JP3328287B2 - 細胞培養に使用される粒子沈降タンク - Google Patents
細胞培養に使用される粒子沈降タンクInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、粒子の沈降（settle）装置および細胞培養
への上記装置の使用に関するものである。本発明は、ポ
リペプチドやタンパク質等の分泌された物質、特にモノ
クローナル抗体の製造を目的とした動物細胞の培養に適
用される。
への上記装置の使用に関するものである。本発明は、ポ
リペプチドやタンパク質等の分泌された物質、特にモノ
クローナル抗体の製造を目的とした動物細胞の培養に適
用される。
近年、様々な有用な産物の製造を目的とした動物細胞
の培養への興味が高まっている。細胞融合技術（ケラー
（Kehler）及びミルスタイン（Milstein）、ネーチャー
（Nature）256巻、ページ495〜597（1975年））によっ
て、一定の特異性を有するマウスのモノクローナル抗体
を分泌する多くの様々なハイブリドーマを作製すること
が可能になった。モノクローナル抗体は、免疫精製（im
munopurification）に関しては治療薬及び診断薬として
有用であることが知られており、さらに調査具（resear
ch tool）としても有用であることが知られている。ま
た、ヒトモノクローナル抗体が細胞融合プロセスから製
造された（トンプソン（Thompson）ら、イムノロジー
（Immunology）58巻、ページ157（1986年））ことによ
り、さらに利用可能性の範囲が広がった。組換DNA技術
は、モノクローナル抗体を変換及び改良するのに使用さ
れ、この際、宿主として様々な動物細胞を依然として用
いることが多かった。また、組換DNA技術は、外来遺伝
子によってエンコードされた産物を産生可能な遺伝子を
有する細胞系を作製するのにも使用されてきた。動物細
胞は、動物細胞がタンパク質をグリコシル化し翻訳後修
飾を行うことができるため、しばしば細菌や酵母より優
れていることが分かった。
の培養への興味が高まっている。細胞融合技術（ケラー
（Kehler）及びミルスタイン（Milstein）、ネーチャー
（Nature）256巻、ページ495〜597（1975年））によっ
て、一定の特異性を有するマウスのモノクローナル抗体
を分泌する多くの様々なハイブリドーマを作製すること
が可能になった。モノクローナル抗体は、免疫精製（im
munopurification）に関しては治療薬及び診断薬として
有用であることが知られており、さらに調査具（resear
ch tool）としても有用であることが知られている。ま
た、ヒトモノクローナル抗体が細胞融合プロセスから製
造された（トンプソン（Thompson）ら、イムノロジー
（Immunology）58巻、ページ157（1986年））ことによ
り、さらに利用可能性の範囲が広がった。組換DNA技術
は、モノクローナル抗体を変換及び改良するのに使用さ
れ、この際、宿主として様々な動物細胞を依然として用
いることが多かった。また、組換DNA技術は、外来遺伝
子によってエンコードされた産物を産生可能な遺伝子を
有する細胞系を作製するのにも使用されてきた。動物細
胞は、動物細胞がタンパク質をグリコシル化し翻訳後修
飾を行うことができるため、しばしば細菌や酵母より優
れていることが分かった。
したがって、動物細胞融合技術及び動物細胞における
組換DNA技術は、ワクチンの生産における従来の役割に
加えて、有用な産物の生産において重要な役割を果たし
ている。
組換DNA技術は、ワクチンの生産における従来の役割に
加えて、有用な産物の生産において重要な役割を果たし
ている。
経済的なコストで十分量このような産物を作製するた
めに、細胞培養プロセスはスケールアップされる必要が
ある。従来のバッチ発酵技術は攪拌槽またはエアーリフ
ト型の発酵槽（airlift fermenter）で行われている。
大きな発酵槽の例（例えば、2,000dm3のエアーリフト型
の発酵槽）もいくつかすでに存在する。このような発酵
槽は大きな施設内に建設されなければならず、設備を供
給する必要がある。比較的低いことが多いが、生産品の
下流加工（downstream processing）が一般的に必要が
ある。
めに、細胞培養プロセスはスケールアップされる必要が
ある。従来のバッチ発酵技術は攪拌槽またはエアーリフ
ト型の発酵槽（airlift fermenter）で行われている。
大きな発酵槽の例（例えば、2,000dm3のエアーリフト型
の発酵槽）もいくつかすでに存在する。このような発酵
槽は大きな施設内に建設されなければならず、設備を供
給する必要がある。比較的低いことが多いが、生産品の
下流加工（downstream processing）が一般的に必要が
ある。
細胞は発酵槽内に保持されるが産物が含むが細胞を含
まない上清は連続的に抽出され、発酵槽には数週間ある
いは数ヶ月の期間新しい培地を補給し続ける連続灌流技
術に興味が集まってきた。この技術によって、発酵槽内
の細胞密度をより高くすることが可能であり、これによ
り、高い基質から産物への変換率が得られ、発酵時間を
より良好に利用することができ；さらに、より小さな発
酵槽の使用が可能になる。次に、細胞を保持するために
は、発酵槽内に細胞を物理的に保持し、最終的には産物
の流れとなる周辺の培地から細胞を分離する手段がなけ
ればならない。動物細胞は細胞壁がなく感受性を有する
ため、上記保持手段は緩やかでなければならない。上記
目的に使用される装置または方法は、重大な破壊を伴う
ことなくまたはプロセスを干渉することなく実質的に連
続した無菌操作が可能である必要がある。設計は、簡潔
で、強く、衛生的でかつ経済的なスケールアップが可能
でなければならない。また、有害な生物体が中で成長す
る必要がある際には、封じ込めが可能である必要があ
る。
まない上清は連続的に抽出され、発酵槽には数週間ある
いは数ヶ月の期間新しい培地を補給し続ける連続灌流技
術に興味が集まってきた。この技術によって、発酵槽内
の細胞密度をより高くすることが可能であり、これによ
り、高い基質から産物への変換率が得られ、発酵時間を
より良好に利用することができ；さらに、より小さな発
酵槽の使用が可能になる。次に、細胞を保持するために
は、発酵槽内に細胞を物理的に保持し、最終的には産物
の流れとなる周辺の培地から細胞を分離する手段がなけ
ればならない。動物細胞は細胞壁がなく感受性を有する
ため、上記保持手段は緩やかでなければならない。上記
目的に使用される装置または方法は、重大な破壊を伴う
ことなくまたはプロセスを干渉することなく実質的に連
続した無菌操作が可能である必要がある。設計は、簡潔
で、強く、衛生的でかつ経済的なスケールアップが可能
でなければならない。また、有害な生物体が中で成長す
る必要がある際には、封じ込めが可能である必要があ
る。
様々な装置または方法が細胞を保持するために報告さ
れまたは使用されてきた。これらとしては、外部若しく
は内部スピンフィルター（spinfilter）（ヒンメルファ
ルブ（Himmelfarb）ら、サイエンス（Science）164巻、
ページ555〜557（1969年））、膜分離器（クァチェック
（Knazek）ら、サイエンス（Science）178巻、ページ65
〜67（1972年））、細胞の取込み（entrapment）（ニー
ルソン（Nilsson）ら、ネーチャー（Nature）302巻、ペ
ージ629〜630（1983年））、被包（encapsulation）
（ジャーヴィス（Jarvis）及びグルディナ（Grdina）、
バイオ テクニクス（Bio Techniques）１巻、ページ22
〜27（1983年））または重力沈降（gravitational sett
ling）（キタノ（Kitano）ら、アプル マイクロバイオ
ル バイオテクノル（Appl.Microbiol.Biotechnol.）24
巻、ページ282〜286（1986年）及びバット（Batt）ら、
バイオテクノル プログ（Biotechnol.Prog.）６巻、ペ
ージ458〜464（1990年））が挙げられる。
れまたは使用されてきた。これらとしては、外部若しく
は内部スピンフィルター（spinfilter）（ヒンメルファ
ルブ（Himmelfarb）ら、サイエンス（Science）164巻、
ページ555〜557（1969年））、膜分離器（クァチェック
（Knazek）ら、サイエンス（Science）178巻、ページ65
〜67（1972年））、細胞の取込み（entrapment）（ニー
ルソン（Nilsson）ら、ネーチャー（Nature）302巻、ペ
ージ629〜630（1983年））、被包（encapsulation）
（ジャーヴィス（Jarvis）及びグルディナ（Grdina）、
バイオ テクニクス（Bio Techniques）１巻、ページ22
〜27（1983年））または重力沈降（gravitational sett
ling）（キタノ（Kitano）ら、アプル マイクロバイオ
ル バイオテクノル（Appl.Microbiol.Biotechnol.）24
巻、ページ282〜286（1986年）及びバット（Batt）ら、
バイオテクノル プログ（Biotechnol.Prog.）６巻、ペ
ージ458〜464（1990年））が挙げられる。
一般的に用いられているほとんどの装置は、実験用の
スケールでさらには場合によっては工業的なスケールで
良好に作動している；しかしながら、これらの装置はす
べて欠点を有する。スピンフィルター装置は、目詰まり
を起こしやすく、機械的なシールによっており、破壊さ
れまたは集結性（integrity）が失われやすい。膜装置
は、詰まりやくす、実験中は繰り返し交換する必要があ
るため無菌性を損なう危険性を伴う。また、膜装置は、
膜を清潔に保つために高い接線方向の流量を必要とし、
このことは剪断作用に感受性のある細胞には問題が生じ
うる。
スケールでさらには場合によっては工業的なスケールで
良好に作動している；しかしながら、これらの装置はす
べて欠点を有する。スピンフィルター装置は、目詰まり
を起こしやすく、機械的なシールによっており、破壊さ
れまたは集結性（integrity）が失われやすい。膜装置
は、詰まりやくす、実験中は繰り返し交換する必要があ
るため無菌性を損なう危険性を伴う。また、膜装置は、
膜を清潔に保つために高い接線方向の流量を必要とし、
このことは剪断作用に感受性のある細胞には問題が生じ
うる。
細胞の被包技術は、しばしば、被膜内の生存率が低い
が、抗体はその中に保持される。被膜の形成は、スケー
ルアップを成功させることが困難な複雑なプロセスであ
る。アガロースまたはアルギン酸塩等の物質製のビーズ
内への細胞の取込みは長期間の培養ではビーズの崩壊が
起こり、ここでもスケールアップの問題が生じる。
が、抗体はその中に保持される。被膜の形成は、スケー
ルアップを成功させることが困難な複雑なプロセスであ
る。アガロースまたはアルギン酸塩等の物質製のビーズ
内への細胞の取込みは長期間の培養ではビーズの崩壊が
起こり、ここでもスケールアップの問題が生じる。
重力沈降装置は、構造が簡単で壊れるような動く部分
を有さないので、非常に有効である。また、フィルター
または膜を持たないので、通常の使用では目詰まりや壊
れることもありえない。沈降タンクの使用は簡単にで
き、これにより、細胞の懸濁液がタンク中に残され、細
胞は底に沈み細胞を含まない上層が残る。このタイプの
タンクの主な欠点は、付属する発酵槽との関係で大き
く、細胞が内に止まる時間が長いため代謝効果が損なわ
れることがある。代謝効果はタンクを冷却することによ
って克服できる；しかしながら、タンクの大きさは依然
として問題であり、ドートムンドセトラー（Dortmund S
ettler）（フルシャー（Hulscher）ら、バイオテクノロ
ジー アンド バイオエンジニアリング（Biotechnolog
y and Bioengineering）39巻、ページ442〜446（1992
年））等の設計の改良が必要である。
を有さないので、非常に有効である。また、フィルター
または膜を持たないので、通常の使用では目詰まりや壊
れることもありえない。沈降タンクの使用は簡単にで
き、これにより、細胞の懸濁液がタンク中に残され、細
胞は底に沈み細胞を含まない上層が残る。このタイプの
タンクの主な欠点は、付属する発酵槽との関係で大き
く、細胞が内に止まる時間が長いため代謝効果が損なわ
れることがある。代謝効果はタンクを冷却することによ
って克服できる；しかしながら、タンクの大きさは依然
として問題であり、ドートムンドセトラー（Dortmund S
ettler）（フルシャー（Hulscher）ら、バイオテクノロ
ジー アンド バイオエンジニアリング（Biotechnolog
y and Bioengineering）39巻、ページ442〜446（1992
年））等の設計の改良が必要である。
傾斜沈降（inclined sedimentation）の理論は、赤血
球の沈降及びロールの形成に関する研究を通して、イー
パウンダー（E Pounder）（ジェー エックスプ フ
ィジオル（J.Exp.Physiol.）15巻、ページ235〜253（19
25年））によって1925年に開発された。この理論はバイ
オマスのリサイクルに広く適用されてきたが、近年では
動物細胞培養においてのみ使用されている。最も簡単な
形態は、垂直方向から傾斜した長い管または流路の上部
接斜面（facing slope）上に沈降させることによって、
懸濁液から細胞を除去するものである。ここで、細胞
は、容器の底に滑り落ちて薄い沈降層を形成する。この
ようにして、細胞は底部で濃縮され、上清は上部で浄化
される。濃縮された細胞は、発酵槽に戻されることによ
り発酵槽内に細胞を維持し、分泌分子を含む浄化された
上清は収穫物として上部から抽出される。
球の沈降及びロールの形成に関する研究を通して、イー
パウンダー（E Pounder）（ジェー エックスプ フ
ィジオル（J.Exp.Physiol.）15巻、ページ235〜253（19
25年））によって1925年に開発された。この理論はバイ
オマスのリサイクルに広く適用されてきたが、近年では
動物細胞培養においてのみ使用されている。最も簡単な
形態は、垂直方向から傾斜した長い管または流路の上部
接斜面（facing slope）上に沈降させることによって、
懸濁液から細胞を除去するものである。ここで、細胞
は、容器の底に滑り落ちて薄い沈降層を形成する。この
ようにして、細胞は底部で濃縮され、上清は上部で浄化
される。濃縮された細胞は、発酵槽に戻されることによ
り発酵槽内に細胞を維持し、分泌分子を含む浄化された
上清は収穫物として上部から抽出される。
通常、傾斜沈降の理論は、以下の、バット（Batt）ら
（バイオテクノルプログ（Biotechnol.Prog.）６巻、ペ
ージ458〜464（1990年））に示された方程式によって要
約できる： Ｓ（ｖ）＝vw（lsinθ＋bcosθ） ただし、Ｓ（ｖ）は浄化された流体の容積流量であ
り、 ｖは粒子の沈降速度であり、 ｗは沈降タンク板の幅であり、 ｌは沈降タンク板の長さであり、 θは垂直方向に対する傾斜角度であり、 ｂは沈降タンクの傾斜壁間の間隔である。
（バイオテクノルプログ（Biotechnol.Prog.）６巻、ペ
ージ458〜464（1990年））に示された方程式によって要
約できる： Ｓ（ｖ）＝vw（lsinθ＋bcosθ） ただし、Ｓ（ｖ）は浄化された流体の容積流量であ
り、 ｖは粒子の沈降速度であり、 ｗは沈降タンク板の幅であり、 ｌは沈降タンク板の長さであり、 θは垂直方向に対する傾斜角度であり、 ｂは沈降タンクの傾斜壁間の間隔である。
上記方程式から、例えば、生育不能な（non−viabl
e）ハイブリドーマは1.1cm/時間であり、生存可能な（v
iable）ハイブリドーマは2.9cm/時間である等、様々な
沈降速度を有する粒子に関する沈殿装置の性能特性を予
想することが可能である。
e）ハイブリドーマは1.1cm/時間であり、生存可能な（v
iable）ハイブリドーマは2.9cm/時間である等、様々な
沈降速度を有する粒子に関する沈殿装置の性能特性を予
想することが可能である。
今日まで設計または試験されたすべての装置は非常に
小さいスケールで使用されるのみであった。これらの装
置は、大きくするとそれに比例して工業的スケールで使
用できる細胞の滞留時間が長くなるため、容積を大きく
することはできなかった。
小さいスケールで使用されるのみであった。これらの装
置は、大きくするとそれに比例して工業的スケールで使
用できる細胞の滞留時間が長くなるため、容積を大きく
することはできなかった。
沈降タンクの設計を変更することによって沈降タンク
の大きさを大きくすることが可能であることがここで発
見された。上記を可能にする設計の変更は１つを超える
沈降面を提供することである。
の大きさを大きくすることが可能であることがここで発
見された。上記を可能にする設計の変更は１つを超える
沈降面を提供することである。
本発明の第一の概念によると、垂直方向に対して傾斜
した複数の沈降面を規定する手段、および動物細胞を細
胞上清液から分離して面上に沈降層を形成し細胞を滑り
降ろすことが可能な速度で細胞を含む液体を沈降面の上
方向に流す手段からなり、該沈降面を規定する手段は、
沈降面の下部に位置する、分離される細胞を含む液体の
流入口、細胞が分離された液体の流出口を備える箱型部
材であるハウジング中に含まれ、該流入口及び流出口は
それぞれ衛生的な連結部を備える、無菌または滅菌条件
下で細胞上清液から動物細胞を分離する装置を提供する
ものである。次に、このようにして分離された粒子を集
め、再使用され、廃棄され、または使用目的によって
は、さらに処理および／または取扱される。
した複数の沈降面を規定する手段、および動物細胞を細
胞上清液から分離して面上に沈降層を形成し細胞を滑り
降ろすことが可能な速度で細胞を含む液体を沈降面の上
方向に流す手段からなり、該沈降面を規定する手段は、
沈降面の下部に位置する、分離される細胞を含む液体の
流入口、細胞が分離された液体の流出口を備える箱型部
材であるハウジング中に含まれ、該流入口及び流出口は
それぞれ衛生的な連結部を備える、無菌または滅菌条件
下で細胞上清液から動物細胞を分離する装置を提供する
ものである。次に、このようにして分離された粒子を集
め、再使用され、廃棄され、または使用目的によって
は、さらに処理および／または取扱される。
このような「多板状の」沈降装置は、コンパクトであ
り、滅菌設計の原理に従うことが可能であり、スケール
アップでき、さらに連続して操作することが可能であ
る。したがって、本発明による装置は、動物細胞培養の
最も厳しい要求にも合致でき、細胞の保持及び高い生産
性が得られる。また、本発明による装置は、粒子を仕切
り、粒子を含む大量の液体の流れから粒子を保持する浄
化用の装置としても使用できる。
り、滅菌設計の原理に従うことが可能であり、スケール
アップでき、さらに連続して操作することが可能であ
る。したがって、本発明による装置は、動物細胞培養の
最も厳しい要求にも合致でき、細胞の保持及び高い生産
性が得られる。また、本発明による装置は、粒子を仕切
り、粒子を含む大量の液体の流れから粒子を保持する浄
化用の装置としても使用できる。
このような設計によって、本発明による沈降装置は、
大量の液体に対して、複数の沈降面によって規定され
た、（既知の装置と比較すると）非常に大きな表面積を
有する。
大量の液体に対して、複数の沈降面によって規定され
た、（既知の装置と比較すると）非常に大きな表面積を
有する。
本発明による装置は多くの用途が考えられるが、最も
一般的なものの一つとしては、細胞、特に動物源の細胞
の、連続発酵がある。本装置は、発酵槽の流出口に連結
され、細胞上清液からすべての細胞をまたは選択された
細胞集団（例えば、生存可能な細胞とは沈降特性が異な
る生育不能な細胞）を除去する。本発明は、モノクロー
ナル抗体を排出する培養ハイブリドーマ等の、タンパク
質産生細胞の発酵に特に適用される。
一般的なものの一つとしては、細胞、特に動物源の細胞
の、連続発酵がある。本装置は、発酵槽の流出口に連結
され、細胞上清液からすべての細胞をまたは選択された
細胞集団（例えば、生存可能な細胞とは沈降特性が異な
る生育不能な細胞）を除去する。本発明は、モノクロー
ナル抗体を排出する培養ハイブリドーマ等の、タンパク
質産生細胞の発酵に特に適用される。
本装置は少なくとも３、５、10または15枚の様々な大
きさの沈降面積を提供する沈降面を有することが好まし
い。いくつかの、または好ましくはすべての面を規定す
る手段が取り外し可能である際には、より大きな汎用性
が得られる。
きさの沈降面積を提供する沈降面を有することが好まし
い。いくつかの、または好ましくはすべての面を規定す
る手段が取り外し可能である際には、より大きな汎用性
が得られる。
各面の沈降特性は等しくない場合には類似であるた
め、本発明のほとんどの実施態様においては、面は相互
に平行である。しかしながら、場合によっては、特定の
面上の沈降特性が異なるように、例えば、液体の流入口
部位等から生じる様々な面の流量が異なるように、板の
うち少なくとも１つが互いに若干集束する（あるいは末
広になる）ことが望ましい。
め、本発明のほとんどの実施態様においては、面は相互
に平行である。しかしながら、場合によっては、特定の
面上の沈降特性が異なるように、例えば、液体の流入口
部位等から生じる様々な面の流量が異なるように、板の
うち少なくとも１つが互いに若干集束する（あるいは末
広になる）ことが望ましい。
沈降面を規定する手段は板であることが好ましく、上
部面（ここで沈降及び滑りが起こる）が上記を目的に使
用される。鏡面磨きされた（mirror−polished）ステン
レス鋼によって優れた面が得られる。必要であればまた
は好ましくは、特に鏡面磨きされた（mirror−polishe
d）ステンレス鋼より安価な（及びより有効でない）面
を用いる際には、面をシリコーン材料等の、適当な潤滑
剤で被覆する；ジメチルジクロロシランが一例として挙
げられる。板は、除去可能なように、積重ねて配置して
もよい；他の実施態様としては、個々の板または板の組
み合わせが取り外し可能である。
部面（ここで沈降及び滑りが起こる）が上記を目的に使
用される。鏡面磨きされた（mirror−polished）ステン
レス鋼によって優れた面が得られる。必要であればまた
は好ましくは、特に鏡面磨きされた（mirror−polishe
d）ステンレス鋼より安価な（及びより有効でない）面
を用いる際には、面をシリコーン材料等の、適当な潤滑
剤で被覆する；ジメチルジクロロシランが一例として挙
げられる。板は、除去可能なように、積重ねて配置して
もよい；他の実施態様としては、個々の板または板の組
み合わせが取り外し可能である。
面、及び本発明の好ましい実施態様においては板自身
が垂直方向に対して傾斜する角度は装置の特殊な器具に
よって決定される。
が垂直方向に対して傾斜する角度は装置の特殊な器具に
よって決定される。
一般的には、角度は10゜〜50゜または80゜であるが、
多くの用途では20゜〜40゜、または約30゜である。傾斜
角度が調節できる手段が好ましい。このような手段は調
節可能な脚またはスタンドであってもよい。
多くの用途では20゜〜40゜、または約30゜である。傾斜
角度が調節できる手段が好ましい。このような手段は調
節可能な脚またはスタンドであってもよい。
傾斜角度は、装置が行う分離作業によって設定される
パラメーターの一つである。大量の液体は、一部のみを
除去することを目的とする、異種の粒子集団を含むもの
であってもよいと考えられる。様々な密度及び直径を有
する粒子は異なる速度で沈降するため、傾斜角度を含
む、装置のパラメーターは不必要な粒子を除去するよう
に設定することができる。例えば、0.1cm/時間より大き
いまたは0.01〜10cm/時間の沈降速度を有する粒子を除
去することが望ましい；ハイブリドーマ技術に本発明を
適用する際には、生育不能な細胞から生存可能な細胞を
分離することが望ましい。
パラメーターの一つである。大量の液体は、一部のみを
除去することを目的とする、異種の粒子集団を含むもの
であってもよいと考えられる。様々な密度及び直径を有
する粒子は異なる速度で沈降するため、傾斜角度を含
む、装置のパラメーターは不必要な粒子を除去するよう
に設定することができる。例えば、0.1cm/時間より大き
いまたは0.01〜10cm/時間の沈降速度を有する粒子を除
去することが望ましい；ハイブリドーマ技術に本発明を
適用する際には、生育不能な細胞から生存可能な細胞を
分離することが望ましい。
他のパラメーターとしては、液体の流速及び面の長さ
（流れの方向に沿った）が挙げられる。液体の流速は装
置の特殊な用途によって完全に変化する。細胞をリアク
ターシステムに保持しようとする、細胞上清液体からハ
イブリドーマ細胞を分離する場合では、付属した発酵槽
の面から発酵槽の後ろへの細胞含有液の流速は、しばし
ば、0.5〜5dm3/時間であり、約1dm3/時間であることが
好ましい。この速度は細胞のタイプによって変化する；
細胞を流れ及び戻りのパイプウォーク（return pipewor
k）の中で実質的な細胞の沈降を防止するのに十分な速
度で発酵槽に戻すことが初期の必要条件である。
（流れの方向に沿った）が挙げられる。液体の流速は装
置の特殊な用途によって完全に変化する。細胞をリアク
ターシステムに保持しようとする、細胞上清液体からハ
イブリドーマ細胞を分離する場合では、付属した発酵槽
の面から発酵槽の後ろへの細胞含有液の流速は、しばし
ば、0.5〜5dm3/時間であり、約1dm3/時間であることが
好ましい。この速度は細胞のタイプによって変化する；
細胞を流れ及び戻りのパイプウォーク（return pipewor
k）の中で実質的な細胞の沈降を防止するのに十分な速
度で発酵槽に戻すことが初期の必要条件である。
流れ方向の面の長さは必要により変えられる。5cmか
ら30cmの長さが一般的である。生存可能な及び生育不能
なハイブリドーマ細胞の両方を最大限保持するために
は、約30cmなどの長い長さが選択できる。生存可能なハ
イブリドーマ細胞と生育不能なハイブリドーマ細胞とを
最大限区別するためには、約10cmなどの短い長さがより
好ましい。一般的には、長さが短いほど、全体の沈降効
率は低いが、沈降タンクは生存可能な細胞と生育不能な
（即ち、死んでいる）細胞とをより区別できる。
ら30cmの長さが一般的である。生存可能な及び生育不能
なハイブリドーマ細胞の両方を最大限保持するために
は、約30cmなどの長い長さが選択できる。生存可能なハ
イブリドーマ細胞と生育不能なハイブリドーマ細胞とを
最大限区別するためには、約10cmなどの短い長さがより
好ましい。一般的には、長さが短いほど、全体の沈降効
率は低いが、沈降タンクは生存可能な細胞と生育不能な
（即ち、死んでいる）細胞とをより区別できる。
板間の間隔は任意な距離でよく、一般的には0.2cmか
ら2cmである。ハイブリドーマを分離するためには、約
0.5cmが上清液の最適な流れ及び細胞の沈降を生じさせ
ると考えられる。前記で引用したバット（Batt）らの方
程式を、本発明による装置における板間の間隔を考慮し
て、以下のように修飾する： Ｓ（ｖ）＝vnw（lsinθ＋bcosθ） ただし、Ｓ（ｖ）は浄化された流体の容積流量であ
り、 ｖは粒子の沈降速度であり、 ｎは板の数であり、 ｗは沈降タンク板の幅であり、 ｌは沈降タンク板の長さであり、 θは垂直方向に対する傾斜角度であり、 ｂは板間の間隔である。
ら2cmである。ハイブリドーマを分離するためには、約
0.5cmが上清液の最適な流れ及び細胞の沈降を生じさせ
ると考えられる。前記で引用したバット（Batt）らの方
程式を、本発明による装置における板間の間隔を考慮し
て、以下のように修飾する： Ｓ（ｖ）＝vnw（lsinθ＋bcosθ） ただし、Ｓ（ｖ）は浄化された流体の容積流量であ
り、 ｖは粒子の沈降速度であり、 ｎは板の数であり、 ｗは沈降タンク板の幅であり、 ｌは沈降タンク板の長さであり、 θは垂直方向に対する傾斜角度であり、 ｂは板間の間隔である。
この修飾された方程式は、数多くの様々な用途に対す
る、および目的とする使用形態における面を規定する板
の様々な数に関して、本発明による装置の寸法を算出す
るのに用いられる。大きいまたは小さいスケールの装置
は以下のように設計される：大きいタイプの装置はより
多くのおよび／またはより幅の広い板を有する傾向にあ
る。
る、および目的とする使用形態における面を規定する板
の様々な数に関して、本発明による装置の寸法を算出す
るのに用いられる。大きいまたは小さいスケールの装置
は以下のように設計される：大きいタイプの装置はより
多くのおよび／またはより幅の広い板を有する傾向にあ
る。
板または他の面を規定する手段は一般的にハウジング
に含まれる；このことは装置を無菌的に操作しようとす
る際には重要であると考えられる。ハウジングは長方形
の断面を有し、適当な材料から構成される；電界研磨さ
れた、ステンレス鋼が、無菌的な用途などの多くの用途
で好ましい。ハウジングは目的とする使用形態に必要な
板の数より多い数の板を含むような大きさである；この
ような場合、箱部材（box member）を、板が存在しない
ことにより生じる空隙を埋め、板の分離を確保するため
に、使用してもよい（板状等の、鏡面磨きされたステン
レス鋼で構成されることが好ましい）。
に含まれる；このことは装置を無菌的に操作しようとす
る際には重要であると考えられる。ハウジングは長方形
の断面を有し、適当な材料から構成される；電界研磨さ
れた、ステンレス鋼が、無菌的な用途などの多くの用途
で好ましい。ハウジングは目的とする使用形態に必要な
板の数より多い数の板を含むような大きさである；この
ような場合、箱部材（box member）を、板が存在しない
ことにより生じる空隙を埋め、板の分離を確保するため
に、使用してもよい（板状等の、鏡面磨きされたステン
レス鋼で構成されることが好ましい）。
分離される粒子を含む液体は流入口を通じてハウジン
グに入る；無菌的な設計では、流入口は衛生的な連結部
を有する。流入口は、一般的に、流れの方向に沿った長
手方向を最大限利用するために、沈降面の最下部の下あ
るいは余り上でない所に位置する。
グに入る；無菌的な設計では、流入口は衛生的な連結部
を有する。流入口は、一般的に、流れの方向に沿った長
手方向を最大限利用するために、沈降面の最下部の下あ
るいは余り上でない所に位置する。
不必要な粒子が除去された液体は、流出口を通してハ
ウジングから抜かれるが、この際、ハウジングは同様に
衛生的な連結部を備えていてもよい。流出口は、一般的
に、沈降面の長手方向の利用を最大限にするために、沈
降面の最上部より上あるいは余り下でない所に位置す
る。
ウジングから抜かれるが、この際、ハウジングは同様に
衛生的な連結部を備えていてもよい。流出口は、一般的
に、沈降面の長手方向の利用を最大限にするために、沈
降面の最上部より上あるいは余り下でない所に位置す
る。
粒子の収集用流出口は、面から滑り降りる沈降粒子が
到達可能なハウジングの最下点に設けられる。収集用流
出口は、装置が付属したまたは操作して連結された他の
装置（例えば、発酵槽）に粒子を戻しやすくする。
到達可能なハウジングの最下点に設けられる。収集用流
出口は、装置が付属したまたは操作して連結された他の
装置（例えば、発酵槽）に粒子を戻しやすくする。
液体を沈降面から上方向に流す手段としては、必要で
あれば重力供給システムも容易に用いられるが、ポンプ
（例えば、蠕動ポンプ）が挙げられる。
あれば重力供給システムも容易に用いられるが、ポンプ
（例えば、蠕動ポンプ）が挙げられる。
ポンプまたは液体を流す他の手段は、連続的に若しく
は間欠的に作動してもよい。間欠的に作動する場合に
は、ポンプを切っている間に、沈降が起こるが、周辺の
流体は静止している。これによって、正常な向流操作の
際に生じるのと同様、すでに沈降した細胞が液体の上方
向に流れに妨げられずに沈降面を滑り降りることができ
る。間欠的な操作は、細胞が下に戻る速度を上げること
により細胞の生存率及び生産性を向上することができる
点で好ましい。
は間欠的に作動してもよい。間欠的に作動する場合に
は、ポンプを切っている間に、沈降が起こるが、周辺の
流体は静止している。これによって、正常な向流操作の
際に生じるのと同様、すでに沈降した細胞が液体の上方
向に流れに妨げられずに沈降面を滑り降りることができ
る。間欠的な操作は、細胞が下に戻る速度を上げること
により細胞の生存率及び生産性を向上することができる
点で好ましい。
またはあるいは加えて、液体の流れは、例えば、５分
間隔で約１分間、反対方向になってもよい。ポンプの作
動方向を逆にすることによってなされる、定期的な逆流
は、すでに沈降した細胞より上にある液体と同一方向
（co−directional）に動くことによって、短期間並流
（co−current）沈降を生じさせ、細胞をより早く下に
戻すことを補助する効果を有する。
間隔で約１分間、反対方向になってもよい。ポンプの作
動方向を逆にすることによってなされる、定期的な逆流
は、すでに沈降した細胞より上にある液体と同一方向
（co−directional）に動くことによって、短期間並流
（co−current）沈降を生じさせ、細胞をより早く下に
戻すことを補助する効果を有する。
所定限度内で装置内の液温を維持する温度制御手段を
設けてもよい。限度は、使用目的によって変化し、例え
ば、１〜60℃である。一般的には、20〜40℃の範囲内で
あり、温血動物細胞を含む液体では約37℃である。温度
制御手段は水ジャケットあるいは他の適当な集成装置
（arrangement）からなる。
設けてもよい。限度は、使用目的によって変化し、例え
ば、１〜60℃である。一般的には、20〜40℃の範囲内で
あり、温血動物細胞を含む液体では約37℃である。温度
制御手段は水ジャケットあるいは他の適当な集成装置
（arrangement）からなる。
明らかに示されているように、上記装置は細胞用の発
酵槽に連結されてもよい。したがって、本発明の第二の
概念によると、液体培地中に動物細胞を含むように適応
される発酵槽容器、および上記装置からなるバイオリア
クター器（bioreactor apparatus）であって、該装置が
液体培地中の細胞または細胞集団を液体培地から分離
し、発酵槽容器に戻すことが可能なように該発酵槽容器
に連結されることを特徴とするバイオリアクター器を提
供するものである。
酵槽に連結されてもよい。したがって、本発明の第二の
概念によると、液体培地中に動物細胞を含むように適応
される発酵槽容器、および上記装置からなるバイオリア
クター器（bioreactor apparatus）であって、該装置が
液体培地中の細胞または細胞集団を液体培地から分離
し、発酵槽容器に戻すことが可能なように該発酵槽容器
に連結されることを特徴とするバイオリアクター器を提
供するものである。
発酵槽容器は、（攪拌タンクまたはエアーリフト型等
の）適当に懸濁できる設計になっている。１つより多い
沈降装置が平行に（または異なる沈降基準が他の基準の
後もう一つ用いられる際には、連続して）連結される。
の）適当に懸濁できる設計になっている。１つより多い
沈降装置が平行に（または異なる沈降基準が他の基準の
後もう一つ用いられる際には、連続して）連結される。
発酵槽は、遺伝子操作によって修飾される、不死化さ
れる（immortalised）、他の方法で修飾されるまたは修
飾されないにかかわらず、哺乳動物、他の動物、植物若
しくは微生物細胞を培養するのに用いられる。本発明
は、特に、例えば、モノクローナル抗体分泌ハイブリド
ーマ細胞の連続灌流発酵に使用される。
れる（immortalised）、他の方法で修飾されるまたは修
飾されないにかかわらず、哺乳動物、他の動物、植物若
しくは微生物細胞を培養するのに用いられる。本発明
は、特に、例えば、モノクローナル抗体分泌ハイブリド
ーマ細胞の連続灌流発酵に使用される。
本発明の第三の概念によると、動物細胞を細胞上清液
から分離して沈降面上に沈降層を形成し細胞を滑り降ろ
すことが可能な速度で、垂直方向に対して傾斜した複数
の沈降面の上方向に動物細胞を含む液体を流すことから
なり、該沈降面を規定する手段は、沈降面の下部に位置
する、分離される細胞を含む液体の流入口、細胞が分離
された液体の流出口を備える箱型部材であるハウジング
中に含まれ、該流入口及び流出口はそれぞれ衛生的な連
結部を備える、無菌または滅菌条件下で細胞上清液から
動物細胞を分離する方法を提供するものである。
から分離して沈降面上に沈降層を形成し細胞を滑り降ろ
すことが可能な速度で、垂直方向に対して傾斜した複数
の沈降面の上方向に動物細胞を含む液体を流すことから
なり、該沈降面を規定する手段は、沈降面の下部に位置
する、分離される細胞を含む液体の流入口、細胞が分離
された液体の流出口を備える箱型部材であるハウジング
中に含まれ、該流入口及び流出口はそれぞれ衛生的な連
結部を備える、無菌または滅菌条件下で細胞上清液から
動物細胞を分離する方法を提供するものである。
本発明の各概念の好ましい形態は、必要な変更を加え
て（mutatis mutandis）、それぞれ他の概念と同様であ
る。
て（mutatis mutandis）、それぞれ他の概念と同様であ
る。
本発明の好ましい実施態様を、以下の詳細な説明及び
実施例において、添付した図面を参照しながら、詳細に
説明する。図を以下に説明する： 図１は、本発明の分離装置の縦断面図である； 図２は、図１の分離装置を25dm3の発酵槽に付属させ
た概略図である； 図３は、実施例１において行われた実験中の時間に対
する全細胞数及び生存可能な細胞数、生存率（％）およ
び灌流速度の変化を示すものである；および 図４は、実施例２において行われた実験中の時間に対
する全細胞数及び生存可能な細胞数、生存率（％）およ
び灌流速度の変化を示すものである。
実施例において、添付した図面を参照しながら、詳細に
説明する。図を以下に説明する： 図１は、本発明の分離装置の縦断面図である； 図２は、図１の分離装置を25dm3の発酵槽に付属させ
た概略図である； 図３は、実施例１において行われた実験中の時間に対
する全細胞数及び生存可能な細胞数、生存率（％）およ
び灌流速度の変化を示すものである；および 図４は、実施例２において行われた実験中の時間に対
する全細胞数及び生存可能な細胞数、生存率（％）およ
び灌流速度の変化を示すものである。
本発明による分離装置１の一般的な配置を図１に示
す。装置１は、垂直方向に対して30゜で傾斜した正方形
チャンバー５中に挿入可能な硬質の積重ねを形成する一
緒に溶接された一連の板３を有する。正方形チャンバー
５は、最小限のクリアランスを有する標準的な板を収納
する大きさを有する箱型部材（box section）である。
積重ねられた板３は４つのラグ７によって箱型部材内に
保持される。チャンバー５の箱型部材はテーパー付き下
部チャンバー９状に引かれる；テーパー角度はすべて、
積重ねられた板の傾斜角をまねて、垂直方向から30゜で
ある。テーパー付き下部チャンバー９は、トリ−クラン
プ（商標）（TRI−CLAMPTM）コネクター11によって1/
2″（1.27cm）の外径（OD）を有するチューブ状で終わ
っている；これによって、再循環され沈降した材料を戻
すための衛生的な連結が可能になる。装置への流入口13
は、下部チャンバー９内に位置し、装置１を再循環ルー
プの発酵槽側に連結する。流入口13は、流出口コネクタ
ー11への下部チャンバーを通じた再循環液の流路を形成
するような角度を有する。沈降動作は対流によって妨げ
られるので、装置１には正方形チャンバー５より大きな
横断面を有するチューブから構成される水ジャケット15
が設けられている。転移部（transition piece）17によ
って円形ジャケットへの正方形箱型部材の流出口が形成
される。転移部17は、トリ−クランプ（TRI−CLAMP）連
結が設置されたヘッドプレート（headplate）19に連結
できる６″（15.27cm）のトリ−クランプ（商標）（TRI
−CLAMPTM）コネクターが設けられている。ヘッドプレ
ート19は、細胞が沈降した上清を抜くためのトリ−クラ
ンプ（TRI−CLAMP）コネクターを有する排出管（1/2″
または1.27cmの外径（OD））21を有する。排出管21は適
当な無菌収集タンクに接続されていてもよい。
す。装置１は、垂直方向に対して30゜で傾斜した正方形
チャンバー５中に挿入可能な硬質の積重ねを形成する一
緒に溶接された一連の板３を有する。正方形チャンバー
５は、最小限のクリアランスを有する標準的な板を収納
する大きさを有する箱型部材（box section）である。
積重ねられた板３は４つのラグ７によって箱型部材内に
保持される。チャンバー５の箱型部材はテーパー付き下
部チャンバー９状に引かれる；テーパー角度はすべて、
積重ねられた板の傾斜角をまねて、垂直方向から30゜で
ある。テーパー付き下部チャンバー９は、トリ−クラン
プ（商標）（TRI−CLAMPTM）コネクター11によって1/
2″（1.27cm）の外径（OD）を有するチューブ状で終わ
っている；これによって、再循環され沈降した材料を戻
すための衛生的な連結が可能になる。装置への流入口13
は、下部チャンバー９内に位置し、装置１を再循環ルー
プの発酵槽側に連結する。流入口13は、流出口コネクタ
ー11への下部チャンバーを通じた再循環液の流路を形成
するような角度を有する。沈降動作は対流によって妨げ
られるので、装置１には正方形チャンバー５より大きな
横断面を有するチューブから構成される水ジャケット15
が設けられている。転移部（transition piece）17によ
って円形ジャケットへの正方形箱型部材の流出口が形成
される。転移部17は、トリ−クランプ（TRI−CLAMP）連
結が設置されたヘッドプレート（headplate）19に連結
できる６″（15.27cm）のトリ−クランプ（商標）（TRI
−CLAMPTM）コネクターが設けられている。ヘッドプレ
ート19は、細胞が沈降した上清を抜くためのトリ−クラ
ンプ（TRI−CLAMP）コネクターを有する排出管（1/2″
または1.27cmの外径（OD））21を有する。排出管21は適
当な無菌収集タンクに接続されていてもよい。
水ジャケット15には、沈降タンクの温度制御ができる
サーモサーキュレイター（thermocirculator）へのジャ
ケットの連結を容易にするホース接続部23が設けられて
いる。装置１には３本の脚が設けられており、うち２本
は固定された脚25でありもう１本は調節可能でかつ取り
外し可能な脚27である。調節可能な脚27は装置１の傾斜
角度を変化させることができるが、このことは必要であ
る。
サーモサーキュレイター（thermocirculator）へのジャ
ケットの連結を容易にするホース接続部23が設けられて
いる。装置１には３本の脚が設けられており、うち２本
は固定された脚25でありもう１本は調節可能でかつ取り
外し可能な脚27である。調節可能な脚27は装置１の傾斜
角度を変化させることができるが、このことは必要であ
る。
装置１は全体が316Lステンレス鋼から構成される。こ
の装置は、バイオ産業または製薬産業に使用される小さ
な高品質のステンレス鋼製の容器の製造に熟達した製作
所によって製造される。溶接は高い水準で仕上げられる
必要があり、細胞懸濁液に接するすべての溶接部は目直
しされ（dressed）かつ研削される（ground down）。板
３は、積重ねて一緒に溶接される前に鏡面磨きされてお
り、構築中に表面仕上げをひっかいたりまたは傷付けた
りしないようによく注意を払わなければならない。残り
の容器の内表面は平滑な仕上げが得られるように電解研
磨される。
の装置は、バイオ産業または製薬産業に使用される小さ
な高品質のステンレス鋼製の容器の製造に熟達した製作
所によって製造される。溶接は高い水準で仕上げられる
必要があり、細胞懸濁液に接するすべての溶接部は目直
しされ（dressed）かつ研削される（ground down）。板
３は、積重ねて一緒に溶接される前に鏡面磨きされてお
り、構築中に表面仕上げをひっかいたりまたは傷付けた
りしないようによく注意を払わなければならない。残り
の容器の内表面は平滑な仕上げが得られるように電解研
磨される。
使用する際には、図２に概略的に示されるように、哺
乳動物細胞の培養物は、延伸チューブ10を含む、適当な
大きさ、例えば、10〜30dm3の作業容積を有する発酵槽3
1中に接種される。発酵槽31は、溶存酸素レベル、pH、
過圧温度（temperature overpressure）及び混合比を制
御可能である必要がある。また、発酵槽31は、流出口35
で沈降タンクを経て培地を含む産物をからにするための
抽出とのバランスをとるために、流入口33を通じて供給
される新鮮な培地を供給する連続した操作が可能である
必要がある。発酵槽31は、細胞が成長の対数中期（mid
−logarithmic phase）にくるまでバッチモード（batch
mode）等で初めは操作される。発酵槽は、例えば、0.2
BarGのやや過圧下で操作される。この時点では、水ジャ
ケット15が予め発酵槽と同じ温度に調節された、分離装
置１を有する外部ループ37,39は、バルブ41で分離装置
１のガス抜きをすることによって発酵槽の内容物でゆっ
くり満たされる。発酵槽31は加圧されるので、発酵槽の
内容物で分離装置１は満たされる。発酵槽31は、充填処
理中新鮮培地収納タンクから新鮮な培地で作業レベルま
で補充される。
乳動物細胞の培養物は、延伸チューブ10を含む、適当な
大きさ、例えば、10〜30dm3の作業容積を有する発酵槽3
1中に接種される。発酵槽31は、溶存酸素レベル、pH、
過圧温度（temperature overpressure）及び混合比を制
御可能である必要がある。また、発酵槽31は、流出口35
で沈降タンクを経て培地を含む産物をからにするための
抽出とのバランスをとるために、流入口33を通じて供給
される新鮮な培地を供給する連続した操作が可能である
必要がある。発酵槽31は、細胞が成長の対数中期（mid
−logarithmic phase）にくるまでバッチモード（batch
mode）等で初めは操作される。発酵槽は、例えば、0.2
BarGのやや過圧下で操作される。この時点では、水ジャ
ケット15が予め発酵槽と同じ温度に調節された、分離装
置１を有する外部ループ37,39は、バルブ41で分離装置
１のガス抜きをすることによって発酵槽の内容物でゆっ
くり満たされる。発酵槽31は加圧されるので、発酵槽の
内容物で分離装置１は満たされる。発酵槽31は、充填処
理中新鮮培地収納タンクから新鮮な培地で作業レベルま
で補充される。
再循環ポンプ43を有する再循環ループ37,39は、沈降
タンクの再循環／戻しチャンバーを通して発酵槽から細
胞を継続的に通過させるために作動され始める。さら
に、このシステムは１から18時間の間平衡化される。こ
れによって、沈降タンク中に抽出された細胞内容物は沈
降することになる。ここで、収集用ポンプ45を作動し始
めることによって、灌流を開始してもよい。初めは、灌
流速度は1/2vvd以下であるが、その後、灌流速度を、細
胞の成長及び培地の利用状態によって、発酵槽の細胞支
持能（一般的にはO2輸送速度）または沈降タンクの細胞
保持能の限界がくるまで、上げてもよい。
タンクの再循環／戻しチャンバーを通して発酵槽から細
胞を継続的に通過させるために作動され始める。さら
に、このシステムは１から18時間の間平衡化される。こ
れによって、沈降タンク中に抽出された細胞内容物は沈
降することになる。ここで、収集用ポンプ45を作動し始
めることによって、灌流を開始してもよい。初めは、灌
流速度は1/2vvd以下であるが、その後、灌流速度を、細
胞の成長及び培地の利用状態によって、発酵槽の細胞支
持能（一般的にはO2輸送速度）または沈降タンクの細胞
保持能の限界がくるまで、上げてもよい。
その後、発酵槽／沈降タンクのシステムは、新鮮な培
地の一定の供給及び一定の抽出が維持できるならば、長
期間作動できる。再循環ポンプ43は一定速度で運転され
るため、収集用ポンプ45の速度を上げると、発酵槽から
沈降タンクへの流れは、全システムが発酵槽から加圧さ
れているため、自動的に補正される。
地の一定の供給及び一定の抽出が維持できるならば、長
期間作動できる。再循環ポンプ43は一定速度で運転され
るため、収集用ポンプ45の速度を上げると、発酵槽から
沈降タンクへの流れは、全システムが発酵槽から加圧さ
れているため、自動的に補正される。
または、ポンプが運転している際には細胞懸濁液を沈
降板から抽出し、上記したように、正常な向流モードで
沈降が生じるように、時限装置で順次ポンプを脈動させ
て（pulse on and off）もよい。ポンプを切った際に
は、沈降は起こるが周囲の液は静止している。これによ
って、正常な向流操作中に生じるのと同様に、すでに沈
降した細胞が液体の上方向への流れによる妨害を何等受
けることなく沈降板を滑り降ろすことができる。この技
術によって、細胞が発酵槽に戻る速度が増加し、ゆえに
細胞の生存率及び生産性が向上できる。
降板から抽出し、上記したように、正常な向流モードで
沈降が生じるように、時限装置で順次ポンプを脈動させ
て（pulse on and off）もよい。ポンプを切った際に
は、沈降は起こるが周囲の液は静止している。これによ
って、正常な向流操作中に生じるのと同様に、すでに沈
降した細胞が液体の上方向への流れによる妨害を何等受
けることなく沈降板を滑り降ろすことができる。この技
術によって、細胞が発酵槽に戻る速度が増加し、ゆえに
細胞の生存率及び生産性が向上できる。
上記方法をさらに改善したものが、ポンプ45の流れを
周期的（例えば、５分間隔で１分間）逆行させることに
よって短期間並流沈降（co−current settling）を生じ
させ、すでに沈降した細胞より上にある液体の同一方向
の動きによって細胞をより早く発酵槽に戻すのを補助す
ることである。
周期的（例えば、５分間隔で１分間）逆行させることに
よって短期間並流沈降（co−current settling）を生じ
させ、すでに沈降した細胞より上にある液体の同一方向
の動きによって細胞をより早く発酵槽に戻すのを補助す
ることである。
本装置は、以下を含む多くの他の形態の様々な過程で
も使用することができる。
も使用することができる。
1.（さらに処理若しくは殺すために水溜め（sump）中
に間欠的にまたは処理終了時に除去することを目的とし
た）沈降した粒子／細胞は再循環せずに粒子／細胞含有
液体が沈降タンクの下部に入り粒子／細胞を含まない流
れを抜き出し、粒子／細胞は沈降タンクの下部に保持さ
れる粒子／細胞を含む液体の単一の通過による浄化。
に間欠的にまたは処理終了時に除去することを目的とし
た）沈降した粒子／細胞は再循環せずに粒子／細胞含有
液体が沈降タンクの下部に入り粒子／細胞を含まない流
れを抜き出し、粒子／細胞は沈降タンクの下部に保持さ
れる粒子／細胞を含む液体の単一の通過による浄化。
2.連続した２つ以上の沈降タンクの使用であって、第
一のタンクは発酵槽に戻すための生存可能な細胞の保持
を目的とし、第二またはそれ以降のより大きな沈降タン
クはさらなる下流加工（downstream processing）前の
全細胞の保持を目的とする。
一のタンクは発酵槽に戻すための生存可能な細胞の保持
を目的とし、第二またはそれ以降のより大きな沈降タン
クはさらなる下流加工（downstream processing）前の
全細胞の保持を目的とする。
他の実施態様としては、15枚の板を有する装置１（fi
fteen plate device）及び10枚の板を有する装置１（te
n plate device）が挙げられる。沈降タンクの本体は挿
入の構造が異なるのみで両方の場合で一致していてもよ
い。したがって、10枚の板の挿入は、５枚の板を水密性
箱（鏡面磨きされた）によって置き換えられた以外はす
べての点で15枚の板を挿入した場合と一致していてもよ
い。10枚の板の挿入の場合の板の長さは10cmである。
fteen plate device）及び10枚の板を有する装置１（te
n plate device）が挙げられる。沈降タンクの本体は挿
入の構造が異なるのみで両方の場合で一致していてもよ
い。したがって、10枚の板の挿入は、５枚の板を水密性
箱（鏡面磨きされた）によって置き換えられた以外はす
べての点で15枚の板を挿入した場合と一致していてもよ
い。10枚の板の挿入の場合の板の長さは10cmである。
実施例１−ハイブリドーマ細胞の生育 ES4と称する細胞系由来のマウスのハイブリドーマ細
胞を培養し、25dm3のエアーリフト型の発酵槽（チェマ
ップ チューリッヒ（Chemap Zurich）製）に接種する
には十分な細胞を得た。この細胞は、当該分野において
既知の一般的な方法で、マウスの脾細胞及びマウスのミ
エローマ細胞から融合されたものであり、培養するとヒ
トのＢ血液型抗原に対する抗体を産生する不死の細胞系
を構成する。
胞を培養し、25dm3のエアーリフト型の発酵槽（チェマ
ップ チューリッヒ（Chemap Zurich）製）に接種する
には十分な細胞を得た。この細胞は、当該分野において
既知の一般的な方法で、マウスの脾細胞及びマウスのミ
エローマ細胞から融合されたものであり、培養するとヒ
トのＢ血液型抗原に対する抗体を産生する不死の細胞系
を構成する。
接種材料を、約107個の凍結細胞を含むアンプルを入
れ、DMEM/F12（ギブコ（Gibdo）製）に５％ウシ胎児血
清を加えた混合液中で37℃でフラスコ中で培養すること
によって調製した。この培養物をフラスコ中で連続的に
拡張し、上記培地中に105細胞/mlを含むようにして1dm3
の攪拌容器に撒くのに十分な細胞を得た。さらに細胞を
生育させ、1dm3の攪拌培養物を用いて、さらに4dm3の作
業容積を有する攪拌容器に撒いた。この4dm3の攪拌培養
物を用いて25dm3の発酵槽に接種した。
れ、DMEM/F12（ギブコ（Gibdo）製）に５％ウシ胎児血
清を加えた混合液中で37℃でフラスコ中で培養すること
によって調製した。この培養物をフラスコ中で連続的に
拡張し、上記培地中に105細胞/mlを含むようにして1dm3
の攪拌容器に撒くのに十分な細胞を得た。さらに細胞を
生育させ、1dm3の攪拌培養物を用いて、さらに4dm3の作
業容積を有する攪拌容器に撒いた。この4dm3の攪拌培養
物を用いて25dm3の発酵槽に接種した。
発酵槽における初期細胞密度（０日目）は、0.7×105
個生存可能細胞/mlであった。この発酵槽を、温度が37
℃、pHが7.2及び溶存酸素（dO）が空気飽和の50％にな
るように制御した。ガスの散布速度は20dm3のガス／時
間に設定した。ガスは、pH及びdOに関して予め設定され
た制御バルブを維持する全ガス流れ中に酸素、二酸化炭
素及び窒素を混合した空気を含むものであった。本実験
をSAL 024と称した。
個生存可能細胞/mlであった。この発酵槽を、温度が37
℃、pHが7.2及び溶存酸素（dO）が空気飽和の50％にな
るように制御した。ガスの散布速度は20dm3のガス／時
間に設定した。ガスは、pH及びdOに関して予め設定され
た制御バルブを維持する全ガス流れ中に酸素、二酸化炭
素及び窒素を混合した空気を含むものであった。本実験
をSAL 024と称した。
培地は、再度、DMEM/F12に５％FCSを加えたものであ
った。発酵槽の作業容積は21dm3であった。生存可能な
細胞数が86％の生存率で５×105個/mlに達するまで、３
日間バッチモードで任意に生育させた。
った。発酵槽の作業容積は21dm3であった。生存可能な
細胞数が86％の生存率で５×105個/mlに達するまで、３
日間バッチモードで任意に生育させた。
予めオートクレーブ滅菌された分離装置１（沈降タン
ク）を図２に示されるように発酵槽に付属させ、発酵槽
に無菌的に接続するためにシリコーンチューブを再循環
流出口及び流入口からニードルコネクター（needle con
nector）（チェマップ（Chemap）製）に繋いだ；沈降タ
ンクのジャケットを満たし、発酵槽温度と同じになるよ
うに37℃で平衡化した。沈降タンクから捕集された空気
を抜くことによって、沈降タンクを発酵槽の内容物でゆ
っくり充填した。沈降タンクへの発酵槽からの培養物の
損失容積分は、新鮮な培地（DMEM/F12に５％FCSを加え
たもの）で培地供給システムによって自動的に置換され
た。再循環ポンプ43を始動し、全システムを２時間で平
衡化させ、沈降し戻した細胞を発酵槽内に導入した。
ク）を図２に示されるように発酵槽に付属させ、発酵槽
に無菌的に接続するためにシリコーンチューブを再循環
流出口及び流入口からニードルコネクター（needle con
nector）（チェマップ（Chemap）製）に繋いだ；沈降タ
ンクのジャケットを満たし、発酵槽温度と同じになるよ
うに37℃で平衡化した。沈降タンクから捕集された空気
を抜くことによって、沈降タンクを発酵槽の内容物でゆ
っくり充填した。沈降タンクへの発酵槽からの培養物の
損失容積分は、新鮮な培地（DMEM/F12に５％FCSを加え
たもの）で培地供給システムによって自動的に置換され
た。再循環ポンプ43を始動し、全システムを２時間で平
衡化させ、沈降し戻した細胞を発酵槽内に導入した。
浄化された液体を、10dm3/日（灌流速度では抽出され
る容積／発酵槽の容積／日）の初期速度で沈降タンクか
ら抜き出した。この速度は、９日間で最大50dm3/日まで
急速に上昇した。
る容積／発酵槽の容積／日）の初期速度で沈降タンクか
ら抜き出した。この速度は、９日間で最大50dm3/日まで
急速に上昇した。
生存可能細胞集団は、12日後約５×106個細胞/ml（50
dm3/日の灌流速度に一致）にまで上昇した。この状態は
さらに10日間比較的一定を保った。全細胞数（生存可能
な細胞に死細胞を加えたもの）は12日目から15日目の間
に鋭く上昇したが、それ以降は上昇度がより鋭くなっ
た。
dm3/日の灌流速度に一致）にまで上昇した。この状態は
さらに10日間比較的一定を保った。全細胞数（生存可能
な細胞に死細胞を加えたもの）は12日目から15日目の間
に鋭く上昇したが、それ以降は上昇度がより鋭くなっ
た。
したがって、全細胞集団が増加し、生存率は減少しな
がら、一定の生存可能細胞集団が維持された。発酵槽の
設定値の制御の問題によって生存可能細胞集団が減少し
その後実験を終了させた22日目まで、この状態は維持さ
れた。結果を図３に示す。
がら、一定の生存可能細胞集団が維持された。発酵槽の
設定値の制御の問題によって生存可能細胞集団が減少し
その後実験を終了させた22日目まで、この状態は維持さ
れた。結果を図３に示す。
全体で935dm3の培地を使用した。始めの100dm3はDMEM
/F12に５％FCSを加えたものであり、それ以降の培地はD
MEM/F12に２％FCSを加えたものであった。これによっ
て、全体で34.9gの抗体が得られた。
/F12に５％FCSを加えたものであり、それ以降の培地はD
MEM/F12に２％FCSを加えたものであった。これによっ
て、全体で34.9gの抗体が得られた。
本実験を通して、沈降タンクは95〜99％の細胞を保持
した。具体的には、0.5×105個の生存可能細胞および２
×105個の死細胞が沈降して取り出された。これは、99
％の生存可能細胞が保持され、96％の死細胞が保持され
たことを意味する。
した。具体的には、0.5×105個の生存可能細胞および２
×105個の死細胞が沈降して取り出された。これは、99
％の生存可能細胞が保持され、96％の死細胞が保持され
たことを意味する。
実施例２ すべての操作条件（灌流速度を除く）は実施例１と同
様で繰り返した；結果を図４に示す。本実験をSAL 027
と称した。
様で繰り返した；結果を図４に示す。本実験をSAL 027
と称した。
実施例３−生存可能及び死細胞保持に関する沈降効率 発酵は、以下のように変更する以外は実施例２と同様
にして行った： 1.使用した細胞系がBIRMA １であり、この細胞系はＡ
血液型物質に特異的な抗体を分泌するマウスのハイブリ
ドーマである。
にして行った： 1.使用した細胞系がBIRMA １であり、この細胞系はＡ
血液型物質に特異的な抗体を分泌するマウスのハイブリ
ドーマである。
2.接種してから９日後の灌流速度が50dm3/日であり、発
酵槽内の細胞集団は、3.76×106個の生存可能細胞でお
よび5.08×106個の全細胞で安定化した。（全細胞数は
生存可能及び死細胞の合計である。）収集の流れでは、
生存可能細胞は0.3×105個であり、全細胞は２×105個
であり、これより99％の生存可能細胞の保持および96％
の全細胞の保持が得られた。
酵槽内の細胞集団は、3.76×106個の生存可能細胞でお
よび5.08×106個の全細胞で安定化した。（全細胞数は
生存可能及び死細胞の合計である。）収集の流れでは、
生存可能細胞は0.3×105個であり、全細胞は２×105個
であり、これより99％の生存可能細胞の保持および96％
の全細胞の保持が得られた。
3.灌流速度を段階的に上昇させ、沈降タンクの保持効率
を試験した（結果は下記表を参照）。
を試験した（結果は下記表を参照）。
上記結果から、灌流速度が4.38VVDまでは収集の流れ1
ml当たりの細胞の損失は有効には上昇していないことが
分かる。上記発酵では、3.62の灌流速度での沈降タンク
を経た発酵槽からの細胞の全損失は3.27×1010であっ
た。全発酵槽の内容物は1.59×1011であり、発酵槽から
の細胞の全損失は20％であった。発酵槽は細胞の成長に
よってこれらの損失した細胞を置換することができる。
ml当たりの細胞の損失は有効には上昇していないことが
分かる。上記発酵では、3.62の灌流速度での沈降タンク
を経た発酵槽からの細胞の全損失は3.27×1010であっ
た。全発酵槽の内容物は1.59×1011であり、発酵槽から
の細胞の全損失は20％であった。発酵槽は細胞の成長に
よってこれらの損失した細胞を置換することができる。
4.38VVDの灌流速度では、発酵槽からの沈降材料1ml当
たりの細胞の損失割合（％）は実質的には上昇しない；
しかしながら、１日当たりの全細胞損失は灌流速度の上
昇により増加し、3.8×1010である。発酵槽における全
細胞数は1.06×1011であり、これから発酵槽からの細胞
の全損失は36％であることが示される。発酵槽内の生存
可能な細胞数及び全細胞数は両方とも減少していること
から、発酵槽はこの速度では細胞を置換せずに細胞が損
失すると結論付けられた。
たりの細胞の損失割合（％）は実質的には上昇しない；
しかしながら、１日当たりの全細胞損失は灌流速度の上
昇により増加し、3.8×1010である。発酵槽における全
細胞数は1.06×1011であり、これから発酵槽からの細胞
の全損失は36％であることが示される。発酵槽内の生存
可能な細胞数及び全細胞数は両方とも減少していること
から、発酵槽はこの速度では細胞を置換せずに細胞が損
失すると結論付けられた。
灌流速度を6.03VVDまで上昇させると、１時間後に生
存可能な細胞及び全細胞の数は両方とも収集の流れにお
いて増加しており、全細胞が4.8×1010個である発酵槽
に対して１日当たり6.6×1010個が損失することが示さ
れた。このことは、この速度では全細胞の流失が迅速に
成されることを示すものである。細胞の損失のさらなる
増加が8.1VVDの灌流速度で観察された。
存可能な細胞及び全細胞の数は両方とも収集の流れにお
いて増加しており、全細胞が4.8×1010個である発酵槽
に対して１日当たり6.6×1010個が損失することが示さ
れた。このことは、この速度では全細胞の流失が迅速に
成されることを示すものである。細胞の損失のさらなる
増加が8.1VVDの灌流速度で観察された。
21dm3のエアーリフト型の発酵槽を用いた際の沈降タ
ンクの大きさに関する上記結果から、最大の灌流速度は
76dm3/日（または3.62VVD）である。このようなタイプ
の実験を用いることによって必要とされる灌流速度に対
する沈降タンクの大きさの最適な構成が推察できる。
ンクの大きさに関する上記結果から、最大の灌流速度は
76dm3/日（または3.62VVD）である。このようなタイプ
の実験を用いることによって必要とされる灌流速度に対
する沈降タンクの大きさの最適な構成が推察できる。
実施例４−生育不能な細胞の漏出実験 以下のように変更する以外は実施例３と同様の発酵を
行った： 1.使用した細胞系がNELP ３であり、この細胞系はRhD
血液型物質に特異的な抗体を分泌するヒトのヘテロハイ
ブリドーマである。
行った： 1.使用した細胞系がNELP ３であり、この細胞系はRhD
血液型物質に特異的な抗体を分泌するヒトのヘテロハイ
ブリドーマである。
2.沈降装置は、それぞれの板の大きさが長さ10cmで幅10
cmである15枚の板を挿入したものを用いた。生育不能な
細胞に関して1.1cm/時間の沈降速度では、10cmの板で
は、修飾されたバット（Batt）らの方程式により、交換
速度が21.4dm3/日、即ち約1VVDを超えると生育不能な細
胞の漏出を示すことが予想された。
cmである15枚の板を挿入したものを用いた。生育不能な
細胞に関して1.1cm/時間の沈降速度では、10cmの板で
は、修飾されたバット（Batt）らの方程式により、交換
速度が21.4dm3/日、即ち約1VVDを超えると生育不能な細
胞の漏出を示すことが予想された。
灌流速度を段階的に上昇させ、沈降タンクの保持効率
及び漏出レベルを試験した（結果は下記表を参照）。
及び漏出レベルを試験した（結果は下記表を参照）。
上記結果から、灌流速度が約1.57までは収集の流れ1m
l当たりの細胞の損失は有効には上昇しないことが分か
る。
l当たりの細胞の損失は有効には上昇しないことが分か
る。
この灌流速度を超えると、生育不能な細胞の濃度の増
加が収集の流れ中に観察され、全細胞保持効率が2.38VV
Dで79.6％まで減少した。生存可能な細胞の保持もまた
減少するが、その減少度合いは上記より少ない。これよ
り、本沈降装置は、21dm3/日未満では、全細胞の保持と
共に、生育不能な細胞に関して計算されるような挙動を
示すが、上記流速を超えると、より小さな生育不能な細
胞が漏出することが示される。
加が収集の流れ中に観察され、全細胞保持効率が2.38VV
Dで79.6％まで減少した。生存可能な細胞の保持もまた
減少するが、その減少度合いは上記より少ない。これよ
り、本沈降装置は、21dm3/日未満では、全細胞の保持と
共に、生育不能な細胞に関して計算されるような挙動を
示すが、上記流速を超えると、より小さな生育不能な細
胞が漏出することが示される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウィルソン，ジェームズ，サミュエル イギリス国，ミドロチアン イーエッチ 26 ９エッチエッチ，ペニクィック，グ レンクロス ガーデンズ 23 (56)参考文献 特開 昭50−70966（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−278806（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−238108（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−98572（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−36774（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−265（ＪＰ，Ａ) 実開 昭61−132009（ＪＰ，Ｕ) 実公 昭58−8322（ＪＰ，Ｙ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) B01D 21/02 C02F 3/00 - 11/20 C12M 1/00 - 3/10
Claims (27)
- 【請求項１】垂直方向に対して傾斜した複数の沈降面を
規定する手段、および動物細胞を細胞上清液から分離し
て面上に沈降層を形成し細胞を滑り降ろすことが可能な
速度で動物細胞を含む液体を沈降面の上方向に流す手段
からなり、該沈降面を規定する手段は、沈降面の下部に
位置する、分離される細胞を含む液体の流入口、細胞が
分離された液体の流出口を備える箱型部材であるハウジ
ング中に含まれ、該流入口及び流出口はそれぞれ衛生的
な連結部を備える、無菌または滅菌条件下で細胞上清液
から動物細胞を分離する装置。 - 【請求項２】少なくとも15枚の沈降面を有する、請求の
範囲第１項に記載の装置。 - 【請求項３】沈降面を規定する手段が板である、請求の
範囲第１または２項に記載の装置。 - 【請求項４】少なくとも各板の上部面は鏡面磨きされた
ステンレス鋼から形成される、請求の範囲第３項に記載
の装置。 - 【請求項５】面が垂直方向に対して傾斜する角度が10゜
から50゜である、請求の範囲第１から４項のいずれかに
記載の装置。 - 【請求項６】面が垂直方向に対して傾斜する角度が調節
可能である、請求の範囲第１から５項のいずれかに記載
の装置。 - 【請求項７】該装置は0.5〜5dm3/時間の範囲の液体の流
速で使用される、請求の範囲第１から６項のいずれかに
記載の装置。 - 【請求項８】板間の間隔が0.2cmから2cmである、請求の
範囲第３または４項に記載の装置。 - 【請求項９】液体を沈降面の上方向に流す手段がポンプ
である、請求の範囲第１から８項のいずれかに記載の装
置。 - 【請求項１０】該ポンプが間欠的な操作が可能である、
請求の範囲第９項に記載の装置。 - 【請求項１１】該ポンプが定期的に流れを逆行させるこ
とが可能であるが、請求の範囲９または10項に記載の装
置。 - 【請求項１２】装置内の液温を所定の限度内に維持する
温度制御手段を有する、請求の範囲第１から11項のいず
れかに記載の装置。 - 【請求項１３】生存可能なまたは全ハイブリドーマ細胞
を細胞含有培地から除去するために用いられる、請求の
範囲第１から12項のいずれかに記載の装置。 - 【請求項１４】液体培地中に動物細胞を含むように適応
される発酵槽容器、および無菌または滅菌条件下におけ
る操作用の請求の範囲第１から13項のいずれかに記載の
装置からなるバイオリアクター器であって、該装置が液
体培地中の細胞または細胞集団を液体培地から分離し、
発酵槽容器に戻すことが可能なように該発酵槽容器に連
結されることを特徴とするバイオリアクター器。 - 【請求項１５】該発酵槽が攪拌タンクまたはエアーリフ
ト型の発酵槽である、請求の範囲第14項に記載のバイオ
リアクター器。 - 【請求項１６】該発酵槽が哺乳動物細胞を培養するため
に用いられる、請求の範囲第14または15項に記載のバイ
オリアクター器。 - 【請求項１７】動物細胞を細胞上清液から分離して沈降
面上に沈降槽を形成し細胞を滑り降ろすことが可能な速
度で、垂直方向に対して傾斜した複数の沈降面の上方向
に動物細胞を含む液体を流すことからなり、該沈降面を
規定する手段は、沈降面の下部に位置する、分離される
細胞を含む液体の流入口、細胞が分離された液体の流出
口を備える箱型部材であるハウジング中に含まれ、該流
入口及び流出口はそれぞれ衛生的な連結部を備える、無
菌または滅菌条件下で細胞上清液から動物細胞を分離す
る方法。 - 【請求項１８】少なくとも15枚の沈降面が存在する、請
求の範囲第17項に記載の方法。 - 【請求項１９】沈降面が板によって規定される、請求の
範囲第17または18項に記載の方法。 - 【請求項２０】少なくとも各板の上部面は鏡面磨きされ
たステンレス鋼から形成される、請求の範囲第19項に記
載の方法。 - 【請求項２１】面が垂直方向に対して傾斜する角度が10
゜から50゜である、請求の範囲第17から20項のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項２２】面が垂直方向に対して傾斜する角度が調
節可能である、請求の範囲第17から21項のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項２３】液体の流速が0.5〜5dm3/時間である、請
求の範囲第17から22項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２４】板間の間隔が0.2cmから2cmである、請求
の範囲第19または10項に記載の方法。 - 【請求項２５】液体がポンプによって沈降面の上方向に
流される、請求の範囲第17から24項のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項２６】液温が所定の限度内に維持される、請求
の範囲第17から25項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項２７】生存可能なまたは全ハイブリドーマ細胞
を細胞含有培地から除去することからなる、請求の範囲
第17から26項のいずれかに記載の方法。
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| GB9309429.0 | 1993-05-07 | ||
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|---|---|
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| JP (1) | JP3328287B2 (ja) |
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| CA (1) | CA2162140C (ja) |
| DE (1) | DE69434052T2 (ja) |
| GB (1) | GB9309429D0 (ja) |
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| CN1112442C (zh) * | 2000-06-14 | 2003-06-25 | 华东理工大学 | 细胞灌注培养过程中的细胞截留分离方法及其装置 |
| ES2357423T3 (es) * | 2001-08-31 | 2011-04-26 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Unidad y procedimiento para realizar fermentación a alta densidad celular. |
| CN1297659C (zh) * | 2004-02-11 | 2007-01-31 | 上海伯瑞生物技术发展有限公司 | 一种造血细胞灌注培养方法和装置 |
| GB0410118D0 (en) * | 2004-05-06 | 2004-06-09 | Glaxo Group Ltd | Novel bioreactor |
| US8667832B2 (en) * | 2008-03-04 | 2014-03-11 | Cleveland State University | Method and system for particle settling velocity measurement |
| DE102008029307A1 (de) | 2008-06-20 | 2009-12-24 | Bayer Technology Services Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zur Rückhaltung und Rückführung von Zellen |
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| EP3275992A1 (en) * | 2016-07-29 | 2018-01-31 | Bayer Aktiengesellschaft | Adapter for cell-culture vessel |
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| SG11202012449XA (en) * | 2018-06-18 | 2021-01-28 | Baxalta Inc | Bottom section for being connected to an assembly with plate settler, and assembly with plate settler |
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| EP4023741A4 (en) * | 2019-08-29 | 2023-11-08 | Fanuc Corporation | DEVICE FOR CELL PRODUCTION AND METHOD FOR CELL PRODUCTION |
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-
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- 1994-05-09 WO PCT/GB1994/000997 patent/WO1994026384A1/en active IP Right Grant
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