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CN114813522B - 基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法及系统 - Google Patents

基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法及系统 Download PDF

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CN114813522B
CN114813522B CN202210745852.8A CN202210745852A CN114813522B CN 114813522 B CN114813522 B CN 114813522B CN 202210745852 A CN202210745852 A CN 202210745852A CN 114813522 B CN114813522 B CN 114813522B
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Shenzhen Anlu Medical Technology Co ltd
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Abstract

基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法及系统，用于血液中目标细胞浓度和体积计算，识别出所选中X幅显微放大数字图像中的目标细胞，并获得所选中X幅显微放大数字图像中的目标细胞数量NTC；计算显微放大数字图像中的单个目标细胞体积VTC=目标细胞面积STC×第一体积校正系数CVC1；计算单个目标细胞体积VTC=第一吸收参数α1×每个目标细胞面积STC×第二体积校正系数CVC2；计算单个目标细胞体积VTC=目标细胞面积STC×第一细胞高度系数TH1。目标细胞浓度和体积计算，方法简单，计数和体积计算的准确率高；使单个目标细胞体积的统计学分析就有了非常精准的基础，也使得针对单个目标细胞体积及其联合其他参数的统计分析能展开，为临床获取了更深一层的有价值信息。

Description

基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法及系统
技术领域
本申请属基于细胞悬浮液显微放大数字图像获取目标样本中各成分特性和参数的技术领域，尤其涉及基于数字图像进行血液样本中各种细胞浓度和细胞体积计算的技术领域。
背景技术
现有技术中，对血液细胞中各种不同细胞的浓度和体积的分析，有不同的方法。其中之一是将血液标本稀释后采用牛鲍血细胞计数板在显微镜下计数后换算得到。这样的计数过程是需要人工参与计数，费时费力，且非常容易出错。其中之二是利用血液分析仪进行血液细胞的浓度、体积及血红蛋白的检测。
现有技术中,对细胞类型识别，细胞体积和数量的计算通常采用流式细胞仪。其中一部分流式细胞仪是采用电学原理，如电阻抗原理即库尔特原理设计不同类型细胞相应的计数通道，进行不同类型细胞的体积和数量检测。或利用射频电导法对不同类型细胞由于细胞特性不同的电导性进行细胞类型识别和计数。如图1所示，电阻抗法流式细胞仪中，血液细胞一个一个通过狭缝，狭缝内外是有直流电的电解质环境，当细胞通过时会引起瞬时的电位变化，形成电脉冲，电脉冲的个数反应细胞的个数，大小反应细胞的体积大小。细胞体积在一定范围内划为目标细胞。此方法为三分类血液分析仪的常用检测原理之一。
其中另一部分流式细胞仪是采用光学或光化学原理，如图2和图3激光散射法，将稀释染色后的细胞注入鞘流机构，让激光照射流进鞘流机构的细胞，由于细胞特性不同，会产生与其特性相应的光学特征，如产生相应的散射，检测相应的光学信号即可获得相应细胞的体积和数量信息。流式细胞仪还有采用激光散射法，即不同细胞被激光束照射时，会产生与细胞特征相应的各种角度的散射光。对经信号检测器获取的散射光信息进行综合分析，即可准确区分正常类型的细胞。低角度散射光（向前散射光）反映细胞的数量和表面积大小，高角度散射光（侧向散射光）反映细胞的内部颗粒、细胞核等复杂性。此方法为现代五分类血液分析仪的主要检测原理之一。该方法能获取单一细胞的尺寸参数，因此单个细胞的体积参数也能获取。
无论是电学原理还是光学或光化学原理的细胞分析仪，其相对于人工的牛鲍板进行分析，其结果准确性可靠性和效率都有了大大的提升。但是，上述流式细胞仪，都需要对小部分样品进行单个细胞依次进行识别；因此需要为单个细胞的流过设计精密的流体通道，并配合相应的复杂光学系统设计，以适应对单个细胞进行光电参数的捕获。需要复杂的流道设计和光学系统设计，系统硬件设计复杂成本高，且非常容易出现故障，通常需要定期维护以保证流道和光学系统维持正常工作状态；且这样的单细胞流道，细胞识别效率低；当细胞的形状特征发生变化时，识别的准确性会降低。
本申请中设计了一种基于明场显微放大数字图像的血液细胞分析方法，能基于明场显微放大数字图像进行不同细胞类型的识别和计数，并计算出不同类型细胞的体积；本申请中的血液细胞分析方法用极简的硬件成本进行了全血细胞分析。且由于这样的方法基于明场图像，非常直观，准确性更好；既没有流式细胞中鞘流机构的设计，也没有复杂的分光光度计的设计；整个技术方案极简，从研发到使用维护的系统效率都很高，成本极低。
在实际应用中，如血液细胞类型的识别和计数中，数字图像中涉及多种细胞类型，不同细胞类型的实际尺寸差异较大，白细胞WBC的直径大于红细胞RBC的直径；红细胞RBC的直径和网织红细胞的直径相当，红细胞RBC和网织红细胞的直径大于血小板直径，且尺寸的差距较大；且不同细胞类型在等量体液样本中的浓度差度较大；在利用显微放大数字图像进行细胞悬浮液成像时，同一张图片中不同类型的细胞的数量往往不在一个数量级上，如一张放大倍数为40倍的显微放大数字图像中，红细胞的数量可能是上百甚至是上千个，但是白细胞的数量却只有个位数。这些特征都给高效利用显微放大数字图像进行细胞分析带来了难度。
WBC 是英文“white blood cell”的缩写，中文意思是白细胞；在血液分析仪中WBC的含义是白细胞浓度，单位是“个/L ”；
RBC 是英文“red blood cell”的缩写，中文意思是红细胞； 在血液分析仪中，RBC的含义是红细胞浓度， 单位是“个/L ”；
HCT是英文“hematocrit”的缩写，HCT又称红细胞压积（PCV），中文意思是红细胞比容；在血液分析仪中，HCT的含义是抗凝血积压后红细胞占全血的容积比；单位是 %；
CV是英文“corpuscular volume”的缩写，中文意思是红细胞体积；单位是“fL”；
MCV 是英文“mean corpuscular volume”的缩写，中文意思是平均红细胞体积 ；在血液分析仪中MCV 的含义是所有红细胞的平均体积，即平均红细胞体积，单位是“ fL”飞升；
HGB是英文“hemoglobin”的缩写，中文意思是血红蛋白 ；在血液分析仪中HGB的含义是单位体积血液中的血红蛋白含量，即血红蛋白浓度，单位是“g/L ”；
CH 是英文“corpuscular hemoglobin”的缩写，中文意思是红细胞的血红蛋白 ；在血液分析仪中CH 的含义是单个红细胞的血红蛋白含量，单位是 “pg”；
MCH 是英文“mean corpuscular hemoglobin”的缩写，中文意思是平均红细胞血红蛋白含量 ；在血液分析仪中MCH 的含义是单个红细胞的平均红细胞血红蛋白含量，单位是 “pg”皮克；
MCHC 是英文“mean corpuscular hemoglobin concentration”的缩写，中文意思是平均红细胞血红蛋白浓度 ；在血液分析仪中MCHC 的含义是单位体积红细胞的平均红细胞血红蛋白含量，单位是“g/L”;
传统血液分析仪的计算过程中，MCHC =HGB÷RBC÷MCV ;MCHC=MCH÷MCV=HGB÷RBC÷MCV;MCH=HGB÷RBC。
发明内容
本申请要解决的技术问题在于避免现有技术上述不足之处，提出了一种基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法；并能基于显微放大数字图像进行多种血液细胞的浓度和体积的计算分析。本申请解决上述技术问题的技术方案是一种基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法，用于血液中目标细胞浓度计算，显微放大数字图像是基于血液细胞单层平铺在悬浮液中所获取的一组显微放大数字图像；一组显微放大数字图像中包括N×M幅显微放大数字图像；N和M均为大于等于1的自然数；包括步骤2A：从N×M幅显微放大数字图像选取X幅显微放大数字图像用于目标细胞浓度计算，X为大于等于1的自然数；识别出所选中X幅显微放大数字图像中的目标细胞，并获得所选中X幅显微放大数字图像中的目标细胞数量NTC；步骤2B：计算参与运算的所有显微放大数字图像中的目标细胞数量NTC；计算参与运算的所有显微放大数字图像对应的视野面积S；步骤2C：获取已知成像目标区域中细胞悬浮液的高度H；计算血液中目标细胞浓度=目标细胞数量NTC÷(视野面积S×H)；所述血液中目标细胞包括红细胞、白细胞、血小板、网织红细胞中的任意一种或多种。该方案用于红细胞、白细胞、血小板、网织红细胞浓度计算。
本申请解决上述技术问题的技术方案是一种基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法，用于血液中目标细胞浓度计算，显微放大数字图像是基于血液细胞单层平铺在悬浮液中所获取的一组显微放大数字图像；一组显微放大数字图像中包括N×M幅显微放大数字图像；N和M均为大于等于1的自然数；包括步骤3A：从N×M幅显微放大数字图像选取X幅显微放大数字图像用于目标细胞浓度计算，X为大于等于1的自然数；识别出所选中X幅显微放大数字图像中的目标细胞，并获得所选中X幅显微放大数字图像中的目标细胞数量NTC；识别出所选中X幅显微放大数字图像中的参比粒子，并获得所选中X幅显微放大数字图像中的参比粒子的数量；步骤3B：计算参与运算的所有显微放大数字图像中的目标细胞数量NTC；计算参与运算的所有显微放大数字图像中的参比粒子数量RRC；步骤3C：计算血液中目标细胞浓度=目标细胞数量NTC÷参比粒子数量RRC×参比粒子浓度C；悬浮液中包含有已知参比粒子浓度C的参比粒子；所述血液中目标细胞包括红细胞、白细胞、血小板、网织红细胞中的任意一种或多种。
本申请解决上述技术问题的技术方案是一种基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法，用于血液中目标细胞体积计算，显微放大数字图像是基于血液细胞单层平铺在悬浮液中所获取的一组显微放大数字图像；一组显微放大数字图像中包括N×M幅显微放大数字图像；N和M均为大于等于1的自然数；包括步骤4A：从N×M幅显微放大数字图像选取X幅显微放大数字图像用于目标细胞浓度计算，X为大于等于1的自然数；识别出所选中X幅显微放大数字图像中的目标细胞，并获得所选中X幅显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC；步骤4B：获取已知的第一体积校正系数CVC1；计算显微放大数字图像中的单个目标细胞体积VTC=目标细胞面积STC×第一体积校正系数CVC1；所述血液中目标细胞包括红细胞、网织红细胞中的任意一种或多种。
所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法，还包括计算第一体积校正系数CVC1的步骤4AA；步骤4AA中包括：步骤4AA1：取同一待分析的血液细胞样品，外部设备获取目标细胞的平均细胞体积ZSC；步骤4AA2：取和步骤4AA1中同一待分析的血液细胞样品，进行预处理制得细胞悬浮液，细胞悬浮液注入成像目标区域内；使血液细胞单层平铺在悬浮液中，并获取血液细胞单层平铺在悬浮液中的显微放大数字图像；步骤4AA3：识别出显微放大数字图像中的目标细胞，并获得显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC，并计算目标细胞面积平均值STCA；步骤4AA4：第一体积校正系数CVC1=平均细胞体积ZSC÷目标细胞面积平均值STCA。
所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法，第一体积校正系数CVC1是固定的第一细胞高度系数TH1。
本申请解决上述技术问题的技术方案是一种基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法，用于血液中目标细胞体积计算，显微放大数字图像是基于血液细胞单层平铺在悬浮液中所获取的一组显微放大数字图像；一组显微放大数字图像中包括N×M幅显微放大数字图像；N和M均为大于等于1的自然数；包括步骤5A：从N×M幅显微放大数字图像选取X幅显微放大数字图像用于目标细胞浓度计算，X为大于等于1的自然数；识别出所选中X幅显微放大数字图像中的目标细胞，并获得所选中X幅显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC；步骤5B：计算显微放大数字图像中的第一吸收参数α1=lg（空白平均灰度值/细胞像素平均灰度值)；获取已知的第二体积校正系数CVC2；计算单个目标细胞体积VTC=第一吸收参数α1×每个目标细胞面积STC×第二体积校正系数CVC2；所述血液中目标细胞是红细胞或网织红细胞。
所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法，还包括计算第二体积校正系数CVC2的步骤5AA；步骤5AA中包括：步骤5AA1：取同一待分析的血液细胞样品，外部设备获取目标细胞的平均细胞体积ZSC；
步骤5AA2：取和步骤5AA1同一待分析的血液细胞样品，进行预处理制得细胞悬浮液，细胞悬浮液注入成像目标区域内；使血液细胞单层平铺在悬浮液中，并获取血液细胞单层平铺在悬浮液中的显微放大数字图像；步骤5AA3：计算显微放大数字图像中的第一吸收参数α1=lg（空白平均灰度值/细胞像素平均灰度值)；步骤5AA4：第二体积校正系数CVC2=平均细胞体积ZSC÷第一吸收参数α1。
所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法，获得显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC之前，包括以下步骤，步骤4A1：获取每个目标细胞的长轴AX和短轴BY数据的步骤,长轴AX=2a；短轴BY=2b；步骤4A2：根据长轴AX和短轴BY之间的比值是否落入设定的阈值范围，该阈值范围是中心值为1的阈值范围；若长轴AX和短轴BY之间的比值落入设定阈值范围，则将显微放大数字图像中的目标细胞投影的形态识别为圆形；目标细胞面积STC=π×a2，或目标细胞面积STC=π×b2;若长轴AX和短轴BY之间的比值大于设定阈值范围，将显微放大数字图像中的目标细胞投影的形态识别为椭圆形；目标细胞面积STC=π×a×b；其中a为长轴AX的半径，b为短轴BY的半径。
所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法，还包括步骤4C或步骤5C或14C：加总显微放大数字图像中的各单个目标细胞体积VTC获取所有目标细胞体积AVC，获取显微放大数字图像中的所有目标细胞数量NTC，计算目标细胞平均体积MCV=所有目标细胞体积AVC÷所有目标细胞数量NTC。
本申请解决上述技术问题的技术方案是一种基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法，用于血液中目标细胞体积计算，显微放大数字图像是基于血液细胞单层平铺在悬浮液中所获取的一组显微放大数字图像；一组显微放大数字图像中包括N×M幅显微放大数字图像；N和M均为大于等于1的自然数；包括步骤15A：从N×M幅显微放大数字图像选取X幅显微放大数字图像用于目标细胞浓度计算，X为大于等于1的自然数；识别出所选中X幅显微放大数字图像中的目标细胞，并获得显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC；所述血液中目标细胞是血小板或白细胞；步骤15B：获取已知的第三体积校正系数CVW3；计算显微放大数字图像中的单个目标细胞体积VTC=目标细胞面积STC1.5×第三体积校正系数CVW3；第三体积校正系数CVW3包括血小板体积校正系数CPLT和第一白细胞体积校正系数CVW1。
所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法，还包括计算第三体积校正系数CVW3的步骤15AA；步骤15AA中包括：步骤15AA1：取同一待分析的血液细胞样品，利获取目标细胞的平均细胞体积ZSC；步骤15AA2：取和步骤15AA1中同一待分析的血液细胞样品，进行预处理制得细胞悬浮液，细胞悬浮液注入成像目标区域内；使血液细胞单层平铺在悬浮液中，并获取血液细胞单层平铺在悬浮液中的显微放大数字图像；步骤15AA3：识别出显微放大数字图像中的目标细胞，并获得显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC，并计算目标细胞面积平均值STCA；步骤13AA4：第三体积校正系数CVW3=平均细胞体积ZSC÷目标细胞面积平均值STCA1.5。
所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法包括，步骤4M：根据各单个目标细胞体积VTC，加总各单个目标细胞体积VTC求平均，计算获取目标细胞平均体积。
所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法包括，步骤4M2：根据各单个目标细胞体积VTC，输出单个目标细胞体积VTC直方图的步骤；直方图用于统计不同目标细胞体积分布规律。
所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法包括，步骤4M3：获取各目标血红蛋白含量CH，并根据各目标细胞体积VTC和各目标血红蛋白含量CH输出CH-CV联合散点图的步骤；CH-CV联合散点图用于统计不同体积目标细胞的血红蛋白分布规律。
所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法包括，步骤4M4：在CH-CV联合散点图上展示至少一条CH范围指示线和至少一条CV范围指示线的步骤。
所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法包括，步骤4M5：获取各目标细胞血红蛋白浓度CHC；或获取各目标血红蛋白含量CH，计算CHC=目标血红蛋白含量CH÷各目标细胞体积VTC；并根据各目标细胞的体积和目标细胞血红蛋白浓度CHC输出CHC-CV联合散点图的步骤；CHC-CV联合散点图用于统计不同体积目标细胞的血红蛋白分布规律。
所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法包括，步骤4M6：在CHC-CV联合散点图上展示至少一条CHC范围指示线和至少一条CV范围指示线的步骤。
一种血液细胞分析系统，用于血液细胞分析，包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述程序时实现如上述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法。
一种可读存储介质，其上存储有计算机程序，其特征在于，该程序被处理器执行时实现如上述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法。
同现有技术相比较，本申请的有益效果之一，基于显微放大数字图像中的目标细胞数量进行目标细胞浓度和体积计算，方法简单，计数和体积计算的准确率高，因此细胞浓度的计算准确率也高。成像目标区域内置有包含血液细胞的细胞悬浮液，其中用于盛放细胞悬浮液的腔体的高度可用作是细胞悬浮液的高度H；其中的细胞悬浮液盛放腔体是经由特殊设计的腔体，细胞悬浮液中基本是单层细胞平铺的状态用于细胞悬浮液成像。
同现有技术相比较，本申请的有益效果之二，使单个目标细胞体积的统计学分析就有了非常精准的基础，也使得针对单个目标细胞体积的统计分析能展开，为临床获取了更深一层的有价值信息。在多种贫血症的分型中，各种目标细胞体积的统计分析具有非常重要的临床价值。
同现有技术相比较，本申请的有益技术效果之三是，在细胞悬浮液中，细胞形态保持完整，细胞的体积测量也会更准确，单个细胞体积和单个细胞血红蛋白含量的联合，将单个血红蛋白含量和单个血红蛋白的体积联合进行统计学分析，为临床获取了更深一层的多维度的有价值信息。尤其是在多种贫血症的分型中，单细胞血红蛋白含量联合单个血红蛋白的体积的统计分析具有极其重要的临床价值。
同现有技术相比较，本申请的有益效果之四，基于显微放大数字图像中的信息，对红细胞、网织红细胞的浓度和体积计算有多种计算方法互相印证，保证了计算的可靠性；对红细胞的体积计算采用圆柱模型进行计算，对血小板、白细胞的体积计算采用球形模型进行计算，更接近与临床实际。
同现有技术相比较，本申请的有益效果之五，基于显微放大数字图像中的信息，能同时进行多种细胞的浓度、体积计算，且成本低廉，无需事先进行离心的步骤，也无需复杂的流式细胞计数和分光光度计的测量过程。所有的计算都只是基于获取了足够放大倍数，且带有足够多信息的显微放大数字图像，颠覆了原有细胞分析仪的工作思路，是一种基于AI大数据图像处理技术在细胞分析领域的应用，是细胞分析仪的真正数字化。
附图说明
图1是现有技术分流式细胞仪的原理示意图之一；
图2是现有技术分流式细胞仪的原理示意图之二；
图3是现有技术分流式细胞仪的原理示意图之三；
图4是显微图像获取装置的示意框图；
图5是显微图像获取装置中光学部分的组成示意图；
图6是成像目标区域的示意图；图中标号100是成像目标区域，包括了承载细胞悬浮液的芯片底座即试剂盒芯片；标号200是细胞悬浮液平铺区域，标号300是选取的一级视野目标成像区域；
图7是成像目标区域一级视野的示意图；图中可见图6中的一级视野目标成像区域300被划分成了16个一级视野310；
图8是成像目标区域分级视野的示意图；图中一级视野目标成像区域300被划分成了16个一级视野310；其中一个一级视野310又被划分成了25个二级视野510；
图9是图8中一个一级视野的局部放大图，该一级视野被划分成了25个二级视野510；
图10是分级视野数字图像获取方法中成像目标区域分级视野的示意图之二；图中一级视野目标成像区域300被划分成了9个一级视野310；其中一个一级视野310又被划分成了16个二级视野510；
图11是一个显微放大数字图像的局部，里面展示了目标细胞之一红细胞的不同状态；在细胞悬浮液中部分细胞处在完全展平的状态，其细胞主体所在中心平面和成像的光束正交，能获得其完整的正投影影像；在细胞悬浮液中部分细胞处在侧向悬浮状态，其细胞主体所在中心平面和成像的光束并不正交，因此只能获得其部分的投影影像；如图9中标号800所示的目标细胞，就处在这样的状态，此时投影是残缺的圆形或椭圆形；而图11中左上部分的几个目标细胞更接近于完整的正投影影像；
图12是图11中一个椭圆形投影的示意图，图中长轴AX=2a，短轴BY=2b；
图13为健康犬的单细胞CV直方图；非常直观地体现了CV的统计学分布特征；
图14为另一病犬的单个细胞的CV直方图，图中可见CV值偏小，临床症状常见于缺铁性贫血、铁幼粒细胞性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血；
图15是健康猫的单细胞CV直方图；非常直观地体现了CV的统计学分布特征；
图16中为一病猫的单细胞CV直方图；图中单细胞CV值偏大，临床常见于巨幼细胞性贫血；
图17是健康犬的CH-CV散点图；
图18是健康犬的CHC-CV散点图；
图19是健康猫的CH-CV散点图；
图20是健康猫的CHC-CV散点图；CHC-CV散点图相对于CH-CV散点图更聚集，能更直观地体现一些病理情况；
图21是一病犬CH-CV散点图，从图中可见该犬CH/CV都偏小，临床症状常见于缺铁性贫血；
图22是一病猫CH-CV散点图，从图中可见该猫CH/CV都偏小，临床症状常见于缺铁性贫血。
具体实施方式
以下结合各附图对本申请的实施方式做进一步详述。
如图4至图6所示，一种分级视野数字图像获取方法其所基于的显微成像系统中，包括主控制器，显微成像组件，驱动组件和照明光源组件；显微成像组件包括透镜组件和相机组件，透镜组件和相机组件组合在一起共同移动，显微成像组件用于获取成像目标区域范围内的显微放大后的数字化图像；显微成像组件和驱动组件连接，驱动组件控制显微成像组件相对于成像目标区域的距离；驱动组件和主控制器电连接，驱动组件接受主控制器指令，能带动显微成像组件沿着成像光轴移动，调整显微成像组件相对于成像目标区域的距离，以获取清晰的显微放大数字图像；成像目标区域设置在照明光源组件和显微成像组件之间；照明光源组件用于成像照明。
图5中，标号600是显微成像组件，标号620是相机组件，标号610是透镜组件；标号100是目标成像区域；标号700是照明光源组件；透镜组件610设置在成像目标区域上方，用于形成成像目标区域的显微放大数字图像；相机组件620用于获取该显微放大数字图像的数字化图像。
如图6所示，选择成像目标区域200中的一部分300，将该部分的成像目标区域划分成N1个一级视野；各一级视野范围大小设定成不同大小或相同大小，N1为大于等于2的自然数；将每个一级视野对应成像目标区域划分成M2个二级视野；各二级视野范围大小设定成不同大小或相同大小，M2为大于等于2的自然数；任选一个一级视野，以其中任意一个二级视野为聚焦目标，调整成像目标区域和显微成像组件的间距，使显微成像组件能获取该个二级视野的清晰的显微放大数字图像；在该焦距维持的状态下，在水平方向移动显微成像组件，使显微成像组件依次获取该二级视野对应的M2幅清晰的显微放大数字图像。
如图6所示，一种分级视野数字图像获取方法的实施例中，成像目标区域大小是12mm×14mm；即图6中标号为200的区域。选择成像目标区域中不小于四分之一的区域，即图6中标号为300的区域,并将其划分成N1个一级视野；显微放大倍数范围是20倍至100倍。除了选择成像目标区域中的四分之一区域，还可以选择成像目标区域中的三分之一区域或五分之一区域或其他面积的大小。具体的成像目标区域面积大小，可跟随细胞悬浮液中体液和稀释液之间的稀释程度进行调整。细胞悬浮液中的血液细胞既包括染色后的细胞，也可以是没有染色后的细胞；在只进行部分细胞分析时，如只进行红细胞分析时，可以用不染色的细胞悬浮液。
如图7至图9所示的实施例中，N1等于16；M2等于25；N1的取值范围是10至20。如图10所示的实施例中，N1等于9；M2等于16。实际分割的区域数量可以根据分割区域大小和放大倍数进行调整以获得最佳的组合。细胞悬浮液中的血液细胞包括染色后的血液细胞和没有染色的血液细胞；细胞悬浮液中血液体积和染色试剂的体积比范围是1:200至1：260。
本申请中的细胞浓度是指单位体积内的细胞个数，因此浓度计算的实质是进行细胞计数。本申请中，显微放大数字图像是基于血液细胞单层平铺在悬浮液中所获取的一组显微放大数字图像；一组显微放大数字图像中包括N×M幅显微放大数字图像；N和M均为大于等于1的自然数；从N×M幅显微放大数字图像选取X幅显微放大数字图像用于目标细胞的浓度或体积计算，X为大于等于1的自然数；识别出所选中X幅显微放大数字图像中的目标细胞，并获得所选中X幅显微放大数字图像中的目标细胞数量NTC；X可以是1，当然也可以是其他数值；具体的数值，可以根据显微放大倍数、数字图像获取用的相机视野大小以及悬浮液的稀释浓度来平衡选择，数量只要能满足统计学上的基本要求即可。
一种用于血液中目标细胞浓度计算，尤其是用于红细胞、白细胞、血小板、网织红细胞浓度计算的血液细胞分析方法的实施例中，即红细胞、血小板、网织红细胞浓度计算方法之一中，包括步骤2A：利用AI算法识别出每一幅显微放大数字图像中的目标细胞，并获得每一幅显微放大数字图像中的目标细胞数量；步骤2B：计算参与运算的所有显微放大数字图像中的目标细胞数量NTC；计算参与运算的所有显微放大数字图像对应的视野面积S；步骤2C：获取已知成像目标区域中细胞悬浮液的高度H；计算血液中目标细胞浓度=目标细胞数量NTC÷(视野面积S×H)；上述步骤中的显微放大数字图像包括基于分级视野数字图像获取方法所获取的至少一幅显微放大数字图像；血液中目标细胞包括红细胞、白细胞、血小板、网织红细胞中的任意一种或多种。
成像目标区域内置有包含血液细胞的细胞悬浮液，其中用于盛放细胞悬浮液的腔体的高度可用作是细胞悬浮液的高度H；其中的细胞悬浮液盛放腔体是经由特殊设计的腔体，细胞悬浮液中是单层细胞平铺的状态用于细胞悬浮液成像。关于细胞悬浮液成像过程，具体请参考专利申请号为CN2020112669182，名称为“细胞悬浮液样品成像方法和系统及试剂盒”的专利申请。
一种用于血液中目标细胞浓度计算，尤其是用于红细胞、白细胞、血小板、网织红细胞浓度计算的血液细胞分析方法的实施例中，即红细胞、血小板、网织红细胞浓度计算方法之二中，包括步骤3A：利用AI算法识别出每一幅显微放大数字图像中的目标细胞，并获得每一幅显微放大数字图像中的目标细胞数量；利用AI算法识别出每一幅显微放大数字图像中的参比粒子，并获得每一幅显微放大数字图像中的参比粒子的数量；步骤3B：计算参与运算的所有显微放大数字图像中的目标细胞数量NTC；计算参与运算的所有显微放大数字图像中的参比粒子数量RRC；步骤3C：计算血液中目标细胞浓度=目标细胞数量NTC÷参比粒子数量RRC×参比粒子浓度C；上述步骤中的显微放大数字图像包括基于分级视野数字图像获取方法所获取的至少一幅显微放大数字图像；细胞悬浮液中包含有已知参比粒子浓度C的参比粒子；血液中目标细胞包括红细胞、白细胞、血小板、网织红细胞中的任意一种或多种。
一种用于血液目标细胞体积计算，尤其是用于红细胞、网织红细胞体积计算的血液细胞分析方法的实施例中，即红细胞、网织红细胞体积计算方法之一中，包括步骤4A：利用AI算法识别出显微放大数字图像中的目标细胞，并获得显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC；步骤4B：获取已知的第一体积校正系数CVC1；计算显微放大数字图像中的单个目标细胞体积VTC=目标细胞面积STC×第一体积校正系数CVC1；上述步骤中的显微放大数字图像包括基于分级视野数字图像获取方法所获取的至少一幅显微放大数字图像；血液中目标细胞包括红细胞、网织红细胞中的任意一种或多种。
上述实施例中，还包括计算第一体积校正系数CVC1的步骤4AA；步骤4AA中包括：步骤4AA1：取同一待分析的血液细胞样品，利用外部设备获取目标细胞的平均细胞体积ZSC；步骤4AA2：取和步骤4AA1中同一待分析的血液细胞样品，进行预处理制得细胞悬浮液，细胞悬浮液注入成像目标区域内；使血液细胞单层平铺在悬浮液中，并获取血液细胞单层平铺在悬浮液中的显微放大数字图像；步骤4AA3：识别出显微放大数字图像中的目标细胞，并获得显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC，并计算目标细胞面积平均值STCA；步骤4AA4：第一体积校正系数CVC1=平均细胞体积ZSC÷目标细胞面积平均值STCA。
利用外部设备获取目标细胞的平均细胞体积ZSC的方法可以有多种。对于其中的不同类型的细胞，其获取方法可以不同。对于血小板、网织红细胞和白细胞都可以采用现有技术中任意一种标准化测量设备获取其相应的平均细胞体积ZSC。标准化测量设备可以是现有技术中的血液细胞分析系统或者更高测量准确性的其他设备。
对于红细胞，获取其平均细胞体积ZSC的方法之一的过程包括：离心法先进行细胞分层，获取红细胞层占全血样本的体积比，即为红细胞比积HCT；根据获得红细胞比积HCT和对应全血样本的体积，计算该对应全血样本中的红细胞体积，即对应全血样本中的红细胞体积=该全血样本的体积×红细胞比积HCT；利用从外部标准化测量设备获取的红细胞浓度，并根据红细胞浓度计算出对应全血样本中的红细胞数量=该全血样本的体积×红细胞浓度；平均细胞体积ZSC=对应全血样本中的红细胞体积÷对应全血样本中的红细胞数量。获取红细胞浓度的外部标准化测量设备可以是现有技术中任意一种。红细胞比积HCT也可以采用现有技术中已知的标准化测量设备获得。需要说明的是，在本申请中，利用外部设备计算各种校正系数过程中，已默认包含了必要的单位转换过程，即同一样本的定量转换过程，以上转换过程都为现有技术，不再赘述。
另一种用于血液目标细胞体积计算，尤其是用于红细胞、网织红细胞体积计算的血液细胞分析方法的实施例中，即红细胞、网织红细胞体积计算方法之二中，包括步骤5A：利用AI算法识别出显微放大数字图像中的目标细胞，并获得显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC；步骤5B：计算显微放大数字图像中的第一吸收参数α1=lg（空白平均灰度值/细胞像素平均灰度值)；获取已知的第二体积校正系数CVC2；计算单个目标细胞体积VTC=第一吸收参数α1×每个目标细胞面积STC×第二体积校正系数CVC2；上述步骤中的显微放大数字图像包括基于分级视野数字图像获取方法所获取的至少一幅显微放大数字图像；血液中目标细胞是红细胞或网织红细胞。lg是对数运算符。
需要说明的是，计算显微放大数字图像中的第一吸收参数α1=lg（空白平均灰度值/细胞像素平均灰度值)。选择将单个细胞所在的区域做矩形的截图，即选择以该细胞为中心的矩形区域来进行第一吸收参数α1的计算。空白平均灰度值的意思是取该矩形区域中没有被细胞所占据的区域的平均灰度值。细胞像素平均灰度值的意思是取该矩形区域中被细胞所占据的区域的平均灰度值。
上述实施例中，还包括步骤计算第二体积校正系数CVC2的步骤5AA；步骤5AA中包括：步骤5AA1：取同一待分析的血液细胞样品，利用外部设备获取目标细胞的平均细胞体积ZSC；步骤5AA2：取和步骤5AA1同一待分析的血液细胞样品，进行预处理制得细胞悬浮液，细胞悬浮液注入成像目标区域内；使血液细胞单层平铺在悬浮液中，并获取血液细胞单层平铺在悬浮液中的显微放大数字图像；步骤5AA3：计算显微放大数字图像中的第一吸收参数α1=lg（空白平均灰度值/细胞像素平均灰度值)；步骤5AA4：第二体积校正系数CVC2=平均细胞体积ZSC÷第一吸收参数α1。由于第一吸收参数α1是和细胞尺寸是强相关的参数；根据朗博比尔定律，第一吸收参数α1的大小和细胞尺寸成线性关系，因此可以利用吸收参数通过体积校正系数来获取目标细胞的体积。利用外部设备获取目标细胞的细胞体积ZSC和数量的过程与上一实施例中相同。
另一种用于血液目标细胞体积计算，尤其是用于红细胞、网织红细胞体积计算的血液细胞分析方法的实施例中，即红细胞、网织红细胞体积计算方法之三中，包括步骤14A：利用AI算法识别出显微放大数字图像中的目标细胞，并获得显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC；步骤14B：获取已知的第一细胞高度系数TH1；计算显微放大数字图像中的单个目标细胞体积VTC=目标细胞面积STC×第一细胞高度系数TH1；上述步骤中的显微放大数字图像包括基于分级视野数字图像获取方法所获取的至少一幅显微放大数字图像；所述血液中目标细胞包括红细胞。第一细胞高度系数TH1是根据临床研究数据库中的各种目标细胞的参数范围所给出的一个参考系数。
在实际临床应用中，尤其是在兽用设备中，对有些无法采用现有常规血液分析仪进行测试对比获得的动物血液样本，也可以利用该方法获得相应的计算参数。在上述多个实施例中，获得显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC之前，包括以下步骤，步骤4A1：获取每个目标细胞的长轴AX和短轴BY数据的步骤；长轴AX=2a；短轴BY=2b；步骤4A2：根据长轴AX和短轴BY之间的比值是否落入设定的阈值范围，该阈值范围是中心值为1的阈值范围，如0.99至1.01；若长轴AX和短轴BY之间的比值落入设定阈值范围，则将显微放大数字图像中的目标细胞投影的形态识别为圆形；目标细胞面积STC=π×（a+b）2/4，或目标细胞面积STC=π×a2，或目标细胞面积STC=π×b2;若长轴AX和短轴BY之间的比值没有落入设定阈值范围， 将显微放大数字图像中的目标细胞投影的形态识别为椭圆形；目标细胞面积STC=π×a×b。
如图9和图10所示，图9是一个显微放大数字图像的局部，里面展示了目标细胞之一红细胞的不同状态；在细胞悬浮液中部分细胞处在完全展平的状态，其细胞主体所在中心平面和成像的光束正交，能获得其完整的正投影影像；在细胞悬浮液中部分细胞处在侧向悬浮状态，其细胞主体所在中心平面和成像的光束并不正交，因此只能获得其部分的投影影像；如图9中标号800所示的目标细胞，就处在这样的状态，此时投影是残缺的圆形或椭圆形；而图9中左上部分的几个目标细胞更接近于完整的正投影影像。图10是图9中一个椭圆形投影的示意图，图中长轴AX=2a，短轴BY=2b。
在红细胞的投影面积计算时，根据长轴AX和短轴BY之间的比值是否落入设定阈值范围，来进行投影近似圆程度的判断；若落入设定阈值范围，相当于该部分图像被识别为是红细胞的正投影；对红细胞的体积计算可以采用圆柱体模型，直接以该正投影的面积乘以高度参数获得红细胞的体积。若没有落入设定阈值范围，认为该部分投影是椭圆形，相当于该部分图像被识别为是红细胞的非正投影；在计算红细胞体积时，可以先将该椭圆形的面积换算成圆形正投影的面积再进行红细胞体积的计算。也就是在椭圆形面积的基础上再乘以a/b，或直接以长轴为半径计算面积用作红细胞体积计算时的圆柱形底面积。
上述用于红细胞、网织红细胞体积计算的血液细胞分析方法的实施例中，还包括步骤4C或步骤5C或14C：加总显微放大数字图像中的各单个目标细胞体积VTC获取所有目标细胞的体积AVC，获取显微放大数字图像中的所有目标细胞数量NTC，计算目标细胞平均体积MCV=所有目标细胞的体积AVC÷所有目标细胞数量NTC。
另一种用于血液目标细胞体积计算，尤其是用于血小板体积计算的血液细胞分析方法的实施例中，即血小板体积计算方法之一中，基于上述的分级视野数字图像获取方法所获取的至少一幅显微放大数字图像；所述血液中目标细胞是血小板；包括步骤15A：利用AI算法识别出显微放大数字图像中的目标细胞，并获得显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC；步骤15B：获取已知的血小板体积校正系数CPLT；计算显微放大数字图像中的单个目标细胞体积VTC=目标细胞面积STC1.5×血小板体积校正系数CPLT。
上述实施例中，还包括计算血小板体积校正系数CPLT的步骤15AA；步骤15AA中包括：步骤15AA1：取同一待分析的血液细胞样品，利用外部设备获取目标细胞的平均细胞体积ZSC；步骤15AA2：取和步骤15AA1中同一待分析的血液细胞样品，进行预处理制得细胞悬浮液，细胞悬浮液注入成像目标区域内；使血液细胞单层平铺在悬浮液中，并获取血液细胞单层平铺在悬浮液中的显微放大数字图像；步骤15AA3：利用AI算法识别出显微放大数字图像中的目标细胞，并获得显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC，并计算目标细胞面积平均值STCA；步骤13AA4：血小板体积校正系数CPLT=平均细胞体积ZSC÷目标细胞面积平均值STCA1.5。
一种用于血液中目标细胞浓度计算，尤其是用于白细胞浓度计算的血液细胞分析方法的实施例中，即白细胞浓度计算方法之一中，基于分级视野数字图像获取方法所获取的N2×M2幅显微放大数字图像；血液中目标细胞是白细胞；包括步骤11A：利用AI算法识别出每一幅显微放大数字图像中的目标细胞，并获得每一幅显微放大数字图像目标细胞数量；步骤11B：计算参与运算的所有显微放大数字图像中的目标细胞数量NTC；计算参与运算的所有显微放大数字图像对应的视野面积S；步骤11C：获取已知成像目标区域中细胞悬浮液的高度H；计算血液中目标细胞浓度=目标细胞数量NTC÷(视野面积S×H)。
另一种用于血液中目标细胞浓度计算，尤其是用于白细胞浓度计算的血液细胞分析方法的实施例中，即白细胞浓度计算方法之二中，基于分级视野数字图像获取方法所获取的N2×M2幅显微放大数字图像；血液中目标细胞是白细胞；包括步骤12A：利用AI算法识别出每一幅显微放大数字图像中的目标细胞，并获得每一幅显微放大数字图像目标细胞数量；利用AI算法识别出每一幅显微放大数字图像中的参比粒子，并获得每一幅显微放大数字图像中的参比粒子的数量；步骤12B：计算参与运算的所有显微放大数字图像中的目标细胞数量NTC；计算参与运算的所有显微放大数字图像中的参比粒子数量RRC；步骤12C：计算血液中目标细胞浓度=目标细胞数量NTC÷参比粒子数量RRC×参比粒子浓度C；参比粒子浓度C已知。
另一种用于血液目标细胞体积计算，尤其是用于白细胞体积计算的血液细胞分析方法的实施例中，即白细胞体积计算方法之一中，基于分级视野数字图像获取方法所获取的N2×M2幅显微放大数字图像；血液中目标细胞是白细胞；显微放大数字图像用于红细胞体积计算；包括步骤13A：利用AI算法识别出显微放大数字图像中的目标细胞，并获得显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC；步骤13B：获取已知的第一白细胞体积校正系数CVW1；计算显微放大数字图像中的单个目标细胞体积VTC=目标细胞面积STC1.5×第一白细胞体积校正系数CVW1。
上述实施例中，还包括计算第一白细胞体积校正系数CVW1的步骤13AA；步骤13AA中包括：步骤13AA1：取同一待分析的血液细胞样品，利用外部设备获取目标细胞的平均细胞体积ZSC；步骤13AA2：取和步骤13AA1中同一待分析的血液细胞样品，进行预处理制得细胞悬浮液，细胞悬浮液注入成像目标区域内；使血液细胞单层平铺在悬浮液中，并获取血液细胞单层平铺在悬浮液中的显微放大数字图像；步骤13AA3：利用AI算法识别出显微放大数字图像中的目标细胞，并获得显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC，并计算目标细胞面积平均值STCA；步骤13AA4：第一白细胞体积校正系数CVW1=平均细胞体积ZSC÷目标细胞面积平均值STCA1.5。
基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法的实施例中包括，步骤4M：根据各单个目标细胞体积VTC，加总各单个目标细胞体积VTC求平均，计算获取目标细胞平均体积。步骤4M2：根据各单个目标细胞体积VTC，输出单个目标细胞体积VTC直方图的步骤；直方图用于统计不同目标细胞体积分布规律。图13为健康犬的单细胞CV直方图；图14为另一病犬的单个细胞的CV直方图，图中可见CV值偏小，临床症状常见于缺铁性贫血、铁幼粒细胞性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血；图15是健康猫的单细胞CV直方图；图16中为一病猫的单细胞CV直方图；图中单细胞CV值偏大，临床常见于巨幼细胞性贫血。图13至图15可见，直方图非常直观地体现了CV的统计学分布特征。在具体的实施例中，红细胞统计的个数大约在25000个左右，但在图13至图22中，只是提取了其中一小部分大约500个至1000个数据进行了直方图展示；在实际应用中，展示的数量可根据临床需要设定。
基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法的实施例中包括，步骤4M3：获取各目标血红蛋白含量CH，并根据各目标细胞体积VTC和各目标血红蛋白含量CH输出CH-CV联合散点图的步骤；CH-CV联合散点图用于统计不同体积目标细胞的血红蛋白分布规律。图17是健康犬的CH-CV散点图；图19是健康猫的CH-CV散点图；图21是一病犬CH-CV散点图，从图中可见该犬CH/CV都偏小，临床症状常见于缺铁性贫血；图22是一病猫CH-CV散点图，从图中可见该猫CH/CV都偏小，临床症状常见于缺铁性贫血。CH-CV联合散点图能同时直观地看到两个维护的细胞信息，即体积和血红蛋白分布规律。
基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法的实施例中包括，步骤4M4：在CH-CV联合散点图上展示至少一条CH范围指示线和至少一条CV范围指示线的步骤。步骤4M5：获取各目标细胞血红蛋白浓度CHC；或获取各目标血红蛋白含量CH，计算CHC=目标血红蛋白含量CH÷各目标细胞体积VTC；并根据各目标细胞的体积和目标细胞血红蛋白浓度CHC输出CHC-CV联合散点图的步骤；CHC-CV联合散点图用于统计不同体积目标细胞的血红蛋白分布规律。步骤4M6：在CHC-CV联合散点图上展示至少一条CHC范围指示线和至少一条CV范围指示线的步骤。图18是健康犬的CHC-CV散点图；图20是健康猫的CHC-CV散点图；CHC-CV散点图相对于CH-CV散点图更聚集，能更直观地体现一些病理情况。
一种血液细胞分析系统的实施例中，用于血液细胞分析，包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述程序时实现上述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法。一种可读存储介质的实施例中，其上存储有计算机程序，该程序被处理器执行时实现如上述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法。
本申请中的第一、第二这样的序号只是为了表达的方便，并不必然表示大小和时序上的顺序关系。步骤1的字母序号，也只是为了表达的方便，并不必然表示时序上的顺序关系。
如图1至图22所示以上所述仅为本申请的实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法，用于血液中目标细胞体积计算，其特征在于，
显微放大数字图像是基于血液细胞单层平铺在悬浮液中所获取的一组显微放大数字图像；一组显微放大数字图像中包括N×M幅显微放大数字图像；N和M均为大于等于1的自然数；
包括步骤15A：从N×M幅显微放大数字图像选取X幅显微放大数字图像用于目标细胞浓度计算，X为大于等于1的自然数；识别出所选中X幅显微放大数字图像中的目标细胞，并获得显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC；所述血液中目标细胞是血小板或白细胞；
步骤15B：获取已知的第三体积校正系数CVW3；计算显微放大数字图像中的单个目标细胞体积VTC=目标细胞面积STC1.5×第三体积校正系数CVW3；
第三体积校正系数CVW3包括血小板体积校正系数CPLT和第一白细胞体积校正系数CVW1；
所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法，
还包括计算第三体积校正系数CVW3的步骤15AA；
步骤15AA中包括：
步骤15AA1：取同一待分析的血液细胞样品，利获取目标细胞的平均细胞体积ZSC；
步骤15AA2：取和步骤15AA1中同一待分析的血液细胞样品，进行预处理制得细胞悬浮液，细胞悬浮液注入成像目标区域内；使血液细胞单层平铺在悬浮液中，并获取血液细胞单层平铺在悬浮液中的显微放大数字图像；
步骤15AA3：识别出显微放大数字图像中的目标细胞，并获得显微放大数字图像中的每个目标细胞面积STC，并计算目标细胞面积平均值STCA；
步骤13AA4：第三体积校正系数CVW3=平均细胞体积ZSC÷目标细胞面积平均值STCA1.5。
2.根据权利要求1所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法，其特征在于，包括，
步骤4M：根据各单个目标细胞体积VTC，加总各单个目标细胞体积VTC求平均，计算获取目标细胞平均体积。
3.根据权利要求1所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法，其特征在于，包括，
步骤4M2：根据各单个目标细胞体积VTC，输出单个目标细胞体积VTC直方图的步骤；直方图用于统计不同目标细胞体积分布规律。
4.一种血液细胞分析系统，用于血液细胞分析，包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述程序时实现如权利要求1至3中任一所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法。
5.一种可读存储介质，其上存储有计算机程序，其特征在于，该程序被处理器执行时实现如权利要求1至3中任一所述的基于显微放大数字图像的血液细胞分析方法。
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