DE69720252T2 - Gewebetransplantat aus der magensubmukosa - Google Patents

Description

Gebiet der Erfindung
• Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung eines Gewebetransplantates und Methoden für dessen Herstellung. Vor allem bezieht sich die vorliegende Erfindung auf nicht-immunogene Gewebetransplantatzusammensetzungen enthaltend Magensubmucosa und die Verwendung von derselben, um endogenes Gewebewachstum zu fördern.
Hintergrund und Zusammenfassung der Erfindung
• Es ist bekannt, dass Zusammensetzungen, die die Tunica submucosa des Darms von warmblütigen Wirbeltieren enthalten, vorteilhaft als Gewebetransplantatmaterialien benutzt werden können. Siehe dazu U.S. Patent Nr. 4.902.508 und 5.281.422. Die in diesen Patenten beschriebenen Gewebetransplantatzusammensetzungen sind charakterisiert durch hervorragende mechanische Eigenschaften einschließlich einem hohen Berstdruck und einem effektiven Porositätsindex, was solchen Zusammensetzungen erlaubt, gewinnbringend als Gefäßtransplantat- und Bindegewebstransplantatkonstrukte benutzt zu werden. Bei Verwendung in dieserlei Anwendungen treten die Transplantatkonstrukte nicht nur auf, um als eine Matrix für die Wiederbildung der durch die Transplantatkonstrukte ersetzten Gewebe zu dienen, sondern veranlasst und ruft in der Tat solch eine Wiederbildung von endogenem Gewebe hervor. Gemeinsame Ereignisse zu diesem Neugestaltungsprozess enthalten: weitverbreitete und sehr schnelle Neovaskularisation, Vermehrung von mesenchymalen Wucherungszellen, Bioabbau/Resorption von implantiertem submucosalen Darmgewebematerial und Mangel an immunologischer Abstoßung.
• Ebenfalls ist bekannt, dass die Darmsubmucosa durch Zerkleinerung und/oder enzymatischem Verdau ohne einen Verlust von deren offensichtlichen biotropischen Eigenschaften zur Nutzung in weniger invasiven Verabreichungsmethoden (z. B. durch Injektion oder topische Anwendung) zu Wirtsgeweben bei Bedarf der Wiederherstellung fluidisiert werden kann. Siehe U.S. Patent Nr. 5.275.826.
• Es wurde viel ergänzende Untersuchungsarbeit geleistet, um andere natürliche oder synthetische Materialien mit diesen erforderlichen Eigenschaften zur Verwendung als Gewebetransplantat zu finden. Überraschenderweise wurde gefunden, dass Magensubmucosa, die durch die Ablösung des Magengewebes von warmblütigen Wirbeltieren hergestellt wurde, ähnliche mechanische und biotropische Eigenschaften zu denen aufweist, welche über submucosales Darmgewebe berichtet wurden. Auch kann es in den meisten, wenn nicht gar in allen Anwendungen, welche zuvor für die Darmsubmucosa angeführt wurden, ersatzweise für Darmsubmucosagewebe eingesetzt werden.
• Die Zusammensetzung des Gewebetransplantates dieser Erfindung beinhaltet vom Magengewebe eines warmblütigen Wirbeltieres erhaltene Magensubmucosa. Die Magenwand ist zusammengesetzt aus folgenden Schichten: Tunica mucosa (einschließlich einer Epitheliumschicht, einer Tunica propria Schicht, die aus netzartigem oder feinem areolaren Gewebe besteht, und einer Drüsenchicht), der Tunica submucosa Schicht (bestehend aus der areolaren Schicht und fehlenden Drüsen), der Tunica muscularis Schicht (bestehend aus drei Muskelschichten) und der Serosa (einer Schicht aus Mesothelium außerhalb des losen Bindegewebes, welches an die Muskelschichten angelegt ist). Blutgefäße, lymphatisches Gewebe und neurologisches Gewebe durchdringen ebenfalls die Magengewebe, einschließlich der Tunica submucosa.
• Magensubmucosalgewebe in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung enthält vom Drüsenteil der Tunica mucosa und den glatten Muskelschichten des Muscularis externa delaminierte Magensubmucosa. Es wurde nachgewiesen, dass die Zusammensetzung die Fähigkeit hat, die Neugestaltung von Bindegewebe und Wundheilung in einer Art und Weise sehr ähnlich der Darmsubmucosa - wie beschrieben in U.S. Patent Nr. 5.275.826 - zu induzieren. Speziell die Zusammensetzung der Magensubmucosa begründet Zellvermehrung in vitro, unterstützt Zellwachstum bei Benutzung als ein Wachstumsträgermaterial und ruft die Bildung und die Reparatur von Bindegewebsstrukturen wie die Achillessehne bei Platzierung in xenogenen Wirtsspezies hervor. Die Magensubmucosa tritt nicht-antigenetisch zu Tage und ruft Reaktionen in vivo hervor, die als anerkannte Komponenten der Wundheilung, wie Neovascularisation, das zelluläre Eindringen, die Ablagerung von extrazellulärer Matrix und letztendlich Abbau und Ersatz des implantierten Materials mit Wirtsgewebe, gelten. Die vorliegende Transplantatzusammensetzung kann in einem Wirbeltierwirt implantiert oder injiziert werden, um die Reparatur oder den Austausch von beschädigtem oder defektem Gewebe hervorzurufen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
• Die Transplantatgewebezusammensetzung in Übereinstimmung mit der Erfindung umfasst die Magensubmucosa eines warmblütigen Wirbeltieres, die von benachbarten Magengewebeschichten delaminiert ist. Auf diese Weise beinhaltet die vorliegende Transplantatgewebezusammensetzung die Magensubmucosa, die von den glatten Muskelschichtender Muscularis externa und wenigstens dem luninalen Teil der Mucosalschicht eines Magensegmentes eines warmblütigen Wirbeltieres delaminiert ist. In einem Ausführungsbeispiel beinhalten die Zusammensetzungen des Magensubmucosalgewebes die Tunica submucosa und basilare Teile der Tunica mucosa des Magens eines warmblütigen Wirbeltieres. Typischerweise stellt die unten beschriebene Delaminationstechnik eine Gewebezusammensetzung bereit, die im Wesentlichen aus der Magensubmucosa besteht. Jene Zusammensetzungen werden hier im allgemeinen als submucosales Magengewebe in Bezug genommen.
• Der Glycosaminoglycan(GAG)-Gehalt der Magensubmucosa wurde analysiert. Die Typen des GAG, die in der Magensubmucosa identifiziert wurden, beinhalten Heparin, Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat B und Hyaluronsäure. Im Gegensatz zur Darmsubmucosa, wurde in der Magensubmucosa kein Heparansulfat gefunden.
• Der in einer Probe der Magensubmucosa vorliegende Wassergehalt variiert abhängig von den Bearbeitungsschritten, die nach der Gewebsdelamination angewendet wurden. Gemäß einer Prozedur wurde das Material zur eigenen "Entwässerung" für zehn Minuten auf eine feste Oberfläche gesetzt. Das Materialgewicht wurde anschließend bestimmt und das Material wurde einer mechanischen Wringmaschine zur Entfernung weiteren Wasserüberschusses vor dem Einfrieren und dem Lyophilisieren unterzogen. Wiederholte Messungen an zwei getrennten Proben zeigten einen Wassergehalt, der im Bereich von ungefähr 80% bis ungefähr 94% lag. Die Höhe der Variabilität ergibt sich zweifellos aus der Veränderlichkeit der Bestimmung des anfänglichen "Nassgewichtes". Immerhin bleibt sicher festzustellen, dass der Wassergehalt der Magensubmucosa zwischen 80% und 95% liegt.
• Die Zusammensetzung der Magensubmucosa dieser Erfindung ist typischerweise hergestellt aus dem Magengewebe, welches wiederum von Tieren abgetrennt wurde, die für die Fleischproduktion herangezüchtet worden waren, einschließlich beispielsweise Schweine, Rinder und Schafe oder andere warmblütige Wirbeltiere. Dieses Gewebe ist normalerweise ein verworfenes Nebenprodukt der Fleischproduktion. Auf diese Weise ergibt sich eine kostengünstige kommerzielle Quelle des Magengewebes für die Verwendung bei der Herstellung der Gewebezusammensetzungen im Zusammenhang mit dieser Erfindung.
• Die Herstellung der Magensubmucosa aus einem Magensegment ist ähnlich der Prozedur zur Herstellung der Darmsubmucosa, dargelegt im U.S. Patent Nr. 4.902.508, dessen Offenbarung hierin ausdrücklich als Referenz eingeschlossen ist. Ein Segment des Magengewebes wurde zunächst einer Abtragung mit Hilfe einer longitudinalen Wischbewegung zur Entfernung äußerer Schichten (insbesondere der glatten Muskelschichten) und der luminalen Teile der Tunica mucosa Schichten unterworfen. Das erhaltene Submucosagewebe weist eine Stärke von ungefähr 100 bis ungefähr 200 Mikrometern auf und besteht vornehmlich (zu mehr als 98%) aus azellularem, eosinophilisch anfärbenden(H&E Staining) extrazellulärem Matrixmaterial. Gelegentlich sind Blutgefäße und Spindelzellen übereinstimmend mit Fibrozyten zufällig über das Gewebe verstreut. Typischerweise ist die Submucosa für annähernd zwei Stunden mit Wasser ausgespült und wahlweise in einem gefrorenen hydratisierten Zustand gelagert worden, bis zur unten beschriebenen Benutzung. Delamination der Tunica Submucosa von sowohl dem Muscularis externa als auch wenigstens den luminalen Teilen der Tunica mucosa Schichten und Spülung der Submucosa stellt eine azelluläre magensubmucosale Gewebematrix bereit.
• Fluidisierte Magensubmucosa kann nach einer Methode hergestellt werden, ähnlich der Präparation von fluidisierter Darmsubmucosa, wie beschrieben in U.S. Patent Nr. 5.275.826, dessen Offenbarung hierin ausdrücklich als Referenz eingeschlossen ist. Das Submucosagewebe ist zerkleinert durch Abreißen, Schneiden, Mahlen, Scheren und ähnlichem. Mahlen der Submucosa im gefrorenem oder gefriergetrocknetem Zustand ist bevorzugt, obwohl auch gute Resultate beim Behandeln einer Suspension von Submucosastücken im Hochgeschwindigkeit- (Hochscherungs-) Mischgerät und nachfolgender Entwässerung durch Zentrifugieren und Dekantieren des überschüssigen Wassers erreicht werden. Zusätzlich kann das zerkleinerte fluidisierte Gewebe durch enzymatischen Verdau der Magensubmucosa, einschließlich unter Anwendung von Proteasen wie Trypsin oder Pepsin oder anderen geeigneten Enzymen wie einer Collagenase oder einer Glycosaminglycanase oder unter Anwendung einer Enzymmixtur, für einen ausreichenden Zeitabschnitt zur Auflösung des Gewebes und Bildung einer im wesentlichen homogenen Lösung aufgelöst werden.
• Die vorliegende Erfindung betrachtet auch die Verwendung von Pulverformen der Magensubmucosa. In einem Ausführungsbeispiel ist eine Pulverform der Magensubmucosa durch Pulverisierung von Magensubmucosalgewebe unter Flüssigstickstoff hergestellt worden, um Teilchen in dem Größenbereich von 0,1 bis 1 mm² zu ergeben. Die partikulierte Zusammensetzung ist daraufhin über Nacht lyophilisiert und sterilisiert worden, um ein festes, im Wesentlichen wasserfreies Partikelgemisch zu ergeben. Alternativ kann eine Pulverform der Magensubmucosa aus fluidisierter Submucosa erzeugt werden, indem die Suspensionen oder Lösungen der zerkleinerten und/oder teilweise verdauten Magensubmucosa getrocknet werden.
• Die submucosale Magengewebezusammensetzung dieser Erfindung verleiht ihr selbst eine breite Vielfalt chirurgischer Anwendungen mit Bezug auf die Reparatur oder den Ersatz von beschädigtem Gewebe, einschließlich z. B. der Reparatur von Gefäß- und Bindegewebe. Bindegewebe zum Zwecke dieser Erfindung umfasst Knochen, Knorpel, Muskel, Sehnen, Bänder und Fasergewebe, das die Dermalschicht der Haut umfasst.
• In Zusammenhang mit der Erfindung wird das submucosale Magengewebe zur Herstellung der Transplantatgewebezusammensetzungen verwendet, die nützlich für die Veranlassung der Bildung von endogenem Gewebe an der gewünschten Stelle in warmblütigen Wirbeltieren sind. Magensubmucosa enthaltende Zusammensetzungen können einem Wirbeltierwirt in einem Umfang verabreicht werden, der Wachstum des endogenen Gewebes an einer Stelle des Wirtes hervorruft, wenn dieses aufgrund der Abwesenheit eines Defektes oder erkrankten Gewebes benötigt wird. Die submucosalen Magenzusammensetzungen können einem Wirt entweder in fester oder in Lagenform durch chirurgische Implantation allein oder in Kombination mit anderen artverwandten Implantatzusammensetzungen oder in fluidisierter Form durch Injektion verabreicht werden.
• In einem Ausführungsbeispiel können die vorliegenden submucosalen Magenzusammensetzungen in Lagenform benutzt werden, um Gefäßtransplantate zu formen. Der Durchmesser des Transplantates sollte ungefähr derselbe sein, wie der Durchmesser des rezipienten Blutgefäßes. Dies wird erreicht, indem die Magensubmucosa manipuliert wird, um einen Zylinder mit annähernd demselben Durchmesser zu definieren, wie der des rezipienten Blutgefäßes, und Vernähen oder anderweitige longitudinale Sicherung des Transplantatgewebes, um das besagte Gefäßtransplantat zu formen. Auf diese Weise kann z. B. ein Gefäßtransplantat durch Selektion eines sterilen Glasstabes mit einem Außendurchmesser gleich dem des rezipienten Blutgefäßes hergestellt werden, wobei die Magensubmucosalage um den Glasstab außen gewickelt und das redundante Gewebe gesammelt wird. Der gewünschte Lumendurchmesser wird durch Vernähen entlang der Länge des Transplantates (z. B. unter Verwendung zweier fortlaufender Nahtlinien oder einer einfachen unterbrochenen Nahtlinie) oder unter Verwendung anderer artverwandter Gewebesicherungstechniken erreicht. Ein beschädigtes oder erkranktes Blutgefäß wird chirurgisch unter Anwendung von standardisierten Gefäßchirurgietechniken durch das Gefäßtransplantat substituiert.
• In Übereinstimmung mit der Verwendung von Magensubmucosa als Gefäßtransplantatmaterial besitzt auch die Magensubmucosa mechanische. Eigenschaften, die denen der Darmsubmucosa sehr ähnlich und höchst wünschenswert für solche Gewebetransplantatmaterialien sind, einschließlich einem niedrigen Porositätsindex und einem hohen Berstdruck. Die Fachleute auf diesem Gebiet werden einsehen, dass das Gefäßtransplantatmaterial einerseits von genügend niedriger Porosität sein muss, um intraoperative Blutungen zu vermeiden, andererseits auch von genügend hoher Porosität sein muss, um eine Extension eines neugestalteten Vasa Vasorum durch das Transplantatmaterial zur Ernährung der luminalen Oberfläche erlauben zu können.
• Die vorliegenden Magensubmucosasegmente können ebenfalls in Anlehnung an diese Erfindung als Gewebetransplantatkonstrukt zur Verwendung bei der Reparatur oder dem Ersatz von Bindegeweben bei Anwendung der gleichen Prozeduren, wie für die Verwendung der Darmsubmucosa in U.S. Patent No. 5.281.422 und 5.352.463 beschrieben, dessen Offenbarung hier ausdrücklich als Referenz eingeschlossen ist, verwendet werden. Die Magensubmucosazusammensetzung kann in ihrer delaminierten, natürlichen Lagenform verwendet werden, oder sie kann longitudinal oder lateral zur Formung von elongierten Gewebesegmenten geschnitten werden. Solche. Segmente haben einen Zwischenbereich, gegenüberliegende Endbereiche und gegenüberliegende Lateralbereiche, welche als chirurgischer Anhang zu existenten physiologischen Strukturen unter Verwendung chirurgisch annehmbarer Techniken geformt werden können.
• Die in Übereinstimmung mit dieser Erfindung gebildeten und verwendeten Transplantate unterliegen flach der Implantation einer biologischen Neugestaltung. Sie dienen als schnell vascularisierte Matrix zur Unterstützung und zum Wachstum von neuem endogenen Bindegewebe. Im Fall der Verwendung als Gewebetransplantatmaterial, wurde die Magensubmucosa als tropisch für Wirtsgewebe entdeckt, mit welchen sie befestigt ist oder sonst wie in ihrem implantierten Umfeld assoziiert ist. Es wurde gefunden, dass das Transplantatgewebe umgewandelt wurde (resorbiert und ersetzt durch autogenes differenziertes Gewebe), so dass es die charakterisierenden Eigenschaften derjenigen/desjenigen Gewebe annimmt, mit welchen/welchem es an der Implantationsstelle assoziiert ist.
• Anwender erwarten, dass die Magensubmucosa als Sehnen- und Bänderersatz und zur Wiederherstellung derselben benutzt werden kann, wie es zuvor für die Darmsubmucosa bereits beschrieben wurde. Darüber hinaus wird das Magensubmucosamaterial für Anwendungen zum Sehnen- und Bänderersatz und andere Bindegewebswiederhetstellungsanwendungen typischerweise beschaffen sein, wie in U.S. Patent Nr. 5.275.826 (dessen Offenbarung hier ausdrücklich als Referenz eingeschlossen ist) beschrieben, um die viskoselastischen Eigenschaften des Submucosalgewebes zu ändern und die Spannung (strain) des ursprünglich isolierten Magensubmucosalgewebes zu mindern. Der Ausdruck Spannung, wie er hier verwendet wird bezieht sich auf den maximalen Betrag der Gewebeelongation vor dem Versagen des Gewebes, wenn das Gewebe unter angewendeter Last gedehnt wird. Dies wird als ein Prozentsatz der Gewebelänge vor der Belastung ausgedrückt. In Übereinstimmung mit einem Ausführungsbeispiel ist die Magensubmucosa, die von sowohl dem luminalen Bereich der Tunica mucosa als auch von den glatten Muskelschichten des Muscularis Externa des Magens eines warmblütigen Wirbeltieres delaminiert ist, so beschaffen, um eine Spannung von nicht mehr als 20% zu haben. Das Submucosagewebe ist durch Strecken, chemische Behandlung, enzymatische Behandlung oder Exposition des Gewebes gegenüber anderen äußerlichen Faktoren konditioniert.
• In einem Ausführungsbeispiel sind die Streifen des Magensubmucosagewebes durch longitudinale Dehnung des Submucosagewebes konditioniert, um ein Transplantatkonstrukt zu formen, welches eine Länge hat, die länger als die der Magensubmucosa ist, aus welcher das Transplantatkonstrukt geformt wurde, und ganz besonders durch Dehnung in longitudinaler oder lateraler Richtung, so dass die Streifen des Darmsubmucosagewebes eine Spannung von nicht mehr als 20% haben.
• Eine Methode zur "Konditionierung" des Gewebes durch Dehnung beinhaltet die Anwendung einer gegebenen Last auf die Magensubmucosa für drei bis fünf Zyklen. Jeder Zyklus besteht aus der Anwendung einer Last auf das Transplantatgewebe für fünf Sekunden, gefolgt von einer zehnsekündigen Relaxationsphase. Drei bis fünf Zyklen werden ein dehnungskonditioniertes Transplantatmaterial mit reduzierter Spannung ergeben. Das Transplantatgewebe fällt nicht zurück in seine ursprüngliche Größe; es verbleibt in "gedehnter" Dimension. Beispielsweise kann ein Magensubmucosasegment durch Aufhängen eines Gewichts an besagtem Segment für eine Zeitperiode konditioniert werden, die ausreichend ist, um ein Gewebe zu produzieren, welches eine Spannung von weniger als 20% hat, z. B. zwischen 10% und 20%. Optional kann das Transplantatmaterial durch Dehnung in lateraler Richtung vorkonditioniert werden. Das Transplantatgewebe weist ähnliche viskoselastische Eigenschaften in longitudinaler und lateraler Richtung auf.
• Das Transplantatsegment wird anschließend gemäß einem Ausführungsbeispiel in einer Vielzahl von Formen und Konfigurationen gebildet, beispielsweise um als Bänder- oder Sehnenersatz oder als Lappen für eine gebrochene oder abgetrennte Sehne oder Band zu dienen. Das Segment kann geformt und gebildet werden, um eine überlagerte oder gar mehrfach überlagerte Konfiguration mit zumindest den gegenüberliegenden Endbereichen und/oder den gegenüberliegenden lateralen Bereichen zu ergeben, die gebildet wurden, um viele Schichten des Transplantatmaterials zu haben, um eine Verstärkung zur Anbringung an physiologischen Strukturen, eingeschlossen Knochen, Sehnen, Bänder, Knorpel und Muskel, bereitzustellen. In Anwendungen des Bänderersatzes können die gegenüberliegenden Enden unter Anwendung chirurgischer Standardtechniken jeweils am ersten und zweiten Knochen angeheftet werden, wobei die Knochen typischerweise ein Gelenk bilden, wie im Falle eines Kniegelenkes.
• Die Endbereiche der Magensubmucosazusammensetzung können gebildet, manipuliert oder geformt werden, um sie anzuheften, beispielsweise an einer Knochenstruktur, in einer Art und Weise, die die Möglichkeiten des Transplantatabrisses am Anhaftungspunkt verringert. Vorzugsweise kann das Material gefaltet oder teilweise umgewendet werden, um Mehrfachschichten zum Ergreifen, beispielweise mit mit Spikes behafteten Abdeckscheiben oder Klammern, bereit zu stellen.
• Alternativ kann die Magensubmucosazusammensetzung auf sich selbst zurückgefaltet werden, um die Endbereiche zu verbinden, um einen ersten Bindungsbereich bereitzustellen, der beispielsweise an einen ersten Knochen und eine Biegung im Zwischenbereich anzubringen ist, um durch einen Tunnel im Schienbein durchgezogen und dort angehaftet zu werden, um einen zweiten Bindungsbereich bereitzustellen, der an einem zweiten Knochen anzubringen ist, der mit Bezug auf den ersten Knochen gelenkig verbunden ist. Beispielsweise kann einer der Endbereiche angepasst werden, um durch einen Tunnel befindlich z. B. in dem Oberschenkelknochen hindurch gezogen und dort angeheftet zu werden, während der andere der Endbereiche angepasst sein kann, um durch einen Tunnel im Schienbein hindurchgezogen und dort angehaftet zu werden, um einen Ersatz für das natürliche Kreuzband bereit zu stellen, wobei das Segment angepasst ist, um unter Spannung zwischen den Tunneln platziert zu werden, um eine Bänderfunktion, d. h. eine durch ein normales Band bereitgestellte Spannungs- und Positionierungsfunktion, bereitzustellen.
• Mehrfachstreifen/-Stücke der Magensubmucosa können überlappt und unter eine Dehydrierung des Gewebes erlaubenden Bedingungen komprimiert werden, um die Streifen/Stücke des Magensubmucosagewebes zu einem einheitlichen Mehrfachlaminatkonstrukt zu verschmelzen. Es ist zu erwarten, dass der Prozess zur Formung der Darmsubmucosakonstrukte, beschrieben in U.S. Patentanmeldung 08/418.515 (deren Offenbarung hier ausdrücklich als Referenz mit eingeschlossen ist) auf Magensubmucosa anwendbar ist und benutzt werden kann, um Mehrfachlaminatkonstrukte der Magensubmucosa zu bilden.
• Die vorliegenden Magensubmucosazusammensetzungen können unter Verwendung konventioneller Sterilisationstechniken einschließlich Gerben mit Glutaraldehyd, Formaldehydgerbung bei saurem pH, Behandlung mit Ethylenoxid, Behandlung mit Propylenoxid, Gasplasmasterilisation, Gammastrahlung und Peressigsäuresterilisation sterilisiert werden. Vorzugsweise ist eine Sterilisationstechnik, die nicht signifikant die mechanische Festigkeit und biotropischen Eigenschaften des Transplantates schwächt, zu verwenden. Beispielsweise wird es angenommen, dass starke Gammastrahlung ursächlich für den Verlust an Festigkeit in dem Transplantatmaterial sein kann. Weil eines der höchst attraktiven Merkmale der aus dem Magensubmucosalgewebe gebildeten Transplantatkonstrukte deren Fähigkeit zur Induktion von Wirtsremodellierungsantworten ist, ist es wünschenswert, nicht eine Sterilisationsmethode zu verwenden, die diese Eigenschaft beeinträchtigt. Bevorzugte Sterilisationstechniken beinhalten ein Aussetzen des Transplantatgewebes gegenüber Peressigsäure, Gammastrahlung in niedrigen Dosen (≤ 2,5 m Rad) und Gasplasmasterilisation; Peressigsäuresterilisation stellt die am meisten bevorzugte Methode dar. Typischerweise wird die Zusammensetzung, nachdem die Gewebetransplantatzusammensetzung sterilisiert wurde, in eine Hülle aus nicht porösem Plastikmaterial eingewickelt und nochmals unter Verwendung von Ethylenoxid- oder Gammastrahlungs-Sterilisationstechniken sterilisiert.
• Die Zusammensetzungen des Magensubmucosalgewebes dieser Erfindung können ebenfalls unter Übereinstimmung mit dieser Erfindung in einer Zusammensetzung zur Unterstützung der Vermehrung und Induktion der Differenzierung von in vitro kultivierten eukariotischen Zellen benutzt werden. Prozeduren zur Verwendung des Submucosalgewebes für die in vitro Kultivierung von Zellen ist beschrieben in U.S. Patentanmeldung Nr. 08/386.452. Allgemein umfasst die Methode den Schritt der Kontaktierung eukariotischer Zellen, in vitro, mit einer von der Magensubmucosa von Wirbeltieren abgeleiteten Matrix unter eukariotisches Zellwachstum förderlichen Bedingungen.
• In einem Ausführungsbeispiel wird ein Kultursubstrat eukariotischer Zellen enthaltend Submucosalgewebe präpariert. Das Submucosalgewebe kann mit verschiedenen Nährstoffen, Wachstumsfaktoren, Mineralien und Salzen kombiniert werden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet als wichtig für die in Zellkulturprozeduren bekannt sind. Der Ausdruck "Kontaktierung", wie er hier mit Bezug auf die Zellkulturen benutzt wird, ist gedacht, sowohl den direkten wie auch indirekten Kontakt, beispielsweise in fluider Kommunikation, des Submucosalgewebes und den kultivierten Zellen, einzuschließen. Der Ausdruck "unter für eukariotisches Zellwachstum förderlichen Bedingungen", wie hier benutzt, bezieht sich auf die das Umfeld betreffenden Bedingungen, wie sterile Techniken, Temperatur und Nährstoffversorgung, welche für das eukariotische Zellwachstum unter aktuell verfügbaren Zellkulturprozeduren als optimal gesehen werden. Obwohl die besten Zellkulturbedingungen, welche für die Kultivierung eukariotischer Zellen verwendet werden, etwas von dem jeweiligen Zelltyp abhängig sind, sind Zellwachstumsbedingungen allgemein auf diesem Fachgebiet gut bekannt.
• Darüber hinaus kann das Magensubmucosalgewebe mit derzeit erhältlichen Kulturmedien kombiniert werden, um die Effektivität von solchen Medien zu steigern, Wachstum, Vermehrung und Differentiation verschiedener Zelltypen zu induzieren.
Beispiel 1 Präparation von Magensubmucosalgewebe
• Das Transplantatgewebematerial dieser Erfindung ist in Übereinstimmung mit den folgenden Schritten präpariert:
• Zunächst wird der Magen aus der tierischen Quelle durch Abtrennen des Esophagus und des Dünndarms an deren entsprechenden Eingangs- und Ausgangspunkten am Magen entnommen. Irgendwelches überschüssige Gekrösegewebe oder Fett wird vom Magen entfernt, die Mageninhalte werden entleert und jedwede zurückbleibenden Rückstände werden aus dem Inneren des Magens durch Spülung mit laufendem Leitungswasser entfernt. Der Magen wird anschließend umgestülpt, um die innenliegenden Schichten des Magens nach außen zu kehren. Diejenigen Bereiche des Magens, die die Bildung der Mageneingangs- oder -Ausgangspunkte zu bilden beginnen, werden entfernt. Der Magen wird typischerweise im Ganzen belassen, der Magen kann jedoch auch zerschnitten und vor der Entfernung des unerwünschten Gewebes abgeflacht werden.
• Die luminale Oberfläche des Magens ist Gegenstand der Abtragung unter Verwendung des Griffbereichs einer Schere oder eines Hemostaten, um die inneren Schichten des Magens, einschließlich zumindest des luminalen Bereichs des Tunica mucosa, abzukratzen. Eine dünne Restschicht wird an diesem Punkt zurückbleiben. Wenn das Gewebe im Ganzen zurückgelassen wurde, wurde das Magengewebe abermals umgestülpt, um die luminale Oberfläche des Magens wieder zum Inneren des Transplantatkonstruktes zurück zu führen. Ein schmaler Schnitt wurde dann in die äußere Muskelfaserschicht gesetzt. Die Muskelschichten sind daraufhin vom Submucosalgewebe durch den Gebrauch einer Schere oder eines Hemostaten delaminiert worden, um den Schnitt im Muskel zu vergrößern und die Muskelschichten heraus zu kratzen. Das verbliebene Gewebe wurde wieder umstülpt, um die luminale Seite an dem Äußeren des Transplantatgewebes zu platzieren. Die luminale Oberfläche wurde abgeschabt, um den verbliebenen inneren Rückstand, welcher eine bräunliche Farbe hat, zu entfernen. Das Magengewebe wird solange geschabt, bis das rosafarben-weiße Gewebe erscheint.
• Während der Präparation des Magengewebes ist Vorsicht geboten, um das Gewebe durch periodische Wässerung des Gewebes mit Wasser feucht zu halten. Das. Magensubmucosalgewebe wurde mit fließendem Leitungswasser für annähernd zwei Stunden ausgespült, um jegliches Blut oder lose Gewebeabschabungen, Lyse und verbliebene Zellen zu entfernen. Nach Spülung sollte das Gewebe weiß erscheinen, falls das Gewebe in rosa Farbe erscheint, wird das Gewebe unter Wasser so lange gerieben, bis es weiß erscheint. Nach vollendeter Spülung wurde der Wasserüberschuss durch Wringen des Gewebes mit der Hand oder unter Gebrauch von mechanischen Wringmaschinen entfernt. Das Gewebe wurde dann bei -80ºC in flüssigem Stickstoff gelagert.
Beispiel 2 Mechanische Eigenschaften der Magensubmucosa
• Die mechanischen Eigenschaften des Magensubmucosablomaterials wurden unter Verwendung zweier unterschiedlicher Bench-Top- Tests ausgewertet: dem "Nassdiaphragma-Bersttest" und dem "Kugel-Bersttest".
• Der Nassdiaphragma-Bersttest beinhaltet die Platzierung des Materials in einer Öffnung, um ein "Diaphragma" zu bilden, welches das Submucosagewebe, gehalten durch einen umgebenden Ring, beinhaltet. Wasserdruck wird auf eine Seite der Materialeinheit bis zu dessen Versagen angewendet. Die gesammelten Daten von zehn getrennten Testproben von jedem Material sind in Tabelle 1 dargestellt, worin der Nassdiaphragma-Bersttest der Darmsubmucosa, der Harnblasensubmucosa und der Magensubmucosa verglichen wird. Die Ausdrücke "in Medium" und "gefroren" kennzeichnen die Methode, durch welche die Materialien im Anschluss an die Gewinnung und vor dem Testen gelagert wurde. Tabelle 1 Nassdiaphragma-Berattest (Druck, in Kg/cm²)
• Die Festigkeit von submucosalen Magengewebetransplantaten können auch durch den Gebrauch eines Zerreißprüfers eines Material-Test-System (MTS) ermittelt werden. Die Lage des submucosalen Magengewebes wird in einer runden Klammer (Probenklammer) gesichert, um die gleichmäßige Verteilung der Belastung über die ganze Gewebelage hinweg bereitzustellen. Der Griff der Probenklammer ist in seine höchste Position zu bringen, so dass die Einspannbacken der Klammer in der Lage sind, die Testprobe aufzunehmen. Das submucosale Gewebekonstrukt wird zerschnitten, um in die Form der Probenklammer zu passen, die Öffnung der Klammer hat einen Durchmesser von 1 9/16 (4 cm) Annähernd 1,3-1,5 cm des überschüssigen Materials sollten um den Umkreis der Testprobe herum eingeschlossen sein, um einen ausreichenden Einspannbereich zu garantieren. Das submucosale Gewebe ist in den Einspannbacken der Klammer platziert und gesichert; die Klemmkraft wird durch ein an der obersten Klemme angeordnetes Daumenhandrad kontrolliert.
• Die anfängliche Einstellungsstufe ist so einzustellen, dass die Oberseite der Stahlkugel unmittelbar unter der Ebene der Testprobe angeordnet ist. Die Stahlkugel drückt nach oben gegen das geklammerte Submucosalgewebe bei einem durch ein Softwareinterface eines Zugversuchgerätes überwachten Grad, um die auf die Testprobe einwirkende Kraft zu überwachen und zu messen. Die Kraft wird solange gesteigert, bis ein Versagen der Probe auftritt. Versagen ist definiert als die maximale Belastung, die dem ersten Erscheinen der Kugel durch sichtbare, nicht-natürliche Diskontinuitäten in der Ebene der Probe zuzuordnen ist. Im Falle, dass die höchste Position der Einstellung vor dem Versagen erreicht ist, greifen die Softwarebegrenzungen und unterbrechen den Test. Der Spitzenbelastungswert, angezeigt am Mikroprofiler 458,01, wird gespeichert und die Probe entnommen. Tabelle 2 zeigt die gesammelten Daten des Kugel-Bersttests, der drei unterschiedliche Quellen der Submucosa miteinander vergleicht: Darmsubmucosa, Harnblasensubmucosa und Magensubmucosa. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Magensubmucosa das stärkste dieser drei unterschiedlichen Biomaterialien ist. TABELLE 2 Kugel-Bersttest (max. Belastung in kg)
Beispiel 3 In-Vivo-Neugestaltung
• Sektionen der Magensubmucosa wurden als Gerüst zum Ersetzen von Bereichen der operativ entfernten Harnblase im Hund verwendet. Zwei Untersuchungen wurden durchgeführt. Ein Tier wurde nach drei Wochen geopfert, das zweite Tier nach sechs Wochen. Die morphologische Auswertung der neugestalteten Gewebe zeigte ein Wachstum des Übergangsepitheliums über die Oberfläche des Magensubmucosagerüsts und die Anwesenheit von glatten Muskelzellen inmitten des Biogerüsts. Weil kein endgültiger Weg zur Identifikation der An- oder Abwesenheit verbleibender Magensubmucosa bestand, konnte das Ausmaß und/oder der Umfang der Abtragung der Magensubmucosa nicht durch diese Untersuchungen bestimmt werden.
Beispiel 4
• In-Vitro Zellwachstumseigenschaften der Magensubmucosa Die Fähigkeit der Magensubmucosa als extrazelluläre Matrix zur Unterstützung von in-vitro-Zellwachstum zu dienen, wurde durch Anwendung vieler Zelltypen auf die magensubmucosale Gewebsoberfläche unter standardisierten Zellkulturbedingungen getestet. Die getesteten Zelltypen beinhalteten 3T3 Fibroblasts, Darmepitheliumzellen und FR (fötale Ratten-) Mesenchymalzellen. Alle drei Zelltypen zeigten die Fähigkeit, sich leicht auf dieser extrazellulären Matrix zu vermehren, ohne die Zugabe von Ergänzungsmitteln, die für das Wachstum dieser Zellen auf einer Kunststoffoberfläche nötig wären. Deshalb kann geschlossen werden, dass das Material notwendige Struktur- und Zusammensetzungs-"Nährstoffe" beinhaltet, die als Zellkultursubstrat zur Unterstützung des Zellwachstums dienen.

Claims (10)

1. Zusammensetzung enthaltend Magensubmucosa, die von sowohl dem luminalen Bereich der Tunica mucosa und den glatten Muskelschichten der Muscularis externa eines Magens eines warmblütigen Wirbeltieres delaminiert ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Magensubmucosa fluidisiert ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Magensubmucosa mit einem Enzym für einen zur Solubilisierung des Gewebes ausreichenden Zeitraumes verdaut ist und eine im wesentlichen homogene Lösung bereitstellt.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Magensubmucosa getrocknet ist und in Pulverform vorliegt.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, die in einen Zylinder mit einem vorbestimmten luminalen Durchmesser geformt und entlang der Länge des. Zylinders vernäht ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, die konditioniert ist, um die Spannung der isolierten Magensubmucosa für eine Verwendung als Bindegewebsersatz zu reduzieren.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Magensubmucosa durch Dehnung konditioniert ist, um ein Transplantatkonstrukt herzustellen, welches in wenigstens einer Dimension größer ist als die Magensubmucosa, aus welcher es gebildet ist.

8. Verwendung von Magensubmucosa zur Herstellung eines Gewebetransplantatkonstrukts, welches zur Induzierung von endogenem Gewebewachstum nützlich ist, wenn dieses in ein warmblütiges Wirbeltier implantiert ist, wobei die Magensubmucosa von sowohl dem luminalen Bereich der Tunica mucosa und den glatten Muskelschichten der Muscularis externa eines Magens eines warmblütigen Wirbeltieres delaminiert ist.

9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Magensubmucosa in fluidisierter Form vorliegt.

10. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Magensubmucosa in Pulverform vorliegt.