DE68904800T2

DE68904800T2 - Zusammensetzung fuer das ausbessern von knorpel und knochen und verfahren fuer ihre zubereitung als skelett-gewebe-implantat.

Info

Publication number: DE68904800T2
Application number: DE8989107552T
Authority: DE
Inventors: Samuel Dr Itay
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-04-29
Filing date: 1989-04-26
Publication date: 1993-08-05
Anticipated expiration: 2009-04-27
Also published as: AU625913B2; JPH02209811A; EP0339607B1; AU3380889A; IL90075A; US4904259A; DE68904800D1; EP0339607A2; JP2858782B2; ES2051914T3; EP0339607A3

Description

Zusammensetzungen für eine Verwendung bei der Reparatur von Knochen und Gewebe durch Implantation eines Materials, das eine proliferierende Chondrocyten-Zellen-Struktur mit einer phänotypischen Eignung umfaßt, die in ein Vehikel oder Gel eingebettet ist, das aus Thrombin, Antiprotease, Fibrinogen, einer extrazellulären Matrix und einem oder mehreren Wachstumsfaktoren besteht und einen "biologischen Kleber" von biologisch abbaubarem Charakter bildet, sind beschrieben im US- Patent 4,642,120. Vor der Implantation werden die Zellen in Gewebekultur gezüchtet und geerntet, und die Chondrozytenpopulation wird in dem biologischen Leim in einer Konzentration von zwischen 100.000 bis 500.000 Zellen pro Milliliter Leim eingebettet. Bevor diese Formulierung verwendet wird, wird der beschädigte Knorpel oder Knochen, beispielsweise in einer Hüfte oder einem anderen Gelenk, chirurgisch entfernt. Ein passendes Implantat aus der Formulierung wird dann in den Hohlraum eingesetzt, und zwar mit oder ohne Knochensegmente, um einen Teil des Volumens auszufüllen. In der von dem System geschaffenen förderlichen Umgebung hält die Zellproliferation an, während externe Einflüsse eingeschränkt sind. Chondrozyten (Knorpelzellen) und Osteoblasten (knochenbildende Zellen) entwickeln sich auf eine Weise, daß sie sich mit der existierenden Struktur vereinigen, so daß nach einem Zeitraum die implantierte Struktur praktisch ununterscheidbar vom umgebenden Material ist.
Dieser Ansatz einer Reparatur von Gelenkknorpel führt zu zahlreichen Vorteilen, beispielsweise im Vergleich zu dem Ersatz eines Hüftgelenks mit einer Metall-Kunststoff-Prothese niedriger Reibung. Die Unterschiede bei den biomechanischen Eigenschaften zwischen dem Knochen und dem Prothesenelement stellen ein Hauptproblem dar. Die Implantation einer Prothese setzt das Mechanorezeptorsystem in der Gelenkkapsel außer Betrieb, das die Rückkopplung für die Muskelsteuerung liefert, was zu einer Abnutzung und schließlich dem Erfordernis eines Austauschs führt. Die zahlreichen Freiheitsgrade der Bewegung, die von dem Gelenk gefordert werden, beispielsweise eine Rotations- und Gleitbewegung können aufgrund der Abwesenheit des Mechanorezeptorsystems nicht gewährleistet werden. Zusätzlich weisen die besten Prothesen mit niedriger Reibung immer noch die mehr als 100fach Reibung der natürlichen Knorpelstruktur mit der zwischengelagerten Gelenkschmiere auf, und auch aus diesem Grund sind eine Abnutzung und ein Qualitätsverlust unvermeidlich.
Obwohl die Zusammensetzung des Patents 4,642,120 ein nachgewiesenes Potential zur Reparatur von Gelenkknorpel aufweist, wurde im Ergebnis weiterer experimenteller Arbeiten auch erkannt, daß sie auch eine Anzahl von Unzulänglichkeiten aufweist. Es wurde angenommen, daß die erforderliche Fähigkeit zur Zellproliferation am besten bei embryonalen Chondrozyten (jungen festgelegten Chondrozyten) gegeben ist, für eine humane Verwendung ist jedoch die Verfügbarkeit begrenzt und aufgrund von Reaktionen des Immunsystems kann es zu erheblichen Problemen kommen. In dem Patent werden knochenmark-stämmige Zellen lediglich als eine andere mögliche Quelle von Zellen erwähnt, und zwar neben mesenchymalen Zellen mit einem Potential zu einer Umwandlung in Knorpelzellen durch Selbstdifferenzierung oder unter dem Einfluß von chondrogenen Faktoren. Es wurden keine Arbeiten unter Verwendung dieser Vorläuferzellen durchgeführt. Eine zusätzliche detaillierte Information und Diskussion findet sich in einem Artikel, der betitelt ist "Use of Cultured Chick Epiphyseal Chondrocytes as Grafts for Defects in Chick Articular Cartilage", S. Itay et al., Clinical Orthopedics, Seiten 284 - 302, Juli 1987.
Der erwähnte Artikel zitiert eine Anzahl von Artikeln von allgemeiner Relevanz für das Thema als Ganzes. Drei davon sind von speziellem Interesse, da sie Versuche einer Transplantation von Chondrozyten in Gelenkknorpel belegen, die nur von beschränktem Erfolg gekrönt waren, und zwar, weil, wenigstens zum Teil, ein geeignetes biologisch abbaubares viskoelastisches Material fehlte und die Fähigkeit zur Erzeugung von Knorpel fehlte. Diese drei Artikel sind: Bentley, G. et al, "Homotransplantation of isolated epiphyseal and articular cartilage chondrocytes onto joint surfaces of rabbits", Nature 230:385 (1971); Bentley, G. et al, "Isolated Epiphyseal chondrocyte allograft onto joint surface-An experimental study in rabbits", Ann. Rheum. Dis. 37:449 (1978); und Helbing, G. et al, "In vitro Untersuchungen an isolierten Chondrozyten zur Prognose von Knorpeltransplantaten", Helv. Chir. Acta 46:21 (1979).
Wie im US-Patent 4,642,120 ausgeführt wird, wurde bisher angenommen, daß eine Grenze für die Chondrozytenkonzentrationen von etwa 500.000 Zellen pro Milliliter Gel eingehalten werden muß, um eine Nekrose der Zellen zu vermeiden. Es wurde ferner angenommen, daß nur 5-50 Einheiten Thrombin pro Milliliter und etwa 25-80 mg/ml Fibrinogen verwendet werden sollten, wobei das Abbinden des Gels von der Menge des Thrombins bestimmt wird, die unterhalb eines Grenzwerts von weniger als 50 Einheiten/ml gehalten werden sollte. Wie bei weiteren Untersuchungen festgestellt wurde, schränken diese Beziehungen und Parameter die Proliferationsgeschwindigkeiten und -kapazitäten ein, sowie die Fähigkeit zur Reifung und Umwandlung des Implantats in geeignete phänotypische Ausprägungen, insbesondere bei großen Defekten. Folglich macht die Ausweitung dieses Ansatzes auf die Reparatur von Gelenkknorpel neue Zusammensetzungen und Arbeitsweisen erforderlich.
Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung zur Regenerierung von Skelett-Gewebe verwenden Zellkulturen, die Zellen erzeugen, die einen chondrogenen Phänotyp zur Ausprägung bringen. Diese schließen knochenmark-stämmige Chondrozyten und muskelfibroblasten-stämmige Chondrozyten sowie embryonale Chondrozyten ein. Wachstumsfaktoren, vorwiegend in Form von 10 bis 20 % Serum, werden in dem Kulturmedium verwendet, um die Zellproliferation zu erleichtern. Ein biologisch resorbierbares Immobilisationsvehikel (BRIV) in der Zusammensetzung umfaßt vorzugsweise etwa 15 bis 30 % Serum, 100 bis 150 mg/ml Fibrinogen, 60 bis 90 Einheiten/ml Thrombin, 60 mM Calciumchlorid (CaCl&sub2;) und 2000 Einheiten/ml (KIU) Aprotinin. Die Zellen in dem Implantat liegen in einer Konzentration von 80 bis 160 x 10&sup6; Zellen/ml BRIV vor. Die erhaltene Zusammensetzung ermöglicht eine Zellproliferation mit einer höheren Geschwindigkeit in vivo, reift schneller und wandelt sich schneller in eine histologische Identität mit den umgebenden Knorpel- und Knochenstrukturen um.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf eine Zusammensetzung zur Verwendung als ein Implantat zur Reparatur von Schäden in Knorpel und Knochen. Die Zusammensetzungen werden durch Isolierung der geeigneten Zellen durch Trypsinisieren und Aufbrechen des Gewebes hergestellt. Die Zellen werden auf einem geeigneten Medium kultiviert, geerntet und mit einem biologisch resorbierbaren Immobilisationsvehikel (BRIV) auf Fibrinogen-Basis kombiniert. Die BRIV-Gelzusammensetzung mit den eingebetteten Zellen kann sofort verwendet werden, kann für begrenzte Zeiträume (2 bis 3 Tage) in einem Inkubator gelagert werden, gefrierkonserviert werden bis zu 3 Jahren, oder die geernteten Zellen können lange Zeiträume dadurch konserviert werden, daß man sie tiefgefriert und direkt vor ihrer Verwendung auftaut und dann in die gewünschte Gelzusammensetzung einbettet. Wenn das Implantat verwendet werden soll, werden der beschädigte Knorpel und Knochen chirurgisch entfernt, das Gel wird in eine Lösung von Fibrinogen getaucht, die Implantationsstelle wird mit einer Thrombinlösung besprüht, und das Gelimplantat wird auf den Schaden oder die verletzte Stelle aufgedrückt.
Die verwendeten Zellen sind vorzugsweise Knochenmark-Vorläuferzellen, wobei jedoch embryonale Zellen und Chondrozyten, die aus Muskelfibroblasten stammen, oder andere Zellen mesenchymalen Ursprungs ebenfalls verwendet werden können. Die Knochenmark-Vorläuferzellen oder die muskelfibroblasten-stämmigen Chondrozyten weisen den Vorteil auf, daß der Patient selbst zu einem geeigneten frühen Zeitpunkt der Donor sein kann, was die Gefahr einer Autoimmunantwort vermindert.
Die Kultivierung der Zellen auf Kunststoff schafft eine adäquate Wachstumsumgebung für die Zellproliferation und für die Selektion des gewünschten Zelltyps. Das Kulturmedium enthält 10 bis 20 % fötales Kälberserum und kann gegebenenfalls Wachstumsfaktoren, wie IGFI, IGFII, TGFB, PDGF oder irgendwelche anderen Wachstumsfaktoren, enthalten, von denen man feststellt, daß sie die Proliferation der Zellen fördern. Die Zellen werden so lange in Subkultur gezogen, bis man reine fibroblastenähnliche Zellpopulationen erhalten hat. Die reinen fibroblastenähnlichen Zellpopulationen werden mit Trypsin aufgeschlossen und in eine Suspensionskultur mit einer Dichte von 3-8 x 10&sup6; Zellen/ml Medium gegeben und über weichem Agar in einem F-12-Medium (Sigma Co.) mit 10% fötalem Kälberserum (F.C.S.) und 50 ug/ml Natriumascorbat kultiviert. Nach einigen Tagen liegen die fibroblastischen Zellen in Aggregaten von 30-60 Zellen vor.
Alternativ können die Zellen mit Trypsin aufgeschlossen werden, und die Einzelzellsuspension wird auf einem Ham F-12-Medium (Sigma Co.) auf weichem Agar in einer Dichte von 2 x 10&sup5; bis 4 x 10&sup5; Zellen/ml kultiviert. 30 bis 50 ug/ml Natriumascorbat werden täglich zu dem Medium zugesetzt.
Die Zellen, die in dem Implantat verwendet werden, werden in einem biologisch resorbierbaren Immobilisationsvehikel (BRIV) eingebettet, einer viskoelastischen, biologisch abbaubaren, biologisch verträglichen, resorbierbaren Matrix, und zwar in einer Konzentration von 80 bis 160 x 10&sup6; Zellen/ml BRIV. Die BRIV-Zusammensetzung gewährleistet eine gute Haftung und eine selektive Permeabilität von Nährflüssigkeiten und trophischen Mitteln. Das BRIV-Gel verhindert ferner mechanisch eine Zellwanderung. Außer einer Fixierung der Chondrozyten in den geschädigten Stellen dient das BRIV zusätzlich auch in wirksamer Weise als ein geeignetes extrazelluläres Milieu, das das Wachstum und den differenzierten Zustand der Chondrozyten unterstützt, während es gleichzeitig ein Eindringen von Fibroblasten und deren Proliferation verhindert.
Die Zusammensetzung des BRIV umfaßt etwa 15 bis 30 % Serum, 100 bis 150 mg/ml Fibrinogen, 60 bis 90 Einheiten/ml Thrombin, 60 mM Calciumchlorid (CaCl&sub2;) und eine Antiprotease, wie beispielsweise Aprotinin. Vorzugsweise weist die BRIV-Implantat-Zusammensetzung 20 % fötales Kälberserum, 150 mg/ml Fibrinogen, 90 Einheiten/ml Thrombin in 60 mM CaCl&sub2; sowie 2000 Einheiten/ml (KIU) Aprotinin auf. Das in dem BRIV verwendete Serum kann fötales Kälberserum, ein Nabelschnurserum aus dem zweiten Trimester oder ein Pferdeserum sein, obwohl fötales Kälberserum bevorzugt wird. Allgemein gesprochen wird ein natürlicher Nicht-Plasmaproteaseinhibitor verwendet, um die schnelle Auflösung der Matrix zu verhindern. Eine Kombination aus Polysaccharidinhibitoren mit Plasmaproteaseinhibitoren und/oder synthetischen Proteaseinhibitoren kann verwendet werden. Geeignete Proteaseinhibitoren sind chemische Inhibitoren, wie Epsilon-Aminocapronsäure, die in Mengen von etwa 200 bis 400 mg/ml Gel verwendet wird, und Tranexemsäure, die in Mengen von etwa 200 bis 400 mg/ml Gel verwendet wird. Polysaccharidinhibitoren können ebenfalls verwendet werden. Auch ein natürlicher Nicht-Plasmaproteaseinhibitor, wie Anti- Trypsin (Hühnereiweiß, Sigma, Typ III) kann verwendet werden, oder geeignete synthetische Proteaseinhibitoren. Plasmaproteaseinhibitoren können auch verwendet werden.
Die Bioimplantate der Erfindung können auf verschiedene Weisen verwendet werden. Ein frisch hergestelltes Implantat (BRIV-Zusammensetzung, die eingebettete Zellen enthält) kann direkt auf die verletzte Stelle oder den Schaden aufgebracht werden. Zusätzlich kann die BRIV-Zusammensetzung mit den eingebetteten Zellen mit F-12-Medium (Sigma Company) plus 10 % fötales Kälberserum bedeckt und in einem CO&sub2;-Inkubator 2 bis 3 Tage bei etwa 37ºC gelagert werden. Ferner kann ein Implantat aus in flüssigem Stickstoff gefrierkonservierten Zellen (90 % fötales Kälberserum und 10 % DMSO) (gefrierkonserviert bis zu 3 Jahren) hergestellt werden, die aufgetaut und dann im BRIV eingebettet wurden. Als eine bevorzugte Möglichkeit können die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt werden, und das vollständige Implantat mit den im BRIV eingebetteten Zellen kann in flüssigem Stickstoff für längere Zeiträume gefrierkonserviert werden (90 % fötales Kälberserum und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO)). Das Implantat wird in diesem Falle im Operationsraum aufgetaut und sofort implantiert. Ein Implantat kann gegebenenfalls Knochensegmente oder Knochenersatz enthalten, um einen Teil des Volumens aufzufüllen.
Wenn das Implantat verwendet werden soll, wird die verletzte Stelle oder der Schaden mit einer Thrombin-Lösung eingesprüht, und die Zellen enthaltende BRIV-Matrix wird in eine Lösung getaucht, die Fibrinogen und Antiprotease enthält. Das Implantat wird auf die verletzte Stelle oder den Schaden gepreßt, so daß der Schaden aufgefüllt wird. Die Thrombin-Lösung enthält 90 Einheiten/ml Thrombin in 60 mM CaCl&sub2;.
Innerhalb von 48 Stunden nach der Implantation ist eine Chondrozyten-Proliferation zu erkennen. Zwei Wochen später umgibt eine Hyalinknorpelmatrix die Zellen. Innerhalb von acht Wochen sind die Schäden vollständig mit Hyalinknorpel gefüllt, der sich glatt mit dem benachbarten Knorpel verbindet, ohne daß sich an der Grenzfläche ein faseriges Gewebe bildet. Der Zellgehalt und die Geschwindigkeit der Proteoglycansynthese in dem Reparaturgewebe bleibt vier Monate hoch und sinkt dann langsam auf das Niveau des umgebenden Knorpels ab. Sechs Monate nach der Transplantation zeigt das knorpelartige Reparaturgewebe auf einem Niveau unterhalb der Ossifikationsfront das Eindringen von vaskulären Elementen und von Knorpel für die Knochenumwandlung. 18 Monate nach der Transplantation wandelt sich das gesamte Implantat unterhalb der Ossifikationsfront in knochenartige Elemente um, während der Gelenkteil des Implantats knorpelartig bleibt, mit allen Eigenschaften des Originalknorpels. Keinerlei Zeichen einer immunogenen Abstoßung oder von degenerativen Veränderungen des Implantats werden beobachtet. Im Gegenteil scheint die Gelenkoberfläche des implantierten Bereichs jünger zu sein als die Originaloberläche.
Die Zusammensetzung ermöglicht eine Zellproliferation mit einer höheren Geschwindigkeit in vivo. Die Zellen in dem Implantat reifen schneller und wandeln sich leichter im Sinne einer histologischen Identität mit den umgebenden Knorpel- und Knochenstrukturen um. Innerhalb von zwei Monaten nach der Transplantation ist der Schaden korrekt mit aktiven proliferierenden Zellen gefüllt, und ist gut integriert, ohne Faserknorpel oder ein anderes weiches Gewebe an den Kanten. Im Zeitraum vom zweiten bis sechsten Monat ist das gesamte Implantat, das sich unterhalb der osteochondralen Verbindungsstelle befindet, in Knochen umgewandelt, während der Gelenkknorpel seine knorpeligen Eigenschaften beibehält. Das biologisch abbaubare BRIV des Implantats wurde reabsorbiert.
Die folgenden spezifischen Beispiele können dazu verwendet werden, die Erfindung weiter zu illustrieren, und enthalten auch eine beste Ausführungsform. Die Beispiele wurden durchgeführt und getestet, wie beschrieben wird.

Beispiel 1

Implantat, das knochenmark-stämmige Chondrozyten enthält

Ein autologes oder homologes Knochenmark wird durch Aspiration mit einer Knochenbiopsienadel auch dem Darmbeinkamm oder dem Oberschenkelknochenkanal gewonnen. Die aspirierten Zellen werden in eine phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) injiziert, die 0,25 % Trypsin enthält, und nacheinander durch Nadeln der Größen 17, 18 und 20 injiziert, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Es wurde festgestellt, daß Nadeln mit noch höheren Kennziffern zu einer gewissen Zellzerstörung führen. Die Zellen werden mit einer Dichte von 50 bis 100 x 10&sup6; Zellen auf 100 mm Gewebekulturplatten ausgestrichen, die mit einem BGJb-Medium (GIBCO) mit 15 % F.C.S. versorgt werden. Das Medium wird täglich gewechselt oder wie von der Proliferationsgeschwindigkeit der Zellen diktiert wird. Das Medium kann durch Wachstumsfaktoren, wie IGFI, IGFII, TGFB, PDGF oder irgendwelche andere Wachstumsfaktoren, ergänzt werden, von denen man festgestellt hat, daß sie die Proliferation der Zellen erleichtern. Die Zellen werden wöchentlich in Subkultur überführt, und nach fünf bis sechs Subkulturen wird eine nahezu reine fibroblastische Stromazellenpopulation erhalten. Diese Zellpopulation wird dann mit Trypsin aufgeschlossen und in eine Suspensionkultur in einer Dichte von 3-8 x 10&sup6; Zellen/ml Medium überführt und über weichem Agar in einem F-12- Medium (Sigma Co.) mit 10 % F.C.S. und 50 ug/ml Natriumascorbat, das man dem Medium täglich zusetzt, kultiviert. Die fibroblastischen Stromazellen beginnen sofort zu aggregieren, und nach drei bis sieben Tagen liegen die meisten Zellen in Aggregaten von 30 bis 60 Zellen vor. Alle die Aggregaten prägen einen chondrogenen Phänotyp aus, wie unter Anwendung von histochemischen und immunohistochemischen Sonden zur Analyse festgestellt wird.
Obwohl in diesem Beispiel knochenmark-stämmige Chondrozyten bevorzugt werden, kann man Chondrozyten oder Osteoblasten von autologem oder homologem Ursprung oder homologe festgelegte Chondrozyten oder irgendwelche andere Vorläuferzellen von mesenchymalem Ursprung verwenden. Es ist zu erkennen, daß diese ursprüngliche Formulierung die Reinigung, die Proliferation und die Manipulation einer Population umfaßt, die einen chondrogen oder osteogenen Phänotypus ausprägt. Genauergesagt gehören die proliferierenden Zellen zu einer Klasse, die Knochenmark-Stromazellen, embryonale festgelegte Chondrozyten und irgendwelche undifferenzierten mesenchymalen Zellen umfaßt.
Um die Zellen in eine biologisch abbaubare viskoelastische Matrix einzuarbeiten, wird das erhaltene Zellpellet in einem kleinen Volumen einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) resuspendiert, die Fibrinogen (150 mg/ml) und 20 % fötales Kälberserum und Aprotinin enthält, das unter dem Warenzeichen "Trasylol " (2000 KIU/ml) erhältlich ist, oder irgendeine andere Antiprotease. Die Lösung enthält Zellen (in einem Konzentrationsbereich zwischen 80-160 x 10&sup6; Zellen/ml), Fibrinogen, 15 bis 30 % Serum und Antiprotease und kann als Lösung A bezeichnet werden. Genauer werden in diesem Beispiel 120 x 10&sup6; Zellen/ml BRIV, 20 % fötales Kälberserum, 150 mg/ml Fibrinogen, 90 Einheiten/ml Thrombin in 60 mM CaCl&sub2; und 2000 Einheiten Aprotinin verwendet. Eine zweite Lösung, die als Lösung B bezeichnet wird, enthält Thrombin (90 Einheiten/ml in 60 mM CaCl&sub2;). Die Lösungen werden vermischt, wobei man ein Verhältnis der Lösungen A und B von 3 : 1 (Volumen/Volumen) einhält. Das Implantat wird in ein F-12-Medium eingetaucht, das 10 % F.C.S. enthält und kann unmittelbar verwendet werden. Alternativ hierzu kann das Implantat gefrierkonserviert (beispielsweise in flüssigem LN&sub2;) in 90 % F.C.S. und 10 % DMSO (oder irgendeinem anderen Gefrierkonservierungsansatz) werden. Bei der Transplantation wird der Schaden mit einer Thrombinlösung eingesprüht, und das Implantat wird in den Schaden passend eingepreßt.
Daten, die bei Versuchen mit knochenmark-stämmigen Chondrozyten und Chondrocyten embryonalen Ursprungs bei verschiedenen Arten (Vögel und Säugetiere) durch makroskopische Beobachtung, histologische Schnitte und biochemische Tests erhalten wurden, zeigten, daß an der Transplantationsstelle innerhalb von zwei Monaten der Schaden ordnungsgemäß in einer kompletten Kongruenz mit der Gelenkoberfläche und einer perfekten Integration gefüllt wird, wobei an den Grenzflächen kein Faserknorpel oder irgendein anderes weiches Gewebe vorliegt.
Nach zwei bis sechs Monaten ist das gesamte Implantat, das sich unterhalb der osteochondralen Verbindungsstelle befindet, in Knochen umgewandelt, während der Gelenkknorpel seine knorpeligen Eigenschaften beibehält. Keine degenerativen Veränderungen oder immunologische Abstoßungen werden bei ausgedehnten Nachbeobachtungszeiträumen beobachtet.
Obwohl das Serum in diesem Beispiel vorzugsweise fötales Kälberserum ist, können auch Nabelschnurserum aus dem zweiten Trimester oder Pferdeserum oder irgendeine Kombination davon verwendet werden. Es muß keine extrazelluläre Matrix verwendet werden.

Beispiel 2

Herstellung einer Zusammensetzung für die Knorpelreparatur

Als Ausgangsmaterial wurde die Epiphyse von langen Knochen (Schienbein, Oberschenkelknochen, Oberarmknochen) verwendet. Die Isolationsprozedur von embryonalen Chondrozyten umfaßt die Trypsin-Aufschließung der Epiphyse (1 % Schweinetrypsin), eine Inkubation für 60 Minuten bei 37ºC und eine Verwirbelung für zwei Minuten jeweils nach 10-Minuten-Intervallen und anschließend eine milde mechanische Desintegration des Gewebes mit Hilfe eines Teflon-ausgekleideten Homogenisators. Die Trypsin-Aktivität wird mit einem Serum beendet, das eine antiproteolytische Substanz enthält. Die erhaltene Einzelzellsuspension wird dann mehrere Tage (vier bis sieben Tage) in Ham F-12-Medium (Sigma Co.) auf Platten ausgesät, die mit weichem Agar überzogen sind (0,5 % Bacto-Agar in Ham F-12), und zwar bei einer Dichte von 2 x 10&sup5; bis 4 x 10&sup5; Zellen/ml. Eine Menge von 50 ug Natriumascorbat wird täglich zu dem Medium zugesetzt. Während dieser Wachstumsperiode stirbt die Hauptmenge der Fibroblasten ab, und es kommt zu einer Anreicherung von Chondrozyten. Die Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt und direkt in dem BRIV als ein frisches Transplantat verwendet. Alternativ dazu kann das vollständige Transplantat gefrierkonserviert werden, oder die Zellen können (90 % fötales Kälberserum (F.C.S.) und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO)) in flüssigem Stickstoff für längere Zeiträume gefrierkonserviert werden und zu einem späteren Zeitraum in dem BRIV eingebettet werden. Die Zellen wurden gesammelt und in einer Konzentration von 80-160 x 10&sup6; Zellen/ml der gleichen viskoelastischen biologisch abbaubaren Matrix wie in Beispiel eingebettet. Die erhaltenen Ergebnisse sind mit denen von Beispiel 1 vergleichbar.

Beispiel 3

Implantat, das muskelfibroblasten-stämmige Chondrozyten enthält

Ein autologer oder homologer Muskel wird durch eine offene Biopsie unter örtlicher Betäubung erhalten. Der Muskel wird zu sehr kleinen Gewebestücken zerkleinert und dann 30 Minuten in 0,5 % Trypsin in BBS und Ethylendiamintetraessigsäure (E.D.T.A.) unter gelegentlichem Verwirbeln mit Trypsin aufgeschlossen. Die mit Trypsin aufgeschlossenen Zellen werden dann durch ein 53 um Nitex-Filter filtriert. Der Trypsin-Aufschluß wird dann mit Hilfe von M.E.M-Medium (minimales essentielles Medium) (GIBCO Co.) gestoppt, das 15 % F.C.S. enthält. Nach der Zentrifugierung wird das Zellpellet mit M.E.M.-Medium mit einem Gehalt von 15 % F.C.S. gewaschen. Die Zellen werden dann in einer Dichte von 50-100 x 10&sup6; Zellen pro 100 mm Gewebekulturplatten ausgestrichen und täglich mit M.E.M.-Medium mit 15 % F.C.S. unterhalten. Die Zellen werden wöchentlich auf M.E.M.-Medium mit 15 % F.C.S. in Subkultur überführt, und nach drei Subkulturen wird eine reine fibroblastenartige Population erhalten. Diese Zellpopulation wird dann trypsiniert und in einer Konzentration von 3-8 x 10&sup6; Zellen/ml Medium in eine Suspension gegeben und über weichem Agar in F-12-Medium (Sigma Co.) mit 10 % F.C.S. und 50 ug/ml Natriumascorbat, das dem Medium täglich zugesetzt wird, kultiviert. Die fibroblastischen Zellen beginnen sofort zu aggregieren, und nach drei bis sieben Tagen liegen die meisten Zellen in Aggregaten von 30 bis 60 Zellen vor. Alle die Aggregate bilden einen chondrogenen Phänotypus heraus, wie durch die Verwendung von histochemischen und immunohistochemischen Sonden zur Analyse bestimmt wird.
Obwohl in diesem Beispiel muskelstämmige Chondrozyten bevorzugt werden, kann man auch knochenmark-stämmige Chondrozyten oder festgelegte Chondrozyten verwenden. Die Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt und direkt in einer Konzentration von 80-160 x 10&sup6; Zellen/ml der gleichen viskoelastischen biologisch abbaubaren Matrix (BRIV) wie in Beispiel 1 eingebettet. Alternativ dazu können die Zellen in flüssigem Stickstoff lange Zeiträume gefrierkonserviert werden (in 90 % F.C.S. und 10 % DMSO), vor der Verwendung aufgetaut werden und in einer Konzentration von 80-160 x 10&sup6; Zellen/ml in BRIV eingebettet und verwendet werden. Als eine weitere Alternative können die Zellen in BRIV eingebettet werden, und das gesamte Implantat kann in 90 % F.C.S. und 10 % DMSO gefrierkonserviert werden und vor der Verwendung in dem Operationsraum aufgetaut werden. Die erhaltenen Ergebnisse sind denen von Beispiel 1 vergleichbar.

Beispiel 4

Herstellung einer Zusammensetzung für die Knochenreparatur

Um Knochenschäden zu regenerieren, kann eine von drei Methoden angewandt werden:
4A. Für kleine Schäden von 2 bis 4 cm Länge kann man ein Implantat verwenden, wie es in Beispiel 1, Beispiel 2 oder Beispiel 3 vorgeschlagen wird.
4B. Für große Defekte wird ein Verbundtransplantat eines Knochenersatzes als Stützmatrix mit biomechanischen Eigenschaften verwendet, die den Eigenschaften des natürlichen Knochens nahekommen. Die Zellen werden mit dieser Matrix mit Hilfe der biologisch abbaubaren Klebematrix auf Fibrinogen-Basis kombiniert.
4C. Die Knochenmarkstromazellen können in vitro zur Ausprägung eines osteoblastischen Phänotyps angeregt werden und direkt wie beispielsweise in 4A oder 4B verwendet werden, um Knochenschäden zu korrigieren. (Das kann nur innerhalb der autologen Gruppe zur Anwendung kommen, bei der das Knochenmark von dem Patienten stammt, der den Knochenschaden hat.)

Das Verfahren

Ein Schaden aufgrund einer traumatischen (Bruch) oder pathologischen (Tumor) degenerativen Erkrankung im Knochen oder Gelenkknorpel wird gesäubert und in eine geometrische Konfiguration gebracht (würfelförmig oder zylindrisch). Im Falle einer Gelenkoberfläche kann die gesamte Prozedur durch eine Arthroscopeinrichtung erfolgen.
Nachdem der geschädigte Bereich vorbereitet wurde, wird ein gefrorenes Implantat einer identischen Form (hergestellt wie in näheren Einzelheiten in Beispiel 1, Beispiel 2 oder Beispiel 3 beschrieben ist) rasch aufgetaut, indem man es fünf bis zehn Minuten bei 37ºC in eine Salzlösung legt.
Das Implantat wird dann in eine Lösung von Fibrinogen eingetaucht, und die Implantatsstelle wird mit der Thrombin-Lösung eingesprüht. Das Implantat wird nunmehr in den Schaden unter Pressen eingepaßt. Bei einem Gelenkschaden beginnt man sofort mit einer kontinuierlichen passiven Bewegung.
Im Falle großer Schäden kann ein Verbundtransplantat aus dem biologischen Implantat, das eingebettet ist in (oder über) einem Knochenersatzmaterial einer geeigneten Form, verwendet werden. Dieses Implantat wird entweder auf Bestellung hergestellt oder als ein kommerzieller Standardtyp.
Obwohl oben verschiedene Alternativen und Modifikationen vorgeschlagen werden, versteht es sich jedoch, daß die Erfindung nicht auf diese beschränkt ist, sondern alle Formen und Variationen innerhalb der folgenden Ansprüche umfaßt.

Claims

1. Eine Zusammensetzung zur Regenerierung von Gelenkknorpel und Knochen durch Implantation, die knochenmark-stämmige Chondrozyten oder Osteoblasten von autologem oder homologem Ursprung, oder homologe festgelegte Chondrozyten, oder autologe oder homologe muskelfibroblasten-stämmige Chondrozyten oder irgendwelche andere Vorläuferzellen von mesenchymalem Ursprung und einen biologisch abbaubaren, biokompatiblen, biologisch resorbierbaren Immobilisationsvehikel-(BRIV)-Haftkleber, der aus Fibrinogen, Thrombin, CaCl&sub2;, Proteaseinhibitor und etwa 10-30% Serum besteht, umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Kombination von 8 bis 160 x 10&sup6; Zellen/ml BRIV enthält.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das genannte Serum 15 bis 30% Serum darstellt, das ausgewählt ist aus fötalem Kälberserum oder Nabelschnurserum aus dem zweiten Trimester oder Pferdeserum oder irgendeiner Kombination derartiger Sera.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der die Zellen knochenmark-stämmige Chondrozyten in einer Konzentration von 120 x 10&sup6; Zellen/ml BRIV sind, die in Kultur zur Vermehrung angeregt werden können und so umgewandelt werden können, daß sie chondrogene oder osteogene Phänotypen hervorbringen.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei dem die Zellen muskelfibroblasten-stämmige Chondrozyten in einer Konzentration von 120 x 10&sup6; Zellen/ml BRIV sind, die in Kultur zur Vermehrung angeregt werden können und die so umgewandelt werden können, daß sie chondrogene und osteogene Phänotypen hervorbringen.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der der Proteaseinhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polysaccharidinhibitoren, Plasmaproteaseinhibitoren und syntetischen und natürlichen Nichtplasmaproteaseinhibitoren besteht.

6. Verfahren zur Herstellung eines Skelettgewebeimplantats, das eine Zusammensetzung gemäß irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche umfaßt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

a. Reinigung, Vermehrung und Manipulation einer Zellpopulation, die einen spezifischen chondrogenen oder osteogenen Phänotyp hervorbringt; und;

b. Einbetten der Zellen in ein biologisch resorbierbares Immobilisationsvehikel (BRIV), das wenigstens 10%, vorzugsweise 15 bis 30% Serum aufweist, so daß die Konzentration der Zellen zwischen 80 x 10&sup6; und 160 x 10&sup6; Zellen/ml BRIV liegt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die sich vermehrenden Zellen ausgewählt sind aus Knochenmark-Stromazellen, embryonalen festgelegten Chondrozyten, oder Chondrozyten, die muskelfibroblasten-stämmig sind, sowie irgendwelchen undifferenzierten mesenchymalen Zellen.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, bei dem das BRIV 100 bis 150 mg/ml Fibrinogen und 60 bis 90 Einheiten/ml Thrombin enthält und bei dem das BRIV außerdem etwa 2000 Einheiten/ml Aprotinin enthält.

9. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 6 bis 8, bei dem die Zellen in einem BRIV in einem geeignet geformten Knochenersatz eingebettet sind.

10. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 6 bis 9, das die Schritte umfaßt:

a. Kultivieren einer sich vermehrenden Zellpopulation, die autologe Knochenmark-Stromazellen oder autologe muskelfibroblasten-stämmige Chondrozyten umfaßt;

b. deren Manipulation in Suspension über weichem Agar in einer Konzentration von mehr als 2 x 10&sup6; Zellen/ml Medium für wenigstens 5 Tage;

c. Ernten der Zellen; und

d. Einbetten der Zellen in einer Konzentration von mehr als 80 x 10&sup6; Zellen/ml BRIV, das mehr als 10 % Serum, 100 mg/ml Fibrinogen und 60 Einheiten/ml Thrombin in einem Überschuß von 40mM CaCl&sub2; und 2000 Einheiten Aprotinin umfasst.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das BRIV 15 bis 30% Serum und 60 Einheiten/ml Thrombin in einem Überschuß von 60mM CaCl&sub2; enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das biologische Implantat nach seiner Herstellung unter Niedertemperaturbedingungen mit einem Konservierungsmedium gelagert wird, das 90% fötales Kälberserum und 10% DMSO enthält, und wobei etwa 20% Serum vorliegen.

13. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 12, bei dem die geernteten Zellen nach ihrer Herstellung unter Niedertemperaturbedingungen mit einem Konservierungsmedium gelagert werden, das 90% fötales Kälberserum und 10% DMSO enthält, und bei dem sie zu einem späteren Zeitpunkt in BRIV eingebettet werden.

14. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Serum ausgewählt ist aus fötalem Kälberserum, Nabelschnurserum aus dem zweiten Trimester und Pferdeserum.