆酸或其衍生物；平均分子量为2-40kDa的聚乙二醇；定义明确的精确聚合物，如确切分子量范围为700Da至20kDa的树枝状大分子(dendrimer)；基本上非免疫原性的多肽，如白蛋白，抗体或任选含有Fc-结构域的抗体的一部分；和高分子量有机聚合物。

本发明进一步的实施方式涉及制备具有以下通式改性糖蛋白的方法

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)，

其中M和/或M’选自树枝状大分子，树枝状大分子，聚氧化烯(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，支化PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-共聚-马来酸酐、聚苯乙烯-共聚-马来酸酐、葡聚糖、羧甲基葡聚糖。

在进一步的实施方式中，M和/或M’选自羟烷基淀粉(HAS)和羟乙基淀粉(HES)，例如Clin Pharmacokinet 2005；44(7)：681-699中描述的化合物，以及WO 2006094810A2中公开的化合物；HES合适的活化形式公开在WO 2005092369A2中，将其引入作为参考。

在进一步的实施方式中，M和/或M’是聚(1-羟基甲基乙烯羟基甲基甲醛)(PHF)或类似的降解葡聚糖，例如WO 2006094810A2所描述的化合物，将其引入作为参考，其中还公开了聚合物的合适活化形式。

在进一步的实施方式中，M和/或M’选自两性离子聚合物，例如WO 03062290A1所描述的，引入作为参考。在具体实施方式中，该聚合物是2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基磷酸铵内盐(MPC)。

在进一步实施方式中，本发明涉及一种制备具有如下通式改性糖蛋白的方法

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)，

其中M和/或M’选自血清蛋白结合配体和含有在生理条件下改变电荷性质的部分的有机小分子，抑制聚糖与受体结合的结构，和阻止聚糖特异性识别的中性取代基。

在进一步的实施方式中，本发明涉及一种制备具有如下通式改性糖蛋白的方法

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)，

变体其中P选自FVII、FVIII、FIX、FX、FII、FV、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子、FXI、FXII、FXIII及其序列变体；免疫球蛋白，细胞因子如白介素，α-、β-和γ-干扰素，集落刺激因子，包括粒性白细胞集落刺激因子，成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、磷脂酶激活蛋白(PUP)、胰岛素、植物蛋白如凝集素和蓖麻毒蛋白、肿瘤坏死因子和相关等位基因、溶解形式的肿瘤坏死因子受体，白介素受体和溶解形式的白介素受体，生长因子例如组织生长因子，如TGFa′s或TGFps和表皮生长因子，激素、生长调节素、促红细胞生成素、色素激素、下丘脑释放因子、抗利尿素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、促卵胞激素、促甲状腺激素、组织纤溶酶原激活物，和免疫球蛋白如IgG、IgE、IgM、IgA和IgD及其片段，或含有任何前述蛋白或其片段的任何融合蛋白。

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)，

其中糖蛋白是VII因子多肽。

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)，

其中糖蛋白含有野生型人VII因子的氨基酸序列。

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)，

其中糖蛋白是VIII因子多肽。

本文使用的“VIII因子”和“FVIII多肽”包括VIII：C，FVIII的B-结构域删除形式、氨基酸变体及其组合。

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)，

其中改性糖蛋白在一个或多个如本发明说明书所述的凝集测定、蛋白酶解作用测试或TF结合测试中表现出的特异活性是未改性VII因子多肽的特异活性的至少约10％，如至少约20％、如至少约40％、如至少约60％、如至少约80％、如至少约100％。

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)，

其中改性糖蛋白表现出的生物利用度为未改性糖蛋白生物利用度的至少约110％，如至少约120％、约130％或为未改性糖蛋白生物利用度的至少约140％。

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)，

其中改性糖蛋白表现出的血清半衰期为未改性糖蛋血清半衰期的至少约125％，如约150％、约200％或为未改性糖蛋血清半衰期的至少约250％。

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)，

其中相对于糖蛋白上存在的未还原聚糖末端的数量，高碘酸或高碘酸盐离子以少于20当量的量，例如少于10当量，例如少于5当量，例如少于1当量的量存在，例如，相对于糖蛋白上存在的未还原聚糖末端的数量，以0.1-20当量，例如0.1-10当量，例如0.1-5当量，例如0.1-1当量的量存在。

因此，在一个实施方式中，高碘酸或高碘酸盐离子的量为相对于糖蛋白上存在的未还原聚糖末端的数量的10-20当量。在另一个实施方式中，高碘酸或高碘酸盐离子的量为相对于糖蛋白上存在的未还原聚糖末端的数量的5-10当量。在另一个实施方式中，高碘酸或高碘酸盐离子的量为相对于糖蛋白上存在的未还原聚糖末端的数量的2-5当量。在另一个实施方式中，高碘酸或高碘酸盐离子的量与糖蛋白上存在的未还原聚糖末端的数量基本相等。在另一个实施方式中，高碘酸或高碘酸盐离子的量为相对于糖蛋白上存在的未还原聚糖末端的数量的0.1-0.9当量。

在另一个实施方式中，相对于糖蛋白上存在的未还原聚糖末端的数量，使用低于化学计量量的高碘酸或高碘酸盐。在本申请说明书和权利要求中，术语“多肽”是指包含肽键合氨基酸残基的线性链形分子。因此，术语环状肽(2-10氨基酸残基)、低聚肽(11-100氨基酸残基)和纯多肽(具有超过100氨基酸残基)。多肽因而是具有生物活性但是也可以没有任何功能的结构单元。本文的“蛋白”指有功能或无功能分子或除单体之外，含有至少一个多肽的复合物，该术语也包括多聚体分子，如同或异多聚体。蛋白可包括辅基，也可包括不同的糖基化和酯化结构。“糖蛋白”指某些被糖基化的蛋白。在本发明的某些实施方式中，糖蛋白是N-糖基化和/或O-糖基化蛋白和/或用唾液酸基团改性的。

在另一个实施方式中，制备改性糖基化分子的方法包括进一步确认改性糖蛋白相对于糖基化起始分子具有改进药理性质的步骤。

典型的，改善的药理性质选自提高的生物利用度、延长的功能体内半衰期、延长的体内血浆半衰期、降低的免疫原性、提高的蛋白酶抗性、提高的白蛋白亲和力、改善的受体亲和力、提高的储存稳定性。

术语“功能体内半衰期”指其通常含义，即，改性糖蛋白或相关分子在体内或靶器官保持50％生物活性的时间，或改性糖蛋白或相关分子的活性降至峰值的50％的时间。作为测定功能体内半衰期的其他选择，可测定“体内血浆半衰期”，即50％的改性糖蛋白或相关分子在被清除前在血液或血浆中循环的时间。测定血浆半衰期通常比测定功能体内半衰期简单，血浆半衰期的量值通常很好的代表了功能体内半衰期的量值。血浆半衰期的替代术语包括血清半衰期、流通半衰期、循环半衰期、血清清除率、血浆清除率和清除半衰期。保持的功能性通常选自促凝血的、蛋白酶解的、辅助因子结合、受体结合活性，或与特定蛋白相关的其他类型的生物活性。

术语“提高的”用于指示功能体内半衰期或血浆半衰期，改性糖蛋白的相关半衰期相对于其相关分子，例如其他相同但是没有使用本发明的方法处理的糖蛋白在统计学上显著的增长。因此，半衰期在对照条件下测定。例如相关半衰期可以延长至少约25％，例如至少约50％，如至少约100％、150％、200％、250％或500％。在一些实施方式中，本发明的改性糖蛋白半衰期相对于未改性糖蛋白的半衰期延长至少约0.25小时，优选至少约0.5小时，更优选至少约1小时，和最优选约2小时。

可采用文献中描述的多种方法测量体内生物半衰期。测试改性FVIIa(凝结因子VIIa)来检测rFVIIa和其变体体内半衰期的例子如FDA参考号96-0597中所述。简而言之，在血浆中施用改性糖蛋白之前或之后24小时内测定FVIIa的凝固能力。在稳定状态下测量表观分布容积的中值并测定半数清除率。

“生物利用度”指施用后预定时间血浆中可检测的糖结合物施用剂量的比例。典型的，生物利用度通过给测试动物施用约25-250μg/kg剂量的制剂来检测；在施用后预定时间取血浆样品；使用合适的生物检测或免疫检测或相当的检测方法测定样品中的糖蛋白浓度。数据通常用图解显示为[糖蛋白]v.时间，生物利用度表示为曲线下面积(AUC)。测试制剂的相对生物利用度是指测试制剂和未改性糖蛋白的AUC比率。

在某些实施方式中，本发明的制剂的相对生物利用度为相应的未改性糖蛋白生物利用的至少约110％，优选至少约120％，更优选至少约130％以及最优选至少约140％。生物利用度可以用任何哺乳动物测定，优选狗，用于计算AUC的预定时间可以包含不同增量由10分钟-8小时。生物利用度可以例如在狗模型中按以下方法检测：该试验将12只小猎犬分为四组进行四腿交换试验。所有的动物被施用剂量为约90μg/kg的测试制剂A和相关的制剂B，该制剂包含于合适的缓冲溶液中，如含有氯化钠(2.92mg/ml)、二水合氯化钙(1.47mg/ml)、甘露醇(30mg/ml)和吐温80的甘氨酰肽甘氨酸缓冲液(pH5.5)。在施用制剂后10、30和60分钟以及2、3、4、6和8小时后取血。由样品获取血浆，通过ELISA定量糖蛋白。

术语制剂的“免疫原性”指制剂给人施用后引发有害免疫反应的能力，无论是体液的、细胞的或两者兼有的。在任何人亚种群中，可能存在对特定施用蛋白敏感的个体。免疫原性可通过使用现有技术常规手段定量敏感个体中存在的抗糖蛋白抗体和/或糖蛋白敏感的T-细胞来检测。在某些实施方式中，本发明改性糖蛋白在敏感个体中的免疫原性相对于未改性糖蛋白的个体的免疫原性降低至少约10％，优选至少约25％，更优选至少约40％，最优选至少约50％。

药物的免疫原性也指蛋白质性质的药物可能在非敏感的受试者产生免疫性的现象，意味着重复施用药物导致连续的升高对药物的免疫反应。这是最不期望的情况，因为免疫反应会干扰药物的活性，这就是为何需要逐渐增加药物的剂量以达到治疗效果。在某些实施方式中本发明的改性蛋白在非敏感个体中的免疫原性相对于未改性糖蛋白的个体的免疫原性降低至少约10％，优选至少约25％，更优选至少约40％，最优选至少约50％。

术语“蛋白酶抗性”指糖蛋白被化学改性后致使所述化合物对血浆肽酶或蛋白酶耐药的糖蛋白。血浆蛋白酶已知参与了许多肽类激素的降解，还参与了大蛋白的降解。

糖蛋白对通过例如二肽氨基肽酶IV(DPPIV)降解的抗性可通过如下降解测试检测：部分糖蛋白(5nmol)在37℃与相应的酶活力为5mU的1μL纯化二肽氨基肽酶IV在100μL 0.1M三乙胺-HCl缓冲液中孵化10-180分钟。酶反应通过加入5μL 10％三氟乙酸终止，分离肽降解产物，用HPLC检测定量。按照Siegel等人.，Regul.Pept.1999；79：93-102和Mentlein等人.Eur.J.Biochem.1993；214：829-35，该检测的操作方法之一：将混合物注入Vydac C18广孔(30nm孔，5μm颗粒)250×4.6mm柱，用含0.1％三氟乙酸的乙腈以流速1ml/分钟线性阶式梯度洗脱(三分钟0％乙腈，17分钟0-24％乙腈，1分钟24-48％乙腈)。肽及其降解产物可通过其220nm(肽键)或280nm(芳香族氨基酸)的吸收来监测，通过积分其峰面积与标准对照来定量。在低于10％的肽被水解的孵化时间估测二肽氨基肽酶IV对肽的水解率。

哺乳动物循环血液中含量最高的蛋白组分是血清白蛋白，其浓度通常为每100毫升全血约3至4.5克。血清白蛋白是约70,000道尔顿的血液蛋白，它在循环系统中发挥多种重要的功能。例如，它可以作为血液中发现的各种有机分子的运载体，作为各种代谢物如脂肪酸和胆红素通过血液的主要运载体，并且由于其含量丰富，可作为循环血液渗透性的调节剂。血清白蛋白的半衰期长于一周，延长肽血浆半衰期的方法之一是用与血清白蛋白结合的化学个体衍生肽。术语“白蛋白结合剂”是指已知与血浆蛋白如白蛋白结合的化学实体。白蛋白结合的性质可根据J.Med.Chem，43，2000，1986-1992所描述的检测，将其引入作为参考。白蛋白结合基团可包括脂肪酸衍生物，有机肽磺噻唑多环芳烃，例如促皮质素，以及含有少于40个氨基酸残基的肽，例如J.Biol Chem.277，38(2002)35035-35043中描述的基团，将其引入作为参考。

根据本发明方法制备的改性糖蛋白相对于未改性的糖蛋白具有改进的功能性质。改进的功能性质可包括而不限于a)物理性质，例如改进的储存稳定性；b)改进的药动学性质，例如增加的生物利用度和半衰期；c)降低的人体免疫原性。

糖蛋白的储存稳定性可通过测定以下数据检测(a)以干燥粉末形式储存于25℃时生物利用度降低20％所需时间；(b)加倍制剂预定降解产物如凝聚物比率所需要的时间。

在某些实施方式中，当含有糖蛋白的制剂以干燥粉末形式储存于25℃时，本发明改性糖蛋白生物利用度降低20％需要的时间相对于未改性糖蛋白需要的时间延长至少约30％，优选至少约60％，更优选至少约100％。

生物利用度的测定方法可以根据特定蛋白相关的生物活性类型来操作，例如，凝血因子的生物活性可用任何凝集测定、凝集测定、TF-结合测定或TF-不依赖的凝血酶生成测定来检测。

在某些实施方式中，当制剂均以干燥粉末形式储存于25℃时，本发明的制剂加倍预定降解产物，如凝聚物所需的时间相对于对比制剂延长至少约30％，优选至少约60％，更优选至少约100％。凝聚物浓度可以例如通过凝胶渗透HPLC或其他已知的色谱方法测定。对于凝血因子，凝聚物可以用凝胶渗透HPLC以Protein Pak 300 SW柱(7.5×300mm)(水，80013)按以下方法测定。用洗脱剂A(0.2M硫酸铵，5％异丙醇，用磷酸调节pH2.5，然后用三乙胺调节pH7.0)平衡柱，然后将25μg样品上柱。洗脱以洗脱液A在流速0.5ml/分钟的条件下洗脱30分钟，然后通过在215nm测量吸光度完成检测。凝聚物的浓度按凝血因子凝聚物峰面积/总凝血因子峰面积(单体和凝聚物)计算。

二价接头L和L’：

L和L’代表二价化学接头，其可以相同或不同

在一个实施方式中L和L’独立地为键或

取代基M和M’

以下将讨论取代基M和/或M’。

在本发明的一个实施方式中，通过M和/或M’作为增加分子量的基团以降低或消除肾清除率和/或M和/或M’作为掩蔽肝受体结合位点的基团延长半衰期。在可选择的实施方式中，通过M和/或M’作为阻断抗体与致免疫的位点结合基团降低免疫原性。在另一个实施方式中，通过M和/或M’作为对白蛋白具有高亲和力的基团改进对白蛋白的亲和力。并且在另一个实施方式中，通过M和/或M’作为与靶细胞表面受体特异性结合的基团改进对受体的亲和力。取代基M和/或M’可以是功能改进基团，如“分度器基团”(protractor group)。在此指与蛋白或肽紧密结合以延长所述蛋白或肽相对于未糖蛋白的循环半衰期的基团。分度器效应的特殊原理可能是由增加的体积导致的，掩盖了可以被肽酶或抗体识别的肽序列，或掩蔽了聚糖从而使它们不能被存在于例如肝或巨噬细胞的聚糖特异性受体识别，阻止或降低了清除。分度器基团的分度器效应也可以例如由结合至血液组分如白蛋白导致，或由特异性或非特异性吸附至血管组织导致。结合糖蛋白基本上保持了非改性糖蛋白的生物活性。

其他的可能性包括M和/或M’是使改性糖蛋白靶向特定类型的细胞或组织的基团，例如与如果糖蛋白能够在非常高的局部浓度下发挥其效应有关。进一步的可能性包括M和/或M’拥有其有效成分，如放射性核素或毒性物质-这样在未改性糖蛋白对恶性组织具有亲和力的情况下将是适宜的，因而作为改性分子的靶向基团。

在本发明的一个实施方式中M和/或M’选自

-低分子量有机带电荷基团(15-1000Da)，含有一个或多个羧酸、胺、磺酸、磷酸或其组合。

-低分子量(15-1000Da)中性亲水分子，例如环糊精或任选分枝的聚乙烯链；

-低分子量(15-1000Da)亲脂分子，如脂肪酸、胆酸或其衍生物；

-平均分子量为2-40kDa的聚乙二醇；

-定义明确的精确聚合物，如具有确切分子量范围为700Da至20kDa或更优选700-10,000Da的树枝状大分子；

-基本上非免疫原性的多肽，如白蛋白，抗体或任选含有Fc-结构域的抗体的一部分；和

-高分子量有机聚合物如葡聚糖。

在本发明的实施方式中多聚分子选自树枝状大分子(如分子量范围为700-10,000Da或国际专利申请WO 2005014049所公开的树枝状大分子)、聚氧化烯(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、支化PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-共聚-马来酸酐、聚苯乙烯-共聚-马来酸酐和葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖、HES、PHF或MPC。在本发明的一个实施方式中，多聚体分子是PEG基团。在本发明的一个实施方式中，多聚体分子是树枝状大分子。

在本发明的一个实施方式中，M和/或M’是分度器基团(protactorgroup)，选自血清蛋白结合配体，如血清蛋白结合配体，例如与白蛋白结合的分子，如脂肪酸，C5-C24脂肪酸，脂肪二酸(如C5-C24)，抑制聚糖与受体(如唾液酸糖蛋白受体和甘露糖受体)结合的结构(如唾液酸衍生物或其模拟物)，含有在生理条件下改变电荷性质的部分的有机小分子，例如羧酸或胺或中性取代基，能够阻止聚糖特异性识别，例如低级烷基取代基(如C1-C5烷基)、低分子量有机带电荷基团(如C1-C25)，其含有一个或多个羧酸、胺、磺酸、磷酸或其混合物；低分子量(如C1-C25)中性亲水分子，例如环糊精或任选分枝的聚乙烯链；平均分子量为2-40kDa的聚乙二醇；定义明确的聚合物，如确切分子量范围为700Da至20kDa或更优选700-10,000Da的树枝状大分子；和基本上非免疫原性的多肽，如白蛋白，抗体或任选含有Fc-结构域的抗体的一部分。

在一个实施方式中M和/或M’独立地选自：

其中Q代表10-20，10-30，10-40，20-30，20-40，30-40的整数，例如10、20或30。

在一个实施方式中，M-L-ONH₂和/或M’L’-ONH₂是：

在一个实施方式中，M-L-ONH₂和/或M’L’-ONH₂独立地选自：

M和/或M’可以是选自以下组之一的有机基团：

-直链、支链和/或环状C_1-30烷基、C_2-30烯基、C_2-30炔基、C_1-30杂烷基、C_2-30杂烯基、C_2-30杂炔基，其中可插入一个或多个同素环状芳族化合物双基或杂环化合物双基，其中所述的C_1-30或C_2-30基团可任选地被一个或多个以下基团取代：-CO₂H、-SO₃H、-PO₂OH、-SO₂NH₂、-NH₂、-OH、-SH、卤素或芳基，其中所述芳基任选地被以下基团取代：-CO₂H、-SO₃H、-PO₂OH、-SO₂NH₂、-NH₂、-OH、-SH或卤素；甾类基团；脂类基团；

-聚糖类基团，如葡聚糖，α-、β-或γ-环糊精，聚酰胺类基团，如聚氨基酸；PVP；聚(1-3-二氧杂环己烷)；聚(1，3，6-三氧杂环已烷)；乙烯/马来酸聚合物；

-汽巴(Cibacron)染料，如Cibacron Blue 3GA和特定链长的聚酰胺，如WO00/12587中所述，将其引入作为参考；

-基本上非免疫原性的蛋白残基，例如血液组分如白蛋白衍生物，或抗体或其区域例如Fc-结构域为人正常IgG1，如Kan，SK等人等人在The Journal of Immunology 2001，166(2)，1320-1326中或在Stevenson，GT，The Journal of Immunology 1997，158，2242-2250中所述；

-聚乙二醇(PEG)或甲氧基聚乙二醇(mPEG)基团和其氨基衍生物，其中平均分子量可为500-100,000Da，如500-60,000Da，如1000-40,000Da，如500-40,000Da；

-已知与血浆蛋白如白蛋白结合的基团，其中白蛋白结合性质可根据J.Med.Chem，43，2000，1986-1992中所描述的方法测定，将其引入作为参考，或白蛋白结合基团，例如含有少于40个氨基酸残基的肽，如J.Biol Chem.277，38(2002)35035-35043中所述的基团，将其引入作为参考。

在其他实施方式中，M和/或M’是C₁-C₂₀烷基，如C₁-C₁₈烷基。具体指C₁₄-、C₁₆-和C₁₈-烷基，可任选的被特殊带电荷基团、极性基团和/或卤素取代。所述取代基的例子包括-CO₂H、四唑基和卤素。在具体实施方式中，C₁-C₂₀烷基的所有氢被氟取代形成全氟烷基。

在具体实施方式中M’不同于M。在具体实施方式中M’具有比M基本上较低的分子量。在一个具体实施方式中，M’是甲氧基胺(MeONH₂)。

起始分子P ^*

以下将讨论取代基P^*。

糖蛋白P^*含有聚糖末端，对高碘酸的氧化作用具有反应活性。

因此，P^*上的反应基团是糖基的一部分，或衍生自糖基基团，如糖基化糖蛋白的N-或O-聚糖。可选择的，糖蛋白P^*的反应基团可以是唾液酸残基。

在一个实施方式中P^*选自FVII、FVIII、FIX，、FX、FII、FV、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子、FXI、FXII、FXIII及其序列变体；免疫球蛋白、细胞因子如白介素、α-、β-、γ-干扰素，集落刺激因子包括粒性白细胞集落刺激因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、磷脂酶激活蛋白(PUP)。P^*也可以是其他具有一般生物和治疗重要性的蛋白和肽，包括胰岛素、植物蛋白如外源凝集素、蓖麻毒蛋白、肿瘤坏死因子和相关等位基因，溶解形式的肿瘤坏死因子受体、白介素受体和溶解形式的白介素受体，生长因子例如组织生长因子，如TGFa′s或TGFps和表皮生长因子，激素、生长调节素、促红细胞生成素、色素激素、下丘脑释放因子、抗利尿素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、促卵胞激素、促甲状腺激素、组织纤溶酶原激活物和免疫球蛋白如IgG、IgE，IgM，、IgA、IgD和其片段。

不含聚糖末端的肽和蛋白可以如Li Shao等人l.Glycobiology 12(11)762-770(2002)中所述，用糖基转移酶进行酶糖基化，或例如用标准肽化学和糖基化氨基酸组分如N-半乳糖苷化天冬酰胺进行化学合成糖基化。

可选择的糖基化位点可以设计于在体内正常以非糖基化形式存在的蛋白或肽。例如用UDP-葡萄糖和葡萄糖基转移酶在EGF重复插入共有序列Cys-XXX-Ser-XXX-Pro-Cys选择性O-糖基化丝氨酸(Li Shao等人l.Glycobiology 12(11)762-770(2002))，而插入共有序列Asn-XXX-Ser/Thr进行N-糖基化(R.A.Dwek，Chem.Rev.1996，96，683-720)。含有苏氨酸或丝氨酸的肽序列也可在UDP-GalNAc：多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶和UDP-GalNAc的存在下以序列依赖方式糖基化(参见例如B.C.O’Connell，F.K.Hagen and L.A.Tabak in J.Biol.Chem.267(35)，25010-25018(1992))。可选择的，定向诱变引入孕尿翳突变可用于通过混合二硫化物的形成引入半乳糖或含有糖结构的半乳糖，如D.P.Gamblin等在Angew.Chem.Int.Ed.，43，828(2004)中所述。含有肽和蛋白的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺也可通过结合至含有非生物手段的方法制备，如P.G.Schultz in J.Am.Chem.Soc，125，1702(2003)所述，或者非特定地用糖基供体底物如三氯乙酸半乳糖苷等直接糖基化肽。加入糖苷酶抑制剂发酵培养，从而生成具有截短聚糖结构的糖苷酶，如US 4925796A/US 5272066A1，也是获得含有肽或蛋白的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺的可能方法，还可以用TGase酶修饰谷胺酰胺残基(参加例如M.Sato等人.Angew.Chem.Int.Ed.43，1516-1520，(2004))。

制备专性基因N-糖基化蛋白不限于使用哺乳动物宿主细胞如CHO或BHK细胞，还可以使用昆虫细胞、酵母或用细菌细胞，如M.Wacker等人.在Science，298，1790-1793(2002)中所述。在本发明的一个实施方式中肽是抑肽酶、组织因子通道抑制剂或其他酶抑制剂，胰岛素或胰岛素前体，人或牛生长激素，白介素，高血糖素，胃泌酸调节素，GLP-1，GLP-2，IGF-I，IGF-II，组织纤溶酶原激活物，转化生长因子γ或β，血小板衍生的生长因子，GRF(生长激素释放因子)，人生长因子，免疫球蛋白，EPO，TPA，蛋白C，凝血因子如FVII、FVIII、FIX、FX、FII、FV，蛋白C，S蛋白，PAI-1，组织因子，FXI，FXII和FXIII，exendin-3，exentidin-4和酶或其功能类似物。在本文中，术语“功能类似物”指与天然蛋白具有相似功能的蛋白。该蛋白可能与天然蛋白结构相似，也可能是通过加入一个或多个氨基酸至天然蛋白的C末端或末N端之一或全部，在一个或多个天然氨基酸序列的不同位点取代一个或多个氨基酸，在天然蛋白的末端或氨基酸序列的一个或多个位点之一或全部缺失一个或多个氨基酸，或在天然氨基酸序列的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸从天然蛋白衍生。进一步，蛋白可以在一个或多个位置被乙酰化，参见例如WO 98/08871，其中公开了乙酰化GLP-1和其类似物。GLP-1乙酰化衍生物的例子是Lys26(Nε-十四烷酰)-GLP-1(7-37)，其中GLP-1(7-37)中位置26的Lys残基的伊普西隆氨基基团被十四烷酰化。

蛋白或其部分可以用本技术领域普通技术人员已知的技术制备或分离，如组织培养，动物源提取或通过重组DNA方法。蛋白、肽、氨基酸等遗传转移源也可考虑使用。这些材料获得自转基因动物，如老鼠、猪、牛等，其中蛋白由奶、血或组织表达。转基因昆虫和杆状病毒表达系统也可考虑用作源。此外，蛋白的突变体，例如TNF的突变体和/或干扰素突变体也在本发明范围内。其他感兴趣的蛋白是豕草、抗原E、蜜蜂毒液、螨变应原等等。

前面描述的生物活性肽适于与依照本发明的分度器基团结合。可以理解的是没有明确提到的但是具有合适肽的生物活性材料也是预期的，在本发明的范围内。

在一个实施方式中，糖蛋白是FVII多肽。在一个实施方式中，多肽是野生型VIIa因子。

在此使用的术语“VII因子多肽”或“FVII多肽”指含有野生型人FVII因子的氨基酸序列1-406的任何蛋白(如含有U.S.专利号4,784,950公开的氨基酸序列的多肽)，及其变体。

术语“VII因子”指包含以未裂解(酶原)形式存在的VII因子多肽，以及那些经蛋白酶解过程生成的相应生物活性形式，可特指VIIa因子。具体的，VII因子裂解残基152和153之间生成VIIa因子。VII因子的这些变体相对于人VII因子具有不同的性质，包括稳定性、磷脂结合、改变的特异性活性等等。

在此所用的“野生型人VIIa因子”是具有U.S.专利No.4,784,950公开的氨基酸序列的多肽。

VII因子变体非限制的例子包括S52A-FVIIa，S60A-FVIIa(Lino等人.，Arch.Biochem.Biophys.352：182-192，1998)；FVIIa变体显示提高的蛋白酶解稳定性，如U.S.专利号5,580,560所公开；FVIIa变体蛋白酶解裂解残基290和291之间或残基315和316之间(Mollerup等人.，Biotechnol.Bioeng.48：501-505，1995)；VIIa因子的氧化形式(Kornfelt等人.，Arch.Biochem.Biophys.363：43-54，1999)；如PCT/DK02/00189所公开的FVII变体(与WO 02/077218相应)；以及FVII变体显示增加的蛋白酶解稳定性，如WO 02/38162所公开(ScrippsResearch Institute)；FVII变体具有改性Gla-区域并具有增强的膜结合，如WO 99/20767，US专利US 6017882和US 6747003，US专利申请20030100506(University of Minnesota)和WO 00/66753，US专利申请US 20010018414，US 2004220106和US 200131005，US专利US6762286和US 6693075(University of Minnesota)所公开的；和FVII变体如WO 01/58935，US专利US 6806063，US专利申请20030096338(Maxygen ApS)，WO 03/93465(Maxygen ApS)，WO 04/029091(MaxygenApS)，WO 04/083361(Maxygen ApS)和WO 04/111242(Maxygen ApS)以及WO 04/108763(Canadian Blood Services)所公开。

相对于野生型FVIIa具有增强生物活性的FVII变体的非限制性例子包括如WO 01/83725，WO 02/22776，WO 02/077218，PCT/DK02/00635(相应于WO 03/027147)，丹麦专利申请PA 200201423(相应于WO 04/029090)，丹麦专利申请PA 200101627(相应于WO 03/027147)；WO 02/38162(Scripps Research Institute)所公开的FVII变体；以及如JP 2001061479所公开(Chemo-Sero-TherapeuticRes Inst.)的具有增强活性的FVIIa变体。

VII因子的变体的例子包括但不限于

L305V-FVII，

L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，

V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，

V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，

V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII，and S336G-FVII，L305V/K337A-FVII，L305V/V158D-FVII，L305V/E296V-FVII，L305V/M298Q-FVII，L305V/V158T-FVII，L305V/K337A/V158T-FVII，

L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII，L305V/K337A/V158D-FVII，

L305V/V158D/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V-FVII，L305V/V158T/M298Q-FVII，

L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，

L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，

L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，

L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，

L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/K316H-FVII，S314E/K316Q-FVII，

S314E/L305V-FVII，S314E/K337A-FVII，S314E/V158D-FVII，S314E/E296V-FVII，

S314E/M298Q-FVII，S314E/V158T-FVII，K316H/L305V-FVII，K316H/K337A-FVII，

K316H/V158D-FVII，K316H/E296V-FVII，K316H/M298Q-FVII，K316H/V158T-FVII，

K316Q/L305V-FVII，K316Q/K337A-FVII，K316Q/V158D-FVII，K316Q/E296V-FVII，

K316Q/M298Q-FVII，K316Q/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D-FVII，S314E/L305V/E296V-FVII，S314E/L305V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T-FVII，

S314E/L305V/K337A/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII，

S314E/L305V/K337A/E296V-FVII，S314E/L305V/K337A/V158D-FVII，

S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V-FVII，

S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V-FVII，

S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，

S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，

S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，

S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，

S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/K337A-FVII，

K316H/L305V/V158D-FVII，K316H/L305V/E296V-FVII，K316H/L305V/M298Q-FVII，

K316H/L305V/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305V/K337A/V158D-FVII，

K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V-FVII，

K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V-FVII，

K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，

K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，

K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，

K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，

K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII，

K316Q/L305V/V158D-FVII，K316Q/L305V/E296V-FVII，K316Q/L305V/M298Q-FVII，

K316Q/L305V/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII，

K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII，

K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII，

K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，

K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，

K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，

K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，

K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/K337A-FVII，F374Y/V158D-FVII，

F374Y/E296V-FVII，F374Y/M298Q-FVII，F374Y/V158T-FVII，F374Y/S314E-FVII，

F374Y/L305V-FVII，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVII，

F374Y/L305V/E296V-FVII，F374Y/L305V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T-FVII，

F374Y/L305V/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E-FVII，F374Y/K337A/V158T-FVII，

F374Y/K337A/M298Q-FVII，F374Y/K337A/E296V-FVII，F374Y/K337A/V158D-FVII，

F374Y/V158D/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q-FVII，F374Y/V158D/E296V-FVII，

F374Y/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q-FVII，F374Y/V158T/E296V-FVII，

F374Y/E296V/S314E-FVII，F374Y/S314E/M298Q-FVII，F374Y/E296V/M298Q-FVII，

F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，

F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，

F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，

F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII，

F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，

F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，

F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII，

F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII，F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII，

F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII，

F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII，F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII，

F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII，

F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII，

F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII，

F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII，

F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII，

F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII，

F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII，

F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，

F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII，

F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，

F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII，

F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII，

F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，

F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII，

F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII，

F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII，

F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII，

F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，

F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，

F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII，

F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，

F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，

F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，S52A-Factor VII，S60A-Factor VII；

R152E-Factor VII，S344A-Factor VII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，

R290N/A292T-FVII，G291N-FVII，R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；和

以及在氨基酸序列233Thr至240Asn中具有取代、增加或缺失的FVII；

在氨基酸序列304Arg至329Cys中具有取代、增加或缺失的FVII；以及在氨基酸序列153Ile至233Arg中具有取代、增加或缺失的FVII。

在一个实施方式中糖蛋白是FVIII多肽。在一个实施方式中，糖蛋白是FIX多肽。

本发明的其他方面

本发明也和具有如下通式的新改性糖蛋白有关：

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L′-M′)_m(通式I)

其中M和任选的M’独立地为增加改性糖蛋白分子量的聚合部分，其中L和L’独立地代表二价接头，其中P代表糖蛋白，所述糖蛋白包含糖蛋白的一个或多个被氧化葡聚糖末端，O、N、C和H分别代表氧、氮、碳和氢原子，n为1-10，m为0-50，其中所述改性糖蛋白相对于起始糖蛋白P^*具有改善的药理性质并保持其功能活性。

在本发明某些实施例中的所述改性糖蛋白选自FVII、FVIII、FIX，、FX、FII、FV、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子、FXI、FXII、FXIII及其序列变体、免疫球蛋白、细胞因子如白介素、α-、β-、γ-干扰素、集落刺激因子包括粒性白细胞集落刺激因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、磷脂酶激活蛋白(PUP)。

其他改性糖蛋白是具有一般生物学和治疗学重要性的改性蛋白和肽，例如，包括胰岛素、植物蛋白如外源凝集素、蓖麻毒蛋白、肿瘤坏死因子和相关等位基因、溶解形式的肿瘤坏死因子受体、白介素和溶解形式的白介素受体、生长因子例如组织生长因子，如TGFa′s或TGFps和表皮生长因子，激素、生长调节素、促红细胞生成素、色素激素、下丘脑释放因子、抗利尿素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、促卵胞激素、促甲状腺激素、组织纤溶酶原激活物和免疫球蛋白如IgG、IgE，IgM，、IgA、IgD和其片段。

在本发明的一个实施方式中改性糖蛋白是N-糖基化的和/或O-糖基化的和/或含有唾液酸基。

在本发明的一个实施方式中改性糖蛋白具有改善的药理性质选自提高的生物利用度、延长的功能体内半衰期、延长的体内血浆半衰期、降低的免疫原性、提高的蛋白酶抗性、提高的白蛋白亲和力、改善的受体亲和力、提高的储存稳定性、缩短的功能体内半衰期、缩短的体内血浆半衰期。在一个实施方式中通过M’作为增加分子量的基团以降低或消除肾清除率和/或M作为掩蔽肝受体结合位点的基团延长半衰期。在一个实施方式中通过M作为阻断抗体与致免疫的位点结合基团降低免疫原性。在一个实施方式中，通过M作为对白蛋白具有高亲和力的基团改进对白蛋白的亲和力。在一个实施方式中，通过M作为与靶细胞表面受体特异性结合的基团改进对受体的亲和力。

在本发明的一个实施方式中，改性糖蛋白的M基团选自：低分子量有机带电荷基团，其可含有一个或多个羧酸、胺、磺酸、膦酸或其组合；低分子量中性亲水分子，例如环糊精或任选支化的聚乙烯链；低分子量的亲脂分子，如脂肪酸或胆酸或其衍生物；平均分子量为2-40kDa的聚乙二醇；定义明确的精确聚合物，如确切分子量范围为700Da至20kDa的树枝状大分子；基本上非免疫原性的多肽，如白蛋白，抗体或任选含有Fc-结构域的抗体的一部分；和高分子量有机聚合物。

在本发明的一个实施方式中改性糖蛋白中M选自树枝状大分子，聚氧化烯(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，支化PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-共聚-马来酸酐、聚苯乙烯-共聚-马来酸酐、葡聚糖、羧甲基葡聚糖、HES、MPC和PHF。

在本发明的一个实施方式中改性糖蛋白中M选自血清蛋白结合配体和含有在生理条件下改变电荷性质的部分的有机小分子，抑制聚糖与受体结合的结构，和阻止聚糖特异性识别的中性取代基。

在一个实施方式中本发明的改性糖蛋白中P选自FVII、FVIII、FIX、FX、FII、FV、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子、FXI、FXII、FXIII及其序列变体；免疫球蛋白，细胞因子如白介素，α-、β-和γ-干扰素，集落刺激因子，包括粒性白细胞集落刺激因子，成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、磷脂酶激活蛋白(PUP)、胰岛素、植物蛋白如凝集素和蓖麻毒蛋白、肿瘤坏死因子和相关等位基因、溶解形式的肿瘤坏死因子受体，白介素受体和溶解形式的白介素受体，生长因子例如组织生长因子，如TGFa′s或TGFps和表皮生长因子，激素、生长调节素、促红细胞生成素、色素激素、下丘脑释放因子、抗利尿素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、促卵胞激素、促甲状腺激素、组织纤溶酶原激活物，和免疫球蛋白如IgG、IgE、IgM、IgA和IgD及其片段，或含有任何前述蛋白或其片段的任何融合蛋白。

在一个实施方式中本发明的改性糖蛋白的糖蛋白是VII因子多肽。

在一个实施方式中本发明的改性糖蛋白的糖蛋白具有野生型人VII因子的氨基酸序列。

在一个实施方式中本发明的改性糖蛋白在一个或多个如本发明说明书所述的凝集测定、蛋白酶解作用测试或TF结合测试中表现出的特异活性是未改性VII因子多肽的特异活性的至少约10％，如至少约20％、如至少约40％、如至少约60％、如至少约80％、如至少约100％。

在一个实施方式中本发明的改性糖蛋白表现出的生物利用度为未改性糖蛋白生物利用度的至少约110％，如至少约120％、约130％或为未改性糖蛋白生物利用度的至少约140％。

在一个实施方式中本发明的改性糖蛋白表现出的血清半衰期为未改性糖蛋血清半衰期的至少约125％，如约150％、约200％或至少约为未改性糖蛋血清半衰期的250％。

在一个实施方式中，制备改性糖基化分子的方法包括进一步将所述糖基化分子制剂成药物组合物的步骤。

在本发明一个实施方式中，具有通式(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m的改性糖蛋白中的m范围为0-50，例如0-20，例如0-10，例如0-5，例如0-3。

具有通式(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m的改性糖蛋白中n受具体糖蛋白上存在的未还原聚糖末端数量的限制。因此，在本发明一个实施方式中，具有通式(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m的改性糖蛋白的n等于糖蛋白中未还原聚糖末端数量。在本发明另一个实施方式中，具有通式(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m的改性糖蛋白的n范围为1-10，例如1-5，例如1-3，例如1-2，例如1，例如2，例如3。

在一个实施方式中具有(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)的改性糖蛋白选自

药物组合物

本发明的另一个目的是提供一种含有改性糖蛋白的药物组合物，其浓度为10^-12mg/ml至200mg/ml，例如10^-10mg/ml至5mg/ml并且所述组合物具有pH2.0至10.0。该组合物可进一步含有缓冲体系、防腐剂、张力剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明一个实施方式中药物组合物是含水组合物，如含有水的组合物。该组合物通常是溶液或混悬液。术语“含水组合物”指含有至少50％w/w水的组合物。同样，术语“水溶液”指含有至少50％w/w水的溶液，术语“水混悬液”指含有至少50％w/w水的混悬液。

在另一个实施方式中药物组合物是冷冻干燥组合物，在使用前医生或病人向其中加入溶剂和/或稀释剂。在另一个实施方式中药物组合物是在使用时不需要任何预先溶解的干燥组合物(如冷冻干燥或喷雾干燥)。

本发明再进一步涉及含有改性蛋白含水溶液和缓冲剂的药物组合物，所述改性蛋白浓度范围为0.1-100mg/ml或以上，其中所述组合物的pH为约2.0至约10.0。

在本发明的另一个实施方式中组合物的pH选自2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9和10.0。

在本发明进一步的实施方式中缓冲剂选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰肽甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和氨丁三醇、N，N-二(羟乙基)甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。每个具体缓冲剂构成了本发明可选择的实施方式。

本发明进一步的实施方式中组合物进一步含有药学上可接受的防腐剂。本发明的进一步实施方式中防腐剂选自苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、2-苯氧乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、三氯叔丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、氯己啶、甲醋吡喃酮钠、氯甲酚、尼泊金乙酯、苄索氯铵、氯苯苷醚(3-对氯苯氧丙烷-1，2-二醇)或其混合物。本发明进一步的实施方式中防腐剂的浓度为0.1mg/ml至20mg/ml。本发明进一步的实施方式中防腐剂的浓度为0.1mg/ml to 5mg/ml。本发明进一步的实施方式中防腐剂的浓度为5mg/ml至10mg/ml。本发明进一步的实施方式中防腐剂的浓度为10mg/ml至20mg/ml。每个具体防腐剂构成了本发明可选择的实施方式。在药物组合物中使用防腐剂是本技术领域技术人员公知的。适合的参考是Remington：The Science and Practice ofPharmacy，20^th edition，2000。

本发明进一步的实施方式中组合物进一步含有等渗剂。本发明的进一步实施方式中等渗剂选自盐(如氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、醛糖醇(如甘油(丙三醇)、1，2-(二羟基丙烷)(丙二醇)、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇)、聚乙烯二醇(如PEG400)或其混合物。可以使用任何糖如单-、二-或多糖、或水溶性葡聚糖、包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、可溶淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。在一个实施方式中糖添加剂是蔗糖。糖醇定义为具有至少一个-OH的C₄-C₈烃，例如甘露醇、山梨醇、肌醇、卫矛醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方式中糖醇添加剂是甘露糖。上述糖或糖醇可单独或联合使用。对于使用量没有固定限制，糖或糖醇溶于液体制剂，不会对使用本发明的方法获得的稳定效果产生不利影响。在一个实施方式中糖和糖醇的浓度约1mg/ml至约150mg/ml。在本发明进一步的实施方式中等渗剂的浓度约1mg/ml至约50mg/ml。在本发明进一步的实施方式中等渗剂的浓度约1mg/ml至约7mg/ml。在本发明进一步的实施方式中等渗剂的浓度约8mg/ml至约24mg/ml。在本发明进一步的实施方式中等渗剂的浓度约25mg/ml至约50mg/ml。每个具体等渗剂构成了本发明可选择的实施方式。药物组合物中使用等渗剂是本技术领域技术人员所公知的。适合的参考是Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20^th edition，2000。

本发明进一步的实施方式中组合物进一步含有螯合剂。本发明的进一步实施方式中螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸和其混合物。在本发明进一步实施方式中螯合剂浓度为0.1mg/ml至5mg/ml。在本发明进一步实施方式中螯合剂浓度为0.1mg/ml至2mg/ml。在本发明进一步实施方式中螯合剂浓度为2mg/ml至5mg/ml。每个具体螯合剂构成了本发明可选择的实施方式。药物组合物中使用螯合剂是本技术领域技术人员所公知的。适合的参考是Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，20^th edition，2000。

本发明进一步的实施方式中组合物进一步包含稳定剂。药物组合物中使用稳定剂是本技术领域技术人员所公知的。适合的参考是Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20^th edition，2000。

更具体的，本发明组合物是稳定的液体药物组合物，其治疗活性组分包括在液体药物组合物储存期间可能有聚集体形成的蛋白。“聚集体”形成指蛋白分子之间的物理作用形成低聚物，该低聚物可能仍然可溶，或为大量可见的聚集物，由溶液中沉淀。“储存期间”指液体药物组合物或组合物一旦制备后不被立即用于患者。更确切的，制备后，组合物以液体形式、冷冻状态、或在之后从新形成液体形式或其他适于给患者施用的干燥形式包装储存。“干燥形式”指液体药物组合物或组合物采用冷冻干燥(如低压冻干法；参见例如Williams和Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.38：48-59)、喷雾干燥(参见Masters(1991)，Spray-Drying Handbook(5th ed；Longman Scientific and Technical，Essez，U.K.)，pp.491-676；Broadhead等人.(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.18：1169-1206；和Mumenthaler等人.(1994)Pharm.Res.11：12-20)，或自然干燥(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology 25：459-470；和Roser(1991)Biopharm.4：47-53)干燥。液体药物组合物在储存期间蛋白形成的聚集体形式可以对蛋白的生物活性产生不利影响，导致药物组合物治疗活性的降低。进一步，聚集体的形成会导致其他问题，如当含有蛋白的药物组合物通过输注系统给药时，造成输液管、薄膜或泵阻塞。

本发明的药物组合物进一步含有许多氨基酸碱基足以减少组合物储存期间蛋白引起的聚集体形成。“氨基酸碱基”指氨基酸或氨基酸混合物，其中任何氨基酸以其游离碱形式或其盐的形式存在。使用氨基酸混合物时，所有的氨基酸以其游离碱形式存在，或全部以其盐的形式存在，或一部分以其游离碱形式存在而另一部分其盐的形式存在。在一个实施方式中，用于制备本发明组合物的氨基酸具有带电侧链，如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。当具体氨基酸或有机碱以游离碱形式或其盐形式存在时，具体氨基酸(蛋氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸或其混合物)的任何立体异构体(如L或D异构体或其混合物)或其立体异构体的混合物或甘氨酸或有机碱例如但不限于咪唑可以存在于本发明药物组合物中。在一个实施方式中，使用氨基酸L-立体异构体。在一个实施方式中，使用氨基酸D-立体异构体。本发明组合物可以用这些氨基酸的类似物制剂。“氨基酸类似物”指天然存在氨基酸的衍生物，能在本发明液体药物组合物储存期间产生减少蛋白质引起的聚集体产生的效果。合适的精氨酸类似物包括例如氨基胍、鸟氨酸和N-单乙基L-精氨酸，合适的蛋氨酸类似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸，和合适的半胱氨酸类似物包括S-甲基-L-半胱氨酸。与其他氨基酸一样，可用于组合物的氨基酸类似物以其游离碱形式或其盐的形式。本发明进一步的实施方式中氨基酸或氨基酸类似物使用的浓度足以阻止或延缓蛋白的聚集。

本发明进一步的实施方式中当作为治疗药物的蛋白质是含有至少一个容易受氧化影响的蛋氨酸残基的蛋白质时，可加入蛋氨酸(或其他硫磺氨基酸或氨基酸类似物)抑制蛋氨酸残基氧化为蛋氨酸。“抑制”指蛋氨酸氧化物随时间的最低累积。抑制蛋氨酸氧化致使蛋白质更大限度的保留其正常分子形式。可以使用蛋氨酸(L或D异构体)的任何立体异构体或其任何混合物。加入量应该是足以抑制蛋氨酸残基氧化的量，这样蛋氨酸硫氧化物的量是调节作用所能接受的。具体的，指组合物中含有不大于约10％至约30％蛋氨酸硫氧化物。通常，可以通过加入蛋氨酸实现，加入蛋氨酸残基的蛋氨酸比例范围为约1∶1至约1000∶1，例如10∶1至约100∶1。

本发明的进一步实施方式中组合物进一步包含稳定剂，选自高分子量聚合物或低分子量化合物。本发明进一步的实施方式中稳定剂选自聚乙二醇(如PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物(如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、含硫物质如硫代甘油、巯基乙酸、2-甲基巯基乙醇和不同的盐(如氯化钠)。每个具体稳定剂构成了本发明可选择的实施方式。

药物组合物还可含有附加稳定剂，进一步增加其中治疗活性蛋白的稳定性。本发明具体有益的稳定剂包括但不限于蛋氨酸和EDTA，可以保护蛋白避免蛋氨酸氧化作用，以及非离子表面活性剂，可以保护蛋白质避免冻融或机械搅拌引起的聚集。

本发明的进一步实施方式中组合物进一步包含表面活性剂。本发明进一步的实施方式中表面活性剂选自清洁剂、乙氧基蓖麻油、聚乙二醇化甘油酯、乙酰化甘油一酯、山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(如泊洛沙姆如普卢兰尼克F68、聚羟亚烃188和407、Triton X-100)、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯和聚氧乙烯衍生物如烷基化和烷氧基衍生物(吐温，如吐温-20，吐温-40，吐温-80和苄泽-35)、甘油一酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物、醇类、甘油、外源凝集素和磷脂类(如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、双磷脂酰甘油和，神经磷脂)、磷脂衍生物(如二棕榈酰棕榈酰)和溶血磷脂(如棕榈酰溶血磷脂-L-丝氨酸和乙醇胺、胆碱、丝氨酸或苏氨酸的的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)和溶血磷脂和磷酸卵磷酯的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物，如溶血磷脂胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱的月桂酰和肉豆蔻酰衍生物和极性头基团修饰物，即胆碱、乙醇胺、磷脂酸、丝氨酸、苏氨酸、甘油、肌醇、和荷正电的DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、溶血磷酸甘油酯和溶血磷脂苏氨酸和甘油磷脂(如脑磷脂)、甘油糖脂(如吡喃半乳糖苷)、神经鞘氨糖脂(如神经酰胺、神经节糖苷)、月桂基磷酸胆碱、鸡子溶血卵磷脂、夫西地酸衍生物(如牛磺酸二氢暗褐菌素钠等)、C₆-C₁₂长链脂肪酸和其盐(如油酸和辛酸)、酰基肉毒碱和衍生物、赖氨酸、精氨酸或组氨酸的N^α-酰化衍生物或赖氨酸或精氨酸的侧链酰化衍生物、含有任何联合的赖氨酸、精氨酸或组氨酸和中性氨基酸的二肽的N^α-酰化衍生物、含有任何联合的中性氨基酸和两个带电氨基酸的三肽的N^α-酰化衍生物、DSS(多库酯钠，CAS登记号[577-11-7])、多库酯钙，CAS登记号[128-49-4])、多库酯钾，CAS登记号[7491-09-0])、SDS(月桂基硫酸钠或十二烷基硫酸钠)、辛酸钠、胆酸或其衍生物、胆汁酸和其盐和甘氨酸或牛磺酸缀合物、熊去氧胆酸、牛胆酸钠、去氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、N-十六烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷基磺酸酯、阴离子(烷基-芳基-磺酸酯)单价表面活性剂、两性离子表面活性剂(如N-烷基-N，N-二甲基铵基-1-丙烷磺酸酯、3-乙醇氨基-1-丙基二甲基铵基-1-丙烷磺酸酯、阳离子表面活性剂(季铵碱)(如溴化十六烷基三甲铵、西氯吡铵)、非离子表面活性剂(如十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷)、poloxamines(如四聚醇胺)，其是衍生自向氨茶碱中连续加入环氧丙烷和环氧乙烷的四功能基嵌段共聚物、或可选自咪唑啉衍生物的表面活性剂或其混合物。每个具体表面活性剂构成了本发明可选择的实施方式。

药物组合物中使用表面活性剂是本技术领域技术人员所公知的。适合的参考是Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20^thedition，2000。

本发明药物组合物中还可加入其他成分。所述添加的成分包括湿润剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张度调节剂、螯合剂、金属离子、油性载体、蛋白质(如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(如氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。该添加成分当然应该不会对本发明药物组合物的整体稳定性产生不利影响。

含有本发明改性糖蛋白的药物组合物可施用给需要在不同部位治疗的病人，例如外部，如皮肤和粘膜，旁路吸收的部位，如动脉、静脉、心脏给药，吸收的部位，如皮内、皮下、肌肉内、或腹腔内给药。

本发明的药物组合物的施用可通过不同的给药途径，如通过舌、舌下、颊、口内、口腔、胃肠、鼻、肺，例如通过细支气管和海马槽或其两者，表皮、真皮、经皮、阴道、直肠、眼，例如通过结膜、输尿管和肠胃外给病人施用该治疗。

本发明组合物可以以不同剂型给药，例如溶液、混悬液、乳剂、微乳、多层乳剂、泡沫、膏剂、糊剂、硬膏、软膏、片剂、包衣片剂、洗剂、胶囊，例如硬明胶胶囊和软明胶胶囊，栓剂、直肠用胶囊、滴剂、凝胶剂、喷雾剂、粉剂、气溶剂、吸入剂、滴眼剂、眼膏、眼洗剂、阴道栓剂、阴道环、阴道软膏剂、注射液、原位转化为溶液，例如原位胶凝作用、原位调整、原位沉淀、原位结晶、输液剂和植入剂。

本发明的组合物可进一步通过共价、疏水和静电相互作用混合或附加药物载体、给药系统和先进给药系统以进一步增强的稳定性、提高生物利用度、增加溶解性、减少副作用、达到本技术领域技术人员公知的时间治疗、加强病人的依从性或其组合。载体、给药系统和先进给药系统的例子包括但不限于聚合物，如纤维素和衍生物，多糖，如糊精和衍生物，淀粉和衍生物，聚(乙烯醇)，丙烯酸酯和异丁烯酸共聚物，聚乳酸和聚乙醇酸和其嵌段共聚物，聚乙二醇，载体蛋白，例如白蛋白，凝胶，例如热敏凝胶系统，例如本技术领域公知的嵌段共聚体系，微利、脂质体、微球、纳米颗粒、液晶和其分散物，L2相和其分散物，本技术领域公知的脂水系统中的相行为，多聚体微粒、多层乳剂、自乳化、自微乳化、环糊精和其衍生物，以及树枝状大分子。

本发明组合物用于固体、半固体、粉末、溶液组合物来肺部施用改性糖蛋白，使用例如压力定量气雾剂、干粉吸入装置和喷雾器，所有装置是本技术领域技术人员公知的。

本发明组合物具体用于控释、持续释放、延长释放、迟释和缓释给药系统。更具体的但不限于，本技术领域技术人员公知，组合物用于肠胃外控释和持续释放系统(所有系统导致给药次数减少多倍)。更加具体的，控释和持续释放系统皮下给药。不受本发明范围的限制，有效的控释系统和组合物是水凝胶、油凝胶、液晶、多聚体微粒、微球和纳米颗粒。

产生用于本发明组合物控释系统的方法包括但不限于结晶、缩合、共结晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高压匀化、胶囊化、喷雾干燥、微胶囊化、凝聚、相分离、蒸发溶剂成微球、挤出和特别关键液体过程。通常参考药物控释手册(Wise，D.L.，ed.Marcel Dekker，New York，2000)和Drug and the Pharmaceutical Sciences vol.99：ProteinComposition and Delivery(MacNally，E.J.，ed.Marcel Dekker，New York，2000)。

肠胃外投药可以通过注射器，任选的笔状注射器经皮下、肌肉内、腹膜内或经脉注射。可选择的，肠胃外投药可以通过输注泵。进一步的选择是溶液或混悬液组合物以鼻或肺喷雾的形式施用改性糖蛋白。再进一步的选择，含有本发明的改性糖蛋白的药物组合物也可经皮给药，如通过针头分离注射器或通过贴剂，任选的离子电渗疗法贴剂、或经粘膜，如面颊给药。

术语“稳定组合物”指组合物具有增加的物理稳定性、增加的化学稳定性或增加的物理和化学稳定性。

术语蛋白组合物的“物理稳定性”指由于将蛋白暴露于热-机械应力和/或与接口和表面相互作用而失去稳定，如疏水接口和表面，蛋白质形成蛋白质的无生物活性物和/或不容聚集体。含水蛋白组合物的物理稳定性通过将组合物装于适当容器(如药筒或管形瓶)后在不同的温度和不同时间暴露于机械/物理应力(如搅拌)下由视觉检查或混浊度检查评估。组合物的视觉检查在黑背景的聚焦光中进行。组合物的混浊度由视觉评分表示，表明混浊程度如范围为0至3(组合物无混浊对应于视觉评分0，组合物在日光下视觉混浊对应于视觉评分3)。组合物在日光下出现视觉混浊时，组合物被归类为与蛋白聚集有关的物理不稳定。可选择的，组合物的混浊度可以施用本技术领域技术人员公知的简单混浊度测量方法评估。含水蛋白组合物的物理稳定性也可以用光谱试剂或用探针测蛋白的构型状态来评估。探针优选小分子优先结合至蛋白的非天然构型异构体。蛋白结构的小分子光谱探针的例子是硫磺素T。硫磺素T是广泛应用于检测淀粉状蛋白纤丝的荧光染料。纤丝或其他蛋白构型存在时，硫磺素T当与纤丝蛋白形式结合时，在450nm引起新激发最大值，在约482nm引起增强的发射值。未结合的硫磺素T基本上在该波长无荧光。其他蛋白结构在天然和非天然状态间转变的小分子可用作探针。例如“疏水斑区”探针优先结合至蛋白暴露的疏水斑区。疏水斑区通常埋入天然状态蛋白的三级结构，但是当蛋白可是展开或变性时则暴露出来。这些小分子的例子，光谱探针是芳香族疏水染料，如蒽、吖啶、二氮菲等等。其他的光谱探针是金属-氨基酸螯合物，例如疏水氨基酸的钴金属螯合物，如苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸等等。

术语蛋白组合物的“化学稳定性”指蛋白结构的化学共价变化导致形成化学降解产物，该产物比天然蛋白结构可能降低生物活性和/或可能增加免疫原性。化学降解产物的不同取决于天然蛋白种类和性质及其暴露的环境。如本技术领域技术人员公知的，化学降解的消除物不能够完全避免，化学降解产物数量的增多通常出现在蛋白组合物储存和使用期间。大多数蛋白质易于脱酰胺作用，该过程中谷氨酰基或天冬酰胺酰残基的侧链酰胺基团水解形成游离羧酸。其他降解途径引起高分子量变质产物的形成，其中两个或多个蛋白分子通过转酰胺基作用和/或二硫化物作用相互共价结合导致形成共价结合的二聚体、低聚物和聚合物降解产物(Stability of Protein Pharmaceuticals，Ahern.T.J. &Manning M.C.，Plenum Press，New York 1992)。氧化(例如蛋氨酸残基)是另一种化学降解。蛋白组合物的化学稳定性可以通过将其暴露于不同环境条件(降解产物的形成通常可以被例如升高的温度而加速)后测量不同时间点化学降解产物的数量来评估。使用不同的色谱技术(如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)根据分子量和/或电荷测量区分降解产物从而测定各种降解产物的数量。

因此，如上所述，“稳定的组合物”指具有提高的物理稳定性、提高的化学稳定性或提高的物理和化学稳定性的组合物。通常组合物在有效期到达前使用和储存期间应当稳定(遵照推荐的使用和储存条件)。本发明的实施方式中含有改性糖蛋白的药物组合物稳定使用长于6周，稳定储存长于3年。

本发明另一个实施方式中药物组合物稳定使用长于4周，稳定储存长于3年。

本发明进一步的实施方式中药物组合物稳定使用长于4周，稳定储存长于2年。

本发明更进一步的实施方式中药物组合物稳定使用长于2周，稳定储存长于2年。

所有参考，包括出版物、专利申请和专利在此引入其全部内容作为参考，对于同样的程度如果各个参考是独立和具体的显示引入作为参考，在此阐明其全部(法律允许的最大程度)，无论任何分离的提出具体段落的引入在别处。

本发明内容中描述的术语“一个”和“这个”和类似的指代解释为包括单个和复数个，除非上下文另有说明或清楚的反对。

除非另有说明，在此所有确切的值表示相应的近似值(如关于特定因素或测量提供的所有例值可以被认为提供相应的近似测量，适当的修改为“约”)。

本发明任何部分或实施方式在此的描述使用的术语如“包括”、“具有”或“含有”指要素或成分用于提供支持本发明相似部分或实施例“由......组成”、“本质上由......组成”、“基本上含有”该要素或成分，除非上下文另有说明或清楚的反对(如在此描述的组合物含有特定元素应当理解为描述由该元素组成的组合物，除非上下文另有说明或清楚的反对)。

在此使用的所有标题和副标题仅为了方便，而不用作对本发明任何方式的限制。

在此任何和所有实施例或举例语言(如“例如”)的使用意在更好的描述本发明，而不是对本发明范围的限制，除非另有要求。说明书中所有语言应当解释为表明实现本发明必不可少的任何要求的元素。

在此引证和引用专利文献仅仅是为了更加方便而不反映任何该专利文献有效性、专利性和/或强制性的观点。

实施例

缩写：

SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

EDTA：乙二胺四乙酸

FVIIa：VIIa因子

FVIII：VIII因子

FIX：IX因子

材料、仪器和方法

纯化：

蛋白纯化在离子交换柱(HiTrap Q HP，Amersham Bioscience)或尺寸排阻色谱柱(XK26/60 HiLoad Superdex 200，Amersham Bioscience)上进行，使用FPLC以及FC-950分段收集器(Amersham Bioscience)。洗脱缓冲液、柱和分段收集器均恒温于5℃。

SDS-PAGE：

SDS-PAGE使用Invitrogen^TM的X细胞Surelock^TM迷你型细胞系统和根据Invitrogen标准实验设计的预凝4-12％双丙烯酰胺-氨基丁三醇凝胶、NuPAGE MES SDS电泳缓冲液、Mark 12标准样品和NUPAGELDS样品缓冲液。根据Invitrogen实验设计，凝胶用SimpleBlue^TM染色。

缓冲溶液：

GlyGly缓冲液：25mM Gly-Gly，50mM NaCl，25mM CaCl₂，pH6.0CaCl₂游离GlyGly缓冲液：25mM Gly-Gly，50mM NaCl，pH6.0Hepes缓冲液：50mM羟乙基哌嗪乙磺酸，100mM NaCl，5mM CaCl₂，0,01％吐温80，pH＝7.4

实施例

NaIO₄处理FVIIa以及S2288活性

相关研究NaIO₄和残基分解肽的活性→无明显相关性。

测试I

测定FVIIa的分解肽活性：

使用源于Chromogenix，Sweden的显色底物S-2288(H-D-Ile-Pro-Arg-p-硝基苯胺)检测分解肽的活性。按以下实验设计进行：制备10mM于Hepes缓冲液中的S2288原液。类似的制备200nM于Hepes缓冲液中的组织因子原液。200nM实验品的原液和相关化合物(如野生型FVIIa)以Hepes缓冲液制备。化合物按三份用ELISA孔测试。在典型的实验中，10ul 200nM组织因子原液和135ul Hepes缓冲液加入孔内。通过加入5ul 200nM S2288原液引发反应。用ELISA-读数器于室温(吸光度于405nm)连续分析孔15分钟。由开始率计算相对活性，与野生型FVIIa的比率进行对比。改性FVIIa类似物的活性表示为野生型FVIIa活性的百分比。

实施例1

10K PEG-ONH₂：10K-SMB-PEG(1,00g；0.1mmol；Nektar Inc)溶于DCM(10ml)。加入4-(N-叔丁氧羰基氨氧基)丁基胺(0.20g，1mmol，按WO 2005014049A2制备)，混合物于室温搅16h。加入乙醚(90ml)，滤出白色沉淀。重复用DCM(10ml)溶解沉淀以及加入乙醚(90ml)的步骤。然后用DCM(6ml)复溶沉淀物质，加入Amberlyst15离子交换树脂(2,0g；先用DCM和10％EtOH的DCM溶液洗)。混合物于室温搅拌30分钟，然后滤出树脂，用DCM充分洗涤。合并DCM溶液用旋转蒸发仪浓缩至小体积，然后加入乙醚(90ml)使产品析出。产物用DCM(6ml)溶解，加入TFA(6ml)。混合物于室温搅拌1/2小时。用乙醚(100ml)使产物析出，滤出。产物用DCM(5ml)复溶，加入三乙胺(1ml)。混合物搅拌5分钟，然后再用乙醚(100ml)使产物析出。滤出沉淀，用乙醚洗两次，真空干燥箱干燥过夜。收率：475mg(46％)。¹H-NMR(CDCl₃；选择峰)：

δ1.25ppm(d，3H)；1.50-1.75(m，6H)；1.82(m，1H)；3.38(s，3H)；3,45-3,90(m，ca.900H).

实施例2

单10K-PEG-FVIIa(0128-0000-1018-1A)：

溶于10ml 25mM Gly-Gly、50mM NaCl、25mM CaCl₂、pH6.0(GlyGly缓冲液)的Factor VIIa(14mg，0.28umol)加入100ul CaCl₂游离GlyGly缓冲液中的20mM NaIO₄溶液和1000ul GlyGly缓冲液中的10K-PEG-ONH₂溶液(实施例1，42mg；4.2umol；VIIa因子的15当量)：混合物置于冰浴2h，并偶尔摇动。然后在反应混合液中加入GlyGly缓冲液(1M NaOH调pH至6.0)中的500ul MeONH₂.HCl溶液(17mg；0,21mmol)。混合物再置于冰浴10min。然后向反应混合物中加入100mM二代的EDTA冷溶液(4,5ml)，维持pH低于9.0。然后用100ul 1N HCl溶液调pH至8.0。

离子交换色谱：

用离子交换色谱除去多余的PEG-ONH₂。冷却的反应混合物装于5ml HiTrap Q离子交换柱(Amersham Bioscience)，该交换柱预先用25mM GlyGly、50mM NaCl、pH8.0平衡。用25mM GlyGly、50mM NaCl、pH8.0(缓冲液A)洗脱超过10cv；然后用25mM GlyGly、50mM NaCl、25mM CaCl₂、pH8.0(缓冲液B)洗脱超过15cv，恒流(1ml/min)并恒温(5℃)。流出物用吸光度在280nm监测。

尺寸排阻色谱：

于5℃在Superdex 200上用FPLC和Frac-950(AmershamBioscience)通过尺寸排阻色谱从由HiTrap Q混合馏分中回收的糖PEG化FVIIa变体中除去未PEG化(Pegylated)的FVIIa。XK26/60HiLoadSuperdex 200柱(320ml cv)预先平衡(10cv)，装柱后用25mM GlyGly、50mM NaCl、25mM CaCl₂、pH6.0以流速2.5ml/min洗脱。流出液用280nm吸光度检测。收集10ml馏分。按照Invitrogen的描述，馏分用SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris NuPAGE gels)分析，用Simple Blue染色。合并含有纯单-PEG化FVIIa的馏分，于4000rpm，10℃通过AmiconUltra^TM-15(10K MWCO)离心过滤器过滤浓缩13.5分钟，最终体积为4.1ml。

蛋白浓度用UV测量方法(使用E_280nm＝1.32ml/mg/cm)测定为0.29mg/ml，其等于0.35mg/ml FVIIa-10K PEG。分解肽的活性(S2288测试)相对于wt FVIIa为79％。

实施例3

制备高取代(HS)和低取代(LS)10K-PEG-FVIIa

溶于10ml 25mM Gly-Gly、50mM NaCl、25mM CaCl₂、pH6.0(GlyGly缓冲液)的因子VIIa(14mg，0.28umol)中加入100ul CaCl₂游离GlyGly缓冲液中的20mM NaIO₄溶液和1000ul GlyGly缓冲液中的10K-PEG-ONH₂溶液(实施例1，42mg；4.2umol；VIIa因子的15当量)：混合物置于4℃24h，并偶尔摇动。然后在反应混合液中加入500ul GlyGly缓冲液(1M NaOH调pH至6.0)中的MeONH₂.HCl溶液(17mg；0,21mmol)。混合物置于冰浴10min。然后向反应混合物中加入100mM二代EDTA冷溶液(4,5ml)，维持pH低于9.0。然后用60ul 1N HCl溶液调pH至8.0。

离子交换色谱：

用离子交换色谱除去多余的PEG-ONH₂。冷却的反应混合物装于5ml HiTrap Q离子交换柱(Amersham Bioscience)，该交换柱预先用25mM GlyGly、50mM NaCl、pH8.0平衡。用25mM GlyGly、50mM NaCl、pH8.0(缓冲液A)洗脱超过10cv；然后用25mM GlyGly、50mM NaCl、25mM CaCl₂、pH8.0(缓冲液B)洗脱超过15cv，恒流(1ml/min)并恒温(5℃)。流出物在280nm用吸光度监测。

尺寸排阻色谱：

于5℃用FPLC和Frac-950(Amersham Bioscience)在Superdex 200上通过尺寸排阻色谱从由HiTrap Q混合馏分中回收的糖PEG化FVIIa变体中除去未PEG化的FVIIa。XK26/60HiLoad Superdex200柱(320ml cv)预先平衡(10cv)，装柱后用25mM GlyGly、50mMNaCl、25mM CaCl₂、pH6.0以流速2.5ml/min洗脱。流出液在280nm用吸光度检测。收集10ml馏分。按照Invitrogen的描述，馏分用SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris NuPAGE gels)分析，用Simple Blue染色。根据PEG取代水平混合馏分，于4000rpm，10℃通过Amicon Ultra^TM-15(10K MWCO)离心过滤器过滤浓缩13.5分钟。

HS(tri/tetra 10K PEG)FVIIa：0.92mg蛋白(UV_280nm)/ml，总体积＝1.6ml。

HS(di/tri 10K PEG)FVIIa：0.63mg蛋白(UV_280nm)/ml，总体积＝1.4ml。

LS(mono/di 10K PEG)FVIIa：1.2mg蛋白(UV_280nm)/ml，总体积＝1.4ml。

单10K PEG FVIIa：0.7mg蛋白(UV_280nm)/ml，总体积＝2.3ml。

实施例4

制备高取代(HS)和低取代(LS)40K-PEG-FVIIa

溶于10ml 25mM Gly-Gly、50mM NaCl、25mM CaCl₂、pH6.0(GlyGly缓冲液)的VIIa因子(14mg，0.28umol)中加入100ul CaCl₂游离GlyGly缓冲液中的20mM NaIO₄溶液和1500ul GlyGly缓冲液中的40K-PEG-ONH₂溶液((20k PEG)OCH₂(20K PEG)OCHCH₂OC(＝O)O-CH₂CH₂ONH₂；WO 2006042847，112mg；2.8umol；相当于VIIa因子10当量)。混合物置于4℃48h，并偶尔摇动。在反应混合液中加入500ul GlyGly缓冲液中的MeONH₂.HCl溶液(17mg；0,21mmol)，然后用1N NaOH调pH至6.0。混合物置于冰浴10min。然后向反应混合物中加入100mM二代EDTA冷溶液(4,5ml)，维持pH低于9.0。然后用60ul 1N HCl溶液调pH至8.0。

离子交换色谱：

用离子交换色谱除去多余的PEG-ONH₂。冷却的反应混合物装于5ml HiTrap Q离子交换柱(Amersham Bioscience)，该交换柱预先用25mM GlyGly、50mM NaCl、pH8.0平衡。用25mM GlyGly、50mM NaCl、pH8.0(缓冲液A)洗脱超过10cv；然后用25mM GlyGly、50mM NaCl、25mM CaCl₂、pH8.0(缓冲液B)洗脱超过15cv，恒流(1ml/min)并恒温(5℃)。流出物在280nm用吸光度监测。混合流出物，用1N HCl调pH至6.0。

尺寸排阻色谱：

于5℃用FPLC和Frac-950(Amersham Bioscience)在Superdex 200上通过尺寸排阻色谱从由HiTrap Q混合馏分中回收的糖PEG化FVIIa变体中除去未PEG化的FVIIa。XK26/60 HiLoad Superdex200柱(320ml cv)预先平衡(10cv)，装柱后用25mM GlyGly、50mMNaCl、25mM CaCl₂、pH6.0以流速2.5ml/min洗脱。流出液在280nm用吸光度检测。收集10ml馏分。按照Invitrogen的描述，具有UV活性(280nm)的馏分用SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris NuPAGE gels)分析，用Simple Blue染色。根据PEG取代水平混合馏分，于4000rpm，10℃通过Amicon Ultra^TM-15(10K MWCO)离心过滤器过滤浓缩。

HS(di/tri 40K PEG)FVIIa：0.46mg蛋白(UV_280nm)/ml，总体积＝3.0ml。

LS(mono/di 40K PEG)FVIIa：0.75mg蛋白(UV_280nm)/ml，总体积＝3.7ml。

Mono 40K-PEGFVIIa：0.53mg蛋白(UV_280nm)/ml，总体积＝4.5ml。

实施例5

制备高取代(HS)和低取代(LS)5K-PEG-FVIIa

对高碘酸或高碘酸盐浓度和最终化合物肽分解的活性的影响：

制备以下原液：

2.8mM PEG原液：将5K-PEG-ONH₂(4.03mg；0.8umol，按实施例1所述由5K-PEG-NHS酯制备)溶于281ul CaCl₂游离GlyGly缓冲液(25mM Gly-Gly、50mM NaCl、pH6.0)。20mM NaIO₄原液：NaIO₄(426mg；2mmol)的100ml CaCl₂游离GlyGly缓冲液(25mM Gly-Gly、50mM NaCl、pH6.0)溶液。100mM EDTA溶液：EDTA二钠盐(292mg)溶于10ml水。1M CaCl₂溶液：CaCl₂(1.12g)的10ml水溶液(由0.45um滤膜过滤)。12.8uMVIIa因子溶液：(1.4mg，0.028umol)溶于1.0ml 25mM Gly-Gly、50mM NaCl、pH6.0(GlyGly缓冲液)，加入95ul 100mMEDTA溶液，再加入1.095ml CaCl₂游离GlyGly缓冲液(最终FVIIa浓度＝0.64mg/ml)。原液根据下表混合：

条目	12.8uM FVIIa	不含CaCl₂-的GlyGly缓冲液	20mMNaIO₄	2.8mMPEG5000-ONH₂	总体积
						1	50ul	40ul	0ul	10ul	100ul
2	50ul	20ul	20ul	10ul	100ul
						3	50ul	30ul	10ul	10ul	100ul
4	50ul	38ul	2ul	10ul	100ul
						5	50ul	39,5ul	0,5ul	10ul	100ul

所有的反应混合物室温下温和摇动2h。每个管形瓶中加入25ul 1MCaCl₂溶液。然后样品按测试部分所述分析分解肽的活性。

条目	NaIO₄最终浓度	FVIIa∶NaIO₄比例	唾液酸∶NaIO₄比例^*	相对肽分解活性
					1	0.0mM	1∶0	1∶0	100
2	4.0mM	1∶625	1∶138	3,6
					3	2.0mM	～1∶312	～1∶70	15
4	0.4mM	～1∶63	～1∶14	47
					5	0.1mM	～1∶16	～1∶3.5	82

*FVIIa上唾液酸的平均数目等于4.5，按以下实施例8所述唾液酸苷酶-半乳糖氧化试验测定。

在所有的情况下，获得单-、二-和三-PEG化产物的相同混合物，如Invitrogen所描述的，用以SilverQuest染色的SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶)分析。

实施例6

制备高取代(HS)和低取代(LS)10K-PEG-FIX：

这些材料使用实施例3所述实验方法制备。

实施例7

制备高取代(HS)和低取代(LS)40K-PEG-FIX：

IX因子(重组DNA源凝血因子IX)按以下步骤从辅料中纯化：冷冻干燥物质(1000IU)用无菌水(4ml)复溶，加入EDTA(200ul，0.25M水溶液，pH6)。于5℃10min后，样品上用25mM GlyGly、100mM NaCl、pH6.0预先平衡的1ml Resource Q柱(AmershamBioscience)。柱子流速为1ml/min。柱子用25mM GlyGly、100mMNaCl、pH8.0(缓冲液A)洗脱超过30cv；然后用25mM GlyGly、100mM NaCl、10mM CaCl₂、pH8.0(缓冲液B)洗脱超过15cv，恒流(1ml/min)并恒温(5℃)。流出物在280nm用吸光度监测。收集馏分4.2ml，蛋白浓度用吸光度(1.32/mg/ml)测定为0.52mg/ml。

PEG化(Pegylation)反应：

纯化重组DNA源凝血因子IX的25mM GlyGly、100mM NaCl、pH6.0溶液(2ml；1.04mg；18.54mmol)加入80ul(1mM NaIO4，80nmol，相当于纯化重组DNA源凝血因子IX中唾液酸的1当量)。混合物室温搅拌2h，然后加入40K-PEG-ONH₂((20K PEG)OCH₂(20KPEG)OCHCH₂OC(＝O)O-CH₂CH₂ONH₂；WO 2006042847；926ul；500uM；25x)的25mM GlyGly，100mM NaCl，pH6.0溶液。混合物置于室温48h。然后加入蛋氨酸(100ul，5mM in 25mM GlyGly，100mMNaCl，pH6.0)，再加入MeONH₂(100ul，5mM的25mM GlyGly，100mM NaCl，pH6.0溶液)。混合物置于室温30min，然后冷冻至-80℃直到进一步纯化。

离子交换色谱

用1ml Resource Q柱以FPLC和Frac-950操作(全部来于Amersham Bioscience)通过离子交换色谱柱从糖PEG化FIX变体中除去多余的PEG-ONH₂试剂和未PEG化的FIX。流出物在280nm用吸收度监测。收集1000ul馏分，过程中流速保持1ml/min。冷冻反应混合物缓慢融化，加入EDTA(400ul，0.25M水溶液，pH6)。加入水调节混合物的导电率至9.3mS。然后将混合物装于用20cv的10mM组氨酸、50mM NaCl、10mM EDTA、0.01％吐温80、pH6.0预先平衡的Resource Q柱。柱子用15cv的10mM组氨酸、50mM NaCl、10mMEDTA、0.01％吐温80、pH6.0洗，再用15cv的10mM组氨酸、50mMNaCl、0.01％吐温80、pH6.0(缓冲液A)洗。柱子用增加梯度(0-80％)10mM组氨酸、50mM MgCl₂、0.01％吐温80，pH6.0(缓冲液B)，超过15cv洗脱，再用100％缓冲液B超过20cv洗脱。馏分按照Invitrogen所述用SDS-PAGE(4-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶)分析，以Simple Blue染色。根据PEG取代水平合并馏分。

LS(mono/di 40K PEG)FIX：34.3ug蛋白(UV_280nm)/ml，总体积＝3ml。

Mono 40K-PEG-FIX：70.7ug蛋白(UV_280nm)/ml，总体积＝3ml。

实施例8

FVIIa的唾液酸浓度的定量：

如WO 2005014035A2所述，使用购自Molecular Probes Inc.(29851 Willow Creek Road，Eugene，OR 97402)的除臭剂红唾液酸苷酶(唾液酸酶)测定试剂盒(A-22178)测定唾液酸浓度。

实施例9

高碘酸或高碘酸盐介导的FVIII 40K-PEG化

VIII因子(Refacto；Wyeth，2000IE)溶于1ml分散缓冲液含有：NaCl(36mg/ml)；蔗糖(12mg/ml)；L-组氨酸(6mg/ml)；KCl(1mg/ml)；聚山梨酯80(0,4mg/ml)。然后400IE(200ul组织缓冲液)使用AmiconUltra 15，10K MWCO(3×12min，13.000rpm)通过自旋翻转缓冲液更换为20mM GlyGly，0.15M NaCl；10mM CaCl₂；0.02％吐温80，pH7.3。向30ul该FVIII溶液中加入10ul 500uM(SunBright GL2-400CA；20mg/ml)的20mM GlyGly，0.15M NaCl；10mM CaCl₂；0.02％吐温80，pH7.3，再加入3ul 100uM含水NaIO4和12ul 20mM GlyGly，0.15M NaCl；10mM CaCl₂；0.02％吐温80，pH7.3溶液。反应于4℃孵化16h，然后按照Invitrogen所述用SDS-Gel(7％氨基丁三醇乙酸盐凝胶150V/70min)分析，以SilverQuest染色为银白色。

本发明的示例性实施方式和特征

为了更好的理解在此所述的发明，提供一些非限制性的本发明的示例性实施方式和特征：

接头

1.一种制备具有如下通式的改性糖蛋白的方法：

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)

其中M和任选的M’独立地为增加改性糖蛋白分子量的聚合部分，其中L和L’独立地代表二价接头，其中P代表糖蛋白，所述糖蛋白包含糖蛋白的一个或多个被氧化葡聚糖末端，O、N、C和H分别代表氧、氮、碳和氢原子，n为1-10，m为0-50，该方法包括以下步骤：

a)用高碘酸或高碘酸盐离子氧化至少一个存在糖蛋白P^*上的聚糖末端，其中P^*代表多个糖型，以获得含有一个或多个醛基团的糖蛋白P-(CHO)_n+m，和

b)将P-(CHO)_n+m 与M-L-O-NH₂反应以得到具有(M-L-O-N＝CH))_n-P-(CHO)_m结构的改性糖蛋白，和

2.根据实施方式1所述的方法，其中所述糖蛋白是N-糖基化和/或O-糖基化的和/或含有唾液酸残基。

3.根据前述任何实施方式所述的方法，该方法包括进一步确认该改性糖蛋白相对于初始糖蛋白具有改善的药理性质的步骤。

4.根据前述任何实施方式所述的方法，其中所述改善的药理性质选自提高的生物利用度、延长的功能体内半衰期、延长的体内血浆半衰期、降低的免疫原性、提高的蛋白酶抗性、提高的白蛋白亲和力、改善的受体亲和力、提高的储存稳定性、缩短的功能体内半衰期、缩短的体内血浆半衰期。

5.根据实施方式4所述的方法，其中延长的半衰期通过M和/或M’作为增加分子量的基团降低或消除肾清除和/或通过M作为掩蔽肝脏受体的结合配偶体(partner)的基团实现。

6.根据实施方式4所述的方法，其中降低的免疫原性通过M和/或M’作为阻断抗体与致免疫位点结合的基团实现。

7.根据实施方式4所述的方法，其中改善白蛋白亲和力通过M和/或M’作为与白蛋白具有高度亲和力的基团实现。

8.根据实施方式4所述的方法，其中改善受体亲和力通过M和/或M’作为与靶细胞表面受体特异性结合的基团实现。

9.根据前述任何实施方式所述的方法，其中M和/或M’选自：低分子量有机带电荷基团，其可含有一个或多个羧酸、胺、磺酸、膦酸或其组合；低分子量中性亲水分子，例如环糊精或任选支化的聚乙烯链；低分子量的亲脂分子，如脂肪酸或胆酸或其衍生物；平均分子量为2-40kDa的聚乙二醇；定义明确的精确聚合物，如确切分子量范围为700Da至20kDa的树枝状大分子(dendrimer)；基本上非免疫原性的多肽，如白蛋白，抗体或任选含有Fc-结构域的抗体的一部分；和高分子量有机聚合物。

10.根据前述任何实施方式所述的方法，其中M和/或M’选自：树枝状大分子，聚氧化烯(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，支化PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-共聚-马来酸酐、聚苯乙烯-共聚-马来酸酐、葡聚糖、羧甲基葡聚糖、HES、MPC和PHF。

11.根据实施方式1-9任一项所述的方法，其中M和/或M’选自血清蛋白结合配体和含有在生理条件下改变电荷性质的部分的有机小分子，抑制聚糖与受体结合的结构，和阻止聚糖特异性识别的中性取代基。

12.根据前述任何实施方式所述的方法，其中P选自FVII、FVIII、FIX、FX、FII、FV、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子、FXI、FXII、FXIII及其序列变体；免疫球蛋白，细胞因子如白介素，α-、β-和γ-干扰素，集落刺激因子，包括粒性白细胞集落刺激因子，成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、磷脂酶激活蛋白(PUP)、胰岛素、植物蛋白如凝集素和蓖麻毒蛋白、肿瘤坏死因子和相关等位基因、溶解形式的肿瘤坏死因子受体，白介素受体和溶解形式的白介素受体，生长因子例如组织生长因子，如TGFa′s或TGFps和表皮生长因子，激素、生长调节素、促红细胞生成素、色素激素、下丘脑释放因子、抗利尿素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、促卵胞激素、促甲状腺激素、组织纤溶酶原激活物，和免疫球蛋白如IgG、IgE、IgM、IgA和IgD及其片段，或含有任何前述蛋白或其片段的任何融合蛋白。

13.根据实施方式1-12任一项所述的方法，其中糖蛋白是VII因子多肽。

14.根据实施方式1-12任一项所述的方法，其中糖蛋白含有野生型人VII因子的氨基酸序列。

15.根据实施方式13-14任一项所述的方法，其中改性糖蛋白在一个或多个如本发明说明书所述的凝集测定、蛋白酶解作用测试或TF结合测试中表现出的特异活性是未改性VII因子多肽的特异活性的至少约10％，如至少约20％、如至少约40％、如至少约60％、如至少约80％、如至少约100％。

16.根据实施方式1-15任一项所述的方法，其中改性糖蛋白表现出的生物利用度为未改性糖蛋白生物利用度的至少约110％，例如是未改性糖蛋白生物利用度的至少约120％、约130％或至少约140％。

17.根据实施方式1-15任一项所述的方法，其中改性糖蛋白表现出的血清半衰期为未改性糖蛋血清半衰期的至少约125％，如约150％、约200％或为未改性糖蛋血清半衰期的至少约250％。

18.根据实施方式1-17任一项所述的方法，其中相对于糖蛋白上存在的未还原聚糖末端的数量，高碘酸或高碘酸盐离子以少于20当量的量，例如少于10当量，例如少于5当量，例如少于1当量的量存在，例如，相对于糖蛋白上存在的未还原聚糖末端的数量，以0.1-20当量，例如0.1-10当量，例如0.1-5当量，例如0.1-1当量的量存在。

19.具有以下通式的改性糖蛋白

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)

20.实施方式19所述的改性糖蛋白，其中所述糖蛋白是N-糖基化和/或O-糖基化的和/或含有唾液酸残基。

21.根据实施方式19-20任一项所述的改性糖蛋白，其中改善的药理性质选自提高的生物利用度、延长的功能体内半衰期、延长的体内血浆半衰期、降低的免疫原性、提高的蛋白酶抗性、提高的白蛋白亲和力、改善的受体亲和力、提高的储存稳定性、缩短的功能体内半衰期、缩短的体内血浆半衰期。

22.根据实施方式21所述的改性糖蛋白，其中延长的半衰期通过M和/或M’作为增加分子量的基团降低或消除肾清除和/或通过M和/或M’作为掩蔽肝脏受体的结合配偶体的基团实现。

23.根据实施方式21所述的改性糖蛋白，其中降低的免疫原性通过M和/或M’作为阻断抗体与致免疫位点结合的基团实现。

24.根据实施方式21所述的改性糖蛋白，其中改善白蛋白亲和力通过M和/或M’作为与白蛋白具有高度亲和力的基团实现。

25.根据实施方式21所述的改性糖蛋白，其中改善受体亲和力通过M和/或M’作为与靶细胞表面受体特异性结合的基团实现。

26.根据实施方式19-25任一项所述的改性糖蛋白，其中M和/或M’选自：低分子量有机带电荷基团，其可含有一个或多个羧酸、胺、磺酸、膦酸或其组合；低分子量中性亲水分子，例如环糊精或任选支化的聚乙烯链；低分子量的亲脂分子，如脂肪酸或胆酸或其衍生物；平均分子量为2-40kDa的聚乙二醇；定义明确的精确聚合物，如确切分子量范围为700Da至20kDa的树枝状大分子；基本上非免疫原性的多肽，如白蛋白，抗体或任选含有Fc-结构域的抗体的一部分；和高分子量有机聚合物。

27.根据实施方式19-26任一项所述的改性糖蛋白，其中M和/或M’选自：树枝状大分子，聚氧化烯(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，支化PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-共聚-马来酸酐、聚苯乙烯-共聚-马来酸酐、葡聚糖、羧甲基葡聚糖、HES、MPC和PHF。

28.根据实施方式19-26任一项所述的改性糖蛋白，其中M和/或M’选自血清蛋白结合配体和含有在生理条件下改变电荷性质的部分的有机小分子，抑制聚糖与受体结合的结构，和阻止聚糖特异性识别的中性取代基。

29.根据实施方式19-28任一项所述的改性糖蛋白，其中P选自变体FVII、FVIII、FIX、FX、FII、FV、蛋白C、蛋白S、tPA、PAI-1、组织因子、FXI、FXII、FXIII及其序列变体；免疫球蛋白，细胞因子如白介素，α-、β-和γ-干扰素，集落刺激因子，包括粒性白细胞集落刺激因子，成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、磷脂酶激活蛋白(PUP)、胰岛素、植物蛋白如凝集素和蓖麻毒蛋白、肿瘤坏死因子和相关等位基因、溶解形式的肿瘤坏死因子受体，白介素受体和溶解形式的白介素受体，生长因子例如组织生长因子，如TGFa′s或TGFps和表皮生长因子，激素、生长调节素、促红细胞生成素、色素激素、下丘脑释放因子、抗利尿素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、促卵胞激素、促甲状腺激素、组织纤溶酶原激活物，和免疫球蛋白如IgG、IgE、IgM、IgA和IgD及其片段，或含有任何前述蛋白或其片段的任何融合蛋白。

30.根据实施方式19-29任一项所述的改性糖蛋白，其中糖蛋白是VII因子多肽。

31.根据实施方式19-29任一项所述的改性糖蛋白，其中糖蛋白含有野生型人VII因子的氨基酸序列。

32.根据实施方式30-31任一项所述的改性糖蛋白，其中改性糖蛋白在一个或多个如本发明说明书所述的凝集测定、蛋白酶解作用测试或TF结合测试中表现出的特异活性是未改性VII因子多肽的特异活性的至少约10％，如至少约20％、如至少约40％、如至少约60％、如至少约80％、如至少约100％。

33.根据实施方式19-32任一项所述的改性糖蛋白，其中改性糖蛋白表现出的生物利用度为未改性糖蛋白生物利用度的至少约110％，例如是未改性糖蛋白生物利用度的至少约120％、约130％或至少约140％。

34.根据实施方式19-33任一项所述的改性糖蛋白，其中改性糖蛋白表现出的血清半衰期为未改性糖蛋血清半衰期的至少约125％，如约150％、约200％或为未改性糖蛋血清半衰期的至少约250％。

35.具有以下通式的改性糖蛋白

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m(式I)

接头其中M和任选的M’独立地为增加改性糖蛋白分子量的聚合部分，其中L和L’独立地代表二价接头，其中P代表糖蛋白，所述糖蛋白包含糖蛋白的一个或多个被氧化葡聚糖末端，O、N、C和H分别代表氧、氮、碳和氢原子，n为1-10，m为0-50，其中所述改性糖蛋白相对于起始糖蛋白P^*具有改善的药理性质并保持其功能活性，所述改性糖蛋白是通过实施方式1-12中任一项所述的方法获得的。

36.包含根据实施方式19-35任一项的多种改性糖蛋白的制剂。

37.含有根据实施方式19-36任一项的改性糖蛋白以及与其混合的药学上可接受的载体、稀释剂、辅料或赋形剂的药物组合物。

38.用于治疗的根据实施方式19-36任一项的改性糖蛋白。

Claims

1.一种制备具有如下通式的改性糖蛋白的方法：

(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m (式I)

其中M和任选的M’独立地为增加改性糖蛋白分子量的聚乙二醇(PEG)，其中L和L’独立地代表二价接头，其中P代表糖蛋白，所述糖蛋白包含糖蛋白的一个或多个被氧化葡聚糖末端，O、N、C和H分别代表氧、氮、碳和氢原子，n为1-10，m为0-50，该方法包括以下步骤：

a)用高碘酸或高碘酸盐离子氧化至少一个存在糖蛋白P*上的聚糖末端，其中P*代表多个糖型，以获得含有一个或多个醛基团的糖蛋白P-(CHO)_n+m，和

c)将具有结构(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CHO)_m的糖蛋白中任何没有反应的醛基团与M’-L’-O-NH₂反应，以得到具有结构(M-L-O-N＝CH)_n-P-(CH＝N-O-L’-M’)_m的改性糖蛋白，

其中相对于糖蛋白上存在的未还原聚糖末端的数量，所述高碘酸或高碘酸盐离子以0.1-5当量的量存在，并且其中所述改性糖蛋白相对于起始糖蛋白P*具有改善的药理性质并保持其功能活性，且其中P选自FVII、FVIII和FIX。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚乙二醇的平均分子量为2-40kDa。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中糖蛋白是VII因子多肽。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中改性糖蛋白表现出的生物利用度为未改性糖蛋白生物利用度的至少110％。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述改性糖蛋白表现出的生物利用度为未改性糖蛋白生物利用度的至少120％。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述改性糖蛋白表现出的生物利用度为未改性糖蛋白生物利用度的至少130％。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述改性糖蛋白表现出的生物利用度为未改性糖蛋白生物利用度的至少140％。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中相对于糖蛋白上存在的未还原聚糖末端的数量，所述高碘酸或高碘酸盐离子以0.1-1当量的量存在。