KR101118485B1 - 고정화된 인산 가용화 미생물을 포함하는 비료 조성물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고정화된 인산 가용화 미생물을 포함하는 비료 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 젤라틴을 이용하여 고정화된 인산 가용화 미생물을 포함하는 비료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 미생물 비료 조성물은 토양 정착 능력이 우수하여 매우 안정하며 불용성 인산염을 가용성 인산염으로 전환시킴으로써 식물의 인산 흡수 및 생육을 촉진할 수 있는 효능이 장기간 동안 유지되는 효과가 있다.

불용성 인산염, 인산 가용화 미생물, 고정화, 젤라틴

Description

고정화된 인산 가용화 미생물을 포함하는 비료 조성물의 제조방법 {Manufacturing method of Fertilizer composition containing immobilized phosphate solubilizing microorganism}

본 발명은 고정화된 인산 가용화 미생물을 포함하는 비료 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 젤라틴을 이용하여 고정화된 인산 가용화 미생물을 포함하는 비료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

인(phosphorus)은 식물의 생장과 발달을 위해 매우 중요한 필수 영양원소이다. 따라서 농업에 있어서 주요 작물의 수확량이 증가되기 위해서는 식물이 가용할 수 있는 인의 유무가 매우 중요한 조건이 된다.

그러나 토양 내에 존재하는 대부분의 인은 화학적으로 공고하게 결합된 불용성 복합체나 유기적으로 결합된 파이테이트(phytate)와 같은 상태로 존재하여 식물이 전혀 사용할 수 없는 불용성 인산염으로 존재한다(Paul and Clark, Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press, San Diego, CA, 1996).

따라서 식물의 생장 저하를 방지하기 위해서는 무기인산비료의 공급이 필요하다. 그러나 무기인산비료를 공급하더라도 공급된 비료 중 75% 이상이 매우 빠르게 알칼리 및 산성 토양 내의 철, 알루미늄 및 칼슘이온 등과 결합하여 식물체가

이용할 수 없는 불용성 인산염의 형태로 전환된다(Whitelaw, M. A. et al., Soil Biol. Biochem., 31, 655-665). 이에 따라 농작물의 생산성을 향상시키기 위하여 과도한 무기인산비료를 농토에 공급하는 과도한 시비가 반복된다.

상기와 같은 인산의 과도한 공급은 환경오염을 비롯한 여러 가지 문제를 발생시킨다. 토양에 공급된 무기인산비료는 일부분만이 농작물에 흡수되고 나머지는 수분과 함께 토양 표층으로 이동하면서 수분은 증발하고 염류만 쌓이게 되어 농작물의 생장이 정상적으로 이루어지지 않는 염류장해 토양이 된다. 염류가 과도하게 집적된 토양은 식물의 영양분 흡수와 생육을 방해함으로써 각종 질병 감염 위험을 높이며, 지표수의 부영양화와 지하수의 오염을 초래한다.

이에 따라, 최근에는 인산 가용화 미생물을 토양에 접종하여 토양 내에 존재하는 불용성 인산염의 가용화를 촉진하여 농작물을 생산성을 높이고자 하는 연구가 진행되고 있다(Chabot et al., Appl. Environ. Microbiol., 62:2767-2772, 1996; Illmer P. et al., Soil Biol. Biochem. 27, 257-263, 1995).

상기 인산 가용화 미생물은 유기산을 분비하거나 특정 효소를 분비하여 토양의 불용성 인산염을 가용화 인으로 전환시켜 식물이 흡수하여 사용할 수 있도록 하는 것으로 추정되고 있다(Goldstein, Am. J. Altern. Agric. 1:51-57, 1986).

한편, 상기와 같은 인산 가용화 미생물을 이용하여 제조한 미생물 비료(biofertilizer)를 실제 농경지에 적용하기 위해서 미생물 비료의 안정성과 효능 유지, 저장 및 운송 등이 문제가 되고 있다. 따라서 최근에는 상기와 같은 문제를 해결하기 위해 미생물을 이탄(peat), 갈탄(lignite), 토양-모래 혼합물, 질석, 펄 라이트 등과 같은 벌크 담체(bulk carrier) 또는 아가, 카라기난, 알지네이트, PAG(Polyacrylamide gel) 등과 같은 담체에 고정화하여 미생물 비료로 사용하는 방법이 개발되고 있다.

이에 본 발명자들은 인산 가용화 미생물을 농경지에 가장 효과적으로 적용할 수 있는 방법을 연구한 결과, 젤라틴으로 인산 가용화 미생물을 고정화하고 이를 토양에 적용한 경우 다른 종류의 담체에 비해 안정성 및 효능이 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 젤라틴으로 고정화된 인산 가용화 미생물을 포함하는 비료 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 비료 조성물을 토양에 처리하는 것을 특징으로 하는 식물의 재배방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 젤라틴으로 고정화된 인산 가용화 미생물을 포함하는 비료 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 비료 조성물을 토양에 처리하는 것을 특징으로 하는 식물의 재배방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 비료 조성물은 젤라틴으로 고정화된 인산 가용화 미생물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 '인산 가용화 미생물'이란 불용성의 인산염 또는 인산질 비료원을 유기태에서 무기태로 가용화하는 능력을 가진 미생물을 말한다. 본 발명에서 인산 가용화 미생물로는 특별히 한정되지 않으며 당 분야에 공지된 미생물을 모두 사용할 수 있다. 예를 들면, 판토에아 에그로머란스(Pantoea agglomerans,

NCBI: accession no. 취득기관: National Center for Biotechnology Information, Accession No: AY335552), 엔테로박터 에어로제네스(Enterobacter aerogenes, NCBI, Accession No: AY335554), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp. Accession No: NCBI, AY335553), 페니실리움 옥살리컴(Penicillium oxalicum CBPS-3F-Tsa, IMI387080)을 들 수 있다. 바람직하게는 판토에아 에그로머란스(Pantoea agglomerans, NCBI, Accession No: AY335552)를 사용한다.

본 발명에서 인산 가용화 미생물은 그들이 고정화된 담체에서 생장, 번식 할 수 있는 수준의 양 이상으로 사용되어야 하며 미생물이 과다하여 담체가 그 기능을 충분히 수행할 수 없어서도 안된다. 이러한 관점에서 볼 때 인산 가용화 미생물의 사용량은 미생물의 종류 및 담체의 종류에 따라 다를 수 있으나 일반적으로 본 발명의 비료 조성물은 0.1 내지 1.0 mg d.w./ml of gel 또는 디스크(0.8×0.4cm) 당 5.0 내지 30 mg d.w의 양으로 미생물이 함유되도록 하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하기로는 0.56 mg d.w./ml of gel 또는 디스크(0.8×0.4cm) 당 10.113 mg d.w의 양으로 미생물이 함유되도록 하는 것이 좋다.

본 발명의 비료 조성물은 다음의 단계로 이루어진 방법에 따라 제조될 수 있다.

즉, 본 발명의 비료 조성물은 (a) 인산 가용화 미생물을 배양한 후 배양액을 원심분리하여 세포를 수득하고 멸균수로 현탁하는 단계;

(b) 물에 젤라틴을 첨가하고 가열하여 젤라틴 수용액을 제조하고 이를 35 내지 40 ℃로 냉각하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 젤라틴 수용액에 상기 (a) 단계의 세포 현탁액을 첨가하고 혼합하는 단계;

(d) 상기 (c) 단계의 혼합액에 경화액을 첨가하고 교반하는 단계; 및

(e) 상기 (d) 단계의 혼합액을 성형틀에 부은 후 1 내지 7 ℃에서 15 내지 20 시간 동안 방치하여 겔 형성을 유도한 후 실온에서 입방체가 되도록 절단하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직하기로는 상기 겔 형성시 4 ℃에서 18 시간 동안 방치하여 겔 형성을 유도하는 것이 좋다.

본 발명의 비료 조성물 제조시 상기 경화액은 통상의 경화액이 사용될 수 있음은 물론이며, 구체적인 예로는 포름알데히드 20%(v/v), 에탄올 50%(v/v) 및 물 30%(v/v)을 포함하는 경화제를 들 수 있다. 또한 상기 경화액의 성분 중 포름알데히드를 대신하여 퍼리오데이트로 산화된 전분, 아밀로오스, 아밀로펙틴 및 덱스트로스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 경우 인산가용화균의 젤라틴 내에서의 생존율을 더욱 높을 수 있다.

또한, 본 발명의 비료 조성물은 미생물 보호제로서 적합한 글리세롤, 분유, 우유, 탈지분유 또는 동식물유 등을 추가로 첨가할 수 있으며, 영양 공급원으로서 섬유소 분말, 대두박 분말, 면실박 분말, 각종 동식물성 펩톤, 밀기울 분말, 옥수 수 추출물, 효모 추출액, 당밀, 포도당, 설탕, 옥수수시럽 등과 같은 탄소원 및 질소원과 무기염류 등을 추가로 포함하여 인산 가용화 미생물의 생장을 촉진하도록 할 수 있다.

상기 첨가제들은 인산 가용화 미생물과 젤라틴 용액을 혼합하기 전에 상기 미생물에 첨가하거나 또는 젤라틴 용액에 첨가할 수 있으며, 통상의 양으로 포함될 수 있다.

상기와 같은 방법에 의해 수득된 비료 조성물은 일반적인 제형기를 사용하여 적당한 크기의 분말, 펠렛 또는 과립 등의 다양한 형태로 제형화 될 수 있다. 상기에서 제형화된 본 발명의 비료 조성물은 그대로 사용되거나 또는 실온에서 풍건하거나 동결 건조 또는 고온 건조 방법으로 건조시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 비료 조성물을 토양에 적용하는 경우 토양에 살포하는 방법으로 적용할 수 있다. 또한, 본 발명의 비료 조성물은 쌀겨에 본 발명의 비료 조성물을 넣고 수분을 적합한 함량으로 조절하여 상온에서 확대 배양한 후 토양에 적용시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

인산 가용화 미생물의 젤라틴을 이용한 고정화

인산 가용화 미생물로는 판토에아 에그로머란스(Pantoea agglomerans)를 사 용하였다. 상기 미생물은 충북 청주시 개신동 고추 작물의 근권 토양으로부터 분리 및 선별하여 동정되었다. 상기 미생물을 피코브스키야 배지(Pikovskaya's medium; 글루코오스 10 g, Ca₃(PO₄)₂, AlPO₄, FePO₄ 로 이루어진 인산 공급원 5 g, MgSO₄?7H₂O 0.1 g, (NH₄)₂SO₄ 0.5 g, KCl 0.2 g, MnSO₄ 0.01 g 및 증류수 1 L)에 접종하여 30 ℃에서 24 시간 동안 120 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 배양이 완료된 후 상기 배양액을 10,000×g로 원심분리하여 펠렛을 회수하고 이를 멸균수로 세척하였다. 그 후에 세포 농도를 1×10⁸ cells/ml로 조정하여 고정화에 사용하였다.

젤라틴을 이용하여 상기 인산 가용화 미생물을 고정화하기 위해 젤라틴 수용액을 제조하였다. 젤라틴 5, 10 및 15 g을 각각 물 100 ml에 첨가하여 열을 가하여 용해시킨 후 상기 젤라틴 용액의 온도를 35 내지 40 ℃로 조절한 다음 상기에서 제조한 세포 현탁액을 첨가하고 혼합하였다. 여기에 포름알데히드 20 %(v/v), 에탄올 50 %(v/v) 및 물 30 %(v/v)로 이루어진 경화액 2 ml를 첨가한 다음 즉시 교반하고 성형틀(mold)에 부어 넣은 후 4 ℃에서 18 시간 동안 방치함으로써 교차 결합 및 완전한 겔 형성이 촉진되도록 하였다. 그 다음 실온에서 약 3.5 mm의 입방체가 되도록 절단 한 후 멸균수로 충분히 세척하였다.

<비교예 1>

인산 가용화 미생물의 알지네이트를 이용한 고정화

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 판토에아 에그로머란스(Pantoea agglomerans)를 배양한 후 원심분리하여 수득한 세포 현탁액을 알지네이트 (alginate)를 이용하여 공지의 방법에 따라 고정화하였다(Woodward, J. Microbiol. Meth., 8, 91-102, 1988).

상기 실시예 1의 세포 현탁액 5 ml와 멸균한 후 냉각한 2.5, 3.5 및 5 % 소디움 알지네이트(sodium alginate) 용액 20 ml를 각각 혼합하였다. 그 다음 상기 혼합액을 0.5 M 염화 칼슘 용액 200 ml에 떨어뜨려 비드로 제형화 하였다. 상기 비드를 4 ℃에서 1시간 동안 경화시킨 다음 멸균수로 세척하였다.

<비교예 2>

인산 가용화 미생물의 아가를 이용한 고정화

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 판토에아 에그로머란스(Pantoea agglomerans)를 배양한 후 원심분리하여 수득한 세포 현탁액을 아가(agar)를 이용하여 공지의 방법에 따라 고정화하였다((Lopez et al., J. Microbiol. Meth., 30, 231-234, 1997).

상기 실시예 1의 세포 현탁액 5 ml와 40 ℃의 2.3 %(w/v) 또는 4 %(w/v) 아가(Bacto agar, Difco) 용액과 각각 혼합하였다. 상기 혼합액을 식용유 200 ml에 떨어뜨려 비드로 성형하고 이를 4 ℃에서 1시간 동안 방치한 후 멸균수로 세척하였다.

<실험예 1>

본 발명의 방법에 따라 고정화된 인산 가용화 미생물의 인산 가용화 정도 측정

상기 실시예 1에서 제조한 고정화된 인산 가용화 미생물의 인산 가용화 정도 를 비교예 1 및 비교예 2에서 제조한 고정화 미생물과 비교하였다.

먼저, Ca₃(PO₄)₂ 0.5 g이 첨가된 피코브스카야 배지(Pikovskaya, Microbiologiya, 17, 362-370, 1948) 100 ml를 250 ml 용량의 플라스크에 넣고 pH를 7.0으로 조절한 후 121 ℃에서 멸균하였다. 상기 플라스크에 상기 실시예에서 제조한 젤라틴 입방체 또는 비교예에서 제조한 비드를 각각 5개씩 접종하고 120 rpm으로 교반하면서 30 ℃에서 배양하였다. 접종 후 7일째에 시료를 채취하고 상기 시료를 원심분리(10,000×g)하여 상등액을 수득하였다. 상기에서 수득한 상등액을 0.45 ㎛의 필터를 통과시켜 여과액을 수득하고 상기 여과액을 사용하여 인산 농도를 결정하였다. 가용화 인산의 농도는 몰리브도-인산 블루 측정법(Murphy and Riley, 1962)에 의해 측정하고 이를 mg P/L로 나타내었다.

실험 결과, 젤라틴을 이용하여 고정화한 인산 가용화 미생물에 의해 가용화된 인산의 농도는 36.8 mg P/L로 나타났으며, 알지네이트와 아가를 이용하여 고정화한 인산 가용화 미생물에 의해 가용화된 인산의 농도는 각각 72 mg P/L 및 71.5 mg P/L로 나타났다.

본 발명에서 상기 실시예 1에서 사용된 젤라틴은 인산 가용화 미생물의 고정화에 처음으로 사용된 것으로, 상기 실험 결과에서 젤라틴으로 고정화한 경우 알지네이트나 아가와 마찬가지로 에 비해 인산가용화능이 있는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 젤라틴은 알지네이트나 아가에 비해 고정화 과정이 간단하고 가격면에서 더 저렴하기 때문에 젤라틴을 이용하여 인산가용화균을 고정화하여 더 나아가 비료로서 제제화하는데 충분한 가능성이 있음을 확인하였다.

본 발명에 따른 미생물 비료 조성물은 토양 정착 능력이 우수하여 매우 안정하며 불용성 인산염을 가용성 인산염으로 전환시킴으로써 식물의 인산 흡수 및 생육을 촉진할 수 있는 효능이 장기간 동안 유지되는 효과가 있다.

Claims (4)

1. 식물 재배용 비료조성물의 제조방법에 있어서,

   (a) 판토에아 에그로머란스(Pantoea agglomerans), 엔테로박터 에어로제네스(Enterobacter aerogenes), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.) 및 페니실리움 옥살리컴(Penicillium oxalicum CBPS-3F-Tsa) 중에서 선택된 인산 가용화 미생물을 배양한 후 배양액을 원심분리하여 세포를 수득하고 멸균수로 현탁하는 단계;

   (b) 물에 젤라틴을 첨가하고 가열하여 젤라틴 수용액을 제조하고 이를 35 내지 40℃로 냉각하는 단계;

   (c) 상기 (b) 단계의 젤라틴 수용액에 상기 (a) 단계의 세포 현탁액을 첨가하고 혼합하는 단계;

   (d) 상기 (c) 단계의 혼합액에 경화액을 첨가하고 교반하는 단계; 및

   (e) 상기 (d) 단계의 혼합액을 성형틀에 부은 후 1 내지 7℃에서 15 내지 20 시간 동안 방치하여 겔 형성을 유도한 후 실온에서 입방체가 되도록 절단하는 단계를 포함하는 젤라틴으로 고정화된 인산 가용화 미생물을 포함하는 식물재배용 비료 조성물의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서,

   비료조성물에 0.1 내지 1.0 mg d.w./ml of gel 또는 디스크(0.8×0.4cm) 당 5.0 내지 30 mg d.w의 양으로 미생물이 함유되어지도록 하는 것을 특징으로 하는 식물재배용 비료조성물의 제조방법.
3. 제 1항에 있어서,

   경화액은 포름알데히드 20%(v/v), 에탄올 50 %(v/v), 및 물 30 %(v/v)로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물재배용 비료조성물의 제조방법.
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