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WO2025027938A1 - 培養装置及び細胞分離方法 - Google Patents

培養装置及び細胞分離方法 Download PDF

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Publication number
WO2025027938A1
WO2025027938A1 PCT/JP2024/014077 JP2024014077W WO2025027938A1 WO 2025027938 A1 WO2025027938 A1 WO 2025027938A1 JP 2024014077 W JP2024014077 W JP 2024014077W WO 2025027938 A1 WO2025027938 A1 WO 2025027938A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture
culture solution
settling chamber
tank
cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2024/014077
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
周太郎 石川
崇 青木
Original Assignee
エイブル株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by エイブル株式会社 filed Critical エイブル株式会社
Priority to JP2024108800A priority Critical patent/JP2025021428A/ja
Publication of WO2025027938A1 publication Critical patent/WO2025027938A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/04—Apparatus for enzymology or microbiology with gas introduction means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a culture device for culturing cells in a culture medium and a cell separation method for separating cells from a culture medium in which the cells are dispersed.
  • cell culture techniques are sometimes used to produce target substances, and if the density of cells in the culture medium can be increased, the production efficiency of the target substances can be improved.
  • the cells produce various metabolites, which can inhibit cell growth and substance production, thereby reducing the efficiency of cell culture.
  • a known technology to solve this problem and achieve high-density cell culture is the perfusion culture method, in which the culture medium is removed from the culture tank, the cells dispersed in the culture medium are separated, and the removed cells are returned to the culture tank (the supernatant of the culture medium from which the cells were separated is extracted), and fresh culture medium is added.
  • Patent Documents 1 to 3 relate to perfusion culture apparatuses for culturing cells by perfusion culture, and each of these apparatuses is provided with a separation tank (sedimentation tank) for separating cells dispersed in a culture solution.
  • a separation tank is provided separately from the culture tank, the culture medium is caused to flow from the culture tank into the separation tank, and the cells separated in the separation tank are returned to the culture tank.
  • the present invention aims to provide a culture device and a cell separation method that can reduce damage to cells during the process of separating cells dispersed in a culture medium (and removing the supernatant).
  • a culture apparatus for culturing cells in a culture solution comprising: a culture tank in which at least oxygen is supplied to the culture solution; a settling chamber having an opening in the culture solution; a cooling and flocculating device that cools the culture solution in the settling chamber to flocculate cells contained in the culture solution in the settling chamber; and a discharge mechanism that discharges the supernatant of the culture solution in the settling chamber.
  • (Configuration 2) The culture apparatus according to configuration 1, wherein the settling chamber is a tubular member arranged at an incline with respect to the vertical direction, thereby forming an inflow path for the culture medium into the settling chamber on the side that becomes the upper side due to the incline, and a return path for the culture medium to the culture tank on the side that becomes the lower side due to the incline.
  • a cell separation method for separating cells from a culture solution in which the cells are dispersed comprising the steps of: providing a sedimentation chamber having an opening in the culture solution; cooling the culture solution in the sedimentation chamber to aggregate cells contained in the culture solution in the sedimentation chamber; and discharging the supernatant of the culture solution in the sedimentation chamber.
  • the culture device, culture tank, and cell separation method of the present invention can reduce damage to cells during the process of separating cells dispersed in a culture medium (and removing the supernatant) with a relatively simple configuration.
  • FIG. 1 is a block diagram showing an outline of the configuration of a perfusion culture system (perfusion culture apparatus) according to an embodiment of the present invention.
  • a schematic diagram showing the operation concept inside the settling chamber of the perfusion culture system Conceptual diagram showing another example of a settling chamber (settling tube)
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of the configuration of a perfusion culture system (perfusion culture apparatus) according to an embodiment of the present invention.
  • the perfusion culture system 1 of this embodiment is configured as a culture device that cultures various cells (e.g., animal, insect, plant cells, microorganisms, bacteria, etc.) in a culture solution.
  • various cells e.g., animal, insect, plant cells, microorganisms, bacteria, etc.
  • the perfusion culture system 1 includes a culture tank 11 for holding a culture solution, a settling chamber 12 and a cooling device 13 for separating the culture solution into a supernatant and a precipitate, a discharge mechanism 15 for discharging the supernatant of the culture solution in the settling chamber, a measuring tank 142 for measuring the discharged solution, a storage tank 18 for storing the discharged solution, a supply mechanism 16 for supplying new culture solution to the culture tank 11, a metering tank 141 for measuring the culture solution to be supplied, and a feed liquid tank 17 containing the culture solution.
  • the perfusion culture system 1 is equipped with a control unit connected to each pump, each on-off valve, each sensor, and each cooling device, and the operations described below are controlled by the control unit.
  • the culture tank 11 is a member for holding a culture solution in which cells to be cultured are dispersed, and although not shown in the figure, is equipped with various mechanisms for maintaining the culture solution in a desired state, such as a mechanism for supplying oxygen to the culture solution. By adjusting the state of the culture solution in the culture tank 11, the cells are appropriately cultured in the culture solution, making it possible to produce the target product.
  • the perfusion culture system 1 (culture tank 11) can be configured to include various mechanisms (ancillary equipment) for appropriately controlling the culture process.
  • the perfusion culture system 1 can be configured to include a measuring device for measuring the state of the culture solution (dissolved oxygen, pH, temperature, etc.), a measuring device for measuring the progress of the culture (measuring device for glucose concentration, etc.), an adjustment mechanism for adjusting the state of the culture solution, a supply mechanism for supplying the culture solution (fresh liquid medium) and nutrients, etc., and a sampling mechanism for extracting the culture solution.
  • the culture tank 11 and various ancillary equipment maintain the culture solution held in the culture tank 11 in an appropriate state, making it possible to culture cells in the culture solution, and therefore these can be called a culture device.
  • the sedimentation chamber 12 is a member for separating cells from the culture solution in the culture tank 11 in order to perform perfusion culture, and plays a role in separating the culture solution into a supernatant and a precipitate by sedimentation.
  • the settling chamber 12 is provided in the culture tank 11 and has an opening 121 in the culture fluid, so that the culture fluid is contained therein and the culture fluid can flow in and out of the culture tank 11.
  • the settling chamber 12 is a tubular member arranged at an incline with respect to the vertical direction, and, in combination with the function of the cooling device 13 as described later, forms an "inflow path P in (see FIG.
  • the settling chamber 12 in this embodiment is configured such that a part of the tubular member (here, the upper side) protrudes outside the culture tank 11 and is attached to the culture tank 11. In this attachment structure, the position of the settling chamber 12 in the height direction relative to the culture tank 11 is adjustable.
  • a discharge pipe 151 is provided inside the settling chamber 12 , and the supernatant of the culture fluid separated in the settling chamber 12 is discharged through the discharge pipe 151 .
  • the cooling device (cooling and flocculating device) 13 is installed at the portion of the settling chamber 12 that protrudes outside the culture tank 11, and has a function of cooling the culture solution in the settling chamber 12 to flocculate the cells contained in the culture solution (a function of increasing the settling rate by flocculating the cells).
  • the cooling device has a function of forming the aforementioned "inflow path P in " and "return path P out ".
  • the cooling device 13 of this embodiment is configured by using a Peltier element and installing it so as to wrap it around the outer periphery of the settling chamber 12.
  • the present invention is not limited to this, and any device capable of cooling the settling chamber 12 can be used.
  • the cooling device may be configured by providing a circulation path that circulates a cooling medium from a chiller near or inside the settling chamber.
  • the discharge mechanism 15 forms a flow path for discharging the supernatant of the culture solution in the settling chamber 12 into the storage tank 18.
  • a discharge pipe 151 installed in the settling chamber 12;
  • a pump P2 provided on the flow path for pumping the discharged liquid;
  • a measuring tank 142 for measuring the discharged liquid;
  • Each flow path member such as a pipe or tube, that connects these members and the settling chamber 12 and the storage tank 18 to each other;
  • Each on-off valve V2, V3 is provided on the flow path to switch or open and close the flow path; , connecting the settling chamber 12 and the reservoir 18 .
  • Discharge pipe 151 is made of a hollow pipe, and as shown in Fig.
  • discharge pipe 151 has end opening 1511 disposed in a position close to upper side surface 12u of settling chamber 12, which is disposed at an angle. This results in "the end opening of the discharge mechanism that opens in the settling chamber being disposed in a position on the inflow path.”
  • the metering tank 142, pump P2, and on-off valves V2 and V3 are conceptually similar to the supply/discharge unit 16 shown in Fig. 2 of Patent Document 1, and therefore a description thereof will be omitted here.
  • the amount of culture solution (supernatant) extracted can be accurately controlled.
  • the supply mechanism 16 constitutes a flow path that supplies new culture solution to the culture tank 11 in an amount corresponding to the culture solution discharged by the discharge mechanism 15.
  • a pump P1 is provided on the flow path for supplying the culture solution;
  • a measuring tank 141 for measuring the amount of culture solution to be supplied;
  • Each flow path member such as a pipe or tube that connects these members and the culture tank 11 and the feed liquid tank 17 to each other;
  • An on-off valve V1 provided on the flow path for switching or opening and closing the flow path; and connects the culture tank 11 and the feed liquid tank 17.
  • the supply mechanism 16 is similar in concept to the supply unit 18 shown in Fig. 3 of Patent Document 1, and therefore a description thereof will be omitted here.
  • the supply amount of culture medium can be accurately controlled.
  • the storage tank 18 and the feed liquid tank 17 are provided with an aeration unit that communicates the internal space of the tank with the external space via a sterile filter F.
  • the culture tank 11 may also be configured to include an aeration unit.
  • the perfusion culture system 1 of this embodiment having the above configuration efficiently separates the culture solution into a supernatant and a sediment using the settling chamber 12 and the cooling device 13, and discharges the supernatant into the storage tank 18 using the discharge mechanism 15 while supplying new culture solution in an amount corresponding to the discharged supernatant from the feed liquid tank 17 to the culture tank 11 using the supply mechanism 16, thereby performing perfusion culture.
  • separation of the culture medium is carried out in a settling chamber 12 disposed in the culture tank 11 .
  • the separation of the culture solution is based on two functions provided by the settling chamber 12 and the cooling device 13. First, the culture solution in the settling chamber 12 is cooled by the cooling device, causing the cells to aggregate and settle, thereby making the separation of the cells from the culture solution more efficient.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram showing the operational concept within the settling chamber 12. As shown in FIG.
  • the sedimentation chamber 12 has an opening 121 on the lower end side that is open in the culture fluid CF, and the upper end side is sealed.
  • the culture solution CF in the culture tank 11 flows into the settling chamber 12, and because the culture solution in the settling chamber 12 is cooled, convection occurs in the settling chamber 12.
  • this convection has an inflow path P in for the culture solution into the settling chamber 12 on the side of the upper side surface 12u of the settling chamber 12, and a return path P out for the culture solution to the culture tank 11 on the side of the lower side surface 12d (this tendency is created by the inclination of the settling chamber 12). 2
  • this convection current allows the settling cells C to ride on the flow on the return path P out and be efficiently returned to the culture tank 11.
  • the sedimentation chamber 12 of this embodiment can separate cells while circulating the culture medium between the culture tank 11, and therefore can reduce damage to the cells during the process of separating the cells dispersed in the culture medium (and removing the supernatant) (by providing an appropriate supply of oxygen, etc. at all times).
  • the present embodiment is preferable because it has both the first function of cell aggregation by cooling and the second function of forming an inflow path and a return path by convection and tilt, but the present invention is not limited to having both of these functions, and it is also acceptable to use only one of the functions.
  • the perfusion culture system (culture apparatus), culture tank, and cell separation method of this embodiment can reduce damage to cells during the process of separating cells dispersed in a culture solution (and removing the supernatant), and can achieve this with a relatively simple configuration.
  • the simple configuration is also suitable for single-use use, and for example, it is possible to provide a culture tank part (a culture tank having a settling chamber attached at a position having an opening in the culture solution) as a replacement part (single-use product) at a relatively low cost.
  • the pump P2 it is preferable to control the pump P2 so that the increasing component of the linear velocity of the inflowing culture solution in the inflow path P in is slower than the settling velocity of the aggregated cells C.
  • this can be easily achieved by simply increasing the suction (conversely to the above, making the linear velocity of the inflowing culture solution in the inflow path P in faster than the settling velocity of the aggregated cells C).
  • the cooling by the cooling device 13 may be stopped.
  • controls control of pumps, etc.
  • the opening 121 of the settling chamber 12 is formed at one end (lower end) of the settling chamber 12, which is a tubular member, as an example, but the present invention is not limited to this, and any opening can be used as long as it allows the culture medium to pass in and out of the culture tank (at least allows the culture medium to flow in from the culture tank).
  • the position (depth) of the opening relative to the liquid surface is preferably "deeper than the bubble presence region where bubbles exist near the culture liquid surface in the culture tank during culture.”
  • FIG. 3 is a schematic diagram for explaining this point. During the culture, bubbles generated in the culture solution in the culture tank may float near the liquid surface WS1.
  • the opening 121 is located in the bubble presence region BZ (shaded area in FIG. 3) where these bubbles exist, the cells adhering to the bubbles may be sucked in, which may make it difficult to improve the cell separation efficiency.
  • the depth D1 of the opening 121 is set deeper than the bubble presence region BZ, thereby improving the cell separation efficiency.
  • an inflow opening provided on the "inflow path” and a return opening provided on the "return path” may be formed as openings.
  • FIG. 5 shows an example of such an example.
  • an inflow opening 1211 for the inflow path P in and a return opening 1212 for the return path P out are formed as separate openings.
  • the settling chamber is a tubular member, but the present invention is not limited to this, and the settling chamber may be a member of any shape that has an opening in the culture solution in the culture tank (i.e., the culture solution can be held therein (enclosing the culture solution in a specified compartment) while allowing the culture solution to pass in and out of the culture tank).
  • the upper side of the sedimentation chamber 12 is protruding to the outside of the culture tank, but a part of the sedimentation chamber 12 may be protruding from the side of the culture tank.
  • a part of the sedimentation chamber 12 is protruding to the outside of the culture tank, and the protruding part is cooled by a cooling device, but the present invention is not limited to this, and for example, the entire sedimentation chamber may be disposed inside the culture tank.
  • a cooling device is used to cool the sedimentation chamber from the outside of the sedimentation chamber, but the entire sedimentation chamber may be disposed inside the culture tank while a cooling device is provided inside the sedimentation chamber.
  • the sedimentation chamber by constructing the sedimentation chamber from a material with low thermal conductivity, the influence on the temperature management of the culture solution in the culture tank is reduced, and the culture solution in the sedimentation chamber can be cooled by a cooling device provided in the sedimentation chamber to aggregate the cells.
  • the end of the discharge pipe 151 is curved in a J-shape, with the end opening 1511 facing upward, but the present invention is not limited to this.
  • the end opening of the discharge pipe 151 may face to the side, or may face downward, such as end opening 1511-1 of discharge pipe 151-1 in FIG. 3.
  • the end opening is located at a position higher than the liquid level of the culture fluid in the culture tank, so that the liquid level WS2 of the culture fluid in the settling chamber 12-1 is higher than the liquid level WS1 of the culture fluid in the culture tank, as shown in Fig. 3.
  • This is preferable because it is considered that it is difficult for cells to rise to a higher position, and therefore it is possible to obtain the effect of increasing the efficiency of cell separation, but the present invention is not limited to this.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of an example in which the liquid level WS2 of the culture fluid in the sedimentation chamber 12-1 is lower than the liquid level WS1 of the culture fluid in the culture tank, among the cases in which the liquid level of the culture fluid in the culture tank and the liquid level of the culture fluid in the sedimentation chamber are different.
  • the upper side of the sedimentation chamber is sealed (the discharge pipe is inserted at the upper part of the sedimentation chamber, but after the end opening of the discharge pipe becomes the same height as the liquid level WS2, the air in the sedimentation chamber is not released), so by making the position of the end opening 1511-1 of the discharge pipe 151-1 lower than the liquid level WS1 of the culture fluid in the culture tank, the liquid level WS2 becomes lower than the liquid level WS1.
  • liquid level of the culture medium in the culture tank and the liquid level of the culture medium in the settling chamber are configured to be different, but the liquid level of the culture medium in the culture tank and the liquid level of the culture medium in the settling chamber may also be configured to be the same.
  • the end opening set higher than the liquid level of the culture liquid in the culture tank, as in this embodiment, so that the liquid level in the settling chamber at the time of withdrawal is higher than the liquid level of the culture liquid in the culture tank.
  • the mounting height of the settling chamber 12 relative to the culture tank 11 can be adjusted, but instead (or in addition), the height of the discharge pipe 151 (end opening 1511) relative to the settling chamber 12 may be adjustable.
  • the end opening of the discharge pipe is always located near the liquid level in the settling chamber when the supernatant is discharged, but the present invention is not limited to this.
  • the end opening of the discharge pipe may be arranged so that it is lower than the liquid level of the culture fluid in the settling chamber by creating a negative pressure in the settling chamber 12 using a negative pressure means separate from the discharge pipe. Even when the end opening is located lower than the liquid level of the culture fluid in the settling chamber, it is preferable that the end opening 1511 is located on the inflow path P in .
  • Perfusion culture system (culture device) 11. Culture tank 12. Settling chamber 121. Opening 13. Cooling device (cooling and flocculation device) 15. .. .. Ejection mechanism 1511. .. .. End opening 16. .. .. supply mechanism

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Abstract

培養液に分散した細胞の分離（及び上清の引き抜き）の工程において、細胞がダメージを受けることを低減することが可能な培養装置及び細胞分離方法の提供。　培養液中の細胞の培養を行う培養槽であって、培養液に少なくとも酸素の供給が行われる培養槽１１と、前記培養液中において開口１２１を有する沈降室１２と、沈降室１２内の培養液を冷却して、沈降室１２内の培養液に含まれる細胞を凝集させる冷却凝集装置１３と、沈降室１２内の培養液の上清を排出させる排出機構１５と、を備える、培養装置１。

Description

培養装置及び細胞分離方法
　本発明は、培養液中の細胞の培養を行う培養装置及び細胞が分散した培養液から細胞を分離するための細胞分離方法に関する。
　創薬や食品などの分野では、目的物の生産に細胞の培養技術が利用されることがあり、培養液中の細胞の密度を高めることができれば、目的物の生産効率を高めることができる。
　ところで、細胞の培養工程では、細胞は種々の代謝物を生成するため、これが細胞の増殖阻害や物質生産阻害の原因になり、細胞の培養効率を低下させることがあった。
　これを解消して細胞の高密度培養を実現する技術として、培養槽から培養液を取り出して、培養液に分散した細胞を分離すると共に、取り出された細胞を培養槽に戻し（細胞が分離された培養液の上清を引き抜き）、新鮮な培養液を加える灌流培養手法が知られている。
特開２０２１－１０３９５３号公報 特表２００５－５０１５５３号公報 国際公開第２０２０／１８９４１７号
　特許文献１～３は、灌流培養によって細胞を培養する灌流培養装置に関し、何れの装置においても、培養液に分散した細胞を分離するための分離槽（沈降槽）が設けられている。
　これらの培養装置では、分離槽が培養槽とは別に設けられ、培養槽から培養液を分離槽へと流入させて、分離槽で分離した細胞を培養槽に戻す構成となっている。
　このような構成においては、分離槽で分離されて培養槽に戻るまでの間（培養槽から引き抜かれてから再度培養槽に戻ってくるまでの間）、細胞に十分な酸素が供給され難くなること（培養槽で管理された培養条件ではなくなること）により、細胞がダメージを受ける場合があるという問題がある。
　本発明は、上記の点に鑑み、培養液に分散した細胞の分離（及び上清の引き抜き）の工程において、細胞がダメージを受けることを低減することが可能な培養装置及び細胞分離方法を提供することを目的とする。
（構成１）
　培養液中の細胞の培養を行う培養槽であって、前記培養液に少なくとも酸素の供給が行われる培養槽と、前記培養液中において開口を有する沈降室と、前記沈降室内の培養液を冷却して、前記沈降室内の培養液に含まれる細胞を凝集させる冷却凝集装置と、前記沈降室内の培養液の上清を排出させる排出機構と、を備える、培養装置。
（構成２）
　前記沈降室が、鉛直方向に対して傾斜して配置された管状の部材であることにより、前記傾斜によって上部側となる側面における前記沈降室内への前記培養液の流入経路と、前記傾斜によって下部側となる側面における前記培養槽への前記培養液の戻り経路と、を形成する、構成１に記載の培養装置。
（構成３）
　前記沈降室内に位置する前記排出機構の端部開口が、前記流入経路上となる位置に配されている、構成２に記載の培養装置。
（構成４）
　前記開口として、前記流入経路上に設けられる流入開口と、前記戻り経路上に設けられる戻り開口と、を備える、構成２又は３に記載の培養装置。
（構成５）
　前記沈降室内に位置する前記排出機構の端部開口が、前記沈降室内の前記培養液の液面付近となる位置に配されている、構成１から４の何れかに記載の培養装置。
（構成６）
　前記開口の設置深さが、培養中に前記培養槽内の前記培養液液面付近の泡が存在する泡存在領域よりも深い、構成１から５の何れかに記載の培養装置。
（構成７）
　前記培養槽内の前記培養液の液面高さと、前記沈降室内の前記培養液の液面高さが異なるように構成されている、構成１から６の何れかに記載の培養装置。
（構成８）
　構成１から７の何れかに記載の培養装置において使用される培養槽であって、培養液中において開口を有して前記培養槽に対して取り付けられた沈降室を備える、培養槽。
（構成９）
　細胞が分散した培養液から前記細胞を分離する細胞分離方法であって、前記培養液中において開口を有する沈降室を設け、前記沈降室内の培養液を冷却して前記沈降室内の培養液に含まれる細胞を凝集させつつ、前記沈降室内の培養液の上清を排出させる、細胞分離方法。
　本発明の培養装置、培養槽、及び細胞分離方法によれば、培養液に分散した細胞の分離（及び上清の引き抜き）の工程において細胞がダメージを受けることを低減することを、比較的簡易な構成で実現することができる。
本発明に係る実施形態の灌流培養システム（灌流培養装置）の構成の概略を示すブロック図 灌流培養システムの沈降室内の動作概念を示す概念図 沈降室（沈降管）の別の例を示す概念図 沈降室（沈降管）の別の例を示す概念図 沈降室（沈降管）の別の例を示す概念図
　以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。なお、以下の実施形態は、本発明を具体化する際の一形態であって、本発明をその範囲内に限定するものではない。
　図１は、本発明に係る実施形態の灌流培養システム（灌流培養装置）の構成の概略を示す図である。
　本実施形態の灌流培養システム１は、培養液中で、種々の細胞（例えば、動物、昆虫、植物等の細胞、微生物、細菌等）を培養する培養装置として構成される。
　灌流培養システム１は、培養液を保持する培養槽１１と、培養液を上清と沈殿物とに分離するための沈降室１２及び冷却装置１３と、沈降室内の培養液の上清を排出させる排出機構１５と、排出液を計量するための計量槽１４２と、排出液をためる貯留槽１８と、培養槽１１への新たな培養液の供給を行う供給機構１６と、供給する培養液を計量するための計量槽１４１と、培養液が入っているフィード液槽１７を備える。
　なお、特に図示していないが、灌流培養システム１は、各ポンプ、各開閉弁や各センサ、冷却装置のそれぞれと接続された制御部を備えており、以下で説明する動作が制御部によって制御される。
　培養槽１１は、培養対象となる細胞が分散された培養液を保持する部材で、特に図示しないが、培養液に酸素を供給するための機構などの培養液を所望の状態に維持するための種々の機構を備える。培養槽１１で培養液の状態を調整することにより、培養液中で細胞が適切に培養され、目的物の生成が可能になる。
　また、特に図示しないが、灌流培養システム１（培養槽１１）は、培養工程を適切に制御するための種々の機構（付帯設備）を備えた構成とすることが可能である。例えば、培養液の状態（溶存酸素やｐＨ、温度など）を計測する計測装置や、培養の進捗度を計測する計測装置（グルコース濃度などの計測装置）、培養液の状態を調整するための調整機構、培養液（新鮮な液体培地）や栄養素などを供給する供給機構、培養液を抜き出すサンプリング機構などの設備（付帯設備）を備えた構成とすることができる。培養槽１１と各種付帯設備によって、培養槽１１に保持された培養液が適切な状態に維持され、培養液内で細胞の培養が可能になることから、これらを培養装置と呼ぶことが可能である。
　沈降室１２は、灌流培養を行うために、培養槽１１の培養液から細胞を分離するための部材であり、培養液を沈降法によって上清と沈殿物に分離する役割を果たす。
　沈降室１２は、培養槽１１に対して設けられ、培養液中において開口１２１を有していることにより、その内部に培養液を有しつつ、当該培養液は培養槽１１との間で出入り可能な構成となっている。
　本実施形態における沈降室１２は、鉛直方向に対して傾斜して配置された管状の部材であり、後に説明するように、冷却装置１３の機能と相まって、「傾斜によって上部側となる側面における沈降室内への培養液の流入経路Ｐｉｎ（図２参照）」と、「傾斜によって下部側となる側面における培養槽への培養液の戻り経路Ｐｏｕｔ」と、を形成する。
　本実施形態における沈降室１２は、その管状の部材の一部（ここでは上部側）が培養槽１１の外部に突出した構成であり、培養槽１１に対して取り付けられているものである。当該取り付け構造において、沈降室１２は培養槽１１に対してその高さ方向の位置を調節可能とされている。これにより、培養条件の相違等による培養液の液面の高低に対応することができ、また、以下で説明する分離機能の調整のために、培養槽内の培養液の液面に対する沈降室の下端（開口１２１）の位置を調整することが可能である。なお、ここでは沈降室１２の取り付け高さの調節が可能なものを例としているが、所定の設計に基づき沈降室１２の取り付け高さが固定されているものであっても勿論よい。
　沈降室１２の内部には、排出管１５１が設けられ、沈降室１２内で分離された培養液の上清が、排出管１５１によって排出される。
　冷却装置（冷却凝集装置）１３は、沈降室１２が培養槽１１の外部に突出している部分に対して設置され、沈降室１２内の培養液を冷却して、培養液に含まれる細胞を凝集させる機能（細胞を凝集させることにより、その沈降速度を高める機能）を有する。加えて、培養液を冷却することで対流を生じさせ、沈降室１２が傾斜していることと相まって、前述の「流入経路Ｐｉｎ」と「戻り経路Ｐｏｕｔ」とを形成させる機能を有する。
　本実施形態の冷却装置１３は、ペルチェ素子を使用して、これを沈降室１２の外周に巻き付けるようにして設置することで構成されている。なお、本発明をこれに限るものではなく、沈降室１２を冷却可能な任意の装置を用いることができる。例えばチラーによる冷却媒体を沈降室の近傍や内部に循環させる循環路を設けること等によって、冷却装置を構成するもの等であってもよい。
　排出機構１５は、沈降室１２内の培養液の上清を貯留槽１８に排出させる流路を形成するものであり、
　　沈降室１２内に設置される排出管１５１と、
　　排出液を送るために流路上に設けられるポンプＰ２と、
　　排出液を計量するための計量槽１４２と、
　　これらの部材及び沈降室１２と貯留槽１８との間を相互に接続するパイプやチューブ等の各流路部材と、
　　流路上に設けられて流路の切り替えや開閉を行う各開閉弁Ｖ２、Ｖ３と、
　を備えて、沈降室１２と貯留槽１８との間を接続している。
　排出管１５１は中空のパイプによって構成され、図２にも示されるように、先端がＪ字状に湾曲しており、その先端の開口である端部開口１５１１が、上を向いて開口するように構成されている。本実施形態の排出管１５１は、その端部開口１５１１が、傾斜して配置される沈降室１２の上部側面１２ｕに近い位置に配置されている。これにより、「沈降室内で開口する排出機構の端部開口が、流入経路上となる位置に配され」るものとなる。
　なお、計量槽１４２、ポンプＰ２、開閉弁Ｖ２、Ｖ３（及びこれらを接続する流路部材や、フィルターＦ）については、特許文献１の図２で示される供給／排出部１６と同様の概念のものであるため、ここでの説明を省略する。特許文献１で示される供給／排出部１６と同様のものを用いることにより、培養液（上清）の抜き出し量を正確に制御することができる。
　供給機構１６は、排出機構１５によって排出された培養液に応じた量の新たな培養液を培養槽１１に供給する流路を構成するものであり、
　　培養液を送るために流路上に設けられるポンプＰ１と、
　　供給する培養液を計量するための計量槽１４１と、
　　これらの部材及び培養槽１１とフィード液槽１７の間を相互に接続するパイプやチューブ等の各流路部材と、
　　流路上に設けられて流路の切り替えや開閉を行う開閉弁Ｖ１と、
　を備えて、培養槽１１とフィード液槽１７との間を接続している。
　供給機構１６については、特許文献１の図３で示される供給部１８と同様の概念のものであるため、ここでの説明を省略する。特許文献１で示される供給部１８と同様のものを用いることにより、培養液の供給量を正確に制御することができる。
　なお、貯留槽１８とフィード液槽１７には、無菌フィルターＦを介して槽の内部空間と外部空間とを連通する通気ユニットが備えられている。また、特に図示しないが、培養槽１１についても、通気ユニットを備えた構成とすることができる。
　上記構成を有する本実施形態の灌流培養システム１は、沈降室１２及び冷却装置１３によって培養液を上清と沈殿物とに効率的に分離し、上清を排出機構１５によって貯留槽１８に排出させつつ、排出された上清に応じた量の新たな培養液をフィード液槽１７から供給機構１６によって培養槽１１へと供給することで、灌流培養を行う。
　上記処理動作において、培養液の分離が、培養槽１１に配置された沈降室１２内で行われる。
　当該培養液の分離は、本実施形態においては、沈降室１２及び冷却装置１３によってもたらされる２つの機能に基づいている。第１には、冷却装置によって沈降室１２内の培養液を冷却することで、細胞を凝集し、沈降させることで、培養液からの細胞の分離を効率化するものである。第２には、冷却装置によって沈降室１２内の培養液を冷却することで、沈降室内に対流を生じさせ、且つ、沈降室１２を傾斜させておくことで、「傾斜によって上部側となる側面における沈降室内への培養液の流入経路Ｐｉｎ」と、「傾斜によって下部側となる側面における培養槽への培養液の戻り経路Ｐｏｕｔ」と、を形成し、沈降する細胞を効率よく培養槽１１に戻すものである。
　図２は、沈降室１２内の動作概念を示す概念図である。
　沈降室１２は、下端側の開口１２１が培養液ＣＦの中で開口しており、上端側は密閉されている。この沈降室１２内に配された排出管１５１（上述の排出機構１５）によって吸引を行うと、沈降室１２の内部が負圧となり、沈降室１２内の液面が上昇し、液面が端部開口１５１１に達することで、培養液（上清）が排出管１５１（排出機構１５）によって引き抜かれる。当該構成により、「排出機構の端部開口が、沈降室内の培養液の液面付近となる位置に配され」るものである。
　沈降室１２内の細胞Ｃは、冷却装置１３による冷却によって凝集し、沈降速度が増加する。これによって、沈降室１２内の液面付近に位置することになる端部開口１５１１からは上清が排出されることになる（第１の機能）。
　また、この引抜き動作時に、培養槽１１内の培養液ＣＦが沈降室１２内に流入することになるが、沈降室１２内の培養液が冷却されていることにより、沈降室１２内で対流が生じる。この対流は、図２に示されるように、沈降室１２の上部側面１２ｕの側における沈降室１２内への培養液の流入経路Ｐｉｎと、下部側面１２ｄの側における培養槽１１への培養液の戻り経路Ｐｏｕｔと、を有する（沈降室１２の傾斜によってこのような傾向付けがなされる）。
　この対流により、図２からも理解されるように、沈降する細胞Ｃは、戻り経路Ｐｏｕｔ上の流れに乗って、効率的に培養槽１１へと戻されることになる。一方、端部開口１５１１は、流入経路Ｐｉｎ上の液面付近に位置しているため（凝集した細胞が沈降していく経路である「戻り経路Ｐｏｕｔ」に位置していないことにより）、含まれている細胞が少ない上清を排出することができる。
　上記のように、本実施形態の沈降室１２は、培養液を培養槽１１との間で循環させながら細胞の分離を行うことができ、従って、培養液に分散した細胞の分離（及び上清の引き抜き）の工程において細胞がダメージを受けることを低減すること（常時酸素等を適切に供給すること）ができる。
　なお、本実施形態では、冷却による細胞の凝集という第１の機能と、対流及び傾斜による流入経路と戻り経路の形成という第２の機能と、の双方の機能を有し、好適なものであるが、本発明をこれらの双方を有するものに限るというものではなく、いずれか一方の機能のみを利用するものであっても構わない。
　以上のごとく、本実施形態の灌流培養システム（培養装置）、培養槽、及び細胞分離方法によれば、培養液に分散した細胞の分離（及び上清の引き抜き）の工程において、細胞がダメージを受けてしまうことを低減することができ、なお且つこれを比較的簡易な構成で実現することができる。
　簡易な構成であることにより、シングルユースとして用いる場合にも好適である。例えば、交換部品（シングルユース品）として、培養槽部分（培養液中において開口を有する位置に取り付けられた沈降室を備える培養槽）を、比較的安価に提供すること等が可能となる。
　なお、分離効率を高めるためには、流入経路Ｐｉｎにおける流入する培養液の線速度の上昇成分が、凝集した細胞Ｃの沈降速度よりも遅くなるように、ポンプＰ２を制御することが好ましい。
　一方で、培養槽１１内の細胞密度が高くなり過ぎた場合に、細胞の抜き取り（培養槽１１内の細胞量の調整）をしたい場合には、吸引を増大する（上記とは逆に、流入経路Ｐｉｎにおける流入する培養液の線速度を、凝集した細胞Ｃの沈降速度よりもより速くする）ことだけで簡単にこれを行うことができる。細胞の抜き取りをする際には、冷却装置１３による冷却を停止するようにしてもよい。
　これらの制御（ポンプ等の制御）は、設定値に従って動作（制御部が設定値に基づいて各部の動作を制御）するものであってもよいし、培養槽１１内の細胞密度をセンサ等（例えば、特許文献１に記載の計測部２２等を用いること）によって測定し、当該測定値に基づいて、細胞密度が所定範囲となるようにＰＩＤ等のフィードバック制御によって動作（センサ値に基づいて制御部が各部の動作を制御）させるものであってもよい。
　本実施形態では、沈降室１２の開口１２１が、管状の部材である沈降室１２の一端（下端）において形成されているものを例としているが、本発明をこれに限るものではなく、培養液が培養槽との間で出入り可能である（少なくとも培養槽からの培養液の流入が可能な）開口であれば、任意の開口とすることができる。
　ここで、開口の液面に対する位置（深さ）は、「培養中に培養槽内の培養液液面付近の泡が存在する泡存在領域よりも深い」ことが好ましい。
　図３はこの点を説明するための概略図である。
　培養中においては、培養槽内の培養液で生じた泡が、液面ＷＳ１付近に浮んでいる状態となることがある。この泡に対して細胞が付着しやすく、この泡が存在する泡存在領域ＢＺ（図３の斜線部分）に開口１２１が位置していると、泡に付着した細胞を吸い込みやすく、細胞の分離効率が上がり難くなるおそれがある。これに対し、図３に示されるように、開口１２１の深さＤ１を、泡存在領域ＢＺよりも深く設定しておくことにより、細胞の分離効率を高くすることができる。
　また、本実施形態では、開口が１つであるものを例としているが、本発明をこれに限るものではなく、開口が複数あるものであってもよい。例えば、開口として、「流入経路」上に設けられる流入開口と、「戻り経路」上に設けられる戻り開口と、をそれぞれ形成するようにしてもよい。図５にはこのようなものの例を示した。図５の沈降室１２－２では、流入経路Ｐｉｎ用の流入開口１２１１と、戻り経路Ｐｏｕｔ用の戻り開口１２１２が、別個の開口として形成されている。それぞれの経路上にそれ専用の開口とすることで、流入経路と戻り経路がより形成されやすくなることが期待できるものである。なお、上清が排出されるため、流量としては流入経路Ｐｉｎの方が多い。従って、流入開口１２１１を戻り開口１２１２よりも大きく形成するようにしてもよい。
　本実施形態では沈降室が管状の部材であるものを例としたが、本発明をこれに限るものではなく、沈降室は、培養槽内の培養液中において開口を有する（即ち、その内部に培養液を保持し（所定の区画内に培養液を囲い）つつ、培養液が培養槽との間で出入り可能である）任意の形状の部材であってよい。
　また、本実施形態では、沈降室１２の上部側が培養槽の外部に突出した構成を例としたが、培養槽の側面において沈降室１２の一部が突出しているような構成であってもよい。また、本実施形態では、沈降室１２の一部を培養槽の外部に突出させて、当該外部に突出している部分を冷却装置で冷却するものを例としているが、本発明をこれに限るものではなく、例えば、沈降室の全体が培養槽の内部に配置されているもの等であってもよい。例えば、本実施形態では冷却装置が沈降室の外部から沈降室を冷却するものを例としているが、沈降室の内部に冷却装置を設けつつ、沈降室の全体が培養槽の内部に配置されるもの等であってもよい。この場合、沈降室を熱伝導率の低い部材で構成することにより、培養槽における培養液の温度管理への影響を低減させつつ、沈降室内に設けた冷却装置によって沈降室内の培養液を冷却して細胞を凝集させることができる。
　本実施形態では、排出管１５１の端部がＪ字状に湾曲して、その端部開口１５１１が上を向くように構成されているものを例としたが、本発明をこれに限るものではなく、排出管１５１の端部開口が側面を向いているものや、例えば図３の排出管１５１－１の端部開口１５１１－１のように、下を向いて開口しているもの等であってもよい。「排出機構の端部開口が、沈降室内の培養液の液面付近となる位置に配され」るように構成することで、細胞があまり含まれていない上清を引き抜く（排出する）ことができる（分離効率を向上することができる）。
　本実施形態では、端部開口が、培養槽内の培養液の液面より高い位置であることにより、図３に示されるように、沈降室１２－１内の培養液の液面ＷＳ２が、培養槽内の培養液の液面ＷＳ１よりも高くなるものとしている。これによれば、より高い位置までの細胞の上昇はし難いと考えられるため、細胞の分離効率を高くし得るという作用効果を得ることができるため好適であるが、本発明をこれに限るものではない。
　図４は、培養槽内の培養液の液面高さと沈降室内の培養液の液面高さが違うもののうち、沈降室１２－１内の培養液の液面ＷＳ２を、培養槽内の培養液の液面ＷＳ１よりも低くした例の概略図である。前述のごとく、沈降室の上部側は密閉されている（沈降室の上部で排出管が挿通されているが、排出管の端部開口が液面ＷＳ２と同じ高さとなった後は、沈降室内の空気は抜けない構成である）ため、排出管１５１－１の端部開口１５１１－１の位置を、培養槽内の培養液の液面ＷＳ１よりも低くすることで、液面ＷＳ２は液面ＷＳ１より低くなる。このような構成とすると、水圧がかかるため、引き抜き（排出）用のポンプ（図１のポンプＰ２）の負荷を低減することができる。
　ここでは培養槽内の培養液の液面高さと、沈降室内の培養液の液面高さが異なるように構成されているものを例としているが、培養槽内の培養液の液面高さと、沈降室内の培養液の液面高さが同じになるものであってもよい。
　なお、引き抜き（排出）用のポンプの能力に問題が無い場合には、沈降室の冷却効果や、その冷却の培養槽内の培養液への影響の低減、加えて対流の効率的な形成等の観点においては、本実施形態のように、培養槽内の培養液の液面より端部開口が高く設定され、これにより、引き抜き時には沈降室内の液面が、培養槽内の培養液の液面より高くなる構成の方がより好適である。
　本実施形態では、沈降室１２の培養槽１１に対する取り付け高さを調整できるものを例としているが、これに替えて（或いはこれに加えて）、沈降室１２に対する排出管１５１（端部開口１５１１）の高さを調節可能としてもよい。
　本実施形態では、その構成上、上清の排出時には必ず排出管の端部開口が沈降室内の液面付近に位置することになるが、本発明をこれに限るものではない。例えば、排出管とは別途の負圧手段により沈降室１２内を負圧にすることで、排出管の端部開口の高さが、沈降室内の培養液の液面より低い位置となるように配置するものであってもよい。端部開口を沈降室内の培養液の液面より低い位置に設ける場合においても、端部開口１５１１は流入経路Ｐｉｎ上に設けることが好ましい。
　１．．．灌流培養システム（培養装置）
　　１１．．．培養槽
　　１２．．．沈降室
　　　１２１．．．開口
　　１３．．．冷却装置（冷却凝集装置）
　　１５．．．排出機構
　　　１５１１．．．端部開口
　　１６．．．供給機構

Claims (8)

  1. 　培養液中の細胞の培養を行う培養槽であって、前記培養液に少なくとも酸素の供給が行われる培養槽と、
    　前記培養液中において開口を有する沈降室と、
    　前記沈降室内の培養液を冷却して、前記沈降室内の培養液に含まれる細胞を凝集させる冷却凝集装置と、
    　前記沈降室内の培養液の上清を排出させる排出機構と、
    　を備える、培養装置。
  2. 　前記沈降室が、鉛直方向に対して傾斜して配置された管状の部材であることにより、前記傾斜によって上部側となる側面における前記沈降室内への前記培養液の流入経路と、前記傾斜によって下部側となる側面における前記培養槽への前記培養液の戻り経路と、を形成する、請求項１に記載の培養装置。
  3. 　前記沈降室内に位置する前記排出機構の端部開口が、前記流入経路上となる位置に配されている、請求項２に記載の培養装置。
  4. 　前記開口として、前記流入経路上に設けられる流入開口と、前記戻り経路上に設けられる戻り開口と、を備える、請求項２又は３に記載の培養装置。
  5. 　前記沈降室内に位置する前記排出機構の端部開口が、前記沈降室内の前記培養液の液面付近となる位置に配されている、請求項１に記載の培養装置。
  6. 　前記開口の設置深さが、培養中に前記培養槽内の前記培養液液面付近の泡が存在する泡存在領域よりも深い、請求項１に記載の培養装置。
  7. 　前記培養槽内の前記培養液の液面高さと、前記沈降室内の前記培養液の液面高さが異なるように構成されている、請求項１に記載の培養装置。
  8. 　細胞が分散した培養液から前記細胞を分離する細胞分離方法であって、
    　前記培養液中において開口を有する沈降室を設け、前記沈降室内の培養液を冷却して前記沈降室内の培養液に含まれる細胞を凝集させつつ、前記沈降室内の培養液の上清を排出させる、細胞分離方法。
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