KR101186128B1 - Ｌ-아미노산 생산 세균 및 ｌ-아미노산의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L-아미노산 생산능을 갖고 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성이 감소되도록 변형된 코리네형 세균에 관한 것이다. 당해 세균은 중간체로서 피루브산을 사용하는 생합성 경로에 의해 생성된 L-아미노산, 예를 들어, L-글루탐산, L-아르기닌, L-글루타민, L-프롤린, L-알라닌, L-발린 및 L-라이신을 생산하는데 사용된다.

L-아미노산, 아세틸-CoA 하이드롤라제, 코리네형 세균

Description

Ｌ-아미노산 생산 세균 및 Ｌ-아미노산의 생산 방법{L-amino acid-producing bacterium and a method for producing L-amino acid}

본 발명은 코리네형 세균의 발효 동안에 중간체로서 피루브산을 사용하는 생합성 경로에 의해 생성되는 L-아미노산의 생산 방법, 특히, L-글루탐산, L-아르기닌, L-글루타민, L-프롤린, L-발린, L-알라닌 및 L-라이신의 생산 방법에 관한 것이다.

L-글루탐산과 같은 L-아미노산은 중간체로서 피루브산을 사용하는 생합성 경로에 의해 생성되고 통상적으로 산업적 규모로는 L-아미노산 생산능을 갖는 브레비박테리움(Brevibacterium) 및 코리네박테리움(Corynebacterium)을 포함하는 코리네형 세균을 사용하는 발효 방법에 의해 생산된다. 코리네형 세균의 L-아미노산 생산능을 개선시키기 위해, 천연 또는 인공 돌연변이로부터 분리된 균주를 사용하였다(문헌참조: JP07-121228B, JP07-121228B, JP06-237779A, Adv Biochem Eng Biotechnol. 2003;79:59-112. J Biotechnol. 2003 Sep 4;104(1-3):155-72. and WO95/34672).

호기성 세균, 특히 코리네형 세균은 산소 제한 조건하에서 배양되는 경우, 표적 물질 보다는 다른 유기산, 예를 들어, 락트산 및 아세트산을 부산물로서 과량으로 축적한다. 그러한 축적은 세균의 증식을 억제하고 발효 동안의 이들의 생산능을 크게 감소시킨다. 추가로, 당해 유기산을 중화시키는 과량의 역이온이 요구되고 이는 생산 비용을 증가시킨다. 따라서, 배양 동안에 아세트산을 적게 생산하는 균주, 예를 들어, 아세트산의 생성을 촉매하는 효소의 활성이 감소되거나 제거된 균주의 작제가 요망되고 있다.

아세트산의 생성을 촉매하는 효소의 활성이 감소되거나 제거된 균주를 사용한 발효 방법의 예는 포스포아세틸트랜스퍼라제(pta) 및 락테이트 데하이드로게나제(ldh)의 활성이 결핍된 에스케리치아 콜리를 사용한 L-아미노산의 생산 방법 (WO99/06532), 피루베이트 옥시다제(poxB)의 활성이 결핍된 엔테로박테리아세애 과를 사용한 L-아미노산의 생산 방법 및 피루베이트 옥시다제(poxB)의 활성이 결핍된 엔테로박테리아세애를 사용한 D-판토텐산의 생산 방법 (WO02/36797)을 포함한다.

아세테이트 키나제(ack) 및 포스포트랜스아세틸라제(pta)는 코리네형 세균에서 아세트산을 동화하는데 관여하는 효소로서 보고되었다 (문헌참조: Microbiology, 1999 Feb; 145(Pt2):503-13). 또한 아세테이트 생산 효소 피루베이트 옥시다제(poxB)가 붕괴된 코리네형 세균이 보고되었다(EP1096013A).

아세틸-CoA 하이드롤라제는 아세틸-CoA 및 H₂O로부터 아세트산을 생성하는 효소 (3.1.2.1)이고 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 아 세틸-CoA 하이드롤라제를 암호화하는 것으로 추정되는 뉴클레오타이드 서열이 밝혀졌다 (EP1108790A). 그러나, 당해 유전자를 실제 클로닝하고 발현시키는 분석에 대해서는 보고된 바 없고 따라서, 당해 유전자의 실제 기능은 아직 확인되지 않았다.

본 발명의 목적은 중간체로서 피루브산을 사용하는 생합성 경로에 의해 생성되는 L-아미노산의 생산능이 개선된 코리네형 세균을 제공하고 당해 세균을 사용하여 상기된 L-아미노산을 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자는 상기된 목적을 달성하기 위해 세부적인 연구를 수행하였다. 결과로서, 본 발명자들은 코리네형 세균에서 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성을 감소시킴으로써 L-아미노산, 특히, L-글루탐산, L-발린 및 L-알라닌의 생산능이 증가함을 밝혔고 이로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 제공하는 것이고 여기서, 당해 코리네형 세균은 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성이 감소되도록 변형되고 당해 L-아미노산은 중간체로서 피루브산을 사용하는 생합성 경로에 의해 생성되는 하나 이상의 L-아미노산이다.

본 발명의 추가의 목적은, 염색체 아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자의 암호화 영역 또는 발현 조절 영역으로 돌연변이를 도입함에 의해 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성이 감소된 상기 코리네형 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 염색체 아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자를 파괴시킴에 의해 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성이 감소된 상기 코리네형 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 아세틸-CoA 하이드롤라제가 하기의 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 상기 코리네형 세균을 제공하는 것이다:

(A) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및

(B) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에서 하나 이상의 아미노산이 치환되거나 결실되거나 삽입되거나 부가된, 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성을 갖는 단백질.

본 발명의 추가의 목적은, 아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자가 하기의 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 코리네형 세균을 제공하는 것이다:

(a) 서열번호 23의 1037번 내지 2542번의 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자; 및

(b) 서열번호 23의 1037번 내지 2542번의 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 당해 폴리뉴클레오타이드로부터 제조된 프로브와 엄중 조건하에서 하이브리드화할 수 있고 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.

본 발명의 추가의 목적은, 글루탐산 데하이드로게나제 활성이 증가되도록 추가로 변형된 코리네형 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, L-아미노산이 L-글루탐산, L-아르기닌, L-글루타민, L-프롤린, L-알라닌, L-발린 및 L-라이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 L-아미노산인 코리네형 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은,

배지에서 상기 코리네형 세균을 배양하는 단계 및

중간체로서 피루브산을 사용하는 생합성 경로에 의해 생성된 하나 이상의 L-아미노산을 배지로부터 수거하는 단계
를 포함하는 L-아미노산의 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 상기 방법에 있어서, L-아미노산이 L-글루탐산, L-아르기닌, L-글루타민, L-프롤린, L-알라닌, L-발린 및 L-라이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산인 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 플라스미드 pBS3을 작제하는 과정을 도시한 것이다.

도 2는 플라스미드 pBS4를 작제하는 과정을 도시한 것이다.

도 3은 플라스미드 pBS5T를 작제하는 과정을 도시한 것이다.

도 4는 플라스미드 pΔldh56-1를 작제하는 과정을 도시한 것이다.

도 5는 플라스미드 pBS4S::Δach를 작제하는 과정을 도시한 것이다.

이후 부터는 본 발명의 양태를 상세하게 기술할 것이다.

<1> 중간체로서 피루브산을 사용하는 생합성 경로에 의해 생성된 L-아미노산을 생산하는 능력을 갖는 코리네형 세균

본 발명에서, 코리네형 세균의 예는 통상적인 코리네형 세균을 포함하고 또한 브레비박테리움(Brevibacterium) 속으로 분류되었었지만 현재는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속으로 분류되는 세균(문헌참조: Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)) 및 코리네박테리움 세균에 매우 밀접한 브레비박테리움 세균을 포함한다. 당해 코리네형 세균의 예는 다음의 세균을 포함한다:

코리네박테리움 아세토액시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum)

코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum)

코리네박테리움 알카노리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum)

코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae)

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)

코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium)

코리네박테리움 멜라쎄콜라(Corynebacterium melassecola)

코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes)(코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens))

코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis)

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum)

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)

브레비박테리움 임마리오필럼(Brevibacterium immariophilum)

브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) (코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum))

브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum)

브레비박테리움 사카로리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum)

브레비박테리움 티오게니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis)

브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes)

브레비박테리움 알붐(Brevibacterium album)

브레비박테리움 세리눔(Brevibacterium cerinum)

마이크로박테리움 암모니아필럼(Microbacterium ammoniaphilum).

코리네형 세균의 특정 예는 다음과 같다:

코리네박테리움 아세토액시도필럼 ATCC13870

코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806

코리네박테리움 알카노리티쿰 ATCC21511

코리네박테리움 칼루내 ATCC15991

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060, ATCC13869

코리네박테리움 릴리움 ATCC15990

코리네박테리움 멜라쎄콜라 ATCC17965

코리네박테리움 써모아미노게네스 AJ12340 (FERM BP-1539)

코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC13868

브레비박테리움 디바리카툼 ATCC14020

브레비박테리움 플라붐 ATCC13826, ATCC14067, AJ12418 (FERM BP-2205)

브레비박테리움 임마리오필럼 ATCC14068

브레비박테리움 락토퍼멘툼 (코리네박테리움 글루타미쿰) ATCC13869

브레비박테리움 로세움 ATCC13825

브레비박테리움 사카로리티쿰 ATCC14066

브레비박테리움 티오게니탈리스 ATCC19240

브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC6871, ATCC6872

브레비박테리움 알붐 ATCC15111

브레비박테리움 세리눔 ATCC15112

마이크로박테리움 암모니아필럼 ATCC15354

이들 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)으로부터 입수할 수 있다. 즉, 균주 각각은 ATCC의 카탈로그에 등재된 고유 등록번호가 부여되어 있다. 균주는 당해 등록 번호를 사용하여 주문될 수 있다. AJ12340 균주는 부다페스트 조약하에 1989년 10월 27일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)(현재, 국제 특허 생물 기탁기관인 고등생명공학공업기술 국립연구소)(International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(주소: 우편번호 305-5466, 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 1고 쓰쿠바 센트랄 6)에 기탁되었고 기탁번호 FERM BP-1539를 부여받았다. AJ12418 균주는 부다페스트 조약하에 1989년 1월 5일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 기탁되어 기탁번호 FERM BP-2205를 부여받았다.

"중간체로서 피루브산을 사용한 생합성 경로에 의해 생성된 L-아미노산"은 바람직하게 피루브산으로부터 유래된 탄소 골격을 갖고 있는 것들을 의미한다. 당해 L-아미노산의 예는 L-글루탐산, L-아르기닌, L-글루타민, L-프롤린, L-알라닌, L-발린 및 L-라이신을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "중간체로서 피루브산을 사용하는 생합성 경로에 의한 L-아미노산의 생산능은" 본 발명의 코리네형 세균이 배지에서 배양되는 경우 상기된 L-아미노산 하나 이상을 축적시키는 능력을 의미한다.

L-아미노산의 생산능은 야생형 코리네형 세균의 고유 능력이거나 개량에 의해 부여된 능력일 수 있다. 추가로, L-아미노산의 생산능은 이후에 기술되는 바와 같이 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성을 감소시키는 변형에 의해 부여될 수 있다.

L-아미노산 생산능을 부여하기 위해, 코리네형 세균을 개량하는데 사용되는 통상적인 방법, 예를 들어, 대사 조절 돌연변이 균주의 작제 또는 표적 물질의 생합성 효소의 활성을 증진시키는 재조합 균주의 작제(문헌참조: "Amino Acid Fermentation", Center for Academic Publications Japan Co., Ltd., 1st ed. published on May 30, 1986, p.77 to 100) 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법에서, 대사 조절 돌연변이의 도입 방법 및 표적 물질 생합성 효소의 증진 방법이 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 추가로, 2개 이상의 돌연변이가 도입될 수 있고 2개 이상의 효소 활성이 증진될 수 있다.

L-글루탐산 생산능을 부여하기 위한 방법의 예는 L-글루탐산 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증진시키는 것이다. L-글루탐산 생합성에 관여하는 효소의 예는 글루타메이트 데하이드로게나제, 글루타민 신테타제, 글루타메이트 신테타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 아코니테이트 하이드라타제, 시트레이트 신타제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 피루베이트 카복실라제, 피루베이트 데하이드로게나제, 피루베이트 키나제, 포스포에놀피루베이트 신타제, 에놀라제, 포스포글리세로뮤타제, 포스포글리세레이트 키나제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 프럭토스 비스포스페이트 알돌라제, 포스포프럭토키나제 및 글루코스 포스페이트 이소머라제를 포함한다.

이들 유전자의 발현 증진은 당해 유전자를 포함하는 DNA 단편을, 코리네형 세균에서 자가 복제할 수 있는 적당한 플라스미드로 삽입하고 수득한 플라스미드로 세균 세포를 형질전환시키거나; 상동성 재조합, 접합, 전이에 의해 당해 유전자를 염색체로 통합시키거나(EP0756007B, EP0332488A EP0771879A); 돌연변이를 당해 유전자의 프로모터 영역에 도입 (WO/0018935)하거나 강한 프로모터로 대체함에 의해 성취될 수 있다.

상기된 유전자가 플라스미드에 의해 도입되거나 염색체로 통합되는 경우, 유전자 발현용 프로모터는 코리네형 세균에서 작용할 수 있는 한 임의의 프로모터일 수 있다. 당해 프로모터의 예는 lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, PS2 프로모터, 및 pL 프로모터를 포함한다. 유전자 각각에 대한 고유 프로모터가 또한 사용될 수 있다.

시트레이트 신테타제 유전자, 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자 및/또는 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자의 발현이 증진되도록 변형된 미생물의 예는 JP2001-333769A (EP1078989A), JP2000-106869A (EP955368A), JP2000-189169A (EP952221A), 및 JP2001-333769A (EP1078989A)에 기재된 미생물들을 포함한다.

L-글루탐산 생산능을 부여하기 위한 변형은 또한 L-글루탐산 이외의 화합물의 합성을 촉매하는 효소의 활성을 감소시키거나 제거하는 것 및 L-글루탐산 생합성 경로로부터의 분기를 차단하는 것을 포함한다. 당해 효소의 예는 이소시트레이트 리아제, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제, 포스포트랜스아세틸라제, 아세테이트 키나제, 아세토하이드록시산 신타제, 아세토락테이트 신타제, 포르메이트 아세틸트랜스퍼라제, 락테이트 데하이드로게나제 및 글루타메이트 데카복실라제를 포함한다.

상기된 효소의 활성을 감소시키거나 제거하기 위해, 효소 활성을 감소시키거나 결손시키는 돌연변이 또는 결실이 염색체상의 효소 유전자들에 도입될 수 있다. 이것은 예를 들어, 염색체상의 효소를 암호화하는 유전자를 파괴시키거나 유전자의 프로모터 및/또는 샤인 달가노(Shine Dargarno)(SD)와 같은 발현 조절 서열을 변형시킴에 의해 성취될 수 있다. 추가로, 당해 효소의 활성은 아미노산 대체를 유발하는 미스센스 돌연변이, 종료 코돈을 생성하는 넌센스 돌연변이 또는 암호화 영역으로 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드를 첨가하거나 이를 결실시키는 프레임 시프트(frameshift) 돌연변이를 도입함에 의해 또는 유전자의 일부를 결실시킴에 의해 감소되거나 제거될 수 있다(문헌참조: Journal of biological Chemistry 272:8611-8617 (1997)). 추가로, 당해 효소의 활성은 결실된 암호화 영역을 갖는 돌연변이 효소를 암호화하는 유전자를 작제하고 상동성 재조합에 의해 염색체 유전자를 수득한 유전자로 대체함에 의해 감소되거나 제거될 수 있다. α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 감소된 코리네형 세균의 예는 JP7-834672A 및 JP06-237779에 기재된 균주를 포함한다.

추가로, L-글루탐산 생산능을 부여하는 방법의 예는 yggB 유전자를 암호화하는 유전자의 발현을 증진시키거나 돌연변이를 yggB 유전자 (NCgl 1221；NP_600492. Reports small-conductance...[gi:19552490]）로 도입하기 위해 균주를 변형시키는 방법을 포함한다(미국 특허원 제60/715131호).

L-글루탐산 생산능은 또한 유기산 유사체, 조절 억제제, 호흡 억제제 또는 슈퍼옥사이드 발생제에 내성인 균주를 스크리닝하거나 세포벽 합성의 억제제에 민감한 균주를 스크리닝함에 의해 부여될 수 있다. 당해 방법의 예는 벤조피론 또는 나프토퀴논에 대한 내성을 부여하는 방법(JP56-1889A), 모노플루오로아세트산에 대한 내성을 부여하는 방법 (JP 50-113209A), 아데닌 및 티민에 대한 내성을 부여하는 방법（JP57-065198）, HOQNO (JP56-140895A)에 대한 내성을 부여하는 방법, α-케토말론산에 대한 내성을 부여하는 방법 (JP57-2689A), 구아니딘에 대한 내성을 부여하는 방법 (JP56-35981A), 다우노미신 (JP58-158192A)에 대한 내성을 부여하는 방법 및 페니실린에 대한 내성을 부여하는 방법(JP04-88994A)을 포함한다.

당해 세균의 특정 예는 하기의 균주를 포함한다..

브레비박테리움 플라붐 AJ3949 (FERM BP-2632：JP 50-113209A)

코리네박테리움 글루타미쿰 AJ11628 (FERM P-5736；JP 57-065198A)

브레비박테리움 플라붐 AJ11355 (FERM P-5007; JP56-1889A)

코리네박테리움 글루타미쿰 AJ11355 (FERM P-5020; JP56-1889A)

브레비박테리움 플라붐 AJ11217 (FERM P-4318; JP57-2689A)

코리네박테리움 글루타미쿰 AJ11218 (FERM P-4319; JP57-2689A)

브레비박테리움 플라붐 AJ11564 (FERM P-5472; JP56-140895A)

브레비박테리움 플라붐 AJ11439 (FERM P-5136; JP56-35981A)

코리네박테리움 글루타미쿰 H7684 (FERM BP-3004; JP04-88994A)

브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ11426（FERM P5123 JP56-048890A）

코리네박테리움 글루타미쿰 AJ11440（FERM P5137 JP56-048890A）

브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ11796 (FERM P6402 JP58-158192A)

L-발린 생산능을 부여하는 방법의 예는 L-발린 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증진되도록 균주를 변형시키는 방법을 포함한다. L-발린 생합성 효소의 예는 ilvBNC 오페론의 유전자에 의해 암호화된 효소 즉, ilvBN에 의해 암호화된 아세토하이드록시산 신테타제 및 ilvC에 의해 암호화된 이소메로-리덕타제를 포함한다 (WO00/50624). ilvBNC 오페론은 L-발린, L-이소류신 및 L-류신의 배합에 의해 전사가 억제됨으로 생성물로서 L-발린에 의한 전사 억제를 피하기 위해 감쇠(attenuation)를 약화시키는 것이 바람직할 수 있다.

코리네형 세균에 L-발린 생성능의 부여는 L-발린의 생성을 감소시키는 반응을 촉매하는 하나 이상의 효소의 활성을 감소시키거나 제거함에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, L-발린 생산능은 L-류신 합성을 촉매하는 트레오닌 데하이드라타제의 활성을 감소시키거나 D-판토테네이트 합성을 촉매하는 효소의 활성을 감소시킴에 의해 부여될 수 있다(WO00/50624).

L-발린 생산능은 또한 코리네형 세균에 아미노산 유사체등에 대한 내성을 부여함으로써 부여될 수 있다.

예를 들어, L-이소류신 및 L-메티오닌에 대해 영양요구성이고 D-리보스, 퓨린 리보뉴클레오사이드 또는 피리미딘 리보뉴클레오사이드에 대해 내성인 L-발린 생산 돌연변이 균주(FERM P-1841, FERM P-29, JP-B-53-025034), 폴리케타이드에 내성인 L-발린 생산 돌연변이 균주 (FERM P-1763, FERM P-1764; JP-B006-065314), L-발린에 대해 내성이고 β-플루오로피루브산과 같은 피루브산 유사체에 대해 민감성인 L-발린 생산 돌연변이 균주(FERM BP-3006, BP-3007, Patent 3006929)가 사용될 수 있다.

L-알라닌 생산능을 갖는 코리네형 세균의 예는 H⁺-ATPase 활성이 결핍된 코리네형 세균 (Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Nov;57(4):534-40), 및 아스파르트산 β-데카복실라제를 암호화하는 구조 유전자가 증폭된 코리네형 세균 (JP-A-7-163383)을 포함한다.

L-아르기닌 생산능은 L-아르기닌 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증진되도록 코리네형 세균을 변형시켜 부여될 수 있다. L-아르기닌 생합성 효소의 예는 N-아세틸글루타밀 포스페이트 리덕타제 (argC), 오르니틴 아세틸 트랜스퍼라제 (argJ), N-아세틸글루타메이트 키나제 (argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제 (argD), 오르니틴 카바모일 트랜스퍼라제 (argF), 아르기니노숙신산 신테타제 (argG), 아르기니노숙신산 리아제 (argH), 및 카바모일 포스페이트 신테타제를 포함한다. 이들 아르기닌 생합성 효소는 Arg 오페론 (argCJBDFRGH)상에 존재하고 argR에 의해 암호화된 아르기닌 리프레서에 의해 조절된다(J Bacteriol. 2002 Dec;184(23):6602-14.). 따라서, 아르기닌 리프레서의 파괴는 Arg 오페론의 발현을 증가시킴에 따라서 L-아르기닌 생성 효소의 활성을 증진시킨다 (US2002-0045223,).

L-아르기닌 생산능을 부여하기 위한 또 다른 방법은 예를 들어, 아미노산 유사체에 대한 내성을 부여하는 것이다. 코리네형 세균의 예는 2-티아졸알라닌에 대해 내성이고 L-히스티딘, L-프롤린, L-트레오닌, L-이소류신, L-메티오닌, 또는 L-트립토판에 대해 영양요구성인 코리네형 세균 (JP-A-54-044096); 케토말론산, 플루오로말론산 또는 모노플루오로아세트산에 대해 내성인 코리네형 세균 (JP-A-57-18989); 아르기니놀에 대해 내성인 코리네형 세균 (JP-B-62-024075); 및 x-구아니딘 (여기서, x는 지방산 또는 지방족 쇄 유도체이다)에 대해 내성인 코리네형 세균 (JP-A-2-186995); 및 아르기닌 하이드록사메이트 및 6-아자우라실에 대해 내성인 코리네형 세균 (JP-A-57-150381)을 포함한다.

L-글루타민 생산능을 부여하기 위한 방법의 예는 L-글루타민 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증진되도록 코리네형 세균을 변형시키는 것이다. L-글루타민 생합성 효소의 예는 글루타민 신테타제 및 글루탐산 데하이드로게나제를 포함한다(US2003-0003550).

L-글루타민 생산능은 또한 L-글루타민 생합성 경로로부터 분기하여 기타 화합물을 생성시키는 반응을 촉매하는 효소의 활성을 감소시키거나 제거함에 의해 부여될 수 있다. 예를 들어, L-글루타민 생산능은 글루타미나제 활성을 감소시킴에 의해 부여될 수 있다(US2004-0152175).

L-글루타민 생산능은 또한 L-아미노산 유사체 내성을 부여함에 의해 부여될 수 있다. 당해 방법의 예는 6-디아조-5-옥소-노르류신에 대한 내성을 부여하는 방법 (JP-A-3-232497), 퓨린 유사체 및/또는 메티오닌 설폭사이드에 대해 내성을 부여하는 방법 (JP-A-61-202694), α-케토말론산에 대해 내성을 부여하는 방법 (JP-A-56-151495), 및 글루탐산 함유 펩타이드에 대한 내성을 부여하는 방법 (JP-2-186994)을 포함한다.

L-글루타민 생산 코리네형 세균의 특정 예는 하기의 균주를 포함한다.

브레비박테리움 플라붐 AJ11573 (FERM P-5492, JP56-161495A)

브레비박테리움 플라붐 AJ11576 (FERM BP-10381, JP56-161495A)

브레비박테리움 플라붐 AJ12212 (FERM P-8123, JP61-202694A)

브레비박테리움 플라붐 AJ12418 (FERM BP-2205, JP02-186994A)

브레비박테리움 플라붐 DH18 (FERM P-11116, JP03-232497A)

코리네박테리움 멜라쎄콜라 DH344 (FERM P-11117, JP3-232497A)

코리네박테리움 글루타미쿰 AJ11574 (FERM P-5493, JP56-151495A)

L-프롤린 생산능을 부여하는 방법의 예는 L-프롤린 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증진되도록 코리네형 세균을 변형시키는 방법을 포함한다. L-프롤린 생합성 효소의 예는 글루타메이트 키나제, γ-글루타밀 포스페이트 리덕타제 및 피롤린-5-카복실레이트 리덕타제를 포함한다(문헌참조: J Bacteriol. 1996 Aug;178(15):4412-9.).

L-프롤린 생산능은 또한 L-프롤린 생합성 경로로부터 분기시키는 반응 및 기타 화합물을 생성시키는 반응을 촉매하는 효소의 활성을 감소시키거나 제거함에 의해 부여될 수 있다. 예를 들어, L-프롤린 생산능은 오르니틴-아미노트랜스퍼라제 활성을 감소시킴에 의해 부여될 수 있다(J Bacteriol. 1996 Aug;178(15):4412-9.）.

한편, L-아르기닌, L-글루타민 및 L-프롤린은 탄소 골격으로서 L-글루탐산을 포함하여 이들 아미노산의 생산능은 상기된 L-글루탐산 생산 세균에서 L-글루탐산으로부터 각각의 L-아미노산을 생성시키는 반응을 촉매하는 효소를 암호화하는 유전자를 증폭시킴에 의해 부여될 수 있다.

추가로, L-알라닌은 L-아스파르트산의 β-탈카복실화에 의해 합성되기 때문에, L-알라닌 생산 세균은 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성이 감소되도록 L-아스파르트산 생산 세균을 변형시킴에 의해 수득될 수 있다.

L-라이신 생산능을 부여하거나 증진시키기 위한 개량은 다음과 같은 하나 이상의 돌연변이를 도입함에 의해 수행할 수 있다. 당해 인공 돌연변이체는 다음과 같다: S-(2-아미노에틸)시스테인 (이후부터 "AEC"로서 언급됨) 내성 돌연변이체; 성장을 위해 L-호모세린과 같은 아미노산 요구성인 돌연변이체(문헌참조: Japanese Patent Publication Nos. 4828078 and 566499); AEC에 내성이고 L-류신, L-호모세린, L-프롤린, L-세린, L-아르기닌, L-알라닌, L-발린등과 같은 아미노산 요구성인 돌연변이체(문헌참조: 미국 특허 제3,708,395호 및 제3,825,472호); DL-아미노 카프롤락탐, 아미노라우릴락탐, 아스파르트산 유사체, 설파 드럭, 퀴노이드 및 N-라우로일류에 대해 내성인 L-라이신 생산 돌연변이체; 및 옥살로아세테이트 데카복실라제 또는 호흡계 효소 억제제에 내성인 L-라이신-생산 돌연변이체(참조 일본 특허 공개 공보 제5053588호, 제5031093호, 제52102498호, 제539394호, 제5386089호, 제559783호, 제559759호, 제5632995호, 제5639778호, 일본 특허 공보 제5343591호, 제531833호); 이노시톨 또는 아세트산 요구성 L-라이신 생산 돌연변이(참조문헌: 일본 특허 공개 공보 제559784호, 제568692호); 플루오로피루브산 또는 34℃ 이상의 온도에 민감성인 L-라이신 생산 돌연변이체(문헌참조: 일본 특허 공개 공보 제5386090호); 에틸렌 글리콜에 내성인 브레비박테리움 또는 코리네박테리움의 L-라이신 생산 돌연변이체(문헌참조: 미국 특허 제4,411,997호).

L-라이신 생산능을 부여하기 위한 방법의 예는 L-라이신 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증진시키는 것이다. L-라이신 생합성에 관여하는 효소의 예는 디아미노피멜레이트 경로 효소, 예를 들어, 디하이드로디피콜리네이트 신타제 유전자 (dapA), 아스파르토키나제 유전자 (lysC), 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제 유전자 (dapB), 디아미노피멜레이트 데카복실라제 유전자 (lysA), 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제 유전자 (ddh) (당해 언급된 모든 유전자; International Publication No. 96/40934), 소프포에놀피루베이트 카복실라제 유전자 (ppc) (일본 특허원 제60-87788호), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 유전자 (aspC) (일본 특허 공보 제6-102028호), 디아미노피멜레이트 에피머라제 유전자 (dapF) (일본 특허원 제2003-135066호), 및 아스파르테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자 (asd) (International Publication No. 00/61723), 및 아미노아디페이트 경로 효소, 예를 들어, 호모아코니테이트 하이드라타제 유전자 (일본 특허원 제2000-157276호)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

추가로, 본 발명의 세균은 L-라이신의 생합성 경로로부터 분기하여 L-라이신 이외의 화합물을 합성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성이 감소될 수 있거나 당해 효소가 결핍된 것일 수 있다. L-라이신의 생합성 경로로부터 분기하여 L-라이신 이외의 화합물을 합성하는 반응을 촉매하는 효소는 호모세린 데하이드로게나제 및 라이신 데카복실라제를 포함한다. 당해 효소의 활성이 감소된 균주는 WO95/23864 및 WO 96/178930에 기재되어 있다.

<2> 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성을 감소시키기 위한 변형

본 발명의 코리네형 세균은 상기된 바와 같이 중간체로서 피루브산을 사용하는 생합성 경로에 의해 생성된 L-아미노산의 생산능을 갖고 아세틸-CoA 하이드롤라제(EC 3.1.2.1) 활성이 감소되도록 변형된다.

본 발명의 코리네형 세균은 중간체로서 피루브산을 사용하는 생합성 경로에 의해 생성된 L-아미노산의 생산능을 갖는 상기된 코리네형 세균을, 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성이 감소되도록 변형시킴에 의해 수득될 수 있다. 본 발명의 코리네형 세균을 개량시키는 경우, 세균에 L-아미노산 생산능을 부여하거나 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성이 감소되도록 세균을 변형시키는 것을 임의의 순서대로 수행할 수 있다.

"아세틸 -CoA 하이드롤라제 (ACH) 활성"은 아세틸-CoA와 H₂O로부터 아세트산의 생성을 촉매하는 활성을 언급한다. "아세틸-CoA 하이드롤라제 활성이 감소되도록 변형된"이란 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성이 야생형 코리네형 세균을 포함하는 비-변형된 균주에서 보다 낮다는 것을 의미한다. ACH 활성은 바람직하게 비-변형된 균주와 비교하여 단위 세포 중량당 50% 이하, 보다 바람직하게는 30% 이하, 보다 더 바람직하게는 10% 이하로 감소한다. 본원에서, 대조군으로서 작용하는 야생형 코리네형 세균은 예를 들어, 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) 2256 균주 (ATCC 13869) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032을 포함하고 비-변형된 균주는 브레비박테리움 락토퍼멘툼 1dh 균주를 포함한다. 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성은 문헌[Gergely, J., et al., (Gergely, J., Hele, P. & Ramkrishnan, C.V. (1952) J. Biol. Chem. 198 p323-334)]의 방법에 따라 측정할 수 있다. "감소"는 활성이 완전히 소멸된 경우를 포함한다. 본 발명의 코리네형 세균은 야생형 또는 비-변형된 균주 보다 적은 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성을 가져 야생형 또는 비-변형된 균주 보다 더 L-아미노산을 축적시키는 것이 바람직할 수 있다.

ACH의 예는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 및 하나 이상의 아미노산이 하나 이상의 위치에서 치환되거나 결실되거나 삽입되거나 첨가되고 ACH 활성을 유지하는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함한다. 본원에서 언급되는 "여러" 아미노산 잔기의 수가 단백질의 3차원 구조에서의 위치 또는 아미노산 잔기의 유형에 따라 상이할 수 있지만 바람직하게는 2 내지 20, 보다 바람직하게는 2 내지 10, 보다 더 바람직하게는 2 내지 5일 수 있다. ACH 유전자는 바람직하게, 서열번호 24의 아미노산 서열과 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 97% 이상 상동성을 가지면서 ACH 활성을 보유하고 있는 단백질을 암호화한다. 당해 ACH 동족체에서 아미노산의 치환은 바람직하게, ala의 ser 또는 thr로의 치환, arg의 gln, his 또는 lys로의 치환, asn의 glu, gln, lys, his 또는 asp로의 치환, asp의 asn, glu 또는 gln으로의 치환, cys의 ser 또는 ala로의 치환, gln의 asn, glu, lys, his, asp 또는 arg로의 치환, glu의 gly, asn, gln, lys 또는 asp로의 치환, gly의 pro로의 치환, his의 asn, lys, gln, arg 또는 tyr로의 치환, ile의 leu, met, val 또는 phe로의 치환, leu의 ile, met, val 또는 phe로의 치환, lys의 asn, glu, gln, his 또는 arg로의 치환, met의 ile, leu, val 또는 phe로의 치환, phe의 trp, tyr, met, ile 또는 leu로의 치환, ser의 thr 또는 ala로의 치환, thr의 ser 또는 ala로의 치환, trp의 phe 또는 tyr로의 치환, tyr의 his, phe 또는 trp로의 치환 및 val의 met, ile 또는 leu로의 치환을 포함하는 보존성 치환이다.

"아세틸-CoA 하이드롤라제 활성이 감소되도록 변형된"은 세포당 아세틸-CoA 하이드롤라제의 수가 감소하는 경우 및 분자당 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성이 감소하는 경우를 포함한다. 구체적으로, 당해 변형은 예를 들어, 염색체상의 아세틸-CoA 하이드롤라제를 암호화하는 유전자를 파괴시키거나 프로모터 및/또는 샤인-달가노(SD)와 같은 발현 조절 서열을 변형시킴에 의해 성취될 수 있다. 염색체상의 아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자는 예를 들어, 서열번호 23의 1037번 내지 2542번의 뉴클레오타이드를 포함하는 DNA를 포함한다. 추가로, 아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자는 예를 들어, PCR 방법에서 서열번호 7 및 8의 프라이머를 사용하여 수득가능한 DNA를 포함한다. 추가로, 염색체상의 아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자는 엄중 조건하에서 서열번호 23의 1037번 내지 2542번의 뉴클레오타이드 또는 당해 뉴클레오타이드로부터 제조될 수 있는 프로브와 하이브리드화할 수 있는 DNA일 수 있고 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성을 갖는 단백질을 암호화한다. "엄중 조건"은 소위 특이적 하이브리드가 형성되고 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 언급한다. 수치로서 당해 조건을 표현하기는 어렵지만, 당해 조건의 예는 세척이 60℃ 및 1 x SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1 x SSC, 0.1% SDS에 상응하는 염 농도에서 1회, 바람직하게는 2 또는 3회 수행되는 경우를 포함한다.

아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자 (이후부터 "ach 유전자"로서 언급함)는 코리네박테리움 글루타미쿰의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 서열번호 23, GenBank 승인번호 NC_003450의 NCgl2480 (NC_003450의 2729376번 내지 2730884번의 상보적 쇄))을 기준으로 합성 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 DNA를 주형으로서 사용하는 PCR을 수행함에 의해 클로닝할 수 있다. 추가로, 브레비박테리움 락토퍼멘툼과 같은 코리네형 세균 기원의 또 다른 뉴클레오타이드 서열이 또한 입수가능하다. 염색체 DNA는 예를 들어, 문헌[Saito and Miura (H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), "Biotechnology Experiments Handbook", ed. by The Society for Biotechnology Japan, p.97 to 98, Baifukan, 1992)]의 방법에 의해 DNA 공여체로서 코리네형 세균으로부터 제조할 수 있다.

따라서, 제조된 ach 유전자 또는 이의 일부는 염색체 ach유전자를 파괴시키는데 사용할 수 있다. 추가로, 염색체 ach 유전자를 파괴시키는데 사용되는 ach 유전자는 또한 표적 코리네형 세균상의 ach 유전자(예를 들어, 서열번호 23의 1037번 내지 2542번의 뉴클레오타이드를 갖는 유전자)와 상동성 재조합을 유발하기에 충분한 상동성을 갖는 유전자일 수 있다. 본원에서, 상동성 재조합을 유발하기에 충분한 상동성은 바람직하게 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상이다. 추가로, 엄중조건하에서 상기 언급된 유전자와 하이브리드화할 수 있는 DNA는 또한 유전자 파괴를 위해 사용될 수 있다.

ach 유전자는 예를 들어, ach 유전자의 일부 서열이 결실되어 정상적으로 작용하는 아세틸-CoA 하이드롤라제가 생성되지 않는 "결실형 ach 유전자"를 제조하고 결실형 ach 유전자와 염색체상의 ach 유전자가 재조합하도록 결실형 ach 유전자를 포함하는 DNA로 코리네형 세균을 형질전환시킴에 의해 파괴될 수 있다. 상동성 재조합을 사용한 유전자 치환에 의한 당해 유전자 파괴는 이미 확립되어 있고 선형 DNA를 사용하는 방법 또는 온도 민감성 복제 오리진(미국 특허 제6,303,383호 또는 JP-A-05-007491)을 함유하는 플라스미드를 사용하는 방법을 포함한다. 상동성 재조합을 사용한 유전자 치환에 의한 유전자 파괴는 또한 코리네형 세균에서 복제할 수 없는 플라스미드를 사용함에 의해 수행될 수 있다. 코리네형 세균에서는 복제할 수 없지만 에스케리치아 세균에서 복제할 수 있는 플라스미드가 바람직하게 사용된다. 당해 플라스미드의 예는 pHSG299 (Takara Bio) 및 pHSG399 (Takara Bio)를 포함한다.

염색체 ach 유전자는 예를 들어, sacB를 사용한 상동성 재조합에 의해 결실형 ach 유전자로 대체될 수 있다(문헌참조: Schafer, A. et al., Gene 145 (1994) 69-73). sacB 유전자는 레반 슈크라제를 암호화하고 염색체 표적 유전자가 돌연변이 유전자에 의해 대체되고 벡터 부분이 염색체로부터 소실된 균주를 효율적으로 선별하는데 사용된다.

처음에, 재조합 플라스미드는 결실형(돌연변이) ach 유전자, sacB 유전자 및 클로로람페니콜-내성 유전자와 같은 선별 마커를 온도 민감성 복제 오리진을 포함하는 플라스미드로 삽입함에 의해 제조한다. 수득된 플라스미드는 코리네형 세균의 숙주 균주로 도입한다. 레반 슈크라제가 코리네형 세균의 세포에서 발현되는 경우, 슈크로스 전환에 의해 생성된 레반은 세균에 치명적이고 따라서 세균은 슈크로스 함유 배지상에서 증식할 수 없다. 따라서, 슈크로스-함유 플레이트상에서 배양함에 의해, 플라스미드내 돌연변이 ach 유전자와 염색체 ach 유전자간에 치환이 일어나고 이로부터 플라스미드의 또 다른 부분이 세포로부터 소실된 균주를 선별할 수 있다.

sacB 유전자의 예는 다음을 포함한다.

바실러스 서빌러스(Bacillus subillus) ：sacB GenBank 승인번호 X02730 （서열번호 19）

바실러스 아밀로리쿠파시엔스(Bacillus amyloliqufaciens)：sacB GenBank 승인번호 X52988

자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)：sacB GenBank 승인번호 L33402

바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)：surB GenBank 승인번호 U34874

락토바실러스 샌프란시스센시스(Lactobacillus sanfranciscensis)：frfA GenBank 승인 번호 AJ508391

아세토박터 크실리누스(Acetobacter xylinus)：lsxA GenBank 승인 번호 AB034152

글루콘아세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus)：lsdA GenBank 승인 번호 L41732

형질전환은 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, DNA에 대한 투과성을 증가시키기 위해 수용 세포를 염화칼슘으로 처리하는 방법은 에스케리치아 콜리에 대해 보고되었고 (문헌참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), DNA를 도입하기 위해 증식하는 세포로부터 제조된 컴피턴트 세포를 사용하는 방법은 바실러스 서브틸리스에 대해 보고되었으며 (문헌참조: Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)) 당해 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법에 추가로, 원형질 또는 부분원형질형 수용 세포로 재조합 DNA를 도입하는 방법이 바실러스 서브틸리스, 액티노마이세테스 및 효모에 적용가능한 것으로 보고되었고 (문헌참조:Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)) 이러한 방법이 사용될 수 있다. 추가로, 코리네형 세균의 형질전환은 또한 전기 펄스 방법에 의해 수행될 수 있다 (문헌참조: Sugimoto et al., JP2-207791A).

코리네형 세균에 대한 온도 민감성 플라스미드의 예는 p48K 및 pSFKT2 (EP1038966), pHSC4 (France Patent Laid-open Publication No. 2667875, 1992 and JP5-7491A), pBS5T등을 포함한다. 코리네형 세균에서, 이들 플라스미드는 25℃의 온도에서 적어도 자발적으로 복제할 수 있지만 37℃의 온도에서는 자발적으로 복제할 수 없다. pHSC4를 함유하는 AJ12571 균주는 1991년 8월 26일자로 부다페스트 조약하에 기탁번호 FERM BP-3524로서 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)(현재, 국제 특허 생물 기탁기관인 고등생명공학공업기술 국립연구소)(International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(주소: 우편번호 305-5466, 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 1고 쓰쿠바 센트랄 6)에 기탁되었다.

형질전환체 균주를 온도 민감성 복제 오리진이 작용하지 않는 온도(예를 들어, 25℃)에서 배양하여 플라스미드가 도입된 균주를 수득한다. 이어서, 형질전환체를 고온에서 배양하여 온도 민감성 플라스미드를 제거하고 가나마이신과 같은 항생제를 함유하는 플레이트 배지상에 도말한다. 플라스미드가 제거된 균주가 당해 항생제를 함유하는 플레이트상에서 증식할 수 없지만 염색체 ach 유전자가 돌연변이 ach 유전자로 대체된 몇몇 균주는 증식하여 콜로니를 형성할 수 있다.

돌연변이 ach 유전자를 함유하는 재조합 DNA가 염색체 DNA로 통합된 균주에서, 재조합 DNA는 본래에 염색체상에 존재했던 ach 유전자와 재조합하고 염색체 ach 유전자와 돌연변이 ach 유전자의 융합 유전자는 재조합 DNA의 다른 일부(벡터 절편, 온도 민감성 복제 오리진 및 약물 내성 마커)가 융합 유전자 사이에 존재하도록 염색체로 삽입된다. 이어서, 염색체 DNA상에 돌연변이 ach 유전자만을 잔류시키기 위해, ach 유전자 1개 카피를 염색체 DNA로부터 벡터 절편(온도 민감성 복제 오리진 및 약물 내성 마커)과 함께 제거한다. 이 경우에, 정상적인 ach 유전자는 염색체 DNA상에 잔류하고 돌연변이 ach 유전자는 염색체 DNA로부터 절단되거나 반대로, 돌연변이ach 유전자가 염색체 DNA상에 잔류하고 정상적인 ach 유전자가 염색체 DNA로부터 절단된다. 이어서, 돌연변이 ach 유전자만이 염색체상에 잔류하는 균주는 PCR, 서던 하이브리드화 등에 의해 선별할 수 있다.

아세틸-CoA 하이드롤라제 활성의 감소는 또한 프로모터, 샤인-달가노(SD) 서열, 작동인자(operator), 종결인자 및 감쇠인자(attenuator)와 같은 발현 조절 서열을 변형시켜 성취할 수 있다. 염색체상의 발현 조절 서열은 Genetix와 같은 유전자 분석 소프트웨어에 의해, 프로모터 검색 벡터와 같은 발현 분석용 벡터 및 Genbank 데이터베이스와 같은 공지된 정보에 의해 동정될 수 있다. 예를 들어, 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성을 감소시키는 돌연변이의 예는 아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자의 프로모터 영역이 덜 강하게 변형된 돌연변이 및 아세틸-CoA 하이드롤라제의 프로모터 영역에서 컨센서스 서열이 파괴된 돌연변이를 포함한다. 당해 돌연변이는 숙주 세포에서 복제할 수 없는 온도 민감성 플라스미드 또는 자살 벡터를 사용함에 의해 도입될 수 있다.

아세틸-CoA 하이드롤라제 활성의 감소는 또한 염색체상의 아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자의 암호화 영역에 아미노산 치환을 도입(미스센스 돌연변이)하거나 종료 코돈을 도입하거나(넌센스 돌연변이) 하나 또는 2개의 뉴클레오타이드가 첨가되고 결실된 프레임 시프트 돌연변이를 도입하거나 유전자 일부를 결실시킴에 의해 성취될 수 있다 (문헌참조: Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617 (1997)).

아세틸-CoA 하이드롤라제 활성을 감소시키는 방법의 예는 코리네형 세균을 자외선 조사로 처리하거나 통상적인 돌연변이 처리에서 사용되는 돌연변이 유발제, 예를 들어, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 및 질산으로 처리하여 감소된 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성을 갖는 균주를 선별함을 포함한다(문헌참조: "Amino Acid Fermentation", Center for Academic Publications Japan Co., Ltd., 1st ed. published on May 30, 1986, p.77 to 100).

한편, 글루타메이트 데하이드로게나제(이후부터 "GDH"로 언급됨) 활성이 증진되도록 추가로 변형된 균주가 본 발명에 사용되는 것이 바람직하다.

L-아미노산 생산능을 갖고 ACH 활성이 감소되도록 변형된 코리네형 세균에서 GDH 활성을 증폭시키기 위해, GDH를 암호화하는 유전자 단편을 코리네형 세균에서 바람직하게 다중 카피형 벡터로 작용하는 벡터에 연결하여 재조합 DNA를 제조하고 코리네형 세균을 수득한 DNA로 형질전환시킨다. 형질전환체의 세포에서 GDH를 암호화하는 유전자 카피수가 증가함에 따라 GDH 활성이 증폭된다.

GDH를 암호화하는 유전자는 코리네형 세균으로부터 유래할 수 있거나 에스케리치아 콜리와 같은 기타 유기체로부터 유래할 수 있다.

코리네형 세균의 GDH를 암호화하는 유전자 (gdh 유전자)의 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 서열번호 25: Molecular Microbiology (1992) 6(3), 317-326 1999, a complementary strand of 2194739..2196082 of NC_003450)은 이미 동정되었고 따라서 gdh 유전자는 뉴클레오타이드 서열을 기초로 디자인된 프라이머 및 주형으로서 코리네형 세균의 염색체 DNA를 사용하는 PCR에 의해 수득될 수 있다 (PCR: 폴리머라제 연쇄 반응; White, T.J. et al.; Trends Genet. 5, 185 (1989)). 기타 미생물의 GDH를 암호화하는 유전자는 또한 동일한 방식으로 수득될 수 있다.

<3> 본 발명의 코리네형 세균을 사용한 L-아미노산의 생산

중간체로서 피루브산을 사용하여 생성된 L-아미노산은 상기된 바와 같이 수득된 코리네형 세균을 배지에서 배양하여 L-아미노산을 축적시키고 당해 배지로부터 L-아미노산을 수거함에 의해 효율적으로 생산될 수 있다.

본 발명의 코리네형 세균을 사용하여 당해 L-아미노산을 생산하기 위해, 탄소원, 질소원, 무기염 및 미량의 유기 영양물(예를 들어, 요구되는 경우 아미노산 및 비타민)을 함유하는 통상적인 배지를 사용한 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 합성 또는 천연 배지를 사용할 수 있다. 배양 배지에 사용되는 탄소원 및 질소원은 이들이 본 발명의 균주에 의해 사용될 수 있는 한 임의의 종류일 수 있다.

탄소원의 예는 글루코스, 글리세롤, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 만노스, 갈락토스, 전분 가수분해물 및 당밀과 같은 당을 포함한다. 추가로, 시트르산 및 말레이트와 같은 유기산 및 에탄올과 같은 알코올이 단독으로 또는 기타 탄소원과 배합하여 사용될 수 있다.

질소원의 예는 암모니아; 황산암모늄, 탄산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 및 암모늄 아세테이트와 같은 암모늄 염; 및 니트레이트를 포함한다.

미량으로 존재할 수 있는 유기 영양물의 예는 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 펩톤, 카사미노산 및 효모 추출물을 포함하고 이들 영양물을 함유하는 대두 단백질이 또한 사용될 수 있다. 증식을 위해 아미노산등을 요구하는 영양 요구성 돌연변이 균주를 사용하는 경우, 요구되는 영양물을 보충하는 것이 바람직할 수 있다.

무기염의 예는 포스페이트, 마그네슘 염, 칼슘 염, 철 염 및 망간 염을 포함한다.

호기 조건하에서 20 내지 45℃의 발효 온도에서 배양을 수행하고 pH 는 5 내지 9로 조정한다. PH가 배양동안에 감소하는 경우, 탄산칼슘 또는 암모니아 가스와 같은 알칼리를 중화를 위해 배지에 첨가할 수 있다. 약 10시간 내지 120시간의 배양은 상당한 양의 L-아미노산을 축적시킨다.

배양 종료 후 공지된 회수 방법을 사용하여 L-아미노산을 회수한다. 예를 들어, 배양액으로부터 세포를 제거한 후 농축 및 결정화에 의해 L-아미노산을 수거한다.

이후부터, 본 발명은 하기의 비제한적인 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다.

실시예 1

<1> sacB 유전자를 갖는 파괴 벡터의 작제

(A) pBS3의 작제

sacB 유전자 (서열번호 19)는 주형으로서 바실러스 서브틸리스의 염색체 DNA를 사용하고 프라이머로서 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 PCR에 의해 수득하였다. PCR은 하기와 같이 LA taq(제조원: TaKaRa)를 사용하여 수행하였다: 94℃에서 5분동안 열 보존 1회 및 94℃에서 30초동안 변성 25회, 49℃에서 30초동안 어닐링 및 72℃에서 2분동안 신장. 수득한 PCR 생성물을 통상적인 방법으로 정제한 다음 BglII 및 BamHI로 분해하여 평활 말단화시켰다. 당해 단편을 AvaII로 분해되어 평활 말단화된 pHSG299에 삽입하였다. 수득된 DNA를 사용하여 에스케리치아 콜리 JM109의 컴피턴트 세포(제조원: TAKARA BIO INC.)를 형질전환시켰다. 이어서, 형질전환된 세균 세포를 25㎍/ml의 카나마이신 (이후부터, "Km"으로서 약칭)을 함유하는 LB 한천 배지상에 도말하고 밤새 배양하였다. 이후, 단일 콜로니를 형질전환체로서 분리하였다. 플라스미드를 수득된 형질전환체로부터 추출하고 목적하는 PCR 생성물의 삽입체를 갖는 플라스미드를 pBS3으로 명명하였다. 도 1은 pBS3의 작제 과정을 보여준다.

(B) pBS4S의 작제

pBS3상의 카나마이신 내성 유전자에서 SmaI 인지 부위는 아미노산 치환을 유발하는 것 없이 교차(cross-over) PCR을 사용하는 뉴클레오타이드 치환에 의해 pBS3이 SmaI 엔도뉴클레아제에 의해 절단되지 않도록 변형시켰다. 우선, 주형으로서 pBS3을 사용하고 프라이머로서 서열번호 3 및 4의 합성 DNA를 사용하는 PCR을 수행하여 카나마이신 내성 유전자의 N-말단 단편을 수득하였다. 한편, 카나마이신 내성 유전자의 C-말단 단편을 수득하기 위해, 주형으로서 pBS3을 사용하고 프라이머로서 서열번호 5 및 6의 합성 DNA를 사용하는 PCR을 수행하였다. PCR은 하기와 같이 Pyrobest DNA 폴리머라제 (제조원: TAKARA BIO INC.)을 사용하여 수행하여 목적하는 PCR 생성물을 수득하였다: 5분동안 98℃에서 열 보존 1회; 및 98℃에서 10초동안 변성 25회, 57℃에서 30초동안 어닐링 및 72℃에서 1분동안 신장. 서열번호 4 및 5는 서로에 대해 부분적으로 상보적이고 SmaI 인지 부위를 함유하지 않는다. 이어서, SmaI 인지 부위가 없는 돌연변이 카나마이신 내성 유전자의 전장 단편을 수득하기 위해, 상기된 N 말단 및 C 말단 유전자 생성물을 실질적으로 동몰량으로 함께 혼합하였다. 주형으로서 유전자 생성물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 3 및 6의 합성 DNA를 사용하는 PCR을 수행하여 SmaI 부위 변형된 카나마이신 내성 유전자 단편을 수득하였다. PCR은 Pyrobest DNA 폴리머라제 (제조원: TAKARA BIO INC.)을 사용하여 하기와 같이 수행하여 목적하는 PCR 생성물을 수득하였다: 5분동안 98℃에서 열 보존 1회; 및 98℃에서 10초동안 변성 25회, 57℃에서 30초동안 어닐링 및 72℃에서 1.5분동안 신장.

PCR 생성물을 통상적인 방법으로 정제한 다음 BanII 로 분해하고 이어서 상기된 pBS3의 BanII 인지 부위로 삽입하였다. 수득한 플라스미드를 사용하여 에스케리치아 콜리 JM109의 컴피턴트 세포(제조원: Takara Bio)를 형질전환시켰다. 즉, 형질전환된 세균 세포를 25㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지상에 도말하고 밤새 배양하였다. 이후, 출현한 콜로니를 형질전환체로서 선택하였다. 플라스미드를 수득된 형질전환체로부터 분리하고 목적하는 PCR 생성물의 삽입체를 갖는 플라스미드를 pBS4S로 명명하였다. 도 2는 pBS4S를 작제하기 위한 과정을 보여준다.

(C) pBS5T의 작제

코리네형 세균에서 온도 민감성 복제 오리진을 BamHI 및 SmaI 으로 분해하고 평활 말단화시킴에 의해 pHSC4 (JP-A-5-7491)로부터 절개하고 pBS4S의 평활말단화된 NdeI 부위로 삽입하였다. 수득한 DNA를 사용하여, 에스케리치아 콜리 JM109(제조원: TAKARA BIO INC.)의 컴피턴트 세포를 형질전환시키고 25㎍/ml의 Km을 함유하는 LB 한천 배지상에 도말함에 이어서 밤새 배양하였다. 이어서, 단일 콜로니를 형질전환체로서 분리하였다. 플라스미드를 수득된 형질전환체로부터 추출하고 목적하는 PCR 생성물을 갖는 플라스미드를 pBS5T로 명명하였다. 도 3은 pBS5T의 작 제 과정을 보여준다.

실시예 2

< ldh-파괴된 균주의 작제 >

(A) 락테이트 데하이드로게나제 유전자를 파괴시키기 위한 단편의 클로닝

ORF가 결실된 브레비박테리움 락토퍼멘툼 2256 균주로부터 유래하는 락테이트 데하이드로게나제(이후부터 "ldh gene"로 약칭)를 함유하는 유전자 단편은 프라이머로서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주의 ldh 유전자의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 21: GenBank 데이터베이스 승인번호 NC_003450)을 기초로하여 디자인된 합성 DNA를 사용하는 교차 PCR에 의해 수득하였다. 구체적으로, PCR은 주형으로서 브레비박테리움 락토퍼멘툼 2256 균주의 염색체 DNA를 사용하고 프라이머로서 서열번호 7 및 8의 합성 DNA를 사용하는 통상적인 방법에 의해 수행하여 ldh 유전자의 N-말단 단편을 수득하였다. 한편, ldh 유전자의 C 말단 단편을 수득하기 위해, 주형으로서 브레비박테리움 락토퍼멘툼 2256의 염색체 DNA를 사용하고 프라이머로서 서열번호 9 및 10의 합성 DNA를 사용하는 통상적인 방법에 의해 PCR을 수행하였다. 서열번호 8 및 9는 서로가 상보적이고 ldh 유전자의 ORF의 전체 서열이 결실되도록 디자인한다.

이어서, 내부 서열이 결실된 ldh 유전자 단편을 수득하기 위해, ldh의 N-말단 및 C-말단 유전자 생성물을 실질적으로 동몰량으로 혼합하고 주형으로서 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 11 및 12의 합성 DNA를 사용하는 통상적인 방법에 의해, PCR을 수행하였다. 통상적인 방식으로 PCR 생성물을 정제한 후, PCR 생성물을 SalI로 분해시켰다. 이후, PCR 생성물을 상기된 pBS4S의 SalI 부위에 삽입하였다. 수득된 DNA로 에스케리치아 콜리의 컴피턴트 세포 (제조원: TAKARA BIO INC.)를 형질전환시키고 100 μM IPTG, 40㎍/ml X-Gal 및 25㎍/ml Km를 함유하는 LB 한천 배지상에 도말함에 이어서 밤새 배양하였다. 이후, 단일 콜로니를 형질전환체로서 분리하였다. 플라스미드를 수득된 형질전환체로부터 추출하고 목적하는 PCR 생성물의 삽입체를 갖는 플라스미드를 pΔldh56-1로 명명하였다. 도 4는 플라스미드의 작제 과정을 보여준다.

(B) ldh-파괴된 균주의 작제

상기 항목(A)에서 작제된 pΔldh56-1은 코리네형 세균에서 자발적 복제를 가능하게 하는 영역을 함유하지 않기 때문에, 코리네형 세균이 당해 플라스미드로 형질전환되는 경우 상동성 재조합에 의해 염색체로 혼입된 플라스미드를 갖는 형질전환체 균주는 극히 낮은 빈도로 나타난다. 따라서, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 2256 균주는 전기 펄스 방법에 의해 고농도의 플라스미드 pΔldh56-1를 함유하는 용액을 사용하여 형질전환시킴에 이어서 25㎍/ml 카나마이신을 함유하는 CM-Dex 한천 배지(5g/L 글루코스, 10 g/L 폴리펩톤, 10 g/L 효모 추출물, 1 g/L KH₂PO₄, 0.4 g/L MgSO₄?7H₂O, 0.01 g/L FeSO₄?7H₂O, 0.01 g/L MnSO₄?7H₂O, 3 g/L 우레아, 1.2 g/L 대두 가수분해물, 및 pH 7.5 (KOH))상에 도말하고 약 30시간동안 31.5℃상에서 배양하였다. 당해 배지상에 나타난 콜로니는 플라스미드의 ldh 유전자 단편과 브레비박테리움 락토퍼멘툼 2256 균주의 염색체상의 ldh 유전자 간에 상동성 재조합이 유발되고 당해 플라스미드로부터 유래하는 카나마이신 내성 유전자와 SacB 유전자가 염색체로 삽입된 균주이다.

이어서, 당해 제1 재조합체를 하루밤 동안 31.5℃에서 카나마이신을 함유하지 않는 CM-Dex 액체 배지에서 배양하였다. 적당한 희석 후, 재조합체를 10% 슈크로스 함유 Dex-S10 한천 배지(10 g/L 슈크로스, 10 g/L 폴리펩톤, 10 g/L 효모 추출물, 1 g/L KH₂PO₄, 0.4 g/L MgSO₄?7H₂O, 0.01 g/L FeSO₄?7H₂O, 0.01 g/L MnSO₄?4H₂O, 3 g/L 우레아, 1.2 g/L 대두 가수분해물, 10㎍/L 비오틴, 및 pH 7.5 (KOH)) 상에 도말하고 약 30시간동안 31.5℃에서 배양하였다. 결과로서, 제2 재조합에 의해 sacB 유전자가 소실되고 슈크로스 비감수성이 된 50개의 균주를 수득하였다.

따라서, 수득된 균주는 염색체 ldh 유전자가 pΔldh56-1로부터 유래하는 돌연변이형에 의해 대체된 균주 및 염색체 야생형 ldh, 유전자가 잔류하는 균주를 포함한다. ldh 유전자가 돌연변이형 또는 야생형인지의 여부는 Dex-S10 한천 배지에서 배양함에 의해 수득된 세포를 PCR함에 의해 용이하게 조사되었다. ldh 유전자를 분석하기 위한 PCR 증폭용의 프라이머(서열번호 7 및 10)를 사용하고, 주형으로서 야생형 2256 균주의 염색체 DNA를 사용하여 증폭된 야생형 ldh 유전자보다 PCR 생성물이 작은 균주를 ldh 파괴된 균주로서 선별하였고 2256Δ(ldh) 균주로서 명명하였다. 당해 균주는 하기의 ach 유전자 파괴된 균주를 작제하기 위한 모균주로서 사용하였다.

혐기적 조건하에서 발효가 수행되는 경우 상당량의 락트산이 부산물로서 축적되고 따라서 락테이트 데하이드로게나제 활성이 결핍인 것이 바람직할 수 있다 (문헌참조: JP11-206385; J Mol Microbiol Biotechnol. 2004;7(4):182-96.) 그러나, L-글루탐산은 통상적으로 락테이트 데하이드로게나제가 작용하지 않는 호기적 조건하에서 생성되고 L-글루탐산 생산을 위해 아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자 파괴된 균주에서 ldh 유전자를 파괴시킬 필요가 없다.

실시예 3

<아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자 파괴된 균주의 작제 >

(A) 아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자를 파괴시키기 위한 단편의 클로닝

ORF가 결실된 브레비박테리움 락토퍼멘툼 2256 균주로부터 유래하는 아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자(이후부터 유전자를 "ach"로 언급함)를 함유하는 유전자 단편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 유전자의 뉴클레오타이드 서열(서열번호23: GenBank 데이터베이스 승인 번호 NC_003450)을 기초로 하여 디자인된 합성 DNA를 사용하는 교차 PCR에 의해 수득하였다. 구체적으로, 주형으로서 브레비박테리움 락토퍼멘툼 2256 균주의 염색체 DNA를 사용하고 프라이머로서 서열번호 13 및 14의 합성 DNA를 사용하는 통상적인 방법에 의해 PCR을 수행하여 ach 유전자의 C-말단 단편을 수득하였다. 한편, N-말단 단편을 수득하기 위해, 주형으로서 브레비박테리움 락토퍼멘툼 2256 균주의 염색체 DNA를 사용하고 프라이머로서 서열번호 15 및 16의 합성 DNA를 사용하는 통상적인 방법에 의해 PCR을 수행하였다. 서열번호 14 및 15는 서로가 부분적으로 상보적이었다. PCR 반응은 KOD-플러스(제조원: TOYOBO Co., LTD.)을 사용하여 수행하였다. 94℃에서 2분동안 1회 체류를 수행한 후, 하기의 과정을 30회 반복하였다: 10초동안 94℃에서 변성, 30초동안 55℃에서 어닐링 및 50초동안 68℃에서 신장. 이어서, 내부 서열이 결실된 ach 유전자를 수득하기 위해, ach 유전자의 N-말단 단편 및 C-말단 단편을 실질적으로 동몰량으로 함께 혼합하였다. 주형으로서 혼합물을 사용하고 프라이머로서 서열번호 17 및 18의 합성 DNA를 사용하는 통상적인 방법에 의해 PCR을 수행하였다. KOD-플러스(제조원: TOYOBO Co., LTD.)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 2분동안 94℃에서 2분동안 1회 체류를 수행한 후, 하기의 과정을 30회 반복하였다: 10초동안 94℃에서 변성, 30초동안 55℃에서 어닐링 및 90초동안 68℃에서 신장. 통상적인 방법에 의해 증폭된 PCR 생성물을 정제한 후, PCR 생성물을 XbaI로 분해시키고 상기 실시예 1(B)에서 작제된 pBS4S의 XbaI 부위에 삽입하였다. 수득한 DNA를 사용하여, 에스케리치아 콜리 JM109의 컴피턴트 세포(제조원: TAKARA BIO INC.)를 형질전환시키고 100 μM IPTG, 40 ㎍/ml X-Gal,및 25㎍/ml Km을 함유하는 LB 배지상에 도말함에 이어서 밤새 배양하였다. 이후, 단일 백색 콜로니를 형질전환체로서 분리하였다. 플라스미드를 형질전환체로부터 추출하고 목적하는 PCR 생성물의 삽입체를 갖는 하나를 pBS4S::Δach로 명명하였다. 도 5는 pBS4S::Δach을 작제하는 과정을 보여준다.

(B) ach-파괴된 균주의 작제

상기 (A)에서 작제된 pBS4S::Δach은 코리네형 세균에서 자발적 복제를 가능하게 하는 영역을 함유하지 않기 때문에, 코리네형 세균이 당해 플라스미드로 형질전환되는 경우 상동성 재조합에 의해 염색체로 혼입된 플라스미드를 갖는 형질전환체 균주는 극히 낮은 빈도로 나타난다. 따라서, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 2256Δ(ldh) 균주는 전기 펄스 방법에 의해 고농도의 플라스미드 pBS4S::Δach를 함유하는 용액을 사용하여 형질전환시킴에 이어서 25㎍/ml 카나마이신을 함유하는 CM-Dex 한천 배지상에 도말하고 약 30시간동안 31.5℃상에서 배양하였다. 당해 배지상에 나타난 균주는 플라스미드의 결실형 ach 유전자 단편과 브레비박테리움 락토퍼멘툼 2256Δ(ldh) 균주의 염색체상의 ach 유전자 간에 상동성 재조합이 유발되고 당해 플라스미드로부터 유래하는 카나마이신 내성 유전자와 SacB 유전자가 염색체로 삽입된 균주이다.

이어서, 당해 제1 재조합체를 하루밤 동안 31.5℃에서 카나마이신을 함유하지 않는 CM-Dex 액체 배지에서 배양하였다. 적당한 희석 후, 재조합체를 10% 슈크로스 함유 Dex-S10 한천 배지상에 도말하고 약 30시간동안 31.5℃에서 배양하였다. 결과로서, 제2 재조합에 의해 sacB 유전자가 염색체로부터 소실되고 슈크로스 비감수성이 된 50개의 균주를 수득하였다.

따라서, 수득된 균주는 염색체 ach 유전자가 pBS4S::Δach 로부터 유래하는 돌연변이형에 의해 대체된 균주 및 염색체 야생형 ach 유전자가 잔류하는 균주를 포함한다. ach 유전자가 돌연변이형 또는 야생형인지의 여부는 Dex-S10 한천 배지에서 배양함에 의해 수득된 세포를 PCR함에 의해 용이하게 조사되었다. ach 유전자 분석시 프라이머(서열번호 13 및 16)를 사용하여, 야생형 ach 유전자에 대한 2.9kb DNA 단편 및 돌연변이형 ach 유전자에 대한 1.4kb의 DNA 단편을 증폭시켰다. 상기 방법에 의한 슈크로스 비민감성 균주의 분석 결과로서 단지 돌연변이형 ach 유전자를 함유하는 균주를 선별하였고 2256Δ(ldh) 균주로부터 수득한 ach 파괴된 균주를 2256Δ(ldh, ach) 균주로 명명하였다.

실시예 4

<ach-파괴된 균주에 의한 L-글루탐산의 생산 >

(1) ach-파괴된 균주의 L-글루탐산 생산능에 대한 평가

브레비박테리움 락토퍼멘툼 2256Δ(ldh) 균주 및 2256Δ(ldh, ach) 균주를 하기와 같은 S형 발효조에서 L-글루탐산 생산을 위해 배양하였다. CMDex 한천 플레이트상에 배양된 2256Δ(ldh) 균주 및 2256Δ(ldh, ach) 균주 각각의 1개 백금이 분량을 종균 배지(정제수 1리터당 60 g 글루코스, 1.54 g H₃PO₄, 1.45 g KOH, 0.9 g MgSO₄ ?7H₂O, 0.01 g FeSO₄?7H₂O, 670 ㎍ VB1?HCl, 40 ㎍ 비오틴, 1.54 g의 대두 가수분해물, 0.28 g의 DL-메티오닌, 0.1 ml AZ-20R (암모니아수로 pH 7.2로 조정됨)) 300ml에 접종하고 잔류 당이 완전히 고갈될때까지 1/1vvm의 통기와 함께 pH 7.2(NH₃), 31.5℃의 온도 및 PL>0로 조절하면서 배양하였다.

30 ml의 배양액을 270ml의 본배양 배지(정제수 1리터당 80 g 글루코스, 3.46 g KH₂PO₄, 1g MgSO₄?7H₂O, 0.01g FeSO₄?7H₂O, 0.01 g MnSO₄?4-5H₂O, 230 ㎍ VB1?HCl, 0.35 g 대두 가수분해물 및 0.2 ml AZ-20R (암모니아로 pH 7.3으로 조정함)) 에 접종하고 1/1vvm의 통기와 함께 pH 7.3, 31.5℃의 온도 및 PL>0로 조절하면서 배양하였다. 잔류 당이 완전히 소모되기 전에, 정제수 1L당 500g의 글루코스 및 0.2ml의 AZ-20R로 이루어진 70 내지 80 ml의 영양액을 첨가하고 잔류 당이 완전히 소모될때까지 배양을 계속하였다.

배양을 종결한 후, 배양액을 적당히 희석한 후 배양액에 축적된 L-글루탐산 (Glu)의 양을 Biotech 분석기 AS210 (제조원: Asahi Kasei Corporation.)에서 분석하였다. 표 1은 당해 결과를 보여준다.

2256Δ(ldh, ach) 균주는 2256Δ(ldh) 균주 (모균주)와 비교하여 수율이 약 2% 개선되었음을 보여주었다. 추가로, 축적된 L-글루탐산의 전구체인 α-케토글루타레이트 (α-KG)의 양은 약 3배 개선되었다. 당해 결과는 ACH 활성을 감소시키거나 제거하는 것이 L-글루탐산의 생산에 효과적임을 보여준다.

실시예 5

<ach-결핍 균주에 의한 L-알라닌 및 L-발린의 생산 >

(1) ach-결핍 균주의 배양물에 대한 평가

브레비박테리움 락토퍼멘툼 2256Δ(ldh) 균주 및 2256Δ(ldh, ach) 균주를 하기와 같은 S형 발효조에서 L-알라닌 및 L-발린 생산을 위배 배양하였다. CMDex 한천 플레이트상에 배양된 2256Δ(ldh) 균주 및 2256Δ(ldh, ach) 균주 각각의 1개 백금이 분량을 종균 배지(정제수 1리터당 60 g 글루코스, 1.54 g H₃PO₄, 1.45 g KOH, 0.9 g MgSO₄ ?7H₂O, 0.01 g FeSO₄?7H₂O, 670 ㎍ VB1?HCl, 40 ㎍ 비오틴, 1.54 g의 대두 가수분해물, 0.28 g의 DL-메티오닌, 0.1 ml AZ-20R (암모니아수로 pH 7.2로 조정됨)) 300ml에 접종하고 잔류 당이 완전히 고갈될 때까지 1/1vvm의 통기와 함께 암모니아를 사용한 pH 7.2의 조절, 31.5℃의 온도 및 PL>0로 조절하면서 배양하였다.

30 ml의 배양액을 270ml의 본배양 배지(정제수 1리터당 80 g 글루코스, 3.46 g KH₂PO₄, 1 g MgSO₄?7H₂O, 0.01 g FeSO₄?7H₂O, 0.01 g MnSO₄?4-5H₂O, 230 ㎍ VB1?HCl, 0.35 g 대두 가수분해물 및 0.2 ml AZ-20R (암모니아로 pH 7.3으로 조정함)) 에 접종하고 1/1vvm의 통기와 함께 pH 7.3, 31.5℃의 온도 및 PL>0로 조절하면서 배양하였다. 잔류 당이 완전히 소모되기전에, 정제수 1L당 500g의 글루코스 및 0.2ml의 AZ-20R로 이루어진 70 내지 80 ml의 영양액을 첨가하고 잔류 당이 완전히 소모될때까지 배양을 계속하였다.

배양을 종결한 후, 배양액을 적당히 희석한 후 배양액에 축적된 L-알라민(Ala) 및 L-발린(Val)의 양을 아미노산 분석기 L8500 (제조원: Hitachi, Ltd)에서 분석하였다. 표 2는 당해 결과를 보여준다.

2256Δ(ldh, ach) 균주는 축적된 L-알라닌의 양에 대해 2.2배 개선되었고 축적된 L-발린의 양에 대해 약 4배 개선되었음을 보여주었다. 당해 결과는 ACH 활성을 감소시키거나 제거하는 것이 L-발린 및 L-알라닌의 생산에 효과적임을 보여준다.

본 발명에 따라, 중간체로서 피루브산을 사용하는 생합성 경로에 의해 생성되는 L-아미노산의 발효 수율이 개선된다.

<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> L-AMINO ACID-PRODUCING BACTERIUM AND A METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACID <130> C537-C5225 <150> JP2004-340187 <151> 2004-11-25 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cgggatcctt tttaacccat caca 24 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gaagatcttc aaaaggttag gaatacggt 29 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccttttgaag atcgaccagt tgg 23 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tacctggaat gctgttttcc cagggatcgc agtggtgagt aacc 44 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cctgggaaaa cagcattcca ggtattag 28 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgcaggtcga ctctagagga tcc 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cactgcacgg ccctgcgaac 20 <210> 8 <211> 42 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Ile Ile Asp Ala Lys Gly Ser Thr Ser Tyr Gly Ile 225 230 235 240 ggc atg ggt ctt gct cgc atc acc cgc gca atc ctg cag aac caa gac 1665 Gly Met Gly Leu Ala Arg Ile Thr Arg Ala Ile Leu Gln Asn Gln Asp 245 250 255 gtt gca gtc cca gtc tct gca ctg ctc cac ggt gaa tac ggt gag gaa 1713 Val Ala Val Pro Val Ser Ala Leu Leu His Gly Glu Tyr Gly Glu Glu 260 265 270 gac atc tac atc ggc acc cca gct gtg gtg aac cgc cga ggc atc cgc 1761 Asp Ile Tyr Ile Gly Thr Pro Ala Val Val Asn Arg Arg Gly Ile Arg 275 280 285 cgc gtt gtc gaa cta gaa atc acc gac cac gag atg gaa cgc ttc aag 1809 Arg Val Val Glu Leu Glu Ile Thr Asp His Glu Met Glu Arg Phe Lys 290 295 300 cat tcc gca aat acc ctg cgc gaa att cag aag cag ttc ttc taa 1854 His Ser Ala Asn Thr Leu Arg Glu Ile Gln Lys Gln Phe Phe 305 310 315 atctttggcg cctagttggc gacgcaagtg tttcattgga acacttgcgc tgccaacttt 1914 ttggtttacg ggcacaatga aactgttgga tggaatttag agtgtttgta gcttaaggag 1974 ctcaaatgaa tgagtttgac caggacattc tccaggagat caagactgaa ctcgacgagt 2034 taattctaga 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Gly Ser Lys Met Lys Glu Thr Val Gly Asn Lys Ile Val Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ala Gly Asp Val Gly Val Ala Tyr Ala Tyr Ala Leu Ile Asn Gln 20 25 30 Gly Met Ala Asp His Leu Ala Ile Ile Asp Ile Asp Glu Lys Lys Leu 35 40 45 Glu Gly Asn Val Met Asp Leu Asn His Gly Val Val Trp Ala Asp Ser 50 55 60 Arg Thr Arg Val Thr Lys Gly Thr Tyr Ala Asp Cys Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80 Met Val Val Ile Cys Ala Gly Ala Ala Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg 85 90 95 Leu Gln Leu Val Asp Lys Asn Val Lys Ile Met Lys Ser Ile Val Gly 100 105 110 Asp Val Met Asp Ser Gly Phe Asp Gly Ile Phe Leu Val Ala Ser Asn 115 120 125 Pro Val Asp Ile Leu Thr Tyr Ala Val Trp Lys Phe Ser Gly Leu Glu 130 135 140 Trp Asn Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Phe 145 150 155 160 Arg Tyr Met Leu Gly Glu Leu Tyr Glu Val Ala Pro Ser Ser Val His 165 170 175 Ala Tyr Ile Ile Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Leu Ser 180 185 190 Ser Ala Thr Ile Ala Gly Val Ser Leu Ser Arg Met Leu Asp Lys Asp 195 200 205 Pro Glu Leu Glu Gly Arg Leu Glu Lys Ile Phe Glu Asp Thr Arg Asp 210 215 220 Ala Ala Tyr His Ile Ile Asp Ala Lys Gly Ser Thr Ser Tyr Gly Ile 225 230 235 240 Gly Met Gly Leu Ala Arg Ile Thr Arg Ala Ile Leu Gln Asn Gln Asp 245 250 255 Val Ala Val Pro Val Ser Ala Leu Leu His Gly Glu Tyr Gly Glu Glu 260 265 270 Asp Ile Tyr Ile Gly Thr Pro Ala Val Val Asn Arg Arg Gly Ile Arg 275 280 285 Arg Val Val Glu Leu Glu Ile Thr Asp His Glu Met Glu Arg Phe Lys 290 295 300 His Ser Ala Asn Thr Leu Arg Glu Ile Gln Lys Gln Phe Phe 305 310 315 <210> 23 <211> 3600 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1037)..(2542) <223> <400> 23 gaagcgctac ggacttcgcg ccggcgtcga cagcaatgcg tccagcatcc aagtgagtat 60 ggtgctcatc atcaatacca acgcggaact tcaccgtcac cggaatgtcc gtgccttccg 120 tagccttcac agccgcggaa acgatgtttt caaacaaacg gcgcttgtaa ggaatcgcag 180 aaccgccacc ccggcgcgtg acctttggaa ccgggcagcc aaagttcata tcaatatgat 240 ccgccaagtt ttcatcaacg atcatcttcg ccgcttcgta ggtgtacttc gggtcaaccg 300 tgtacagctg caagcttcgg ggattttcat ccggcgcgaa ggtggtcatg tgcatggttt 360 tctcattgcg ctcaacaaga gcacgcgcag tcaccatttc acagacgtac agccccgaga 420 ttgttcccgt gcgttgcatt tcctgttcac ggcacagcgt gcggaaagca acgttggtta 480 caccagccat gggggctaga accacagggg aggcaaggtc aaaggggccg atttttaaag 540 tcacctaact attgtccccc gtgaatcagg ttgggcaaaa tatttgaagc aaattgtgag 600 cagggcgcaa ctaggaaagt ggtgtgcttt cactttttgg gggctggggt tgggttaagc 660 ttcgcgggct ctagggttgg tctgagcttt attcctgggc tttgggaggc ttgcaaacag 720 ggggcatgca aatttggggg taatgctggg ccttgaaatc ccactatcac agatagtatt 780 cgggcatttc ctgtcacgat ggtttatcct tgggacacaa catcaaagtg gggtacatca 840 tatgcttccg gttgaagtga cctatctgaa aagattggtc gaaccttgaa gcaatggtgt 900 gaactgcgtt aacgaatttt gtcggacgtt aaaatggtcg cattctgctt gctgaagtgg 960 cacacctatg tgttctgctt gggtatagca gtgcgggaaa aatttgaaaa agtccgatta 1020 cctgaggagg tattca atg tct gat cgc att gct tca gaa aag ctg cgc tcc 1072 Met Ser Asp Arg Ile Ala Ser Glu Lys Leu Arg Ser 1 5 10 aag ctc atg tcc gcc gac gag gcg gca cag ttt gtt aac cac ggt gac 1120 Lys Leu Met Ser Ala Asp Glu Ala Ala Gln Phe Val Asn His Gly Asp 15 20 25 aag gtt ggt ttc tcc ggc ttc acc ggc gct ggc tac cca aag gca ctg 1168 Lys Val Gly Phe Ser Gly Phe Thr Gly Ala Gly Tyr Pro Lys Ala Leu 30 35 40 cct acg gca atc gct aac cgg gct aaa gaa gca cac ggt gca ggc aac 1216 Pro Thr Ala Ile Ala Asn Arg Ala Lys Glu Ala His Gly Ala Gly Asn 45 50 55 60 gac tac gca atc gac ctg ttc act ggc gca tcg acc gcc cct gac tgc 1264 Asp Tyr Ala Ile Asp Leu Phe Thr Gly Ala Ser Thr Ala Pro Asp Cys 65 70 75 gat ggc gta ctt gca gaa gct gac gct atc cgc tgg cgc atg cca tac 1312 Asp Gly Val Leu Ala Glu Ala Asp Ala Ile Arg Trp Arg Met Pro Tyr 80 85 90 gca tct gat cca atc atg cgt aac aag atc aac tcc ggc tcc atg gga 1360 Ala Ser Asp Pro Ile Met Arg Asn Lys Ile Asn Ser Gly Ser Met Gly 95 100 105 tac tcc gat atc cac ctg tcc cac tcc ggc cag cag gtt gaa gag ggc 1408 Tyr Ser Asp Ile His Leu Ser His Ser Gly Gln Gln Val Glu Glu Gly 110 115 120 ttc ttc ggc cag ctc aac gta gct gtc att gaa atc acc cgc atc 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gac ttc ctg gaa agc gaa gtt 1792 Ser Lys Lys Ile Ala Gly Asn Phe Leu Asp Phe Leu Glu Ser Glu Val 240 245 250 gct gca ggt cgc ctg tcc tac gac ggc tac atc atg cag tcc ggc gtg 1840 Ala Ala Gly Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Tyr Ile Met Gln Ser Gly Val 255 260 265 ggc aac gtg cca aac gcg gtg atg gca ggc ctg ctg gaa tcc aag ttt 1888 Gly Asn Val Pro Asn Ala Val Met Ala Gly Leu Leu Glu Ser Lys Phe 270 275 280 gag aac atc cag gcc tac acc gaa gtt atc cag gac ggc atg gtg gac 1936 Glu Asn Ile Gln Ala Tyr Thr Glu Val Ile Gln Asp Gly Met Val Asp 285 290 295 300 ctc atc gac gcc ggc aag atg acc gtt gca tcc gca act tcc ttc tcc 1984 Leu Ile Asp Ala Gly Lys Met Thr Val Ala Ser Ala Thr Ser Phe Ser 305 310 315 ctg tct cct gag tac gca gag aag atg aac aac gag gct aag cgt tac 2032 Leu Ser Pro Glu Tyr Ala Glu Lys Met Asn Asn Glu Ala Lys Arg Tyr 320 325 330 cgc gag tcc att atc ctg cgc cca cag cag atc tct aac cac cca gag 2080 Arg Glu Ser Ile Ile Leu Arg Pro Gln Gln Ile Ser Asn His Pro Glu 335 340 345 gtc atc cgc cgc gtt ggc ctg atc gcc acc aac ggt ctc atc gag gct 2128 Val Ile Arg Arg Val Gly Leu Ile Ala Thr Asn Gly Leu Ile Glu Ala 350 355 360 gac att tac ggc aac gtc aac tcc acc aac gtt tct ggc tcc cgc gtc 2176 Asp Ile Tyr Gly Asn Val Asn Ser Thr Asn Val Ser Gly Ser Arg Val 365 370 375 380 atg aac ggc atc ggc ggc tcc ggc gac ttc acc cgt aac ggc tac atc 2224 Met Asn Gly Ile Gly Gly Ser Gly Asp Phe Thr Arg Asn Gly Tyr Ile 385 390 395 tcc agc ttc atc acc cct tca gag gca aag ggc ggc gca atc tct gcg 2272 Ser Ser Phe Ile Thr Pro Ser Glu Ala Lys Gly Gly Ala Ile Ser Ala 400 405 410 atc gtt cct ttc gca tcc cac atc gac cac acc gag cac gat gtc atg 2320 Ile Val Pro Phe Ala Ser His Ile Asp His Thr Glu His Asp Val Met 415 420 425 gtt gtt atc tct gag tac ggt tac gca gac ctt cgt ggt ctg gct cca 2368 Val Val Ile Ser Glu Tyr Gly Tyr Ala Asp Leu Arg Gly Leu Ala Pro 430 435 440 cgt gag cgc gtt gcc aag atg atc ggc ctg gct cac cct gat tac cgc 2416 Arg Glu Arg Val Ala Lys Met Ile Gly Leu Ala His Pro Asp Tyr Arg 445 450 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tggcgccctc tggcccctcg tcgcggccat tgagggcgcg gacctcgccg 3105 cgatcgacct gcctaaaact ccgctttacg acgattggct gcgcctttta gaatctttca 3165 tctcttccga agacgacggt cggccactca tcctgatcgg tgcaggcacc ggaggcttgc 3225 tttgcgcaga agctgcacac cgcacaggac tggtcgcaca cgtcattgcc acctgcctgc 3285 tcaacccctc cgaccagccg acgcgccggg cactgttcag gttttcaccg ctgactcggt 3345 tgatccaagg ccgcttgcgc aaccgcgaaa ttcccgtgac cagagtgttg aacttcagca 3405 aaatcagccg cagcccagcc ctgagcaaat tgtgcgcggc cgatgaattt agcggagcat 3465 ccaaaataac ctggggtttc ctcgcgtcat atgtgcaaca caaggccaaa ctgggtgcag 3525 ttcccgtcac tctgatgcac cctgaccacg accttctgac tcccgttgag ctcagtctgc 3585 gtacgctttc gcgcc 3600 <210> 24 <211> 502 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 24 Met Ser Asp Arg Ile Ala Ser Glu Lys Leu Arg Ser Lys Leu Met Ser 1 5 10 15 Ala Asp Glu Ala Ala Gln Phe Val Asn His Gly Asp Lys Val Gly Phe 20 25 30 Ser Gly Phe Thr Gly Ala Gly Tyr Pro Lys Ala Leu Pro Thr Ala Ile 35 40 45 Ala Asn Arg Ala Lys Glu Ala His Gly Ala Gly Asn Asp Tyr Ala 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gac ttc gac cct 977 Thr Gly Leu Pro Ile Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro 120 125 130 135 aag ggc aag tcc gat ctg gaa atc atg cgt ttc tgc cag tcc ttc atg 1025 Lys Gly Lys Ser Asp Leu Glu Ile Met Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met 140 145 150 acc gag ctg cac cgc cac atc ggt gag tac cgc gac gtt cct gca ggt 1073 Thr Glu Leu His Arg His Ile Gly Glu Tyr Arg Asp Val Pro Ala Gly 155 160 165 gac atc gga gtt ggt ggc cgc gag atc ggt tac ctg ttt ggc cac tac 1121 Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly His Tyr 170 175 180 cgt cgc atg gcc aac cag cac gag tcc ggc gtt ttg acc ggt aag ggc 1169 Arg Arg Met Ala Asn Gln His Glu Ser Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly 185 190 195 ctg acc tgg ggt gga tcc ctg gtc cgc acc gag gca act ggc tac ggc 1217 Leu Thr Trp Gly Gly Ser Leu Val Arg Thr Glu Ala Thr Gly Tyr Gly 200 205 210 215 tgc gtt tac ttc gtg agt gaa atg atc aag gct aag ggc gag agc atc 1265 Cys Val Tyr Phe Val Ser Glu Met Ile Lys Ala Lys Gly Glu Ser Ile 220 225 230 agc ggc cag aag atc atc gtt tcc ggt tcc ggc aac gta gca acc tac 1313 Ser Gly Gln Lys Ile Ile Val Ser Gly Ser Gly Asn Val Ala Thr Tyr 235 240 245 gcg att gaa aag gct cag gaa ctc ggc gca acc gtt att ggt ttc tcc 1361 Ala Ile Glu Lys Ala Gln Glu Leu Gly Ala Thr Val Ile Gly Phe Ser 250 255 260 gat tcc agc ggt tgg gtt cat acc cct aat ggc gtt gac gtg gct aag 1409 Asp Ser Ser Gly Trp Val His Thr Pro Asn Gly Val Asp Val Ala Lys 265 270 275 ctc cgc gaa atc aag gaa gtt cgc cgc gca cgc gta tcc gtg tac gcc 1457 Leu Arg Glu Ile Lys Glu Val Arg Arg Ala Arg Val Ser Val Tyr Ala 280 285 290 295 gac gaa gtt gaa ggc gca acc tac cac acc gac ggg tcc atc tgg gat 1505 Asp Glu Val Glu Gly Ala Thr Tyr His Thr Asp Gly Ser Ile Trp Asp 300 305 310 ctc aag tgc gat atc gct ctt cct tgt gca act cag aac gag ctc aac 1553 Leu Lys Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala Thr Gln Asn Glu Leu Asn 315 320 325 ggt gag aac gct aag act ctt gca gac aac ggc tgc cgt ttc gtt gct 1601 Gly Glu Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Asn Gly Cys Arg Phe Val Ala 330 335 340 gaa 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atcagggatt tttgatttct tccaggtcaa ttatccgatc 1996 cacatgggtt aatgcagctg tgcggtgcgc aatgatgatc a 2037 <210> 26 <211> 447 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 26 Met Thr Val Asp Glu Gln Val Ser Asn Tyr Tyr Asp Met Leu Leu Lys 1 5 10 15 Arg Asn Ala Gly Glu Pro Glu Phe His Gln Ala Val Ala Glu Val Leu 20 25 30 Glu Ser Leu Lys Ile Val Leu Glu Lys Asp Pro His Tyr Ala Asp Tyr 35 40 45 Gly Leu Ile Gln Arg Leu Cys Glu Pro Glu Arg Gln Leu Ile Phe Arg 50 55 60 Val Pro Trp Val Asp Asp Gln Gly Gln Val His Val Asn Arg Gly Phe 65 70 75 80 Arg Val Gln Phe Asn Ser Ala Leu Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg 85 90 95 Phe His Pro Ser Val Asn Leu Gly Ile Val Lys Phe Leu Gly Phe Glu 100 105 110 Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Gly Leu Pro Ile Gly Gly Gly Lys 115 120 125 Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Leu Glu Ile Met 130 135 140 Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu His Arg His Ile Gly Glu 145 150 155 160 Tyr Arg Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Ile 165 170 175 Gly Tyr Leu Phe Gly His Tyr Arg Arg Met Ala Asn Gln His Glu Ser 180 185 190 Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly Leu Thr Trp Gly Gly Ser Leu Val Arg 195 200 205 Thr Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Cys Val Tyr Phe Val Ser Glu Met Ile 210 215 220 Lys Ala Lys Gly Glu Ser Ile Ser Gly Gln Lys Ile Ile Val Ser Gly 225 230 235 240 Ser Gly Asn Val Ala Thr Tyr Ala Ile Glu Lys Ala Gln Glu Leu Gly 245 250 255 Ala Thr Val Ile Gly Phe Ser Asp Ser Ser Gly Trp Val His Thr Pro 260 265 270 Asn Gly Val Asp Val Ala Lys Leu Arg Glu Ile Lys Glu Val Arg Arg 275 280 285 Ala Arg Val Ser Val Tyr Ala Asp Glu Val Glu Gly Ala Thr Tyr His 290 295 300 Thr Asp Gly Ser Ile Trp Asp Leu Lys Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys 305 310 315 320 Ala Thr Gln Asn Glu Leu Asn Gly Glu Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp 325 330 335 Asn Gly Cys Arg Phe Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Pro 340 345 350 Glu Ala Val Glu Val Phe Arg Glu Arg Asp Ile Arg Phe Gly Pro Gly 355 360 365 Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Thr Ser Ala Leu Glu Met Gln 370 375 380 Gln Asn Ala Ser Arg Asp Ser Trp Ser Phe Glu Tyr Thr Asp Glu Arg 385 390 395 400 Leu Gln Val Ile Met Lys Asn Ile Phe Lys Thr Cys Ala Glu Thr Ala 405 410 415 Ala Glu Tyr Gly His Glu Asn Asp Tyr Val Val Gly Ala Asn Ile Ala 420 425 430 Gly Phe Lys Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Ile 435 440 445

Claims (9)

1. 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하며 L-아미노산 생산능을 갖는 세균을 배지에서 배양하는 단계 및

   중간체로서 피루브산을 사용하는 생합성 경로에 의해 생성되는 하나 이상의 L-아미노산을 배지로부터 수거하는 단계

   를 포함하는 L-아미노산의 생산 방법으로서,

   상기 세균이, 염색체 아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자를 파괴시킴에 의해, 염색체 아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자의 암호화 영역으로 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이 또는 프레임 시프트 (frameshift) 돌연변이를 도입함에 의해, 또는 아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자의 샤인-달가노 (SD) 서열 또는 프로모터 영역을 덜 강한 것으로 변형시키는 돌연변이 또는 아세틸-CoA 하이드롤라제의 샤인-달가노 서열 또는 프로모터 영역 내 컨센서스 서열을 파괴하는 돌연변이를 도입시킴에 의해, 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성이 야생형 또는 비-변형된 균주에 비해 감소되도록 변형된 것이고,

   이때, 아세틸-CoA 하이드롤라제가,

   (A) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 및

   (B) 서열번호 24의 아미노산 서열에서 1 내지 5개 아미노산 잔기의 보존성 치환을 갖고 아세틸-CoA 하이드롤라제 활성을 갖는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, L-아미노산의 생산 방법.
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5. 제1항에 있어서, 아세틸-CoA 하이드롤라제 유전자가 서열번호 23의 1037번 내지 2542번 뉴클레오타이드를 포함하는 유전자인, L-아미노산의 생산 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 세균이, 글루타메이트 데하이드로게나제 암호화 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 야생형 또는 비-변형된 균주에 비해 글루타메이트 데하이드로게나제 활성이 증가되도록 추가로 변형된, L-아미노산의 생산 방법.
7. 제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, L-아미노산이 L-글루탐산, L-아르기닌, L-글루타민, L-프롤린, L-알라닌, L-발린 및 L-라이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 L-아미노산인, L-아미노산의 생산 방법.
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