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KR100779138B1 - 용액 캡쳐에 의한 질량 분광측정법으로 연속 분석하기 위한핵산의 신속 정제 방법 - Google Patents

용액 캡쳐에 의한 질량 분광측정법으로 연속 분석하기 위한핵산의 신속 정제 방법 Download PDF

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KR100779138B1
KR100779138B1 KR1020057021495A KR20057021495A KR100779138B1 KR 100779138 B1 KR100779138 B1 KR 100779138B1 KR 1020057021495 A KR1020057021495 A KR 1020057021495A KR 20057021495 A KR20057021495 A KR 20057021495A KR 100779138 B1 KR100779138 B1 KR 100779138B1
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KR
South Korea
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methanol
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resin
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스티븐 에이. 호프스테들러
렌델 엘. 커민즈
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아이시스 파마수티컬즈 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은, 종래의 방법에 비해 효율적이고 비용-절감 효과를 갖는, 전기분무 질량 분광측정법에 의한 연속한 분석을 위한 핵산의 신속한 용액 캡쳐 분리 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 정제된 샘플이 전기분무 질량 분광측정법에 의한 분석에 사용될 수 있도록 핵산의 신속한 용액 캡쳐를 실시하는데 유용한 키트를 제공한다.
핵산 정제, 용액 캡쳐, 질량 분광측정법

Description

용액 캡쳐에 의한 질량 분광측정법으로 연속 분석하기 위한 핵산의 신속 정제 방법{METHODS FOR RAPID PURIFICATION OF NUCLEIC ACIDS FOR SUBSEQUENT ANALYSIS BY MASS SPECTROMETRY BY SOLUTION CAPTURE}
본 발명은 일반적으로 질량 분광측정법 (mass spectrometry)으로 핵산을 분석하는 분야에 관한 것으로, 이러한 목적에 유용한 방법 및 키트를 제공한다.
EST-MS (Electrospray ionization mass spectrometry)는 바이오중합체를 분석하는데 중요한 기술이 되었다. 다수의 하전 현상은 신속하고 정확하며 정밀한 분자 질량 측정, 변형의 확인 및 매우 높은-질량 바이오중합체에 대한 보다 상세한 구조 연구를 가능하게 한다.
폴리머라제 연쇄 반응를 이용하는 특정 DNA 서열의 증폭은 미생물학, 의학적 연구, 법의학 분석 및 임상적 진단학을 포함한 많은 과학적 학문 분야에서 다양한 적용을 갖는다. 보다 종종, PCR 산물은 삽입 염료 또는 형광 표지된 프라이머를 사용하는 표준 겔 전기영동과 같은 전통적인 생화학적 기술을 이용하여 "크기-분 류" 된다. 다수의 PCR 기초 진단 키트에 널리 사용되는 TaqmanTM 검정은, 특정 PCR 산물의 존재를 확증하지만 앰플리콘 (amplicon)의 크기를 직접 판독하지는 못한다. 증폭 사이클 동안 PCT 산물의 레이저-유도된 형광을 측정하는, 소위 "실시간 (real-time)" PCR 장치가 지정된 DNA 템플레이트 및 프라이머 세트로부터의 DNA 증폭을 정량하는데 사용된다. 이들 방법은 상대적으로 높은 형광 백그라운드 때문에 비교적 적은 앰플리콘 (150 염기쌍 미만)에 대해서는 제한된 유용성을 가지며 앰플리콘 이종성 또는 정확한 길이에 대해서는 어떠한 정보도 제공하지 않는다.
이러한 전통 방법과 비교하여, 질량 분광측정법은 속도, 감도 및 질량 정확을 포함하여 PCR 산물을 특징짓기 위한 플랫폼으로서 다수의 잠재적 잇점을 갖는다. DNA를 포함하는 각각의 염기의 정확한 질량이 아주 정확히 알려져 있기 때문에, 질량 분광측정법으로 수득되는 고-정밀 질량 측정을 이용하여 실험적으로 수득된 질량 측정 불확실성 내에서 염기 조성을 추론해낼 수 있다 (J. Aaserud, Z. Guan, D.P. Little and F.W. McLafferty, Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes, 1997, 167/168, 705-712. and D.C. Muddiman, G.A. Anderson, S.A. Hofstadler and R.D. Smith, Anal. Chem. 1997, 69, 1543-1549). 핵산 증폭 및 정보를 제공하는 앰플리콘의 염기 조성의 측정을 조합하여 이용하면서 분자 질량 분석에 의해 공지되지 않은 바이오제제를 신속히 확인하는 방법이 문헌 (공개된 미국 특허원 20030027135, 20030082539, 20030124556, 20030175696, 20030175695, 20030175697 및 20030190605 및 미국 특허원 10/326,047, 10/660,997, 10/660,122 및 10/660,996, 이들 모두 본원에 참조로 전부 인용된다)에 기술되고 청구되어 있다.
MALDI (matrix assisted, laser desorption ionization) 및 ESI-MS 모두 연속한 질량 분광측정 검출을 위해 PCR 산물을 이온화하는데 이용되었다. MALDI는 짭은 길이 (20-머 또는 그 이하)의 올리고뉴클레오타이드를 분석하는데 널리 이용되는 반면, 100 bp 초과의 앰플리콘에 대한 적용은 일반적이지 않다. ESI는 500 bp 초과의 DNA를 분리 없이 이온화시키는 이온화 공정의 고유한 "유연성 (softness)" 때문에 큰 생물학적 분장 대해 가장 널리 이용되는 이온화 기술 중의 하나이다.
ESI에서, 크게 하전된 소적은 분석물 용액이 니들 (새로운 용액을 모두 동일한 극성을 갖는 하전된 소적의 매우 미세한 분무물로 분산시키기에 충분한 전위가 이의 말단에 적용된다)을 통해 지나가는 "공기 분무 (pneumatic nebulization)" 공정에서 생성된다. 용매가 증발하여 소적 크기가 수축되고 소적 표면에서 하전 농도가 증가한다. 결국, Rayleigh 한계에서, 쿨롱 반발이 소적 표면 장력을 극복하여 소적이 폭발한다. 이러한 "쿨롱 폭발"은 일련의 보다 작고 보다 낮게 하전된 소적을 형성한다. 수축 및 이어지는 폭발의 공정은 개별적으로 하전된 분석물 이온이 형성될 때까지 반복된다. 하전은 분석물의 이용가능한 하전 부위 전체에 걸쳐 통계학적으로 분포되어, 다수의 하전된 이온 상태를 형성할 수 있다. 분무된 이온에 무수 (drying) 가스 유동 역전류를 도입함으로써 용매 증발율을 증가시키면 다중-하전 정도가 증가한다. 모세관 직경을 감소시키고 분석물 용액 유동 속도를 낮춤으로써, 즉 나노분무 이온화에 의해 "통상의" ESI에 의해 얻어지는 m/z 비율 보다 높은 m/z 비율을 갖는 이온을 생성하고 (즉, 보다 유연한 이온화 기술임) 생바이오분석 분야에서 보다 높은 이용이 가능할 것이다.
불행히도, ESI는 비교적 순수한 샘플을 필요로 하며 생화학적 실험실에서 통상 사용되는 양이온성 염, 세제 및 많은 완충제에 대해 견딜 수 없는 것으로 유명하다.
폴리머라제 연쇄 반응에서 통상 사용되는 완충 시스템은 50 mM KC1, 2 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl 및 4개의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 (dNTPs) 각각 (200 :M)와 같은 전기분무 (electrospray) 비친화성 (uncompatible) 시약을 포함한다. 각각의 분자 이온에 대한 시그날이 다수 염 부가물에 퍼지기 때문에, 비교적 낮은 농도의 금속 양이온 (100 :M 미만)의 존재에 의해서도 올리고뉴클레오타이드에 대한 MS 감도가 상당히 감소될 수 있다. 따라서, PCR의 산물의 효과적인 ESI-MS는, 세제 및 dNTPs를 제거하는 것에 추가하여, 염 농도가 분석 이전에 1000 계수 이상으로 감소되어야 한다.
짭은 올리고뉴클레오타이드 및 염이 샘플이 농축되는 동안 제거되기 때문에 연속한 MS 분석을 위해 PCR 산물을 탈염시키는데 에탄올 침전이 이용되어 왔다 (M.T. Krahmer, Y.A. Johnson, J.J. Walters, K.F. Fox, A. Fox and M. Nagpal, Electrospray Anal. Chem. 1999, 71, 2893-2900; T. Tsuneyoshi, K. Ishikawa, Y. Koga, Y. Naito, S. Baba, H. Terunuma, R. Arakawa and D.J. Prockop Rapid Commun. Mass Spectrom. 1997, 11, 719-722; and D.C. Muddiman, D.S. Wunschel, C.L. Liu, L. Pasatolic, K. F. Fox, A. Fox, G.A. Anderson and R.D. Smith Anal. Chem. 1996, 68, 3705-3712). 이러한 방법에서, PCR 산물은 5 ℃에서 밤새 또는 냉각 (-20 ℃) 에탄올로 10 내지 15 분에 걸쳐 농축된 암모늄 아세테이트 용액으로부터 침전될 수 있다. 불행히도, 침전 단계 단독은 일반적으로 고질의 ESI 스펙트럼을 얻기 위해 적합하게 탈염되는 PCR 산물을 얻기에는 불충분하여, 샘플을 추가로 탈염시키기 위해 침전 후 투석 단계가 이어진다 (D.C. Muddiman, D.S. Wunschel, C.L. Liu, L. Pasatolic, K.F. Fox, A. Fox, G.A. Anderson and R.D. Smith Anal. Chem. 1996, 68, 3705-3712). 몇몇 연구자들은 다수의 PCR 산물을 특징짓기 위해 성공적으로 이용하였으나, 힘이 드는 완전히 자동화된 고용량 처리 방식에 이들 방법을 적용하는 루트는 분명하지 않다.
또한, 시판되는 DNA 정제 키트가 마이크로투석과 같은 전통적 탈염 기술과 연합하여 사용될 수 있다 (S. Hahner, A. Schneider, A. Ingendoh and J. Mosner Nucleic Acids Res. 2000, 28, e82/i- e82/viii; and A.P. Null, L.T. George and D.C. Muddiman J: Am. Soc. Mass Spectrom. 2002, 13, 338-344). 또한, 다른 정제 기술, 예를 들어 겔 전기영동에 이은 고성능 액체 크로마토그래피 또는 드롭 투석, 또는 막 또는 수지를 이용하는 양이온 교환이 MS 검출을 위한 고순도의 탈염 DNA를 얻는데 사용되었다 (L.M. Benson, S.-S. Juliane, P.D. Rodringues, T. Andy, L.J. Maher III and S. Naylor, In: The 47th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Dallas, Texas (1999); C.G. Huber and M.R. Buchmeiser Anal. Chem. 1998, 70, 5288-5295; H. Oberacher, W. Parson, R. Muehlmann and C.G. Huber Anal. Chem. 2001, 73, 5109-5115; and C.J. Sciacchitano J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 1996, 19, 2165-2178). 불행히도, 상술한 기술과 같이, 신속하고 완전히 자동화된 고용량 처리 수행을 위한 길은 분명하지 않다.
Jiang 및 Hofstadler는 음이온 교환 수지로 패킹된 시판되는 피펫 팁을 사용하는 PCR 산물의 탈염 및 정제를 위한 단일 프로토콜을 개발하여 보고하였다 (Y. Jiang and S. A. Hofstadler Anal. Biochem. 2003, 316, 50-57). 이러한 프로토콜은 ESI-MS-친화성 (compatible) 샘플을 생산하고 단지 10 : 1의 조악한 (crude) PCR 산물을 필요로 한다. 그러나, 이 방법은 공지되지 않은 바이오제제의 확인을 위해 상기 인용된 방법과 같이 고용적 및 고용량 처리 공정에 적용하는 경우 비용이 너무 많이 든다. 시판되는 ZipTipTM AX (Millipore Corp. Bedford, MA)을 사용하는 경우 소매가가 플레이트 웰 당 $1.77로 어림된다.
신속하고 효과적이며 저렴한 질량 분광측정을 위한 핵산의 정제법이 여전히 요구되고 있으며, 본 발명이 이러한 요구를 충족시킨다.
증폭 반응으로부터 수득되는 것과 같은 핵산의 용액 캡쳐 (solution capture)는 질량 분광측정법에 의한 연속한 분석을 위해 이들 분석물을 추출하고 정제하는 신속하고 경재적인 방법을 가능하게 한다. 핵산 및 이온 교환 매질이 용액 상이기 때문에, 핵산의 효과적인 캡쳐가 볼텍싱 또는 기타 혼합 방법에 의해 달성된다. 이는 핵산의 높은 회수율을 달성하기 위해 컬럼 위에 핵산 용액을 다수 통과시켜야 하는 컬럼 포맷에 매질을 패킹시키는 필요성을 제거한다. 보다 긴 컬 럼이 보다 적은 통과를 요하는 한편, 상당한 백프레셔 (backpressure)가 문제가 된다. 따라서, 컬럼 또는 피펫 팁 포맷에 음이온 교환 수지를 패킹하는 공정은 절차와 관련된 비용을 증가시킨다. 따라서, 질량 분광측정법에 의한 분석을 위해 PCR 산물을 정제하기 위한 용액 캡쳐의 사용은 컬럼을 패킹하고 균형을 맞추고 테스트하는 필요성을 제거시킴으로써 샘플 제조와 관련된 비용을 실질적으로 감소시켰다. ZipTipTM AX (Millipore, Bedford, MA)로 예시되는 음이온 교환 수지로 패킹된 피펫 팁을 사용하는 현공정의 소매 비용은 (각각의 샘플에 대해) 피펫 팁 당 약 $1.77이다. PCR 산물의 용액 캡쳐에 대한 예상 비용은 샘플 당 $0.10이며, 음이온 교환 수지 및 필터 플레이트의 조합을 고려한 것이다. 또한, PCR 산물의 용액 캡쳐 정제에 필요한 시간은, ZipTipTM AX 피펩 팁을 이용하고 약 20분을 요하는 이전 방법과 대조적으로, 96-웨 플레이트 당 약 10분 이다.
발명의 요지
본 발명은, 특히, 음이온 교환 수지를 이에 결합하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 용액에 가하고 혼합하여 상기 용액에 음이온 교환 수지의 현탁액을 제조하는 단계; 상기 용액으로부터 음이온 교환 수지를 분리하는 단계; 상기 음이온 교환 수지를 세척하여 결합된 핵산은 남기면서 하나 이상의 세척 완충제와 함께 오염물을 제거하는 단계; 용출 완충제를 사용하여 상기 음이온 교환 수지로부터 핵산을 용출시키는 단계; 및 임의로 핵산을 전기분무 질량 분광측정법으로 분석하는 단계 를 포함하여, 전기분무 질량 분광측정법에 의한 연속 분석 또는 기타 분석을 위해 하나 이상의 핵산을 포함하는 용액을 정제하는 용액 캡쳐 방법에 관한 것이다.
음이온 교환 수지는 4급 아민가 같은 강음이온 교환 작용기 또는 예를 들어 폴리에틸렌이민, 하전된 방향족 아민, 디에틸아미노메틸 또는 디에틸아미노에틸과 같은 약음이온 작용기를 가질 수 있다. 이러한 약음이온 교환 수지는 pKa 값이 9.0 이상인 작용기를 포함한다.
또한, 본 발명은 다수의 웰 또는 다수의 튜브를 포함하는 튜브 랙 (rack)을 포함하는 필터 플레이트, 음이온 교환 수지, 하나 이상의 음이온 교환 세척 완충제 및 ESI-MS 친화성 용출 완충제를 포함하는 핵산의 정제를 위한 키트에 관한 것이다.
도 1은 핵산 샘플로 음이온 교환 수지를 첨가하고 혼합 (100)하는 것을 시작으로 하는 본 발명의 단계를 개요하는 공정 다이아그램이다. 이어서, 수지를 용액으로부터 분리하고 (110), 적합한 세척 완충제로 세척하여 수지로부터 오염물을 제거하며 (120), 이어서 ESI-MS에 의한 핵산 분석의 최종 단계를 가능하게 하는 ESI-친화성 용출 완충제로 핵산을 수지로부터 용출시킨다 (140).
도 2는 ZipTipsTM (상단 패널)로 정제하여 수득한 정제된 PCR 산물 및 본 발명의 용액 캡쳐 분리법으로 수득된 정제된 PCR 산물의 ESI-MS 스펙트럼을 비교한 것이다. 이러한 비교는 용액 캡쳐법에 의한 정제가 ZipTipsTM 을 사용하는 기존의 확인된 방법과 동일하게 효과적이라는 것을 나타낸다.
질량 분광측정법에 의한 분석을 위한 핵산의 용액 캡쳐 분리 방법에 대한 하나의 양태가 예를 들어 도 1에 개요되어 있다. 본원에 기술된 방법은 당업자에게 공지된 바와 같은 질량 분광측정법 이외에, 다른 타입의 분석에 대해서도 이용될 수 있다. 이 방법은 다음 단계를 포함한다: 음이온 교환 수지를 핵산을 포함하는 용액에 가하고 혼합하는 단계 (100); 상기 용액으로부터 음이온 교환 수지를 분리하는 단계 (110); 상기 음이온 교환 수지를 세척하여 오염물을 제거하는 단계 (120); 상기 음이온 교환 수지로부터 (오염물이 함유되지 않은) 핵산을 용출시키는 단계 (130); 및 임의로 핵산을 ESI-MS로 분석하는 단계.
하나의 양태에서, 음이온 교환 수지의 작용기로서 강음이온 교환 작용기, 예를 들어 4급 아민이 사용된다. 추가의 강음이온 교환 작용기는 당업자에게 공지되어 있다.
또 다른 양태에서, 약음이온 교환 작용기가 적합한 음이온 교환 작용기이며, 예를 들어 폴리에틸렌이민, 하전된 방향족 아민, 디에틸아미노메틸, 또는 디에틸아미노에틸이 음이온 교환 수지의 작용기로서 사용된다. 이러한 작용기는 pKa 값이 9.0 이상이다. 약음이온 교환 수지의 시판 제품은 이로 한정되는 것은 아니라 Baker PEI, Baker DEAM, Dionex ProPacTM WAX, Millipore PEI, Applied Biosystems PorosTM PI을 포함한다.
하나의 양태에서, 핵산 용액으로 음이온 교환 수지의 혼합은 반복적 피펫팅, 볼텍싱, 음파처리, 교반 또는 핵산을 포함하는 용액에 음이온 교환 수지의 현탁액을 생성하는 다른 방법에 의해 수행된다.
하나의 양태에서, 무수 (dry) 음이온 수지는 핵산의 용액에 직접적으로 가하거나 핵산 용액이 혼합 전에 가해지는 마이크로튜브 또는 마이크로필터 플레이트의 웰에 포함된다. 또 다른 양태에서, 음이온 교환 수지는 예비수화시켜 핵산 용액에 직접적으로 가하거나 핵산 용액이 혼합 전에 가해지는 마이크로튜브 또는 마이크로필터 플레이트의 웰에 포함된다.
하나의 양태에서, 결합된 핵산을 포함하는 음이온 교환 수지는 여과에 의해 용액으로부터 분리된다. 여과는, 예를 들어 다수 샘플의 고용량 처리를 가능하게 하는 96-웰 또는 384-웰 포맷 또는 필터가 장착된 모든 용기 또는 다수의 용기의 필터 플레이트를 이용하여 수행될 수 있다. 다른 웰 포맷 플레이트도 이용될 수 있다. 여과에 유용한 막은 이로 한정되는 것은 아니나 하기 물질로 구성된 것들을 포함한다: 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 폴리비닐디플루오로 (PVDF), 폴리프로펠렌, 폴리에틸렌, 유리 섬유, 폴리카보네이트 및 폴리설폰. 여과는 진공, 원심분리, 또는 유체 또는 가스를 갖는 PPD (Positive Pressure Displacement), 또는 용액으로부터 음이온 교환 수지를 분리하기 위한 모든 다른 방법을 포함한다. 여과 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
하나의 양태에서, 음이온 교환 수지는 자성 비드에 연결된 음이온 교환 작용기를 포함한다. 이러한 배열은 액체 핸들러 (handler) 덱 (deck)으로부터 플레이트 또는 마이크로튜브의 제거가 필요한 원심분리, 진공 또는 PPD 할 필요 없이 단순한 분리 단계 (110)을 가능하게 한다. 대신, 액체가 액체 핸들러에 의해 완전히 흡인될 수 있도록 자성 비드를 압착하기 위해 자장이 활성화될 수 있다. 바이오분자를 분리하기 위해 자성 비드를 사용하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
하나의 양태에서, 결합된 핵산을 포함하는 음이온 교환 수지는 하나 이상의 오염물을 제거하기 위해 세척된다. 오염물은 이로 한정되는 것은 아니나 단백질, 예를 들어 역전사효소 및 제한효소, 중합체, 염, 완충 첨가제, 또는 증폭 반응의 다양한 성분, 예를 들어 폴리머라제, 뉴클레오타이드 트리포스페이트 또는 이들의 배합물을 포함한다. 핵산 용액 중의 오염물의 조성에 따라 하나 이상의 세척 완충제가 오염물의 제거에 유용할 수 있다. 음이온 교환 수지의 세척은 약 20 mM 내지 약 500 mM NH4OAc 암모늄 아세테이트의 수용액 또는 약 20 mM 내지 약 500 mM NH4HCO3로 수행될 수 있다. 약 10% 내지 약 50% 메탄올, 약 20% 내지 약 50% 메탄올, 또는 약 10% 내지 약 30% 메탄올로의 세척이 최종 세척 단계에 유용하다. 메탄올은 당업자에게 공지된 다른 적합한 알콜로 대체될 수 있다.
하나의 양태에서, 음이온 교환 수지로부터 핵산의 용출은 약 pH 9 이상의 알칼리 pH의 ESI-친화성 용액, 예를 들어 약 2% 내지 약 8% 암모늄 하이드록사이드 수용액 또는 약 10 mM 내지 약 50 mM, 또는 25mM 피페리딘, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 또는 25mM 이미다졸 및 약 30% 메탄올 또는 다른 적합한 알콜의 수용액을 사용하여 수행된다. 본원에서 정의되는 ESI 친화성 용액은 ESI 공급원의 작용에 치명적인 영향을 주지 않는 용액이다.
본원에서 사용된 용어 "약"은 수식되는 용어의 ± 10 %를 의미한다. 따라서, 예를 들어 "약" 10 mM은 9 내지 11 mM을 의미한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 용액 캡쳐 방법에 의해 핵산을 정제하기 위한 키트를 제공한다. 하나의 양태에서, 키트는 충분한 양의 음이온 교환 수지를 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 음이온 교환 수지는 약음이온 교환 수지, 예를 들어 하기한 시판되는 약음이온 교환 수지이다: Baker 폴리에틸렌이민 수지, Baker 디에틸아미노메틸 수지, Dionex ProPacTM WAX, Millipore 폴리에틸렌이민, 및 Applied Biosystems POROSTM PI.
하나의 양태에서, 키트는 필터 플레이트, 예를 들어 96-웰 또는 384-웰 필터 플레이트 또는 다수의 마이크로 필터 튜브를 포함하는 마이크로튜브 랙을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 무수 양이온 교환 수지는 필터 플레이트의 웰 또는 마이크로튜브 랙에 예비-로딩되며, 예비-수화되거나 무수 (파우더) 형태일 수 있다.
또한, 키트는 다수의 웰을 포함하는 필터 플레이트 또는 다수의 튜브를 포함하는 튜브 랙, 음이온 교환 수지, 하나 이상의 음이온 교환 세척 완충제 및 ESI-MS 친화성 용출 완충제를 포함한다.
하나의 양태에서, 키트는 예비-수화된 음이온 교환 주지 또는 무수 음이온 교환 수지를 포함하는 96 또는 384-웰 플레이트, 제 2의 96 또는 384-웰 샘플 혼합 플레이트, 96 또는 384-웰 필터 플레이트, 수지 처리 완충제, 하나 이상의 세척 완충제 및 ESI 친화성 용출 완충제를 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 핵산 용액은 알려지지 않은 바이오제제의 확인을 위해 제조된 PCR 산물이며 자동화된 액체 핸들러 덱의 96-웰 샘플 플레이트의 각각의 웰에 포함된다. 액체 핸들러는 약물 발견 및 고용량 처리 스크리닝과 관련된 많은 실험 공정을 위한 토대이다. 액체 핸들러의 분배 (dispensation) 및 흡인 (aspiration) 기능은 용매/시약 첨가, 희석, 플레이트 복제 강화, 재분포 및 기타 마이크로플레이트-기초 작업을 수행하는데 이용되며 통상적으로 액체를 이동시키기 위해 1회용 피펫 팁을 이용한다. 이러한 양태의 다양한 액체 처리 작업을 수행하기 위한 액체 핸들러의 프로그래밍은 과도한 실험 없이도 당업자에 의해 가능하다.
액체 핸들러는 PCR 산물을 포함하는 웰로 예정된 용적의 음이온 교환 수지의 현탁액을 전달하고 혼합하도록 프로그래밍된다. 수지 현탁액은 수지 공급 용기, 예를 들어 96-웰 용기에 포함되어 액체 핸들러에 의해 PCR 산물 플레이트로 전달될 수 있다. 혼합은 PCR-수지 혼합물의 반복된 분배 및 흡인을 통해 액체 핸들러에 의해 수행되며 핵산의 수지에의 결합이 이 단계에서 일어난다. 이어서, 액체 핸들러는 PCR 산물-수지 혼합물을 96-웰 플레이트에서 96 또는 384-웰 필터 플레이트로 이동시킨다. 이 단계에서, 필터 플레이트는 액체 핸들러 덱으로부터 떼어낼 수 있으며 수지는 필터 플레이트를 액체 핸들러 덱으로 되돌리기 전에 원심분리 또는 PPD에 의해 용액으로부터 분리될 수 있다.
이어서, 결합된 핵산을 포함하는 수지는 세척 용액을 필터 플레이트로 피펫팅하는 액체 핸들러를 사용하여 적합한 세척 용액, 예를 들어 약 100 mM NH4HCO3으로 1회 이상 세척되고, 원심분리, 진공 또는 PPD 한 후, 약 20 % 내지 약 50 % 메탄올로 1회 이상 세척하여, 수지 및 결합된 핵산을 포함하는 플레이트를 액체 핸들러 덱으로 되돌린다.
마지막으로, 핵산은 ESI 친화성 용출 완충제, 예를 들어 약 25mM 피페리딘, 약 25mM 이미다졸 및 약 50% 메탄올의 수용액을 사용하여 수지로부터 용출된다. 이러한 ESI 친화성 완충제는 또한 임의로 연속한 ESI 질량 분광측정 분석 동안 ESI 질량 분광측정계를 보정하는데 사용되는 내부 표준을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 발명이 효율적으로 이해될 수 있도록 하기 위해 하기 실시예가 주어진다. 이들 실시예는 단지 설명을 위한 것으로 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 간주되지 않는다. 이들 실시예에 걸쳐, 분자적 클로닝 반응 및 기타 표준 재조합 DNA 기술은 달리 언급하지 않는 한 시판되는 시약을 사용하여 문헌 (Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, - 8 2nd ed. Cold Spring Harbor Press (1989))에 기술된 방법에 따라 수행되었다.
실시예 1: 핵산 분리 및 PCR
하나의 양태에서, 핵산은 유기체로부터 분리되어 질량 분광측정법에 의해 BCS 측정하기 전에 표준 방법을 이용하여 PCR 증폭된다. 핵산은, 예를 들어 세균 세포의 세제 용해, 원심분리 및 에탄올 침전에 의해 분리된다. 핵산 분리 방법이 예를 들어 문헌 (Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al.) and Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Sambrook et al.))에 기술되어 있다. 이어서, 핵산은 후술하는 바와 같이 삽입되는 다양한 서열을 포함하는 핵산의 보존된 영역에 결합하는 프라이머를 사용하여 PCR과 같은 표준 방법을 이용하여 증폭된다.
일반적인 게놈성 DNA 샘플 프렙 프로토콜: 원료 (raw) 샘플을 Supor-200 0.2 μM 막 시린지 필터 (VWR International)를 사용하여 여과시킨다. 샘플을 0.7 mm Zirconia 비드 0.45 g으로 예비-충전된 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 이동시키고 ATL 완충액 (Qiagen, Valencia, CA) 350 μl를 가한다. 샘플을 Retsch Vibration Mill (Retsch)에서 19 1/s 빈도로 10 분 동안 비드 비팅한다. 원심분리 후, 샘플을 S-블록 플레이트 (Qiagen)에 이동시키고, BioRobot 8000 핵산 분리 로봇 (Qiagen)을 이용하여 DNA 분리를 완결한다.
스왑 (Swab) 샘플 프로토콜: 샘플을 수거하기 위해 Allegiance S/P 브랜드 컬쳐 스왑 및 수집/이동 시스템을 이용한다. 건조시킨 후, 스왑을 17xlOO mm 컬쳐 튜브 (VWR International)에 놓고 게놈 핵산 분리를 Qiagen Mdx 로봇 및 Qiagen QIAamp DNA 블러드 바이오로봇 (Blood BioRobot) Mdx 게놈 제조 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 자동식으로 수행한다.
실시예 2: 질량 분광측정법
사용된 질량 분광측정계는 능동적으로 쉴딩된 (sheilded) 7 Tesla 강력 자석을 사용하는 Bruker Daltonics (Billerica, MA) Apex II 70e ESI-FTICR-MS (electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer)이다. 모든 양상의 플러스 서열 조절 및 데이타 수득은 1.1 GHz Pentium II 데이타 스테이션 러닝 Bruker's Xmass 소프트웨어에서 수행되었다. 20 μl 샘플 분량은 데이타 스테이션에 의해 트리거되는 (triggered) CTC HTS PAL 자동샘플러 (LEAP Technologies, Carrboro, NC)를 사용하여 96-웰 마이크로역가 플레이트로부터 직접적으로 추출되었다. 샘플은 75μL/hr의 유속으로 ESI 공급원에 직접적으로 주입되었다. 이온은 유리 디솔베이션 (desolvation) 모세관의 금속처리된 말단으로부터 약 1.5 cm에 위치된 off 축, 기초된 전기분무 프로브 (off axis, grounded electrospray probe)을 사용하는 변형된 Analytica (Branford, CT) 공급원에서 ESI를 통해 형성되었다. 유리 모세관의 대기압 말단은 데이트 수집 동안 EAI 니들에 대해 6000 V에서 편향되었다 (biased). 무수 N2/O2의 역전류 흐름이 디솔베이션 공정을 돕는데 이용되었다. 이온은, 질량 분석되는 트랩핑된 (trapped) 이온 셀로 주입하기 전에, rf-only 헥사폴 (hexapole), 스킴머 콘 (skimmer cone) 및 보조 게이트 전극으로 구성된 외부 이온 저장기에 축적된다.
스펙트럼 수집은 연속식 (continuous duty) 사이클 모드에서 수행되어 이온이 트랩핑된 이온 셀에서 이온 검출과 동시에 헥사폴 이온 저장기에 축적되었다. 이온이 트랩핑된 이온 셀로 전달되는 1.2 ms 전달 이벤트에 이어서, 이온은 8000 내지 500 m/z에 상응하는 1.6 ms chirp 자극되었다. 500 내지 5000 m/z 범위를 초과하는 데이타가 수득되었다 (1 M 데이타는 225 Hz 밴드폭을 초과함). 각각의 스펙트럼은 코-에딩 32 과전류 (co-adding 32 transients)에 의한 것이었다. 과전류는 매그니튜드 모드 (magnitude mode) Fourier 변형 및 내부 질량 표준을 이용한 포스트 보정 전에 일단 0으로 채워졌다 (zero-filled). ICR-2LS 소프트웨어 패키지 (G. A. Anderson, J. E. Bruce (Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA, 1995)를 이용하여 질량 스펙트럼을 디컨볼루션 (deconvolution)하고 DNA를 위해 변형된 "평균화" 핏팅 루틴 ("averaging" fitting routine) (M. W. Senko, S. C. Beu, F. W. McLafferty, J: Am. Soc. Mass Spectrom. 1995, 6, 229)을 이용하여 단일동위원소 (monoisotopic) 종의 질량을 계산하였다. 이러한 접근을 이용하여, 단일동위원소 분자량이 계산되었다.
실시예 3: 시판 ZipTipsTM을 사용하여 PCR 혼합물을 반자동 정제하는 공정
ZipTipsTM AX (Millipore Corp. Bedford, MA)을 전처리하기 위해, 하기 단계가 프로그래밍 되었으며, 96-웰 플레이트 (Marshall Bioscience)의 각각의 웰에 있는 스톡 용액으로부터 취해지는 유체를 사용하여 EvolutionTM P3 액체 핸들러 (Perkin Elmer)에 의해 수행되었다: ZipTipsTM AX의 랙을 로딩; ZipTipsTM AX을 15 :1의 10% NH40H/50% 메탄올로 세척; ZipTipsTM AX을 15 :1의 물로 8회 세척; ZipTipsTM AX을 15 :1의 100 mM NH4OAc로 세척.
PCR 혼합물의 정제를 위해, 20 :1의 조악한 PCR 산물을 BioHitTM 멀티채널 피펫을 이용하여 MJ 연구용 플레이트의 각각의 웰에 이동시켰다. 96-웰 플레이트의 각각의 웰을 300 :1의 40 mM NH4HCO3로 채웠다.. 96-웰 플레이트의 각각의 웰을 300 :l의 20% 메탄올로 채웠다. MJ 연구용 플레이트를 10 :1의 4% NH40H로 채웠다. 2개의 저장기를 탈이온수로 채웠다. 모든 플레이트 및 저장기를 예정된 순서로 EvolutionTM P3 (EP3) 피펫팅 스테이션에 놓았다. 하기 단계가 EvolutionTM P3 피펫팅 스테이션에 의해 수행되도록 프로그래밍되었다: 20 :1의 공기를 EP3 P50 헤드로 흡인, ZipTipsTM AX의 전처리된 랙을 EP3 P50 헤드로 로딩, 20 :1의 NH4HCO3를 ZipTipsTM AX로부터 분배; PCR 용액을 18회 흡인/분배하여 PCR 산물을 ZipTipsTM AX으로 로딩; 결합된 핵산을 포함하는 ZipTipsTM AX을 15 :1의 40 mM NH4HCO3로 8회 세척; 결합된 핵산을 포함하는 ZipTipsTM AX을 15 :1의 20% 메탄올로 24회 세척; 15 :1의 NH4OH로 18회 흡인/분배하여 ZipTipsTM AX로부터 정제된 핵산의 용출. ESI-MS에 의한 분석을 위한 최종 제제를 위해, 각각의 샘플을 50 mM 피페리딘 및 50 mM 이미다졸을 포함하는 70% 메탄올로 1:1 비율의 용적으로 희석하였다.
실시예 4: 용액 캡쳐로 PCR 혼합물을 반자동 정제하기 위한 공정
ProPacTM WAX 약음이온 수지를 전처리하기 위해, 하기 단계를 벌크로 수행하였다: 하기 용액 각각으로 연속 세척 3회 (완충액: 수지가 10:1 용적비): (1) 1.0 M 포름산/50% 메탄올 (2) 20% 메탄올 (3) 10% NH4OH (4) 20% 메탄올 (5) 40 mM NH4HCO3 (6) 100 mM NH4OAc. 수지는 4℃에서 20 mM NH4OAc/50% 메탄올에 저장되었다.
Corning 384-웰 유리 섬유 필터 플레이트를 250 :1의 NH4OH로 2회 헹굼하고100 :1의 NH4HCO3로 2번 헹굼하여 전처리하였다.
PCR 산물 핵산의 수지에의 결합을 위해, EvolutionTM P3 액체 핸들러에 의해 수행되도록 하기 단계가 프로그래밍되었다.: 0.05 내지 10 :1의 전처리된 ProPacTM WAX 약음이온 교환 수지 (30:1의 1:60 희석물)를 96-웰 플레이트의 50 :1 PCR 반응 혼합물 (80 :1 총 용적)에 첨가; 2.5 분 동안 흡인/분배하여 용액을 혼합; 및 용액을 전처리된 Corning 384-웰 유리 섬유 플레이트에 이동시킴. 수지로부터 액체를 제거하기 위해 원심분리하며 수동으로 또는 로봇 암의 조절 하에 수행된다.
핵산을 포함하는 수지를 200 :1의 100 mM NH4OAc, 200 :1의 40 mM NH4HCO3 로 3회 헹구고, 약 15 초 동안 원심분리하여 완충액을 제거하고, 이어서 약 15초 동안 20 % 메탄올로 3회 행구어 세척하였다. 최종 헹굼 후 연장 원심분리 (1 내지 2분)를 하였다.
수지로부터 핵산의 용출은 40 :1의 용출/전기분무 완충액 (25 mM 피페리딘/25 mM 이미다졸/35% 메탄올 및 50 nM의 내부 표준 올리고뉴클레오타이드, 질량 분광측정 시그날이 보정용)을 가하고 원심분리에 의해 384-웰 필터 플레이트로부터 384-웰 캐치 플레이트로 용출시켜 수행되었다. 이러한 조건에서 용출된 핵산은 ESI-MS에 의한 분석이 용이하였다 (도 2 참조). 액체 핸들러를 사용하여 단일 96-웰에서 샘플을 정제하는데 필요한 시간은 약 5분이다.
실시예 5: ZipTipsTM 정제 방법과 용액 캡쳐 방법의 비교
본 발명의 용액 캡쳐 방법의 효율성을 조사하기 위해, 용액 캡쳐 방법 (실시예 4)으로 정제된 PCR 산물에 대해 수득된 ESI-MS 분석 결과를 실시예 3에서 개요된 ZipTipsTM 방법과 비교하였다.
바실루스 안트라시스 (Bacillus anthracis) DNA를 분리하고 잔기 756 내지 872의 lef 유전자를 증폭하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. ZipTipsTM (상단 패널)을 사용한 정제 및 본 발명에 따른 용액 캡쳐 정제법으로 수득된 정제된 PCR 산물에 대한 ESI-MS 스펙트럼의 비교가 도 2에 나타나 있다. 그 결과, 용액 캡쳐 방법에 의한 정제가 ZipTipsTM을 사용하는 이전에 확인된 방법과 동일하게 효과적이다. 그러나, 용액 캡쳐에 의한 정제는 상당한 비용 절감 효과가 있고 보다 효율적이다. Jiang 및 Hofstadler에 의해 기술된 바와 같이, ZipTipsTM을 사용하는 PCR 산물의 정제는 20 분 미만에 ESI-친화성 샘플 (96-웰)을 생산한다. 본 발명의 용액 캡쳐 방법은 약 5분에 ESI-친화성 샘플을 생산한다. ZipTipTM AX (Millipore, Bedford, MA)으로 예시되는 음이온 교환 수지로 패킹된 피펫팅 팁을 사용하는 현 공정의 소매가는 (각각의 샘플에 대해) 피펫 팁 당 약 $1. 77이다. PCR 산물의 용액 캡쳐에 대한 예상 비용은 샘플 당 $0.10이며 음이온 교환 수지와 필터 플레이트의 조합을 고려한 것이다.
본원에 기술된 것 이외에도 앞서 기술한 바로부터 다양한 변형이 당업자에게는 자명할 것이다. 이러한 변형 또한 첨부된 특허청구범위의 범위에 속하며, 본원에 인용된 각각의 참조 문헌은 본원에 전부 참조로 삽입된다. 2003년 5월 13일에 출원된 미국 가출원 60/478,547는 본원에 전부 참조로 삽입된다.

Claims (60)

  1. 음이온 교환 수지에 결합하는 핵산을 포함하는 용액을 음이온 교환 수지와 혼합하여 상기 용액에 음이온 교환 수지의 현탁액을 제조하는 단계; 상기 용액으로부터 음이온 교환 수지를 분리하는 단계; 상기 음이온 교환 수지를 세척하여 결합된 핵산은 남기면서 세척 완충제와 함께 오염물을 제거하는 단계; 및 용출 완충제를 사용하여 상기 음이온 교환 수지로부터 핵산을 용출시키는 단계를 포함하여, 핵산을 포함하는 용액을 정제하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 질량 분광측정법으로 핵산을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 혼합, 세척 및 용출 단계가 액체 핸들러에 의해 수행되는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 혼합, 세척, 분리 및 용출 단계가 로봇에 의해 수행되는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 음이온 교환 수지가 강음이온 교환 수지인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 강음이온 교환 수지의 작용기가 4급 아민인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 음이온 교환 수지가 약음이온 교환 수지인 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 약음이온 교환 수지의 작용기가 폴리에틸렌이민, 하전된 방향족 아민, 디에틸아미노메틸 또는 디에틸아미노에틸을 포함하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 음이온 교환 수지는 폴리에틸렌이민 수지, 디에틸아미노메틸 수지, 비다공성 삼급 아민 중합체 수지(non porous tertiary amine polymer resin) 및 폴리에틸렌이민으로 표면 코팅된 가교(cross-linked) 폴리(스티렌디비닐벤젠)으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 혼합이 피펫팅, 볼텍싱, 음파처리 또는 교반에 의해 수행되는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 분리 단계가 여과에 의해 수행되는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 여과가 96-웰 플레이트, 384-웰 플레이트 또는 마이크로 필터 튜브에서 수행되는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 여과가 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐디플루오로에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 유리 섬유, 폴리카보네이트 및 폴리설폰의 막 중 하나를 사용하여 수행되는 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 여과가 진공, 원심분리 또는 유체 또는 가스를 사용한 PPD (Positive Pressure Displacement)에 의해 수행되는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 음이온 교환 수지가 자성 비드에 결합된 음이온 교환 작용기를 포함하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 분리 단계가 자성 비드를 압착하기 위해 자기장에 적용시키고 용액을 흡인시켜 수행되는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 세척 완충제가 암모늄 아세테이트를 포함하는 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 세척 완충제가 암모늄 비카보네이트를 포함하는 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 세척 완충제가 메탄올을 포함하는 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 용출 완충제가 암모늄 하이드록사이드를 포함하는 방법.
  21. 제 1항에 있어서, 용출 완충제가 ESI (Electrospray Ionization)와 친화성인 방법.
  22. 제 1항에 있어서, 용출 완충제가 피페리딘, 이미다졸 및 메탄올의 배합물을 포함하는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 핵산의 용액이 핵산 증폭 반응에 의해 제조된 것인 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 증폭 반응이 폴리머라제 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응 또는 스트랜드 교환 증폭에 의해 수행되는 방법.
  25. 제1항에 있어서, 오염물이 완충제 염, 안정화제, 금속 양이온, 단백질, 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 또는 이들의 조합물을 포함하는 것인 방법.
  26. 약음이온 교환 수지를 이에 결합하는 핵산을 포함하는 용액에 가하고 혼합하여 상기 용액에 약음이온 교환 수지의 현탁액을 제조하는 단계;
    상기 용액으로부터 약음이온 교환 수지를 분리하는 단계;
    상기 약음이온 교환 수지를 세척하여 결합된 핵산은 남기면서 세척 완충제와 함께 오염물을 제거하는 단계; 및
    용출 완충제를 사용하여 상기 약음이온 교환 수지로부터 핵산을 용출시키는 단계를 포함하여, 전기분무 질량 분광측정법으로 연속 분석하기 위해 핵산을 포함하는 용액을 정제하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 핵산을 질량 분광측정법으로 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제 26항에 있어서, 약음이온 교환 수지의 작용기가 폴리에틸렌이민, 하전된 방향족 아민, 디에틸아미노메틸 또는 디에틸아미노에틸을 포함하는 방법.
  29. 제26항에 있어서, 약음이온 교환 수지는 폴리에틸렌이민 수지, 디에틸아미노메틸 수지, 비다공성 삼급 아민 중합체 수지(non porous tertiary amine polymer resin) 및 폴리에틸렌이민으로 표면 코팅된 가교(cross-linked) 폴리(스티렌디비닐벤젠)으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  30. 약음이온 교환 수지를 이에 결합하는 핵산을 포함하는 용액에 가하고 혼합하여 상기 용액에 약음이온 교환 수지의 현탁액을 제조하는 단계;
    상기 용액으로부터 약음이온 교환 수지를 분리하는 단계;
    상기 약음이온 교환 수지를 세척하여 결합된 핵산은 남기면서 세척 완충제와 함께 오염물을 제거하는 단계; 및
    피페리딘, 이미다졸 및 메탄올을 포함하는 용출 완충제를 사용하여 상기 약음이온 교환 수지로부터 핵산을 용출시키는 단계를 포함하여, 전기분무 질량 분광측정법으로 연속 분석하기 위해 핵산을 포함하는 용액을 정제하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 질량 분광측정법으로 핵산을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 음이온 교환 수지를 포함하는 수지 공급원 플레이트; 샘플 혼합 플레이트; 필터 플레이트 또는 다수의 마이크로 필터 튜브를 포함하는 마이크로튜브 랙; 수지 세척 용액; 및 ESI-MS-친화성 용출 완충제를 포함하는, 핵산 정제를 위한 키트.
  33. 제 32항에 있어서, 필터 플레이트가 96-웰 플레이트 또는 384-웰 플레이트인 키트.
  34. 제 32항에 있어서, 음이온 교환 수지가 약음이온 교환 작용기를 포함하는 키트.
  35. 제 32항에 있어서, 음이온 교환 수지가 폴리에틸렌이민 수지, 디에틸아미노메틸 수지, 비다공성 삼급 아민 중합체 수지(non porous tertiary amine polymer resin) 및 폴리에틸렌이민으로 표면 코팅된 가교(cross-linked) 폴리(스티렌디비닐벤젠)으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 키트.
  36. 제 32항에 있어서, 음이온 교환 수지가 자성 비드에 결합된 약음이온 교환 작용기를 포함하는 키트.
  37. 제 36항에 있어서, 약음이온 교환 수지가 폴리에틸렌이민 수지, 디에틸아미노메틸 수지, 비다공성 삼급 아민 중합체 수지(non porous tertiary amine polymer resin) 및 폴리에틸렌이민으로 표면 코팅된 가교(cross-linked) 폴리(스티렌디비닐벤젠)으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 키트.
  38. 제 32항에 있어서, 하나 이상의 세척 용액이 약 50 mM 내지약 200 mM 암모늄 아세테이트 또는 약 50 mM 내지 약 200 mM 암모늄 비카보네이트를 포함하는 키트.
  39. 제 32항에 있어서, 하나 이상의 음이온 교환 세척 완충제가 약 20 % 내지 약 50 % 메탄올을 포함하는 키트.
  40. 제 32항에 있어서, ESI-MS 친화성 용출 완충제가 약 2 % 내지 약 6 % 암모늄 하이드록사이드를 포함하는 키트.
  41. 제 32항에 있어서, ESI-MS 친화성 용출 완충제가 약 10 mM 내지 약 50 mM 이미다졸, 약 10 mM 내지 약 50 mM 피페리딘 및 약 20 % 내지 약 50 % 메탄올을 포함하는 키트.
  42. 제 32항에 있어서, ESI-MS 친화성 용출 완충액이 25mM 이미다졸, 25mM 피페리딘 및 약 20 % 내지 약 50 % 메탄올을 포함하는 것인 키트.
  43. 제22항에 있어서, 상기 용출 완충제는 약 10mM 내지 약 50mM 피페리딘, 약 10mM 내지 약 50mM 이미다졸 및 메탄올을 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 용출 완충제는 약 25mM 피페리딘, 약 25mM 이미다졸 및 메탄올을 포함하는 것인 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 메탄올은 30% 메탄올인 방법.
  46. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 메탄올은 35% 메탄올인 방법.
  47. 제26항에 있어서, 상기 용출 완충제는 약 10mM 내지 약 50mM 피페리딘, 약 10mM 내지 약 50mM 이미다졸 및 메탄올을 포함하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 용출 완충제는 약 25mM 피페리딘, 약 25mM 이미다졸 및 메탄올을 포함하는 것인 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 메탄올은 30% 메탄올인 방법.
  50. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 메탄올은 35% 메탄올인 방법.
  51. 제30항에 있어서, 상기 용출 완충제는 약 10mM 내지 약 50mM 피페리딘, 약 10mM 내지 약 50mM 이미다졸 및 메탄올을 포함하는 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 용출 완충제는 약 25mM 피페리딘, 약 25mM 이미다졸 및 메탄올을 포함하는 것인 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 메탄올은 30% 메탄올인 방법.
  54. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 메탄올은 35% 메탄올인 방법.
  55. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 메탄올은 30% 메탄올인 키트.
  56. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 메탄올은 35% 메탄올인 키트.
  57. 제1항에 있어서, 상기 세척 완충제는 20mM 내지 500mM NH4Ac의 밀리몰 농도 범위 내의 암모늄 아세테이트 수용액, 20mM 내지 500mM NH4HCO3 및 10% 내지 50%의 메탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  58. 제26항에 있어서, 상기 세척 완충제는 20mM 내지 500mM NH4Ac의 밀리몰 농도 범위 내의 암모늄 아세테이트 수용액, 20mM 내지 500mM NH4HCO3 및 10% 내지 50%의 메탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  59. 제30항에 있어서, 상기 세척 완충제는 20mM 내지 500mM NH4Ac의 밀리몰 농도 범위 내의 암모늄 아세테이트 수용액, 20mM 내지 500mM NH4HCO3 및 10% 내지 50%의 메탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  60. 제30항에 있어서, 상기 약음이온 교환 수지의 작용기(functional group)는 폴리에틸렌이민, 전하를 띄는 방향족 아민, 디에틸아미노메틸 또는 디에틸아미노에틸을 포함하는 것인 방법.
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