KR100909316B1 - 고세포밀도 발효를 수행하기 위한 유닛 및 방법 - Google Patents
고세포밀도 발효를 수행하기 위한 유닛 및 방법Info
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Abstract
본 발명은 생물학적 생성물을 효율적으로 생성시킬 목적으로 현탁된 동물 또는 식물 세포라인을 고세포밀도 배양하는 연속적 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 현탁된 동물 또는 식물 세포라인을 배양하는 본 발명에 따르는 방법을 수행할 수 있는 유닛 및 장치에 관한 것이다.
Description
본 발명은 생물학적 생성물을 효율적으로 생성시킬 목적으로 현탁된 동물 또는 식물 세포라인 (cell line)을 배양하는 연속적 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 현탁된 동물 또는 식물 세포라인을 배양하는 본 발명에 따르는 방법을 수행할 수 있는 유닛 및 장치에 관한 것이다.
세포 배양은 생물학적 활성물질 및 약제학적 활성생성물을 생산하는데 매우 중요하다. 특히, 빈번하게 사용되고 영양배지에 자유롭게 현탁되는 세포는 미생물이나 유착세포와는 달리 기계적 스트레스 및 기질의 불충분한 공급에 매우 민감하기 때문에, 이들의 배양은 어렵고 복잡하다. 이러한 이유로, 본 발명에 따르는 유닛 및 장치 및 사용된 기술적 방법은 효과적인 생산방법에 결정적으로 중요한 것이다.
현탁된 동물 또는 식물 세포라인을 배양하는 기술적 방법의 대부분에서는 배취(batch)방법이 사용된다. 이러한 방법은 세포수 및 영양배지와 대사산물의 농도가 수일 또는 수주일의 배취 사이클에 걸쳐서 연속적으로 변화하며, 사멸세포가 발효의 후기상에 축적되고 형성된 생성물이 효소적 또는 자발적 분해를 일으킨다는 단점을 갖는다. 따라서, 연속적 발효방법은 불안정한 활성화합물의 생산에 특히 추천할 수 있다.
발효조내에서 높은 세포밀도가 수득될 수 있고 상응하게 높은 생산성이 수득된다면, 연속적 방법이 경제적이며 경쟁력이 있다. 이 방법은 (1) 높은 세포밀도에서 세포의 높은 산소요구량을 충족시키기 위해 발효조내에서 산소의 충분한 공급, (2) 반응기 시스템내에서 세포의 효과적인 유지를 가능하게 하는 세포 유지 시스템 (cell retention system), (3) 정지상 조작조건 (세포, 기질, 대사산물 및 생성물 농도) 및 전체 반응기 시스템의 장기간 무균성 (sterility)에 관해서 더욱 신뢰성이 있는 장기간 조작, 및 (4) 확실하고 간단하며 용이하게 조정할 수 있는 방법이 필요하다.
이 방법은 또한, 기계적 스트레스에 대향한 세포의 높은 민감성 및 기질의 불충분한 공급 및 생성물의 불안정성을 반드시 고려하여야 한다.
선행기술은 세포라인을 배양하는 다수의 장치, 유닛 및 방법을 기술하고 있다. 다음과 같은 장치 및 유닛의 변형은 이미 공지되어 있다:
1. 발효조 (fermenters)
액체 표면상에서 기포의 형성, 상승 및 폭발은 세포에 높은 정도의 스트레스를 제공하기 때문에, 다공성 또는 확산막을 통한 산소의 무기포 (bubble-free) 공급이 세포배양 발효조를 위해서 빈번하게 선택되는 산소 공급방법이다. 이러한 목적으로 추천되는 교반기는 막 고정자 (membrane stator)내에 중앙에 배열된 비교적 작고, 고속이며 축방향으로 운반하는 교반기이다 (예를들어, Fenge, Fraune, Maier, 1992. BioTec, 4: 52-54). 이러한 반응기 디자인은 매우 높은 정도의 스트레스를 야기시키는 축방향으로 운반하는 고속 교반기, 및 비교적 저속 및 상응하게 낮은 산소 운반속도가 용기 벽과 교반기 사이에 위치하는 막상에서 일어난다는 사실 둘다로 인하여 불리하다.
비록 이 반응기 디자인에서 사용된 배플 (baffles)로 인하여 단지 비교적 작은 막 고정자 및 상응하게 작은 물질 이동 표면 (mass transfer surface)이 사용될 수 있지만, 산소 운반이 막의 전체 높이로부터 약간의 간격을 두고 그 높이 전체에 걸쳐서 배열된 대형 교반기에 의해서 증강시키는 반응기 디자인이 더욱 적합하다.
공정의 규모를 증가시키는 경우에 막 표면적과 반응기 용적 사이의 비는 반응기 직경에 반비례하는 방식으로 변화하기 때문에, 상기 언급한 산소 공급방법은 단지 소형 반응기 또는 더 낮은 세포밀도의 경우에만 적합하다.
또한, 큰-기포 통기를 이용한 산소의 공급 및 교반을 이용한 기포의 분산은 연루된 기계적 스트레스의 큰 정도로 인하여 세포 밀도 및 세포 배양물의 생존도를 제한한다.
2. 세포 유지 (cell retention)
과거에, 융통성이 있는 취급이 가능하도록 하기 위해서 발효조의 외부에 적절하게 배열된 다수의 상이한 세포 유지 시스템이 연속 발효방법을 위해서 제안되었다.
특히, 외부장치를 사용하는 경우에 세포에 대한 산소의 불충분한 공급 및 발효조 외부에서 CO2의 불충분한 제거의 결과로 나타나는 세포에 대한 손상을 최소화하기 위하여는, 작은 작업용적 (working volume) 및 세포 유지 시스템내에서 세포의 상응하게 짧은 체류시간을 갖는 세포 유지 시스템이 특히 바람직하다.
고정 및 이동성 막을 갖는 교차-유동 (cross-flow) 여과 유닛 및 막 필터 이외에도, 특별한 원심분리기 및 침강장치가 사용되었다.
그러나, 세포 체류가 막 필터를 사용하여 일어나는 경우에는 그의 확실한 저-유지 장기간 조작을 불가능하게 만드는 오염효과 (fouling effect)가 관찰된다. 오염의 감소는 막상에서 높은 유속에 의해서 수득될 수 있다. 그러나, 막 유닛의 펌프, 파이프라인 및 채널에서의 고속은 증가된 스트레스를 발생시키기 때문에, 고속의 필요성은 세포의 저전단 처리에 대한 필요성에 밀리게 된다.
원심분리를 이용한 세포의 제거를 위해서는, 그들의 제거를 위해서 중력 가속도의 가속도 보다 200배 이상 더 큰 가속도가 사용되기 때문에 세포에 증가된 기계적 스트레스를 부여하는 단점을 갖는 특별한 원심분리기가 개발되어 왔다. 또한, 원심분리기는 유지관리없이 수주일 또는 수개월에 걸쳐서 신뢰성이 있게 작동하지 않으며, 이들은 또한 증가된 작업비용을 야기시킨다.
세포 배양 상등액으로부터 세포를 제거하는 추가의 방법은 중력침강 유닛 (gravitational sedimentation units)를 사용하는 것이다. 세포 배양시에 유력하게 사용되는 중력침강 유닛는 침강탱크 및 사면채널 (slanting channel) 시스템이다. 단순한 침강용기에 비해서, 사면채널 시스템은 현저하게 더 작은 용적의 잇점을 갖는다.
지금까지 기술된 시스템 (J. Stevens, u.a.: Preprint Esact-Meeting 1993 Wurzburg; K.J. Thompson, J.S. Wilson: Preprint Esact-Meeting 1993 Wurzburg; J.A. Searles, u.a. Biotechnol. Prog. 1994, 10, 188-206; WO 94/26384)은 매우 작은 침강면적 (Ath=z b1 L cosα< 0.2 ㎡; z: 플레이트의 수; b1: 폭; L: 채널의 길이; α: 수평까지의 경사)을 갖는 역류 (counter current) 시스템이며, 따라서 생산 스케일로는 사용될 수 없다.
시설 규모의 확장 (scaling-up)는 역류 사면채널 시스템에서의 문제이다. 침강 분리기의 필요한 농축물 및 청정상 (clear phase) 수집챔버의 용적 VSF는 발효조 용적 V가 증가함에 따라서 지나치게 크게 증가하고 (일정 관류속도에서 VSF ∝V1.5), 관류속도 q/V가 증가함에 따라서 더 더욱 증가한다 (일정 발효조 용적에서 VSF ∝(q/V)2.15). 그러나, 세포의 배양을 위해서 제안된 대부분의 사면채널 시스템의 기하구조는 불리한 기하구조 (유입 및 유출 구역 및 채널 길이) 및 그 결과의 큰 작업용적으로 인해서 큰 스케일에서의 이들의 사용을 방해한다. 농축물 및 청정상 수집챔버 및 그안에 통합된 유입 및 유출 스트림 채널은 제안된 변형체내에서 불리하게 디자인된다. 100 내지 300 ㎜ 범위의 사용된 사면채널 시스템의 채널 길이는 상응하게 짧다. 가장 빈번하게 제안되는 채널 길이는 단지 100 ㎜이다. 그러나, 단지 작은 규모 (1 내지 25 ℓ의 발효조 용적을 가짐)상에서의 시험만이 수행되었기 때문에, 제안된 변형체의 특징은 이러한 시스템을 사용해야 하는 것으로 알려진 이들 소비자에게는 부정적인 것을 입증하지 못하였다.
반응기 용적의 ㎖당, 1.5×107 생존세포 (living cells) 이상의 세포농도를 사용한 고세포밀도 발효의 경우에, 통상적인 침강기 디자인이 사용된다면 100 내지 200 ℓ의 발효조 용적을 위해서 (비교적 빠르게 침강하는 BHK 세포를 사용하는 경우에 조차도) 70 내지 550 또는 50 내지 500 ℓ의 용적을 갖는 침강 분리기가 필요할 수 있다. 이러한 유닛에서는 침강 분리기내에서의 긴 유지시간 및 상응하게 불충분한 산소의 공급으로 인하여 μ≒ 0.4/d의 바람직한 성장율이 유지될 수 없었기 때문에, 반응기 용적의 ㎖당, 1.5×107 생존세포의 목적하는 세포밀도가 수득될 수 없었다.
문헌 (Bayer AG's bulletin, 1992, Chemie-Technik, 21(3), 118)에는 0.2 내지 2.5 m의 긴 사면채널 시스템에 대한 언급이 포함되어 있지만, 이 문헌은 작은 작업용적에 관한 필요조건을 충족시키지 않는 액체 분포 시스템 및 농축물 수집챔버를 기술하고 있다. 기술된 유닛에서는 매질이 (수용챔버 (32)내에서의 난류 (turbulence)를 감소시키기 위해서) 컵-모양의 장치에 주입된다는 사실로 인해서, 수용챔버 (32) 그 자체의 용적은 비교적 커야 한다. 실제로는, 컵-모양의 장치를 가지며 순수하게 원뿔형이거나 피라미드형의 기하학을 갖는 이러한 수용챔버를 조립하는 것은 불가능하다. 컵-모양의 장치를 수용챔버내에 배치시키기 위해서, 수용챔버는 반드시 원뿔형 또는 피라미드형 구역 이외에도 원통형 구역을 가져야 하며, 따라서 수용챔버의 용적은 증가한다. 상기 언급한 예에서, 침강 분리기의 작업용적은 본 발명의 분리기의 용적보다 훨씬 더 큰 Vs = 50 내지 100 ℓ이다.
2.1. 냉각
침강 분리기내에서 대사활성 및 세포 침착물 (deposit)을 감소시키기 위해서, 침강 분리기내의 세포 배양육즙의 냉각이 제안되었다. 그러나, 침강 분리기의 내부에서 온도 구배 (및 상응하는 밀도 구배)의 형성으로 인해서, 이러한 근본적으로 올바른 제안은 대류를 야기하지 않는다. 이들은 다시 세포분리의 유효성에 대하여 부정적인 영향을 갖는다. 이러한 유닛에서는 분리기 용적당, 단지 비교적 작은 용적상 처리량 만이 수득될 수 있기 때문에, 이것은 분리기 용적에 대한 분리기 표면적의 비가 비교적 작은 분리기가 사용되는 경우에 특히 결정적이다.
2.2. 진동
침강 분리기내에서 세포의 체류시간을 감소시키기 위해서는 사면채널 시스템의 비-규정된 진동이 제안되었다 (Bayer AG, 1992, Chemie-Technik, 21(3): 118; Searles, et al., 1994, Biotechnology Progress, 10: 188-206).
3. 접종 발효조
불충분한 출발 세포밀도는 알로몬 (allomones)의 결여로 인하여 세포의 지연된 성장을 유도하기 때문에, 발효방법의 효율적인 조작을 위해서는 발효조내에서 특정한 출발 세포밀도가 필요하다. (동물세포의 경우에, 출발 세포밀도는 ㎖당, 대략 106 세포이어야 한다.) 따라서, 생산 발효조의 크기에 따라서는 몇개의 전발효조가 필요하다. 세포의 배양을 위해서는 ㎖당, 5×106 내지 8×106 세포의 세포밀도가 수득될 수 있는 불연속적으로 작동된 발효조가 그들의 더 간단한 작동모드로 인하여 통상적으로 사용된다. 이것은, 예를들어 세포 보존물 (cell conserve)로부터 출발하여 200 ℓ 생산 발효조를 접종하는 경우에 다수의 T-플라스크 및 60개의 롤러병 (roller bottles)을 사용한 통상적인 시드-트레인 팽창 (seed-train expansion)이 필요할 수 있음을 의미한다.
4. 저전단 펌프 및 파이프라인
이 방법의 조작에는 저장탱크, 발효조, 외부 침강 분리기 및 수확용기를 서로 연결시키는 펌프 및 파이프라인이 필요하다. 공지의 문헌에는 펌프 및 파이프라인의 선택 및 디자인에 대한 상세한 사항이 제시되지 않았다. 그러나, 이 관점은 높은 세포농도 및 활력도 (vitality)에서 무균조건하에 장기간 배양하는데 매우 중요하다. 또한, 대체로 유닛내에서 펌프의 정확한 배열에 주의를 기울여야만 한다. 특허 WO94/26384에 기술된 바와 같이 발효조까지 이어지는 농축물 재순환 스트림에서 펌프의 배열은, 결과적으로 농축된 세포 현탁액 (즉, 다수의 세포)이 펌프내에서 매우 높은 기계적 스트레스에 노출되기 때문에 불리하다.
상기의 고려사항을 기초로하여, 생물학적 생성물을 경제적이며 고품질로 생성할 수 있는 전단-민감 세포를 발효시키는 유닛, 장치 및 효율적인 방법을 개발하고자 하는데 있어서 기술적인 문제가 야기되었다.
이 문제는 본 발명에 따라서 영양배지, 펌프 및 파이프라인을 함유하는 적어도 하나의 저장탱크, 생산 발효조, 적어도 두개의 관통류 (throughflow) 열교환기, 및 임의로 진동기 (5)가 장치된 세포 유지 침강 분리기로 구성된 발효 유닛에 의해서 해결된다. 높은 관류속도를 갖는 연속적 발효방법이 연관된 기술적 문제를 해결하는데 유리하다.
발명의 간단한 설명
공정 기구는 다수의 장치, 및 영양배지, 펌프 및 파이프라인 (7,8)을 함유하는 적어도 하나의 저장탱크 (1), 적어도 간헐적으로 연속적으로 관류되는 생산 발효조 (2), 적어도 두개의 관통류 열교환기 (3), 및 임의로 진동기가 장치된 세포 유지 침강 분리기 (4)로 구성되며, 이 유닛의 성분들은 배양된 세포가 낮은 정도의 기계적 스트레스에 적용되는 장기간 발효가 1개월 보다 더 긴 공정시간에 걸쳐서 수행될 수 있도록 하는 방식으로 디자인된다. 본 발명에 따르는 유닛의 도움을 받아서, 반응기 용적 ㎖당, 1.5×107 생존세포 이상의 세포밀도 및 80%, 바람직하게는 90% 이상의 생존도에서 3-5 개월에 걸친 장기간 안정성을 갖는 배양이 수득된다. 이와 관련하여, 생존도는 생존세포로 구성되는 배양물내에서 세포의 총수의 상대적 백분율로 정의된다.
그러나 세포밀도, 생존도 및 배양시간은 사용되는 유기체 및 발효공정의 형태에 따라서 더 낮거나/짧을 수 있다.
본 발명에 따르는 방법에서는 또한, 최대 충전용적이 생산 발효조 용적의 6% 미만이고, 그럼에도 불구하고 세포수에서 50 내지 150배 증가를 허용하는 특별히 고안된 배취식이고/이거나 연속적으로 조작되는 접종 발효조 (9)를 사용할 수도 있다.
본 발명의 도움으로, 분해하기 쉬운 민감성 세포 및 생성물을 사용함에도 불구하고 공정의 고생산성이 수득된다.
이하에서는, 본 발명의 실시예를 개략적인 도면의 도움을 받아서 더욱 상세히 기술하고 있다.
도 1은 기질 저장탱크 (1), 펌프 (8), 파이프라인 (7), 생산 발효조 (2), 관통류 열교환기 (3), 진동기 (5) 및 수확용기 (6)를 갖는 세포 유지 시스템 (4), 전배양 발효조 (9) 및 저장배양물 튜브 (10)로 이루어진 공정의 기구를 나타낸다.
도 2는 펌프, 관통류 열교환기, 사이클론 또는 초음파 분리 시스템 및 매스의 중앙에 장착되고 진동기 및 하류에 배열된 침강 탱크를 갖는 세포 유지 시스템으로 이루어진 공정 기구의 일부분을 나타낸다.
도 3은 앵커 교반기 및 실리콘 튜브 통기를 위한 통기 케이지 (aeration cage)를 포함하는 타입 A의 교반된 발효조이다.
도 4는 큰-면적 블레이드 교반기, 교반기에 근접한 액침된 경사진 배플 및 기부에 근접하여 배열된 마이크로스파저를 포함하는 타입 B의 교반된 발효조이다.
도 5는 편심성 방식으로 배열된 큰-면적 블레이드 교반기 및 기부에 근접하여 배열된 마이크로스파저를 포함하는 타입 C의 교반된 발효조이다.
도 6은 접종 발효조이다.
도 7은 평행으로 배열된 튜브 및 원뿔형 수용챔버내로의 방사상 유입을 갖는 역류 침강 분리기이다.
도 8은 평행으로 배열된 채널 및 원뿔형 수용챔버내로의 방사상 유입을 갖는 역류 침강 분리기이다.
도 9는 평행으로 배열된 채널 및 원뿔형 수용챔버의 외부상에 배열된 링 챔버 (40)내에서 동일한 방향으로 접선 유입을 갖는 역류 침강 분리기이다.
도 10은 평행으로 배열된 채널 및 원뿔형 수용챔버내로의 반대 방향의 접선 유입을 갖는 역류 침강 분리기이다.
도 11은 평행으로 배열된 채널 및 원뿔형 수용챔버내로의 두개의 별개의 반대로 지향된 접선 유입 스트림을 갖는 역류 침강 분리기이다.
도 12는 평행으로 배열된 채널 및 피라미드형 수용챔버내로의 두개의 별개의 반대로 지향된 접선 유입 스트림을 갖는 역류 침강 분리기이다.
도 13은 평행으로 배열된 채널 및 발효조로부터의 유입을 위한 유입구 (45) 및 채널의 양면상에 배열된 청정상 배출구 (46) 및 채널 아래의 피라미드형 수용챔버를 갖는 교차-유동 침강 분리기이다.
도 14는 평행으로 배열된 채널 및 발효조로부터의 유입을 위한 유입구 (48) 및 채널의 양면상에 배열된 청정상 배출구 (46) 및 채널 아래의 원뿔형 또는 피라미드형 수용챔버 (44)를 갖는 교차-유동 침강 분리기이다. 플레이트 (49)는 유입 채널 (48) 및 유출 채널 (48)에 근접하여 배열되며, 바람직하게는 유입 및 유출 채널에 대해 수직으로 장착된다.
도 15는 침강 분리기의 기하학을 나타낸 것이다.
본 발명은 유닛의 다양한 지점에서 유리한 변형으로 선행기술과는 상이한 발효 유닛에 관한 것이다. 유리한 변형체는 또한 분리에 있어서의 그들의 유리한 효과를 나타낼 수 있는 반면에, 바람직한 변형체는 본 발명에 따르는 유닛의 몇가지 또는 모든 유리한 특징이 상호작용하는 것이다. 따라서, 주발효조의 증가된 산소 이동용량이 예를들어, 침강 분리기내에서 더욱 효과적인 세포 재순환으로 인하여 배양물에서 더 큰 세포밀도가 수득되기 때문에 특히 효과적이다. 발효방법의 총괄 생산성을 증가시키는 유사한 상승적 효과는 또한, 본 발명에 따르는 유닛의 다른 성분의 상호작용에 의해서도 수득된다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따르는 유닛에서 고세포밀도 발효방법을 수행하기 위한 유리한 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르는 방법은 본 발명에 따르는 발효 유닛의 변형체의 긍정적 효과를 효과적으로 이용할 수 있다.
이하에서는 발효 유닛의 유리한 변형체를 기술한다:
1. 생산 발효조 (production fermenter)
생산 발효조 (2)는 교반에 관한 그의 최적 디자인으로 인해서 가스/액체상 계면에서 물질 이동의 높은 속도 및 최소 전단 스트레스를 나타낸다.
상기 언급된 효과를 나타내는 3가지 다양한 발효조 타입이 개발되었다.
발효조 타입 A (도 3)의 경우에, 산소 공급은 확산막을 통해서 일어난다. 작은 벽 두께를 갖는 사용된 실리콘 튜브 막은 동심원상으로 교반기를 둘러싸는 튜브 고정자상에 축방향으로 권취된다 (14). 발효조 및 튜브 고정자가 슬렌더 방식 (slender fashion)으로 디자인되는 것이 더 큰 용적-특이적 물질 이동 표면 (A/V [m-1])이 수득될 수 있기 때문에 유리하다. 교반기는 실리콘 튜브로부터 작은 간격, 바람직하게는 5 내지 15 ㎜의 간격을 두고 떨어져 있고, 그의 교반기 블레이드 (blade)는 튜브 고정자의 전체 길이에 걸쳐서 연장되는 큰 면적의 멀티블레이드 앵커 (multiblade anchor) 교반기 (13)이다. 발효조 용적 ㎥당, 10 또는 20 왓트 미만의 교반기 동력 및 낮은 교반기 회전속도에서도 이 디자인 타입은 실리콘 튜브의 약간의 진동을 나타내어 작동중에 물질 이동 및 동시에 막의 세정의 추가의 증강이 일어난다.
세포의 만족스러운 현탁을 위해서, 사용된 교반기는 이들이 용기의 기부 (base)에 근접한 부분에 까지 연장될 수 있도록 본 발명에 따르는 방식으로 변형된다. 이것은 기부 (13a)에 근접한 부분에서 교반기 블레이드를 테이퍼링 (tapering)함으로써 이루어질 수 있다.
타입 A에 따르는 발효조는 어떠한 배플도 함유하지 않는다. 그 결과, 튜브 고정자는 매우 클 수 있으며, A/V > 10/D (A: 물질 이동 면적; V: 발효조 용적; D: 용기 직경)의 물질 이동 비표면적이 가능하다. 따라서, 특히 낮은 전단도가 나타나는 d/D > 0.6 (d: 교반기의 외부 직경)의 큰 교반기가 사용될 수 있다.
배플을 함유하는 시스템과는 달리 여전히 우세한 주변 운동은 놀랍게도 물질 이동의 추가의 증강 및 기포에 의한 추가의 통기를 나타낸다. 가스 기포는 소정의 기포 크기에서 발효조내에서 더 큰 가스 함량 및 이에 따라 더 큰 상 계면을 나타내는 접선운동 (tangential movement)이 일어난다.
실리콘 튜브 고정자 이외에도 통기 링 (aeration ring) (17)이 추가의 기포 통기를 위해서 발효조의 기부에 추가로 통합될 수 있다. 이렇게 하여 산소의 추가의 이동 및 CO2 제거의 필요할 수 있는 증강이 일어난다.
실리콘 튜브내에서 순수한 산소 및 과도한 압력이 사용되는 경우에 발효조 타입 A에 의해서 ㎖당, 2×107 세포 까지의 매우 높은 세포밀도가 수득될 수 있다.
발효조 타입 B (도 4)의 경우에, 산소 공급은 단지 산소에 의한 미세기포 통기를 통해서만 일어난다.
미세기포 통기는 특별한 소결체, 필터 플레이트, 세라믹 막 또는 dL < 15 ㎛의 매우 작은 크기의 공극 또는 홀 (hole)을 갖는 레이저-천공된 플레이트 (laser-perforated plate) (20)를 사용하여 수득된다. 사용될 수 있는 v < 0.5 m/h의 낮은 표면 가스속도로 인하여, 저속 교반기로 중등도로 교반하는 중에 단지 약간의 유합(coalescence) 경향을 나타내는 매우 작은 가스 기포가 형성된다. 따라서, 고세포밀도 발효의 산소 요구량은 기계적으로 천공된 홀 (dL > 0.2 ㎜)을 통한 큰-기포 통기에 필요한 표면 가스속도의 1/10 미만으로 수득될 수 있어서 세포의 성장은 통기과정에 의해서 악영향을 받지 않는다.
또한, 본 발명에 따라 교반을 위해서는 d/D > 0.5, 바람직하게는 d/D > 0.6의 외부 교반기 직경 대 내부 용기 직경의 비를 갖는 큰 저속 다단계 블레이드 교반기 (18)이 사용되는데, 이는 놀랍게도 고속, 특히 축방향으로 이송하는 고속 교반기는 가스 기포의 유합을 야기시키기 때문이다. 이들 큰 교반기는 미세 가스 기포의 비-유합성 저전단 분포를 만든다. 동시에, 기부에 근접하여 연장되는 교반기 및 용기 기부로부터 얼마간 떨어져 있는 배플은 기부에서 발생된 접선운동으로 인해서 P/V < 5 W/㎥의 매우 낮은 교반기 동력에서 조차도 바이오매스 (biomass)의 현탁 및 균일한 분포를 발생시킨다.
배플 (19)은 방사상으로가 아닌, 경사진 방식으로 통합되며, 그 결과로 40% 더 큰 물질 이동 효율 (용적-특이적 교반기 동력 당, 물질 유량) 및 세포상에서 스트레스의 상응하는 추가의 감소가 수득된다.
배플 (19)은 벽 위에 위치하지 않으며, 기부로부터 얼마간 떨어져 있을 뿐 아니라 액체의 표면에 까지 연장하지도 않고, 따라서 액체에 의해서 상부가 덮히기 때문에, 실질적으로 침착을 피할 수 있다. 이것은 동일계(in situ) (CIP: "cleaning-in-place") 세정을 위한 중요한 선행 필요조건을 생성해 준다.
발효조 타입 C (도 5)의 경우에, 산소 공급은 (타입 B의 경우에서와 같이) 미세기포 산소 통기를 통해서 일어난다. 타입 B와는 달리, 편심성으로 배열된 다단계 블레이드 교반기 (21)를 갖는 무-배플 (baffle-free) 반응기가 사용된다.
교반기 (21)의 편심성 배열은 축방향 혼합을 증강시키지만, 배플, 특히 벽 배플을 사용한 경우에서와 같이 주변 유동 성분을 완전히 억제하지는 않는다. 상기에서 이미 언급한 바와 같이, 여전히 우세한 주변 운동은 놀랍게도 가스/액체상 계면에서 물질 이동을 증강시킨다. 가스 기포는 소정의 기포 크기에서 높은 가스 함량 및 상응하게 큰 상 계면을 발생시키는 접선운동을 일으킨다.
본 발명에 따르는 교반기의 편심성 배열은 실질적으로 세포 침착을 방지하며, 발효조의 CIP 세정을 위한 이상적인 선행 필요조건을 야기시킨다.
본 발명에 따라 순수한 산소를 사용한 경우에, > 90%의 생존도에서 발효조 타입 B 및 C에 의해서 ㎖당, 5×107 생존세포의 세포 밀도가 수득될 수 있다.
2. 접종 발효조 (inoculation fermenter)
발효공정을 단순화시키기 위해서, 생산 발효조에 대한 시드의 양은 단일-단계 전배양으로 생산된다. 이것은 어떠한 추가의 배양단계도 없이 저장배양물 튜브를 사용하여 직접 접종된다. 그러나, 접종 발효조 (9)내에서 필요한 세포수의 50- 내지 150-배 증가를 수득하기 위해서는 특별한 타입의 발효조 기하 구조 및 특별한 타입의 전배양이 필요하다. 특히, 배양물은 영양배지를 첨가함으로써 전배양 단계 중에 크기가 증가하는 작은 작업용적에서 접종하는 것이 필요하다.
동물세포의 효과적인 배양을 위해서는 ㎖당, 105 세포 이상 (바람직하게는 ㎖당, > 5×105 내지 106 세포)의 세포 농도가 필요하기 때문에, 특별한 발효조 기하 구조가 필요하였다. 세포 농도가 더 낮으면, 빠른 성장을 위해서 필요한 대사산물 및 알로몬은 필요한 높은 성장속도가 수득되도록 하기에는 너무 낮은 농도로 존재한다.
본 발명에 따라, 발효조 (도 6)는 하향으로 테이퍼링된 단면을 갖는다. 한가지 특별한 변형체는 하부 (27a) 및 상부 (27b) 구역 둘다에서 원통형 형태를 갖는 것이며, 하부 구역이 더 작은 직경을 갖는다. 따라서, 하부 구역은 총 용적의 약 1/6 만을 보유한다. 특별한 형태의 전이성 피팅 (transition fitting)이 용기의 하부 구역을 상부 구역에 연결시킨다.
본 발명에 따르는 그밖의 다른 반응기는 하향으로 테이퍼링된 원뿔형 형태를 갖는다.
몇개의 큰-면적 블레이드 교반기 (23, 23a) 및 교반기에 인접한 액침된 배플로 구성된 다단계 교반 시스템이 교반을 위해서 사용된다. 통기는 용기의 기부에 근접하게 배열된 마이크로스파저 (microspargers)를 통해서 일어난다. 본 발명에 따라 교반기 시스템은 반응기의 각각의 단면에 도입된 동력이 미소기포 (microbubbles)의 균일한 분포 및 세포의 이동에 충분하도록 하는 방식으로 디자인된다. 이러한 목적으로, 가변성 반응기 단면에 따라서 가변성 직경 및 블레이드 높이 및 각각으로부터의 가변적 간격을 갖는 블레이드 교반기가 사용된다.
배플을 사용하는 반응기 시스템에 대한 대용으로, 배플이 없고 편심성으로 배열된 교반기 시스템 (23)이 있는 반응기 시스템이 사용된다.
전배양조 (9)에서의 배양은 세포 유지가 있거나 없는 상태로 배취식, 유가 배양식 및 연속적 관류방법으로 계속해서 조작될 수 있다. 연속적 전배양 조작이 배취식 발효방법에서 보다 3-4배 더 큰 세포 밀도를 수득하고, 생산 발효조를 위한 접종물질이 장기간에 걸쳐서 제공될 수 있어 후속 생산공정의 빠른 시동이 일어날 수 있기 때문에 특히 유리하다.
전배양 공정의 연속적 조작시에는 생산 배양시의 경우와 유사한 기술적 방법이 사용된다. 공정 기구는 다시 다수의 장치 및 최소한 영양배지, 펌프 및 파이프라인을 함유하는 저장탱크, 그 다음에 연속적으로 관류되는 접종 발효조 (9), 관통류 열교환기, 및 진동기를 갖거나 갖지 않는 세포 유지 시스템으로 구성되며, 여기에서 모든 공정 성분은 반응기 용적의 ㎖당, 107 생존세포 이상의 세포밀도 및 90% 이상의 생존도를 갖는 저전단 배양이 성취될 수 있도록 하는 방식으로 디자인된다.
3. 침강 분리기 (sedimentation separator)
공정을 위해서 개발된 외부 침강 분리기 (4)의 특징은 소정의 유효 분리기 표면적에 대한 최소 용적이며, 그 결과로 발효조 외부에서 세포의 체류시간 및 상응하는 불충분한 산소의 공급이 최소로 감소될 수 있다.
본 발명에 따르는 발효 유닛에서 사용된 침강 분리기는 직사각형 단면을 가지며 평행으로 배열된 튜브 또는 채널을 함유한다. 본 발명에 따르는 장치는 바람직하게는 10 ㎜ 또는 그 미만의 튜브 직경 또는 채널 높이, 약 0.2 내지 2.5 m 또는 약 0.2 내지 1.5 m의 길이, 및 수평에 대하여 α= 40-65°의 경사각을 갖는다.
직사각형 단면을 갖는 평행 채널을 갖는 분리기의 경우에, 장치는 압력-안정성 직사각형 모듈 (module) (29)로 구성되며, 이것은 그 아래 배열된 농축물 귀환용기 (concentrate return vessel) (32, 44)에, 및 용착되어 있는 플랜지 (flange)를 통해서 피복 플레이트 (covering plate)에 나사로 고정된다. 직사각형 모듈 (29)은 그루브 (grooves)를 함유하는데, 이 그루브는 채널 높이를 결정하며, 일정한 간격을 두고 양면상에 서로 반대로 배열되고, 그 안에 본 발명에 따라 각각의 채널에 대한 경계를 형성하는 플레이트가 삽입된다. 모듈의 단면은 바람직하게는 높이-대-폭 비 (a/b1)가 모듈의 경사각의 사인 (sine)에 상응하는 직사각형이다 (도 15). 이것은 모듈 아래의 농축물 귀환용기의 표면적 및 용적이 가능한 한 작도록 만든다.
모듈은 물질의 고체 블럭으로부터 스탬프되거나, 전제작된 U-형 절편으로부터 또는 4개의 플레이트로부터 이음새 없이 함께 용접된다.
다양한 구조요소는 O-링 밀봉부 (O-ring seals)의 도움을 받아서 장기간 무균성이 보장될 수 있도록 하는 방식으로 함께 나사로 고정된다.
본 발명에 따르는 유닛에서 사용된 침강 분리기는 이들이 용이하게 세정되고 유지될 수 있도록 하는 방식으로 해체될 수 있다. 직사각형 단면을 갖는 평행 채널을 갖는 분리기가 연관되는 한은, 이것은 또한 채널을 형성하는 플레이트 (30)에 적용된다. 이들은 피복 플레이트의 나사를 푼 후에 분리될 수 있으며, 필요에 따라 외부적으로 세정할 수 있다.
본 발명에 따라, 큰 침강 분리기에서 모듈은 전체 장치의 매스 (mass)의 중앙에 회전가능한 방식으로 (4a) 장착됨으로써 플레이트는 용이하게 수평 위치에서 분리될 수 있고, 모듈의 그루브내로 재삽입될 수 있다.
발효조의 외부에서 세포의 체류시간을 감소시키기 위해서, 침강 분리기의 상향으로 면한 표면은 고도의 표면 평활도 (smoothness)를 갖도록, 바람직하게는 ISO 3274 및 ASME B46.1-1995.에 해당하는 DIN 4768에 의해서 정의되는 것으로 Ra < 0.25 ㎛의 표면 조도 (roughness)를 갖도록 제작된다. 대용으로, 소수적으로 피복된 표면 및 로투스 플라워 효과 (lotus flower effect)를 갖는 표면이 적합한 것으로 입증되었다.
로투스 플라워 효과는 잘 규정된 표면구조 (조도), 및 예를들어, 로투스 플라워에서와 같은 특정의 식물에서 관찰되는 것과 같은 해당 물질의 특성의 적합한 조합으로 인한 특정 표면의 오염-기피 효과인 것으로 이해된다. 적합한 물질로 제조된 현미경적으로 작은 마디 (knobs)를 갖는 표면구조가 예를들어, 로투스 플라워 효과의 원인이 되는 것으로 생각된다. 사용된 적합한 물질은 주로 소수성 물질이다.
3.1. 역류 침강 분리기 (countercurrent sedimentation separator)
역류 침강 분리기 (도 8 내지 12)는 3개의 부분으로 구성된다: 채널을 함유하는 모듈 (31), 농축물 귀환용기 (32) 및 피복 플레이트 (29).
발효조 (2)에서 유출된 현탁액은 경사진 채널의 아래에서 원뿔형 또는 피라미드형 컨테이너 (32)내로 도입되며, 채널 (38) 상부에서 투명한 상이 분리된다.
농축물에 대한 재순환 배출구는 수용챔버내에 그의 최하점에서 중앙에 통합되어 (36), 하향으로 플레이트를 미끄러져 나오는 세포 응집체는 수용챔버내에 수집되고 발효조내로 재순환될 수 있다. 역류 침강 분리기의 수용챔버 (32)내에서 정화될 세포 현탁액의 유입 및 채널내에 형성된 분리된 세포 응집체의 귀환이 둘다 일어나기 때문에, 그리고 본 발명에 따라 이 용기의 용적은 최소화되어야 하기 때문에, 용기 및 유입 파이프라인의 유동 특징은 바람직한 방식으로 디자인되어야 한다. 특히, 큰 장치의 사용을 위해서 규모를 증대시키는 경우에는, 유입 스트림에 의한 (예를들어, 난류의 발생으로 인한) 속도에 있어서의 요동의 어떠한 추가의 촉진도 피해야만 한다. 단지 이러한 방식으로, 수용챔버내에서 분리된 응집체의 대부분이 재현탁되어 채널 (31)내로 재도입되지 않는 것이 보장될 수 있다. 이러한 현상을 나타내는 바람직하지 않게 디자인된 장치는 세포 생존도의 80% 이하로의 감소를 야기시킨다.
유체 역학에 관한 기본적 고려사항을 기초로 하여, 수용용기에 적절한 것으로 보이는 디자인 원리가 선택되고, CFD (전산유체역학 (computational fluid dynamics)) 계산 및 특별한 실험적 시험을 이용하여 더 최적화되었다. 따라서, 다음의 디자인 원리가 본 발명에 따라 개발되었다:
● 수용챔버내에서 잠재적인 순환운동을 피하기 위해서 유입채널 (34)의 대칭적 배열;
● 유입 스트림 속도가 0.1 m/s가 되는 것을 보장하기 위해서 큰 유입단면의 사용;
● 저난류로 속도의 감소를 발생시키는 작은 정점각 (small apex angle)을 갖는 유입 확산기의 사용;
● 4° 미만 또는 대용으로 6° 미만의 원뿔각 (cone angle)을 갖는 원뿔형 확산기의 사용, 및 편평 확산기 (flat diffusors)가 사용되는 경우에는 0.1 미만의 원주로 나눈 단면적의 종방향 차등 (longitudinal differential) (1/P dA/ds) (P: 원주 [㎝]; A 면적 [㎠]; s: 길이 좌표 [㎝])의 사용;
● 두개의 방사상의, 바람직하게는 접선의 유입 스트림의 사용.
수용챔버의 중앙에서 단지 하나의 유지 점유동을 발생시키는 두개의 직접적으로 반대되는 유입 스트림 (35)를 갖는 방사상 유입 스트림 변형체 (도 8)의 경우에, 유입 스트림의 도입점은 채널 및 농축물 재순환 배출구로부터 뚜렷한 간격을 두고 배열된다. 간격은 바람직하게는 체널 높이의 15배 이상, 또는 바람직하게는 농축물 재순환 배출구의 10배 이상이다. 유입은 수용챔버의 기부 위쪽으로 수용챔버의 전체 높이의 반보다 크고 0.8배 보다 더 작은 기하학적 높이에서 일어난다.
유입 스트림이 접선상으로 배열된 유입 스트림 변형체는 동일하거나 (도 9; 도 11) 또는 반대방향 (도 10; 도 12)으로 유입 스트림이 배열되는 것을 특징으로 한다.
접선 유입 스트림 및 원뿔형 수용챔버의 경우에, 유입은 바람직하게는 용기의 외부에 배열된 링 채널 (ring channel) (도 9에서 40)내에서 일어날 수 있다.
3.2. 교차-유동 (cross-flow) 침강 분리기
교차-유동 침강 분리기의 경우에, 채널은 본 발명에 따라 직사각형 채널로서 디자인된다. 장치는 채널, 피복 플레이트 및 농축물 귀환용기를 포함하는 모듈로 구성된다. 모듈내에서 발효조로부터의 유입 스트림은 채널의 한 면에 배열되고, 반대면상에는 청정상 배출구가 배열된다. 내부에는 액체 분포의 개선을 위해서 유입 및 유출 챔버 플레이트 (49)가 짜 넣어질 수 있다. 플레이트는 편평 플레이트이거나 형태를 가질 수 있다. 플레이트는 바람직하게는 유입 및 유출 채널에 근접하여, 바람직하게는 수직으로 배열된다. 채널 전체에 걸쳐서 액체의 균일한 분포가 보장되도록 하기 위해서는, 유입은 채널의 상류 또는 하류의 챔버내에서 원형 또는 편평 유입 확산기를 통해서 일어난다. 본 발명에 따라, 이들 유동 부분은 특별한 유체역학 시험을 사용하여, 비-탈착된 층류 (non-detached laminar flow)가 0.1 m/s 미만의 속도 수득되고 평행으로 배열된 채널상에서 균일한 분포가 일어나도록 하는 방식으로 디자인된다.
유입채널로부터의 배지의 유입 이외에도, 일정량의 발효육즙을 원뿔형 또는 피라미드형 수용챔버 (44)에 직접적으로 공급하는 것이 유리할 수도 있다. 이 과정은 원뿔형 또는 피라미드형 수용챔버 (44)내에서 세포의 체류시간을 감소시킨다.
경사진 채널 아래에 원뿔형 또는 피라미드형 용기가 배치되며, 여기에는 농축물 재순환 배출구가 최하점에서 중앙에 통합된다.
교차-유동 분리기는 다음과 같은 유리한 특성을 갖는다:
● 세포의 분리 및 재순환은 역류 시스템의 경우에서와 같이 역류 유동에 의해서 방해를 받지 않는다.
● 하강하는 농축물의 공동지향적 유동 (codirectional flow)은 플레이트상에서 세포의 하향 슬라이드 (slide)를 촉진시킨다. 이것은 특히 청정상 스트림에 대한 농축물 귀환 스트림의 비 qR/q가 2보다 큰 경우이다.
● 동일한 채널 단면의 경우에, 농축물 수집용기는 역류 분리기의 경우에서 보다 더 작을 수 있는데, 이는 교차-유동 분리기 디자인에 따르면 유입은 농축물 수집용기내에서 일어나지 않기 때문이다.
● 분리 채널의 상부의 수용챔버 및 그의 하류의 유출챔버는 공정의 규모를 증대시키는 경우에 그들의 용적이 분리기 면적이 증가함에 따라서 지나치게 크게 증가하지 않도록 하는 크기를 가질 수 있으며, 이것은 역류 분리기와 비교하여 교차-유동 분리기의 결정적인 잇점을 나타낸다.
● 이러한 분리기 타입에서, 채널 길이는 역류 침강 분리기내에서 보다 저 작을 수 있다. 더 작은 채널 길이, 역류 유동의 부재 및 세포의 하향 슬라이드를 촉진시키는 귀환 스트림은 분리기내에서 세포의 체류시간을 감소시킨다.
따라서, 교차-유동 분리기는 극도로 높은 세포밀도의 경우에 바람직하게 사용된다.
4. 진동 (vibration)
세포의 재순환을 촉진시키고 채널의 오염을 방지하기 위해서는 공기에 의해서 또는 전기적으로 작동되는 진동기가 사용될 수 있다. 이들은 바람직하게는 농축물 귀환용기의 상부에 또는 플랜지상에 고정된다.
진동 강도, 진폭 및 주파수는 조작 및 배양조건 및 관련된 세포 유지시스템에 적합하도록 조정된다. 진동 강도는 바람직하게는 0.1 내지 0.3 g이며, 진폭은 0.1 내지 1 ㎜이고, 주파수는 20 내지 50 Hz이다.
5. 사이클론 (cyclone), 초음파 분리 시스템 및 제 2 침강장치의 사용
침강 분리기내에서 분리시킬 세포 매스의 예비 분리 및 감소를 위해서는, 사이클론 또는 초음파 분리 시스템을 침강 분리기의 상류에 배열하는 것을 추천할 수 있다. 이러한 사이클론은 세포량의 50% 까지를 더구나 더 낮은 유입속도에서, 즉 세포상에서 더 낮은 정도의 스트레스에서 분리시킬 수 있다. 유사한 효과는 기술적으로 유리한 관류속도에서 부분적 분리를 가능하게 하는 시판품으로 이용할 수 있는 초음파 분리 시스템 (예를들어 Biosep; Applikon, Schiedam, the Netherlands)에 의해서 수득될 수 있다.
더 낮은 세포 농도로 인하여 개선된 세포 재순환 및 더 큰 관류속도가 침강 분리기내에서의 후속 세포 분리공정에서 수득된다. 따라서, 발효조는 더 큰 세포밀도에서 작동시키고, 공정의 생산성을 증가시킬 수 있다.
침강 분리기의 상류 또는 바람직하게는 하류의 더 작은 침강장치에 의한 더 큰 세포 응집체의 분리는 유사하게 긍정적인 효과를 갖는다. 더 큰 응집체는 기질의 불충분한 공급 (제한된 확산)으로 인하여 백분율-방식 (percentage-wise)으로 더 큰 수의 사멸세포를 내포하기 때문에, 이들 사멸세포는 생존세포 보다 더 큰 정도로 제거되고, 총 세포수는 감소하며, 활력도는 증가한다.
6. 펌프, 파이프라인 및 열교환기
발효공정의 연속적 조작을 위해서는 3개의 펌프가 필요하다. 첫번째 펌프는 발효조내로 기질을 도입시키기 위한 것이며, 두번째 펌프는 발효조로부터의 세포 현탁액을 침강 분리기로 이송하기 위한 것이고, 세번째 펌프는 분리기로부 수확용기에 이송하기 위한 것이다. 저전단 펌프는 세포 활력도에서의 감소는 일어나지 않도록 세포 현탁액을 이송하는 두개의 펌프, 특히 펌프 2에 대해서 사용되어야 한다. 본 발명에 따라, 낮은 정도의 파동 (pulsation)으로 현탁액을 이송하는 저속 양성-전위 (positive-displacement) 펌프가 사용된다. 0.01 N/㎡ 미만 또는 0.004 N/㎡ 미만의 입자 스트레스 (particle stress)를 야기시키는, 큰 펌프 튜브를 갖는 호스 펌프 및 그밖의 다른 무-밀봉 (seal-free) 양성-전위 펌프가 장기간 무균조작에 적합한 것으로 입증되었다.
작은 체류시간에서 효과적인 가열을 가능하게 하는 나선형 (spiral) 열교환기는 세포 현탁액을 분리기에 도입시키기 전에 발효조 온도 보다 낮은 온도로 세포 현탁액을 냉각시키고, 발효조에 재순환시키는 중에는 발효조 온도로 가열하기 위해서 사용된다.
파이프라인 및 장치에 대한 연결 피팅은 단지 세포의 침착 한계 (deposition limit) 이상의 낮은 유동 속도만이 파이프라인내에서 우세하고, 파이프내에서의 벤드 (bend)가 최소로 감소하고, 단지 점진적인 단면 확장만이 일어나도록 하는 방식으로 디자인된다. 파이프 직경에 대한 곡률 반경 (curvature radius)의 비가 > 2인 엘보우 피팅 (elbow fittings)이 바람직하게 사용된다. 단면 확장은 6° 이하, 바람직하게는 4° 이하의 반원뿔각 (semi-cone angle)을 갖는 확산기 (diffusor)로 이루어진다. 단면의 감소 및 상응하는 유동의 가속화는 유동의 가속화의 결과로 나타나는 관성력 (force of inertia)이 작게 유지되도록 제한되어야 한다.
본 발명은 전배양 발효조 (9), 기질 저장탱크 (1), 생산 발효조 (2), 침강 분리기 (4) 및 수확용기 (6)를 함유하며, 여기에서 침강 분리기는 분리기 용적을 기준으로 하여 Ath/Vs > 30 ㎡/㎥, 더욱 바람직하게는 Ath/Vs
> 70 ㎡/㎥의 분리기 면적을 갖는 연속적 고세포밀도 발효를 수행하기 위한 유닛에 관한 것이다. 더 더욱 바람직한 것은 분리기 용적을 기준으로 한 분리기 표면적이 Ath/Vs = 50 내지 100 ㎡/㎥인 것이다. 바람직하게는 침강 분리기는 역류 침강 분리기이다. 바람직한 구체예에서, 분리기는 Ath = 0.5 ㎡ 내지 10 ㎡의 절대 표면적을 갖지만, 상술한 바와 같은 더 높은 Ath/Vs 를 가진다.
본 발명은 또한, 전배양 발효조 (9), 기질 저장탱크 (1), 생산 발효조 (2), 침강 분리기 (4) 및 수확용기 (6)를 함유하며, 여기에서 침강 분리기는 원뿔형 (32) 또는 피라미드형 수용챔버 (43)를 가지고, 침강 분리기의 수용챔버내로의 유입은 방사상으로 (35), 동일한 방향으로 접선상으로 (39, 42), 또는 반대 방향으로 접선상으로 (41, 43) 배열된 적어도 두개의 도관 (conduits)을 통해서 일어나고, 도관은 단면상에 규칙적인 방식으로 분포되는, 연속적 고세포밀도 발효를 수행하기 위한 유닛에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 침강 분리기내로의 유입이 수용챔버 외부에 배열된 링 채널 (40)에서 동일 방향으로 접선상으로 배열된 도관을 통해서 일어나는 상기 언급한 유닛에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 침강 분리기내로의 유입이 최대 6°, 더욱 바람직하게는 4°의 반원뿔각을 갖는 원형 확산기 (35)를 통해서, 또는 0.1 또는 그 미만의 원주-관련된 단면적의 종방향 차등을 갖는 편평 확산기 (39)를 통해서 최대 0.1 m/s의 속도에서 일어나는 고세포밀도 발효용 유닛에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 발효조로부터의 유입을 위한 유입구 (45, 48) 및 청정상을 위한 배출구 (46)가 침강채널의 양 면상에 배열되고 농축물 회수챔버 (44)는 침강채널 아래에 대칭적으로 배열된 피라미드형 또는 원뿔형 컨테이너로 구성되고, 교차 유동이 채널 아래로 슬라이딩하는 바이오매스에 대해 수직으로 채널내에서 발생되는 적어도 하나의 침강장치를 함유하는, 연속적 고세포밀도 발효를 수행하기 위한 유닛에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 모듈의 폭 (b1)과 교차류 침강 분리기의 채널의 길이 (L)의 비가 1에 가까운 상기의 장치에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 침강 분리기의 수용챔버내로의 유입 (35)이 수용챔버의 기부 위쪽으로 수용챔버의 전체 높이의 반 보다 크고 수용챔버의 전체 높이의 0.8 보다 작은 기하학적 높이에서 일어나는 상기의 유닛에 관한 것이다.
본 발명의 한가지 변형체는 직사각형 모듈 (29)로 구성된 침강 분리기를 함유하며, 여기에서는 개개 채널 (31)이 플레이트 (30)에 의해서 서로 공간적으로 분리되며, 상기의 채널은 모듈내의 그루브내에서 유도되고 유지되며, 이들은 필요에 따라 조립되거나 해체될 수 있다.
본 발명은 또한, 침강 분리기의 직사각형 침강채널 또는 침강튜브는 길이가 50 ㎝ 또는 그 이상이고, 상응하는 채널 높이는 10 ㎜이거나 그보다 더 작은 상기의 유닛에 관한 것이다.
가장 바람직한 채널 높이는 4 ㎜ 내지 6 ㎜ 사이이다. 4 내지 6 ㎜ 사이의 채널 높이는 침강 특징 및 침강기 (settler) 용적과 관련하여 최적 높이를 나타내는 것으로 확인되었다. 더 작은 채널 높이는 더 바람직하지 않은 침강 특징을 유도하는 반면에, 더 큰 채널 높이는 침강기의 바람직하지 않은 큰 용적을 유도한다. 이들 매우 작은 채널 높이는 최신 기술의 침강기, 예를들어 폐수처리 플랜트에서 슬러지 (sludge) 재순환을 위해서 사용된 것과 같은 침강기로부터 공지된 것과는 상이하다.
본 발명은 또한, 침강 분리기의 직사각형 침강채널 또는 침강튜브가 역류 분리기의 경우에는 길이가 50 ㎝이고 교차류 분리기인 경우에는 길이가 20 ㎝ 또는 그 이상이고, 상응하는 채널 높이는 10 ㎜ 또는 그 미만인 상기의 유닛에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 침강 분리기의 평행 플레이트 또는 튜브가 단면 높이 (a) 대 단면 폭 (b1) 비가 그의 조립된 상태에서 수평과 모듈 (도 15)의 경사각 사이의 각의 사인에 대략적으로 상응하는 직사각형 모듈 내부에 배열된 상기의 유닛에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 침강 분리기의 평행 플레이트 또는 튜브가 그들의 상향면 표면상에서 Ra = 0.25 ㎛ 미만의 표면 조도를 가지거나 이들 표면이 소수적으로 피복되거나, 이들이 로투스 플라워 효과를 갖는 표면 마감재를 갖는 상술한 바와 같은 유닛에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 침강 분리기의 평행 플레이트 또는 튜브가 특정 주파수 및 진폭의 진동에 적용되는 유닛에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 전배양 발효조 (9), 기질 저장탱크 (1), 생산 발효조 (2), 침강 분리기 (4) 및 수확용기 (6)를 함유하며, 여기에서 침강 분리기는 교차-유동 원리에 따라 작동되는, 연속적 고세포밀도 발효를 수행하기 위한 유닛에 관한 것이다 (도 13, 14).
본 발명은 또한 전배양 발효조 (9)가 하향 방향으로 테이퍼링된 단면을 가지며, 전배양 발효조의 교반기 (23)는 편심성 방식으로 매달려 있고, 전배양의 통기는 마이크로스파지 통기 유닛 (25)에 의해서 수행되는, 연속적 고세포밀도 발효공정를 수행하기 위한 유닛에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 큰-면적 앵커 교반기 (13) 및 축방향으로 권취된 무-기포 통기 시스템 (14)를 생산 발효조에서 사용하는, 연속적 고세포밀도 발효공정을 수행하기 위한 유닛에 관한 것이다. 통기 유닛 (17)은 이들 교반기내에 추가로 통합될 수 있으며, 앵커 교반기의 교반기 블레이드는 기부 (13a)에 근접한 부분에서 테이퍼링될 수 있다.
앵커 교반기 대신에, 게이트 교반기 (gate stirrers)가 또한 사용될 수 있다. 앵커 또는 게이트 교반기는 용기 직경의 절반 보다 더 큰 바람직한 직경, 더욱 바람직하게는 용기 직경의 70%, 또는 용기 직경의 80%의 직경을 갖는다.
본 발명은 또한, 원주 방향으로 경사지고 벽, 발효조 기부 및 액체 표면으로부터 일정 간격을 두고 배열된 큰-면적 블레이드 교반기 (18) 및 배플 (19), 및 마이크로스파지를 위한 통기 링 (17)이 생산 발효조내에 배열된, 연속적 고세포밀도 발효공정을 수행하기 위한 유닛에 관한 것이다.
본 발명은 마지막으로 또한, 큰-면적 블레이드 교반기 (21)가 생산 발효조내에 편심성 방식으로 배열된, 연속적 고세포밀도 발효공정을 수행하기 위한 유닛, 및 마이크로스파지를 위한 통기 링 (17)이 생산 발효조내에 추가로 통합되어 있는 유닛에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 하이드로사이클론 (11) 또는 초음파 분리 시스템이 침강 분리기의 상류에 배열된 유닛, 및 응집체 분리기 (12)가 침강 분리기의 재순환 배출구 (36)의 하류에 배열된 유닛에 관한 것이다.
본 발명과 관련하여 응집체 분리기는 예를들어, 침강원리에 따라 작동하여 액체 배지로부터 세포 응집체를 제거하는 장치이다. 응집체 분리기는 연속적으로 유동하는 배지 스트림으로부터 세포 응집체를 분리할 수 있다.
본 발명은 또한, 관통류 열교환기 (3)가 각각의 경우에 발효탱크의 배출구와 침강 분리기의 유입구 사이 및 침강 분리기의 농축물 배출구 (36)과 발효탱크의 재순환 유입구 사이에 배열된 유닛에 관한 것이다.
그러나, 본 발명은 또한 본 발명에 따르는 유닛를 사용하여 연속적 고세포밀도 발효공정을 수행하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 단일-단계 전배양을 사용하여 수행될 수 있으며, 여기에서 전배양은 유가 배양 방법으로 적어도 간헐적으로 수행되며, 전배양 용적은 공급 배취로 인하여 초기 용적의 적어도 5배 까지 증가한다. 전배양은 또한 세포 재순환이 있는 연속적 방법으로 간헐적으로 수행될 수도 있다.
본 발명에 따르는 방법에서, 전배양은 또한 병행하여 수행되는 후속 주배양 또는 주배양들을 위한 비교적 장기간에 걸쳐서 시드를 제공하기 위해서 생산 배양과 동시에, 세포 재순환시키면서 연속적 방법으로 수행될 수도 있다.
실시예 1
40 리터 발효조를 사용하여 막 기본 산소 공급 및 역류 세포 유지에 의한 하이브리도마 세포의 연속적 배양
도 1 및 2에 따르는 공정 기구는 1 g/L 인간 혈청 알부민 (HSA)을 갖는 영양배지를 함유하는 저장탱크 (1), 3-30 ℓ/h의 펌프 속도를 갖는 3개의 펌프 (이들 중에서 적어도 세포 현탁액과 접촉하게 되는 것은 저전단 튜브 펌프 및 파이프라인 (7)이다), 40 리터의 작업용적을 갖는 연속적으로 관류된 발효조 (2), L = 630 ㎜의 채널 길이 및 추가의 크기 z = 16; b1 = 111 ㎜; α = 60°에서 Ath = 0.56 ㎡ (Ath = z b1 L cosα; z: 채널의 수, b1: 채널 폭, L: 채널 길이, α: 수직에 대한 채널의 경사)의 이론적 분리 표면적을 갖는 도 8에 따르는 중력 역류 침강 분리기 (4), 및 분리기를 b = 0.1 g의 가속도를 갖는 진동하에 두는 공기에 의해서 조작되는 진동기 (5)로 구성된다. 역류 분리기는 분리기 용적을 기초로 하여 Ath/Vs 63 ㎡/㎥의 큰 침강 비면적으로 인해서 매우 효율적이다.
발효조는 65 ㎡/㎥의 비표면적을 갖는 실리콘 튜브 고정자 (14) 및 저속 앵커 교반기 (13)를 갖는 도 3에 따르는 교반된 발효조이다. 앵커 교반기 (13)의 4개의 블레이드는 실리콘 튜브 (16)로부터 8 ㎜의 간격을 두고 있으며, 고정자 (14)의 전체 높이에 걸쳐서 연장된다. 실리콘 막이외에, 0.5 ㎜의 홀을 갖는 도 3에 따르는 링 스파저 (17)가 바닥에 근접하여 배열된다. 세포 농도가 2×107 세포/㎖를 초과하는 경우에는 2 m/h 이하의 표면 가스속도 이하의 추가의 산소 스파지가 적용된다.
약 12일의 시동상 이후에, 30 내지 50×107 생존세포/㎖의 세포 농도에 도달할 수 있다. 세포-발효조 침강기 시스템의 이러한 준정류 상태 (quasi steady state) 조건은 1일당, 6.9 발효조 용적의 관류속도에서 수득된다. 이 관류속도에서 사용된 세포 분리기는 생존세포에 대해 R = 94.5%의 평균 유지도 및 사멸세포에 대해 Rd = 92%의 평균 유지도를 가지며, 75 내지 85% 사이이 세포 생존도 (총 세포수에 대한 생존세포수의 비) 및 100 ㎎/L의 항체 농도를 가지고 장기간에 걸친 장기간 조작시에 이러한 세포 농도를 보장할 수 있다. 70일 후에, 배양을 중지시켰다.
실시예 2
100 리터 발효조를 사용하여 막 기본 산소 공급 및 추가의 스파지 및 역류 세포 유지 시스템에 의한 BHK-세포의 연속적 배양
도 1 및 2에 따르는 공정 기구는 1 g/ℓ HSA를 갖는 영양배지를 함유하는 저장탱크 (1), 20 내지 100 ℓ/h의 펌프 속도를 갖는 3개의 펌프 (이들 중에서 적어도 세포 현탁액과 접촉하게 되는 것은 10 ㎜ 이상의 직경을 갖는 저전단 튜브 펌프 및 파이프라인 (7)이다), 100 ℓ의 충전용적을 갖는 연속적으로 관류된 발효조 (2), 300 ㎡/㎥ 보다 큰 열교환 비표면적을 갖는 관통류 열교환기 (3), L = 960 ㎜의 채널 길이 및 추가의 크기 z = 20; b1 = 148 ㎜; α = 60°에서 Ath = 1.4 ㎡의 이론적 분리 표면적을 갖는 중력 역류 침강 분리기 (4), 및 분리기를 b = 0.2 g의 가속도를 갖는 진동하에 두는 공기에 의해서 조작되는 진동기 (5)로 구성된다. 역류 분리기는 Ath/Vs = 77 ㎡/㎥의 큰 침강 비면적으로 인해서 매우 효율적이다. 발효조로부터 나오는 온도 37℃의 발효육즙은 세포-분리기에 도입시키기 위해서 열교환기에 의해서 20℃ 까지 냉각시키고, 발효조에 도입시키기 전에 다시 37℃로 가열된다.
발효조는 33 ㎡/㎥의 물질 이동 비표면적을 갖는 실리콘 튜브 고정자 (14) 및 저속 앵커 교반기 (13)를 갖는 도 3에 따르는 교반된 발효조이다. 앵커 교반기 (13)의 4개의 블레이드는 실리콘 튜브 (16)으로부터 10 ㎜의 간격을 두고 있으며, 고정자 (14)의 전체 높이에 걸쳐서 연장된다. 15 W/㎥의 동력 입력에 상응하는 20 rpm의 교반기 회전속도에서, 순수한 산소 및 2 바아의 내부 튜브 압력을 사용하는 경우에 1.5 내지 2×107 생존 BHK 세포/㎖의 배양에 충분한 산소 입력이 수득된다.
1.5 내지 2 ×107 생존 BHK 세포/㎖에 대한 영양소를 공급하기 위해서는 10 발효조 용적/d의 관류속도가 필요하다. 사용된 세포 분리기는 생존세포에 대해 R = 97%의 평균 유지도를 가지며, μ= 0.4/d의 관찰된 성장률에서 Vi = 90% 이상의 세포 생존도를 가지고 3개월의 기간에 걸친 장기간 조작시에 이러한 세포 농도를 보장할 수 있다.
배양물의 이러한 높은 세포 생존도는 세포 분리기 내부에서의 저온에 의해서 수득될 수 있었다. 정류상 배양조건은 약 10일 후에 수득되었다.
실시예 3
마이크로-스파지 및 역류 세포 유지 200 ℓ 발효조에 의한 CHO-세포의 연속적 배양
도 1 및 2에 따르는 공정 기구는 배지 1 g/ℓ 플루로닉을 갖는 영양배지를 함유하는 저장탱크 (1), 20 내지 100 ℓ/h의 펌프 속도를 갖는 3개의 펌프 (이들 중에서 적어도 세포 현탁액과 접촉하게 되는 것은 15 ㎜ 이상의 직경을 갖는 저전단 전위 펌프 (8) 및 파이프라인 (7)이다), 200 ℓ의 충전용적을 갖는 연속적으로 관류된 발효조 (2), 300 ㎡/㎥ 보다 큰 열교환 비표면적을 갖는 관통류 열교환기 (3), 960 ㎜의 채널 길이 및 도 11에 따라 추가의 크기 z = 26; b1 = 194 ㎜; α = 60°에서 Ath = 2.4 ㎡의 이론적 분리 표면적을 갖는 도 14에 따르는 중력 역류 침강 분리기, 및 분리기를 0.2 g의 가속도를 갖는 진동하에 두는 전기적으로 구동된 진동기로 구성된다.
역류 분리기는 분리기 용적을 기초로 하여 Ath/Vs = 84 ㎡/㎥의 큰 침강 비면적으로 인해서 매우 효율적이다.
발효조는 벽, 액체 표면 및 바닥과 접촉하지 않는 직경비 0.6의 경사진 배플 (19)을 갖는 큰 면적의 다단계 블레이드 임펠러 (impeller) (18)에 의해서 교반되는 도 4에 따르는 교반된 발효조이다. 8개의 금속 소결 플레이트가 장치된 0.5 ㎛ 공극 크기 및 직경 10 ㎜의 링 스파저는 바닥에 근접하게 배열된다. 9 W/㎥의 동력 입력에 상응하는 단지 0.2 m/h의 표면 산소 속도 및 25 rpm의 교반기 회전속도에서, 4×107 생존 BHK 세포/㎖의 배양에 충분한 산소 입력이 수득된다.
4×107 생존 CHO 세포/㎖에 대한 영양소를 공급하기 위해서는 4 발효조 용적/d의 관류속도가 필요하다. 이 관류속도의 경우에 사용된 세포 분리기는 생존세포에 대해 R = 90%의 평균 유지도를 갖는다. μ= 0.4/d의 세포의 관찰된 성장률에서 110일의 기간에 걸친 장기간 조작시에 이러한 세포 농도를 보장할 수 있다. 세포의 생존도는 전체 배양시간에 걸쳐서 90% 초과로 유지된다. 고세포밀도를 갖는 정류상 조건은 15일의 시동상 이후에 수득된다.
실시예 4
마이크로-스파지 및 역류 세포 유지 200 ℓ 발효조에 의한 무 HSA 배지에서 BHK-세포의 연속적 배양
공정 기구는 도 1 및 2에 따르며, 배지 1 g/ℓ 플루로닉을 갖는 영양소를 함유하는 저장탱크 (1), 75 내지 300 ℓ/h의 이송능력을 갖는 3개의 펌프 (8) (이들 중에서 적어도 세포 현탁액과 접촉하게 되는 것은 15 ㎜ 이상의 직경을 갖는 저전단 전위 펌프 (8) 및 파이프라인 (7)이다), 200 ℓ의 충전용적을 갖는 연속적으로 관류된 발효조 (2), 200 ㎡/㎥ 보다 큰 열교환 비표면적을 갖는 관통류 열교환기 (3), 345 ㎜의 채널 길이 및 추가의 치수 z = 46; b1 = 345 ㎜; α = 60°에서 Ath = 2.8 ㎡의 이론적 분리 표면적을 갖는 도 14에 따르는 중력 역류 침강 분리기, 및 분리기를 0.1 g의 가속도를 갖는 진동하에 두는 전기적으로 구동된 진동기로 구성된다.
도 14에 따르는 역류 분리기는 분리기 용적을 기초로 하여 Ath/Vs = 75 ㎡/㎥의 큰 침강 비면적 및 실시예 1-3에서 사용된 역류 시스템으로서 훨씬 더 짧은 채널 길이로 인해서 매우 효율적이다.
발효조는 벽, 액체 표면 및 바닥과 접촉하지 않는 직경비 0.6의 경사진 배플 (19)을 갖는 큰 면적의 다단계 블레이드 임펠러 (18)에 의해서 교반되는 도 3에 따르는 교반된 발효조이다. 8개의 금속 소결 플레이트가 장치된 0.5 ㎛ 공극 크기 및 직경 10 ㎜의 링 스파저는 바닥에 근접하게 배열된다. 9 W/㎥의 동력 입력에 상응하는 단지 0.15 m/h의 표면 산소 속도 및 25 rpm의 교반기 회전속도에서, 3×107 생존 BHK 세포/㎖의 배양에 충분한 산소 입력이 수득된다.
3×107 생존 BHK 세포/㎖에 대한 영양소를 공급하기 위해서는 15 발효조 용적/d의 관류속도가 필요하다. 사용된 세포 분리기는 생존세포에 대해 R = 96.8%의 평균 유지도를 가지며, μ= 0.5/d의 세포의 관찰된 성장률에서 100일의 기간에 걸친 장기간 조작시에 이러한 세포 농도를 보장할 수 있다. 세포의 생존도는 전체 배양시간에 걸쳐서 Vi > 95%로 유지된다. 정류상 배양조건은 12일의 시동상 이후에 수득된다.
실시예 1-3에 비해서 더 큰 관류속도, 더 큰 성장률 및 배양의 증가된 생존도는 분리기의 내부에서 세포의 더 짧은 체류시간을 유도하는 교차류 분리기 원리에 의해서 야기된다.
공정은 충전용적이 생산 발효조 용적의 6% 미만이고 2주일 이내에 세포수에서 대략 120 또는 150-배 증가를 제공하는 도 6에 따라 특별히 디자인되고 조작되는 접종 발효조를 포함한다. 접종 그 자체는 50 ㎖ 바이알 및 2 ℓ의 출발 용적으로 접종함으로써 개시된다. 2일 후에, 용적은 5 ℓ 까지 충전되며, 4일 후에는 12 ℓ로 충전된다. 처음 4일 이내에 발효조는 배취 방식으로 운전되고, 5일 이후에는 연속 방식으로 운전된다. 200 ℓ 발효조의 접종에 충분한 2 내지 2.5×107 생존세포/㎖의 최종 세포 농도는 단지 12일 이내에 수득된다. 접종 발효조의 연속적 발효를 위해서 사용된 세포 유지 시스템은 도 9에 따라서 500 ㎜의 채널 길이에서 Ath = 0.12 ㎡의 이론적 분리 표면적을 갖도록 디자인된다.
실시예 5
난류 전단 스트레스 τ의 측정
이 공정에서는 저전단 펌프가 사용된다. 펌프는 펌프에 의해서 야기된 스트레스를 수성 발효배지에 관하여 공지의 계면 표면장력 σ의 적합한 모델 입자 시스템을 사용하여 모델 실험에서 시험하는 특별한 펌프 시험을 사용하여 선택된다. 장기간 펌핑한 후에 그 자체로 설정되는 평형 입자 직경 dp는 펌프에 의해서 나타나는 최대 난류 전단 스트레스 τ = σ/dp를 제공한다. 입자 시스템의 평형 직경이 발효중에 사용된 세포 또는 세포 응집체의 직경과 상이하다면, 펌프에 의해서 야기된 스트레스는 등방성 난류의 원리의 법칙을 적용함으로써 측정될 수 있다. 난류 전단 스트레스는 τ세포/τ모델 입자 = d세포/d모델 입자에 따라서 소산 범위 (dissipation range)의 법칙으로 계산된다.
Claims (32)
- 전배양 발효조 (9), 기질 저장탱크 (1), 생산 발효조 (2), 침강 분리기 (4) 및 수확용기 (6)를 함유하는 연속적 고세포밀도 발효를 수행하기 위한 유닛에 있어서, 침강 분리기가 분리기 용적을 기준으로 하여 Ath/Vs ≥ 30 ㎡/㎥의 분리기 표면적을 가지고, 침강 분리기가 원뿔형 또는 피라미드형 수용챔버 (32, 44)를 가지며, 침강 분리기의 수용챔버내로의 유입은 방사상으로 (35), 동일 방향으로 접선상으로 (39, 34), 또는 반대 방향으로 접선상으로 (41, 42) 배열된 두개 이상의 도관을 통해서 일어나고, 도관은 단면상에서 규칙적 방식으로 배열되는 것을 특징으로 하는 유닛.
- 제1항에 있어서, 침강 분리기가 Ath ≥ 0.5 ㎡의 분리기 표면적 및 동시에, Ath/Vs ≥ 30 ㎡/㎥ (분리기 용적을 기준으로 함)의 비표면적 또는 Ath/V ≥ 5 ㎡/㎥ (발효조 용적을 기준으로 함)의 비표면적을 가지면서, 유닛이 1일에 5 내지 15배 발효조 용적의 범위의 관류속도에서 운전될 수 있음을 특징으로 하는 유닛.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 침강 분리기가 분리기 용적을 기준으로 하여 Ath/Vs 50 내지 100 ㎡/㎥의 분리기 표면적을 가짐을 특징으로 하는 유닛.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 침강 분리기 (4)의 수용챔버내로의 유입 (35)이 수용챔버의 기부 위쪽으로 수용챔버의 전체 높이의 반보다 더 크고 수용챔버의 전체 높이의 0.8배 보다 더 작은 기하학적 높이에서 일어나는 유닛.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 침강 분리기 (4)의 수용챔버내로의 유입 (35)이 수용챔버의 기부 위쪽으로 수용챔버의 전체 높이의 반보다 더 크고 수용챔버의 전체 높이의 0.75배 보다 더 작은 기하학적 높이에서 일어나는 유닛.
- 제1항에 있어서, 침강 분리기가 교차-유동 원리에 따라 작동되는 유닛.
- 제6항에 있어서, 추가의 유입 채널이 발효배지를 직접 수용챔버 (33, 44)내로 이송함으로써 이 수용챔버내에서 세포의 유지시간을 감소시킨 유닛.
- 제1항, 제2항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 침강 분리기의 평행 플레이트 또는 튜브가, 단면 높이 대 단면 폭 비가 그의 조립된 상태에서 수평과 모듈의 경사각 사이의 각 α의 사인값(sine)에 상응하는 직사각형 모듈 내부에 배열된 유닛.
- 제1항, 제2항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 침강 분리기가 직사각형 모듈 (29)로 구성되며, 여기에서는 개개 채널 (31)이 플레이트 (30)에 의해서 서로 공간적으로 분리되고, 이 플레이트는 모듈내의 그루브내로 안내되어 유지되며, 플레이트는 필요에 따라 조립되거나 해체될 수 있는 유닛.
- 제1항, 제2항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 침강 분리기의 경사진 직사각형 채널 또는 튜브는 길이가 50 ㎝ 또는 그 이상이고, 상응하는 채널 높이는 10 ㎜ 또는 그 미만인 유닛.
- 제1항, 제2항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 침강 분리기의 경사진 직사각형 채널 또는 튜브는 길이가 50 ㎝ 또는 그 이상이고, 채널 높이는 4 내지 6 ㎜인 유닛.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 교차류 침강 분리기는 길이가 20 ㎝ 또는 그 이상인 경사진 직사각형 채널을 가지며, 채널은 높이가 10 ㎜ 또는 그 미만인 유닛.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 교차류 침강 분리기는 길이가 20 ㎝ 또는 그 이상인 경사진 직사각형 채널을 가지며, 채널 높이는 4 내지 6 ㎜인 유닛.
- 제1항에 있어서, 전배양 발효조 (9)는 하향 방향으로 테이퍼링된 단면을 가지며, 전배양 발효조의 교반기 (23)는 편심성 방식으로 매달려 있고, 전배양의 통기는 마이크로스파지 통기 유닛 (25)에 의해서 수행됨을 특징으로 하는 유닛.
- 제1항, 제2항, 제6항, 제7항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 통기 유닛 (17)이 통기를 위해서 추가로 통합된 유닛.
- 제1항에 있어서, 블레이드 교반기 (21)가 생산 발효조내에 편심성 방식으로 배열됨을 특징으로 하는 유닛.
- 제1항, 제2항, 제6항, 제7항, 제14항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로스파지를 위한 통기 링 (17)이 생산 발효조내에 추가로 통합되어 있는 유닛.
- 제1항, 제2항, 제6항, 제7항, 제14항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 응집체 분리기 (12)가 침강 분리기의 재순환 배출구 (36, 47)의 하류에 배열된 유닛.
- 제1항, 제2항, 제6항, 제7항, 제14항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 관통류 열교환기 (3)가 각각의 경우에 발효탱크의 배출구와 침강 분리기의 유입구 (34, 45, 48)의 사이 및 침강 분리기의 농축물 배출구 (36, 47)와 발효탱크의 재순환 유입구의 사이에 배열된 유닛.
- 제1항, 제2항, 제6항, 제7항, 제14항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 저전단 펌프 (8)를 적용하여 0.1 N/㎡ 또는 그 미만의 난류 전단 스트레스를 유도하는 유닛.
- 제1항, 제2항, 제6항, 제7항, 제14항 및 제16항 중 어느 한 항에 따르는 유닛를 사용함을 특징으로 하여, 연속적 고세포밀도 발효를 수행하는 방법.
- 제21항에 있어서, 전배양이 세포를 재순환시키면서 연속적 방법으로 간헐적으로 또는 지속적으로 수행되는 방법.
- 제22에 있어서, 생산 배양과 동시에 전배양을 세포를 재순환시키면서 연속적 방법으로 수행하는 방법.
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