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KR101099333B1 - 측정 장치, 방법 및 컴퓨터 프로그램 - Google Patents

측정 장치, 방법 및 컴퓨터 프로그램 Download PDF

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KR101099333B1
KR101099333B1 KR1020097002990A KR20097002990A KR101099333B1 KR 101099333 B1 KR101099333 B1 KR 101099333B1 KR 1020097002990 A KR1020097002990 A KR 1020097002990A KR 20097002990 A KR20097002990 A KR 20097002990A KR 101099333 B1 KR101099333 B1 KR 101099333B1
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KR
South Korea
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sample
particles
blood cells
white blood
image
Prior art date
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KR1020097002990A
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Inventor
톰 올레센
스텔란 린드버그
Original Assignee
헤모큐에이비
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Publication date
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Application filed by 헤모큐에이비 filed Critical 헤모큐에이비
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Abstract

샘플에 있는 입자들 또는 백혈구들의 계산을 위한 측정 장치로서, 샘플을 보유한 샘플 획득 장치를 수용하도록 배치된 홀더, 확대 수단과 적어도 하나의 디지털 이미지 획득 수단을 포함하는 이미징 시스템 - 이미징 시스템은 상기 샘플의 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하도록 배치됨 -; 및 입자들 또는 백혈구들을 식별하여 입자들 또는 백혈구들의 수를 결정하기 위해 상기 디지털 이미지를 분석하도록 배치되고, 초점이 맞게 이미징되는 입자들 또는 백혈구들을 식별하여 이러한 입자들 또는 백혈구들의 타입들을 결정하고 상이한 타입들의 입자들 또는 백혈구들의 비율을 결정하기 위해 상기 디지털 이미지를 분석하도록 배치되는, 이미지 분석기를 포함하고, 상기 타입들은 물리적 특성들에 의해 구별된다.

Description

측정 장치, 방법 및 컴퓨터 프로그램{A MEASUREMENT APPARATUS, METHOD AND COMPUTER PROGRAM}
본 발명은 혈액 샘플과 같은 샘플의 백혈구와 같은, 입자들(particles)의 계산을 위한 측정 장치 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 샘플을 분석하기 위한 컴퓨터 프로그램에 관한 것이다.
백혈구의 수를 결정하는 것은 환자를 치료하는 것과 연계하여 중요하다. 이러한 분석은 예를 들어, 백혈병, 전염병 또는 염증 질병들을 진단하거나, 치료를 모니터링하기 위해 필요할 수 있다. 의사가 환자의 첫번째 검사를 수행할 때 바로 치료 및 진료를 결정할 수 있도록 하고 환자들의 대기 시간을 최소화하기 위해, 가능한 신속하게 분석 결과들이 획득될 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 따라서, 연구실에서 떨어져서 테스트를 전송할 필요 없이 의사 또는 간호사에 의해 신속하게 수행될 수 있는 분석 방법을 제공하는 것이 바람직하다. 백혈구의 수를 결정하는 것은 진료할 때 환자들에게 수행되는 가장 통상적인 테스트들 중 하나이다. 따라서, 분석을 수행하는 신속하고 간단한 방법을 갖는 것이 매우 바람직하다.
오늘날, 백혈구의 수는 일반적으로, 혈액 샘플을 염색하여 예를 들어 뷔커(Burker) 챔버와 같은 특수 카운팅 챔버에서 샘플을 현미경으로 관찰함으로써 수 동 프로시저를 통해 획득된다. 카운팅 챔버에는 명확하게 규정된 작은 볼륨들로 챔버를 분할하는 그리드가 제공된다. 백혈구들은 현미경이 챔버내의 모든 백혈구들 상에 포커싱되어 카운팅을 용이하게 할 수 있도록 카운팅 챔버의 바닥부에 침전(settle)될 수 있다. 따라서, 샘플은 카운팅이 수행되기 이전에 몇분 동안 침전될 필요가 있다. 그 다음, 그리드 내의 박스 당 혈구들의 수를 카운팅함으로써 백혈구의 수가 결정될 수 있다. 백혈구의 수는 신뢰가능한 분석을 수행하기 위하여 분석 수행 경험이 요구되는 분석가에 의해 수동으로 획득된다.
이러한 분석은 시간 소모적이다. 또한, 수동으로 수행되기 때문에, 분석 결과들이 분석을 수행하는 사람에 따라 가변될 수 있다.
백혈구의 수를 결정하기 위해 현존하는 몇가지 자동 분석 방법들이 있다. 백혈구의 수는 방해물(impedance)을 감지함으로써 혈구 크기 및 이에 따른 혈구 타입의 결정을 기반으로 하는 Coulter 규칙에 의해 결정될 수 있다. Coulter 규칙에 의해 백혈구들을 카운팅하기 위한 방법은 미국특허 제5,262,302호에 기재되어 있다. Coulter 규칙에 따른 측정 장치는 고가이기 때문에, 상당한 투자비용이다. 따라서, 병원 또는 연구실은 하나 보다 많은 장치에 투자하지 않으려 할 것이다. 이는 분석이 중앙화된 지점에서 수행되고 환자는 분석 결과들을 기다릴 필요가 있음을 의미한다.
Coulter 규칙은 현재 사용되고 있는 탁월한 자동 분석 방법이다. 그러나, 개시되어 있는 몇가지 다른 방법들이 있다. 백혈구의 수를 결정하기 위한 그러한 한가지 방법은 미국특허 제5,585,246호에 개시되어 있다. 여기서, 혈액 샘플은 형 광 염료, 및 백혈구들을 추적하는 리간드 복합물과 혼합되도록 마련되어야 한다. 샘플은 모세관(capillary)에 주입되고 레이저 소스에 의해 조사되어 모세관 내의 샘플을 스캔한다. 백혈구들의 수를 결정하기 위해 형광성이 측정된다. 형광 염료 및 모세관에 대한 레이저 소스 스캐닝을 이용하는 유사한 방법이 WO 97/02482호에 개시되어 있다. 이러한 방법은 적은 개수의 백혈구들을 포함하는 채집산물들(apheresis products)에서 백혈구들의 계산(enumeration)에 적용된다. 여기서, 모세관은 매우 두껍고, 모세관이 스캔되기 이전에 모세관의 바닥부에 백혈구들이 침전될 때까지 대기하는 것이 요구된다.
WO 99/45384호에서, 가변 두께를 갖는 샘플-함유 챔버가 도시된다. 가변 두께는 혈액의 상이한 화합물들을 분리시킨다. 혈액 샘플은 혈액 샘플에서 적어도 3개의 상이한 백혈구 타입들을 구별되게 강조하기 위해 착색제(colorant)로 착색된다. 백혈구들은 챔버의 일부분을 관찰하기 위해 광학 스캐닝 기구를 이용함으로써 계산될 수 있다.
WO 98/50777호에서, 우유에 있는 체세포들의 수의 평가 방법이 개시되어 있다. 방법은 샘플 구획에 일정 부피의 샘플을 제공하는 단계, 및 전자기 신호들을 샘플 구획을 통과시켜서 검출 엘리먼트들의 어레이 위로 전송하는 단계를 포함한다. 검출된 전자기 신호들의 세기들이 처리되고, 그 결과들은 샘플에 존재하는 세포들의 수와 상관된다.
분석은 특별한 트레이닝을 요구함이 없이, 임의의 사용자에 의해 수행될 수 있도록, 및 측정 장치들이 상대적으로 저렴할 수 있도록, 백혈구 수를 결정하기 위 한 현존하는 자동화 방법들을 간략화 및 촉진시킬 필요가 있다. 이는 진료 시점에 분석이 제공될 수 있음을 의미한다. 백혈구 카운트는 통상적으로 수행되는 분석이기 때문에, 분석 방법에 대한 임의의 개선은 환자 진료에 긍정적인 영향을 준다. 진료 시점에 결과들을 달성할 가능성을 제공하는 분석 방법이 특히 바람직하다.
또한, 상이한 백혈구 카운트를 달성하는 것, 즉 혈액 샘플에 있는 상이한 타입들의 백혈구들의 분포를 검사하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 상이한 백혈구 카운트는 백혈구들이 정상 분포로 존재하는지 여부, 또는 임의의 백혈구 타입이 증가 또는 감소되는지 여부를 나타낼 수 있다. 정보는 특정 타입들의 질병을 진단하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 호중성 백혈구들(neutrophils)의 증가는 박테리아 감염을 나타내는 반면에, 림프구(lymphocytes)의 증가는 통상 바이러스성 감염들이다.
또한, 상이한 백혈구 카운트는 Burker 챔버에 있는 착색된 혈구들을 현미경으로 관찰하고 수동으로 카운팅함으로써 달성될 수도 있다. 또한, 몇가지 자동화 방법들이 존재한다. 예를 들어, 전기장을 통과하는 세포에 의해 생성되는 전기 펄스의 형태 및 크기를 분석함으로써 Coulter 규칙에 의해 상이한 카운트가 달성될 수 있다. 펄스의 형태 및 크기는 검출되는 백혈구의 타입에 관련될 수 있다. 그러한 한가지 방법은 미국특허 제4,528,274호에 기재되어 있다.
미국특허 제5,123,055호에, 상이한 타입들의 백혈구들을 식별하기 위한 다른 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 백혈구들의 타입을 구별하기 위해 몇가지 크기 및 색상 파라미터들이 순차적으로 분석되는 것을 요구한다.
상이한 백혈구 카운트를 결정하기 위해 현존하는 자동화 방법들을 간략화 및 촉진시키는 것이 여전히 바람직하다. 특히, 분석이 진료 시점에 제공될 수 있도록 신속하고 간단하며 상대적으로 저비용의 분석 방법을 제공하는 것이 바람직하다.
혈액 샘플과 같은 샘플에 있는 백혈구들과 같은 입자들의 용적측정(volumetric) 계산을 결정하고 상이한 백혈구 카운트와 같은 상이한 입자 카운트를 결정하기 위한 간단한 분석을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따라, 혈액 샘플과 같은 샘플에 있는 백혈구들과 같은, 입자들의 계산을 위한 측정 장치가 제공된다.
측정 장치는 샘플을 홀딩하는 측정 캐비티를 포함하는 샘플 획득 장치를 수용하도록 배치된(arranged) 홀더, 및 샘플의 적어도 하나의 확대된 디지털 이미지를 획득하도록 구성된 이미징 시스템을 포함한다. 측정 장치는 입자들을 식별하고 샘플에 있는 입자들의 수를 결정하기 위해 적어도 하나의 획득된 디지털 이미지를 분석하도록 배치된 이미지 분석기를 추가로 포함하고, 이미지 분석기는 초점이 맞게(in focus) 이미징되는 입자들을 식별하고 이러한 입자들의 수 및 타입들을 결정하기 위해 적어도 하나의 획득된 디지털 이미지를 분석하도록 배치되며, 상기 타입들은 입자들의 물리적 특징들에 의해 구별되고, 이에 따라 샘플에 있는 상이한 타입들의 입자들의 비율이 결정된다.
이미징 시스템은 확대 수단(magnifying means) 및 적어도 하나의 디지털 이미지 획득 수단을 포함할 수 있다.
일 실시예에 따라, 상기 장치는 혈액 샘플에 있는 백혈구들의 계산을 위해 구성되고, 측정 캐비티는 착색되고 용혈된(hemolysed) 혈액 샘플을 홀딩하도록 구성되며, 이미지 분석기는 착색된 백혈구들을 식별하고 샘플에 있는 백혈구들의 수를 결정하기 위해 적어도 하나의 획득된 디지털 이미지를 분석하도록 배치되고, 이미지 분석기는 초점이 맞게 이미징되는 백혈구들을 식별하고 이러한 백혈구들의 수와 타입들을 결정하기 위해 적어도 하나의 획득된 디지털 이미지를 분석하도록 배치되며, 상기 타입들은 백혈구들의 기하학적 특징들에 의해 구별되고, 이에 따라 샘플에 있는 상이한 타입들의 백혈구들의 비율이 결정된다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 샘플에 있는 입자들의 계산 방법이 제공되고, 상기 방법은, 샘플 획득 장치의 측정 캐비티에 샘플을 획득하는 단계; 측정 캐비티의 조사된(irradiated) 샘플의 배율의 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하는 단계; 입자들을 식별하고 샘플에 있는 입자들의 수를 결정하기 위해 적어도 하나의 디지털 이미지를 디지털 분석하는 단계; 및 초점이 맞게 이미징되는 입자들을 식별하고 이러한 입자들의 수와 타입들을 결정하기 위해 적어도 하나의 디지털 이미지를 디지털 분석하는 단계를 포함하고, 상기 타입들은 입자들의 기하학적 특징들에 의해 구별되며, 이에 따라 샘플에 있는 상이한 타입들의 입자들의 비율이 결정된다.
일 실시예에 따라, 상기 방법은 혈액 샘플의 백혈구들의 계산을 위해 적용된다. 상기 방법은 샘플 획득 장치의 측정 캐비티에 혈액 샘플을 획득하는 단계를 포함한다. 혈액 샘플은 반응제와 혼합되고, 반응제는 혈액 샘플에서 적혈구들을 용해시키기 위한 용혈제(homolysing agent), 및 혈액 샘플에서 백혈구들을 착색하기 위한 착색제를 포함한다. 착색제는 백혈구들을 선택적으로 착색하는 것이 바람직하고, 혈액 샘플에 있는 다른 혈구들을 착색하지 않는다. 상기 방법은 측정 캐비티의 일정 배율의 샘플의 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법은 착색된 백혈구들을 식별하고 샘플에 있는 백혈구들의 수를 결정하기 위해 적어도 하나의 디지털 이미지를 디지털 분석하는 단계, 및 초점이 맞게 이미징되는 백혈구들을 식별하고 이러한 백혈구들의 수와 타입들을 결정하기 위해 적어도 하나의 디지털 이미지를 디지털 분석하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 타입들은 착색된 백혈구들의 기하학적 특징들에 의해 구별되고, 이에 따라 혈액 샘플에 있는 상이한 타입들의 백혈구들의 비율이 결정된다.
본 발명의 측정 장치 및 방법은 모두 전체 혈액의 샘플의 간단한 분석을 가능하게 한다. 따라서, 측정 장치는 혈액 샘플의 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하도록 배치되고, 샘플은 백혈구들을 착색하기 위한 착색제와 혼합된다. 백혈구들의 착색은 백혈구들이 디지털 이미지에서 구별될 수 있고 상이한 타입들의 백혈구들이 동일하거나 다른 디지털 이미지에서 백혈구들의 기하학적 특징들에 의해 구별될 수 있음을 의미한다.
따라서, 측정 장치 및 방법은 혈액 샘플 내의 모든 백혈구들의 용적측정 계산을 결정하고 상이한 백혈구 카운트를 결정하기 위해 배치된다.
많은 현존하는 방법들은 상이한 혈구들 및 혈구들의 서브그룹들을 카운트할 수 있는 반면에, 본 발명에 따른 측정 장치는 특히 백혈구들의 분석에 적용된다. 반응제는 혈액 샘플에 있는 적혈구들을 용해시키는 용혈제를 포함한다. 이는 샘플에 있는 적혈구들을 계산할 가능성을 제거한다. 한편, 적혈구들의 용해는 혈액 샘플 내의 백혈구들의 구별 및 식별을 간소화시킨다.
또한, 구체적으로는, 측정 장치는 초점이 맞게 이미징되는 백혈구들이 식별되도록 적어도 하나의 디지털 이미지를 분석하기 위해 구성된다. 이는 포커싱되는 백혈구들만이 카운트되면서 상대적으로 두꺼운 샘플의 이미지가 획득될 수 있도록 한다. 이러한 특징은 타입 분류가 분석될 백혈구의 보다 세부사항들을 요구하기 때문에, 백혈구들의 총 수의 계산이 백혈구들의 타입의 식별보다 더 용이하게 이루어진다는 점을 고려하면 특히 유용하다. 따라서, 포커싱되는 백혈구들만이 카운트되도록 보장함으로써, 백혈구들의 타입 식별이 샘플에서 수행될 수 있고, 동시에 샘플에 있는 백혈구들의 통계적으로 신뢰가능한 용적 계산을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 측정 장치 및 방법은 전체 혈액의 샘플의 매우 간단한 분석을 제공한다. 분석은 오퍼레이터에 의해 수행되는 고도한 단계들 또는 복잡한 측정 장치를 요구하지 않는다. 따라서, 자질을 갖춘 기술자가 필요함이 없이 환자의 검사와 직접 연계하여 수행될 수 있다. 단지 혈액 샘플을 획득하여 착색제와 혼합하는 것만이 요구된다. 그 다음, 혈액 샘플은 측정 장치의 홀더에 배치될 수 있고, 이에 직접 대응하여, 측정 장치가 분석 결과들을 표시할 수 있다.
사실상, 혈액 샘플은 측정 캐비티에 있는 반응제와 혼합되도록 허용될 수 있다. 따라서, 샘플 준비를 수동으로 수행할 필요가 없다. 수분 내에 또는 그 미만 내에서, 혈액 샘플과 반응제의 반응은 적혈구들을 용혈시키고, 샘플이 광학 측정을 위해 준비되어 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하도록 백혈구들을 착색시킬 것이다. 혈액 샘플은 예를 들어, 혈액 샘플로 반응제를 분산 또는 확산시키거나, 측정 캐비티에 교반(agitation)이 유발되도록 샘플 획득 장치를 능동적으로 진동 또는 이동시킴으로써, 반응제와 혼합될 수 있다.
측정 장치는 샘플 획득 장치의 측정 캐비티에 홀딩되는 샘플을 조사하도록 배치된 전자기 방사 소스를 추가로 포함할 수 있다.
이미징 시스템은 상이한 광학 셋팅들을 이용하여 샘플의 다수의 디지털 이미지들을 획득하도록 배치될 수 있고, 이미지 분석기는 입자들 또는 착색된 백혈구들을 식별하고 샘플의 입자들 또는 백혈구들의 수를 결정하기 위해 각각의 획득된 디지털 이미지를 분석하도록 배치되며, 이미지 분석기는 초점이 맞게 이미징되는 입자들 또는 백혈구들을 식별하고 이러한 입자들 또는 백혈구들의 타입들과 수를 결정하기 위해 각각의 획득된 디지털 이미지를 분석하도록 배치되며, 상기 타입들은 입자들 또는 착색된 백혈구들의 기하학적 특징들에 의해 구별되고, 이에 따라 샘플에 있는 상이한 타입들의 입자들 또는 백혈구들의 비율이 결정된다.
샘플에 있는 필드의 깊이의 방향의 상이한 레벨들에서 다수의 디지털 이미지들을 획득함으로써, 높은 배율을 사용할 때에도 상대적으로 큰 샘플 부피를 분석할 수 있다. 높은 배율은 결과적인 작은 필드 깊이로 인해, 하나의 이미지에서 전체 부피를 관찰하기 어렵게 한다. 배율 레벨은 필드 깊이에 영향을 주기 때문에, 다수의 디지털 이미지들을 획득하는 단계는 더 높은 배율을 사용할 수 있도록 하고, 이에 따라 각각의 이미지에서, 다른 것들 중에서 세포핵들(nuclei)의 형상, 수 또는 크기에 따른 상이한 종류의 백혈구들을 구별할 수 있도록 한다.
다른 실시예에 따라, 이미징 시스템은 포커싱을 용이하게 하기 위해 획득된 이미지에서 광의 방향에 대한 정보를 제공하도록 배치됨으로써, 획득된 이미지에서 초점 시프팅이 가능해진다. 이는 한번에 전체 깊이의 샘플을 분석하는 샘플에 있는 백혈구들의 총 수의 계산을 위해, 및 포커싱되는 혈액 샘플의 두께의 일부분이 이미지에 나타날 때 이미지의 백혈구들을 분석함으로써 혈액 샘플에 있는 상이한 타입들의 백혈구들의 비율을 결정하기 위해, 단일 이미지가 사용될 수 있음을 의미한다. 이미지로의 광의 방향 정보를 포함하는 이미지는 이미지의 상이한 부분들이 초점이 맞게 배치될 수 있도록, 획득된 이미지에서 광선들을 추적하는 성능을 제공하는 작은 렌즈들의 어레이를 이용하여 획득될 수 있다.
이미징 시스템은 상이한 광학 셋팅들을 이용하여 샘플의 제 1 및 제 2 디지털 이미지를 획득하도록 배치될 수 있고, 이미지 분석기는 샘플에 있는 입자들 또는 백혈구들의 수를 결정하기 위해, 획득된 제 1 디지털 이미지를 분석하도록 배치되며, 이미지 분석기는 샘플에 있는 상이한 타입들의 입자들 또는 백혈구들의 비율을 결정하기 위해, 획득된 제 2 디지털 이미지를 분석하도록 배치된다.
따라서, 구체적으로는, 측정 장치는 상이한 광학 셋팅들을 이용하여 2개의 디지털 이미지들을 획득하도록 구성된다. 이는 광학 셋팅들이 최적화 및 구성되어, 첫째로 일정 부피 내의 백혈구들의 수를 결정하고, 둘째로 상이한 타입들의 백혈구들의 비율을 결정할 수 있음을 의미한다.
이미징 시스템은 적어도 부분적으로 분리된 2개의 부분들을 포함할 수 있고, 조사되는 샘플로부터 이미징 시스템의 제 1 및 제 2 부분으로 광을 지향시킨다.
백혈구가 포커싱되는지 여부를 결정하기 위한 조치는 백혈구의 세포질(cytoplasm)이 광을 굴절시키는 렌즈로서 작용할 수 있다는 사실을 이용함으로써 수행될 수 있다. 초점이 맞게 이미징되는 백혈구에 대해, 세포핵들은 어두운 음영으로 보이는 반면에, 주변 세포질은 거의 보이지 않는다. 세포핵들은 매우 낮은 광 세기를 갖는 영역들로서 보이는 반면에, 세포질은 광 세기에 영향을 받지 않도록 남겨진다.
이미징 시스템에 너무 근접하게 이미징되는(너무 근접하게 포커싱되는) 백혈구에 대해, 세포핵들은 어두운 음영으로 보이는 반면에, 주변 세포질은 렌즈로서 작용하여 광을 굴절시켜서 세포핵들 주위에 어두운 원을 형성한다. 세포핵들은 세포핵들의 포커싱 이미지에 비해 훨씬 더 낮은 광 세기를 갖는 영역으로서 보이고, 세포질은 낮은 광 세기로 보인다.
이미징 시스템으로부터 너무 멀리 떨어져서 이미징되는(너무 멀리 포커싱되는) 백혈구에 대해, 세포핵들은 어두운 음영으로서 보이는 반면에, 주변 세포질은 렌즈로서 작용하여 광을 수축시켜서 세포핵들 주위에 밝은 원을 형성한다. 세포핵들은 세포핵들의 포커싱 이미지에 비해 훨씬 더 낮은 광 세기를 갖는 영역으로서 보이는 반면에, 세포질은 높은 광 세기로 보인다.
대안적으로, 엣지에서 세기의 경사도를 기초로 초점이 맞게 백혈구가 이미징되는지 여부를 평가하기 위해 이미징된 백혈구들의 엣지들을 분석함으로써, 초점이 맞게 이미징되는 백혈구들의 식별이 수행될 수 있다. 포커싱되지 않는 세포들은 엣지들에서 세기의 작은 감소를 나타내는 반면에, 포커싱되는 세포들은 세포의 엣지에서 세기의 큰 감소로서 나타나는 뾰족한 엣지로 이미징된다. 따라서, 이미징되는 세포의 엣지에서 세기가 어떻게 가변하는지를 분석함으로써, 초점이 맞게 세포가 이미징되는지 여부를 결정할 수 있다.
세포 타입을 결정하는 대안적인 방법은, 이미지 분석기에서, 특정한 입자 또는 세포에 대해, 입자 또는 세포가 제 1 방향에서 초점이 맞지 않는(out of focus) 것으로 결정되는 이미지 내지 입자 또는 세포가 제 2 방향에서 초점이 맞지 않는 것으로 결정되는 이미지를 카운팅하는, 상기 입자 또는 세포가 이미징되는 이미지들의 수를 결정하는 것이다.
이미지 분석기는 카운트된 이미지들의 수를 기초로, 상기 입자 또는 세포의 크기에 관련된 기하학적 특징을 결정하도록 배치될 수 있다.
적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하기 위해 사용되는 광학 셋팅들을 갖는 이미징 시스템은 1-50x의 배율(magnification power), 보다 바람직하게는 1-20x, 보다 바람직하게는 3-20x, 보다 바람직하게는 5-20x, 및 보다 바람직하게는 약 10x의 배율을 가질 수 있다.
이미징 시스템은 2-60㎛ 범위, 보다 바람직하게는 2-30㎛ 범위, 보다 바람직하게는 약 8-10㎛의 필드 깊이를 갖는 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하도록 배치될 수 있다.
본 범주에서 사용되는 것처럼, "필드 깊이"는 이러한 길이 내에 위치된 세포들을 이미지 분석기가 식별하도록 하기 위해 충분하게 초점이 맞게 이미징되는 광학 축을 따르는 방향의 길이를 의미한다. 이러한 "필드 깊이"는 광학 셋팅들에 의해 규정되는 종래의 필드 깊이보다 더 넓을 수 있다. 배율 증가에 따라, 필드 깊이는 감소된다.
전자기 방사 소스는 착색제의 흡광도(absorbance)의 피크에 해당하는 파장을 조사하도록 배치될 수 있다. 결과적으로, 착색제의 축적을 포함하는 착색된 백혈구들은 디지털 이미지들에서 낮은 광 투과율의 표시로 검출된다.
전자기 방사 소스는 레이저 소스를 포함할 수 있다. 레이저 소스는 착색제의 흡광도를 고정시키는 명확하게 규정된(well-defined) 파장의 광을 제공할 수 있다. 또한, 레이저 소스는 낮은 광 투과율의 지점이 뚜렷하게 구별되도록 이탈 광(stray light)의 방해들을 최소화하는 조준된(collimated) 광을 제공할 수 있다.
대안적으로, 전자기 방사 소스는 발광 다이오드를 포함할 수 있다. 이러한 방사 소스는 샘플에 있는 다른 물질과 백혈구들을 적절히 구별하기 위해 충분한 조사 조건들(irradiating conditions)을 제공할 수 있다.
이미지 분석기는 샘플에 있는 입자들 또는 백혈구들의 수를 결정하기 위해 높은 흡광도의 영역들을 식별하도록 배치될 수 있다. 이미지 분석기는 이미지에 있는 검은 또는 어두운 점들을 식별하도록 추가로 배치될 수 있다. 착색제들은 백혈구들의 세포핵들에 축적될 수 있기 때문에, 흡광도는 분리 지점들에서 피크들을 가질 수 있다. 이러한 지점들은 디지털 이미지에서 검은 점들을 형성하고, 백혈구들로서 분류될 수 있다.
이미지 분석기는 적어도 하나의 디지털 이미지에서 높은 흡광도의 식별 영역들의 형상 및 크기를 분석함으로써 상이한 타입들의 입자들 또는 백혈구들을 구별하도록 배치될 수 있다. 상이한 타입들의 백혈구들은 상이한 크기들을 갖기 때문에, 백혈구의 타입은 백혈구의 크기를 결정함으로써 식별될 수 있다. 또한, 상이한 타입들은 디지털 이미지에서 식별 영역들의 상이한 형상들을 제공하도록 상이하게 착색될 수 있다. 이는 또한 백혈구들의 타입을 식별하기 위해 사용될 수도 있다. 3가지 상이한 타입들의 백혈구들의 비율을 특정하는 상이한 백혈구 카운트는 백혈구들의 크기를 분석함으로써 달성될 수 있다. 5가지 상이한 타입들의 백혈구들을 구별하는 상이한 백혈구 카운트는 검사될 백혈구들의 추가적인 특징들을 요구할 수 있다. 예를 들어, 각각의 혈구의 세포핵들의 수, 혈구를 통하여 투과되는 광의 세기, 또는 혈구의 형상이 검사될 수 있다.
착색제는 백혈구들의 세포핵들을 선택적으로 착색하도록 배치될 수 있다. 이는 백혈구들이 색상을 가진 점들로서 식별될 수 있고, 이에 따라 디지털 이미지에서 용이하게 구별 및 카운트될 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 상이한 타입들의 백혈구들이 상이한 크기들을 갖기 때문에, 착색 스폿들(spots)의 크기는 백혈구들의 타입을 식별하는데 사용될 수 있다.
착색제는 Hematoxylin, 메틸렌 블루, 메틸렌 그린, 메틸렌 담청색(azure), 크레졸 바이올렛(cresyl violet) 아세테이트, 톨루이딘(Toluidine) 블루, 젠티안 바이올렛(Gentian violet), 수단 유사체들(Sudan analogues), 갈로시아닌(Gallocyanine), 및 푸친 유사체들(Fuchsin analogues), 또는 이들의 임의의 조합물의 그룹에 있는 임의의 하나일 수 있다. 그러나, 착색제는 이러한 그룹으로 제한되는 것이 아니라 많은 다른 물질들이 고려될 수 있다는 점을 고려해야 한다.
용혈제는 4기(quaternary) 암모늄 염, 사포닌(saponin), 디옥시콜산(deoxycholic acid)과 같은 담즙산(bile acid), 디키톡신(digitoxin), 뱀독(snake venom), 글루코피라노사이드(glucopyranoside) 또는 비-이온성 세제(non-ionic detergent) 타입의 트리톤(Triton)일 수 있다. 그러나, 용혈제는 이러한 그룹으로 제한되는 것이 아니라, 많은 다른 물질들이 고려될 수 있다는 점을 인식해야 한다.
측정 장치는 상이한 광학 셋팅들에 대해 공유되는 대물 렌즈를 추가로 포함할 수 있다. 이는 디지털 이미지들이 측정 캐비티내의 동일 지점에 중심을 갖도록, 동일한 광학 경로를 따라 이미징함으로써 디지털 이미지들이 획득될 수 있다는 것을 의미한다. 이는 측정 장치를 소형화시킨다.
일 실시예에 따라, 이미징 시스템은 적어도 2개의 부분적으로 분리된 부분들을 포함할 수 있고, 상기 부분들은 조사된 샘플로부터의 광을 이미징 시스템의 제 1 및 제 2 부분으로 지향시킨다. 이는 샘플로부터 이미징 시스템으로 광의 경로가 고정된 광학 셋업 내에서 규정될 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 측정 장치는 강건(robust)할 수 있고, 충격에 영향을 받지 않을 수 있다.
이미징 시스템은 이미징 시스템의 제 1 부분 또는 제 2 부분을 향해 대물 렌즈로부터 광을 지향시키기 위한 빔 스플리터를 추가로 포함할 수 있다. 이는 제 1 및 제 2 디지털 이미지가 동시에 획득될 수 있고, 이에 따라 분석이 매우 신속하게 수행될 수 있음을 의미한다.
이미징 시스템의 제 1 부분은 빔 스플리터로부터 직접 광을 수용하도록 배치될 수 있고, 즉 이미징 시스템의 제 1 부분과 빔 스플리터 사이에 광학 엘리먼트가 배치되지 않는다. 대안적으로, 대물 렌즈로부터 이미징 시스템의 제 1 부분으로 직접 광이 통과하도록 배치될 수 있다. 그 다음, 제 2 디지털 이미지를 획득하기 위해, 이미징 시스템의 제 2 부분으로 광을 편향시키기 위해 미러가 광 경로에 대신 삽입될 수 있다.
이미징 시스템은 디지털 이미지들을 획득하도록 구성된 이미징 시스템의 부분과 빔 스플리터 사이에 접안 렌즈를 추가로 포함할 수 있다. 이에 따라, 접안 렌즈는 상이한 타입들의 백혈구들을 구별하기 위해 추가적인 배율의 샘플을 제공할 수 있다. 바람직하게는, 렌즈 패키지들이 사용되고, 접안 렌즈 패키지는 이미지 평면과 대물 렌즈 패키지 사이의 관계를 변경하여 추가적인 배율을 허용하도록, 대물 렌즈 패키지 내에서 가상 주평면을 이동시킬 것이다.
이미징 시스템은 이미징 시스템의 초점이 맞게 위치되지 않는 세포들에 영향을 주기 위해 디지털 이미지들을 획득하도록 구성된 이미징 시스템의 부분과 빔 스플리터 사이에 광학 엘리먼트를 추가로 포함할 수 있고, 이에 따라 초점이 맞게 이미징되는 백혈구들의 식별이 촉진된다.
광학 엘리먼트는 이미징 시스템의 필드 깊이보다 훨씬 더 넓은 샘플 두께의 이미지가 획득되도록 허용한다. 광학 엘리먼트는 측정의 확실성을 증가시키기 위해 초점이 맞지 않는 세포들이 고려되지 않도록 보장한다. 광학 엘리먼트는 초점이 맞지 않는 세포들의 이미징에 영향을 주기 때문에, 포커싱된 세포들이 용이하게 식별된다. 광학 엘리먼트는 세포의 엣지가 백그라운드 세기(background intensity)보다 더 큰 오버슛 세기(overshoot intensity)를 포함할 것이며, 세포는 광을 흡수함으로써 이미징된다.
대안적 실시예에 따라, 이미징 시스템은 이미징 시스템의 제 2 부분과 빔 스플리터 사이에 파면 코딩(wavefront coding) 엘리먼트를 추가로 포함할 수 있다. 파면 코딩 엘리먼트는 중간부에서 상대적으로 평탄한 안장형(saddle-like) 형상을 갖지만 부채꼴형 엣지들을 갖는 파장판(waveplate)을 통하여 광선들을 통과시킴으로써 광선들을 의도적으로 왜곡시킨다. 이는 특정한 광 이탈(optical aberration)을 초래하고, 이미지가 흐리게 보이지만, 초점의 흐려짐(de-focus)은 넓은 범위의 거리들에 대해 동일하다. 따라서, 이러한 파면 코딩 엘리먼트는 분석될 수 있는 광학 축을 따라 깊이를 증가시킨다. 이미지의 왜곡들은 정확하게 알려져 있는 탈-포커싱 파면 코딩 엘리먼트의 형상에 의해 주로 결정된다. 따라서, 컴퓨터는 흐릿한 지점을 하나씩 제거할 수 있다. 컴퓨터는 본질적으로 디지털 필터를 이용하여 이미지를 디코딩할 수 있고, 이에 따라 넓은 필드 깊이에 대해 뚜렷한 이미지를 생성한다. 이러한 방식으로, 이미징 시스템의 필드 깊이는 증가될 수 있고, 더 넓은 샘플 깊이가 초점이 맞게 이미징되도록 할 수 있다.
다른 실시예에 따라, 이미징 시스템의 하나의 부분은 제 1 및 제 2 이미지를 모두 획득하도록 배치되고, 이미징 시스템의 배율 시스템의 적어도 일부분은 상이한 광학 셋팅들을 이용하여 제 1 및 제 2 디지털 이미지를 획득하기 위해 스위칭가능할 수 있다. 이는 측정 장치가 이미징 시스템의 하나의 단일 부분만을 포함할 필요가 있음을 의미한다. 또한, 예를 들어 광학 축을 따라 명확하게 규정된 지점들 간에 이동가능한 주 렌즈를 제공함으로써, 몇가지 상이한 광학 셋팅들이 사용될 수 있도록 허용한다.
이미징 시스템은 제 1 디지털 이미지를 획득하기 위해 광학 셋팅들에서 더 넓은 배율이 사용되도록 배치될 수 있다. 이는 세부사항들이 제 2 디지털 이미지에서 양호하게 관찰될 수 있고, 이에 따라 상이한 타입들의 백혈구들이 보다 용이하게 서로 구별될 수 있음을 의미한다.
제 1 디지털 이미지를 획득하기 위해 광학 셋팅들이 사용되는 이미징 시스템은 1-50x의 배율, 보다 바람직하게는 1-20x, 보다 바람직하게는 3-20x, 보다 바람직하게는 3-10x, 보다 바람직하게는 약 4x의 배율을 가질 수 있다. 이러한 범위들의 배율 내에서, 백혈구들은 충분하게 확대되어 검출되고, 이미징 시스템은 이미지 내의 혈구들의 수를 계산하기 위해 충분한 초점 내에서 샘플 두께를 이미징하도록 배치될 수 있다. 따라서, 이미징 시스템은 샘플 두께를 커버하는 필드 깊이를 가질 수 있다. 그러나, 전체 샘플 두께는 종래 규정의 필드 깊이를 이용하여, 이미징 시스템의 필드 깊이 내에서 이미징될 필요가 없다. 초점이 약간 맞지 않게 이미징되는 세포들은 독창적인 이미지 분석을 이용하여 정확하게 카운트될 수 있다. 낮은 배율은 넓은 "필드 깊이"가 달성될 수 있음을 의미한다. 따라서, 넓은 샘플 두께가 허용될 수 있고, 넓은 부피가 분석될 수 있다. 그러나, 낮은 배율이 사용되면, 각각의 혈구가 3-4 픽셀들과 같은 매우 적은 픽셀들 위에 이미징되기 때문에, 백혈구들을 검출하기가 어려울 수 있다. 획득된 이미지에서 픽셀들의 수를 증가시킴으로써, 즉 디지털 이미지의 해상도를 개선함으로써, 보다 낮은 배율이 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 백혈구들이 검출될 수 있도록 하면서 1-4x의 광학 배율을 사용할 수 있다.
제 2 디지털 이미지를 획득하기 위해 사용되는 광학 셋팅들을 갖는 이미징 시스템은 1-50x, 보다 바람직하게는 1-20x, 보다 바람직하게는 3-20x, 보다 바람직하게는 5-20x, 보다 바람직하게는 약 10x의 배율을 가질 수 있다. 이러한 범위들의 배율 내에서, 백혈구들은 상이한 타입들의 백혈구들을 구별하기 위하여 충분하게 확대된다. 초점이 맞게 이미징되는 세포들을 강조하고 이러한 백혈구들의 식별을 용이하게 하기 위해 광학 엘리먼트를 사용함으로써 보다 낮은 배율이 사용될 수 있다.
이미징 시스템은 샘플 획득 장치의 측정 캐비티의 적어도 두께의 필드 깊이를 갖는 제 1 이미지를 획득하도록 배치될 수 있다. 이는 측정 캐비티의 전체 두께가 샘플의 디지털 이미지에서 동시에 분석될 수 있도록 전체 샘플 두께의 충분한 포커스가 달성됨을 의미한다. 따라서, 측정 캐비티에서 백혈구들이 침전되도록 기다릴 필요가 없고, 이에 따라 분석을 수행하기 위한 시간이 감소된다. 그러나, 적혈구들이 용혈되도록 하는 반응을 대기할 필요가 있고, 측정 캐비티에 샘플이 유입되어 침전됨으로써 발생하는 이동들을 대기할 필요가 있을 수 있다. 이러한 대기 시간은 30초 이하의 크기로 매우 짧다. 샘플의 특정 부분 상에 매우 뚜렷하게 포커싱되지 않도록 선택함으로써, 샘플에 있는 백혈구들의 수를 식별할 수 있도록 전체 샘플 두께의 충분한 포커스가 달성된다. 이는 백혈구가 다소 흐려질 수 있고 필드 깊이의 초점에 있도록 고려될 수 있음을 의미한다. 따라서, 분석된 샘플 부피는 이미징되는 측정 캐비티의 단면적을 특정하는 디지털 이미지의 크기와 측정 캐비티의 두께에 의해 선명하게 규정될 수 있다.
이미징 시스템은 50-200㎛ 범위의 필드 깊이를 갖는 제 1 이미지를 획득하도록 배치될 수 있다. 이러한 필드 깊이는 측정 캐비티의 깊이 또는 두께와 일치하도록 적용될 수 있다. 적어도 50㎛의 깊이는 작은 단면적에 대해 보다 많은 부피의 혈액이 분석될 수 있도록 하고, 이에 따라 샘플의 혈구들이 단층으로 압축되는 것을 방지한다. 따라서, 백혈구 카운트의 신뢰가능한 값들을 제공하기 위해, 충분하게 많은 부피의 혈액 샘플은 혈액 샘플의 상대적으로 작은 이미지를 이용하여 분석될 수 있다. 또한, 충분한 배율을 갖는 디지털 이미지를 획득하면서 200㎛를 초과하는 필드 깊이를 달성하는 것은 어렵다. 170㎛를 초과하는 필드 깊이를 달성하기도 어렵다.
이미징 시스템은 2-60㎛ 범위의 필드 깊이를 갖는 제 2 이미지를 획득하도록 배치될 수 있다. 이는 측정 캐비티의 두께의 일부분을 이미징함으로써 달성될 수 있다. 그러한 경우, 측정 캐비티의 두께의 이러한 부분만이 초점이 맞게 이미징된다. 그 다음, 제 2 디지털 이미지는 백혈구들의 타입을 결정하기 위해 충분하게 초점이 맞게 이미징되는 백혈구들만을 계산함으로써 분석된다. 제 2 디지털 이미지는 상이한 타입들의 백혈구들의 비율을 결정하기 위해 사용되기 때문에, 명확하게 규정된 부피를 이미징하는 것은 중요하지 않다. 따라서, 측정 캐비티의 동일한 부분을 이미징함으로써 적절한 제 1 및 제 2 이미지를 획득할 수 있다. 그러나, 제 2 이미지는 대안적으로, 측정 캐비티의 상이한 부분을 이미징하여 획득될 수 있고, 이에 따라 이러한 부분은 제 2 이미지를 획득하기 위해 이미징 시스템의 필드 깊이에 해당하는 두께를 가질 수 있다.
이미지 분석기는 적어도 하나의 획득된 이미지를 전자적으로 확대하도록 배치될 수 있다. 샘플은 샘플의 확대된 디지털 이미지를 획득하기 위해 확대되지만, 획득된 디지털 이미지 자체는 획득된 디지털 이미지에서 서로 매우 근접하게 이미징되는 대상물들의 구별을 간략화하기 위해 전자적으로 확대될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따라, 혈액 샘플에 있는 백혈구들의 계산을 위해 샘플 획득 장치가 제공된다. 샘플 획득 장치는 혈액 샘플을 수용하기 위한 측정 캐비티를 포함한다. 측정 캐비티는 측정 캐비티의 내부 벽들 간에 규정되는 미리 결정된 제 1 및 제 2 고정 두께를 갖고, 제 1 두께는 혈액 샘플에 있는 백혈구들의 총 용적 계산을 결정하기 위해 적용되며, 제 2 두께는 혈액 샘플 내에서 상이한 타입들의 백혈구들의 비율을 결정하기 위해 적용된다. 혈액 획득 장치는 측정 캐비티를 규정하는 표면 상에 건조된 형태로 배치되는 반응제를 추가로 포함한다. 반응제는 혈액 샘플에 있는 적혈구들을 용해하기 위한 용혈제, 및 혈액 샘플에 있는 백혈구들을 선택적으로 착색하기 위한 착색제를 포함한다.
샘플 획득 장치는 측정 캐비티에 전체 혈액의 샘플을 직접 획득하고 분석을 위해 이를 제공하는 성능을 제공한다. 샘플 준비는 필요하지 않는다. 사실상, 혈액 샘플은 바늘에 찔린 환자의 손가락으로부터 직접 측정 캐비티로 흡입될 수 있다. 샘플 획득 장치에 반응제를 제공하는 것은 샘플 획득 장치 내에서 반응을 가능하게 하고, 이는 샘플이 분석 준비되도록 한다. 혈액 샘플이 반응제와 접촉될 때 반응이 개시된다. 따라서, 샘플을 수동으로 마련할 필요가 없고, 특히 환자가 대기하면서 검사실에서 직접 분석이 수행되기 적합하도록 한다.
반응제가 건조된 형태로 제공되기 때문에, 샘플 획득 장치는 샘플 획득 장치의 유용성에 영향을 주지 않으면서 오랜 시간 동안 이송 및 보관될 수 있다. 따라서, 반응제를 가진 샘플 획득 장치는 혈액 샘플의 분석을 수행하기 오래 전에 제조 및 준비될 수 있다.
많은 현존하는 방법들은 상이한 혈구들 및 혈구들의 서브그룹들도 카운트할 수 있는 반면에, 본 발명에 따른 샘플 획득 장치는 특히 백혈구들의 계산을 수행하도록 구성된다. 반응제는 혈액 샘플에 있는 적혈구들을 용해하는 용혈제를 포함한다. 이는 샘플에 있는 적혈구들을 계산할 가능성들을 제거시킨다. 한편, 적혈구들의 용해는 혈액 샘플 내에 있는 백혈구들의 구별 및 식별을 간소화시킨다.
착색제는 개별적인 백혈구들의 마킹을 제공한다. 이는 백혈구들이 개별적으로 관찰 또는 검출될 수 있도록 한다. 백혈구들은 예를 들어, 측정 캐비티를 스캐닝하거나 측정 캐비티의 이미지를 획득함으로써 검출될 수 있다.
샘플 획득 장치는 특히 용적측정 백혈구 카운트의 결정을 용이하게 하도록 구성된 측정 캐비티의 제 1 두께를 추가로 제공한다. 측정 캐비티는 매우 큰 부피의 혈액 샘플이 분석될 수 있도록 하는 충분한 두께를 가질 수 있고, 이에 따라 용적측정 백혈구 카운트를 결정하기 위한 양호한 통계치를 허용한다. 이에 따라 백혈구 카운트는 규정된 부피로 개별적으로 검출된 백혈구들의 수를 합산함으로써 달성될 수 있다.
특히, 샘플 획득 장치는 또한 상이한 타입들의 백혈구들의 구별을 용이하게 하도록 구성된 측정 캐비티의 제 2 두께를 제공한다. 이와 관련하여, 제 2 두께는 제 1 두께보다 더 얇고, 보다 큰 배율의 필드 깊이 내에서 제 2 두께 전체가 이미징될 수 있도록 한다. 그러한 보다 큰 배율은 타입과 무관하게 혈액 샘플 내의 백혈구들의 총 수만을 결정하기 위해, 이미징과 대비하여 상이한 타입들의 백혈구들을 구별할 때 필요할 수 있다.
샘플 획득 장치는 상기 측정 캐비티를 규정하기 위해 내측 벽들을 형성하는 2개의 평면형 표면들을 가진 몸체 부재를 포함할 수 있다. 평면형 표면들은 광학 측정을 위해 샘플 깊이를 결정하도록 서로간에 미리 결정된 거리로 배치될 수 있다. 이는 혈액 샘플의 용적측정 단위당 백혈구 카운트를 정확히 결정하기 위해 사용될 수 있는 광학 측정에 대한 명확하게 규정된(well-defined) 깊이를 샘플 획득 장치가 제공함을 의미한다. 분석된 샘플의 부피는 측정 캐비티의 깊이 및 이미징되는 샘플의 면적에 의해 명확해질 것이다. 따라서, 명확하게 규정된 부피는 용적측정 백혈구 카운트가 결정되도록 백혈구들의 수를 혈액 샘플의 부피와 연관시키기 위해 사용될 수 있다.
측정 캐비티는 50-200㎛의 균일한 제 1 깊이를 갖는 것이 바람직하다. 적어도 50㎛의 깊이는 측정 캐비티가 혈액 샘플이 손상되게 단층으로 가압하지 않으며, 이에 따라 작은 단면적에 대해 보다 큰 부피의 혈액이 분석될 수 있도록 한다. 따라서, 백혈구 카운트의 신뢰가능한 값들을 제공하기 위해 충분하게 많은 부피의 혈액 샘플이 혈액 샘플의 상대적으로 작은 이미지를 이용하여 분석될 수 있다. 제 1 깊이는 보다 바람직하게는 적어도 100㎛이고, 이는 보다 작은 단면적이 분석되거나 보다 많은 부피가 분석될 수 있도록 한다. 추가적으로, 적어도 50㎛, 보다 바람직하게는 100㎛의 제 1 깊이는 2개의 평면형 표면들 간에 명확하게 규정된 깊이를 갖는 측정 캐비티의 제조를 간소화시킨다.
200㎛ 이하의 두께를 갖는 캐비티에 배치되는 대부분의 샘플들에 대해, 백혈구 카운트가 너무 느려서 서로 중첩되게 배치되는 백혈구들로 인해 약간의 편차들만이 있을 것이다. 그러나, 그러한 편차들의 영향은 백혈구 카운트에 관련되고, 이에 따라 적어도 백혈구 카운트의 큰 값들에 대해 통계적으로 정확한 결과들에 의해 적어도 어느 정도까지 처리될 수 있다. 이러한 통계적 수정은 측정 장치의 보정들을 기반으로 할 수 있다. 편차들은 170㎛ 이하의 제 1 두께를 갖는 측정 캐비티에 대해 적고, 150㎛ 이하의 제 1 두께를 갖는 측정 캐비티에 대해서도 적으며, 이에 따라 보다 간단한 보정이 수행될 수 있다. 이러한 두께는 중첩되는 혈구들에 대한 어떠한 보정도 요구하지 않을 수 있다.
또한, 측정 캐비티의 제 1 두께는 측정 캐비티의 전체 깊이가 동시에 분석될 수 있도록 측정 장치가 디지털 이미지를 획득하기에 충분하게 작다. 배율 시스템(magnifying system)이 측정 장치에 사용되기 때문에, 큰 필드 깊이를 달성하기가 용이하지 않다. 따라서, 측정 캐비티의 제 1 두께는 디지털 이미지에서 전체 두께가 동시에 분석될 수 있도록 150㎛를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 필드 깊이는 170㎛ 또는 200㎛의 측정 캐비티의 제 1 두께를 처리하도록 배치될 수 있다.
측정 캐비티는 20-60㎛의 균일한 제 2 두께를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 측정 캐비티의 제 2 두께는 상이한 타입들의 백혈구들을 구별하기 위해 필요한 배율의 필드 깊이 내에서 제 2 두께 전체가 이미징될 수 있도록 한다. 또한, 제 2 두께는 충분한 부피가 이미징되도록 허용하여 많은 수의 백혈구들이 분석될 수 있도록 한다. 이는 상이한 타입들의 백혈구들의 비율이 양호한 통계적 확실성을 갖도록 결정될 수 있게 한다. 전형적으로, 200 백혈구들의 타입을 분석하는 것이 바람직하다.
기화되어 건조된 형태로 반응제를 남겨두는 휘발성 액체에 용해되는 표면에 도포된 반응제가 샘플 획득 장치에 제공될 수 있다.
반응제는 측정 캐비티에 삽입되기 이전에 휘발성 액체에 용해되는 것이 바람직하다는 것을 인식하였다. 이는 샘플 획득 장치의 제조 및 준비 동안 측정 캐비티의 좁은 공간으로부터 액체가 효과적인 방식으로 기화될 수 있음을 의미한다. 반응제는 제 1 두께의 측정 캐비티의 부분에 건조된 형태로 배치될 수 있는 것이 바람직하다.
반응제는 유기 용매, 보다 바람직하게는 메탄올에 용해될 수 있는 것이 바람직하다. 그러한 용매들은 휘발성이고 측정 캐비티의 표면 상에 반응제를 건조시키기 위해 적절히 사용될 수 있다.
샘플 획득 장치는 측정 캐비티를 샘플 획득 장치의 외부와 소통시키는 샘플 입구를 추가로 포함할 수 있으며, 샘플 입구는 혈액 샘플을 획득하도록 배치된다. 샘플 입구는 모세관력에 의해 혈액 샘플을 추출하도록 배치될 수 있고, 측정 캐비티는 샘플 입구로부터 캐비티로 혈액을 추가로 추출할 수 있다. 또한, 샘플 획득 장치는 제 1 두께의 측정 캐비티의 일부분으로 샘플을 먼저 추출하도록 배치될 수 있다. 그 다음, 샘플의 부분은 모세관력에 의해 제 2 두께의 측정 캐비티의 일부분으로 추가로 이송될 수 있다. 결과적으로, 혈액 샘플은 혈액과 접촉되게 샘플 입구를 간단히 이동시킴으로써 측정 캐비티로 용이하게 획득될 수 있다. 그 다음, 샘플 입구와 측정 캐비티의 모세관력들은 명확하게 규정된 양의 혈액을 측정 캐비티로 추출한다. 대안적으로, 혈액 샘플은 외부의 펌핑력을 샘플 획득 장치에 인가함으로써 측정 캐비티로 흡입 또는 추출될 수 있다. 다른 대안에 따라, 혈액 샘플은 피펫(pipette)으로 획득된 다음, 피펫에 의해 측정 캐비티로 유입될 수 있다.
샘플 획득 장치는 1회용일 수 있고, 즉 한번만 사용되도록 배치된다. 샘플 획득 장치는 혈액 샘플을 수용할 수 있고 백혈구 카운팅에 대해 샘플을 표시하기 위해 필요한 모든 반응제들을 보유하고 있기 때문에, 백혈구 카운트를 수행하기 위한 키트(kit)를 제공한다. 특히, 이는 샘플 획득 장치가 1회만 사용하도록 구성되고 샘플 획득 장치를 세정하고 반응제를 다시 인가하는 가능성들의 고려 없이 형성될 수 있기 때문에 가능해진다. 또한, 샘플 획득 장치는 플라스틱 물질로 성형될 수 있고, 이에 따라 낮은 가격으로 제조될 수 있다. 따라서, 1회용 샘플 획득 장치를 사용하는 것이 여전히 비용-효율적일 수 있다.
본 발명은 또한 샘플의 분석을 위해 컴퓨터-판독가능한 매체에 내장되는 컴퓨터 프로그램 제품에 관한 것으로서, 샘플에 있는 입자들의 수를 결정하기 위해 샘플의 적어도 하나의 이미지를 디지털 분석하기 위한 컴퓨터 코드; 샘플의 포커싱된 영역에 있는 하나 이상의 타입의 입자들을 식별하기 위해 샘플의 적어도 하나의 이미지를 디지털 분석하기 위한 컴퓨터 코드 - 입자의 각각의 타입은 하나 이상의 상이한 물리적 특징들과 연관됨 -; 및 샘플에 있는 입자들의 수와 타입들에 해당하는 정보를 출력하기 위한 컴퓨터 코드를 포함한다. 본 발명은 또한 샘플을 분석하기 위한 컴퓨터 프로그램에 관한 것으로서, 컴퓨터 프로그램은, 입자들을 식별하고 샘플에 있는 입자들의 수를 결정하기 위해 적어도 하나의 디지털 이미지를 분석하기 위한 컴퓨터 코드, 및 초점이 맞게 이미징되는 입자들을 식별하고 이러한 입자들의 수와 타입들을 결정하기 위해 적어도 하나의 디지털 이미지를 분석하기 위한 컴퓨터 코드를 포함하며, 상기 타입들은 입자들의 물리적 특징들에 의해 구별되고, 이에 따라 샘플에 있는 상이한 타입들의 입자들의 비율이 결정된다.
본 발명은 첨부된 도면들을 참조로 예로서 보다 상세히 기술될 것이다.
도 1은 샘플 획득 장치의 개념도이다.
도 2는 제 1 실시예에 따른 측정 장치의 개념적인 블록도이다.
도 3은 제 2 실시예에 따른 측정 장치의 개념적인 블록도이다.
도 4는 본 발명의 제 1 실시예에 따른 방법의 흐름도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 이동식 렌즈에 대한 배치의 개념도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 배치의 개념도이다.
도 7은 상이한 3개의 층들에서 이미징되는 샘플을 도시한다.
도 8a는 도 10에 따른 측정 장치에 초점이 맞지 않는 백혈구가 위치될 때 카메라로 본 백혈구를 도시한다.
도 8b는 도 10에 따른 측정 장치에 초점이 맞게 백혈구가 위치될 때 카메라로 본 백혈구를 도시한다.
도 8c는 도 10에 따른 측정 장치에 초점이 맞지 않게 백혈구가 위치될 때 카메라로 본 백혈구를 도시한다.
도 9a는 도 10에 따른 측정 장치의 초점이 맞지 않게 세포가 위치될 때, 분석되는 세포의 단면적의 기록 명암도들(intensities)을 도시한다.
도 9b는 도 10에 따른 측정 장치의 초점이 맞게 세포가 위치될 때, 분석되는 세포의 단면적의 기록 명암도들을 도시한다.
도 9c는 도 10에 따른 측정 장치의 초점이 맞지 않게 세포가 위치될 때, 분석되는 세포의 단면적의 기록 명암도들을 도시한다.
도 10은 제 3 실시예에 따른 측정 장치의 개념도이다.
도 11은 본 발명의 제 2 실시예에 따른 방법의 흐름도이다.
도 12는 제 4 실시예에 따른 측정 장치의 개념도이다.
도 1을 참조하면, 제 1 실시예에 따른 샘플 획득 장치(10)가 기술된다. 샘플 획득 장치(10)는 1회용인 것이 바람직하고, 분석을 위해 사용된 이후 폐기될 것이다. 이는 샘플 획득 장치(10)가 복잡한 취급을 요구하지 않음을 의미한다. 샘 플 획득 장치(10)는 플라스틱 물질로 형성되는 것이 바람직하고, 사출 성형에 의해 제조될 수 있다. 이는 샘플 획득 장치(10)의 제조를 간단하고 저렴하게 하며, 이에 따라 샘플 획득 장치(10)의 비용이 낮게 유지될 수 있다.
샘플 획득 장치(10)는 베이스(14)를 구비한 몸체 부재(12)를 포함하고, 베이스(14)는 분석 결과들을 전혀 방해함이 없이 오퍼레이터에 의해 터치될 수 있다. 베이스(14)는 또한 분석 장치에 홀더를 설치할 수 있는 돌출부들(16)을 가질 수 있다. 돌출부들(16)은 샘플 획득 장치(10)가 분석 장치에 정확하게 위치되도록 배치될 수 있다.
샘플 획득 장치(10)는 샘플 입구(18)를 추가로 포함한다. 샘플 입구(18)는 샘플 획득 장치(10)내의 대향 벽들 사이에 규정되고, 벽들은 서로 근접하게 배치되어 모세관력이 샘플 입구(18)에 생성될 수 있다. 샘플 입구(18)는 혈액이 샘플 획득 장치(10)로 추출될 수 있도록 샘플 획득 장치(10)의 외부와 소통된다. 샘플 획득 장치(10)는 샘플 획득 장치(10) 내부의 대향 벽들 사이에 배치되는 측정 캐비티(20)의 형태로 백혈구들을 카운팅하기 위한 챔버를 추가로 포함한다. 측정 캐비티(20)는 샘플 입구(18)와 소통되게 배치된다. 측정 캐비티(20)를 규정하는 벽들은 모세관력에 의해 샘플 입구(18)로부터 측정 캐비티(20)로 혈액을 추출할 수 있도록, 샘플 입구(18)의 벽들보다 보다 근접하게 함께 배치된다.
측정 캐비티(20)는 제 1 두께를 갖는 제 1 부분(20a), 및 보다 작은 제 2 두께를 갖는 제 2 부분(20b)를 구비한다. 제 1 부분(20a)은 샘플 입구(18)와 소통되는 반면에, 제 2 부분(20b)은 제 1 부분(20a)과 소통된다. 따라서, 측정 캐비 티(20)의 제 1 부분(20a)으로부터 제 2 부분(20b)으로 모세관력에 의해 혈액이 추출될 수 있다.
측정 캐비티(20)의 제 1 부분(20a)의 벽들은 50-200㎛ 만큼의 거리로 서로 이격되게 배치된다. 제 1 부분(20a)은 보다 바람직하게는 적어도 100㎛ 두께이다. 또한, 제 1 부분(20a)은 보다 바람직하게는 150㎛ 두께 이하이다. 제 1 부분(20a) 전체에 대해 거리는 대체로 일정하다. 제 1 부분(20a)의 두께는 검사되는 혈액의 부피를 규정한다. 분석 결과는 검사되는 혈액 샘플의 부피와 비교되기 때문에, 제 1 부분(20a)의 대체로 일정한 두께는 매우 정확할 필요가 있으며, 즉 두께에 있어서 매우 작은 편차들만이 상이한 샘플 획득 장치들(10)의 제 1 부분들(20a) 사이에서 허용된다. 작은 면적의 캐비티에서 상대적으로 많은 샘플 부피가 분석될 수 있도록 두께가 선택되어, 충분한 수의 입자들 또는 세포들이 카운팅을 위해 이용가능하다. 측정 캐비티(20)의 제 1 부분(20a)은 특히 혈액 샘플의 용적측정 백혈구 총 수를 결정하도록 구성된다. 제 1 부분(20a)의 전체 두께는 이미징 시스템의 필드 깊이 내에서 이미징될 수 있도록 선택될 수 있다. 그 다음, 이미지가 분석될 수 있고, 이미지에 존재하는 백혈구들의 수가 카운팅되어 용적측정 백혈구 카운트를 결정할 수 있다.
샘플 획득 장치(10)는 전형적으로 0.5×109 cells/litre 혈액을 초과하는 백혈구 수를 측정하도록 구성된다. 훨씬 더 적은 백혈구 수들에서, 통계적으로 충분한 양의 백혈구들이 카운팅될 수 있도록 하기에 샘플 부피가 너무 작을 것이다. 또한, 백혈구 수가 12×109 cells/litre 혈액을 초과하면, 서로 중첩되게 배치되는 혈구들의 영향은 측정되는 백혈구 수에 있어서 중요해지기 시작할 것이다. 이러한 백혈구 수에서, 제 1 부분(20a)의 두께가 140㎛인 경우, 백혈구들은 분석되는 샘플의 단면적의 약 8%를 점유할 것이다. 따라서, 정확한 백혈구 수를 획득하기 위해, 이러한 영향이 고려될 필요가 있다. 따라서, 12×109 cells/litre 혈액을 초과하는 백혈구 수의 값들의 통계적 정확도가 사용될 수 있다. 백혈구 수가 증가함에 따라 중첩하는 혈구들의 영향이 증가하기 때문에, 백혈구 수가 증가함으로써 이러한 통계적 정확도는 증가할 것이다. 통계적 정확도는 측정 장치의 보정에 의해 결정될 수 있다. 대안예로서, 통계적 정확도는 샘플 획득 장치(10)와 연계하여 사용되는 측정 장치들을 셋업하기 위한 범용 레벨에서 결정될 수 있다. 이러한 통계적 정확도는 Coulter 규칙을 사용하는 분석 장치에서 현재 수행되는 통계적 정확도들과 유사한 크기이다. 샘플 획득 장치(10)가 50×109 cells/litre 혈액만큼 큰 백혈구 수를 분석하는데 사용될 수 있음을 고려한다.
측정 캐비티(20)의 제 2 부분(20b)은 특히 혈액 샘플에 있는 상이한 타입들의 백혈구들의 비율을 결정하도록 구성된다. 제 2 부분(20b)의 전체 두께는 이미징 시스템의 필드 깊이 내에서 이미징된다. 그 다음, 이미지가 분석될 수 있고, 이미지에 존재하는 각 타입의 백혈구들의 수가 카운팅되어 상이한 타입들의 백혈구들의 비율을 결정할 수 있다.
측정 캐비티(20)의 제 2 부분(20b)의 벽들은 20-60㎛의 거리로 서로 이격되 게 배치된다. 상기 거리는 제 2 부분(20b) 전체에 대해 대체로 일정하다. 분석은 주로 상이한 타입들의 백혈구들의 수를 서로 비교하도록 의도되기 때문에, 분석되는 정확한 부피를 아는 것은 중요하지 않다. 따라서, 제 2 부분(20b)의 두께는 제 1 부분(20a)의 두께만큼 정밀할 필요가 없다. 제 2 부분(20b)의 두께는 통계적으로 의미있는 결과들을 획득하기 위해 충분한 양의 백혈구들이 분석될 필요가 있다. 또한, 전술한 것처럼, 제 2 부분(20b)의 두께는 이미징 시스템의 필드 깊이 내에서 그 전체가 이미징되도록 구성되어야 한다. 따라서, 샘플 내에 있는 모든 백혈구들이 초점이 맞게 이미징되고, 샘플의 분석은 초점이 맞지 않게 이미징되는 샘플의 부분들로부터 이미지의 노이즈에 의해 방해받지 않는다. 제 2 부분(20b)은 제 2 부분 전체가 이미징 시스템의 필드 깊이 내에서 이미징되도록 하면서 보다 큰 배율이 사용될 수 있도록 하기 위해, 제 1 부분(20a)보다 더 얇다. 보다 큰 배율은 백혈구들의 총 수를 카운팅하기 위해서 뿐만 아니라 백혈구들의 타입을 결정하기 위해 필요할 수 있다.
측정 캐비티(20)의 벽의 표면은 적어도 부분적으로 반응제(22)로 코팅된다. 반응제(22)는 냉동-건조, 열-건조 또는 진공-건조될 수 있고, 측정 캐비티(20)의 표면에 제공될 수 있다. 혈액 샘플이 측정 캐비티(20)에 획득될 때, 혈액이 건조된 반응제(22)와 접촉되고, 반응제(22)와 혈액 간에 반응이 시작될 것이다.
반응제(22)는 피펫 또는 디스펜서를 이용하여 측정 캐비티(20)내에 반응제(22)를 삽입함으로써 제공된다. 반응제(22)는 측정 캐비티(20)에 삽입될 때, 예를 들어 메탄올과 같은 유기 용매인 휘발성 액체로 용해된다. 반응제(22)의 용매 는 측정 캐비티(20)를 충전(fill)시킬 수 있다. 그 다음, 건조가 수행되어, 용매가 기화되고 반응제(22)가 측정 캐비티(20)의 표면들에 부착된다.
반응제가 좁은 공간의 표면 상에 건조되기 때문에, 액체는 대기와 접촉하는 매우 작은 표면을 갖고, 이에 따라 제공되는 액체의 기화가 보다 어렵다. 따라서, 측정 캐비티의 좁은 공간으로부터 효과적인 방식으로 액체가 기화될 수 있도록, 메탄올과 같은 휘발성 액체를 사용하는 것이 바람직하다.
대안적인 제조 방법에 따라, 샘플 획득 장치(10)는 2개의 부품들(pieces)을 서로 부착함으로써 형성될 수 있으며, 이에 따라 하나의 부품은 측정 캐비티(20)의 바닥 벽을 형성하고, 다른 하나의 부품은 측정 캐비티(20)의 최상부 벽을 형성한다. 이는 2개의 부품들이 서로 부착되기 이전에 개방 표면 상에서 반응제(22)가 건조될 수 있도록 한다. 따라서, 용매가 휘발성일 필요는 없기 때문에, 반응제(22)는 물에 용해될 수 있다.
반응제(22)는 적혈구 용혈제 및 백혈구 착색제를 포함한다. 용혈제는 4기(quaternary) 암모늄 염, 사포닌(saponin), 디옥시콜산(deoxycholic acid)과 같은 담즙산(bile acid), 디키톡신(digitoxin), 뱀독(snake venom), 글루코피라노사이드(glucopyranoside) 또는 비-이온성 세제(non-ionic detergent) 타입의 트리톤(Triton)일 수 있다. 착색제는 Hematoxylin, 메틸렌 블루, 메틸렌 그린, 메틸렌 담청색(azure), 크레졸 바이올렛(cresyl violet) 아세테이트, 톨루이딘(Toluidine) 블루, 젠티안 바이올렛(Gentian violet), 수단 유사체들(Sudan analogues), 갈로시아닌(Gallocyanine), 및 푸친 유사체들(Fuchsin analogues), 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다. 혈액 샘플이 반응제(22)와 접촉될 때, 용혈제는 적혈구들을 용해시키도록 작용하여, 용해된 적혈구들이 혈장(blood plasma)과 혼합되도록 한다. 또한, 착색제는 백혈구들의 세포핵들에 축적된다. 반응제(22)는 백혈구들의 모든 세포핵들을 구별되게 착색하기 위해 충분한 양의 착색제를 포함해야 한다. 따라서, 혈장에서 상호 혼합되는 착색제의 잔류물(surplus)이 종종 존재한다. 착색제의 잔류물은 균질한, 낮은 백그라운드 레벨의 착색제를 혈장에 제공할 것이다. 백혈구들의 축적된 착색제는 백그라운드 레벨의 착색제에 대해 구별가능해진다.
또한, 반응제(22)는 혈액 샘플과의 화학적 반응에 참여하는 활성일 수 있거나, 또는 혈액 샘플과의 화학적 반응에 참여하지 않는 불활성일 수 있는, 다른 성분들을 포함할 수 있다. 활성 성분들은 예를 들어, 용혈 또는 착색 작용을 촉진시키도록 배치될 수 있다. 불활성 성분들은 예를 들어, 측정 캐비티(20)의 벽의 표면에 반응제(22)를 부착시키는 것을 향상시키도록 배치될 수 있다.
수분 이내 또는 1분 미만에서, 혈액 샘플은 반응제(22)와 반응하여, 적혈구들이 용해되고, 착색제가 백혈구들의 세포핵들에 축적된다.
도 2를 참조하면, 혈액 샘플에 있는 백혈구들의 분석을 위한 측정 장치(30)의 제 1 실시예가 기재될 것이다. 장치(30)는 혈액 샘플과 함께 샘플 획득 장치(10)를 수용하기 위한 샘플 홀더(32)를 포함한다. 샘플 홀더(32)는 샘플 획득 장치(10)를 수용하도록 배치되어, 샘플 획득 장치(10)의 측정 캐비티(20)가 장치(30)내에 정확히 배치된다. 장치(30)는 샘플 획득 장치(10)내의 혈액 샘플을 조명하기 위한 광원(34)을 포함한다. 광원(34)은 전체 가시광선 스펙트럼에서 광을 조사하는 백열 램프일 수 있다. 백혈구들의 세포핵들에 축적되는 착색제는 특정 파장들의 광을 흡수하여, 백혈구들의 세포핵들이 샘플의 디지털 이미지에 나타난다. 컬러 이미지가 획득되면, 백혈구들은 특히 컬러 점들로서 나타날 것이다. 흑백 이미지가 획득되면, 백혈구들은 보다 밝은 백그라운드에 대해서 어두운 점들로서 나타날 것이다.
광원(34)은 대안적으로 레이저 또는 발광 다이오드일 수 있다. 이는 백혈구들이 보다 용이하게 검출될 수 있도록 이미지의 명암비(contrast)를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 이 경우, 광원(34)은 착색제의 흡수 피크에 해당하는 파장의 전자기 광을 방출하도록 배치된다. 파장은 혈액에 있는 비-백혈구 성분들이 상대적으로 낮도록 추가적으로 선택되어야 한다. 또한, 샘플 획득 장치(10)의 벽들은 필수적으로 파장에 대해 투과성이어야 한다. 예를 들어, 메틸렌 블루가 착색제로서 사용될 때, 광원(34)은 667nm의 파장을 갖는 광을 조사하도록 배치될 수 있다.
장치(30)는 광원(34)에 대해 샘플 홀더(32)의 대향 측면 상에 배치되는 이미징 시스템(36)을 추가로 포함한다. 따라서, 이미징 시스템(36)은 혈액 샘플을 통하여 투과된 광을 수용하도록 배치된다. 본 실시예의 이미징 시스템(36)은 2개의 분리 부분들로 분할되는 확대(magnifying) 수단(38)을 포함한다. 확대 수단(38)의 제 1 부분(38a)은 측정 캐비티(20)의 제 1 부분(20a)에서 혈액 샘플을 통과하여 투과되는 광을 수용하도록 배치된다. 이미징 시스템은 제 1 이미지 획득 수단(40)을 추가로 포함하고, 제 1 이미지 획득 수단(40)은 확대 수단(38)의 제 1 부분(38a)에 의해 확대되는 바와 같은 측정 캐비티(20)의 제 1 부분(20a)을 이미징하도록 배치 된다. 확대 수단(38)의 제 1 부분(38a)은 1-50x의 배율, 보다 바람직하게는 1-20x, 가장 바람직하게는 1-4x의 배율을 제공하도록 배치된다. 이러한 범위들의 배율 내에서, 백혈구들을 구별할 수 있다. 보다 낮은 배율이 사용될 수 있도록 하기 위해, 개선된 해상도를 갖는 이미지가 획득될 수 있다. 또한, 확대 수단(38)의 제 1 부분(38a)의 필드 깊이는 측정 캐비티(20)의 두께를 포함하도록 배치될 수 있다.
확대 수단(38)의 제 1 부분(38a)은 샘플 홀더(32)와 근접하게 배치된 대물 렌즈 또는 렌즈 시스템(42), 및 대물 렌즈(42)로부터 이격되게 배치된 접안 렌즈 또는 렌즈 시스템(44)을 포함한다. 대물 렌즈 또는 렌즈 시스템(42) 및 접안 렌즈 또는 렌즈 시스템(44)은 각각 하나 또는 복수의 개별 렌즈들 또는 다른 광학 컴포넌트들을 포함할 수 있다. 대물 렌즈(42)는 접안 렌즈(44)에 의해 추가로 확대되는 샘플의 제 1 배율을 제공한다. 확대 수단(38)은 샘플의 적절한 배율 및 이미징을 달성하기 위해 추가적인 렌즈들을 포함할 수 있다. 확대 수단(38)의 제 1 부분(38a)은 측정 캐비티(20)의 제 1 부분(20a)의 샘플이 샘플 홀더(32)에 배치될 때 제 1 이미지 획득 수단(40)의 이미지 평면 상에 포커싱되도록 배치된다.
제 1 이미지 획득 수단(40)은 샘플의 제 1 디지털 이미지를 획득하도록 배치된다. 제 1 이미지 획득 수단(40)은 CCD 카메라 또는 CMOS 카메라와 같은 임의의 종류의 디지털 카메라일 수 있다. 본 발명에서 기술되는 바와 같은 디지털 카메라에 대한 참조는 이미지 분석 부분의 일 실시예로서만 고려되어야 한다. 디지털 카메라의 픽셀 크기는 이미지 평면의 착란원(circle of confusion)이 필드 깊이 내의 픽셀 크기를 초과하지 않도록 이미징 시스템(36)에 제한을 둔다. 그러나, 백혈구 들이 다소 흐린 경우에도 백혈구들이 여전히 검출될 수 있고, 이에 따라 착란원은 본 범주에서 규정되는 바와 같은, 필드 깊이 내에서 고려되면서 픽셀 크기를 초과하도록 허용될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 바와 같이, "필드 깊이"는 충분하게 초점이 맞게 이미징되는 광학 축을 따르는 방향의 길이를 의미하는 것으로서, 이미지 분석에 의해 이러한 길이 내에 위치된 세포들을 식별할 수 있도록 한다. 이러한 "필드 깊이"는 광학 셋팅들에 의해 규정되는 종래의 필드 깊이와 다를 수 있고, 수행되는 특정한 이미지 분석에 의존할 수 있다.
디지털 카메라(40)는 측정 캐비티(20)의 제 1 부분(20a)에 있는 샘플의 제 1 디지털 이미지를 획득하고, 전체 샘플 두께는 백혈구들을 카운팅하기 위해 제 1 디지털 이미지에서 충분하게 포커싱된다. 이미징 시스템(36)은 제 1 디지털 이미지에 이미징되는, 측정 캐비티(20)의 제 1 부분(20a)의 면적을 규정한다. 측정 캐비티(20)의 제 1 부분(20a)의 두께와 함께 이미징되는 면적은 이미징되는 샘플의 부피를 규정한다.
확대 수단(38)의 제 2 부분(38b)은 측정 캐비티(20)의 제 2 부분(20b)에 있는 혈액 샘플을 통과하여 투과되는 광을 수용하도록 배치된다. 이미징 시스템은 확대 수단(38)의 제 2 부분(38b)에 의해 확대되는 바와 같은 측정 캐비티(20)의 제 2 부분(20b)을 이미징하도록 배치되는 제 2 이미지 획득 수단(41)을 추가로 포함한다. 확대 수단(38)의 제 2 부분(38b)은 5-200x의 배율, 보다 바람직하게는 5-100x, 가장 바람직하게는 5-20x의 배율을 제공하도록 배치된다. 이러한 범위들의 배율 내에서, 백혈구들을 구별할 수 있다. 보다 낮은 배율이 사용될 수 있도록 개 선된 해상도를 갖는 이미지가 획득될 수 있다. 또한, 확대 수단(38)의 제 2 부분(38b)의 필드 깊이는 측정 캐비티(20)의 두께를 포함하도록 배치될 수 있다.
제 1 부분(38a)와 같이, 확대 수단(38)의 제 2 부분(38b)은 또한 샘플 홀더(32)와 근접하게 배치된 대물 렌즈 또는 렌즈 시스템(43), 및 대물 렌즈(43)로부터 이격되게 배치된 접안 렌즈 또는 렌즈 시스템(45)을 포함한다. 또한, 대물 렌즈 또는 렌즈 시스템(43)과 접안 렌즈 또는 렌즈 시스템(45)은 각각 하나 또는 복수의 렌즈들 또는 다른 광학 컴포넌트들을 포함할 수 있다. 대물 렌즈(43)는 접안 렌즈(45)에 의해 추가적으로 확대되는 샘플의 제 1 배율을 제공한다. 확대 수단(38)은 샘플의 적절한 배율 및 이미징을 달성하기 위해 추가적인 렌즈들 또는 다른 광학 컴포넌트들을 포함할 수 있다. 확대 수단(38)의 제 2 부분(38b)은 측정 캐비티(20)의 제 2 부분(20b)의 샘플이 샘플 홀더(32)에 배치될 때 제 2 이미지 획득 수단(41)의 이미지 평면 상에 포커싱되도록 배치된다.
제 2 이미지 획득 수단(41)은 샘플의 제 2 디지털 이미지를 획득하도록 배치된다. 제 2 이미지 획득 수단(41)은 CCD 카메라 또는 CMOS 카메라와 같은 임의의 종류의 디지털 카메라일 수 있다. 제 2 이미지는 상이한 타입들의 백혈구들을 결정하기 위해 사용되기 때문에, 이미지 평면의 착란원은 필드 깊이 내의 픽셀 크기를 초과하지 않을 수 있다. 디지털 카메라(41)는 측정 캐비티(20)의 제 2 부분(20a)에 있는 샘플의 제 2 디지털 이미지를 획득하고, 전체 샘플 두께는 존재하는 백혈구들의 타입을 식별하기 위해 제 2 디지털 이미지에 충분하게 포커싱된다.
이미징 시스템(36)은 이미징 시스템(36)을 조절할 필요 없이 샘플 획득 장치 들(10)의 혈액 샘플들을 이미징하기 위해 배치될 수 있다. 바람직하게는, 이미징 시스템(36)은 샘플 홀더에 대해 고정된 관계로 이미징 시스템을 유지시키는 하우징 내에 배치된다.
장치(30)는 이미지 분석기(46)를 추가로 포함한다. 이미지 분석기(46)는 디지털 카메라들(40, 41)에 의해 획득된 제 1 및 제 2 디지털 이미지를 수신하기 위해 제 1 및 제 2 디지털 카메라(40, 41)에 접속된다. 이미지 분석기(46)는 디지털 이미지에 존재하는 백혈구들의 수를 카운팅하기 위해 백혈구에 대응하는 제 1 디지털 이미지의 패턴들을 식별하도록 구성된다. 따라서, 이미지 분석기(46)는 보다 밝은 백그라운드에서 어두운 점들을 식별하도록 구성될 수 있다. 이미지 분석기(46)는 디지털 이미지를 분석하기 이전에 디지털 이미지를 먼저 전자적으로 확대하도록 구성될 수 있다. 이는 디지털 이미지의 전자적 확대가 디지털 이미지를 다소 흐리게 함에도 불구하고, 이미지 분석기(46)가 서로 근접하게 이미징되는 백혈구들을 보다 용이하게 구별할 수 있음을 의미한다.
이미지 분석기(46)는 제 1 및 제 2 디지털 카메라(40, 41)로부터 이미지 정보를 수신하도록 구성된 프로세서를 포함할 수 있다. 프로세서는 예를 들어 이미지 분석 소프트웨어 또는 알고리즘들로 컨피규어(configure)될 수 있고, 그 정확도는 본 발명에서 기술되는 바와 같은 분석들을 수행하도록 조정(adapted)될 수 있다.
이미지 분석기(46)는 전술한 것처럼 명확하게 규정된 혈액 샘플의 부피로 제 1 디지털 이미지에서 식별되는 백혈구들의 수를 분할함으로써 혈액의 부피 당 백혈 구들의 수를 계산할 수 있다. 용적측정 백혈구 수는 장치(30)의 디스플레이 상에 나타낼 수 있다.
이미지 분석기(46)는 디지털 이미지에 존재하는 백혈구들의 수를 카운팅하기 위해 백혈구에 대응하는 제 2 디지털 이미지의 패턴들을 식별하도록 추가적으로 구성된다. 이미지 분석기(46)는 백혈구의 타입을 결정하기 위해 각각의 검출된 백혈구의 형상 및 크기를 추가적으로 분석한다. 따라서, 이미지 분석기(46)는 보다 밝은 백그라운드에 있는 어두운 점들을 백혈구들로서 식별하도록 구성될 수 있다. 이미지 분석기(46)는 디지털 이미지를 분석하기 이전에 디지털 이미지를 전자적으로 먼저 확대하도록 구성될 수 있다. 이는 디지털 이미지의 전자적 확대가 디지털 이미지를 다소 흐리게 함에도 불구하고, 이미지 분석기(46)가 서로 근접하게 이미징되는 백혈구들을 보다 용이하게 구별할 수 있다는 것을 의미한다. 그 다음, 이미지 분석기(46)는 다양한 물리적 기준에 의해 백혈구의 타입을 결정하며, 중요한 하나의 물리적 기준은 이미징되는 백혈구의 크기이다. 문헌에 따르면, 림프구들(lymphocytes)은 약 5-11㎛의 직경을 갖고, 과립구들(granulocytes)은 약 8-15㎛의 직경을 가지며, 단핵세포들(monocytes)은 약 16-25㎛의 직경을 갖는다. 몇몇 경우들에서 예상 크기들이 중첩되기 때문에, 상이한 백혈구 타입들을 서로 구별하기 위해 추가적인 정보를 사용하는 것이 바람직하다. 그러한 정보는 예를 들어 세포핵의 형상 및/또는 크기일 수 있다. 과립구들은 예를 들어 분절된(segmented) 세포핵에 대응하는 세포 내의 2개 이상의 점들의 존재에 의해 식별될 수 있다. 이는 크기 분류에 의해 이루어진 평가를 개선하는데 이용될 수 있다.
백혈구 카운트는 5개 부분들로 구별되며, 여기서 과립구들은 호산성 백혈구(eosinophils), 호중성 백혈구(neutrophils) 및 호염기성 백혈구(basophils)로서 추가적으로 구별되고, 5개 부분들로 구별되는 백혈구 카운트는 추가적인 물리적 특성들을 이용함으로써 달성될 수 있다. 또한, 3개 부분의 백혈구 카운트는 이러한 부가적인 물리적 특성들을 이용하여 개선될 수 있다. 따라서, 분석은 검출된 혈구들의 형상을 추가적으로 검사할 수 있다. 또한, 분석은 검출된 혈구들을 통과하여 투과되는 광의 세기를 추가로 검사할 수 있다.
이미지 분석기(46)는 각 타입의 백혈구들의 수를 계산할 수 있다. 전형적으로, 이미지 분석기(46)는 특정 수, 예를 들어 1000 백혈구들을 카운팅 및 분류할 수 있다. 그 다음, 각 타입의 백혈구들의 퍼센티지 또는 비율은 분석된 백혈구들의 총 수에 의해 나누어지는, 그 타입에 속하는 것으로 분류된 백혈구들의 수로서 결정될 수 있다. 타입에 대해 약 200 백혈구들을 분석함으로써 통계적으로 의미있는 측정치가 결정될 수 있다. 그러나, 통계치들을 개선하기 위해 그 타입에 대해 보다 많은 수의 백혈구들이 분석되는 것이 바람직하다. 또한, 이미지 분석기(46)는 적절히 분류되도록 충분하게 초점이 맞게 이미징되는 백혈구들을 분석하도록 구성될 수 있다. 또한, 2개 이상의 백혈구들이 서로 매우 근접한 경우, 정확히 분리시키기가 어려울 수 있고, 이에 따라 그러한 백혈구들은 이미지 분석기(46)에 의해 완전히 무시될 수 있다. 한편, 이미징 시스템(36)은 포커싱되는 측정 캐비티(20)의 제 2 부분(20b)의 전체 두께를 이미징하도록 구성되기 때문에, 이미지 분석기(46)는 단지 제 2 디지털 이미지로부터 각 타입의 백혈구들의 용적측정 계산값을 결정할 수 있다.
이미지 분석기(46)는 이미지 분석을 수행하기 위한 코드들을 포함하는 처리 유닛으로서 구현될 수 있다.
도 3을 참조하면, 혈액 샘플에 있는 백혈구들의 분석을 위한 측정 장치(130)의 제 2 실시예가 기술된다. 측정 장치(130)는 혈액 샘플을 구비한 샘플 획득 장치(110)를 수용하기 위한 샘플 홀더(132)를 포함한다. 측정 장치(130)는 샘플 획득 장치들(110)을 수용하도록 구성되고, 측정 캐비티(120)는 이미징되는 전체 면적에 대해 일정한 하나의 두께를 갖는다. 따라서, 측정 캐비티(120)는 도 1을 참조로 전술한 실시예에 따른 샘플 획득 장치(10)의 측정 캐비티(20)의 제 1 부분(20a)에 대응하는 두께를 갖는다. 샘플 홀더(132)는 샘플 획득 장치(110)를 수용하도록 구성되어, 샘플 획득 장치(110)의 측정 캐비티(120)가 측정 장치(130)내에 정확하게 배치된다. 측정 장치(130)는 제 1 실시예의 광원(34)에 상응하는 방식으로 샘플 획득 장치(110)내에서 혈액 샘플을 조명하기 위한 광원(134)을 포함한다.
측정 장치(130)는 광원(134)에 대해 샘플 홀더(132)의 대향 측면 상에 배치되는 이미징 시스템(136)을 추가로 포함한다. 따라서, 이미징 시스템(136)은 혈액 샘플을 통과하게 투과되는 광을 수용하도록 배치된다. 본 실시예의 이미징 시스템(136)은 동일한 광 경로를 따라 제 1 및 제 2 디지털 이미지를 획득하도록 배치되어, 이미지들이 측정 캐비티(120)내의 동일 지점에 중심을 둔다. 또한, 샘플의 제 1 및 제 2 디지털 이미지는 상이한 광학 셋팅들을 이용하여 획득된다. 이는 이하에서 기술되는 것처럼, 많은 상이한 방법들로 달성될 수 있다.
도 3에 도시된 것처럼, 이미징 시스템은 하나의 공통 부분과 2개의 분리 부분들을 포함하는 확대 수단(138)을 포함한다. 따라서, 확대 수단(138)은 샘플 홀더(132)에 근접하게 배치되고 제 1 및 제 2 디지털 이미지 모두를 획득하기 위한 2개의 광학 셋팅들에 대해 공유되는, 대물 렌즈 또는 렌즈 시스템(142)을 포함할 수 있다. 대물 렌즈(142)는 샘플의 제 1 배율을 제공한다. 이미징 시스템(136)은 CCD 카메라와 같은 임의의 종류의 디지털 카메라일 수 있는 제 1 및 제 2 이미지 획득 수단(140, 141)을 향하는 2개의 상이한 방향들로 광을 유도하기 위한 빔 스플리터(139)를 추가로 포함할 수 있다. 확대 수단(138)은 빔 스플리터(139)와 제 1 디지털 카메라(140) 사이에 배치된 제 1 접안 렌즈 또는 렌즈 시스템(144)을 포함한다. 대물 렌즈(142)는 샘플의 제 1 배율을 제공하고, 제 1 배율은 접안 렌즈(144)에 의해 추가로 확대된다. 확대 수단(138)은 적절한 배율 및 제 1 디지털 이미지으 샘플의 이미징을 달성하기 위해 추가적인 렌즈들 또는 광학 엘리먼트들을 포함할 수 있다.
확대 수단(138)은 빔 스플리터(139)와 제 2 디지털 카메라(141) 사이에 배치된 제 2 접안 렌즈 또는 렌즈 시스템(145)을 추가로 포함한다. 대물 렌즈(142)는 샘플의 제 1 배율을 제공하고, 제 1 배율은 접안 렌즈(145)에 의해 추가로 확대된다. 확대 수단(138)은 제 2 디지털 이미지의 샘플의 이미징 및 적절한 배율을 달성하기 위해 추가적인 렌즈들 또는 광학 엘리먼트들을 포함할 수 있다. 대물 렌즈(142)와 접안 렌즈(145)는 렌즈 패키지들로서 구현될 수 있고, 그 다음 접안 렌즈 패키지(145)는 샘플 획득 장치(110)가 대물 렌즈 패키지(142)에 대해 이동되지 않으면서, 대물 렌즈 패키지(142)내의 가상 주 평면을 이동시켜서 이미지 평면과 대물 렌즈 패키지(142) 사이의 관계를 변경함으로써 추가적인 배율을 허용한다. 이러한 방식으로, 상이한 배율들이 제 1 및 제 2 디지털 이미지에 달성될 수 있다.
특히, 본 실시예에 도시된 바와 같은 확대 수단(138)은 초점에 배치된 백혈구들의 이미징을 강조하는 광학 엘리먼트(147)를 포함한다. 이는 초점이 맞게 어떤 혈구 타입들이 이미징되고 있는지를 식별하는 특성을 향상시키고, 이에 따라 상이한 타입들의 백혈구들을 구별할 때 고려될 것이다.
광학 엘리먼트(147)는 제 2 디지털 이미지를 캡쳐하는 이미징 시스템(136)의 부분의 필드 깊이보다 훨씬 더 큰 샘플 두께의 이미지가 획득될 수 있도록 한다. 광학 엘리먼트(147)는 측정의 확실성을 증대시키기 위해 초점이 맞지 않는 백혈구들이 고려되지 않도록 보장한다. 광학 엘리먼트(147)는 초점이 맞지 않는 백혈구들의 이미징에 영향을 주기 때문에, 초점이 맞는 백혈구들이 용이하게 식별된다. 광학 엘리먼트(147)는 세포의 이미징에 영향을 주는 공간 필터로서 구현되어, 세포의 엣지가 백그라운드 세기보다 더 큰 오버슛 세기를 포함하도록 할 수 있으며, 여기서 세포는 광을 흡수함으로써 이미징된다. 이는 이미지 분석으로 용이하게 검출될 수 있으며, 이에 따라 이러한 세포들은 고려사항에서 신속하게 배제될 수 있다.
대안적인 실시예에 따라, 확대 수단은 빔 스플리터(139)와 제 2 디지털 카메라(141) 사이에 파면 코딩 엘리먼트를 포함할 수 있다. 따라서 파면 코딩 엘리먼트는 광학 엘리먼트(147)를 대체할 수 있다. 파면 코딩 엘리먼트는 중간부에서 상대적으로 평탄한 안창형 형상을 갖지만 부채꼴 엣지들을 가진 파장판을 통하게 광 선을 통과시킴으로써 광선을 의도적으로 왜곡시킨다. 이는 특정한 광 이탈(optical aberration)을 초래하고, 이미지가 흐리게 보이지만, 초점의 흐려짐은 넓은 범위의 거리들에 대해 동일하다. 따라서, 이러한 파면 코딩 엘리먼트는 분석될 수 있는 광학 축을 따라 깊이를 증가시킨다. 이미지의 왜곡들은 정확하게 알려져 있는 탈-포커싱 파면 코딩 엘리먼트의 형상에 의해 주로 결정된다. 따라서, 컴퓨터는 흐릿한 지점을 하나씩 제거할 수 있다. 컴퓨터는 본질적으로 디지털 필터를 이용하여 이미지를 디코딩할 수 있고, 이에 따라 큰 필드 깊이에 대해 뚜렷한 이미지를 생성한다. 이러한 방식으로, 확대 수단은 이미징 시스템의 필드 깊이를 증가시킬 수 있고, 더 큰 샘플 깊이가 초점이 맞게 이미징되도록 할 수 있다.
본 실시예에서, 빔 스플리터는 교체될 수 있으며, 이미지 시스템(136)은 모든 광을 샘플로부터 2개의 디지털 카메라들(140, 141) 중 선택된 하나의 디지털 카메라를 향하게 유도하기 위한 미러 또는 다른 엘리먼트(미도시)를 포함할 수 있다. 그 다음, 미러는 샘플을 관찰하는 카메라(140, 141)를 이동시키기 위해 회전 또는 이동될 수 있다. 이는 보다 많은 광이 디지털 카메라들(140, 141)로 통과하도록 하고, 이에 따라 이미지들을 획득하기 위한 보다 양호한 광 조건들을 제공한다. 그러나, 2개의 이미지들은 동시에 기록되지 않을 수 있고, 이미징 시스템(136)은 이동 부분들을 필요로 한다. 하나의 대안예에 따라, 미러가 광 경로로부터 완전히 제거될 때 카메라들 중 하나가 샘플을 관찰하도록 배치될 수 있다.
다른 대안예에 따라, 대물 렌즈(142)가 제 1 이미지를 획득하기 위해 필요한 모든 배율을 제공할 수 있다. 따라서, 빔 스플리터 또는 미러로부터 제 1 디지털 카메라(140)로 광이 바로 통과될 수 있다.
또 다른 대안예에 따라, 대물 렌즈가 제 1 및 제 2 광학 셋팅들을 공유하지 않는다. 따라서, 빔 스플리터 또는 미러는 샘플 홀더(132)와 근접하게 배치될 수 있고, 확대 수단(138)은 빔 스플리터와 제 1 디지털 카메라(140) 사이 및 빔 스플리터와 제 2 디지털 카메라(141) 사이의 두 광 경로들에서 대물 렌즈와 접안 렌즈를 모두 포함할 수 있다.
추가적인 대안예에 따라, 제 1 및 제 2 디지털 이미지는 하나의 디지털 카메라에 의해 획득된다. 이 경우, 확대 수단(138)은 2개의 디지털 이미지들을 획득하도록 광학 셋팅들을 변경하기 위해 스위칭되거나 변경될 필요가 있다. 따라서, 대물 렌즈(242)는 도 5에 도시된 것처럼, 명확하게 규정된 2개의 상이한 위치들 간에 이동가능할 수 있다. 따라서, 대물 렌즈(242)는 광학 축을 따라 이동되도록 배치될 수 있고, 정지부(stop), 예를 들어 돌출부(250, 252)와 접촉하는 광학 축의 엣지와 접촉할 것이다. 이에 따라, 대물 렌즈와 샘플 획득 장치 사이의 거리는 획득될 이미지의 배율을 조절하기 위해 정확하게 조절될 수 있다.
임의의 전술한 대안예들에서, 제 1 디지털 카메라(140)는 확대 수단(138)에 의해 제공되는 제 1 광학 셋팅으로 측정 캐비티(120)를 이미징하도록 구성된다. 따라서, 확대 수단(138)은 1-50x의 배율, 보다 바람직하게는 1-20x, 가장 바람직하게는 1-4x의 배율을 제공하도록 구성된다. 이러한 범위들의 배율 내에서, 백혈구들을 구별할 수 있다. 보다 낮은 배율이 사용될 수 있도록 하기 위해 개선된 해상도를 갖는 이미지가 획득될 수 있다. 또한, 확대 수단(138)의 필드 깊이는 측정 캐비티(120)의 두께를 포함하도록 정해질 수 있다.
도 2에 도시된 제 1 실시예를 참조로 기술된 것처럼, 제 2 실시예의 제 1 디지털 카메라(140)는 샘플의 제 1 디지털 이미지를 획득하도록 구성된다. 제 1 디지털 카메라(140)는 측정 캐비티(120)의 전체 두께가 제 1 실시예에 대해 규정된 바와 같은 필드 깊이 내에 있도록 샘플을 보여준다. 이미징 시스템(136)은 제 1 디지털 이미지에 이미징되는 측정 캐비티(120)의 면적을 규정한다. 측정 캐비티(120)의 두께와 함께 이미징되는 면적은 이미징되는 샘플의 부피를 규정한다.
또한, 임의의 전술한 실시예들에서, 제 2 디지털 카메라(141)는 확대 수단(138)에 의해 제공되는 제 2 광학 셋팅으로 측정 캐비티(120)를 이미징하도록 구성된다. 확대 수단(138)은 5-200x의 배율, 보다 바람직하게는 5-100x, 가장 바람직하게는 5-20x의 배율을 제공하도록 구성된다. 이러한 범위들의 배율 내에서, 백혈구들을 구별할 수 있다. 보다 낮은 배율이 사용될 수 있도록 하기 위해 개선된 해상도를 가진 이미지가 획득될 수 있다. 그러나, 제 2 디지털 이미지는 제 1 디지털 이미지와 동일한 부분의 측정 캐비티(120)를 보여주기 때문에, 제 2 광학 셋팅에 사용되는 보다 큰 배율에 의해 측정 캐비티(120)의 전체 두께가 필드 깊이 내에서 이미징되는 것을 방지할 수 있다. 따라서, 제 2 디지털 이미지는 초점이 맞게 백혈구들을 이미징하지만, 이미지에서 흐릿한 방해를 초래하는 초점이 맞지 않는 혈액 샘플의 다른 부분들 및 백혈구들도 이미징한다. 이러한 조건들에서, 전술한 바와 같은 광학 엘리먼트(147)는 초점이 맞게 이미징되는 세포들을 식별할 가능성들을 향상시켜서 타입을 분류하기가 보다 용이해진다.
확대 수단(138)은 포커싱되는 측정 캐비티(120)의 두께의 최상부 부분을 제 2 디지털 카메라(141)의 이미지 평면에 배치하도록 구성되는 것이 바람직할 수 있다. 이는 초점이 맞지 않는 혈액 샘플의 부분들의 방해물들이 거의 바닥에 있고 상대적으로 낮게 유지됨을 의미한다. 그러나, 측정 캐비티(120)의 임의의 부분이 제 2 디지털 이미지에서 초점이 맞게 이미징되도록 도출가능할 수 있다. 또한, 확대 수단(138)은 초점이 맞는 측정 캐비티(120)의 20-60㎛의 두께를 전형적으로 이미징하도록 배치될 수 있다.
또 다른 대안예에 따라, 도 6에 도시된 것처럼, 단지 하나의 디지털 이미지만이 획득된다. 그러나, 이러한 디지털 이미지는 검출되는 광의 방향 정보를 제공할 필요가 있다. 이는 디지털 이미지가 검출된 광 뿐만 아니라 검출된 광이 방출된 공간상의 지점에 대한 정보를 포함한다는 것을 의미한다. 그 다음, 이러한 디지털 이미지는 디지털 이미지의 초점이 목표된 바와 같이 이동될 수 있는 방식으로 나타낼 수 있다. 따라서, 디지털 이미지는 첫째로 측정 캐비티의 전체 깊이 내에서 백혈구들의 총 수를 카운팅하고, 둘째로 두께의 일부분에 대해 초점을 이동시킴으로써 샘플에 있는 상이한 타입들의 백혈구들의 비율을 결정하는데 사용될 수 있다. 이러한 대안예는 광원(334), 대물 렌즈(342), 및 하나의 디지털 카메라(340)를 포함하여 도 6에 도시된 바와 같이 구현될 수 있다. 이러한 부분들은 전술한 것과 유사한 방식으로 구현될 수 있다. 장치는 샘플 획득 장치(110)와 디지털 카메라(340) 사이의 광 경로에 제공되는 작은 렌즈들(360)의 어레이를 추가로 포함한다. 작은 렌즈들(360)의 어레이는 이미지의 상이한 부분들이 초점이 맞게 배치될 수 있도록, 획득된 이미지의 선들을 추적하는 성능을 제공한다.
도 3을 참조하면, 측정 장치(130)는 이미지 분석기(146)를 더 포함한다. 이미지 분석기(146)는 디지털 카메라들(140, 141)에 의해 획득된 제 1 및 제 2 디지털 이미지를 수신하기 위해 제 1 및 제 2 디지털 카메라(140, 141)에 접속된다. 대안적으로, 이미지 분석기(146)는 상기 문단에 기재된 바와 같이 광의 방향의 정보를 포함하는 하나의 디지털 이미지만을 수신한다. 이미지 분석기(146)는 상기 제 1 실시예의 이미지 분석기(46)에 대해 기술된 것과 유사한 방식으로 제 1 및 제 2 디지털 이미지를 분석하도록 구성된다. 그러나, 필드 깊이 내의 샘플의 두께의 일부분만을 이미징함으로써 제 2 디지털 이미지가 획득될 수 있기 때문에, 이미지 분석기(146)는 제 2 디지털 이미지를 보다 신중하게 처리할 필요가 있다. 먼저, 이미지 분석기(146)는 초점이 맞게 이미징되는 것으로 식별된 백혈구들만을 분석할 것이다. 이는 이미지 분석기(146)가 상이한 타입들의 백혈구들의 비율만을 결정할 수 있고 이에 따라 분석되는 샘플의 부피를 정확히 알 필요가 없기 때문에 가능할 수 있다. 초점이 맞지 않게 이미징되는 세포들은 흐릿해질 수 있어서, 이미지 분석기(146)가 세포들의 부정확한 크기들을 결정할 수 있고 이에 따라 세포들을 부정확하게 분류할 수 있다. 따라서, 초점이 맞게 이미징되는 세포들만이 분석되도록 보장함으로써, 분석의 확실성이 개선된다.
도 7은 샘플(710)의 상이한 3개의 층들(720a-c)에 이미징되는 샘플(710)을 도시한다. 층(720b)은 이하에서 상세히 논의될 초점면(focus plane)을 나타낸다. 광학 시스템은 대상물들이 초점면에 정확히 위치되지 않더라도 초점이 맞는 것으로 고려될 수 있는 필드 깊이를 갖는다. 도 7에서, 초점면(720b)의 필드 깊이는 점선 영역(720b')으로 나타낸다.
도 8a-c는 카메라로 본 상이한 3개의 백혈구들을 도시하고, 도 9a-c는 이들의 각각의 광 분포들을 도시한다.
도 8b는 초점이 맞게 이미징되는 백혈구를 도시한다. 세포핵들은 어두운 음영으로 보이는 반면에, 주변 세포질은 거의 보이지 않는다. 도 9b에서, 광 세기의 분포가 도시된다. 세포핵들은 상당히 낮은 광 세기를 갖는 부분들로서 보이는 반면에, 세포질은 광 세기가 영향을 받지 않게 남겨진다.
도 8a는 이미지 획득 수단(441)에 너무 가깝게 이미징되어 초점이 맞지 않는 백혈구를 도시한다. 세포핵들은 어두운 음영으로서 보이는 반면에, 주변 세포질은 렌즈로서 작용하고, 광을 굴절 및 확산시켜서 세포핵들 주위에 어두운 원을 형성한다. 도 9a에서, 광 세기의 분포가 도시된다. 세포핵들은 상당히 낮은 광 세기를 갖는 부분으로서 보이고, 세포질은 낮은 광 세기를 갖는 것으로 보인다.
도 8c는 이미지 획득 수단(441)으로부터 너무 멀리 떨어져서 초점이 맞지 않는 백혈구를 도시한다. 세포핵들은 어두운 음영들로서 보이는 반면에, 주변 세포질은 렌즈로서 작용하고 광을 굴절시켜서 세포핵들 주위에 밝은 원을 형성한다. 도 9c에서, 광 세기의 분포가 도시된다. 세포핵들은 상당히 낮은 광 세기를 갖는 부분으로서 보이는 반면에, 세포질은 높은 광 세기를 갖는 것으로 보인다.
이미지 분석기(146)는 초점이 맞게 이미징되는 백혈구들의 크기를 결정하도록 추가로 구성된다. 그 다음, 이러한 결정된 크기는 제 1 실시예를 참조로 전술 한 방식에 상응하는 방식으로 백혈구들을 분류하는데 사용될 수 있다. 제 2 디지털 이미지는 약간 흐려질 수 있기 때문에, 이미지 분석기(146)는 상대적으로 작은 수, 즉 200개의 백혈구들만을 카운팅 및 분류하도록 구성될 수 있다. 이는 샘플에 있는 상이한 타입들의 백혈구들 비율의 통계적으로 의미있는 결과를 형성하기 위해 여전히 충분할 수 있다. 대안예로서, 이미지 분석기(146)는 동일한 이미지 처리 단계 내에서 세포가 초점이 맞게 이미징되는지 여부의 검증 및 크기의 측정을 수행하도록 구성될 수 있다. 따라서, 모든 이미징된 세포의 크기가 결정되지만, 샘플에 있는 상이한 타입들의 백혈구들의 비율을 결정할 때 초점이 맞게 이미징되는 세포들만이 고려된다.
이미지 분석기(146)는 이미지 분석을 수행하기 위한 코드들을 포함하는 처리 유닛으로서 구현될 수 있다.
도 7-도 9a-c를 중심으로 도 10의 셋업을 이용할 때, 장치(30)는 상이한 광학 셋팅들을 이용하여 샘플의 몇가지 디지털 이미지들을 획득하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 몇가지 디지털 이미지들은 도 10에 도시된 바와 같은 샘플(710)의 10개의 상이한 층들(720a-j)을 이미징할 수 있다. 이미지 분석기는 특정 입자 또는 세포에 대해, 입자 또는 세포가 이미징되는 이미지들의 수를 결정하도록 구성된다. 이미지들의 카운팅은 입자 또는 세포가 제 1 방향에서 초점이 맞지 않는 것으로 결정된 이미지로부터 시작하여 입자 또는 세포가 초점이 맞는 것으로 결정되는 이미지(들)를 통하여 계속되고, 입자 또는 세포가 제 2 방향에서 초점이 맞지 않는 것으로 결정된 이미지에서 종료된다. 제 1 및 제 2 방향은 기본적으로 초점면에 수직하게 대향한다. 도 8a 및 도 9a에서, 세포는 제 1 방향에서 초점이 맞지 않는 것으로 결정된다. 이러한 방향에서 초점이 맞지 않는 것에 대한 제한이 이미지에 결정되고, 이러한 이미지에서 상이한 영역들(중심 및 링 영역)에 대해 가장 큰 명암비가 측정된다. 이미징 시스템에 보다 근접하게 위치되는 세포들에 대해, 어두운 세포핵들 주위에 어두운 링을 갖는 동일한 기본 형상이 검출되지만, 보다 흐릿해지고, 명암비는 제 1 방향에서 초점이 맞지 않는 것에 대한 제한으로서 결정된 이미지에서보다 더 낮을 것이다. 유사하게, 어두운 세포핵들과 세포핵들을 둘러싸는 광 사이에 가장 큰 명암비가 검출되는 이미지를 식별함으로써 다른 제한이 결정된다. 이미징 시스템으로부터 추가적으로 초점면을 가진 이미지들에서, 세포들은 여전히 어두운 세포핵들과 광 원으로서 검출되지만, 보다 흐릿해지고, 명암비는 제 2 방향에서 초점이 맞지 않는 것에 대한 제한으로서 고려되는 이미지에서보다 더 낮을 것이다.
이는 각각의 백혈구의 곡률 반경에 관한 정보를 제공한다. 동등하게(comparably) 작은 백혈구는 상당히 짧은 초점 길이를 제공하고, 그 다음 제한되는 이미지들 간에 이미지들을 카운팅할 때, 동등하게 적은 수의 이미지들을 초래할 것이다. 이는 또한 초점이 맞게 및 초점이 맞지 않게 이미지들이 신속하게 이동하는 것으로 상술될 수 있다. 동등하게 큰 백혈구는 보다 긴 초점 길이를 제공하고, 일 방향에서 초점이 맞지 않는 이미지와 다른 방향에서 초점이 맞지 않는 이미지 사이의 거리는 동등하게 더 클 것이다. 이는 또한 획득된 상이한 이미지들을 인접한 층들의 이미지들과 비교할 때 초점이 맞게 및 초점이 맞지 않게 이미지들이 천 천히 이동하는 것으로서 상술할 수도 있다. 초점 길이 및 제한되는 이미지들은 거리에 관련되지만, 각각의 이미지에 대한 초점면의 특정 거리와 의해, 거리는 많은 이미지들로서 나타낼 수 있다는 점을 유의한다.
도 10의 실시예는 광원(434), 샘플 획득 장치(410), 광학 시스템(438)(10x의 배율 인자를 가짐), 이미지 획득 수단(440)으로 광을 유도하는 조리개(diaphragm)(450)를 포함한다. 도 4를 참조하면, 백혈구들의 용적측정 계산 방법이 기재된다. 방법은 단계(102)에서 혈액 샘플을 샘플 획득 장치에 획득하는 단계를 포함한다. 희석되지 않은 혈액 샘플이 샘플 획득 장치에 획득된다. 샘플은 모세관 혈액 또는 정맥 혈액으로부터 획득될 수 있다. 모세관 혈액의 샘플은 바늘에 찔린 환자의 손가락으로부터 측정 캐비티로 바로 추출될 수 있다. 혈액 샘플은 샘플 획득 장치의 반응제와 접촉하여 반응을 개시한다. 적혈구들은 용해되고 착색제는 백혈구들의 세포핵들에 축적된다. 혈액 샘플을 획득한 이후 수분 이내에, 샘플이 분석될 준비가 된다. 대안적으로, 혈액 샘플이 획득되고 샘플 획득 장치로 유입되기 이전에 용혈제 및 착색제와 혼합된다. 그 다음, 샘플 획득 장치는 단계(104)에서 분석 장치에 배치된다. 분석은 분석 장치의 버튼을 누름으로써 개시될 수 있다. 대안적으로, 샘플 획득 장치의 존재를 감지하는 장치에 의해 분석이 자동적으로 개시된다.
단계(106)에서 샘플이 조사(irradiate)되고, 단계(108)에서 상이한 광학 셋팅들을 이용하여 샘플의 제 1 및 제 2 디지털 이미지가 획득된다. 샘플은 착색제의 흡수 피크에 상응하는 파장의 전자기 광으로 조사된다. 이는 백혈구 세포핵들 의 위치들에서 검은 또는 보다 어두운 점들을 포함함을 의미한다.
획득된 디지털 이미지들은 단계(110)에서, 제 1 및 제 2 디지털 이미지의 이미지 분석을 수행하는 이미지 분석기로 전송된다. 이미지 분석기는 혈액 샘플에 있는 모든 백혈구들의 용적측정 계산을 결정하기 위해 제 1 디지털 이미지의 검은 점들의 수를 카운팅한다. 이미지 분석기는 또한 백혈구들을 분류하고 혈액 샘플에 있는 상이한 타입들의 백혈구들의 비율을 획득하기 위해, 제 2 디지털 이미지의 특정 수의 검은 점들의 크기 및 형상을 분석한다.
도 11에 도시된 다른 실시예에 따라, 이미지 획득 단계(108b)는 상이한 층들의 다수의 디지털 이미지들을 획득하는 단계를 포함한다.
이미지 분석기에서 각각의 디지털 이미지(각각의 층으로부터)가 분석되어 어떤 백혈구들이 초점이 맞는지를 결정하고, 이러한 백혈구들에 대하여 이미지가 분석되어, 백혈구들을 분류하며 혈액 샘플에 있는 상이한 타입들의 백혈구들의 비율을 획득한다.
본 발명에서 기술된 바람직한 실시예들은 어떠한 방식으로도 제한되지 않으며 많은 대안적인 실시예들이 첨부된 청구범위에 의해 규정되는 보호의 범주내에서 가능할 수 있다는 점을 강조한다.
도 10의 장치는 각각의 백혈구의 분류를 결정하면서 백혈구들의 총 수가 결정될 수 있기 때문에, 하나의 분리된 유닛일 수 있다. 대안적으로, 도 10의 장치는 도 2의 실시예의 이미지 획득 수단(41)으로서 사용되거나, 도 3의 실시예의 이미지 획득 수단(141)으로서 사용될 수 있다. 그러한 설계는 도 12에 도시된 원칙 에 따른다. 이러한 실시예는 광원(534), 조리개(550), 샘플 획득 장치(510), 빔 스플리터(539), 제 1 이미지 획득 수단(540)으로 광을 유도하는 제 1 광학 시스템(538a)(약 3x의 제 1 배율 인자를 가짐), 및 미러(534)를 통해 제 2 이미지 획득 수단(541)으로 광을 유도하는 제 2 광학 시스템(538b)(약 10x의 제 2 배율 인자를 가짐)을 포함한다. 또한, 제 2 광학 시스템은 초점(542)을 변경하기 위한 수단을 포함하거나 이동가능할 수 있다. 따라서, 제 2 이미지 획득 수단(541)은 다수의 디지털 이미지들을 획득할 수 있다. 일 실시예에서, 제 1 이미지 획득 수단(540)은 생략되고, 입자들 또는 백혈구들의 총 수는 제 2 이미지 획득 수단(541)에 의해 획득된 이미지들로부터 결정된다.

Claims (37)

  1. 샘플에 있는 입자들(particles)의 계산(enumeration)을 위한 측정 장치로서,
    샘플을 보유하는 측정 캐비티를 포함하는 샘플 획득 장치를 수용하도록 배치된(arranged) 홀더;
    상기 샘플의 확대된 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하도록 구성된(adapted) 이미징 시스템(imaging system); 및
    상기 입자들을 식별하고 상기 샘플에 있는 상기 입자들의 수를 결정하기 위해, 획득된 상기 적어도 하나의 디지털 이미지를 분석하도록 배치된 이미지 분석기
    를 포함하고, 상기 이미지 분석기는 초점이 맞게(in focus) 이미징되는 입자들을 식별하여 이러한 입자들의 수 및 타입들을 결정하기 위해, 획득된 상기 적어도 하나의 디지털 이미지를 분석하도록 배치되며, 상기 입자들의 수는 상기 입자들에 대응하는 획득된 상기 적어도 하나의 디지털 이미지의 패턴들을 식별함으로써 결정되고, 상기 타입들은 상기 입자들의 물리적 특성들에 의해 구별되며, 이에 따라 상기 샘플에 있는 상이한 타입들의 입자들의 비율이 결정되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 측정 장치는 혈액 샘플에 있는 백혈구들을 계산하도록 구성되고,
    상기 측정 캐비티는 착색되고(stained) 용혈되는(hemolysed) 혈액 샘플을 보유하도록 구성되며,
    상기 이미지 분석기는 착색된 백혈구들을 식별하고 상기 샘플에 있는 백혈구들의 수를 결정하기 위해, 획득된 상기 적어도 하나의 디지털 이미지를 분석하도록 배치되고,
    상기 이미지 분석기는 초점이 맞게 이미징되는 백혈구들을 식별하여 이러한 백혈구들의 수 및 타입들을 결정하기 위해, 획득된 상기 적어도 하나의 디지털 이미지를 분석하도록 배치되며, 상기 타입들은 백혈구들의 물리적 특성들에 의해 구별되고, 이에 따라 상기 샘플에 있는 상이한 타입들의 백혈구들의 비율이 결정되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 샘플 획득 장치의 상기 측정 캐비티에 보유된 상기 샘플을 조사(irradiate)하도록 배치된 전자기 방사원(radiation source)을 더 포함하는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 상이한 광학 셋팅들을 이용하여 상기 샘플의 다수의 디지털 이미지들을 획득하도록 배치되고,
    상기 이미지 분석기는 입자들 또는 착색된 백혈구들을 식별하여 상기 샘플에 있는 입자들 또는 백혈구들의 수를 결정하기 위해, 획득된 각각의 디지털 이미지를 분석하도록 배치되며,
    상기 이미지 분석기는 초점이 맞게 이미징되는 입자들 또는 백혈구들을 식별하여 이러한 입자들 또는 백혈구들의 수 및 타입들을 결정하기 위해, 획득된 각각의 디지털 이미지를 분석하도록 배치되고, 상기 타입들은 상기 입자들 또는 착색된 백혈구들의 물리적 특성들에 의해 구별되며, 이에 따라 상기 샘플에 있는 상이한 타입들의 입자들 또는 백혈구들의 비율이 결정되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 상기 획득된 이미지에서 광의 방향 정보를 제공하도록 배치되어 상기 획득된 이미지에서 초점 이동(shifting)이 가능한,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 상이한 광학 셋팅들을 이용하여 상기 샘플의 제 1 및 제 2 디지털 이미지를 획득하도록 배치되고,
    상기 이미지 분석기는 상기 샘플에 있는 입자들 또는 백혈구들의 수를 결정하기 위해, 획득된 상기 제 1 디지털 이미지를 분석하도록 배치되며,
    상기 이미지 분석기는 상기 샘플에 있는 상이한 타입들의 입자들의 비율을 결정하기 위해, 획득된 상기 제 2 디지털 이미지를 분석하도록 배치되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 적어도 부분적으로 분리된 2개의 부분들을 포함하고, 상기 부분들은 조사된 샘플로부터 상기 이미징 시스템의 제 1 및 제 2 부분으로 광을 지향시키는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 이미지 분석기는 상기 입자들 또는 세포들이 이미징되는 입자들 또는 세포들의 엣지들에서 세기(intensity)의 기울기를 기초로 초점이 맞게 이미징되는지 여부를 평가하기 위해, 이미징되는 입자들 또는 세포들의 엣지들을 분석하도록 배치되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 이미지 분석기는 특정한 입자 또는 세포에 대해, 상기 입자 또는 세포가 제 1 방향에서 초점이 맞지 않는 것으로 결정되는 이미지에서부터 상기 입자 또는 세포가 제 2 방향에서 초점이 맞지 않는 것으로 결정되는 이미지까지 카운팅하여, 상기 입자 또는 세포가 이미징되는 상기 이미지들의 수를 결정하도록 배치되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 이미지 분석기는 카운팅된 이미지들의 수를 기초로 상기 입자 또는 세포의 크기에 관련된 물리적 특성을 결정하도록 배치되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하기 위해 사용되는 광학 셋팅들을 갖는 상기 이미징 시스템은 1-50x의 배율을 갖는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 2-60㎛의 범위의 필드 깊이를 갖는 상기 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하도록 배치되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  13. 제 3 항에 있어서,
    상기 전자기 방사원은 착색제의 흡광도(absorbance)의 피크에 대응하는 광의 파장으로 조사하도록 배치되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  14. 제 3 항에 있어서,
    상기 전자기 방사원은 레이저 소스를 포함하는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  15. 제 3 항에 있어서,
    상기 전자기 방사원은 발광 다이오드를 포함하는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  16. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이미지 분석기는 상기 샘플에 있는 입자들 또는 백혈구들의 수를 결정하기 위해 고 흡광도(high light absorbance)의 영역들을 식별하도록 배치되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 이미지 분석기는 상기 샘플에 있는 입자들 또는 백혈구들의 수를 결정하기 위해 암점(dark dot)들을 식별하도록 배치되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  18. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이미지 분석기는 상기 적어도 하나의 디지털 이미지의 고 흡광도의 식별된 영역들의 형상 및 크기를 분석함으로써 상이한 타입들의 입자들 또는 백혈구들을 구별하도록 배치되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 측정 장치.
  19. 샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법으로서,
    샘플 획득 장치의 측정 캐비티 내에 샘플을 획득하는 단계;
    상기 측정 캐비티에서 조사된 샘플의 배율(magnification)의 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하는 단계;
    상기 입자들을 식별하여 상기 샘플에 있는 입자들의 수를 결정하기 위해, 상기 적어도 하나의 디지털 이미지를 디지털 분석하는 단계; 및
    초점이 맞게 이미징되는 입자들을 식별하여 이러한 입자들의 수 및 타입들을 결정하기 위해, 상기 적어도 하나의 디지털 이미지를 디지털 분석하는 단계
    를 포함하고, 상기 입자들의 수는 상기 입자들에 대응하는 획득된 상기 적어도 하나의 디지털 이미지의 패턴들을 식별함으로써 결정되며, 상기 타입들은 상기 입자들의 물리적 특성들에 의해 구별되고, 이에 따라 상기 샘플에 있는 상이한 타입들의 입자들의 비율이 결정되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 방법은 혈액 샘플에 있는 백혈구들을 계산하도록 구성되며,
    상기 방법은,
    샘플 획득 장치의 측정 캐비티 내에 혈액 샘플을 획득하는 단계 ― 상기 혈액 샘플은 반응제와 혼합되고, 상기 반응제는 상기 혈액 샘플에 있는 적혈구들을 용해시키기 위한 용혈제(hemolysing agent) 및 상기 혈액 샘플에 있는 백혈구들을 착색하기 위한 착색제를 포함함 ―;
    상기 측정 캐비티의 조사된 샘플의 배율의 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하는 단계;
    선택적인 상기 착색제에 의해 착색된 백혈구들을 식별하여 상기 샘플에 있는 백혈구들의 수를 결정하기 위해, 상기 적어도 하나의 디지털 이미지를 디지털 분석하는 단계; 및
    초점이 맞게 이미징되는 백혈구들을 식별하여 이러한 백혈구들의 수 및 타입들을 결정하기 위해, 상기 적어도 하나의 디지털 이미지를 디지털 분석하는 단계 ― 상기 타입들은 상기 착색된 백혈구들의 물리적 특성들에 의해 구별되고, 이에 따라 상기 혈액 샘플에 있는 상이한 타입들의 백혈구들의 비율이 결정됨 ―
    를 포함하는, 샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 샘플은 상기 측정 캐비티에 있는 상기 반응제와 혼합되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  22. 제 19 항에 있어서,
    상기 샘플 획득 장치의 상기 측정 캐비티에 보유된 상기 샘플을 조사하는(irradiating) 단계를 더 포함하는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  23. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플의 다수의 디지털 이미지들이 상이한 광학 셋팅들을 이용하여 획득되고, 각각의 획득된 디지털 이미지는 입자들 또는 착색된 백혈구들을 식별하여 상기 샘플에 있는 입자들 또는 백혈구들의 수를 결정하기 위해 분석되며,
    각각의 획득된 디지털 이미지는 초점이 맞게 이미징되는 입자들 또는 백혈구들을 식별하여 이러한 입자들 또는 백혈구들의 수 및 타입들을 결정하기 위해 분석되고, 상기 타입들은 상기 입자들 또는 착색된 백혈구들의 물리적 특성들에 의해 구별되며, 이에 따라 상기 샘플에 있는 상이한 타입들의 입자들 또는 백혈구들의 비율이 결정되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  24. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 디지털 이미지는 광의 방향 정보가 상기 획득된 이미지에 기록되도록 획득되고, 이에 따라 상기 획득된 이미지에서 초점 이동이 가능하며, 상기 분석은 초점의 순차적인 이동에 의해 수행되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  25. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하는 단계는 상기 측정 캐비티에 있는 상기 샘플의 제 1 배율의 제 1 디지털 이미지를 획득하는 단계, 및 상기 측정 캐비티에 있는 상기 샘플의 제 2 배율의 제 2 디지털 이미지를 획득하는 단계를 포함하고, 상기 제 2 배율은 상기 제 1 배율보다 더 크며,
    획득된 상기 제 1 디지털 이미지는 상기 샘플에 있는 입자들 또는 백혈구들의 수를 결정하기 위해 분석되고, 획득된 상기 제 2 디지털 이미지는 상기 샘플에 있는 상이한 타입들의 입자들 또는 백혈구들의 비율을 결정하기 위해 분석되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  26. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    특정한 세포에 대해, 상기 입자 또는 세포가 제 1 방향에서 초점이 맞지 않는 것으로 결정되는 이미지에서부터 상기 입자 또는 세포가 제 2 방향에서 초점이 맞지 않는 것으로 결정되는 이미지까지 카운팅하여, 상기 세포가 이미징되는 상기 이미지들의 수를 결정하는 단계를 더 포함하는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 카운팅된 이미지들의 수를 기초로, 상기 세포의 크기에 관련된 물리적 특성이 결정되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  28. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 디지털 이미지는 1-50x의 배율을 이용하여 획득되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  29. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 2-60㎛ 범위의 필드 깊이를 갖는 상기 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하도록 배치되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  30. 제 20 항에 있어서,
    상기 샘플은 상기 착색제의 흡광도의 피크에 대응하는 파장의 광에 의해 조사되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  31. 제 22 항에 있어서,
    상기 조사는 레이저 소스에 의해 수행되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  32. 제 22 항에 있어서,
    상기 조사는 발광 다이오드에 의해 수행되는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  33. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분석은 상기 샘플에 있는 입자들 또는 백혈구들의 수를 결정하기 위해 고 흡광도의 영역들을 식별하는 단계를 포함하는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 분석은 상기 샘플에 있는 입자들 또는 백혈구들의 수를 결정하기 위해 암점들을 식별하는 단계를 포함하는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  35. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분석은 상기 적어도 하나의 디지털 이미지에서 고 흡광도의 식별된 영역들의 형상 및 크기를 분석함으로써 상이한 타입들의 입자들 또는 백혈구들을 구별하는 단계를 포함하는,
    샘플에 있는 입자들의 계산을 위한 방법.
  36. 샘플의 분석을 위한 컴퓨터-판독가능한 매체로서,
    상기 샘플에 있는 입자들의 수를 결정하기 위해 상기 샘플의 적어도 하나의 이미지를 디지털 분석하기 위한 컴퓨터 코드 ― 상기 입자들의 수는 상기 입자들에 대응하는 획득된 적어도 하나의 디지털 이미지의 패턴들을 식별함으로써 결정됨 ―;
    상기 샘플의 포커싱된 영역에 있는 입자들의 하나 이상의 타입들을 식별하기 위해 상기 샘플의 상기 적어도 하나의 이미지를 디지털 분석하기 위한 컴퓨터 코드 ― 입자의 각각의 타입은 구별되는 하나 이상의 물리적 특성들과 연관됨 ―; 및
    상기 샘플에 있는 입자들의 수 및 타입들에 대응하는 정보를 출력하기 위한 컴퓨터 코드
    를 포함하는 샘플의 분석을 위한 컴퓨터-판독가능한 매체.
  37. 샘플을 분석하기 위한 컴퓨터-판독가능한 매체로서,
    입자들을 식별하여 상기 샘플에 있는 입자들의 수를 결정하기 위해 적어도 하나의 디지털 이미지를 분석하기 위한 컴퓨터 프로그램 코드; 및
    초점이 맞게 이미징되는 입자들을 식별하여 이러한 입자들의 수 및 타입들을 결정하기 위해 상기 적어도 하나의 디지털 이미지를 분석하기 위한 컴퓨터 프로그램 코드 ― 상기 입자들의 수는 상기 입자들에 대응하는 획득된 상기 적어도 하나의 디지털 이미지의 패턴들을 식별함으로써 결정되고, 상기 타입들은 상기 입자들의 물리적 특성들에 의해 구별되며, 이에 따라 상기 샘플에 있는 상이한 타입들의 입자들의 비율이 결정됨 ―
    를 포함하는 샘플을 분석하기 위한 컴퓨터-판독가능한 매체.
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