KR100940615B1

KR100940615B1 - 토양 처리용 미생물 및 이를 얻기 위한 방법

Info

Publication number: KR100940615B1
Application number: KR1020047002210A
Authority: KR
Inventors: 기요르기 보톤드 키스; 이스트반 오트
Original assignee: 아그로.바이오 헝가리 케이에프티.
Priority date: 2001-08-13
Filing date: 2002-08-12
Publication date: 2010-02-05
Also published as: AU2009200523A1; YU14004A; PL217740B1; EP2233458A3; HRP20040126B1; EP2233458A2; CA2457154A1; UA86178C2; ZA200401142B; HUP0103294A2; EP1919848A1; EA200400309A1; EP2233458B1; WO2003016241A1; CN1315758C; RS52487B; HRP20040126A2; US7842494B2; AU2009200523B2; ES2451341T3

Abstract

본 발명은 토양처리에 적합한 살아있는 미생물(들), 상이한 풍토 및 자연환경에서 증식하는 미생물을 포함하는 제품(들), 이러한 제품들을 제조하는 공정, 또한 이러한 제품으로 토양 및 식물을 처리하는 공정에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 하기에서 명시한 미생물 중 1종, 또는 이들의 혼합물로부터 제품을 제조하는 공정에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 사용되는 미생물 배양의 새로운 제조공정에 관한 것이다. 미생물 자체도 본 발명의 주제이다. 더욱 구체적으로는, 아조스피릴룸 브레실렌스 ssp. SW51 (Azospirillum brasilense ssp. SW51) (NCAIM /P/B 001293), 아조토박터 비네란디 ssp. M657 (Azotobacter vinelandi ssp. M657) (NCAIM /P/B 001292), 슈도모나스 플루오레슨스 var. SW11 (Pseudomonas fluorescens var. SW11) (NCAIM /P/B 001296), 바실러스 폴리믹사 var. SW17 (Bacillus polymyxa var. SW17) (NCAIM /P/B 001295/, 바실러스 메가테리움 var. M326 (Bacillus megaterium var. M326) (NCAIM /P/B 001301 -, 의 미생물 중 어느 하나를 포함하는 제품으로 토양 및 식물을 처리하는 공정, 또한 상기 목록의 미생물을 포함하며 문제가 되는 식물의 환경에서 증식하고 존재하는 제품 및 이들의 제조에 관한 것이다.

Description

토양 처리용 미생물 및 이를 얻기 위한 방법{MICRO-ORGANISMS FOR THE TREATMENT OF SOIL AND PROCESS FOR OBTAINING THEM}

본 발명은 토양처리에 적합한 살아있는 미생물(들), 상이한 풍토 및 자연환경에서 증식하는 미생물을 포함하는 제품(들), 이러한 제품들을 제조하는 공정, 또한 이러한 제품으로 토양 및 식물을 처리하는 공정에 관한 것이다.

더욱 상세하게는, 본 발명은 하기에서 명시한 미생물 중 1종, 또는 이들의 혼합물로부터 제품을 제조하는 공정에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 사용되는 미생물 배양의 새로운 제조공정에 관한 것이며, 미생물 자체도 본 발명의 주제이다.

더욱 구체적으로는, 아조스피릴룸 브레실렌스 ssp. SW51 (Azospirillum brasilense ssp. SW51) (NCAIM /P/B 001293), 아조토박터 비네란디 ssp. M657 (Azotobacter vinelandi ssp. M657) (NCAIM /P/B 001292), 슈도모나스 플루오레슨스 var. SW11 (Pseudomonas fluorescens var. SW11) (NCAIM /P/B 001296), 바실러스 폴리믹사 var. SW17 (Bacillus polymyxa var. SW17) (NCAIM /P/B 001295/, 바실러스 메가테리움 var. M326 (Bacillus megaterium var. M326) (NCAIM /P/B 001301 -, 의 미생물 중 어느 하나를 포함하는 제품으로 토양 및 식물을 처리하는 공정, 또한 상기 목록의 미생물을 포함하며 문제가 되는 식물의 환경에서 증식하고 존재 하는 제품 및 이들의 제조에 관한 것이다.

토양의 천연 매개물은 식물 및 미생물의 자기-조절 생태계이고, 전자의 존재는 다른 하나를 결정한다. 진화가 발전되는 과정에서 인간의 활동(깊은 쟁기질, 자연적 및 인공적 비옥화, 식물보호제의 사용 등)에 의해 이의 구조 및 기능에 있어서의 균형이 변화하면, 예견할 수 없는 효과의 변화가 발생할 수 있다. 상이한 토양 및 상이한 풍토 환경상에서의 경작되는 특정 식물의 최적의 재배에 필요한 미생물 군의 개발을 위해서 오랜 기간의 선택의 시간이 필요하다. 그러나, 유리한 미생물 군의 결정적인 미생물은 토양으로 운반될 수 있고, 최적의 재배에 필요한 환경은 1-2일내에 새로 만들어질 수 있다. 이의 결과로서, 자연 생태계를 해치지 않고 더 높은 수율을 얻을 수 있다. 경제적인 관점에서 중요한 주어진 식물 환경에서 존재하는 유용하고 우세한 미생물은 연구실 실험에 의해 결정될 수 있고, 개별적으로 증식될 수 있으며, 이들은 공업적인 방법에 의해 생산될 수 있고, 적당한 비율로 토양으로 되돌려질 수 있다.

중요한 규칙성이 토양 및 미생물의 생태계에서 발견될 수 있다. 미생물의 수는 상이하며, 상이한 종은 더 멀리 떨어진 환경보다는 살아있는 식물 뿌리계에 근접한 환경(리조스피어, rhysosphere) 및 발아하는 종자(스퍼마토스피어, spermatosphere)에서 확인될 수 있다. 뿌리 환경에서 세균의 증식은 다수의 요인에 의해 영향을 받는다. 이러한 요인들은 지역, 토양의 질, 미생물군의 조성 및 풍토환경에 의존한다.

토양 및 광합성과 함께 태양 에너지를 사용하는 압도적인 다수에서 발견되는 탄소원은 가장 중요하다.

질소 사이클은 탄소사이클보다 더 복잡하다. 질소의 변형에 대하여는, 생물학적 및 화학적 공정이 효과를 가진다. 자연에서는 기체상태의 질소, 즉 불활성 상태인 것이 우세하고, 소위 고정된 질소 (질산염, 아질산염, 암모니아)는 제한된 양으로만 존재한다.

질소가스의 광물화 작용(mineralization)에 대해서는, 무엇보다도 생물학적 질소 결합이 책임이 있다. 1 헥타르에 걸쳐 분자질소의 양은 6-7 ×10⁸ 톤에 달하기 때문에, 이것은 질소결합에 대한 고갈되지 않는 원천을 의미한다. 무엇보다도 이러한 미생물들에 대한 지식 및 이들 특성의 이용이 환경친화적인 방법으로 세계적인 기아의 중지를 보장할 수 있기 때문에, 전문가들은 질소결합 생물, 즉 분자적 질소를 암모니아로 환원시킬 수 있는 생물에 관심을 기울여 왔다.

특정 질소 결합 세균은 자유로운 생존 조건에서 질소를 고정하지만, 다수의 세균은 다른 고등의 식물과 함께 합동으로만 질소를 고정할 수 있다.

질소와는 대조적으로 인(phosphorousous) 사이클은 자연 환경하에서는 실제적으로 닫혀있다. 투입과 산출은 동일하고, 흐름은 경미하며, 공기는 인으로 오염되지 않는다. 마지막으로, 이러한 원소는 물, 바다에 축적되고, 이들 중 아주 적은 양만이 땅으로 되돌아온다.(예를 들어 구아노(guano)의 형태로).

토양의 살아있는 세포에서 인은 유기화합물로 축적되고, 이러한 광물화 작용 은 높은 속도(3-8 g/m²/년)로 발생한다. 발생하는 인 화합물의 용해도-즉 식물에 대한 이들의 접근도-는 상이하고, 평균토양의 각 1kg에서 감지 가능한 400-1200mg의 단지 5％만이 이용할 수 있다. 특정 인화합물의 턴오버는 500-2000년이다.

일정의 인분해 미생물 그룹을 토양으로 운반함으로써, 식물이 접근 가능하지 않는 착물 인화합물이 용액으로 변화할 수 있다. 미생물을 토양으로 가져간다면 토양의 무기물 함량은 만족스럽게 될 것이고, 인을 함유한 비료의 사용은 불필요하거나 상당히 감소될 수 있다.

식물은 생장을 위해서, 특히 농작물이 무르익는 때에 상당한 양의 포타슘을 필요로한다. 식물 경작자는 포타슘을 함유하는 비료를 줌으로써 토양에 포타슘을 공급한다. 이러한 비료는 포타슘 이온을 방출하는 미생물을 사용하여 포타슘 무기물로부터 제조될 수 있다.

식물에 관한 한, 토양에서 증식하는 미생물은 생리학적으로 활성인 화합물을 생합성한다. 이들중 가장 중요한 화합물은 식물 호르몬(phytohormone), 옥신(auxin, indole-3-acetic acid), 에틸렌, 지베렐렌(gibberelline), 키네틴(kinetin) 등이다. 일정의 슈도모나스 그룹은 소량의 철이 존재하면 철을 수집할 수 있는 소위 사이드로포어(siderophore)를 생산한다. 이의 결과로서, 식물 병원성 세균 및 진균은 사이드로포어로부터 철을 이용할 수 없기 때문에 철 결핍으로 인한 저해를 겪는다. 반면, 이러한 사이드로포어는 철이 결핍된 토양에서 식물에 대하여 철을 직접 공급하기 때문에 식물의 생장을 매우 두드러지게 촉진한다.

이상과 같은 문제의 해결책으로서, 몇가지 기술적 개발이 이루어졌다; 몇가지 미생물이 특정의 문헌에서 기술되었다.

헝가리 발명자들은 분말형태의 질산화 배양(헝가리 특허 HU 143.391), 아조박터 크루코쿰(Azobacter chroococcum) 및 리조비움 멜리로티(Rhizobium meliloti) 배양 (헝가리 특허 HU 188.434), 조류(alga) 배양 (헝가리 특허 HU 195.068), 아조토박터 크루코쿰 배양의 제제 및 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 미생물 (Hungarian patent HU 207.751)의 배양 제제 등을 개시하고 있다. 아조박터 크루코쿰은 기탁번호 No. 00238로 기탁되었고, 바실러스 메가테리움은 번호 No. NCAIM /P/B 1140으로 기탁되었다. 더욱 상세하게는, 헝가리 특허 HU 188.434 및 HU 207.751에서 저자들은 상기 기탁된 미생물의 혼합물로부터 나오는 발효를 기술한다. 헝가리 특허 HU 213 163에 따르면, 저자들은 카르복시-메틸-셀룰로오스로 HU 207.751의 미생물 배양을 완성하였다. HU 1671/96의 헝가리 발명자들은 아조스피릴룸 리포레룸 ssp.(Azospirillum lipoferum ssp.), 아조박터 비네란디 sp., 슈도모나스 플루오레슨스 ssp. 및 바실러스 메가테리움 ssp. 미생물을 함유하는 배양을 기술한다.

상기 언급한 공정에서 적용된 미생물의 적용 및 효과는 상이한 경작 환경하에서 다양한 조성의 토양에서, 상이한 풍토환경하에서, 짧은 시간 동안만 생존하고, 다양한 식물의 환경 및 리조스피어는 항상 최적의 조건을 형성하는 것만은 아니다라는 사실에 의해 제한된다.

본 발명의 기본 목적은, 식물 재배 및 경제적 관점에서 유리한 효과를 가지며, 동시에 생존 및 증식할 수 있고, 상이한 기후 및 재배 환경에서 다양한 토양 및 다양한 식물에 이들의 유리한 효과를 발휘할 수 있는 토양 미생물 배양 제제이다.

식물의 발달에 유리하게 영향을 미치고, 질소를 고정하고, 인을 결집(mobilizing)시키고, 식물의 생장을 촉진하고, 토양구조를 개선하고, 실험실에서 배양되는 미생물의 증식 및 생존은, 토양의 특성, 온도 조건 및 식물의 직접 환경내의 식물에 따라 변화한다. 상이한 미생물 그룹은 시에르노좀(ciernozjom)토양에서, 낮은 부식(humus)함량의 토양에서, 황토(loess)에서, 지역 또는 예를 들어 진흙 토양 환경에서 이들의 효과를 발휘한다. 그러나 놀랍게도 우리의 실험과정에서, 다른 미생물 그룹은 다양한 식물의 리조스피어내에서, 또는 이에 근접하여, 증식할 수 있어 그들의 효과를 장기간 발휘할 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 이의 재배에 관한한 경제적 관점에서 중요한 주어진 식물의 환경에 유리한 효과를 가지는 이러한 미생물의 분리를 위한 실험을 수행하였다. 추가적으로, 포타슘 이온을 결집시킬 수 있는 미생물의 분리를 위한 실험 및 토양으로 가져온 때에, 낮은 온도에서 증식할 수 있고, 전문가에게는 놀랍겠지만, 이들의 효과를 발휘할 수 있는, 토양으로부터 분리되고 실험실에서 돌연변이 과정을 통해 변화된 이러한 미생물의 제제를 위한 실험을 수행하였다.

또한, 폴리 사카라이드를 생산하는 특정의 미생물은, 놀라운 방식으로 농업적 관점에서 토양의 구조를 유리하게 변화시키고, 가뭄 내성을 향상시킨다는 것을 실험의 도중에 언급하였다.

본 발명의 실험적 성과를 요약하면, 질소, 인, 포타슘을 식물에 전달하고, 식물 생장 호르몬을 생합성하고, 토양구조를 개선시키는 폴리사카라이드를 생합성하고, 씨뿌리는 시기 및 더 추운 기후의 나라에서도 증식할 수 있고, 다양한 토양 및 식물에 이들의 효과를 발휘할 수 있는 미생물을 분리하는 것이 본 발명의 목적이다. 또한, 포함된 미생물이 식물의 환경에서, 리조스피어에서, 또는 식물 세포중에서 직접적으로, 필수적으로 중요한 원소들의 고정 및 결집에 의해서 뿐만 아니라, 주어진 식물환경에서 식물 생장 호르몬 및 폴리사카라이드의 생산에 의해, 주어진 식물 또는 식물 일족의 개발을 촉진시키고, 그 결과 환경보호의 방식으로 비료의 사용을 절감하는 제제를 생산하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 주제는 하기 목록의 미생물에 대한 생장 공정, 이들을 함유하는 제제, 또한 미생물(들)을 함유하는 제제(들)의 적용 및 구체적으로는 미생물이다.

본 발명은, 파종 시기의 낮은 온도에서 증식할 수 있고, 식물에 대한 질소를 공급하고, 인, 포타슘, 생합성된 생장호르몬 및 폴리사카라이드를 결집하는 아조스피릴룸 브레실렌스 ssp. SW51 (Azospirillum brasilense ssp. SW51) (NCAIM /P/B 001293), 아조토박터 비네란디 ssp. M657 (Azotobacter vinelandi ssp. M657) (NCAIM /P/B 001292), 슈도모나스 플루오레슨스 var. SW11 (Pseudomonas fluorescens var. SW11) (NCAIM /P/B 001296), 바실러스 폴리믹사 var. SW17 (Bacillus polymyxa var. SW17) (NCAIM /P/B 001295/, 바실러스 메가테리움 var. M326 (Bacillus megaterium var. M326) (NCAIM /P/B 001291), 마이크로코커스 로세 우스 ssp. A21 (Micrococcus roseus ssp. A21) (NCAIM /P/B 001294/, 브라디리조븀 자포니쿰 var. PH25 (Bradyrhizobium japonicum var. PH25) (NCAIM /P/B 001302/ 및 스트렙토마이세스 알버스 var. 0003 LP (Streptomyces albus var. 0003 LP) (NCAIM /P/B 001301/ 미생물이 상기 목표 제제를 제조하는 데 가장 적합하다는 인식에 기초한다. 따라서, 이들을 분리하였고 이들의 생장 공정을 만들었다.

상기의 관점에서, 1998년 및 1999년 사이 유럽에서 토양 및 특정 식물의 뿌리 환경으로부터 미생물을 분리하였고, 이들의 질소 고정 능력, 인 및 포타슘 용해능력, 폴리사카라이드 생산능력 및 식물 호르몬의 생합성 능력을 테스트하였고, 선택된 미생물을 계통학적으로 확인하였으며, 돌연변이 처리에 의해 20℃ 이하의 온도에서 증식하는 변종을 제조하였고, 이들의 배양을 위해서 배양 기술을 새롭게 확립하였으며, 이러한 배양으로부터 제제를 제조하였고, 식물 개발에 대한 효과 및 온실 및 야외벌판 실험에 의한 수율에 대한 효과를 입증하였다.

아조스피릴룸, 아조토박터, 브라디리조븀, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 마이크로코커스 종 및 그 하위종을 분리하였다.

가장 덜 알려진 아조스피릴룸 종은 미세-공기환경(1-2% 산소의 존재)하에서, 식물의 뿌리 시스템과 밀접하게 연관되어 공기의 질소를 암모니아로 환원시켜 식물로 전달할 수 있는, 토양에서 생존하는 그람 음성 변이 염색 세균이다. 일정의 그룹은 식물 호르몬도 생합성한다.

아조스피릴룸 그룹은 다양한 토양의 유럽의 다양한 경작 가능한 땅의 옥수수, 밀, 보리, 호밀의 뿌리 환경 및 목초장의 풀의 뿌리환경으로부터 분리되었다. 토양 샘플로부터 유래한 세균 현탁액을 하기에 주어지는 조성의 Nfb(II) 및 MM 배양액상에 분산시키고, 미세 호기성 조건하에서 배양하였다. 72시간 후, 아조스피릴룸 배양을 확인하였다. 아조스피릴룸 배양은 다른 작은 세균 및 진균 배양과는 달리 약 3 mm의 크기이었다.

아조스피릴룸 sp. 배양은 하기에서 주어지는 조성의 액체 MM 및 Nb(II) 소프트 아가 배지에서 기하급수적으로 생장할 때 아조스피릴룸 세포의 전형적인 형태를 보여준다. 세포는 비브로이드(vibroid) 및 S-형이고, 1-2 ×2-4 ㎛의 크기이다. 이들의 증가를 위해서는 이들은 비오틴(biotin)을 필요로 한다. 현미경적 관찰에 기초하면 이들은 빠르게 움직일 수 있다. 이들의 이동성은 이들의 극성 편모에 기인한다. 이들은 이들의 세포에서 폴리-베타-하이드록시-부티레이트 과립 및 카로틴을 축적한다. 붉은 빛의 탈색화는 배양의 노화에 의해 설명될 수 있다. 증식를 위해서 이들은 말산, 락트산, 피로라세미산(pyroracemic acid) 및 부탄디오산과 같은 유기산을 사용할 수 있다. 공기중 질소의 고정은 미세 공기 조건하에서 발생한다. 세포는, 가뭄, 낮거나 높은 pH 값, 질소 또는 탄소원의 결핍 등의 극한 조건하에서는, 편모를 가지고 있지 않으나 폴리-베타-하이드록시-부티레이트 과립을 포함하며 캡슐형태의 폴리사카라이드로 둘러싸여진 포낭(cyst)으로 변형될 것이다. 미생물의 탄소원 이용 스펙트럼은 종에 따라 변화한다: A. 아마조넨스(A. amazonense)는 글루코오스 +, 사카로오스 +, 이노지톨 + 이고, A. 브렌실렌스(A. Bransilense)는 글루코오스 +, 사카로오스 및 이노지톨 - 이며, A. 이라켄스(A. Irakense)는 글루코오스 및 사카로오스를 이용하지만, 이노지톨은 이용하지 않는 다. 마지막으로 A. 리포페룸(A. Lipoferum)은 글루코오스만을 이용한다. 질소가 없는 배지에서는, 탄소원 이용 스펙트럼은 더욱 큰 정도로 상이해져서 상기 4가지 종은 구별될 수 있다. 우리가 분리한 미생물의 탄소원 이용 스펙트럼은 ATCC 29.731 A. 리포페룸, A. 아마조넨스, A. 브레실렌스 및 A. 이라켄스 네오타입 (Holt, J. G. And collaborators, Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 9th edition, 1994)의 것과 부분적으로 상이하다. 타입 그룹과는 대조적으로 이들은 3.5% 나트륨 클로라이드의 존재하에 적절하게 존재하고, (후술하는)소프트 아가에서 이들의 현미경적 사진은 배양의 다양한 기간에서 상이하고, 이들의 색소 생산은 예를 들어 감자 추출 아가에 더욱 강하게 나타낸다.

일정의 분리된 아조스피릴룸은 아조스피릴룸 이라켄스 종 뿐만 아니라, 아조스피릴룸 리포페룸, 아조스피릴룸 아마조네스, 아조스피릴룸 브렌실렌스 종에도 가깝다. 본 발명자들은 아조스피릴룸 브렌실렌스 그룹의 하나를 선택하면서 이들에 대한 실험을 수행하였다.

상기 토양 샘플로부터 아조토박터 미생물이 Nfb(II)소프트 아가상에 선택적 배양으로, 이어서, 분산에 의해 MM 및 프조도로브(Fjodorov)배지상에 분리되었고, 이들의 질소 고정 능력에 기초하여 하위종 중의 하나를 선택하고, 추가 실험을 위해 이를 분류하였다. 이들 그룹의 세포는 원형의 플레이오형(pleiomorph)이다. 산소가 존재하는 경우 이들은 빠르게 움직인다. 이들은 그람-음성균이다. 이들은 질소가 없는 배지에서 형광체, 노란-녹색 색소를 생산하며 람노즈 및 메조-이노지톨을 이용한다.

잘 알려진 바와 같이, 리조븀은 콩과식물의 뿌리상에 혹을 형성하고, 식물성 세포중에서 얻고, 고정된 질소를 식물에 직접 전달한다. 상이한 리조븀 종인 다양한 콩과식물은 브라디리조븀 그룹과 연관이 있다. 이는 농작물 수확 후에 죽는 리조븀종 즉, 토양에서 다량으로 잔존하지 않는 유일한 리조븀종이기 때문에, 이러한 그룹을 토양 처리에 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명자들은 스제게드-키스쿤도로즈스마 근처의 수바사의 콩 농장으로부터 7월 13일 브라디리조븀 그룹을 분리하였다. 황토에서 자라는 식물들로부터 잘 성장한 식물을 선택하였고, 이의 뿌리로부터 잘 성장한 혹을 분리하였다. 실시예에서 주어지는 바와 같은 분리된 호냉성 미생물 변종을 기탁하였다.

수집한 토양 샘플에서 인 결집성 미생물을 조사하였고, 계통학적 관점으로부터 선택된 미생물을 테스트하였다. 미생물의 일부는 슈도모나스로 확인되었고, 다른 일부는 바실러스 종인 것으로 판명되었다.

슈도모나스는 그람-음성이고, 가느다란 막대 형태의 호기성 세포이며, 대부분의 배지에서 형광성 색소를 생산하고, 기생생물(saprophyte)이다. 카로틴의 생산은 관찰될 수 없고, 40℃이상의 온도에서는 생장하지 않는다. 젤라틴성 아가상에서 액화가 관찰될 수 있다. 본 미생물 그룹에 의해서 글루코오스는 이용되며, 전분은 이용되지 않는다. 플루오레슨스 슈도모나스 그룹의 변종은 밀접한 연관이 있지만, 일정의 계통학적인 이종성(heterogenity)이 본원의 미생물과 타입 그룹간에 관찰될 수 있다: 슈도모나스의 특징을 가지는 본원의 미생물은 글루코오스, 갈락토오스, 아세트산, 말토오스, 글리세린 및 피로라세미산을 적절하게 이용한다. 이들은 프락토오스, D-아라비노오스, 말토오스, 락토오스, 전분 및 리눌린은 이용하지 않는다. 그러나, 타입 그룹과 대조적으로 이들은 크실로오스, 사카로오스상에서 생장할 수 있고, 소르비톨상에서 일정의 정도까지 생장할 수 있다. 유일한 탄소원으로서 글리신을 이용할 수 있다.

상기에 기초하여, 본 미생물중의 하나는 슈도모나스 플루오레슨트 종으로 확인되었고, 바이오바(Biovar) III 그룹에 속하는 변종에 근접한 것을 알았다. 본 발명자들은 상기 그룹을 슈도모나스 플루오레슨트 ssp. (Pseudomonas fluorescent ssp.)로 명명하였다.

계통학적 특징에 기초하여, 비용해성 인을 용해할 수 있는 바실러스 세포들 중에서, 일부는 바실러스 폴리믹사인 것으로, 일부는 바실러스 메가테리움인 것으로 입증되었다. 일부의 그룹은 추가 실험을 위해 선별되었다.

포타슘 광물로부터, 포타슘 이온을 결집할 수 있는 미생물의 분리를 위해, 포타슘을 함유하는 광물, 장석 및 백운모의 표면으로부터 미생물을 분리하고, 이어서, 포타슘 결집을 증명하기 위해 고체상, 포타슘이 없는 배지상에서 실시예에 주어진 바와 같이 테스트하였다. 실시예에서 주어진 방법을 적용하여 돌연변이 처리에 의해 스트렙토마이세스 사이크로필릭 (Streptomyces psychrophilic)으로 확인된 미생물을 생산하고 기탁하였다.

계통적, 형태적 및 리보좀 DNS 테스트 후에 마이크로코커스 로세우스 (Micrococcus roseus)로 판명되고, 식물 테스트 도중에 놀라운 유리한 효과를 나타낸 미생물도 분리하였다. 연구실에서 변형된 이러한 미생물 그룹의 하나를 기탁하 였다.

본 발명은, 토양에 이식되고, 유리한 효과의 미생물이 가을 및 이른 봄의 기후 조건하에서 및 더 추운 나라에서 파종의 초기 및 식물 초기 발달의 시간에서 가능한 한 빨리 증식할 수 있다는 사실에 기초한다. 따라서, 미생물을 실시예 4에 주어진 바에 따라 처리하고, 분리하고 유지하였다. 인정된 방법에 의해 낮은 온도에서 증가하는 돌연변이 및 변종을 분리하고, 국립 농업 및 산업 미생물 기탁기관(National Collection of Agricultural and Industrial Micro-organisms)에 기탁하였다.

본 발명은 이를 적용함으로써 식물 재배 수율이 증가하는 제제 및 방법에 관한 것이다. 생산제품은, 다양한 경작 가능한 땅으로부터 및 다양한 식물의 환경으로부터 분리되고 테스트되며, 주어진 식물 종족의 환경에서 오랜기간동안 존재하고, 다양한 토양에서 낮은 온도에서 증식하는 미생물을 배양하고, 배양을 포함하는 제제를 대응하는 식물상에, 종자상에, 또는 이들을 경작할 수 있는 토지상에 도입하는 것을 수반한다. 본 발명에 따르면, 제제는 토양, 식물 또는 식물 종자를 처리하는데 사용될 수 있으며, 이러한 제제는 하기의 미생물 중 적어도 하나를 포함한다:

아조스피릴룸 브레실렌스 ssp. SW51 (NCAIM /P/B 001293), 아조토박터 비네란디 ssp. M657 (NCAIM /P/B 001292), 슈도모나스 플루오레슨스 var. SW11 (NCAIM /P/B 001296), 바실러스 폴리믹사 var. SW17 (NCAIM /P/B 001295/, 바실러스 메가테리움 var. M326 (NCAIM /P/B 001291), 마이크로코커스 로세우스 ssp. A21 (NCAIM /P/B 001294/, 브라디리조븀 자포니쿰 var. PH25 (NCAIM /P/P 0012../ 및 스트렙토마이세스 알버스 var. OOO3 LP (NCAIM /P/B 0012../.

처리의 결과 식물의 발달은 가속화되고, 병원균에 대해 더욱 내성을 갖게되고, 토양구조의 물 공급 및 식물은 향상되고, 비료를 적게 사용하거나 전혀 사용하지 않는 경우라도 높은 수율이 제공된다.

본 발명에 따른 가장 큰 이점 중의 하나는 식물 재배 과정 중에 이들을 실행함으로써 질소-, 인- 및 포타슘에 기초한 비료의 이용이 실질적으로 불필요하게 되거나 또는 상당한 정도로 감소된다는 것이다. 비료의 환경 오염의 효과는 명백하다. 미생물내에서 생합성되고, 식물 발달을 촉진하는 화합물은 처리된 식물의 발달 및 뿌리 발달을 촉진시키고, 동시에 식물의 물 공급이 향상될 것이고, 도입된 미생물은 식물 병원성 미생물의 발달을 억제하고, 본 발명의 미생물 중 일부의 세포에서 생합성되는 폴리사카라이드는 토양의 구조, 물 균형 및 토양의 생명을 특히 유리하게 개선시킨다. 본 발명에 따른 제제, 이들의 제조 및 적용은, 공지의 제제와는 대조적으로, 다양하고 상이한 효과를 가지며, 다양한 토양으로부터 분리되고, 주어진 경제적으로 중요한 재배 식물에 특별한 효과를 발휘하며, 가을 및 초봄의 낮은 온도 및 더 추운 기후의 지역에서도 증식할 수 있는 미생물을 사용하는 것에 기초한다.

본 발명에 따른 미생물은 예를 들어 글루코오스, 전분, 사카로오스, 또는 당밀을 탄소원으로서, 옥수수 스팁 리쿠어(corn steep liquor)를 질소원으로서, 카제인, 효모 추출액 또는 암모늄 염, 추가로 다른 무기염 및 미량원소 이온으로 해리 하는 염을 포함하는 배지상에서 재배될 수 있지만, 본 발명에 따른 세균의 증식을 가능하게 하는 동화 가능한 어떠한 탄소- 및 질소원, 무기염도 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다.

본 발명에 따른 미생물을 함유하는 배양은 처리될 토양 또는 재배에 사용될 배지내의 식물에 직접 첨가될 수 있지만, 미생물의 생물적 잠재력을 유지시키는 제제, 이들중에서도 부착력을 가지고 세균을 종자에 고정하는 담체를 함유하는 제제가 제조될 수 있다. 토양으로 가져오는 세균의 양은 헥타르당 5 ×10¹¹ 내지 5 ×10¹⁵ 세포 사이에서 변할 수 있고, 바람직한 세포 양은 10¹² 내지 10¹³이다.

부다페스트 조약에 따라, 본 출원인은 다양한 식물환경으로부터 분리되고, 동정되고, 저온에서도 증식할 수 있는 미생물을 국립 농업 및 공업 미생물 기탁소에 하기와 같은 기탁번호로 기탁하였다.

아조스피릴룸 브레실렌스 ssp. SW51 (Azospirillum brasilense ssp. SW51) (NCAIM /P/B 001293),

아조토박터 비네란디 ssp. M657 (Azobacter vinelandi ssp. M657) (NCAIM /P/B 001292),

슈도모나스 플루오레슨스 var. SW11 (Pseudomonas fluorescens var. SW11) (NCAIM /P/B 001296),

바실러스 폴리믹사 var. SW17 (Bacillus polymyxa var. SW17) (NCAIM /P/B 001295/,

바실러스 메가테리움 var. M326 (Bacillus megaterium var. M326) (NCAIM /P/B 001291),

마이크로코커스 로세우스 ssp. A21 (Micrococcus roseus ssp. A21) (NCAIM /P/B 001294/,

브라디리조븀 자포니쿰 var. PH25 (Bradyrhizobium japonicum var. PH25) (NCAIM /P/B 001302/ 및

스트렙토마이세스 알버스 var. OOO3 LP (Streptomyces albus var. 0003 LP) (NCAIM /P/B 001301/.

보호의 범위는 기탁된 그룹 및 이들의 인공적 및 자연적 돌연변이, 변종 또는 임의의 공지된 방식으로 얻어진 상기 미생물의 그룹 계열에까지도 확장된다.

이하에서, 본 발명을 실시예와 함께 상세히 설명하지만 실시예로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예에서 퍼센트는 특별히 다르게 정하지 않는 한, 중량 퍼센트를 의미한다.

실시예 1.

다양한 토양 및 다양한 식물의 환경으로부터 공기중의 질소를 고정하는 미생물의 분리 및 이들의 질소고정 능력의 증명

아조스피릴룸 종은 미세공기 환경(1-2% 산소 존재)하에서 공기중의 질소를 암모니아로 환원시켜 식물이 이용가능하도록 할 수 있는 그람-음성 변형 염색 세균이다.

아조스릴룸 종은 다양한 토양 샘플(휴모우(humous), 황토, 염분이 많은 토양, 갈색토양 및 흑색토양 등) 및 다양한 식물(시리얼, 해바라기, 옥수수, 목초 등)으로부터 분리하였다. 유기산 및 당과 같은 화학적 유인제는 화학주성(chemotaxis)에 의해 아조스피릴룸 그룹을 유인한다. 그들의 편모의 도움으로 세균은 뿌리를 향해 이동하여 이들에 도달하고 콜로니를 형성한다.

살균 증류수로, 주어진 토양 샘플의 10-, 100-, 1000- 및 10,000- 배로 희석하고, 100- 100㎕ 현탁액을 MM 및 Nfb(II) 소프트 아가를 함유하는 페트리디쉬에 도말하였다. MM 배지의 조성은 다음과 같다.

K₂HPO₄ 1.65 g/l

KH₂PO₄ 0.87 g/l

MgSO₄ ×7H₂O 0.29 g/l

NaCl 0.18 g/l

CaCl₂ ×2H₂O 0.07 g/l

FeCl₃ ×6H₂O 0.01 g/l

NaMoO₄ ×2H₂O 0.005 g/l

MnSO₄ ×H₂O 0.00014 g/l

ZnSO₄ ×7H₂O 0.007 g/l

CuSO₄ ×5H₂O 0.000125 g/l

CoSO₄ ×7H₂O 0.00014 g/l

H₃BO₃ 0.00003 g/l

글루코오스 5.0 g/l

사카로오스 5.0 g/l

박토아가 20.0 g/l

글루코오스는 MM 배지의 다른 성분들과 분리해서 오토클레이브(121℃, 30분)로 멸균하고, 60℃로 냉각시킨 후 이들과 혼합하였다. 1N NaOH용액을 사용하여 멸균된 배지의 pH를 7.4로 조정하였다.

Nfb(II)배지의 조성은 다음과 같다:

L-말산 5.0 g

다이포타슘-하이드로젠-포스페이트 0.5 g

마그네슘-설페이트 ×7 물 0.2 g

소디엄-클로라이드 0.1 g

칼슘-클로라이드 0.02 g

미량원소 용액* 2.0 ml

브롬 티몰 블루(0.2 N KOH에 용해된 0.5% 수용액)

2.0 ml

Fe-EDTA의 1.564% 수용액 4.0 ml

비타민 용액** 1.0 ml

아가 1.75 g

배지는 1N KOH 수용액으로 pH 6.8으로 조정하였다.

미량원소 용액*의 조성은 다음과 같다.

황산 제2철 ×7H₂O 200 mg

염화 제3철 ×6H₂O 10 mg

황산 망간 ×H₂O 1 mg

황산 구리 ×5H₂O 2 mg

NaMoO₄ ×2H₂O 1 mg

염화 코발트 ×6H₂O 2 mg

황산 아연 ×7H₂O 2 mg

소디엄 테트라보레이트 ×10H₂O 1 mg

P₂O₅ ×24 WO₃ ×H₂O 0.5 mg

비스무트나이트레이트 ×5H₂O 0.1 mg

염화 주석 0.01 mg

염화 셀레늄 0.01 mg

요오드화 포타슘 1 mg

시트르산 100 mg

증류수 1000 ml

비타민 용액*의 조성은 다음과 같다.

비타민 C 50 mg

비타민 B1 5 mg

비타민 E 2 mg

비타민 A 2 mg

비오틴 4 mg

증류수 100 ml

MM 플레이트상에 관찰되는 배지내의 세균을 혐기성 서모스탯에 두고, 서모스 탯의 공기 공간을 질소로 교환하고, 이어서 충분한 양의 공기 환류로 1.6%의 산소농도로 고정하였다. 플레이트를 32℃ 온도에서 배양하고, 이어서, 72시간 후에 아조스피릴룸 미생물을 확인하였다. 희석 라인에 대응하여 10-배 희석된 현탁액으로 도말된 플레이트상에 연속적인 세균 필드가 생성되었고, 반면, 10,000-배 희석된 현탁액은 일반적으로 30-50 배양이 생성되었다. 아조스피릴룸 배양은 다른 작은 세균 및 진균 배양과는 달리 약 3 mm 크기에 이른다. 배양중에서 수 개는 아조스피릴룸과 형태학적으로 유사하였다. 이들중에서 수 개를 대상으로 추가 연구하였다.

Nfb(II) 소프트 배지를 호기성 서모스탯, 상기 배지 및 상기 배양조건하에서 두었고, 무엇보다도 아조스피릴룸이 인지가능한 정도 및 특징적 형태를 가지고 증식하였다.

MM 배지 및 Nfb(II) 배지로부터 얻은 다양한 아조스피릴룸 세균 그룹을 미생물학적 실례에 맞게 제1차 세균 배양을 완전 Tag 배지상에 하나의 배양에 2회 도말하는 방식으로 배양하였다. 아조스피릴룸 세균 그룹은 액체 Tag 배지에 하나의 배양상에 2회 도말하여 정제하고 그룹 배양에 저장하였다. -80℃ 온도에서의 세균 현탁액을 그룹 배양으로 간주하고 이러한 배양으로부터 모든 실험을 개시하였다.

Tag 배지의 조성은 다음과 같다.

박토 트립톤 (Difco) 1.0%

효모 추출액 (Difco) 0.1%

NaCl 0.5%

아가 2.5%

멸균후에, 하기의 화합물을 최종농도로 하여 첨가하였다:

0.1 % 0.1 M CaCl₂ ×6H₂O

0.1 % 0.1 M MgCl₂ ×6H₂O

0.2 % 글루코오스 (분리하여 별도로 멸균)

멸균후에, 배지의 pH를 7.0 - 7.2로 조정하였다.

뿌리 콜로니화는 간단한 실험에 의해 확인될 수 있다. 멸균된 펄라이트(항아리의 직경은 15 cm)에 파종되고, 동일한 수(1×10¹⁰)의 세포의 아조스피릴룸 세균으로 처리된 옥수수 및 밀 식물의 뿌리상에, 현미경적 카운팅에 기초하여 대조군보다 더 많은 아조스피릴룸 세포가 측정되었다. 뿌리 콜로니화은 특정 인지 메카니즘에 기초하여 발생한다. 콜로니화 중에 아조스피릴룸 세포는 뿌리의 매트릭스를 통과하고, 이들은 이곳에서 그들의 질소고정 활성을 사용하여 주 식물의 질소 요구량의 일부를 담당할 수 있다(결합적 질소고정). 이는 연구실 실험의 과정에서 아조스피릴룸 그룹으로 접종된 옥수수 및 밀의 더 높은 녹색 질량의 생성에 의해 입증된다. 이들의 결과는 후술된다. 아조스피릴룸은 또한 생장을 촉진하는 식물 호르몬 및 물질을 생산한다. 이들 물질의 증가 및 주식물에 대한 이들의 유리한 효과는 증가된 발아 효율 및 더욱 강한 식물 성장과 연구실 환경하에서 수행된 실험 으로 알 수 있다.

분리된 아조스피릴룸 종의 형태학적 특징은 설명의 일반적인 부분에서 발견된다.

선택적 배양의 질소가 없는 MM 배지보다, 선택적 배양의 Nbf(II) 소프트 아가상에서 경작용 토양 샘플로부터 아조스피릴룸 미생물을 분리하였다. 이들 그룹은 계통적 특징 및 탄소원 이용 스펙트럼에 따라, SW5-01-07과 함께 공기중의 분자 질소를 다량으로 고정하는 아조스피릴룸 브렌실렌스인 것으로 밝혀졌고, 후술하는 바와 같이, 저온에서도 증식하며, 폴리사카라이드를 생합성하는 변종을 분리한 후, 이들 중 하나를 기탁하였다.

아조토박터 그룹의 분리를 위해서, 상기에서 주어진 조성의 Nfb(II) 및 MM 배지이외에, 토양 샘플을 아조토박터가 형태학적 특징을 나타내는 프조도로브 배지에서도 배양하였다. 프조도로브 배지의 조성은 다음과 같다:

포타슘 디하이드로젠-포스페이트 0.03%

칼슘-하이드로젠-포스페이트 0.02%

포타슘-설페이트 0.02%

마그테슘-설페이트 ×7 aqv 0.03%

칼슘-카보네이트 0.5%

소디엄-클로라이드 0.05%

염화 제3철 0.02%

소디엄-몰리브데네이트 0.0002%

만니톨 2.0%

박토 아가 2.0%

멸균전의 배지의 pH는 1N 수산화나트륨으로 7.0으로 조정하였다.

선택적 배양의 Nfb(II) 소프트 아가상에서, 이어서, 선택적 배양의 질소가 없는 MM 및 프조도로브 배지상에서, 경작토지 토양 샘플로부터 아조박터 미생물을 분리하였다. 이들 그룹은 계통적 특징 및 탄소원 이용 스펙트럼에 따라, 마크 M65-01-34와 함께 공기중의 분자 질소를 다량으로 고정하는 아조토박터 비네란디인 것으로 밝혀졌고, 이어서, 후술하는 바와 같이, 저온에서도 증식하는 변종을 분리한 후, 이들 중 하나를 기탁하였다.

아조스피릴룸 및 아조토박터 그룹의 질소 고정 능력은 아세틸렌 환원 방법에 의해 결정하였다. 상기 방법(Dilworth M. J., J. Biochem. Biophys. Acta, 27, 285, 1996)에 따르면, 폐쇄된 디쉬내의 배양내에 주입기로 아세틸렌을 주입하고, 이어서, 12시간 배양후에, 0.25ml 가스 혼합물을 Perkin-Elmer 가스 크로마토그래피의 Propak N 컬럼에 주입하였다. 가스 혼합물의 아세틸렌 및 에틸렌 농도를 수소 불꽃 이온화 검출기에 의해 결정하였다. 아세틸렌 및 에틸렌 피크의 높이로부터 나이트로게나아제의 효소 복합체활성을 명확하게 결정할 수 있다, 본 발명의 아조스피릴룸 및 아조토박터 그룹은 1시간안에 15 내지 85 nmol 양의 아세틸렌을 에틸렌으로 환원시켰다.

브라디리조븀 그룹은 스제게드-키스쿤도로즈마(Szeged-Kiskundorozsma) 근처에 위치한 수바사(Subasa)의 콩 농장으로부터 2000년 7월 13일 분리하였다. 황토에서 자라는 식물로부터 잘 성장하는 식물을 선택하고, 이들의 뿌리로부터 잘 발달한 혹을 제거하였다. 상기 혹을 멸균 증류수로 세정하고, 눌러 찌그러뜨리고, 이어서, 입자들을 생리 식염수에 현탁하였다. 현탁액으로부터, 멸균 조건하에서, 연속 희석을 행하고, 완전 배지에 도말하였다. 소위 공생 식물 테스트에 의한 48시간 배양 후의 생장하는 배양의 질소 고정 능력을 다음과 같이 결정하였다: 시판되는 메딕(medic, Medicago sativa)종자의 표면을 72℃의 온도에서 2시간의 열처리 및 20%의 하이포 용액으로 조심스럽게 세정하여 멸균하였고, 이어서, 1%의 아가를 함유하는 멸균 증류수 배지에서 발아시켰다. 묘목을 1.5% 깁슨(Gibson) 사면 아가(후술내용 참조)에 두고, 온실에서 1주일간 배양하였다. 1주일 자란 식물을 각 세균 배양의 세포로 접종시키고, 온실에서 1주일간 더 배양하였다. 두드러지게 최적의 발달을 보이는 3종 식물(뿌리이상 부분의 건조중량은 22 - 26mg, 이와 대조적으로 대조군 식물의 중량은 3-5mg)에 속하는 그룹으로부터, 3종을 선택하였고, 이들의 형태학적 및 계통학적 관점으로부터 중요한 특성에 기초하여, 브라디리조븀 자포니쿰 바. PH-2-1-3으로 명명하였다.

실시예 2.

포스페이트- 및 포타슘 용해 미생물의 분리

세계의 다양한 부분으로부터 토양 샘플을 수집하고, 샘플 현탁 수용액을 Tag 배지(상기 부분 참조)에 도말하였고, 이어서, 슈도모나스 및 바실러스 배양의 분리된 물질 및 세포 형태를 테스트하였다.

완전 TAg 배지상에 단일 배양으로 제1차 세균 배양을 도말함으로써 미생물학적 실례에 따라 다양한 슈도모나스 및 바실러스 그룹을 분리하였다. 세균 그룹을 액체 및 고체 TAg 배지에 도말함과 함께, 배양하고, 저장하고, 정제하였다.

미생물의 인 결집 특성은 변형 피코브스카야(Pikovskaya, HP) 및 10% 트리칼슘-포스페이트로 완성시킨 1% 하이드록시-아파타이트 및 글루코오스(0.2%)를 함유하는 영양 아가(Oxoid)에서 테스트하였다.

실험중에서 사용된 배지의 조성은 다음과 같다:

변형 피코브스카야 배지:

하이드록시-아파타이트 1.0%

(NH₄)₂SO₄ 0.05%

NaCl 0.02%

KCl 0.02%

MgSO₄ ×7H₂O 0.01%

효모 추출액 0.05%

아가 1.5%

글루코오스(분리하여 멸균) 1.0%

다음 화합물의 용액을 멸균한 후에 배지에 첨가하였다:

1％ 20 mg/ 100 ml FeSO₄ ×7H₂O

1％ 40 mg/ 100 ml MnSO₄ ×H₂O

멸균전에 배지를 pH 7.2로 조정하였다.

Naoxg : 공급자의 지시에 따라 제조된 영양 아가(Oxoid) + 0.2% 글루코오스.

피코브스카야(HP)배지에서 예비적 실험의 과정에서 선택된 그룹의 인 용해 능력의 테스트 동안에, 30℃의 온도에서 3-4일간 생장시킨 배양은 29 내지 38 mm의 용액 링을 생산하였다. TAg 사면 아가로부터 얻은 동일한 그룹의 세포의 1 ml 증류수의 현탁액을, 10% 트리칼슘포스페이트(0.1 ml/구멍(hole))로 완성한 Naoxg 플레이트 상에 만들어진 구멍으로 방울로 떨어뜨렸다. 30℃의 온도에서 2-3일간 배양하여, 잘 보이는 용액 링을 관찰할 수 있었다. 이들의 크기는 세부적으로 테스트한 슈도모나스 그룹을 사용한 때 24 mm 이었고, 바실러스 그룹을 사용한 경우는 26 mm 이었고, 평균 크기는 34 mm 이었다.

각각의 슈도모나스 그룹 및 일정의 바실러스 그룹은 강한 인 용해 특성을 갖는 것으로 입증되었다. 상기 그룹 모두는 용액에서 잘 검출되는 무기 인 변형을 가지고 있어, 이들은 우수한 인 용해 특성을 갖는다고 말할 수 있다.

이들의 계통적 특징 및 탄소 이용 스펙트럼에 기초하면, 테스트에 기초하여 선택된 14개의 슈도모나스 및 25개의 바실러스 미생물은, 순서대로 SW1-1-14, SW17-1-15 및 M32-1-10로 표지되는 바실러스 메가테리움, 슈도모나스 플루오레슨스 및 바실러스 폴리믹사인 것으로 확인되었고, 이어서, 후에 주어지는 바와 같이, 저온에서도 증식하고, 다량의 폴리사카라이드를 생합성하는 변종이 분리되고 기탁되었다.

포타슘 이온을 결집시키는 미생물의 분리는 상기 주어진 조성의 피코브스카야(HP)배지로부터 포타슘클로라이드를 제거하고 미세한 분말로 분쇄된 1％장석 및 하이드록시-아파타이트 대신에 운모편암을 추가하는 차이점과 함께 상기 기술한 바와 같이 수행하였다. 불용성 광물을 완전히 또는 부분적으로 용액으로 만드는 미생물 배양의 주위에는 투명한 영역이 형성될 것이다. 이들 중 일부를 선별하였고, 계통적 특성, 형태적 특성 및 탄소원 이용 스펙트럼에 기초하여 바실러스 및 스트렙토마이세스인 것으로 판명되었고, 15개의 그룹은 No. 1-015-0003으로 표지하였고, 후에 기술하는 바와 같이, 저온에서도 증식하는 변종을 분리하였고, 이들 중 하나를 기탁하였다.

실시예 3.

사이드로포어(siderophore) 및 식물 호르몬의 분리

실시예 1 및 실시예 2에서 기술된 바와 같이 분리한 그룹의 사이드로포어 및 호르몬 생산 능력은 King B 배지를 사용하여 테스트하였다. 이들의 조성은 다음과 같다:

펩톤 2％

글리세린 1％

K₂HPO₄ 0.15％

MgSO₄ ×7H₂O 0.15％

아가 2％

멸균전에 배지를 수산화나트륨 용액으로 pH: 7.2로 조정하였다.

사이드로포어를 생산하는 슈도모나스 그룹은 철 이온을 고정하고, 또한 이를 철이 부족한 토양의 식물에 전달한다. 또한, 이들은 어위니아 카로토보라(Erwinia caratovora)와 같은 일부 식물 병원성 미생물의 증식을 억제하는데, 이들은 고정된 철을 이용할 수 없기 때문이다. 대장균 MC1061 그룹의 생장을 억제하는 것에 의해 사이드로포어 생산을 테스트하였다. 증류수로 아가 배양으로부터의 2 그룹의 세포 현탁액을 제조하여, 이어서, 철이 없는 및 철을 함유한(1μM FeCl₃ ×7H₂O) King B 플레이트 (30 - 50 ㎕) 상에 방울을 떨어뜨려, 28℃의 온도에서 48시간동안 배양한 후, TAg 아가로부터 얻은 E. Coli MC1061 배양으로 플레이트를 도말하고, 28℃의 온도에서 28시간 더 배양하였다. 배양의 주위에 다양한 저해 영역이 관찰될 수 있었다. 음성 대조군으로서 바실러스 메가테리움을, 양성 대조군으로서 슈도모나스플루오레슨스를 사용한 4번의 실험의 평균값을 표 1에 나타내었다.

미생물	King B 저해 영역	King B + 1μM FeCl₃ 저해 영역
SW1-1-6 SW1-1-12 슈도모나스플루오레슨스 (P.fluor.) 바실러스메가테리움 (B.megater.)	+ + + + + + +	- - - -

* 저해정도: - 저해하지 않음, + 낮은 정도로 저해, ++ 높은 정도로 저해, +++ 매우 높은 정도로 저해.

mob4 및 양성 대조군 그룹으로 사이드로포어 생산의 테스트 도중에, 상당한 저해 영역이 관찰되었고, 철 이온의 존재하에서 중지되었다.

앞서 언급한 바와 같이, 일정의 슈도모나스 그룹은 식물 호르몬을 생산한다. 선별된 미생물에 대하여 상기 주어진 조성의 TAg 배지에서 지베렐린산의 생합성 능력이 있는지를 테스트하였다. 상기 테스트는 지베렐린산 A 표준(Sigma)를 사용하여 (40㎍/ml) 실리카 겔(Merck) 박층 크로마토그래피에 의해 수행되었다. 에틸-아세테이트로 배양을 추출한 후, 2배 부피의 소디엄-하이드록사이드-카보네이트로 추출하였고, 이어서, pH 2.5용액내에서 에틸-아세테이트로 다시 추출하였다. 하기 그룹 추출물의 증발 잔여물내에서 기준에 근접한 Rf 값의 점을 발견하였다.

그룹	Rf	점의 크기(mm2)
기준 SW 1-1-6 M32-1-9 슈도모나스플루오레슨스 (P.fluor.) 바실러스메가테리움 (B.megater.)	0.41 0.46 0.42 0.49 0.57	24 17 27 14 7

SW1-1-6 및 M32-1-9로 표지된 그룹을 선별하였다(이들은 밀리미터당 약 3-15㎍ 호르몬을 생산한다).

일반적인 부분에서 기술된 그룹을 계통학적 관점에서 테스트하고 확인하였다.

실시예 4.

세포외 폴리사카라이드를 생산하는 미생물의 분리

4A. 브라디리조븀의 선별

브라디리조븀 PH2-1-3 그룹을 1％ 글루코오스 및 1％ 사카로오스(상기 참조)를 함유하는 Tag 배지에 도말하고 배양 둘레의 폴리사카라이드(점액,slime)양을 테스트하였다. 폴리사카라이드를 생합성하는 PH2-1-1 및 -2 그룹을 선별하였다.

4B. 바실러스의 분리

바실러스 M32-1-10 및 SW17-1-15 그룹을 1％ 글루코오스 및 1％ 사카로오스(상기 참조)를 함유하는 Tag 배지에 도말하고 배양 둘레의 폴리사카라이드(점액,slime)양을 테스트하였다. 폴리사카라이드를 생합성하는 M32-1-6,8 및 SW17-1-7, 11 및 15 그룹을 선별하였다.

분리된 미생물은 마이크로코커스 로세우스(Micrococcus roseus)로 확인되었고, 글루코오스 및 사카로오스를 함유하는 완전 배지상에서 배양배지를 점성물질로 변형시키면서 다량의 폴리사카라이드를 생합성한다.

선별된 그룹은 공지된 구조의 석시오노글루콘(succionoglucone)-타입의 수용성 폴리사카라이드를 생합성한다.

실시예 5.

냉한성(cold-enduring) 미생물의 분리

실시예 1-4에 따라 선별된 미생물을 돌연변이를 일으키는 물질 및 방사능으로 처리하였다. 증류수로 제조한 미생물 현탁액을 0.01, 0.1, 1.0, 10 및 100 ㎍/ml 니트로소구아니딘(nitroso-guanidine)으로 1, 3, 5, 10 및 30 분간 처리하였다. 이러한 처리후에, 세포 현탁액을 원심분리하고, 2회 증류수로 세정하였고, 이어서, 세포를 TAg 배지상에 도말하였다. 밀리미터당 10⁹ 미생물을 함유하는 증류수 세포 현탁액을, 15W UV 램프하에, 10㎝ 거리에서, 1, 3, 5, 10 및 30분간 두는 처리를 반복하였다. 세포 현탁액을 Tag 배양 배지에 연속희석하여 도말하였다.

TAg 배양을 18℃의 온도에서 192시간동안 배양하고, 이어서, 18℃에서 배양한 TAg 사면 아가상의 가장 큰 배양을 분리하였다.

하기의 성장 배양을 조절하고 유지하였다.

분리되고, 선별되고, 냉한성 미생물 중으로부터 분리하고 기탁되었다:

아조토박터 비네란디 ssp. M657 (Azotobacter vinelandi ssp. M657) (NCAIM /P/B 001292),

스트렙토마이세스 알버스 var. 003 LP (Streptomyces albus var. 0003 LP) (NCAIM /P/B 001301/.

실시예 6.

미생물의 배양

6A. 완전 배양 배지상에서의 배양

TAg 배양 배지로부터 사면 아가 배양을 제조하였고, 이어서, 30℃의 온도에서 48시간 동안 배양하였다. 아조스피릴룸, 아조토박터, 바실러스, 브라디리조븀, 슈도모나스, 스트렙토마이세스 또는 마이크로코커스 배양을 하기의 조성의 -Ta1i-로 표지된 배양 배지내에 접종하였다.

글루코오스(50％수용액으로 분리하여 멸균함) 0.5％

당밀 1.5％

옥수수 스팁 리쿠어 (50％ 건조물질) 1.5％

기스텍스(Gistex) 효모 추출액 0.2％

산성 카제인 0.1％

암모늄 설페이트 0.1％

암모늄 나이트레이트 0.1％

칼슘 카보네이트 0.3％

포타슘-디하이드로젠-포스페이트 0.1％

소디움-클로라이드 0.1％

마그네슘-설페이트 ×7H₂O 0.1％

야자 기름 0.2％

배양배지의 100-100ml 부분을 500ml 삼각플라스크에 채우고, 이어서, 121℃의 온도에서 30분간 멸균하였다. 멸균한 배지를 사면 아가 배양상에서 자란 미생 물로 접종하였고, 1분당 260 회전으로 작동하는 회전 테이블에서, 25℃의 온도에서 36분간 배양을 수행하였다. 생장을 현미경적 테스트로 관찰하였고, 이어서, 접종으로부터 5％의 양을 사용하여, 하기 조성의 Ta1f 주요 발효배양 배지내에 접종하였다:

글루코오스(50％수용액에서 분리하여 멸균함) 1.5％

당밀 2.5％

옥수수 스팁 리쿠어 (50％ 건조물질) 1.5％

기스텍스 효모 추출액 0.4％

산성 카제인 0.4％

암모늄 설페이트 0.2％

암모늄 나이트레이트 0.2％

칼슘 카보네이트 0.3％

포타슘-디하이드로젠-포스페이트 0.2％

소디움-클로라이드 0.1％

마그네슘-설페이트 ×7H₂O 0.2％

미량원소 용액 0.45％

야자 기름 0.2％

*미량원소 용액의 조성은 실시예 1에 따른다.

삼각플라스크내의 배양배지 100 ml 를 멸균하였고, 전체부피 10L 및 순수부 피 5L의 연구실 발효기를 상기 주어진 조건하에서 멸균하였다.

v/v 통기 및 2개 입구를 가지는 터보 믹서를 조작하고, 1분당 360회로 회전시키며, 24시간 동안, 세균에 따라 밀리미터당 세포의 수가 4 ×10⁸ - 1.3 ×10⁹의 값에 도달할때 까지, 플라스크내의 배양은 회전 테이블상에서 배양하였고, 발효기내의 배양은 통상의 방법으로 배양하였다.

더 많은 양의 배양의 제조를 위해서, 상기 언급한 발효 조건하에서, 상기 주어진 조성의 Ta1i 배양 배지상에 10 리터 배양을 제조하였고, 이어서, 100 리터의 멸균된 Ta1i 및 100리터의 Ta1f 배양 배지를 각각, 5-5 리터씩 접종하였다. 상기 발효환경하에서 배양을 24시간동안 계속하였고, 이어서, 토양에서의 Ta1f 배양 배지상에서 배양시켰고, Tai 배지상에서 배양된 50리터의 배양을 멸균된 Ta1f 배지 1000리터를 접종하는데 사용하였다. 상기의 발효 환경하에서 24시간 동안 발효를 수행하였고, 이어서, 검사 한 후, 배양을 사용의 준비를 하였다. 강한 거품이 발생하는 경우, 0.01％의 폴리프로필렌-글리콜을 소포제(antifoaming agent)로서 첨가하였다.

6B. 반-최소(semi-minimal) 배양 배지상의 배양

Ta1f 배양배지 대신에 하기의 조성을 갖는 Ta2f 배양배지를 사용하여 실시예 6에서 주어진 과정을 반복하였다:

글루코오스(50％수용액에서 분리하여 멸균함) 1.5％

당밀 0.5％

산성 카제인 0.1％

암모늄 설페이트 0.7％

암모늄 나이트레이트 0.5％

칼슘 카보네이트 0.3％

포타슘-디하이드로젠-포스페이트 0.3％

소디움-클로라이드 0.1％

마그네슘-설페이트 ×7H₂O 0.2％

미량원소 용액 0.35％

야자 기름 0.2％

*미량원소 용액의 조성은 실시예 1에 따른다.

배양 후에, 세균에 따라, 배양은 밀리리터당 1-7 ×10⁸ 세포를 포함하였다.

실시예 7.

토양 구조의 개선 및 식물재배 실험

7A. 토양구조 개선 실험

소므리오지겟(Somlyosziget)근처의 다뉴브(Danube)에서 채취한 모래토양 및 에스즈테르곰의 점토를 90 ×90 cm의 트레이에 두었고, 층의 두께는 25 cm이었다. 모래토양을 트레이당 10g의 암모늄-나이트레이트 및 5g의 칼슘-포스페이트로 처리 하였다. 옥수수 종자를 트레이당 104개 파종하였다. 평가단계에서, 5개의 가장 큰 식물 및 5개의 가장 덜 발달한 식물을 제외하였다. 뿌리를 증류수로 세정하고, 45℃에서 이틀간 건조시킨 후에, 중량을 측정하였다. 트레이 번호 1은 충분하게 물을 주었고, 트레이 번호 2는 파종시 충분히 물을 주었으나, 그 후에는 전혀 주지 않았다. "a"로 표지한 트레이에는, 폴리사카라이드를 생합성하는 미생물로써, 국립 농업 및 산업 미생물 기탁기관에 기탁되고, 실시예 6에 따라 제조된, 바실러스 폴리믹사 var. SW17 (NCAIM /P/B 001295/, 바실러스 메가테리움 var. M326 (NCAIM /P/B 001291), 마이크로코커스 로세우스 ssp. A21 (NCAIM /P/B 001294/, 브라디리조븀 자포니쿰 var. PH25 (NCAIM /P/B 001302/ 미생물 그룹으로, 각 세균이 1 제곱 미터당 10⁸ 세포가 되도록 하여 접종시켰다. "b"로 표지된 트레이에는 미생물로 처리하지 않았다.

표 3에서는 33번째날에 얻은 결과를 보여준다. 하나의 식물에 대해 얻은 평균값으로 나타내었다.

토양	트레이	처리	식물의 높이 (cm)	뿌리계의 중량 (mg)
모래토양	No.1	A	24	945
	No.1	B	17	634
	No.2	A	18	866
	No.2	B	11	757
점토	No.1	A	27	1095
	No.1	B	23	1213
	No.2	A	20	1012
	No.2	B	19	689

표 4에서는, 물을 공급하지 않은 모래 및 점토 토양의 부스러짐(crumbling) 및 갈라짐(cracking)의 정도를 보여준다. 부스러짐의 정도에 대하여는, 종이 시트상에 토양 조각을 흩뿌린 후, 약한 진동하에서 분쇄되지 않는 크기가 2 mm이하는 (-), 2 내지 5 mm는 (+), 5 mm 초과는 (++)으로 나타내었고, 토양 표면의 갈라짐의 정도에 대하여는, 갈라짐이 없는 경우는 (++)으로, 약간 갈라짐이 있는 경우는 (+)으로, 토양가뭄의 특징을 나타내는 쪼개짐, 갈라짐의 큰 줄이 존재하는 경우는 (-)으로 나타내었다.

토양	처리	부스러짐의 정도	갈라짐의 정도
모래토양	A	+	+
모래토양	B	-	- 또는 +
점토	A	++	+
점토	B	++	++

표 3 및 표 4로부터, 폴리사카라이드를 생합성하는 미생물이 존재하면 식물의 발달 및 토양의 유리한 구조를 개선시킨다는 것을 알 수 있다.

7B. 들판 실험.

실험은, 2000년에, 헥타르당 10리터의 미생물로, 4번 반복된 무작위 블록 배열로, 모손머져르오바(Mosonmagyarovar) 대학교의 개량 및 재배 기술 스테이션에서 수행하였다.

실험 토양의 타입 : 다뉴브-지역, 두께: 120-140cm, 습도 함유량 2.4％, 강수량: 적음.

봄 밀(SPRING WHEAT)

단백질 함량％
대조군	11.80
NPK 200 kg/ha	11.87
박토필 A (BactoFil A)	11.96
건조물질에 대한 단백질 함량 ％
대조군	13.84
NPK 200 kg/ha	13.91
박토필 A	14.00
습성 글루텐 ％
대조군	32.00
NPK 200 kg/ha	31.1
박토필 A	31.1
수천 낟알 중량(g)
대조군	36.4
NPK 200 kg/ha	36.8
박토필 A	36.4
분쇄 ％
대조군	50.5
NPK 200 kg/ha	50.0
박토필 A	49.8
낙하 수(Falling number) (초)
대조군	278.3
NPK 200 kg/ha	281.5
박토필 A	272.5
글루텐-평평도(Gluten-flattening) (cm)
대조군	2.75
NPK 200 kg/ha	3.25
박토필 A	2.75
글루텐-신장도(Gluten-stretching) (cm)
대조군	12.5
NPK 200 kg/ha	11.8
박토필 A	12.3

젤레니 지수 (Zeleny-index)
대조군	30.0
NPK 200 kg/ha	30.3
박토필 A	30.8
밸로리그래프(valorigraph) 물-흡수능력 (ml)
대조군	31.3
NPK 200 kg/ha	31.6
박토필 A	31.4
밸로리그래프 값
대조군	57.3
NPK 200 kg/ha	53.1
박토필 A	48.0
덩어리의 부피(Bulk of loaf) (cm³)
대조군	962.5
NPK 200 kg/ha	977.5
박토필 A	1055.0
빵의 형태학적 비율
대조군	2.38
NPK 200 kg/ha	2.46
박토필 A	2.32
단백질-수율 (Kg/ha)
대조군	469.8
NPK 200 kg/ha	498.6
박토필 A	510.3
식물 높이(cm)
대조군	56.3
NPK 200 kg/ha	57.7
박토필 A	55.4

13％ 습기에 대해 측정한 낟알곡물 (g/parcel)
	낟알 농작물 (t/ha)	대조군 ％
대조군	3.366	100.0
NPK 200 kg/ha	3.552	105.5
박토필 A	3.617	107.5
낟알 농작물 (g/parcel)
	낟알 농작물 t/ha	대조군 ％
대조군	3.398	100.0
NPK 200 kg/ha	3.584	105.5
박토필 A	3.646	107.3
수확시의 습기 함유량 ％
대조군	14.08
NPK 200 kg/ha	14.00
박토필 A	13.93
테스트 중량 (kg)
대조군	69.8
NPK 200 Kg/ha	70.4

옥수수

옥수수속의 생 농작물 (kg/parcel)
	옥수수속의 생 농작물(t/ha)	대조군 ％
대조군	5.725	100.0
NPK 200 kg/ha	6.848	119.6
박토필 A	6.495	113.4
14％에 대한 낟알 농작물 (kg/parcel)
	낟알 농작물 (t/ha)	대조군 ％
대조군	5.496	100.0
NPK 200 kg/ha	6.614	120.3
박토필 A	6.175	112.3
낟알의 습기 함유량 ％
대조군	18.40
NPK 200 kg/ha	17.78
박토필 A	19.63
줄기 중량(kg/parcel)
	줄기 중량 (t/ha)	대조군 ％
대조군	2.672	100.0
NPK 200 kg/ha	3.016	112.9
박토필 A	2.886	108.0
줄기의 습기 함유량 ％
대조군	26.1
NPK 200 kg/ha	25.6
박토필 A	25.9
14％에 대한 줄기 중량 (kg/parcel)
	줄기 중량 (t/ha)	대조군 ％
대조군	2.416	100.0
NPK 200 kg/ha	2.740	113.4
박토필 A	2.613	108.2
줄기 수 (Stem number) (thousand pcs/ha)
대조군	38.41
NPK 200 kg/ha	39.13
박토필 A	39.86

줄기 당 옥수수속의 수 (pcs/parcel)
대조군	1.04
NPK 200 kg/ha	1.10
박토필 A	1.05
옥수수속의 수 (thousand pcs/ha)
대조군	39.86
NPK 200 kg/ha	42.93
박토필 A	42.03
생낟알의 1천 낟알 중량 (g)
대조군	255.2
NPK 200 kg/ha	259.2
박토필 A	263.3
14％ 습기에 대한 1천 낟알의 낟알 중량 (g)
대조군	245.6
NPK 200 kg/ha	250.9
박토필 A	251.0
테스트의 생중량 (kg)
대조군	65.9
NPK 200 kg/ha	65.1
박토필 A	64.6
14％ 습기에 대한 하나의 옥수수속 중량 (kg)
대조군	0.121
NPK 200 kg/ha	0.136
박토필 A	0.131
옥수수속당 낟알의 수 (db)
대조군	493.5
NPK 200 kg/ha	545.1
박토필 A	523.1

옥수수속의 습기 ％
대조군	19.4
NPK 200 kg/ha	20.7
박토필 A	18.9
옥수수속의 중량 (g)
대조군	22.3
NPK 200 kg/ha	22.3
박토필 A	22.4
수확-인덱스
대조군	44.1
NPK 200 kg/ha	41.5
박토필 A	42.3

사탕무

사탕무/ha
대조군	79891
NPK 200 kg/ha	81159
박토필 B	83696
상부 농작물 (kg/parc)
	상부 농작물 (t/ha)	대조군 ％
대조군	13.41	100.0
NPK 200 kg/ha	13.96	104.1
박토필 B	15.38	114.7
뿌리 농작물 (kg/parc)
	뿌리 농작물 (t/ha)	대조군 ％
대조군	30.46	100.0
NPK 200 kg/ha	36.74	120.6
박토필 B	39.35	129.2
상부-뿌리의 비율
	상부-뿌리 비율	대조군 ％
대조군	0.443	100.0
NPK 200 kg/ha	0.381	85.9
박토필 B	0.391	88.2
평균 뿌리 중량 (dkg)
	평균 뿌리 중량 (dkg)	대조군 ％
대조군	38.2	100.0
NPK 200 kg/ha	45.3	118.6
박토필 B	47.1	123.5
소화 ％
	소화 ％	대조군 ％
대조군	11.61	100.0
NPK 200 kg/ha	11.07	95.3
박토필 B	10.59	91.3
Na-함유량 (mg/100g 사탕무)
대조군	1.94
NPK 200 kg/ha	2.28
박토필 B	2.08

알파-아미노-N 함유량 (mg/100g 사탕무)
대조군	1.20
NPK 200 kg/ha	1.02
박토필 B	1.02
K-함유량 (mg/100g 사탕무)
대조군	2.52
NPK 200 kg/ha	1.89
박토필 B	2.10
감소치 ％
대조군	2.95
NPK 200 kg/ha	2.68
박토필 B	2.68
정제된 당 함유량 ％
	정제된 당 함유량 ％	대조군 ％
대조군	8.66	100.0
NPK 200 kg/ha	8.39	96.9
박토필 B	7.92	91.4
전체 당 수율 (t/ha)
	전체 당 수율 (t/ha)	대조군 ％
대조군	3.557	100.0
NPK 200 kg/ha	4.081	114.7
박토필 B	4.181	117.5

	순수 당 수율 (t/ha)	대조군 ％
대조군	2.656	100.0
NPK 200 kg/ha	3.091	116.4
박토필 B	3.125	117.7

실시예 8.

본 발명에 따른 미생물을 함유하는 제제의 제조

8A. 미생물 혼합물의 제조 :

실시예 6에 따라 제조된 미생물, 아조스피릴룸 브레실렌스 ssp. SW51 (NCAIM /P/B 001293), 아조토박터 비네란디 ssp. M657 (NCAIM /P/B 001292), 슈도모나스 플루오레슨스 var. SW11 (NCAIM /P/B 001296), 바실러스 폴리믹사 var. SW17 (NCAIM /P/B 001295/, 바실러스 메가테리움 var. M326 (NCAIM /P/B 001291), 마이크로코커스 로세우스 ssp. A21 (NCAIM /P/B 001294/, 브라디리조븀 자포니쿰 var. PH25 (NCAIM /P/B 001302/ 및 스트렙토마이세스 알버스 var. 0003 LP (NCAIM /P/B 001301/ 을 동일한 최적의 비율로 혼합하고, 동결이 없는 기간, 최적으로는 3월과 10월의 사이에, 5 리터 내지 50 리터의 양으로, 최적으로는 12리터/ha의 양으로, 처리될 토양에 적용하였다.

8B. 단자엽식물(monocotyledon)의 처리를 위한 제제

실시예 6에 따른 공정에 이어서, 하기의 미생물을 사용하여 제제를 제조하였다: 아조스피릴룸 브레실렌스 ssp. SW51 (NCAIM /P/B 001293), 아조토박터 비네란디 ssp. M657 (NCAIM /P/B 001292), 슈도모나스 플루오레슨스 var. SW11 (NCAIM /P/B 001296), 바실러스 폴리믹사 var. SW17 (NCAIM /P/B 001295/, 바실러스 메가테리움 var. M326 (NCAIM /P/B 001291), 및 스트렙토마이세스 알버스 var. 0003 LP (NCAIM /P/B 001301/.

8C. 쌍떡잎식물(dicotyledons)의 처리를 위한 제제

실시예 6에 따른 공정에 이어서, 하기의 미생물:

아조스피릴룸 브레실렌스 ssp. SW51 (NCAIM /P/B 001293), 아조토박터 비네란디 ssp. M657 (NCAIM /P/B 001292), 슈도모나스 플루오레슨스 var. SW11 (NCAIM /P/B 001296), 바실러스 폴리믹사 var. SW17 (NCAIM /P/B 001295/, 바실러스 메가테리움 var. M326 (NCAIM /P/B 001291) 마이크로코커스 로세우스 ssp. A21 (NCAIM /P/B 001294/, 브라디리조븀 자포니쿰 var. PH25 (NCAIM /P/B 001302/ 을 사용하여 본 발명에 따른 제제를 제조하였다.

8D. 동결 조건에서 건조된 제제의 제조

실시예 6에 따른 물-미생물 현탁액 2 리터를 장비사용의 지시서에 따라 겔만(Gelman) SP54 동결건조 장치내에서 동결건조시켰다. 건조된 미생물 분말을 그 자체로 사용하거나, 또는 용도에 따라 칼슘-카보네이트, 전분, 글루코오스, 또는 셀룰로오스를 1:1 내지 1:100의 비율로 혼합하고, 이어서, 사용할 때까지, 4 내지 10℃의 온도에서 저장하였다.

8E. 담체를 함유하는 제제의 제조:

실시예 6에 따라 제조한 배지상에 제조된 배양의 동일 부분량을 유기질 비료, 콩 분말(4 메쉬 일반 낟알 크기), 메틸-셀룰로오스 또는 감자 전분과 혼합하여, 제제가 5 ×10⁸ - 10¹⁰, 최적으로는 5 ×10⁹의 미생물을 포함하도록 제조하고, 이어서, 습성 제제 또는 40℃이하의 온도에서 건조한 제제를 2 내지 20 kg/ha, 최적으로는 5 kg/ha의 양으로 처리될 토양에 적용하였다. 최적으로는, 헥타르당 적 어도 10¹³의 미생물 세포를 토양에 접종하였다.

요약

본 발명의 주제는 식물의 생장의 향상 및 수율증가를 위해, 세균으로 토양을 처리하는 제품 및 공정, 이러한 제품을 제조하는 공정, 저온에서도 증식하고 폴리사카라이드를 생합성하며, 제품의 기초로 작용하는 미생물 스탁 및 이들의 생산을 위한 공정에 관한 것이다. 본 발명에 따른 미생물 세포 중의 하나 또는 이들의 화합물은 토양에 운반되거나 식물의 종자에 고정된다.

본 발명에 따른 공정으로, 공기 중의 질소를 식물이 이용가능한 화합물로 변형시키고, 광물화된 포스페이트- 및 포타슘 화합물을 용해시키고, 식물 발달을 향상시키는 광물을 생합성하고, 토양 구조에 최적으로 영향을 미치는 폴리사카라이드를 생산하고, 다양한 토양으로부터 분리되고, 연구실에서 변형되며, 만족할만한 수율에 이르게 하여, 실질적으로 값비싼 비료의 적용을 배제시키는 미생물 그룹 중의 적어도 어느 하나를 포함하는 제품을 토양에 이송한다.

Claims

농업의 관점에서 허용가능하고 미생물에 대해 비독성인 농업적으로 허용가능한 습성 또는 건성 담체와 함께,

국립 농업 및 산업 미생물 기탁기관(National Collection of Agricultural and Industrial Micro-organisms)에 기탁되고, 20℃ 이하의 온도 및 pH 5.0 이하의 토양에서도 번식하는 미생물로서,

아조스피릴룸 브레실렌스 ssp. SW51 (Azospirillum brasilense ssp. SW51) (NCAIM /P/B 001293), 아조토박터 비네란디 ssp. M657 (Azotobacter vinelandi ssp. M657) (NCAIM /P/B 001292), 슈도모나스 플루오레슨스 var. SW11 (Pseudomonas fluorescens var. SW11) (NCAIM /P/B 001296), 바실러스 폴리믹사 var. SW17 (Bacillus polymyxa var. SW17) (NCAIM /P/B 001295), 바실러스 메가테리움 var. M326 (Bacillus megaterium var. M326) (NCAIM /P/B 001291), 마이크로코커스 로세우스 ssp. A21 (Micrococcus roseus ssp. A21) (NCAIM /P/B 001294), 브라디리조븀 자포니쿰 var. PH25 (Bradyrhizobium japonicum var. PH25) (NCAIM /P/B 001302) 및 스트렙토마이세스 알버스 var. OOO3 LP (Streptomyces albus var. 0003 LP) (NCAIM /P/B 001301) 중의 적어도 하나의 배양을 5 ×10⁶ - 10¹¹세포/g의 양으로 포함하는 것을 특징으로 하는,

살아있는 미생물을 포함하는 토양의 처리에 적합한 제제.
제1항에 있어서, 물, 콩가루, 전분, 셀룰로오스, 글루코오스 및 이들의 유도체로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 담체로서 함유하는 것을 특징으로 하는 제제.
토양의 처리에 적합한 제품의 제조를 위한 및 20℃ 이하의 온도 및 pH 5.0 이하에서도 살수 있는 미생물을 포함하는 제제의 제조를 위한 공정으로서,

국립 농업 및 산업 미생물 기탁기관에 기탁된, 아조스피릴룸 브레실렌스 ssp. SW51 (Azospirillum brasilense ssp. SW51) (NCAIM /P/B 001293), 아조토박터 비네란디 ssp. M657 (Azotobacter vinelandi ssp. M657) (NCAIM /P/B 001292), 슈도모나스 플루오레슨스 var. SW11 (Pseudomonas fluorescens var. SW11) (NCAIM /P/B 001296), 바실러스 폴리믹사 var. SW17 (Bacillus polymyxa var. SW17) (NCAIM /P/B 001295), 바실러스 메가테리움 var. M326 (Bacillus megaterium var. M326) (NCAIM /P/B 001291), 마이크로코커스 로세우스 ssp. A21 (Micrococcus roseus ssp. A21) (NCAIM /P/B 001294), 브라디리조븀 자포니쿰 var. PH25 (Bradyrhizobium japonicum var. PH25) (NCAIM /P/B 001302) 및 스트렙토마이세스 알버스 var. 0003 LP (Streptomyces albus var. 0003 LP) (NCAIM /P/B 001301) 중 적어도 하나의 미생물을, 독립적으로 또는 함께, 탄소원, 질소원 및 무기염을 포함하는 배지상에 세포수가 밀리리터당 5 ×10⁷ 내지 5 ×10⁹ 에 이를때까지 배양하는 것을 특징으로 하는 공정.
청구항 3에 있어서, 얻어진 배양 또는 배양들을 특정 비율로 혼합하는 것을 추가로 포함하는 것인 공정.
청구항 3에 있어서, 배양(들)의 담체상으로의 침착 또는 이들과의 혼합하는 것을 추가로 포함하는 것인 공정.
청구항 3에 있어서, 전통적 방식으로 동결건조하는 것을 추가로 포함하는 것인 공정.
제3항에 있어서, 탄소원으로서 글루코오스, 사카로오스 및 당밀로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상, 질소원으로서 암모늄 클로라이드, 암모늄 나이트레이트(ammonium nitrate), 암모늄 설페이트, 옥수수 스팁 리쿠어(corn steep liquor) 및 카제인-가수분해물으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상, 무기염으로서 칼슘카보네이트 및 소디엄-, 포타슘-, 마그네슘-, 칼슘-, 철-, 나이트레이트-, 클로라이드-, 설페이트-, 카보네이트-, 포스페이트-이온으로 해리하는 염으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상 및 미량원소를 사용하는 것을 특징으로 하는 공정.
20℃ 이하 및 pH 5 이하에서도 번식할 수 있는 미생물로서,

아조스피릴룸 브레실렌스 ssp. SW51 (NCAIM /P/B 001293),

아조토박터 비네란디 ssp. M657 (NCAIM /P/B 001292),

슈도모나스 플루오레슨스 var. SW11 (NCAIM /P/B 001296),

바실러스 폴리믹사 var. SW17 (NCAIM /P/B 001295),

바실러스 메가테리움 var. M326 (NCAIM /P/B 001291),

마이크로코커스 로세우스 ssp. A21 (NCAIM /P/B 001294),

브라디리조븀 자포니쿰 var. PH25 (NCAIM /P/B 001302) 및

스트렙토마이세스 알버스 var. 0003 LP (NCAIM /P/B 001301)의

상기 번호로 국립 농업 및 산업 미생물 기탁기관에 기탁된 것인 미생물.
주어진 토양 타입의 상부층 40cm로부터 식물환경으로부터의 토양샘플을 채취하는 단계,

선별된 미생물을 동정하는 단계,

돌연변이 유발제 처리를 적용하는 단계,

20℃ 이하의 온도에서도 증식하는 변종(variant)을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제8항 기재의 미생물의 제조공정.
동결이 없는 기간에, 미생물 세포를, 토양에, 헥타르당 10¹⁰ 내지 10¹⁴의 양으로의 운반을 적용하는 것을 특징으로 하는 제1항 또는 제2항 기재의 제제로 토양을 처리하는 공정.
청구항 10에 있어서, 상기 양이 헥타르당 10¹¹ 내지 10¹²의 양인 것을 특징으로 하는 토양을 처리하는 공정.
미생물 중의 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함하는 액체 제품으로 종자를 처리하는 것을 특징으로 하는 제1항 또는 제2항 기재의 제제로 식물종자를 처리하는 공정.
토양 구조를 개선하거나 또는 보존하기 위한 공정에 있어서, 청구항 8에 기재된 미생물 중에서 선택되는, 석시노글루콘(succinoglucone)을 생합성하는 미생물을 토양에 적용하는 것을 특징으로 하는 토양 구조를 개선하거나 또는 보존하기 위한 공정.
제13항에 있어서,

바실러스 폴리믹사 var. SW17 (Bacillus polymyxa var. SW17) (NCAIM /P/B 001295), 바실러스 메가테리움 var. M326 (Bacillus megaterium var. M326) (NCAIM /P/B 001292), 마이크로코커스 로세우스 ssp. A21 (Micrococcus roseus ssp. A21) (NCAIM /P/B 001294) 또는 브라디리조븀 자포니쿰 var. PH25 (Bradyrhizobium japonicum var. PH25) (NCAIM /P/B 001302)의 하나 이상을 함유하는 제품을 적용하는 것을 특징으로 하는, 토양 구조를 개선하거나 또는 보존하기 위한 공정.