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JP3301140B2 - 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents

発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法

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JP3301140B2
JP3301140B2 JP02681193A JP2681193A JP3301140B2 JP 3301140 B2 JP3301140 B2 JP 3301140B2 JP 02681193 A JP02681193 A JP 02681193A JP 2681193 A JP2681193 A JP 2681193A JP 3301140 B2 JP3301140 B2 JP 3301140B2
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稲雄 小山
恵史 石井
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、発酵法によるＬ−グル
タミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は食品、
医薬品、化学品等として重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】従来よりＬ−グルタミン酸はブレビバク
テリウム属またはコリネバクテリウム属に属する微生物
を用いた発酵法により工業的に生産されている。従来の
Ｌ−グルタミン酸発酵においては、培地に含まれるビオ
チンもしくはビオチン活性物質の濃度がＬ−グルタミン
酸の生産性に大きく影響することが知られており、ビオ
チンもしくはビオチン活性物質が生育の適量以下の制限
条件下において培養を行うか、あるいは甘藷、甜菜から
の糖汁もしくは廃糖蜜等のビオチン過剰原料を炭素源と
して使用する場合はペニシリンＧ、Ｆ、Ｋ、Ｏ、Ｖ、Ｘ
等のペニシリン類またはシュクロースモノパルミテー
ト、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート等
の高級脂肪酸もしくはその誘導体より成る界面活性剤を
ビオチン作用抑制物質として培地に添加する等の方法で
培養が行われていた。
【０００３】一方、ブレビバクテリウム属の細菌におい
てα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の存在を明
らかにした上で本酵素活性の低下した変異株を誘導し、
そのＬ−グルタミン酸生産能を調べた報告があるが、該
変異株のＬ−グルタミン酸生産能は親株とほぼ同じであ
ったとされている（Agric. Biol. Chem., 44, 1897〜19
04 (1980)、Agric. Biol. Chem., 46, 493〜500 (198
2)）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、発酵
法によりＬ−グルタミン酸を工業的にさらに安価に製造
する方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来の発
酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法を改良すべく鋭意
研究した結果、ブレビバクテリウム属またはコリネバク
テリウム属に属し、野生株に比べてα−ケトグルタル酸
デヒドロゲナーゼ活性が低下し、かつＬ−グルタミン酸
生産能を有する変異株をビオチン過剰原料を炭素源とす
る液体栄養培地中で培養すると、ペニシリン類や界面活
性剤等のビオチン作用抑制物質を培地に添加することな
く高蓄積、高収率でＬ−グルタミン酸が生産されること
を見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、ブレビバクテリウム
属またはコリネバクテリウム属に属し、野生株に比べて
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下し、か
つＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株をビオチン濃
度１０乃至１０００μｇ／ｌの液体栄養培地中でビオチ
ン作用抑制物質を培地に添加することなく培養し、培養
液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とする発酵法によるＬ−グルタミン酸の
製造法を提供するものである。
【０００７】本発明で使用する変異株は、ブレビバクテ
リウム属またはコリネバクテリウム属に属し、野生株に
比べてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下
し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するものであれば
いかなるものでもよいが、具体的に例示すると以下のよ
うな菌株を挙げることができる。ブレビバクテリウム・
ラクトフェルメンタム ＡＪ１２８２１（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４１７２） ブレビバクテリウム・フラバム ＡＪ１２８２２（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４１７３） コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＪ１２８２３
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１７４）
【０００８】これらの変異株は、ブレビバクテリウム属
またはコリネバクテリウム属のＬ−グルタミン酸生産菌
を親株として変異誘導することによって得られる。親株
はブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属に
属し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するものであれば特
に限定されないが、例えば以下のような野生株を使用す
ることができる。 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ
１３８６９ ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム・ディバリカタム ＡＴＣＣ１４０
２０ ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１
４０６６ コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ
１３８７０
【０００９】上記変異株の変異誘導方法としては、紫外
線照射、Ｘ線照射、放射線照射、変異誘起剤処理等の通
常の方法が用いられ、例えば２５０μｇ／ｍｌのＮ−メ
チル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンにより３
０℃で２０分間処理する方法等がある。また、遺伝子組
換え法により育種することもできる。
【００１０】変異処理した菌株から本発明の変異株を分
離する方法は限定されないが、例えば、Ｌ−グルタミン
酸を単一炭素源及び単一窒素源とする培地で生育できな
いが、この培地のＬ−グルタミン酸をコハク酸及びアン
モニアで代替した培地で生育可能な菌株として分離する
方法がある（Agric. Biol. Chem., 46, 493〜500 (198
2)）。以下に変異株の取得方法の具体例を示す。
【００１１】ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
ム ＡＴＣＣ１３８６９の菌体にＮ−メチル−Ｎ′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによる通常の変異処理
（２５０μｇ／ｍｌ、３０℃、２０分）を施した後、表
１の組成の固体培地上で培養し、コロニーを形成させ
た。これよりレプリカ法により、Ｌ−グルタミン酸を単
一炭素源及び単一窒素源とする培地で生育できない変異
株を分離した。すなわち、表２の組成の培地上では、３
０℃で２日間培養しても生育できないが、Ｌ−グルタミ
ン酸ナトリウムをコハク酸１０ｇ／ｌ及びアンモニア水
１ｍｌ／ｌで代替した同培地上では同条件下で生育して
くるコロニーを採取した。かくして得られた変異株の１
つがブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＡＪ
１２８２１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１７２）である。同様
の方法により、ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣ
Ｃ１４０６７を親株としてブレビバクテリウム・フラバ
ム ＡＪ１２８２２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１７３）を、
またコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３
０３２を親株としてコリネバクテリウム・グルタミカム
ＡＪ１２８２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１７４）を得た。
【００１２】
【表１】
【００１３】
【表２】
【００１４】次に、各親株並びに変異株のα−ケトグル
タル酸デヒドロゲナーゼ活性を以下のようにして測定し
た。表３に示す組成の培地２０ｍｌを５００ｍｌ容振と
うフラスコに張り込み、１１５℃、１０分間加熱殺菌し
た。これに供試菌株を接種して３１．５℃、３６時間培
養した。得られた培養液より菌体を遠心分離し洗浄した
後、３０％グリセロールを含む０．１Ｍ濃度ＴＥＳ（Ｎ
−トリス（ハイドロキシメチル）メチル−２−アミノエ
タンスルホン酸）−ＮａＯＨ緩衝液２０ｍｌに懸濁し
た。菌体を超音波破砕して遠心分離した上清をセファデ
ックスＧ−２５カラムを用いてゲル濾過し、これを粗酵
素液とした。次いで表４に示す組成の反応液を用いて粗
酵素液のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を調
べた。反応は反応液１．５ｍｌに粗酵素液０．１ｍｌを
添加することにより開始し、室温にて３６５ｎｍにおけ
る吸光度の変化を追跡した。対照として反応液からα−
ケトグルタル酸を除いたものを使用した。
【００１５】
【表３】
【００１６】
【表４】
【００１７】表５にその結果を示す。これから明らかな
ように、上述の方法により得られた変異株はいずれも親
株として用いた野生株に比べてα−ケトグルタル酸デヒ
ドロゲナーゼ活性が著しく低下していた。
【００１８】
【表５】
【００１９】本発明で使用する変異株を野生株と比較し
た場合のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の低
下の度合は特に限定されるものではないが、野生株に比
べて５分の１乃至５００分の１、好ましくは１０分の１
乃至１００分の１程度に活性が下がっている変異株の使
用が好ましい。
【００２０】得られた変異株を用いてＬ−グルタミン酸
を生成蓄積させるには、甘藷、甜菜からの糖汁あるいは
廃糖蜜等のビオチン過剰原料を炭素源とする液体栄養培
地またはデンプン糖化液、酢酸等の炭素源にビオチンを
過剰に添加した液体培地中で培養を行う。ここで、従来
の方法では、ビオチンを過剰に含む液体培地中に培養を
行う場合にはビオチン作用抑制物質、すなわちペニシリ
ンＧ、Ｆ、Ｋ、Ｏ、Ｖ、Ｘ等のペニシリン類またはシュ
ークロースモノパルミテート、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノパルミテート等の高級脂肪酸もしくはその誘
導体より成る界面活性剤を培地に添加することがＬ−グ
ルタミン酸を高収率で生産するために必要であったが、
野生株に比べてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活
性が低下した本発明の変異株を使用する場合、１０乃至
１０００μｇ／ｌの高濃度のビオチンを含む液体栄養培
地で培養する際においても上記のようなビオチン作用抑
制物質の添加を行うことなく高収率、高蓄積でＬ−グル
タミン酸を生成蓄積させることができる。
【００２１】使用する液体栄養培地は、炭素源の他に、
窒素源、無機イオンその他の栄養素を適宜含有する。窒
素源としては、通常のＬ−グルタミン酸発酵に用いられ
るアンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿
素等が用いられ、その他リン酸塩、マグネシウム塩等の
無機イオンが必要に応じて適宜使用される。また、必要
により、サイアミン等の微量栄養素が適宜培地に添加さ
れる。
【００２２】培養は好気的条件下で行うのがよく、培養
温度２４〜４２℃、培養中ｐＨは５〜９に制御するのが
よく、ｐＨの調整には無機あるいは有機の酸性あるいは
アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アン
モニアガス等を使用することができる。
【００２３】培養液からのＬ−グルタミン酸を採取する
方法は、イオン交換樹脂処理、晶析等公知の方法を適宜
組み合わせることにより行われる。
【００２４】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。
【００２５】実施例１ 表６の組成の種母培地を調製し、その２０ｍｌずつを５
００ｍｌ容肩付フラスコに入れ加熱殺菌した。この培地
に各菌株を接種し、３１．５℃に保ちつつ１５時間振盪
培養した（以下、これを種母培養液という）。
【００２６】
【表６】
【００２７】次に、表７の組成を有する培地を別に調製
し、その２０ｍｌずつを５００ｍｌ容振盪フラスコに分
注し１１５℃で１０分加熱殺菌した。なお、この培地中
のビオチン濃度は６０μｇ／ｌであった。
【００２８】
【表７】
【００２９】これらの培地に上記の種母培養液を張り込
み量の１０％相当接種し、往復振とう機により３１．５
℃で培養を行った。培養中、培養液をｐＨ６．０〜８．
５に保つように４５０ｍｇ／ｍｌの濃度の尿素溶液を少
量ずつ添加した。３６時間で発酵を終了し、培養液中に
蓄積したＬ−グルタミン酸の量を測定した。
【００３０】その結果、表８に示すように、親株ではＬ
−グルタミン酸の蓄積が極めて低かったのに対して、α
−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した変異
株は、いずれも良好にＬ−グルタミン酸を生成蓄積し
た。
【００３１】
【表８】
【００３２】実施例２ 表９の組成の培地を調製し、１リットル容ジャーファー
メンターに３００ｍｌずつ張込み１２０℃で１０分加熱
殺菌した。なお、この培地中のビオチン濃度は１５０μ
ｇ／ｌであった。
【００３３】
【表９】
【００３４】これらの培地に実施例１の各菌株の種母培
養液を張込み量の１０％相当を接種し３１．５℃で通気
撹拌培養を行った。培養中アンモニアガスにより培養液
のｐＨを７．８に調製した。３２時間で発酵を終了し、
培養液中に蓄積したＬ−グルタミン酸の量を測定した。
【００３５】その結果、表１０に示すように、親株では
Ｌ−グルタミン酸の蓄積が極めて低かったのに対して、
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した変
異株は、いずれも良好にＬ−グルタミン酸を生成蓄積し
た。
【００３６】
【表１０】
【００３７】実施例３ 表１１の組成にビオチンを３、１０、５０、３００、１
０００μｇ／ｌの各濃度で添加した培地を調製し、１リ
ットル容ジャーファーメンターに３００ｍｌずつ張込み
１２０℃で１０分加熱殺菌した。
【００３８】
【表１１】
【００３９】これらの培地に実施例１の各菌株の種母培
養液を張込み量の１０％相当を接種し３１．５℃で通気
撹拌培養を行った。培養中アンモニアガスにより培養液
のｐＨを７．８に調整した。３０時間で発酵を終了し、
培養液中に生成蓄積したＬ−グルタミン酸の量を測定し
た。
【００４０】その結果、表１２に示すように、ビオチン
濃度を３μｇ／ｌに制限したＬ−グルタミン酸生産培地
においては、親株と変異株のＬ−グルタミン酸蓄積量は
ほぼ同等であった。一方、ビオチン濃度１０乃至１００
０μｇ／ｌの培地においては、親株はＬ−グルタミン酸
生産能が低下したのに対して、α−ケトグルタル酸デヒ
ドロゲナーゼ活性が低下した変異株は良好にＬ−グルタ
ミン酸を生成蓄積した。
【００４１】
【表１２】
【００４２】
【発明の効果】本発明のＬ−グルタミン酸の製造法によ
れば、高濃度のビオチンを含有する培地においてもペニ
シリン類あるいは界面活性剤等のビオチン作用抑制物質
を培地に添加することなくＬ−グルタミン酸を高収率、
高蓄積で生産することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 河原 義雄 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 中央研究所内 審査官 本間 夏子 (56)参考文献 特開 平１−296994（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 13/14 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ブレビバクテリウム属またはコリネバクテ
    リウム属に属し、野生株に比べてα−ケトグルタル酸デ
    ヒドロゲナーゼ活性が５分の１乃至５００分の１程度に
    低下し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株を
    ビオチン濃度１０乃至１０００μｇ／ｌの液体栄養培地
    中でビオチン作用抑制物質を培地に添加することなく培
    養し、培養液中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、
    これを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−グル
    タミン酸の製造法。
  2. 【請求項２】野生株に比べてα−ケトグルタル酸デヒド
    ロゲナーゼ活性が１０分の１乃至１００分の１程度に低
    下したことを特徴とする請求項１記載の製造法。
JP02681193A 1993-02-16 1993-02-16 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 Expired - Lifetime JP3301140B2 (ja)

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