CN1068368A

CN1068368A - 过滤培养技术生产高含多核苷酸磷酸化酶大肠杆菌的方法

Info

Publication number: CN1068368A
Application number: CN 92108910
Authority: CN
Inventors: 聂实践
Original assignee: Beijing Nutrient Source Research Institute
Current assignee: Beijing Nutrient Source Research Institute
Priority date: 1992-08-03
Filing date: 1992-08-03
Publication date: 1993-01-27

Abstract

本发明提供的过滤培养技术生产高含多核苷酸磷酸化酶的大肠杆菌的方法，是在传统的发酵装置上附加一套过滤系统，大肠杆菌按传统的分批培养方法培养后，接种于发酵罐内，在32～40℃温度下，循环培养8～16小时，在循环过程中补加培养基，发酵液通过超滤膜滤除代谢产物后，经分离得到的菌泥于 -20℃温度下贮存。本方法与传统的分批培养方法相比，大幅度提高了设备的产率，后处理工艺简单，并且大肠杆菌细胞内酶的活性高。

Description

本发明涉及一种酶的生产方法。

多核苷酸磷酸化酶是一种很重要的酶，自从1955年被发现以来，广泛地应用于生化、医药等方面。该酶普遍存在于细菌、酵母真核细胞以及高等动植物细胞中。目前，工业上多以大肠杆菌作为菌种，采取分批培养法进行大规模生产。具体方法是：先把大肠杆菌接种于牛肉汁蛋白胨培养基上加以活化，在盛有培养基的容器内，用斜面种子接种后于37℃温度下振荡培养12小时，作为一级种子，再按10%（V种子/V培养基）接种量将一级种子接入种子罐，于37℃温度，1∶0.5-1∶1通风量，0.05Mpa气压的条件下，搅拌培养10小时作为二级种子，按10%接种量将二级种子接入发酵罐，按一级种子的培养条件搅拌培养12-16小时后，经过分离得到含多核苷酸磷化酶的大肠杆菌，于-20℃温度下冷冻贮存。所述的培养基是K₂HPO₄2.18%，KH₂PO₄1.7%，酵母浸汁1%，葡萄糖1%其余为蒸馏水的混合液，或者是蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，酵母膏0.5%，Nacl 0.5%其余为蒸馏水的混合液。

现有生产方法的缺点是：在大肠杆菌发酵过程中细胞代谢产物对细胞生长有很严重的抑制作用，而且发酵后期营养损耗不能补充，不利于细菌生长，以致到收获期时大肠杆菌浓度较低，酶的活性不高。因而发酵设备产率低，细胞分离工艺比较复杂，分离时间过长，酶的活性也受到影响。

本发明的目的是要提供一种克服了上述分批培养方法缺点的过滤培养技术生产高含多核苷酸磷酸化酶的大肠杆菌的方法。

本发明是在传统发酵装置上附加一套过滤系统，该系统包括培养基贮液罐、中空纤维超滤膜如聚砜超滤膜、滤出液罐及输送设备。大肠杆菌按分批培养方法接种后进行过滤循环培养，在循环过程中不断加入营养物质，排出代谢产物以保持很长的细胞旺盛繁殖期，从而克服了发酵过程中代谢产物抑制生长，发酵后期营养缺失的缺点。具体方法是：由葡萄糖20g/l，酵母酶解粉10g/l，NaHPO₄5g/l，K₂HPO₄8g/l和蒸馏水组成培养基，在120℃温度下灭菌15分钟，将大肠杆菌接种于盛有培养基的容器内，于37℃温度下振荡培养16小时，按10%（V种子/V培养基）的接种量接种于发酵设备中，在温度为37℃，搅拌转速为400rpm，PH值控制在7.0，氧饱和度控制在5%的条件下培养2小时，然后开始过滤培养：由供气系统控制发酵罐氧饱和度不低于2.5%，最好为5%，在温度为32-40℃最好为37℃的条件下培养8-16小时，最好为8小时，在培养过程中按稀释率为0.5-1.5hr^-1补加培养基，发酵液通过超滤膜滤除代谢产物，菌体回到发酵罐内，如此往复，当菌体浓度到达规定值后，经分离得到高含多核苷酸磷酸化酶大肠杆菌，于-20℃温度下冷冻贮存，再经提取可得多核苷酸磷酸化酶。

本发明利用过滤培养技术连续生产多核苷酸磷化酶大肠杆菌，由于营养物质的不断加入，代谢产物不断排除，系统中细胞可以保持很长时间的旺盛生长状态，从而在短时间内达到很高的细胞浓度，发酵设备产率大幅度提高，后处理工艺大大简化。

下面结合附图说明其实施例。

图（1）是过滤培养技术生产高含多核苷酸磷酸化酶的大肠杆菌的工艺流程示意图。

图中：

1-培养基贮罐 2-加料泵 3-供气系统 4-发酵罐 5-循环泵 6-超滤膜 7-排料泵 8-滤出液罐

实施例1：

菌种：大肠杆菌（Eschevichiac Coli）AS.1.183;

培养基：由葡萄糖20g，酵母酶解粉10g，NaHPO₄5g，K₂HPO₄8g，蒸馏水1L组成;

培养方法：培养基经121℃温度灭菌15分钟后，装于培养基贮罐1中，用加料泵2送入带搅拌装置的发酵罐4，将预先准备的种子接种发酵罐内，由供气系统3维持发酵罐氧饱和度达到5%，在温度为37℃，搅拌转速为400rpm的条件下培养2小时后，开始过滤培养：用循环泵5以2L/min速度循环培养8小时，在循环过程中按稀释率为1.5hr^-1补加培养基，发酵液通过超滤膜6滤除代谢产物，由排料泵7排入滤出液罐8，发酵液经转速为3000rpm的离心分离机分离，得到高含多核苷酸磷酸化酶的大肠杆菌泥，贮于-20℃冰箱内。

所述的超滤膜6的性能见表1

试验结果：见表2

注：第2、3项的测定方法见附录1

实施例2

用过滤培养技术生产高含多核苷酸磷酸化酶大肠杆菌的方法同实施例1，不同之处在于所述的稀释速率为0.5hr^-1，试验结果与实施例1的结果基本相同。

实施例3

用过滤培养技术生产高含多核苷酸磷酸化酶大肠杆菌的方法同实施例1，不同之处在于：大肠杆菌菌种在使用前接种到含有蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，酵母膏0.5%，Nacl0.5%的培养基上加以活化。

试验结果：见表3

注：第2、3项的测定方法见附录1

实施例4

用过滤培养技术生产高含多核苷酸磷酸化酶的大肠杆菌的方法同实施例1，不同之处在于发酵温度为32℃或40℃，发酵时间为12小时，其结果同实施例3。

Claims

1、一种过滤培养技术生产高含多核苷酸磷酸化酶大肠杆菌的方法，其特征是：大肠杆菌采用传统的分批培养方法接种后，再接种于带搅拌装置的发酵罐内，由供气系统控制发酵罐内氧饱合度不低于2.5%，在温度为32-40℃的条件下，循环培养8-16小时，在循环过程中按稀释率为0.5-1.5hr^-1补加培养基，发酵液通过超滤膜滤除代谢产物，菌体回到发酵罐内，当菌体浓度达到规定值后，经分离得到高含多核苷酸磷酸化酶的大肠杆菌菌泥，于-20℃温度下贮存。

2、根据权利要求1所述的过滤培养技术生产高含多核苷酸磷酸化酶的大肠杆菌的方法，其特征是：发酵工艺条件最好为氧饱和度为5%、温度为37℃，发酵时间8小时。

3、根据权利要求1或2所述的过滤培养技术生产高含多核苷酸磷酸化酶的大肠杆菌的方法，其特征是：培养基为1升蒸馏水中含有葡萄糖20g，酵母酶解粉10g、NaHPO₄5g、K₂HPO₄8g。