KR101743607B1

KR101743607B1 - 에스-아바(엡시스산) 추출물 제조방법

Info

Publication number: KR101743607B1
Application number: KR1020150013820A
Authority: KR
Inventors: 김기태; 변재일
Original assignee: (주)케이케이티생명자원개발연구소
Priority date: 2015-01-28
Filing date: 2015-01-28
Publication date: 2017-06-05
Anticipated expiration: 2035-01-28
Also published as: KR20160092874A

Abstract

본 발명은 질소고정균인 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense)를 이용하여 식물의 생장과 생리적 기능을 조절하는 식물 호르몬인 에스-아바(앱시스산) 추출물을 제조하는 에스-아바(엡시스산) 추출물 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 에스-아바(엡시스산) 추출물 제조방법은 일반배지 배양매체를 준비하여 일반배지를 제조하는 제 1단계; 상기 일반배지에 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense)를 배양하여 일반배양액을 제조하는 제 2단계; 실험배지 배양매체를 준비하여 실험배지를 제조하는 제 3단계; 상기 제 2단계에서 제조된 일반배양액을 상기 실험배지에 접종하여 배양액을 제조하는 제 4단계; 상기 배양액을 여과하는 제 5단계; 상기 여과된 배양액을 분무건조하는 제 6단계; 상기 분무건조된 배양액의 추출물을 얻는 제 7단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

Description

에스-아바(엡시스산) 추출물 제조방법{Manufacturing method of S-ABA(Abscisic acid) extracts}

본 발명은 질소고정균인 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense)를 이용하여 식물의 생장과 생리적 기능을 조절하는 식물 호르몬인 에스-아바(앱시스산) 추출물을 제조하는 에스-아바(엡시스산) 추출물 제조방법에 관한 것이다.

식물은 호르몬을 포함한 여러 생장촉진 물질들을 합성하고 수송해서 그에 대한 충분한 반응이 일어나면 다시 그것들을 분해하든지 변화시킴으로써 그들이 살아나가는데 필수적인 모든 과정을 조절하고 또 생장과 발달을 통합하는 것으로 여겨진다. 또한, 대부분의 생리적 과정은 성장 억제제에 의해서 영향을 받는다. 코마린(Coumarin), 알칼로이드, 페놀화합물들도 몇몇 식물에서 중요한 억제제이기는 하지만 식물계에서 가장 널리 분포하는 억제제는 앱시스산(Abscisic acid)이다.

앱시스산(Abscisic acid)은 목화의 낙과와 단풍나무의 휴면아에서 추출되어 그 화학구조가 밝혀졌고 현재는 인공적으로 합성이 된다. 이 물질은 정단분열 조직의 생장억제와 이층(Absciss layer)형성을 촉진하고 휴먼아의 형성을 촉진하여 여러 종자나 겨울눈의 휴면기간을 연장시키는 효과가 있다. 자작나무나 단풍나무 등의 잎은 가을이 되면 겨울눈을 형성하기 위해 분열조직 위에 새로이 형성된 잎을 비늘눈으로 전환시키며 겨울눈을 보호한다.

이와 같은 일을 하는 물질이 앱시스산(Abscisic acid)이며 이 물질은 잎에서 만들어져서 체관부를 통하여 정단분열 조직으로 이동하는 것으로 생각된다. 눈이 한번 휴면상태가 되면 저온처리나 지베렐린의 합성 등의 작용을 받아야 휴면상태가 파괴된다. 식물에서 강제휴면의 가치는 대단히 중요하다. 앱시스산(Abscisic acid)과 같은 물질로 강제휴면을 지속시키므로 겨울 동안 예기치 않게 기온이 올라가면 식물은 발아하여 나약한 성장을 일으킨다. 다시 기온이 떨어지면 바로 죽게 되는데, 그 때는 지속되는 저온기에 휴면상태를 유지시켜 식물을 보호하게 된다.

앱시스산(Abscisic acid)은 ABA로 약기 되며, 분자식은 C₁₅H₂₀O₄, 분자량은 264.32이다. 앱시스산(Abscisic acid)에 대해서는 1930년 이후 많이 알려져 왔으나 미숙목화 열매에서 낙엽촉진물질을 분리하여 아브시스Ⅱ로 명명한 적이 있었고 단풍잎과 등나무열매에서 같은 물질을 정제하는데 성공하여 이 물질을 도르민(dormin)이라고 명명한 바도 있었다. 또한, 앱시스Ⅱ의 NMR해석에서 추정구조가 도르민의 구조식과 완전히 같은 것으로 동일물질이라는 것을 확인하여 낙엽산이라고 명명하게 되었다. 천연의 (S)-(+)-ABA는 생리활성이 매우 크고, 그 배당체 ABA-1-O-β-D-글루코실에스테르도 식물계에 널리 분포한다.

<앱시스산(Abscisic acid, ABA)>

한편, 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense)은 공중질소를 고정하여 작물로 전이함은 물론 이를 통해 작물의 질소흡수량을 증진시키는 능력이 뛰어난 균주이다. 토양 미생물은 작물의 생육촉진, 물질 순환 및 환경정화 등 많은 부분에서 이용되고 있다. 이중에서 작물과 공생체를 만들어 공기 중의 질소를 고정하는 질소고정균에는 라이조비움(Rhizobium; 뿌리혹박테리아)이 있는데 이균은 콩과작물과 공생체계를 형성하는 미생물로서 콩과작물에 감염되면 뿌리혹을 형성하여 뿌리혹 내에 질소고정효소(Nitrogenase)에 의해 공중 질소를 암모늄태 질소로 전환시키는 질소고정이 이루어지게 된다.

이와 함께 기주작물과 완전한 공생체계를 형성하지 않으면서 반 공생 체계 즉 작물뿌리의 분비물에 의해 탄소원을 공급받으며 공중질소를 고정하는 일군의 균들이 있는데 호기성균에 아조토박터(Azotobacter)속과 아조스피릴룸(Azospirillum)속 미생물, 혐기성균에 클로스트리디움(Clostridium)속, 조건 혐기성균에 클렙시엘라(Klebsiella)속 미생물이 대표적이다. 이중에서 아조스피릴룸(Azospirillum)속 미생물은 식물 생장 촉진 근권균(PGPR; Plant Growth Promoting Bacteria)으로 잘 알려져 있다(Bashan and Holguin, 1997).

또한, 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense) 배양균은 NaCL 배지에 포함되어 있을 때 더 많은 양의 ABA를 생산에 내며 아라비돕시스 살리아나(Arabidopsis thaliana)와 함께 배양되었을 때는 ABA의 생산이 두배로 증가한다고 알려졌다.

그러나 질소고정균인 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense)를 이용하여 식물의 생장과 생리적 기능을 조절하는 식물 호르몬인 에스-아바(앱시스산) 추출물을 제조하는 방법은 종래의 기술로 제조하기 어려운 발명이다.

종래의 기술에서는 식물의 생장을 저해시키지 않고 효과적으로 식물에서의 플라노보이드의 생합성을 증대시킬 수 있는 배지 조성물에 관한 발명이 있었다. 그러나 앱시스산(Abscisic acid) 제조의 구체적인 방안 및 제조기술에 관한 연구가 부족하며 그에 따른 발명이 요구되는 실정이다.

대한민국등록특허 제10-1096332호

본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위해서 안출된 것으로서 질소고정균인 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense)를 이용하여 식물의 생장과 생리적 기능을 조절하는 식물 호르몬인 에스-아바(앱시스산) 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

발명이 해결하고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 에스-아바(엡시스산) 추출물 제조방법은 일반배지 배양매체를 준비하여 일반배지를 제조하는 제 1단계; 상기 일반배지에 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense)를 배양하여 일반배양액을 제조하는 제 2단계; 실험배지 배양매체를 준비하여 실험배지를 제조하는 제 3단계; 상기 제 2단계에서 제조된 일반배양액을 상기 실험배지에 접종하여 배양액을 제조하는 제 4단계; 상기 배양액을 여과하는 제 5단계; 상기 여과된 배양액을 분무건조하는 제 6단계; 상기 분무건조된 배양액의 추출물을 얻는 제 7단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

상기 과제의 해결 수단에 의해, 본 발명에 따른 에스-아바(엡시스산) 추출물 제조방법은 질소고정균인 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense)이용하여 에스-아바(엡시스산)의 제조 시 가장 효과적인 배양조건 및 제조방법을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 에스-아바(엡시스산) 추출물 제조방법을 나타내는 순서도이다.
도 2는 소금(NaCl)의 농도를 달리하였을 때 나타난 ABA 함량(mg/L)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 온도(℃)를 달리 하였을 때 나타난 ABA 함량(mg/L)을 나타낸 그래프이다.
도 4은 압력(mmHg)를 달리 하였을 때 나타난 ABA 함량(mg/L)을 나타낸 그래프이다.
도 5은 상기 중복 스트레스를 달리 하였을 때 나타난 ABA 함량(mg/L)을 나타낸 그래프이다.
도 6은 배양시간(h)을 달리 하였을 때 나타난 ABA 함량(mg/L)을 나타낸 그래프이다.

이상과 같은 본 발명에 대한 해결하려는 과제, 과제의 해결 수단, 발명의 효과를 포함한 구체적인 사항들은 다음에 기재할 일실시예 및 도면들에 포함되어 있다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 일실시예를 참조하면 명확해질 것이다.

하기에서는 상기 제시된 에스-아바(엡시스산) 추출물 제조방법을 도면을 이용하여 설명한다.

<에스-아바(엡시스산) 추출물 제조방법>

도 1은 본 발명의 에스-아바(엡시스산) 추출물 제조방법을 보여주는 순서도이다.

먼저, 제 1단계(S10)에서는 일반배지 배양매체를 준비하여 일반배지를 제조한다. 구체적으로, 상기 일반배지 배양매체는 펩톤(pepton) 1 중량부에 대하여 포도당(C₆H₁₂O₆) 2 중량부, 소금(NaCl) 0.5 중량부를 포함하여 제조된다. 상기 비율로 일반배지를 제조하는 경우, 균주의 증식 및 성장을 위해 기본적으로 필요한 원소의 기능을 균주의 배양에 효과적으로 부여할 수 있다.

상기 펩톤(pepton)은 동물의 육류 등의 단백질을 pepsin 또는 trypsin, pancreatin 등의 효소로 소화시켜 미량의 protease를 함유한 작은 분자의 황색분말로서 수용상태에서는 황갈색의 약한 산성을 나타낸다. 펩톤(pepton)은 단백질의 종류와 소화방법에 따라 구성성분에 차이가 있다. 미생물의 대사에 필요한 탄소원 및 질소원을 제공한다.

상기 포도당(C₆H₁₂O₆)은 탄소원이 없는 배양액에 탄소원을 공급하기 위하여 준비된다. 천연배지의 경우 단백질원은 탄소를 포함하고 있지만, 합성배지는 질소원으로 무기염류를 사용한다. 그러기 때문에 탄소는 폭기 또는 포도당 등의 유기물을 통해 공급한다.

상기 소금(NaCl)은 배지의 삼투압을 맞춰서 세포벽의 구조를 유지한다. 또한, 효소 활성 및 물질의 운반에 필요하다.

다음으로, 제 2단계(S20)에서는 상기 일반배지에 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense)를 배양하여 일반배양액을 제조한다. 구체적으로, 상기 일반배양액 제조의 조건은 25℃의 온도, 760mmHg의 압력, 100rpm, 48시간인 것이 바람직하다.

다음으로, 제 3단계(S30)에서는 실험배지 배양매체를 준비하여 실험배지를 제조한다. 구체적으로, 상기 실험배지 배양매체는 염화칼륨(KCl) 1 중량부에 대하여 포도당(C₆H₁₂O₆) 20 중량부, 옥수수전분 20 중량부, 말토덱스트린(maltodextrin) 10 중량부, 소금(NaCl) 20 중량부, 황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 2 중량부, 질산칼슘(Ca(NO₃)₂) 0.16 중량부, 황산마그네슘(MgSO₄) 0.12 중량부, 염화망간(MnCl₂) 0.0013 중량부, 황산철(FeSO₄) 0.0002 중량부를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 비율로 발효매체를 준비하는 경우, 균주의 증식 및 성장을 위해 필수적으로 필요한 이온과 1차 및 2차 다량원소, 미량원소의 기능을 균주의 배양에 가장 효과적으로 부여할 수 있다.

또한, 상기 소금(NaCl)의 비율이 20 중량부 미만인 경우, 구체적으로 15 중량부 일 때 ABA의 함량이 803mg/L로 20 중량부일 때보다 낮은 수득률을 보이는 문제점이 발생하였다. 반대로 20 중량부를 초과할 경우 20 중량부일 때 ABA의 함량인 954mg/L과 비슷한 수득률을 보였으나, 소금(NaCl)이 많이 첨가되어 비용 효율이 떨어지는 문제점이 발생한다.

상기 염화칼륨(KCl)은 1차 다량원소인 질소(N), 인(P), 칼륨(K) 중 칼륨(K)의 공급을 위해 준비된다.

상기 옥수수전분은 균사체를 가지는 균주의 배양에 효과적으로 사용된다.

상기 말토덱스트린(maltodextrin)은 전분을 묽은 산 또는 아밀라아제로 가수분해하여 생기는 아크로덱스트린보다 중합도가 작은 저분자 덱스트린의 총칭으로 글루코오스의 알파-1,4 글루코사이드 결합으로 이루어진 소당류의 총칭을 말한다. 부형제로도 사용된다.

상기 황산암모늄((NH₄)₂SO₄)은 질소(N)를 공급하기 위해 첨가한다. 수용성 염기염으로 이온 강도를 증가시킨다.

상기 질산칼슘(Ca(NO₃)₂)은 2차 다량원소인 칼슘(Ca)를 공급하기 위해 첨가한다.

상기 황산마그네슘(MgSO₄)은 2차 다량원소인 마그네슘(Mg)를 공급하기 위해 첨가한다.

상기 염화망간(MnCl₂)은 극소량이지만 꼭 필요한 금속이온 중 하나인 망간(Mn)을 공급하기 위해 첨가한다. 극미량이 들어가지만 결핍되면 미생물의 정상적인 증식이 불가능하다.

상기 황산철(FeSO₄)은 극소량이지만 꼭 필요한 금속이온 중 하나인 철(Fe)을 공급하기 위해 첨가한다. 극미량이 들어가지만 결핍되면 미생물의 정상적인 증식이 불가능한다.

다음으로, 제 4단계(S40)에서는 상기 제 2단계(S20)에서 제조된 일반배양액을 상기 실험배지에 접종하여 배양액을 제조한다.

구체적으로, 상기 일반배양액에서 OD600이 1±0.1일 때 상기 실험배지에 접종한다. 600nm의 파장에서 측정한 시료의 흡광도 또는 광학 밀도가 1±0.1인 경우 미생물의 씨드(Seed)가 충분히 배양되었음을 알 수 있으므로, 상기 조건일 때 접종하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 배양액은 500 내지 550mmHg의 압력과 20 내지 27℃의 온도, 80 내지 120rpm 및 70 내지 74시간 동안 진탕배양하여 제조하는 것이 바람직하다.

상기 압력조건이 500mmHg 미만인 경우, 구체적으로 356mmHg일 때 ABA의 함량이 297mg/L로 낮은 수득률을 보였고, 550mmHg를 초과할 경우 구체적으로 760mmHg일 때 ABA의 함량이 205mg/L로 낮은 수득률을 보였다. 압력조건이 500 내지 550mmHg인 경우 ABA의 함량이 305mg/L로 가장 높은 수득률을 나타내었으므로 상기 조건으로 감압하는 것이 바람직하다.

상기 온도조건이 20℃ 미만인 경우 미생물이 성장하기에 너무 낮은 온도로 온도에 대한 스트레스가 증가하여 ABA 함량이 감소하는 문제가 발생하며, 반대로 온도조건이 27℃를 초과할 경우 구체적으로 30℃인 경우 ABA의 함량이 205mg/L로 25℃일 때 ABA의 함량(320mg/L)보다 낮은 수득률을 보였다. 온도조건이 20 내지 27℃인 경우 ABA의 함량이 320mg/L로 가장 높은 수득률을 나타내었으므로 상기 온도 조건으로 배양하는 것이 바람직하다.

상기 회전속도가 80rpm 미만인 경우 진탕배양시 분당 회전이 제대로 이루어지지 않아 미생물의 성장이 효율적으로 이루어지지 않으며, 100rpm을 초과할 경우 회전속도에 대한 미생물의 스트레스가 증가하여 수득률이 감소하는 문제점이 있다.

상기 배양시간이 70시간 미만인 경우 미생물의 배양이 충분히 이루어지지 않는 문제점이 발생하고, 74시간을 초과할 경우 미생물의 먹이가 되는 매체의 부족으로 스트레스가 증가하여 ABA의 수득률이 감소하는 문제점이 발생한다.

다음으로, 제 5단계(S50)에서는 상기 배양액을 여과한다. 구체적으로, 여제를 통과한 용액인 여괴(filterate)에는 상기 배양액 중 ABA의 농도가 1.5g/L이 되며, 여제에 걸린 고형분인 여괴(filter cake)에는 상기 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense)가 걸러지게 된다.

다음으로, 제 6단계(S60)에서는 상기 여과된 배양액을 분무건조한다. 상기 분무건조는 액상시료를 분무 및 미립화하여 열풍기류 속에 접촉시키면 순간적으로 증발 또는 건조되어 일거에 분립된 시료를 얻을 수 있다.

다음으로, 제 7단계(S70)에서는 상기 분무건조된 배양액의 추출물을 얻는다. 구체적으로, 상기 분무건조된 배양액에 함유된 ABA의 함량의 농도는 2%가 되는 것이 바람직하다.

ㄱ. 염 스트레스에 따른 변화

소금의 농도(중량부)	5	10	15	20	25
ABA 함량(mg/L)	205	579	803	954	958

상기 염 스트레스에 따른 변화 실험은 실험배지 배양매체 중 염화칼륨(KCl) 1 중량부에 대하여 소금(NaCl)의 중량부를 달리하여 그에 따른 ABA 함량(mg/L)를 측정한 것이다.

도 2는 소금(NaCl)의 농도를 달리하였을 때 나타난 ABA 함량(mg/L)을 나타낸 그래프이다.

표 1 및 도 2를 살펴본 결과 염화칼륨(KCl) 1 중량부에 대하여 상기 소금(NaCl)의 비율이 20 중량부 미만인 경우, 구체적으로 15 중량부 일 때 ABA의 함량이 803mg/L로 20 중량부일 때보다 낮은 수득률을 보이는 문제점이 발생하였다. 반대로 20 중량부를 초과할 경우 20 중량부일 때 ABA의 함량인 954mg/L과 비슷한 수득률을 보였으나, 소금(NaCl)이 많이 첨가되어 비용 효율이 떨어지는 문제점이 발생한다.

따라서 상기 배양액의 제조조건 중 소금의 농도는 염화칼륨(KCl) 1 중량부에 대하여 상기 소금(NaCl)의 비율이 20 중량부인 것이 바람직하다.

ㄴ. 온도 스트레스에 따른 변화

온도(℃)	20	25	30	35	40
ABA 함량(mg/L)	323	320	205	228	237

상기 온도 스트레스에 따른 변화 실험은 실험배지를 제조 시 온도 변화를 달리하여 그에 따른 ABA 함량(mg/L)를 측정한 것이다.

도 3은 온도(℃)를 달리 하였을 때 나타난 ABA 함량(mg/L)을 나타낸 그래프이다.

표 2 및 도 3를 살펴본 결과 상기 온도조건이 20℃ 미만인 경우 미생물이 성장하기에 너무 낮은 온도로 온도에 대한 스트레스가 증가하여 ABA 함량이 감소하는 문제가 발생하며, 반대로 온도조건이 27℃를 초과할 경우 구체적으로 30℃인 경우 ABA의 함량이 205mg/L로 25℃일 때 ABA의 함량인 320mg/L보다 낮은 수득률을 보였다.

따라서 상기 배양액의 제조조건 중 온도조건이 20 내지 27℃인 경우 ABA의 함량이 323 또는 320mg/L로 가장 높은 수득률을 나타내었으므로 상기 온도 조건으로 배양하는 것이 바람직하다.

ㄷ. 압력 스트레스에 따른 변화

압력(mmHg)	356	530	760	825	854
ABA 함량(mg/L)	297	305	205	197	195

상기 압력 스트레스에 따른 변화 실험은 실험배지를 제조 시 압력 변화를 달리하여 그에 따른 ABA 함량(mg/L)를 측정한 것이다.

도 4은 압력(mmHg)를 달리 하였을 때 나타난 ABA 함량(mg/L)을 나타낸 그래프이다.

표 3 및 도 4를 살펴본 결과 상기 압력조건이 500mmHg 미만인 경우, 구체적으로 356mmHg일 때 ABA의 함량이 297mg/L로 낮은 수득률을 보였고, 550mmHg를 초과할 경우 구체적으로 760mmHg일 때 ABA의 함량이 205mg/L로 낮은 수득률을 보였다.

따라서 상기 배양액의 제조조건 중 압력조건은 500 내지 550mmHg인 경우 ABA의 함량이 305mg/L로 가장 높은 수득률을 나타내었으므로 상기 조건으로 감압하는 것이 바람직하다.

ㄹ. 중복 스트레스에 따른 변화

스트레스	일반배양액 조건	소금(NaCl)20 중량부+ 25℃온도	소금(NaCl)20 중량부+ 530mmHg압력	25℃온도+ 530mmHg압력	소금(NaCl)20 중량부+ 25℃온도+ 530mmHg압력
ABA 함량(mg/L)	205	1218	1123	763	1333

상기 중복 스트레스에 따른 변화 실험은, 실험배지를 제조하여 스트레스를 혼합하였을 때 그에 따른 ABA 함량(mg/L)를 측정한 것이다.

상기 일반배양액 조건은 25℃의 온도, 760mmHg의 압력, 100rpm, 48시간 동안 진탕배양한 것이다. 또한, 상기 중복 스트레스는 염처리와 온도변화, 염처리와 압력변화, 온도변화와 압력변화, 염처리와 온도변화 및 압력변화를 중복으로 처리하였을 때 그에 따른 ABA 함량(mg/L)를 측정한 것이다.

도 5은 상기 중복 스트레스를 달리 하였을 때 나타난 ABA 함량(mg/L)을 나타낸 그래프이다.

표 4 및 도 5를 살펴본 결과 일반배양액 조건인 경우 ABA의 함량(mg/L)이 205mg/L으로 가장 낮은 수득률을 나타내었고, 염처리와 온도변화 및 압력변화를 중복을 처리하였을 때 ABA의 함량이 1333mg/L로 가장 높은 수득률을 나타내었다.

따라서 상기 배양액의 제조조건 중 염처리와 온도변화 및 압력변화를 중복으로 처리하였을 때 가장 높은 수득률을 나타내었으므로 상기 조건으로 진탕배양하는 것이 바람직하다.

ㅁ. 배양시간에 따른 변화

배양시간(h)	0	24	48	72	96
ABA 함량(mg/L)	0	563	1333	1514	1520

상기 배양시간에 따른 변화 실험은 실험배지를 제조 시 배양시간을 달리하여 그에 따른 ABA 함량(mg/L)를 측정한 것이다.

도 6은 배양시간(h)을 달리 하였을 때 나타난 ABA 함량(mg/L)을 나타낸 그래프이다.

표 5 및 도 6을 살펴본 결과 상기 배양시간조건이 70시간 미만인 경우, 구체적으로 48시간일 때 ABA의 함량이 1333mg/L으로 72시간인 경우의 ABA 함량인 1514mg/L보다 낮은 수득률을 나타내었다. 반대로 상기 배양시간조건이 74시간을 초과할 경우, 구체적으로 96시간일 때 ABA의 함량이 1520mg/L으로 72시간인 경우보다 ABA의 함량이 높지만 미생물의 먹이가 되는 매체를 추가해야 하므로 효율성이 떨어지는 문제점이 발생한다.

따라서 상기 배양액의 제조조건 중 배양시간조건은 70시간 내지 74시간인 경우 ABA의 함량이 1514mg/L로 가장 높은 효율성을 가지는 수득률을 나타내었으므로 상기 조건으로 배양하는 것이 바람직하다.

500 내지 550mmHg인 경우 ABA의 함량이 305mg/L로 가장 높은 수득률을 나타내었으므로 상기 조건으로 감압하는 것이 바람직하다.
[비교예 1]
L- 혹은 DL- 말릭산 5.0%, K₂HPO₄ 0.5%, MgSO₄.7H₂O 0.2%, NaCl 0.1%, NH₄Cl 0.1%, CaCl₂ 0.02%, FeEDTA 0.0656%의 조건으로 제조한 일반배양액이다.
[실시예 1]
실시예 1은 본원발명을 바탕으로 제조하되, 상기 일반배지는 펩톤 1 중량부에 대하여 포도당 1 중량부, 소금 0.01 중량부를 혼합하여 제조된 에스-아바 추출물 제조방법이다.
[실시예 2]
실시예 2는 본원발명을 바탕으로 제조하되, 상기 일반배지는 펩톤 1 중량부에 대하여 포도당 3 중량부, 소금 0.1 중량부를 혼합하여 제조된 에스-아바 추출물 제조방법이다.
[실시예 3]
실시예 3은 본원발명을 바탕으로 제조하되, 상기 일반배지에 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense)를 25℃, 740mmHg, 100rpm, 48시간 동안 배양하여 제조된 에스-아바 추출물 제조방법이다.
[실시예 4]
실시예 4는 본원발명을 바탕으로 제조하되, 상기 일반배지에 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense)를 25℃, 780mmHg, 100rpm, 48시간 동안 배양하여 제조된 에스-아바 추출물 제조방법이다.
[실시예 5]
실시예 5는 본원발명을 바탕으로 제조하되, 상기 실험배지는 염화칼륨 1 중량부에 대하여 포도당 10 중량부, 옥수수전분 10 중량부, 말토덱스트린 5 중량부, 소금 10 중량부, 황산암모늄 1 중량부, 질산칼슘 0.10 중량부, 황산마그네슘 0.02 중량부, 염화망간 0.0001 중량부, 황산철 0.0001 중량부를 혼합하여 제조된 에스-아바 추출물 제조방법이다.
[실시예 6]
실시예 6은 본원발명을 바탕으로 제조하되, 상기 실험배지는 염화칼륨 1 중량부에 대하여 포도당 30 중량부, 옥수수전분 30 중량부, 말토덱스트린 15 중량부, 소금 30 중량부, 황산암모늄 3 중량부, 질산칼슘 0.20 중량부, 황산마그네슘 0.20 중량부, 염화망간 0.002 중량부, 황산철 0.0003 중량부를 혼합하여 제조된 에스-아바 추출물 제조방법이다.
[실시예 7]
실시예 7은 본원발명을 바탕으로 제조하되, 제 2단계에서 제조된 일반배양액의 OD600이 0.2±0.1일 때 상기 실험배지에 접종하여 제조된 에스-아바 추출물 제조방법이다.
[실시예 8]
실시예 8은 본원발명을 바탕으로 제조하되, 상기 제 2단계에서 제조된 일반배양액의 OD600이 2.0±0.1일 때 상기 실험배지에 접종하여 제조된 에스-아바 추출물 제조방법이다.
[실시예 9]
실시예 9는 본원발명을 바탕으로 제조하되, 상기 제 4단계 진탕배양 시 356mmHg의 압력과 20℃ 의 온도 및 100rpm에서 48 시간동안 진탕배양하여 제조된 에스-아바 추출물 제조방법이다.
[실시예 10]
실시예 10은 본원발명을 바탕으로 제조하되, 상기 제 4단계 진탕배양 시 760mmHg의 압력과 25℃ 의 온도 및 100rpm에서 96 시간동안 진탕배양하여 제조된 에스-아바 추출물 제조방법이다.
[실시예 11]
실시예 11은 본원발명을 바탕으로 제조된 에스-아바 추출물 제조방법이다.
ㅂ. 전체 변화에 다른 ABA 함량 변화
상기 비교예 1 및 실시예 1 내지 11의 조건을 통해 에스-아바(ABA) 함량의 변화를 통해 가장 최적의 에스-아바 추출물 제조방법을 확인하고자 한다.

구분	ABA함량(mg/L)
비교예 1	130
실시예 1	1434
실시예 2	1410
실시예 3	1454
실시예 4	1435
실시예 5	1323
실시예 6	1287
실시예 7	1204
실시예 8	1476
실시예 9	1308
실시예 10	1257
실시예 11	1515

상기 표 6에 나타난 바와 같이, 본원 발명인 실시예 11의 조건을 통해 제조된 에스-아바 추출물이 에스-아바 함량이 가장 높으므로 상기 조건으로 제조되는 것이 바람직하다.

이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타나며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

S10. 일반배지 배양매체를 준비하는 제 1단계
S20. 상기 일반배지 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense)를 배양하여 일반배양액을 제조하는 제 2단계
S30. 실험배지 배양매체를 준비하여 실험배지를 제조하는 제 3단계
S40. 상기 제 2단계에서 제조된 일반배양액을 상기 실험배지에 접종하여 배양액을 제조하는 제 4단계
S50. 상기 배양액을 여과하는 제 5단계
S60. 상기 여과된 배양액을 분무건조하는 제 6단계
S70. 상기 분무건조된 배양액을 에틸아세테이트(Ethyl Acetate)로 추출하는 제 7단계

Claims

일반배지 배양매체로 펩톤 1 중량부에 대하여 포도당 2 중량부, 소금 0.5 중량부를 준비하여 일반배지를 제조하는 제 1단계;
상기 일반배지에 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense)를 25℃, 760mmHg, 100rpm, 48시간 동안 배양하여 일반배양액을 제조하는 제 2단계;
실험배지를 준비하되, 배양매체로 염화칼륨 1 중량부에 대하여 포도당 20 중량부, 옥수수전분 20 중량부, 말토덱스트린 10 중량부, 소금 20 중량부, 황산암모늄 2 중량부, 질산칼슘 0.16 중량부, 황산마그네슘 0.12 중량부, 염화망간 0.0013 중량부, 황산철 0.0002 중량부를 포함하여 실험배지를 제조하는 제 3단계;
상기 제 2단계에서 제조된 일반배양액의 OD600이 1±0.1일 때 상기 실험배지에 접종하고, 500 내지 550mmHg의 압력과 20 내지 27℃ 의 온도 및 80 내지 120rpm에서 70 내지 74 시간동안 진탕배양하여 배양액을 제조하는 제 4단계;
상기 배양액을 여과하되, 필터레이트(filterate)에는 상기 배양액 중 에스-아바의 농도가 1.5g/L이고, 필터케이크(filter cake)에는 상기 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense)가 걸러지도록 여과하는 제 5단계;
상기 여과된 배양액의 필터레이트(filterate)을 분무 및 미립화하여 열풍기류 속에 접촉시켜 순간적으로 증발 또는 건조되도록 분무건조하는 제 6단계;
상기 분무건조된 배양액에 함유된 에스-아바의 농도가 2%가 되는지 확인하는 제 7단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 에스-아바 추출물 제조방법
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