KR100650295B1

KR100650295B1 - 조직이식기관, 조직이식물 및 조직이식방법

Info

Publication number: KR100650295B1
Application number: KR1019997001423A
Authority: KR
Inventors: 쿠크윌리엄에이.; 하일즈마이클씨.; 코즈마토마스지.; 패텔유메쉬에이치.
Original assignee: 쿠크 바이오텍, 인코포레이티드; 메드 인스티튜트, 인코포레이티드; 쿠크 인코포레이티드
Priority date: 1996-08-23
Filing date: 1997-08-22
Publication date: 2006-11-28
Also published as: US7652077B2; US20110076329A1; US20040180042A1; US8920516B2; AU6531898A; DK0925077T3; EP0925077B1; US20080167728A1; US6206931B1; US20100129463A1; BR9711166A; US20100106256A2; SK22499A3; WO1998022158A3; DK1378257T3; ES2208974T3; US20100106257A2; WO1998022158A2; US20030041386A1; US20040078076A1

Abstract

본 발명은 환자 인체의 일부를 임플란트(implant), 이식, 대체 또는 수복하기 위한 조직이식기관, 조직이식물 및 조직이식방법에 관한 것이다. 본 발명의 조직이식기관은 점막하조직 공급원으로부터 분리한 정제된 콜라겐-기본 매트릭스 구조물을 포함한다. 점막하조직 공급원은 오염물질을 탈활성화시키고 제거하기 위한 살균 및 제거 단계에 의해 정제되기 때문에, 정제된 구조물은 생체적합하고 환자에게 이식하기에 적합하다.

조직이식기관, 조직이식물, 조직이식방법, 점막하조직, 오염물질의 살균 처리

Description

조직이식기관, 조직이식물 및 조직이식방법{Graft prosthesis, materials and methods}

기술

관련 특허출원 참조

본 특허출원은 각각 본원에서 전체가 참고로 인용된 미국 특허원 제60/024,542호(1996년 8월 23일자로 출원됨)와 제60/024,693호(1996년 9월 6일자로 출원됨)를 우선권으로 주장하는 특허출원이다.

본 발명은 일반적으로 의료용 구조물, 특히, 조직이식기관, 조직이식물, 및 조직이식방법에 관한 것이다.

콜라겐-기본 물질로부터 유래된 정제된 형태의 조직 이식물이 제조되어 문헌에 발표된 바 있다. 콜라겐 분자 또는 콜라겐-기본 물질을 사용하여 인장 강도가 높은 접착성 필름을 제조하였다. 그러나, 일반적으로 알데히드를 사용하여 콜라겐 분자를 가교-결합시킴으로써 인장 강도가 높은 필름을 제조하였다. 이러한 유형의 물질의 경우, 예를 들면, 가수분해시, 알데히드가 필름에 고착될 수 있다. 이러한 잔류물은 세포독성이기 때문에, 상기 필름은 조직 이식물(implants)로서 불량하다.

알데히드 가교-결합된 콜라겐 분자와 관련된 문제를 피하면서 콜라겐-기본 조직 이식물을 제조하기 위한 다른 기술들이 개발되어 왔다. 이러한 방법 중의 하나가 미국 특허 제5,141,747호에 예시되어 있는데, 여기서 콜라겐 분자는 리신 엡실론 아미노기에서 가교-결합되거나 커플링된 다음, 커플링된(바람직하게는, 개질된) 콜라겐 분자로 변형된다. 상기와 같은 콜라겐 물질의 기재된 용도는 고막 수복용이다. 이러한 막이 우수한 물리적 특성을 나타내고 후속되는 가공 공정에 의해 멸균되는 것으로 기재되어 있지만, 이들은 세포 성장을 재형성 또는 재생시키거나, 일반적으로 손상되거나 질병에 걸린 조직 구조물의 재성장 및 치유를 향상시킬 수 없다.

일반적으로, 외과 기술 분야의 전문가들은 손상되거나 질병에 걸린 조직 구조물, 예를 들면, 혈관, 근육, 인대, 건(腱) 등을 대체하거나 수복시키기 위한 이식물 및 그라프트로서 사용하기 위한 신규한 기술 및 물질을 개발하기 위해 수년간 연구하였다. 오늘날, 예를 들어, 톤 십자형 인대(torn cruciate ligament) 대체물로서 사용하기 위한 자원성 또는 이원성 슬개골 건을 수확하는 것이 정형외과의에게는 일상적인 것이다. 상기와 같은 기술에 대한 외과적 방법은 공지되어 있다. 또한, 생리학적 구조물의 재구성 또는 대체용 플라스틱, 금속 및/또는 세라믹 물질로부터 형성된 이식성 조직이식물을 사용하는 것이 외과의에게는 통상적인 것이다. 그러나, 이들의 광범위한 용도에도 불구하고, 외과적으로 이식된 조직이식물들에는 환자에게 있어서 수많은 부수적인 위험이 존재한다.

연구원들은 또한 기능적 조직 구조물 및/또는 기타 결합조직(예를 들면, 헤르니아(hernia) 및 관절부 탈구 부상과 관련된 조직)으로서 작용하는 만족스러운 중합체 또는 플라스틱 물질을 개발하고자 시도하고 있다. 장기간의 결합조직 대체물로서 적합한 강성의 내구성 플라스틱 물질을 제공하는 것이 어려운 것으로 밝혀졌다. 플라스틱 물질을 둘러싸고 있는 조직은 감염될 수 있으며, 이러한 감염은 치료하기가 어렵기 때문에 종종 이식을 실패로 이끈다.

앞서 언급한 바와 같이, 여러 콜라겐-기본 물질이 또한 상기 언급한 조직 대체물로서 사용되었지만, 이들 물질은 적절한 인장 강도를 나타내지 않거나 감염 및 기타 면역원성 반응, 캡슐화에 문제가 있거나, 이들이 항생제, 성장 인자 등과 부하될 때 다른 문제를 갖는다. 예를 들면, 미국 특허 제4,956,178호에는 포유류의 장관으로부터 수득한 점막하 콜라겐 매트릭스가 기술되어 있으며, 여기서는 콜라겐 매트릭스를 항생제와 함께 부하하는 것으로 기술되어 있다. 관련 특허, 미국 특허 제5,372,821호에는 점막하 콜라겐 매트릭스를 통상의 기술(예를 들면, 알데히드 태닝, 프로필렌 옥사이드, 감마선 조사 및 과아세트산)에 의해 멸균시킬 수 있다고 기재되어 있다. 멸균 처리전에 점막하조직층을 먼저 주변 조직으로부터 탈층화시키는 것을 제외하고는 특정한 가공 단계가 기재되어 있지 않다.

그러므로, 이러한 조직 공급원으로부터 개선된 정제 형태의 콜라겐-기본 매트릭스를 수득할 필요가 있다. 또한, 조직 공급원으로부터 상기와 같은 매트릭스를 보다 용이하게 분리시킴으로써 개선된 정제 생성물을 수득할 수 있는 방법을 제 공할 필요가 있다. 본 발명은 이러한 필요를 만족시킨다.

발명의 요지

본 발명의 바람직한 양태 중의 하나에 따르면, 오염도가 정제된 구조물이 생체적합하도록 하는 정도인, 점막하조직 공급원으로부터 분리한 정제된 콜라겐-기본 매트릭스 구조물을 포함하는 조직이식기관이 제공된다.

본 발명의 다른 바람직한 양태는 내독소량이 12 내독소 단위/g 미만인, 점막하조직 공급원으로부터 분리한 정제된 콜라겐-기본 매트릭스 구조물을 포함하는 조직이식기관을 제공한다.

본 발명의 다른 바람직한 양태는 핵산 함량량이 2㎍/㎎ 미만인, 점막하조직 공급원으로부터 분리한 정제된 콜라겐-기본 매트릭스 구조물을 포함하는 조직이식기관을 제공한다.

본 발명의 다른 바람직한 양태는 바이러스량이 500 플라크 형성 단위/g 미만인, 점막하조직 공급원으로부터 분리한 정제된 콜라겐-기본 매트릭스 구조물을 포함하는 조직이식기관을 제공한다.

본 발명은 또한 가공보조제량이 100,000ppm/㎏ 미만인, 점막하조직 공급원으로부터 분리한 정제된 콜라겐-기본 매트릭스 구조물을 포함하는 조직이식기관을 제공한다.

본 발명의 추가의 양태는 점막하조직 공급원으로부터 콜라겐-기본 매트릭스를 수득하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 점막하조직 공급원을 살균제로 처리하여 살균된 점막하조직 공급원을 수득하고, 이로부터 콜라겐-기본 매트릭스를 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 양태는 살균제로 처리한 점막하 조직원을 제공하는 단계 및 상기 점막하조직 공급원으로부터 콜라겐-기본 매트릭스를 회수하는 단계를 포함하여, 점막하조직 공급원으로부터 콜라겐-기본 매트릭스를 수득하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 콜라겐-함유 구조물과 다른 조직을 처음부터 함유하는 조직 공급원으로부터 분리한, 내독소량이 12 내독소 수주/g 미만인 콜라겐-함유 구조물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 포유동물 조직원을 살균한 다음 살균된 포유동물 조직 공급원으로부터 콜라겐-함유 구조물을 회수하는 단계를 포함하는 방법으로 수득할 수 있으며 포유동물의 점막하조직을 포함하고 포유동물의 조직 공급원으로부터 수득되는, 정제된 콜라겐-함유 매트릭스를 제공한다.

바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 바이오버든(bioburdon)량이 실질적으로 제로(zero)이고/이거나, 피로겐이 필수적으로 함유되어 있지 않으며, 동물의 소화관, 호흡관, 뇨관 또는 생식관으로부터 유래되는, 정제된 형태의 점막하조직 콜라겐 매트릭스를 제공한다. 바람직한 콜라겐 매트릭스는 세포독성 반응, 감염, 이식 거부반응 또는 대부분의 환자에 있어서 유해한 다른 영향을 유발시키지 않으면서 사람 또는 동물 환자 내에 이식할 수 있다. 본 발명의 몇가지 양태에 따르는 바람직한 이식성 콜라겐 매트릭스가 주로 점막하조직을 포함하는 반면, 상기 양태의 콜 라겐 매트릭스는 이들이 유래되는 공급원에 따라 점막근층, 점막근, 점막고유층, 치밀층 및/또는 다른 기타 조직 물질을 또한 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 동물 또는 사람의 소화관, 호흡관, 뇨관 또는 생식관으로부터 유래되고, 감염된 점막하조직 공급원을 분리시켜 분리된 점막하조직 콜라겐 매트릭스를 수득함으로써 제조되는, 분리되고 정제된 점막하조직 콜라겐 매트릭스가 제공된다. 예를 들면, 동물의 소화관, 호흡관, 뇨관 또는 생식관으로부터 수확한 미가공된 적층 점막하조직 공급원을 살균제로 처리한 다음, 부착된 조직으로부터 점막하조직 콜라겐 매트릭스를 분리시킴을 포함하는 방법에 의해 유용한 매트릭스를 수득할 수 있다. 바람직한 콜라겐 매트릭스의 바이오버든량은 실질적으로 제로이며, 세포독성 반응, 감염, 이식 거부반응 또는 대부분의 환자에 있어서 유해한 다른 영향을 유발시키지 않으면서 사람 또는 동물 환자 내에 이식할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 살균된 점막하조직 공급원을 분리시켜 분리된 점막하조직 콜라겐 매트릭스를 수득함을 포함하여, 고도로 정제시켜 분리한 점막하조직 콜라겐 매트릭스를 실질적으로 멸균 상태로 수득하는 방법이 제공된다. 바람직한 방법은 동물 또는 사람의 소화관, 호흡관, 뇨관 또는 생식관으로부터 수확한 적층 화된 점막하조직 공급원을 살균제로 처리한 다음, 점막하조직에 부착된 다른 조직 공급원으로부터 점막하조직을 분리시키는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명에 따르면, 동물의 소화관, 호흡관, 뇨관 또는 생식관으로부터 유래되고, 바이오버든이 실질적으로 제로이며, 실질적으로 어떠한 표면 조직 파괴 물도 함유하지 않는(즉, 실질적으로 어떠한 근육조직, 점막층, 지질 또는 세포 파괴물도 포함하지 않음), 고도로 순수한 점막하조직 콜라겐 매트릭스가 제공된다. 바람직한 콜라겐 매트릭스는 세포독성 반응, 감염, 이식 거부반응 또는 대부분의 환자에 있어서 유해한 다른 영향을 유발시키지 않으면서 사람 또는 동물 환자 내에 이식할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 동물의 소화관, 호흡관, 뇨관 또는 생식관으로부터 유래되고, 성장 인자를 포함하며, 실질적으로 멸균 상태로 분리된 점막하조직 공급원을 용매(예를 들면, 물)로 세정한 다음, 살균제, 바람직하게는 pH 약 1.5 내지 약 10의 과산으로 처리하고, 이어서 부착된 조직으로부터 점막하조직을 분리시킴으로써 제조되는, 고도로 순수한 점막하조직이 제공된다. 과산은 pH가 7 이상으로 되도록 완충시킨다. 이렇게 하여 제조된 콜라겐 매트릭스 중의 성장 인자의 함량이 1 이상으로 상당히 높은 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따르면, 피로겐이 필수적으로 함유되어 있지 않은 점막하조직 콜라겐 매트릭스를 포함하는 조직이식 조성물이 제공된다. 상기와 같은 조성물이 피로겐 함량이 약 1 내독소 단위/g(EU/g) 미만인 점막하조직 콜라겐 매트릭스를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명에 따라, 상기한 바와 같은 고도로 순수한 점막하조직을 사람 또는 동물 환자에게 이식할 경우 생체내에서의 맥관형성이 활성화되는 것이 증명된다.

본 발명은 정제된 이식성 조직 작제물, 상기와 같은 정제된 이식성 조직 작 제물의 제조방법 및 손상되거나 질병에 걸린 조직 구조물의 성장 및 치유를 향상시키기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 이식성 조직으로서 사용하기에 적합한, 고도로 정제된 형태의 점막하조직 콜라겐 매트릭스 및 상기와 같은 정제된 형태의 콜라겐-기본 이식성 조직의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 이들 양태 및 기타 양태는 하기의 상세한 설명의 숙독시 당해 분야의 숙련가에 있어서 자명해질 것이다.

도 1은 본 발명에 따르는 관형 조직이식기관 구조물의 투시도이다.

본 발명 원리에 대한 이해를 증진시키기 위해, 본 발명의 바람직한 양태를 참고로 하며 특정 용어를 사용하여 설명한다. 그럼에도 불구하고, 이들에 의해 본 발명의 범주가 제한되지는 않으며, 본 명세서에 기술된 바와 같은 발명 원리의 변형, 추가적인 개질 및 응용은 본 발명과 관련된 분야에서의 숙련가에 의해 통상적으로 일어나는 것으로 간주될 것이다.

본 명세서를 기술함에 있어서, 많은 용어가 사용된다. 상세한 설명 및 특허청구의 범위를 제공하고 명확하고 일관성있는 이해를 돕기 위해, 하기의 정의를 제공한다.

<바이오버든(bioburden)>

제공된 양의 물질 표면 및/또는 내부에서 발견되는 살아있는 미생물의 수(콜로니-형성 단위(CFU)로 나타냄)를 나타낸다. 미생물의 예로는 세균, 진균 및 이의 포자가 포함된다.

<살균>

물질 중의 바이오버든의 감소를 나타낸다.

<멸균>

물질의 제공된 분획 표면 및/또는 분획 내부에서 살아있는 미생물의 발견 가능성이 백만분의 1 이하로 되도록 하는 정도의 바이오버든(CFU)을 갖는 물질의 상태를 나타낸다.

<피로겐 (pyrogen)>

숙주에 도입된 후 열반응을 일으키는 물질을 나타낸다.

<내독소>

그람-음성균의 세포벽의 일부인 특정 피로겐을 나타낸다. 내독소는 세균으로부터 연속적으로 발산되어 물질을 오염시킨다.

<정제>

천연적으로 존재하는 물질, 및/또는 물질상에 존재하는 미생물 또는 이들의 성분에 의한 오염물질로 인해 발생되는 하나 이상의 오염물질을 제거하기 위한 물질의 처리를 나타낸다. 일례로서, 오염물질은 독성, 감염성, 피로겐발생성, 자극 잠재능, 반응성, 용혈 활성, 발암성 및/또는 면역원성을 일으키는 것으로 공지된 것일 수 있다.

<생체적합성>

문헌[참조: ISO(International Standards Organization) 표준 제10993호 및/또는 미국 약전(USP) 23 및/또는 미국 식품의약품국(FDA, blue book, memorandum) 제G9501호(표제 "Use of International Standard ISO-10993, Biological Evaluation of Medical Devices Part-1; Evaluation and Testing")]에 설정되어 있는 생체적합성 시험을 통과할 수 있는 물질의 능력을 나타낸다. 통상적으로, 이러한 시험은 물질의 독성, 감염성, 피로겐발생성, 자극 잠재능, 반응성, 용혈 활성, 발암성 및/또는 면역원성에 대해 검정한다. 생체적합성 구조물 또는 물질은, 대다수의 환자에 도입시, 부작용 또는 부반응을 일으키지 않는다. 또한, 생체적합성은 프리온(prion), 계면활성제, 올리고뉴클레오티드, 및 기타 생체적합성에 영향을 줄 수 있는 물질 또는 오염물질과 같은 기타 오염물질에 의해 영향을 받을 수 있다.

<오염물질>

물질 표면에 부착되거나 물질 내부에 있는 바람직하지 못한 물질을 나타낸다. 이에는 바이오버든, 내독소, 항균제와 같은 가공보조제, 혈액, 혈액 성분, 바이러스, DNA, RNA, 포자, 원치않는 조직층의 단편, 세포 파편 및 점막이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

<점막하조직>

동물의 소화관, 호흡관, 뇨관 및 생식관의 대부분에 존재하는 점막조직하부에서 발생하는 콜라겐-함유 결합조직층을 나타낸다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 일반적으로 정제된 콜라겐-기본 매트릭스 구조 물을 포함하는 조직이식기관과 조직이식물, 이를 수득하는 방법 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 유용한 조직이식기관은 사람 또는 다른 포유동물 조직(예를 들면, 돼지, 소 또는 양의 조직)과 같은 동물 조직을 포함하는 점막하조직 공급원으로부터 수득된다.

여러 동물 조직에 있어서, 점막하조직은 일반적으로 사람 또는 동물이 감염되거나 질병에 걸리지 않은 경우, 천연 상태에서 무균 상태이다. 이는 특히 점막하조직이 동물의 소화관, 호흡관, 뇨관 및 생식관의 내부층이기 때문이다. 따라서, 일반적으로 세균 및 장관의 상피조직과 같은 기타의 세포 파편에 노출되지 않는다. 본 발명의 양태 중의 하나는 분리시키기 전에 점막하조직 공급원 조직을 살균시킴으로써, 특히 분리 공정을 멸균 조건하에서 수행하는 경우, 점막하조직층의 무균 상태를 보존하거나 실질적으로 보존할 수 있다는 것을 발견하였다는 점이다.

특히, 점막하조직 공급원을 살균시킨 다음, 점막하조직을 포함하는 정제된 매트릭스를, 예를 들면, 근육층 및 점막층으로부터 점막하조직을 탈층화시켜 분리함으로써 세균 및 기타 오염물질에 대한 점막하조직의 노출이 최소화된다는 사실을 발견하였다. 또한, 이는 단리된 점막하조직 매트릭스가 살균제 또는, 경우에 따라, 멸균제에 노출되는 것을 최소화시킬 수 있기 때문에, 점막하조직의 본질적인 생화학 및 여러 점막하조직의 유익한 효과를 실질적으로 보존시킬 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따르는 점막하조직 이식성 콜라겐 매트릭스는 동물의 소화관, 호흡관, 뇨관 또는 생식관으로부터 수득할 수 있다. 콜라겐을 기본으로하기 때문에 주로 콜라겐인 점막하조직은 포유동물의 소화관으로부터 유래되 는 것이 바람직하며, 돼지의 장관으로부터 유래되는 것이 가장 바람직하다. 가장 바람직한 공급원인 전체 소장은 체중이 약 450파운드 이상인 성숙한 돼지로부터 수확한다. 건강하고 질병에 걸리지 않은 동물로부터 수확한 소장은 장관내에 혈관 및 혈액 공급물 뿐만 아니라 소장의 관강 내에 함유되어 있는 이. 콜라이(E. coli)와 같은 여러 미생물을 함유한다. 따라서, 점막하조직을 분리시키기 전에 소장 전체를 살균시켜, 이들 오염물질을 실질적으로 제거시키고 혈액 및 혈액 성분 뿐만 아니라 그외의 다른 미생물, 피로겐 또는 존재할 수 있는 다른 병원성 물질이 거의 없는 바람직한 이식성 점막하조직을 제공한다. 사실, 본 발명을 특정 이론으로 제한하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 하지만, 이러한 공정이 점막하조직의 본질적인 무균 상태를 실질적으로 보존시키는 것으로 믿어진다.

또한, 본 발명에 따르는 콜라겐 매트릭스가 항생제, 항균제, 또는 매트릭스의 본질적인 생화학 및 이식시 이의 효과에 영향을 줄 수 있는 다른 항미생물 타입 제제가 실질적으로 함유되어 있지 않은 것이 바람직하다. 과거에, 상기와 같은 조직물의 처리 방법 중의 하나는 분리시킨 조직을 염수로 세정하여 이를 항미생물제, 예를 들면, 미국 특허 제4,956,178호에 기술된 바와 같은 항미생물제에 침지시키는 것이다. 상기와 같은 기술은 본 발명의 단리된 점막하조직에 대해 임의로 실시할 수 있는 반면, 본 발명에 따르는 바람직한 방법은 콜라겐 매트릭스의 생화학에 영향을 주지 않을 뿐만 아니라 환자의 조직으로 불필요하게 도입시킬 수 있는 항미생물제 등의 사용을 피할 수 있다.

앞서 논의된 바와 같이, 점막하조직층을 포함하는 정제된 콜라겐 매트릭스를 예를 들면, 점막하조직 공급원을 분리시켜 회수하기 전에, 먼저 점막하조직 공급원을 살균시킴으로써, 고도로 순수한 형태의 이식성 점막하조직 콜라겐 매트릭스를 수득할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 상기 공정에 의해 특정한 가공상의 잇점 뿐만 아니라 점막하조직층으로부터 부착된 조직을 회수하는 것이 더욱 용이하고, 특징적으로 낮은 오염물질을 포함하여 생성된 점막하조직층의 개선된 특성을 수득할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 방법은 바람직하게는 먼저 점막하조직 공급원을 용매(적합하게는, 물)로 1회 이상 세정시키는 단계를 포함한다. 세정 단계에 이어서 살균제로 처리한다. 살균제는 산화제인 것이 바람직하다. 바람직한 화합물은 퍼옥시 화합물, 바람직하게는 유기 퍼옥시 화합물이며, 보다 바람직하게는 과산이다. 상기와 같은 살균제는 액체 매질 중의, 바람직하게는, pH가 약 1.5 내지 약 10, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 6, 가장 바람직하게는 약 2 내지 약 4인 용액으로 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에서, 살균제는 일반적으로 명세서에 기술된 바와 같은 특징적인, 정제된 점막하조직 매트릭스, 바람직하게는 바이오버든이 필수적으로 제로이고/이거나 피로겐이 필수적으로 함유되어 있지 않은 매트릭스를 회수할 수 있는 조건 및 기간 동안 사용된다. 이와 관련하여, 본 발명의 바람직한 방법은 조직 공급원을 살균제를 함유하는 액체 매질 중에 약 5분, 통상적으로 약 5분 내지 약 40시간, 보다 바람직하게는 약 0.5시간 내지 약 5시간 동안 침지(예를 들면, 함침 또는 샤워링)시키는 단계를 포함한다.

바람직한 퍼옥시 살균제는 과산화수소이다. 과산화수소의 농도 범위는 약 0.05 내지 30용적%일 수 있다. 보다 바람직하게는, 과산화수소의 농도는 약 1 내지 약 10용적%이고, 가장 바람직하게는 약 2 내지 5용적%이다. 상기 용액을 pH가 약 5 내지 9로 되도록 완충시키거나 시키지 않을 수 있다. pH가 약 6 내지 7.5인 것이 보다 바람직하다. 이러한 농도를 물 또는 약 2 내지 약 30용적%의 알코올 수용액으로 희석시킬 수 있다. 알코올은 에탄올인 것이 가장 바람직하다. 용액의 온도 범위는 약 15 내지 50℃이다. 보다 바람직한 용액의 온도는 약 20 내지 40℃이다. 가장 바람직한 용액의 온도 범위는 약 32 내지 37℃이다. 노출 시간은 약 10 내지 400분일 수 있다. 바람직한 노출 시간은 약 120 내지 240분이다. 보다 바람직한 노출 시간은 180 내지 210분이다.

바람직한 유기 과산화물 살균제는 퍼프로피온산이다. 퍼프로피온산의 농도 범위는 약 0.1 내지 10용적%일 수 있다. 보다 바람직한 퍼프로피온산 농도는 약 0.1 내지 1.0용적%이고, 가장 바람직하게는 약 0.2 내지 0.5용적%이다. 이러한 퍼프로피온산의 농도를 물 또는 약 2 내지 약 30용적% 알코올 수용액 중에서 희석시킬 수 있다. 알코올은 에탄올인 것이 가장 바람직하다. 점막하조직 공급원을 유기 과산화물 용액에 약 15분 내지 약 40시간 동안, 보다 통상적으로는 약 0.5 내지 약 8시간 동안 노출시킬 수 있다. 다른 퍼옥시 살균제는 문헌(참조; "Peroxygen Compounds", S. Block, in Disinfection, Sterilization and Preservation, S. Block, Editor, 4th Edition, Philadelphia, Lea & Febiger, pp. 167-181, 1991; 및 "Disinfection with peroxygens", M.G.C. Baldry and J.A.L. Fraser, in Industrial Biocides, K. Payne, Editor, New York, John Wiley and Sons, pp. 91- 116, 1988)에 기술된 바와 같이 사용하기에 적합하다.

다른 산화 살균제로는 디클루코네이트 형태의 클로르헥시딘 (1,6-디(4-클로로페닐디구아니도)헥산)이 있다. 클로르헥시딘 디글루코네이트의 농도 범위는 약 0.1 내지 15중량%일 수 있다. 보다 바람직한 클로르헥시딘 디글루코네이트의 농도는 약 0.1 내지 2중량%이고, 가장 바람직한 농도는 약 0.2 내지 5중량%이다. 상기 용액을 pH가 약 5 내지 8로 되도록 완충시키거나 시키지 않을 수 있다. 보다 바람직한 pH는 약 5.5 내지 7이다. 이러한 농도를 물 또는 약 2 내지 약 20용적%의 알코올 수용액 중에서 희석시킬 수 있다. 알코올이 약 5 내지 10% 농도의 에탄올인 것이 가장 바람직하다. 용액 온도 범위는 약 15 내지 30℃일 수 있다. 노출 시간 범위는 약 10 내지 400분일 수 있다. 보다 바람직한 노출 시간은 약 30 내지 60분이다. 다른 염소제가 문헌(참조; "Chlorhexidine", G.W. Denton, in Disinfection, Sterilization and Preservation, S. Block, Editor, 4th Edition, Philadelphia, Lea & Febiger, pp. 274-289, 1991)에 기술되어 있다.

바람직한 제조 공정에서, 과산 또는 기타 살균제를 묽은 알코올 수용액에 용해시킬 수 있으며, 여기서 바람직하게는 알코올의 탄소수가 1 내지 약 6이고, 알코올은 일반적으로 용액의 약 1 내지 약 30용적%를 차지할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 보다 바람직한 알코올은 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 에탄올이 이러한 목적에 가장 바람직한 알코올이다.

과산을 살균에 사용할 경우, 퍼아세트산, 퍼프로피온산 또는 퍼벤조산으로 이루어진 그룹으로부터 선택하는 것이 바람직하다. 퍼아세트산은 가장 바람직한 살균제이다. 퍼아세트산을 약 2 내지 약 10용적% 알코올 용액으로 희석시키는 것이 바람직하다. 퍼아세트산의 농도 범위는 예를 들면, 약 1.0 내지 약 0.5용적%일 수 있다. 퍼아세트산의 가장 바람직한 농도는 약 0.1 내지 약 0.3용적%이다. 과산화수소가 또한 살균제로 사용될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 예를 들면 소장으로부터의 점막하조직 공급원을 글루타르알데히드, 포르말린 등과 같은 살균제를 이용하여 살균시킬 수 있는데, 이들은 또한 가교결합을 도입시키지 않으면서 살균에 사용될 수 있는 과산과 같은 다른 살균제의 작용과는 달리, 콜라겐 매트릭스으로 실질적인 가교결합을 도입시킬 수 있는 능력에 대해 공지되어 있다. 또한, 점막하조직 공급원을 살균 목적으로 조사(예를 들면, 감마선 조사)에 의해 처리할 수 있다.

살균 공정에 대한 별법으로서 또한 하기와 같은 것이 있을 수 있다:

1. 용액 대 소장 중량 비율을 10:1로 하여, 소장을 0.2% 퍼아세트산, 5% 에탄올 용액으로 처리한다. 용액의 pH는 2.6이다. 용액과 소장을 2시간 동안 강력하게 혼합한다.

2. 용액 대 소장 중량 비율을 5:1로 하여, 소장을 1% 퍼아세트산, 25% 에탄올 용액으로 처리한다. 용액의 pH는 2이다. 용액과 소장을 1시간 동안 강력하게 혼합한다.

3. 용액 대 소장 중량 비율을 5:1로 하여, 소장을 1% 퍼아세트산, 15% 에탄올, 및 10% 과산화수소 용액으로 처리한다. 용액과 소장을 1시간 동안 강력하게 혼합한다.

4. 소장 전체를 고순도의 물로 15분간 4회 세정한다. 이어서, 장을 1.5 MRAD 전자빔으로 조사시킨다.

5. 소장 전체를 고순도의 물로 15분간 4회 세정한다. 콘베이어 벨트에 따라 길이방향으로, 소장을 고강도 펄스식 광으로 처리하여 소장을 살균시킨다.

상기한 바와 같이 처리한 다음, 점막하조직층 공급원(예를 들면, 장 전체, 소의 자궁 등)으로부터 점막하조직층을 분리시킨다. 살균전에 점막하조직층을 스트리핑시키는 경우와 비교하여, 이와 같은 살균후-스트리핑 공정에 의해 부착된 조직(예를 들면, 적어도 부착된 근육층 조직)으로부터 점막하조직층을 분리하는 것이 더욱 용이한 것으로 밝혀졌다. 또한, 생성된 가장 바람직한 형태의 점막하조직층이, 점막하조직층을 이의 공급원으로부터 분리시킨 다음 층을 살균시켜 수득한 점막하조직층과 비교하여, 부착된 조직과 세포 파괴물이 적은 우수한 조직학을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이러한 공정으로부터 더욱 균일한 점막하조직을 수득할 수 있으며, 동일하거나 유사한 물리적 특성 및 생화학적 특성을 갖는 점막하조직을 각각의 별도의 가공 단계로부터 보다 균일하게 수득할 수 있다. 이러한 공정에 의해, 고도로 정제되고 실질적으로 멸균 상태의 점막하조직이 수득된다는 것이 중요하다.

점막하조직 공급원의 스트리핑은 살균되거나 멸균된 주조기(casing machine)를 사용하여 수행함으로써 실질적으로 멸균 상태이고 최소로 가공된 점막하조직을 제조하는 것이 바람직하다. 적합한 주조기는 호그 케이징(hog casing)용 모델 3-U-400 스트리즈 유니버셜 머신(Stridhs Universal Machine, 제조원; AB Stridhs Maskiner, Gotoborg, Sweden)이다. 따라서, 측정된 바이오버든량은 최소이거나 실질적으로 제로이다. 물론, 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 점막하조직 공급원을 분리시키기 위한 다른 방법, 예를 들면, 손으로 분리시키는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에 따르는 보다 바람직한 방법은 또한 점막하조직 콜라겐 매트릭스에 함유되어 있는 오염물질을 제거하거나 현저하게 감소시킬 뿐만 아니라, 물리적 특성 및 기계적 특성, 예를 들면 차동 다공성(즉, 점막하조직층의 한 면이 다른 면 보다 다공성이 더 큼), 및 양호한 강도, 예를 들면, 파열 강도(burst strength)가 거의 변하지 않는 조직을 제조하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 보다 바람직한 방법은 조직 이식물의 효능도에 영향을 미치는 점막하조직 콜라겐 매트릭스의 차동 다공성에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 상기 조직을 반드시 가교결합제, 또는 콜라겐 매트릭스의 다공성 또는 본질적인 천연 구조를 파열시키는 물질로 처리할 필요는 없다. 또한, 과산화수소를 사용하는 경우, 매트릭스는 대체적으로 다공성이 더 클 뿐만 아니라 산소 함량이 더 높다. 이는 오염물질, 예를 들면, 내독소, 피로겐 등을 확실하게 제거시키는데 도움이 된다.

또한, 본 발명의 콜라겐-기본 매트릭스(예를 들면, 점막하조직 포함)의 유리한 형태는 활성적인 맥관형성, 즉 조직의 매트릭스내에서의 혈관 형성을 유도하는 능력이 있는 것으로 증명되었다. 이와 관련하여, 본 발명에 따르는 이러한 바람직한 매트릭스는 예를 들면, 하나 이상의 클리코사미노글리칸, 당단백질, 프로테오글리칸 및/또는 성장 인자 (예를 들면, 형질전환 성장 인자-a', 형질전환 성장 인자- a" 및/또는 섬유아세포 성장 인자 2(염기성))를 포함하여, 천연적으로 존재하는 유익한 성분을 함유한다.

본 발명의 바람직한 콜라겐-기본 매트릭스, 바람직하게는 점막하조직-함유 매트릭스는 또한 하기 표 1에 나타낸 오염물질량을 특징으로 하며, 각각의 오염물질량은 개별적으로 또는 일부 또는 다른 모든 기재된 오염물질량과 함께 고려된 것이다. 표 1에서의 약어는 다음과 같다: CFU/g = 그램당 콜로니 형성 단위; PFU/g = 그램당 플라크 형성 단위; ㎍/㎎ = 밀리그램 당 마이크로그램; ppm/㎏ = 킬로그램당 백만분의 1.

양상	첫번째 바람직한 양	두번째 바람직한 양	세번째 바람직한 양
내독소	< 12 EU/g	< 10 EU/g	< 5 EU/g
바이오버든	< 2 CFU/g	< 1 CFU/g	< 0.5 CFU/g
진균류	< 2 CFU/g	< 1 CFU/g	< 0.6 CFU/g
핵산	< 10㎍/㎎	< 5㎍/㎎	< 2㎍/㎎
바이러스	< 500 PFU/g	< 50 PFU/g	< 5 PFU/g
가공보조제	< 100,000 ppm/㎏	< 1,000 ppm/㎏	< 100 ppm/㎏

본 발명의 더욱 바람직한 콜라겐-기본 매트릭스는 내독소량이 1 EU/g 미만이고, 가장 바람직하게는 0.5 EU/g 미만이다.

본 발명에 따르는 정제된 콜라겐-기본 매트릭스는 여러 방법으로 가공하여 시험관내 및 생체내에서 모두 유용한 콜라겐성 매트릭스를 제공할 수 있다. 예를 들면, 점막하조직을 배열시켜 예를 들면, 미국 특허 제2,127,903호 및 제4,902,508호에 기술된 바와 같이 혈관에 사용하기에 유용한 조직 이식물을 제공할 수 있다. 도 1을 참고로 하여, 혈관 이식에 사용할 경우, 일반적으로 관형 조직이식기관 구조물(11)을 콜라겐-기본 매트릭스(12)로 형성시키거나 이를 포함하여 형성시키는 데, 이의 직경 "D"는 수용체 혈관의 직경의 근사치이다. 이러한 방법 중의 한가지에 있어서, 이는 점막하조직의 관형 단편 또는 쉬트를 조작하여 수용체 혈관의 직경과 거의 동일한 직경 "D"를 갖는 실린더를 구획하고, 봉합하여, 길이 방향의 솔기(13)를 접착시키거나 달리 봉합하여 혈액 통과용 관강(14)을 갖는 적절한 치수의 관형 혈관 이식물을 형성시킴으로써 성취될 수 있다. 예시적인 제조 공정에서, 상기 이식물을 이식시킬 혈관의 직경과 거의 동일한 외경을 갖는 멸균 로드 또는 맨드렐 상에 형성시킨다. 예를 들면, 로드를 천연적 관형으로 유지되는 점막하조직 단편의 관강으로 도입시킨다. 이어서, 겹치는 조직을 접어 넣고, 이식물의 길이에 따라 봉합하거나(예를 들면, 2개의 연속 봉합선 또는 단순한 중단되는 봉합선을 사용함), 다른 기술-인지된 조직 봉합 기술을 사용하여 목적하는 관강 직경을 수득한다. 별법으로, 본 발명의 점막하조직의 쉬트를 로드에 감아 중첩되는 솔기를 형성시키는데, 이는 봉합, 풀칠 또는 달리 봉합하여 관형 이식 작제물을 제공한다. 바람직한 형태로, 이식물의 관강 내부면을 점막하조직의 점막면으로 형성시킬 수 있다.

본 발명의 점막하조직은 낮은 다공성 지수, 높은 컴플라이언스, 및 높은 파열 강도를 포함하여, 혈관에 사용되는 조직 이식물에 매우 바람직한 기계적 특성을 부여한다. 당해 분야의 숙련가들은 바람직한 조직 이식물은 수술 중의 출혈을 방지하기에 충분할 정도로 다공성이 낮으며 또한 이식물을 통하여 새롭게-발달한 맥관 형성이 확대될 수 있도록 하여 신생 동맥내막 및 관강 표면에 영양을 공급하기에 충분할 정도로 다공성이 높을 것으로 판단하고 있다.

본 발명의 점막하조직은 또한 예를 들면, 미국 특허 제5,275,826호에 기술된 바와 같은 기술을 사용하여 가공함으로써 유동성 조성물을 제공할 수 있다. 이와 관련하여, 점막하조직을 가용화시켜 실질적으로 균질한 용액을 형성시키기에 충분한 시간 동안 프로테아제(예를 들면, 트립신 또는 펩신)로 분쇄 및/또는 분해함으로써 점막하조직의 용액 또는 현탁액을 제조할 수 있다. 점막하조직 출발 물질은 찢거나, 절단하거나, 분쇄시키거나 전단변형시켜 분쇄하는 것이 바람직하다. 점막하조직의 현탁액을 고속 블렌더에서 처리하여 탈수시키고, 필요에 따라, 원심분리 및 과량의 폐액을 경사여과시켜 양호한 결과를 수득할 수 있지만, 동결된 상태 또는 동결-건조된 상태의 점막을 분쇄하는 것이 유리하다. 분쇄한 점막하조직은 건조(예를 들면, 동결 건조)시켜 분말을 형성시킬 수 있다. 이후, 경우에 따라, 상기 분말을 수화시킬 수 있는데, 즉 물 또는 완충 염수 및 임의로 다른 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합하여, 예를 들면 25 EC에서의 점도가 약 2 내지 약 300,000cps인 유체 조직 이식 조성물을 형성시킬 수 있다. 이식 조성물의 점도가 높을수록 균일한 겔 또는 페이스트를 가질 수 있다.

본 발명에 따르는 유동화된 점막하조직은 대부분 전형적으로 외상 또는 질병-유도된 조직 결함을 교정하기 위한 수복 또는 증량을 필요로하는 조직(예를 들면, 뼈 또는 연조직)에 대한 주사용 헤테로그라프트(Heterograft)로서 사용된다. 본 발명에 따르는 유동화된 점막하조직 조성물은 또한 예를 들면, 미용 또는 외상-치료 외과 시술에 사용하기 위한 밀봉된(봉합된) 파우치로 형성된 점막하조직 쉬트를 하나 이상 포함하는 이식물 작제물용 충전제로서 유리하게 사용된다.

한가지 예시적인 제조방법에 있어서, 본 명세서에 기술된 바와 같이 제조된 점막하조직을 작은 분획물로 나누어(예를 들면, 절단에 의해), 이를 바닥이 평평한 스테인레스 스틸 용기에 충전시킨다. 액체 질소를 용기에 도입시켜 표본을 동결시킨 다음, 이를 동결 상태에서 잘게 부수어 조악한 점막하조직 분말을 형성시킨다. 상기와 같은 가공은 예를 들면, 동결시킨 표본의 상부에 위치하는 원통형 청동 주괴가 장착된 수동식 아바 프레스(abar press)를 사용하여 수행할 수 있다. 주괴는 표본과 프레스의 아바 사이에서 계면으로서 작용한다. 액체 질소를 주기적으로 점막하조직 표본에 가하여 이를 동결 상태로 유지시킬 수 있다.

점막하조직 표본을 분쇄하는 또다른 방법을 사용하여 본 발명에 따라 사용할 수 있는 점막하조직 분말을 제조할 수 있다. 예를 들면, 점막하조직 표본을 동결-건조시킨 다음, 수동식 아바 프레스 또는 다른 분쇄 수단을 사용하여 분쇄시킬 수 있다. 별법으로, 점막하조직을 고전단 블렌더에서 가공하여, 탈수 및 건조시, 점막하조직을 수득할 수 있다.

또한, 미리 냉각시킨 모르타르 및 페스틀을 사용하는 점막하조직 분말 분쇄법을 사용하여, 균일하고 보다 미분된 생성물을 제조할 수 있다. 또한, 최종 분쇄 공정 동안, 고체 냉각된 입자를 유지시킬 필요가 있는 경우 액체 질소를 사용한다. 상기 분말은 예를 들면, 완충된 염수를 사용하여 용이하게 수화시켜 본 발명에 따르는 유동화된 조직 이식물을 목적하는 점도로 제조할 수 있다.

또다른 바람직한 유동화된 물질을 제조하기 위해, 점막하조직 분말을 와이어 메쉬를 통하여 시프트시켜 수집하고, 단백분해시켜 상당히 균질한 용액을 형성시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 분말을 1㎎/㎖의 펩신(제조원; Sigma Chemical Co., St. Louis Mo.) 및 0.1M 아세트산으로 분해시켜 실온에서 48시간에 걸쳐 HCl로 pH를 2.5로 조정한다. 이렇게 처리한 후, 반응 매질을 수산화나트륨으로 중화시켜 펩신 활성을 불활성화시킨다. 이어서, 가용화된 점막하조직을 용액의 염침에 의해 농축시키고, 더욱 정제시키기 위해 분리시키고/시키거나 동결 건조시켜 분말 형태의 프로테아제-가용화된 장의 점막하조직을 형성시킬 수 있다.

본 발명의 유동화된 점막하조직 조성물은 조직 대체, 증량 및/또는 수복에 있어서 광범위하게 사용된다. 본 발명의 유동화된 점막하조직 조성물을 사용하여, 존재하는 결함 영역에서 결합조직 또는 뼈의 재성장을 자연스럽게 유도시킬 수 있다. 유효량의 유동화된 점막하조직 조성물을 조직 결함 또는 치료를 필요로하는 부상 부위에 주사함으로써, 점막하조직의 바이오트로픽 특성의 잇점을 용이하게 사용할 수 있다.

예를 들면, 미국 특허 제2,127,903호 및/또는 1996년 4월 5일자로 출원된 제PCT/US96/04271호의 1996년 10월 17일자로 공개된 국제 공개특허공보 제WO96/32146호에 기술된 바와 같은 기법을 이용하여, 본 발명의 점막하조직 단편을 2개 이상 합하여 표면적이 큰 작제물을 형성시킬 수 있다. 따라서, 다수의 점막하조직 스트립을 예를 들면, 탈수 조건하에서 스트립의 중첩 면적을 압축시킴으로써 서로 융합하여, 작제물을 형성시키는데 사용되는 각각의 스트립의 평면 면적보다 표면적이 더 크고 전체적으로 평면인 작제물을 형성시킬 수 있다.

본 발명의 점막하조직을 사용하여 정형외과적 연조직 용도(예를 들면, 다른 천연 또는 합성 이식물에 대해 사용되는 당해 분야의 기술을 이용하는, 건 또는 인대 수복)에 유용한 조직 이식 작제물을 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 점막하조직을 사용하여 미국 특허 제2,127,903호 및 제5,281,422호에 일반적으로 기술된 바와 같은 수복 기술을 수행할 수 있다.

건 및 인대 대체용으로 사용하는 경우, 점막하조직의 단편을 신장할 수 있는 길이까지 횡방향으로 신장시켜 예비컨디셔닝시킬 수 있다. 예를 들면, 조직 단편이 약 10% 내지 약 20% 신장되기에 충분한 시간 동안 점막하조직 단편을 단편의 횡축상에 연장된 부하에 의해(예를 들면, 단편으로부터 중량을 부하함으로써) 컨디셔닝시킬 수 있다. 이식물을 또한 측면 치수로 신장시켜 예비컨디셔닝시킬 수 있다. 이어서, 점막하조직 단편은 단독으로 또는 다른 단편과 함께 각종 형태로 배열되어 인대 또는 건 대체물로서 작용하거나, 파괴되거나 절단된 건 또는 인대용 대체물 또는 패치로서 작용할 수 있다.

상기와 같은 결합조직 이식물용으로 사용되는 경우, 단편이 뼈, 건, 인대, 연골 및 근육과 같은 생리학적 구조물에 대한 접착을 강화시키기 위해 적어도 반대 말단부 및/또는 반대 측면부에 다층 이식물을 갖는, 적층되거나 다층 배열을 갖도록 배열하는 것이 바람직하다. 인대 대체용으로 사용하는 경우, 반대 말단은 각각 제1 및 제2 뼈에 접착하고, 뼈는 전형적으로 무릎 관절인 경우에서와 같이 관절로 이어진다. 건 대체용으로 사용되는 경우, 이식 작제물의 제1 말단은 뼈에 접착되고, 제2 말단은 근육에 접착된다.

상기에 나타낸 바와 같이, 결합 조직용으로 사용하는 경우에 있어서, 예를 들면, 뼈 구조에 접착시킬 이식 작제물의 말단부를, 접착점에서의 이식 파열 가능성을 감소시키는 방식으로 형성, 조작 또는 성형시키는 것이 유리하다. 이러한 목적을 위해, 점막하조직 이식물을 겹치거나 부분적으로 뒤집어, 예를 들면 스파이크된 워셔 또는 스테이플로 그리핑시키기 위한 다층을 제공할 수 있다. 별법으로, 점막하조직 단편을 자체적으로 뒤로 접어 말단부를 연결하여 예를 들어, 제1 뼈에 부착시킬 제1 결합부와 제1 뼈에 대해 관절로 연결된 제2 뼈에 부착시킬 제2 결합부를 제공하기 위한 중간 영역에서의 굴곡을 제공할 수 있다.

예를 들면, 점막하조직 이식물의 말단부 중의 하나를 예를 들면, 대퇴부에 터널을 통하여 밀어넣어 이에 부칙시킬 수 있는 반면, 말단부의 다른 하나는 경골에 터널을 통하여 밀어넣어 이에 부착시켜 천연 십자형 인대용 대체물을 제공할 수 있으며, 상기 단편을 터널간의 장력하에 배치시켜 인대 기능, 즉, 정상적인 인대에 의해 제공되는 장력 및 위치 기능을 제공한다.

정형외과용으로 사용되는 이식물은 전형적으로 이들의 외과적 장착시 장력하에 놓이게 되기 때문에, 2개 이상의 조직 단편을 합하여 다발성(다층) 이식 작제물을 제공하는 것이 바람직하다. 따라서, 2개 이상의 점막하조직 단편이 이들의 말단부가 결합된 말단부 및/또는 뼈, 건, 인대 또는 다른 생리학적 구조물에 부착되는 측면부와 함께 연결되도록 배열한 이식물을 제공하는 것이 본 발명의 다른 목적이다. 이중 단편을 제공하는 방법 중의 하나는 다른 단편내에 내부적으로 관형 단편을 밀어넣어 예를 들면, 뼈, 건 또는 인대에 부착될 수 있는, 이중벽 관형의, 연결된 말단부를 제공할 수 있다. 이러한 이중 단편은 향상된 인장 강도 및 장력하 에서의 신장에 대한 점막하조직력을 제공한다. 다른 형태로, 다중 점막하조직 단편 또는 스트립을 머리를 땋은 배열로, 예를들면, 다이아몬드 또는 장식띠 방식으로 꼰 배위로, 또는 이웃하는 루프와 서로 커플링된 다중 로프를 포함한 그믈망 구조로 배열할 수 있으며, 이는 인대 또는 건 수복에 유용하게 제공된다.

본 발명의 점막하조직은 또한 체내의 골절된 뼈 조직을 함께 적절한 배열로 유지시키기 위한 결합조직으로서 사용하기위한 정형외과용 이식물을 제공하는데 사용할 수 있으며, 형성된 조직 단편을 골절된 뼈의 단편에 대해 골절 랩(fracture wrap)으로 작용하여 뼈에 부착된다.

또다른 정형외과적 용도에 있어서, 본 발명의 점막하조직은 골 조직을, 예를 들면 미국 특허 제5,641,518호에 기술된 일반적인 기술을 이용하여 수복하는데 사용할 수 있다. 따라서, 수복을 위해, 분말 형태의 점막하조직을 손상되거나 질병에 걸린 뼈 영역에 이식할 수 있다. 점막하조직 분말은 단독으로 사용하거나, 생리학적으로 적합한 무기물, 성장 인자, 항생제, 화학치료제, 항원, 항체, 효소 및 호르몬과 같은 하나 이상의 추가적인 생체활성 제제와 배합하여 사용할 수 있다. 분말 형태의 이식물은 예비설정된 3차원 형태로 압축시키는 것이 바람직하며, 이는 뼈 영역에 이식된 후, 이식물을 내인성 조직으로 대체시키는 동안 이의 형태를 실질적으로 유지한다.

본 발명의 점막하조직은 세포, 예를 들면, 내피, 섬유아세포, 태아 피부, 골육종, 및 선암 세포와 같은 진핵 세포의 성장을 보조하는 영양물과 함께 세포 성장 물질(예를 들면, 쉬트, 페이스트 또는 겔 형태)로서 사용될 수 있다(참조: 1996년 2월 9일자로 출원된 제PCT/US96/01842호로서 1996년 8월 15일자로 공개된 국제 특허 공보 제WO96/24661호). 바람직한 형태로, 점막하조직 물질 조성물은 사람 세포를 포함한 포유동물 세포의 증식 및/또는 분화에 조력한다.

본 발명의 점막하조직은 또한 형질전환된 세포를 생산하기 위한 조성물 중의 콜라겐성 매트릭스로서 작용할 수 있다(문헌 참조: 1996년 2월 9일자로 출원된 제PCT/US96/01842호로서 1996년 8월 15일자로 공개된 국제 공개특허공보 제WO96/24661호; 및 1995년 2월 21일자로 출원된 제PCT/US95/02251호로서 1995년 8월 24일자로 공개된 국제 공개특허공보 제WO95/22611호). 세포를 형질전환시키기 위한 조성물은 일반적으로 예를 들면, 유동화된 형태 또는 페이스트 형태의 본 발명에 따르는 정제된 점막하조직을 시험관내 또는 생체내에서 표적 세포를 유전적으로 형질전환시키는 핵산 서열을 함유하는 재조합 벡터(예를 들면, 플라스미드)와 함께 포함한다. 형질전환용으로 표적된 세포의 예로는 골 자손 세포(bone pregenitor cell)가 포함될 수 있다.

본 발명의 점막하조직은 또한 문헌(참조: Ann. Plast. Surg., 1995, 35:374-380; 및 J. Surg. Res., 1996, 60:107-114)에 기술된 바과 유사한 기술을 이용하여, 예를 들면, 헤르니아와 같은 복부 벽 결함의 수복을 포함한, 체벽 수복에 사용될 수 있다. 상기와 같은 용도에 있어서, 본 발명의 바람직한 점막하조직 이식물을 재형성되는 조직에서 조직화, 혈관형성 및 조도를 유리하게 향상시킨다. 피부학적 용도에 있어서, 본 발명의 점막하조직을 부분적이거나 완전한 부상 부위의 두께 수복 및 당해 기술분야 및 문헌(참조: Annals of Plastic Surgery 1995, 35:381-388)에 공지된 일반적인 이식 기술을 사용하는 피부 증량에 사용될 수 있다. 또한, 화상 치료 분야에서, 배양시킨 표피 이식물(바람직하게는, 배양시킨 표피의 자가이식물, 즉 CEA)이 이식되어 있는 피부 대체물을 제공하는 것이 일반적으로 공지되어 있다. 상기와 같은 배양시킨 이식물은 통상적으로 피부 대체물에 케라틴구 및/또는 섬유아세포를 이식시킴을 포함한다. 본 발명에 따르면, 정제된 점막하조직을 예를 들면, 쉬트 형태의 피부 대체물로서 사용할 수 있기 때문에 CEA를 점막하조직에 이식시킬 수 있다. 본 발명의 상기 양태를 실시하는 방식 중의 한가지에 있어서, 케라틴구 쉬트를 접종 또는 이동시킴으로써 케라틴구를 점막하조직의 점막면에 이식할 수 있다. 섬유아세포도 점막하조직의 점막 및/또는 반대(알부민성)면에 이식할 수 있다.

본 발명의 점막하조직은 또한 비뇨생식 용도로 조직 이식에 사용할 수 있다. 예를 들면, 점막하조직을 방광 수복에 사용하여, 문헌(미국 특허 제5,645,860호; Urology, 1995, 46:396-400; 및 J. Urology, 1996, 155:2098)에 일반적으로 기술된 바와 상응하는 기술을 사용하여, 방광 재생용 골격을 제공할 수 있다. 유동화 형태에서, 본 발명의 점막하조직은 또한 방광 환류를 교정하기 위한 내시경 주사 공정에서 사용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 상기와 같은 용도에 있어서, 예를 들면 환자의 자궁 분문 하부 영역에 점막하 주사하여 주사 부위에서 평활근 성장과 콜라겐 형성을 유도시킬 수 있다.

다른 영역에서, 본 발명의 점막하조직으로 형성시킨 조직 이식 작제물을 신경학적 용도, 예를 들면, 외상, 종양 절개, 또는 감압성 공정으로 인한 결함부를 수복하기 위해 내구성 대체물을 필요로하는 기술에서 사용할 수 있다.

본 발명 및 이의 특징 및 잇점의 이해를 증진시키기 위해, 하기의 구체적인 실시예를 제공한다. 이러한 구체적인 실시예는 설명을 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것이 아님을 이해하여야 한다.

실시예 1

성숙한 돼지로부터 전체 장 중의 30피트를 물로 세정한다. 그후, 상기 물질을 5 용적%의 에탄올 수용액 중의 0.2용적%의 퍼아세트산으로 2시간 동안 교반하면서 처리한다. 이어서, 살균된 주조기에서 점막하조직을 전체 장으로부터 분리시킨다. 분리된 점막하조직을 멸균수로 4회 세정하여 내독소, 미생물 및 피로겐과 같은 불순물 또는 오염물질에 대해 시험한다. 생성된 조직은 바이오버든량이 필수적으로 제로인 것으로 밝혀졌다. 점막하조직층은 전체 장으로부터 용이하고 균일하게 분리되며 이의 표면에는 최소한의 조직 파괴물이 존재하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 2

돼지의 전체 장 분획 중의 10피트를 물로 세정한다. 세정한 후, 상기 분획 점막하조직 장 콜라겐 공급 물질을 약 2.5시간 동안 5용적%의 에탄올 수용액 중의 0.2% 퍼아세트산으로 교반하면서 처리한다. 퍼아세트산으로 처리한 후, 전체 장으로부터 점막하조직층을 분리시킨다. 이어서, 생성된 점막하조직을 멸균수로 4회 세정한다. 바이오버든은 필수적으로 제로인 것으로 밝혀졌다.

실시예 3

점막하조직 장 콜라겐 물질의 작은 분획을 래트의 근육하에 이식시킨다. 72시간내에, 확실한 맥관형성이 관찰된다.

실시예 4

소장의 분획 2개를 상이한 방법으로 가공한다. 첫번째 분획은 수돗물로 세정하여 pH가 대략 2.6인 퍼아세트산 0.2용적%를 포함하는 5용적% 에탄올 수용액에서 2시간 동안 살균시켜, 점막하조직을 분리시키고, 정제수로 세정하여 2가지 샘플로 나누어 신속하게 동결시킨다. 두번째 분획은 수돗물로 세정하여 점막하조직으로 분리시킨 다음 정제수로 세정하여, 10% 네오마이신 황산염 용액 중에서 20분간 방치시키고(미국 특허 제4,902,508호에 기술된 바와 같음), 정제수로 세정하여 2가지 샘플로 나누어 신속하게 동결시킨다. 이렇게 하여 제조된 4가지 샘플을 바이오버든 및 내독소량에 대해 시험한다. 첫번째의 2가지 샘플에서 바이오버든량은 0.1 CFU/g 미만이고 내독소량은 0.1 EU/g 미만이었다. 두번째의 2가지 샘플에서 각각의 바이오버든량은 1.7 CFU/g 및 2.7 CFU/g이고 각각의 내독소량은 23.9 EU/g 및 15.7 EU/g이었다.

실시예 5

소장 분획 3개를 상이한 방법으로 가공한다. 첫번째 분획은 수돗물로 세정 하고, pH가 약 2.6인 퍼아세트산 0.2용적%를 포함하는 5용적% 에탄올 수용액 중에서 2시간 동안 살균시켜 점막하조직을 분리시킨 다음, 정제수로 세정하여 신속하게 동결시킨다. 두번째 분획은 수돗물로 세정하여 점막하조직을 분리시킨 다음, 정제수로 세정하고, 미국 특허 제5,460,962호의 실시예 1의 방법(pH 7.2로 완충시킨 0.1용적%의 퍼아세트산 수용액에서 40시간 동안 처리함)에 따라 살균시켜 신속하게 동결시킨다. 세번째 분획은 수돗물로 세정하여 점막하조직을 분리시키고, 정제수로 세정한 다음, 미국 특허 제5,460,962호의 실시예 2의 방법(pH 7.2로 완충시킨 고 염용액 중의 0.1용적%의 퍼아세트산에서 처리함)에 따라 살균시켜, 신속하게 동결시킨다. 3가지 샘플 모두에서 내독소를 시험한다. 내독소량은 첫번째 샘플의 경우 < 0.14 EU/g이고, 두번째 샘플의 경우 > 24 EU/g이며, 세번째 샘플의 경우 > 28 EU/g이었다.

실시예 6

돼지의 소장 분획 2개를 7×10⁶ 플라크 형성 단위 (PFU)의 바이러스로 감염시킨다. 용액 대 물질의 중량비가 9:1이 되도록, 2개의 분획 둘다를 0.18% 퍼아세트산, 4.8% 에탄올 수용액에 노출시킨다. 첫번째 샘플은 상기 용액에 5분간 침지시키고, 두번째 샘플은 2시간 동안 침지시킨다. 5분간 처리한 물질은 물질 1g당 400 PFU를 나타냈다. 2시간 동안 처리한 물질의 PFU는 물질 1g당 제로인 것으로 나타냈다.

실시예 7

본 명세서에 기술된 바와 같이 제조한, 정제된 점막하조직에서 이의 핵산 함량을 측정하기 위해 시험한다. 중량이 각각 5㎎인 샘플 4가지를 DNA/RNA 단리 키트(제조원; Amersham Lifescience Inc., Arlington Heights, Illinoes)를 사용하여 DNA/RNA를 추출한다. 260nm 및 280nm에서 용액의 광학 밀도를 분광광도법으로 측정하여 핵산을 정량한다. 평균 핵산 함량은 물질 1㎎당 1.9±0.2㎍이었다.

미국 특허 제4,902,508호에 기술된 바와 같이 제조한 소장 점막하조직에서 이의 핵산 함량을 측정하기 위해 시험한다. 중량이 각각 5㎎인 샘플 4가지를 DNA/RNA 단리 키트(제조원; Amersham)를 사용하여 DNA/RNA를 추출한다. 260nm 및 280nm에서 용액의 광학 밀도를 분광광도법으로 측정하여 핵산을 정량한다. 평균 핵산 함량은 물질 1㎎당 2.4±0.2㎍이었다.

실시예 8

본 명세서에 기술된 방법에 따라 제조한 점막하조직 분획을 표준 ISO 10993에 기술된 바와 같은 생체적합성 시험을 위한 독립적인 실험실(NamSA, Inc., Northwood, Ohio)로 보냈다. 샘플을 USP 급성 전신독성(Acute Systemic Toxicity), USP 피내 독성(Intracutaneous Toxicity), 세포독성, LAL 내독소, 물질-매개된 피로겐유발성(material-mediated Pyrogenicity), 직접 접촉성 용혈(Direct Contact Hemolysis) 및 1급 피부 자극(Primary Skin Irritation)에 대해 시험하였다. 샘플이 모든 시험을 통과하였으며, 이는 상기 물질이 생체적합성 임을 나타내는 것이다.

상기한 가공 공정의 변형시키더라도 본 발명의 범주 내에 포함됨을 인지하여야 한다. 예를 들면, 점막하조직의 공급 조직(예를 들면, 위, 전체 장, 소의 자궁 등)을 부분적으로 분리하여 살균제 또는 멸균제로 처리한 다음, 점막하조직을 완전히 분리시킬 수 있다. 설명한다면, 전체 장의 부착된 장간막 및/또는 장막을 살균제로 처리하기 전에 제거한 다음 점막하조직으로부터 나머지 부착된 조직을 분리시키는 것이 유리할 수 있다. 이러한 단계에 이어서 추가적인 살균 단계, 예를 들면, 효소 정제 및/또는 핵산 제거 단계를 수행하거나 수행하지 않을 수 있다. 별법으로, 점막하조직 공급원을 살균제 또는 기타 제제로 최소한으로 처리하여, 피막 근육 및 피막 점막으로부터 점막하조직을 분리시킨 다음, 목적하는 오염물질량이 성취되도록 완전히 살균처리한다. 상기와 같은 모든 변형 및 개질은 본 명세서에 기술된 공정의 일부이며 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 고려된다.

또한, 본 명세서에서 인용된 특허 공보는 관련 분야의 숙련가가 지닌 기술의 지표이며, 이러한 특허 공보는 마치 참고로 인용되어 충분히 기술되어 있는 것처럼 각각 본 명세서에서 전문이 참고로 인용되어 있다.

Claims

인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원으로부터 분리되는 정제된 콜라겐-매트릭스 구조물로서, 오염도가 ISO 표준 제10993호에 설정되어 있는 생체적합성 시험을 통과할 수 있는 정도의 생체적합성을 갖는 정제된 콜라겐-매트릭스 구조물을 포함하는 조직이식기관.
제1항에 있어서, 정제된 구조물의 내독소량이 12 내독소 단위/g 미만인 조직이식기관.
제2항에 있어서, 내독소량이 10 내독소 단위/g 미만인 조직이식기관.
제3항에 있어서, 내독소량이 5 내독소 단위/g 미만인 조직이식기관.
제4항에 있어서, 내독소량이 1 내독소 단위/g 미만인 조직이식기관.
제1항에 있어서, 정제된 구조물의 바이오버든량이 2 콜로니 형성 단위/g 미만인 조직이식기관.
제6항에 있어서, 바이오버든량이 1 콜로니 형성 단위/g 미만이고, 내독소량이 0.5 내독소 단위/g 미만인 조직이식기관.
제7항에 있어서, 바이오버든량이 0.5 콜로니 형성 단위/g 미만인 조직이식기관.
제1항에 있어서, 정제된 구조물의 핵산 함량이 10㎍/㎎ 미만인 조직이식기관.
제9항에 있어서, 핵산 함량이 2㎍/㎎ 미만인 조직이식기관.
제1항에 있어서, 정제된 구조물의 바이러스량이 500 플라크 형성 단위/g 미만인 조직이식기관.
제11항에 있어서, 바이러스량이 100 플라크 형성 단위/g 미만인 조직이식기관.
제12항에 있어서, 바이러스량이 1 플라크 형성 단위/g 미만인 조직이식기관.
제1항에 있어서, 정제된 구조물 중의 가공보조제의 양이 100,000ppm/㎏ 미만인 조직이식기관.
제14항에 있어서, 가공보조제의 양이 1,000ppm/㎏ 미만인 조직이식기관.
제15항에 있어서, 가공보조제의 양이 100ppm/㎏ 미만인 조직이식기관.
제1항에 있어서, 정제된 구조물의 진균량이 2 콜로니 형성 단위/g 미만인 조직이식기관.
제17항에 있어서, 진균량이 1 콜로니 형성 단위/g 미만인 조직이식기관.
제18항에 있어서, 진균량이 0.5 콜로니 형성 단위/g 미만인 조직이식기관.
제1항에 있어서, 정제된 구조물이 인간을 제외한 동물의 탈층화된 점막하조직을 포함하는 조직이식기관.
제1항에 있어서, 정제된 구조물이 인간을 제외한 동물의 살균되고 탈층화된 점막하조직을 포함하는 조직이식기관.
제1항에 있어서, 정제된 구조물이 인간을 제외한 동물의 살균된 후 탈층화된 점막하조직을 포함하는 조직이식기관.
내독소량이 12 내독소 단위/g 미만인, 인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원으로부터 분리한 정제된 콜라겐 매트릭스 구조물을 포함하는 조직이식기관.
핵산 함량이 2㎍/㎎ 미만이고 내독소량이 12 내독소 단위/g 미만인, 인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원으로부터 분리한 정제된 콜라겐 매트릭스 구조물을 포함하는 조직이식기관.
바이러스량이 500 플라크 형성 단위/g 미만이고 내독소량이 12 내독소 단위/g 미만인, 인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원으로부터 분리한 정제된 콜라겐 매트릭스 구조물을 포함하는 조직이식기관.
가공보조제량이 100,000ppm/㎏ 미만이고 내독소량이 12 내독소 단위/g 미만인, 인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원으로부터 분리한 정제된 콜라겐 매트릭스 구조물을 포함하는 조직이식기관.
인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원을 살균제로 처리하여 살균된 점막하조직 공급원을 제공하는 단계 및

살균된 점막하조직 공급원으로부터 콜라겐 매트릭스를 회수하는 단계를 포함하여, 인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원으로부터 콜라겐 매트릭스를 수득하는 방법.
제27항에 있어서, 인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원이 인간을 제외한 포유동물의 소화관으로부터 유래되는 방법.
제28항에 있어서, 인간을 제외한 포유동물이 돼지인 방법.
제29항에 있어서, 인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원이 돼지의 소장으로부터 유래되는 방법.
제27항에 있어서, 살균제가 산화제인 방법.
제27항에 있어서, 살균제가 퍼옥시 화합물인 방법.
제32항에 있어서, 살균제가 유기 퍼옥시 화합물인 방법.
제33항에 있어서, 살균제가 과산인 방법.
제34항에 있어서, 과산이 퍼아세트산, 퍼프로피온산 및 퍼벤조산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제35항에 있어서, 과산이 퍼아세트산인 방법.
제34항에 있어서, 인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원 처리 단계가 인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원을 알코올 및 과산을 함유하는 매질로 처리함을 포함하는 방법.
제37항에 있어서, 알코올의 탄소수가 1 내지 6인 방법.
제38항에 있어서, 알코올이 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제39항에 있어서, 알코올이 에탄올인 방법.
제40항에 있어서, 매질이 퍼아세트산을 0.1 내지 0.3 용적% 함유하는 에탄올 수용액인 방법.
제34항에 있어서, 인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원 처리 단계가 인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원을, 과산을 함유하며 pH가 2 내지 6인 매질로 처리함을 포함하는 방법.
제42항에 있어서, 매질의 pH가 2 내지 4인 방법.
제43항에 있어서, 과산이 퍼아세트산이고, 매질이 퍼아세트산을 0.1 내지 0.3 용적% 함유하는 방법.
살균제로 처리한, 인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원을 제공하는 단계 및

점막하조직 공급원으로부터 콜라겐 매트릭스를 회수하는 단계를 포함하여,

인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원으로부터 콜라겐 매트릭스를 수득하는 방법.
제45항에 있어서, 인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원이 소장으로부터 유래되는 방법.
제46항에 있어서, 살균 처리 단계가 인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원을 산화제로 처리함을 포함하는 방법.
제47항에 있어서, 살균 처리 단계가 인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원을, 산화제를 함유하는 수성 매질과 접촉시킴을 포함하는 방법.
제47항에 있어서, 살균 처리 단계가 인간을 제외한 동물의 점막하조직 공급원을, 퍼옥시 화합물을 함유하는 수성 매질과 접촉시킴을 포함하는 방법.
제49항에 있어서, 퍼옥시 화합물이 과산인 방법.
제50항에 있어서, 과산이 퍼아세트산인 방법.
제51항에 있어서, 매질이 알코올을 포함하는 방법.
제52항에 있어서, 알코올이 에탄올인 방법.
제51항에 있어서, 소장이 돼지로부터 유래되는 방법.
인간을 제외한 동물의 조직 공급원으로부터 분리되며 콜라겐-함유 구조물과 기타 조직을 처음부터 함유하는 콜라겐-함유 구조물로서, 내독소량이 12 내독소 단위/g미만인 콜라겐-함유 구조물을 포함하는 조성물.
제55항에 있어서, 콜라겐-함유 구조물이 인간을 제외한 동물의 조직 공급원으로부터 분리한 점막하조직을 포함하며, 상기 조직 공급원이 소장인 조성물.
제56항에 있어서, 인간을 제외한 동물의 조직 공급원이 돼지의 소장을 포함하는 조성물.
제55항에 있어서, 내독소량이 10 내독소 단위/g 미만인 조성물.
제58항에 있어서, 내독소량이 5 내독소 단위/g 미만인 조성물.
제50항에 있어서, 내독소량이 1 내독소 단위/g 미만인 조성물.
제60항에 있어서, 내독소량이 0.5 내독소 단위/g 미만인 조성물.
인간을 제외한 포유동물의 조직 공급원으로부터 잔류하는 오염물질과 인간을 제외한 포유동물의 점막하조직을 포함하는 것으로, 인간을 제외한 포유동물 조직 공급원을 살균한 다음 살균된 포유동물의 조직 공급원으로부터 회수하는 것을 포함하는 방법으로 수득할 수 있는, 인간을 제외한 포유동물의 조직 공급원으로부터 수득한 정제된 콜라겐-함유 매트릭스 구조물.
제62항에 있어서, 인간을 제외한 포유동물 조직 공급원의 살균 단계가 인간을 제외한 포유동물의 조직 공급원을, 과산을 함유하는 수용액과 접촉시킴을 포함하는 콜라겐-함유 매트릭스 구조물.
제63항에 있어서, 과산이 퍼아세트산인 콜라겐-함유 매트릭스 구조물.