ES2340657B1 - Procedimiento para la obtencion de un producto de ingenieria tisular orientado a la regeneracion de tejido oseo. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la obtención de un producto
de ingeniería tisular orientado a la regeneración de tejido
óseo.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de un producto de ingeniería
tisular orientado a la regeneración de tejidos óseos. Más en
particular, la presente invención se refiere a un producto que
comprende principalmente células mesenquimales de origen óseo
expandidas, inmovilizadas sobre soportes óseos y amalgamadas
mediante geles de fibrina. Dicho procedimiento comprende
fundamentalmente las etapas de colonización de los soportes óseos y
el amalgamado de las partículas colonizadas en base a geles de
fibrina.
Description
Procedimiento para la obtención de un producto
de ingeniería tisular orientado a la regeneración de tejido
óseo.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de un producto de ingeniería
tisular orientado a la regeneración de tejidos óseos. Más en
particular, la presente invención se refiere a un producto que
comprende principalmente células mesenquimales de origen óseo
expandidas, inmovilizadas sobre soportes óseos y amalgamadas
mediante geles de fibrina. Dicho procedimiento comprende
fundamentalmente las etapas de colonización de los soportes óseos y
el amalgamado de las partículas colonizadas en base a geles de
fibrina.
La reconstrucción de segmentos óseos debido a
traumatismos, enfermedades degenerativas, inflamación y el
tratamiento quirúrgico de tumores es un problema clínico no
resuelto. Los tratamientos disponibles en la actualidad incluyen el
trasplante de tejido óseo autólogo, heterólogo y la utilización de
implantes en base a diversos tipos de biomateriales. Entre las
anteriores aproximaciones el autoinjerto de hueso obtenido de
diversas localizaciones, como por ejemplo la cresta ilíaca, es el
tratamiento preferido para una amplia variedad de condiciones
ortopédicas. Entre estas se encuentran el reemplazo de defectos
óseos, la consolidación de fracturas complicadas o los defectos de
unión. La utilización de tejido autólogo como vehículo de la
regeneración ósea cumple una serie de requisitos básicos claves,
aporta una matriz estructural osteoinductiva, factores de
crecimiento que promueven la vascularización y osteoinducción del
implante e introduce células con potencial osteogénico.
A pesar de los beneficios derivados, desde un
punto de vista exclusivamente mecanístico, la utilización de
autoinjertos en la práctica clínica presenta una serie de
importantes inconvenientes. Frecuentemente, no se consigue una
sustitución completa del tejido óseo dañado con el autoinjerto. Esta
circunstancia puede desencadenar a largo plazo en la rotura del
injerto. Se ha estimado que transcurridos 10 años el porcentaje de
rotura es del 60% y se encuentra asociada a multitud de factores
como la disminución en la mineralización del hueso neoformado, la
producción de microfracturas o la actividad de los osteoclastos
(Wheeler DL y otros, Allograft bone decreases in strength in
vivo over time. Clin Orthop Relat Res. 2005;
435:36-42.). Por otro lado, la obtención quirúrgica
del hueso autólogo frecuentemente lleva asociada una elevada
morbilidad variable (Laurie SW y otros, Donor-site
morbidity after harvesting rib and iliac bone. Plast Reconstr Surg.
1984;6:93-98.) en función de la localización
anatómica y la técnica de extracción (Chou LB y otros, Stress
fracture as a complication of autogenous bone graft harvest from the
distal tibia. Foot Ankle Int. 2007;2:199-201;
Brawley SC y otros, Results of an alternative autogenous iliac crest
bone graft harvest method. Orthopedics.
2006;4:342-346.).
La utilización de hueso humano procedente de
bancos de tejidos soluciona el problema de la morbilidad asociada a
los autoinjertos, pero carece de los beneficios asociados a la
actividad regeneradora aportada por el componente celular, la cual
se ha determinado como un factor clave. Este tipo de injertos
presentan una incorporación lenta en el hueso nativo que puede
acabar produciendo inestabilidad mecánica durante esfuerzos o poca
afinidad celular, circunstancias que se traducen en la no unión con
el hueso nativo (Enneking WF y otros, Observations on massive
retrieved human allografts. J Bone Joint Surgery.
1991;73:1123-1142; Turk JB y otros, Bone source from
craneomaxillofacial reconstruction. Facial Plast Surg.
2000;16:7-14). Esta problemática sitúa la tasa de
fracaso de esta técnica entre el 10 y el 40% (Ottoleughi CE. Massive
osteo and osteo-articular bone grafts: technique and
results of 62 cases. Clin Orthop Relat Res
1972;87:156-64). Por esta razón, aunque se disponga
de tejido óseo de banco, el tratamiento más frecuente de lesiones
óseas importantes es el autoinjerto.
Como respuesta a la problemática mencionada, la
presente invención da a conocer un procedimiento para preparar un
producto basado en la ingeniería tisular, cuya utilización resulta
en una alternativa terapéutica eficaz. El uso del producto obtenido
mediante el procedimiento que da a conocer la presente invención se
fundamenta en la utilización de matrices en base a biomateriales,
combinadas con células madre para inducir la regeneración de los
tejidos óseos dañados.
Las matrices utilizadas en la presente invención
muestran varias características, que resultan claves para realizar
la función de soporte a la reconstrucción del tejido diana. Entre
estas características se destacan que son biocompatibles,
reabsorbibles, poseen integridad estructural y características
mecánicas que se adecúan a la zona de implantación. Además, deben
ser capaces de generar un entorno biológico que garantice el aporte
de nutrientes a las células para asegurar que estas puedan realizar
su función regeneradora. A las anteriores características debe
añadirse que una matriz orientada a la regeneración de tejidos óseos
debería poseer capacidad de inducir osteoinducción.
El segundo componente fundamental del producto
de ingeniería tisular de la presente invención son las células.
Dichas células también exhiben varias características relevantes
tales como la facilidad y seguridad de su preparación, son una
fuente segura desde el punto de vista citogenético y tienen
propiedades de multipotencialidad, que les permite diferenciarse
hacia células responsables de la producción de tejido óseo, los
osteoblastos.
Por lo tanto, la presente invención da a conocer
un procedimiento para la preparación de un producto de ingeniería
tisular orientado a la regeneración ósea. Dicho procedimiento se
fundamenta en la utilización de células mesenquimales expandidas, de
origen autólogo o alogénico, procedentes de la médula ósea, dichas
células se inmovilizan sobre soportes en base a partículas de hueso
desantigenizado o desantigenizado/desmineralizado. El producto
obtenido por dicho procedimiento se amalgama y estabiliza en la zona
de implantación utilizando geles de fibrina. El tratamiento con el
producto obtenido por el procedimiento de la presente invención
tiene como principal ventaja respecto de los tratamientos basados en
el autoinjerto, que no es necesario someter al receptor de la
terapia a una o varias intervenciones de cirugía mayor para la
extracción del material biológico.
El material celular necesario para la
preparación del producto de Ingeniería Tisular según la presente
invención se obtiene mediante la extracción de médula ósea que se
realiza de forma ambulatoria. Esta aproximación, por lo tanto, evita
las complicaciones potencialmente graves derivadas de la obtención
de material óseo autólogo tales como dolor crónico, afectación del
tejido nervioso y arterial, inestabilidad de la pelvis, infección y
cicatrices (Banwart JC y otros, Iliac crest bone graft harvest donor
site morbidity. A statistical evaluation. Spine.
1995;20:1055-1060).
Por otro lado, el procedimiento según la
presente invención, que utiliza de forma combinada células
mesenquimales y una matriz de reconocida capacidad osteinductora,
preferentemente hueso desantigenizado o
desantigenizado/desmineralizado permite superar las limitaciones
impuestas por la utilización de hueso procedente de banco de tejidos
sin componente celular, que muestra un Indice de fracaso en la
integración ósea de entre el 10% y el 40%.
La combinación de matrices óseas
desmineralizadas/desantigenizadas o desantigenizadas con médula ósea
no procesada ha demostrado acelerar y incrementar la formación de
hueso en comparación a la utilización de la matriz ósea por sí sola
(Rougraft BT., Treatment of active unicameral bone cysts with
percutaneous injection of demineralizaed bone matrix and autogenous
bone marrow. J. Bone Joint Surg. Am. 2002;84:921). Aunque este
resultado pone de manifiesto que la médula ósea, es decir las
células con posible potencial osteogénico contenidas en ella, puede
ser un elemento clave en la actividad terapéutica del producto, al
actuar como catalizadores de la formación de tejido sano.
Sin embargo, la médula ósea está constituida por
un conjunto celular heterogéneo que incluye todas las células de
linaje hematopoyético, células endoteliales, células de tejido
adiposo así como un porcentaje, menor al 0,01% de células
mesenquimales multipotentes. Esta población de células mesenquimales
es la que mediante un proceso de diferenciación dará lugar a los
osteoblastos, que son los principales responsables de la formación
de hueso. Lógicamente este bajo porcentaje de las células
mesenquimales en la médula ósea supone una limitación en la
capacidad regeneradora de esta fuente celular. Por lo tanto, existe
un grado de incertidumbre elevado en el resultado del tratamiento,
al no ser posible determinar la cantidad de células con capacidad
osteoinductora aplicadas y fijadas a la zona de la lesión.
Los presentes inventores han descubierto que
mediante el procedimiento de la presente invención, en el que se
conjugan matrices óseas mediante un proceso de inmovilización de un
producto celular enriquecido en células mesenquimales se obtienen
resultados sorprendentes en la regeneración ósea. Dicho producto
presenta una excelente capacidad osteoinductora y se obtiene
mediante una selección y posterior expansión in vitro de
estas células mesenquimales.
El procedimiento de la presente invención,
mediante la manipulación del proceso de expansión de las células
mesenquimales, permite generar un amplio rango de cantidades de
injerto óseo, que facilita el tratamiento de lesiones de diverso
tamaño y origen. Esta característica hace que el producto obtenido
mediante el procedimiento según la presente invención sea aplicable
en un abanico de aproximaciones terapéuticas tales como la
reconstrucción ósea maxilofacial, en osteoartosis, en osteonecrosis,
en el reemplazo de defectos óseos, en la fusión intervertebral, en
la consolidación de fracturas complicadas o en los defectos de
unión.
Por otro lado, la conjugación de las células
mesenquimales a las matrices óseas mediante un proceso de
colonización, permite la localización de las células con potencial
osteogénico en la zona a regenerar. Esta característica asegura la
actividad celular reparadora en la zona a tratar y a diferencia de
otras aproximaciones de ingeniería tisular, que introducen las
células sin inmovilizar en la matriz. Además, esto garantiza la
permanencia de las células mesenquimales en la zona de la lesión
donde deben realizar la labor reparadora.
Finalmente, el amalgamado de estas partículas de
hueso colonizadas con células mesenquimales mediante geles de
fibrina permite dotar al conjunto de plasticidad y capacidad de
manipulación, facilitando a su vez la inmovilización de la mezcla en
la zona a tratar y dándole la arquitectura requerida.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención da a conocer un
procedimiento para la preparación de un producto de ingeniería
tisular orientado a la regeneración de tejidos óseos. Dicho producto
está constituido por un componente celular consistente en células
mesenquimales expandidas a partir de la médula ósea y un componente
no celular en base a matrices óseas. El procedimiento comprende las
etapas de:
- a)
- expansión de células mesenquimales;
- b)
- conjugación/inmovilización de las células mesenquimales obtenidas en (a) en matrices óseas;
- c)
- lavado de la suspensión ósea; y
- d)
- acondicionado final (amalgamado).
\vskip1.000000\baselineskip
El tamaño de la lesión a tratar determinará la
cantidad de células mesenquimales requeridas para una adecuada
regeneración ósea. Una vez obtenida en la etapa (a) la dosis de
células mesenquimales requeridas, se inicia la etapa de conjugación
de éstas a una matriz ósea. Esta
conjugación-inmovilización se puede realizar
mediante sistemas dinámicos o estáticos.
En el caso de que se utilice un sistema
dinámico, las células mesenquimales obtenidas en la etapa de
expansión (a) se resuspenden en medio de cultivo, preferentemente
medio DMEM complementado con suero a una concentración no superior
1x10^{7} células por mililitro y no inferior a 1x10^{3} células
por mililitro. A continuación, se dispensa la suspensión celular de
forma estéril en una bolsa o frasco de cultivo, que puede estar
dotado o no de agitador pendular previamente cargado con la matriz
ósea. La relación número de células por centímetro cúbico de matriz
ósea se mantendrá dentro del intervalo de 1x10^{2} a 1x10^{8}
células por centímetro cúbico. Una vez añadida la suspensión celular
al frasco, bioreactor o bolsa de cultivo, se incuba con agitación
durante 4 a 24 horas a una temperatura de 37ºC, una saturación de
CO_{2} del 5%, y humedad relativa del 95%. Las condiciones de
agitación empleadas para garantizar el anclaje de las células son de
1 a 120 revoluciones por minuto.
En caso de emplear un sistema de inmovilización
estático, las células mesenquimales obtenidas en la etapa de
expansión (a) se resuspenden en medio de cultivo, preferentemente
medio DMEM complementado con suero a una concentración no superior
1x10^{7} células por mililitro y no inferior a 1x10^{3} células
por mililitro. A continuación, se dispensa la suspensión celular de
forma estéril en una bolsa o frasco de cultivo, que puede estar
dotado o no de agitador pendular previamente cargado con la matriz
ósea. La relación número de células por centímetro cúbico de matriz
ósea se mantendrá dentro del intervalo de 1x10^{2} a 1x10^{8}
células por centímetro cúbico. Una vez añadida la suspensión celular
al frasco, bioreactor o bolsa de cultivo, se incuba durante 4 a 24
horas a unas condiciones de temperatura de 37ºC, una saturación de
CO_{2} del 5% y humedad relativa del 95%.
El producto obtenido de la etapa de
conjugación/inmovilización (b), compuesto por células mesenquimales
inmovilizadas sobre matrices óseas, preferentemente de hueso
desantigenizadas, más preferentemente
desantigenizadas/desmineralizadas, se somete a un ciclo de lavados,
preferentemente mediante una solución salina fisiológica, y se
emplaza de forma estéril en bolsa de conservación.
El producto obtenido se extrae de la bolsa de
conservación de forma estéril mezclado con un gel de fibrina con una
relación de 1 unidad volumétrica de solución de fibrinógeno por una
unidad volumétrica de solución de trombina y una unidad volumétrica
de matriz ósea colonizada.
A continuación, la presente invención se ilustra
mediante Ejemplos, que no constituyen una limitación de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
En el siguiente procedimiento se realizó para la
obtención de un centímetro cúbico del producto de ingeniería tisular
orientado a la regeneración ósea, según la presente invención.
Se obtuvieron 6x10^{6} células mesenquimales
de médula ósea mediante expansión empleando medios libres de suero
animal y se inocularon en un frasco de cultivo. Mediante el empleo
de medio en base a DMEM suplementado con suero humano al 10% (v/v),
se fijó la concentración celular a una densidad de 6x10^{5}
células por mililitro. Esta suspensión celular se añadió de forma
estéril a un segundo frasco de material plástico dotado de agitador
pendular, donde previamente se añadió 1 centímetro cúbico de matriz
ósea desantigenizada.
Se emplazó el frasco en la incubadora a unas
condiciones de temperatura de 37ºC, saturación de CO_{2} del 5%, y
humedad relativa del 95% y se inició un ciclo de agitación de 24
horas de duración a una velocidad de 1 rpm. A lo largo del tiempo
que dura esta etapa de inmovilización de las células mesenquimales
sobre la matriz ósea, se tomaron muestras del sobrenadante para
determinar el ritmo y rendimiento de la inmovilización de las
células. Los rendimientos de inmovilización cuando finalizó esta
etapa fueron superiores al 80% y la viabilidad de las células,
determinada mediante tinción de núcleos o ensayos metabólicos
indirectos, fue superior al 90%.
Transcurridas las 24 horas, tras la
inmovilización de las células mesenquimales sobre la matriz ósea, se
realizó un lavado del producto obtenido con el objetivo de eliminar
restos celulares y del medio de cultivo. Esta operación se llevó a
cabo mediante filtración empleando como agente de lavado una
solución salina fisiológica. A continuación, se emplazó el producto
obtenido en una bolsa estéril.
En el momento previo de la aplicación del
producto al paciente, se realizó un amalgamado de las partículas
óseas con un gel de fibrina. Para realizar esta operación, se empleó
una relación volumétrica consistente en una unidad de solución de
fibrinógeno por una unidad volumétrica de solución de trombina y una
unidad volumétrica de matriz ósea colonizada. A continuación, se
dotó a dicho conjunto de la forma que le permitió adaptarse a la
distribución espacial de la lesión y se emplazó en la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron 6x10^{6} células mesenquimales
de médula ósea mediante expansión empleando medios libres de suero
animal y se inocularon en un frasco de cultivo. Mediante el empleo
de medio en base a DMEM suplementado con suero humano al 10% (v/v),
se fijó la concentración celular a una densidad de 6x10^{5}
células por mililitro. Esta suspensión celular se añadió de forma
estéril a una bolsa de cultivo permeable a gas de material plástico,
donde previamente se añadió 1 centímetro cúbico de matriz ósea
desantigenizada.
Se emplazó el frasco en la incubadora a unas
condiciones de temperatura de 37ºC, saturación de CO_{2} del 5%, y
humedad relativa del 95% y se mantuvo sin movimiento durante 24
horas. A lo largo del tiempo que dura esta etapa de inmovilización
de las células mesenquimales sobre la matriz ósea, se tomaron
muestras del sobrenadante para determinar el ritmo y rendimiento de
la inmovilización de las células. Los rendimientos de inmovilización
cuando finalizó esta etapa fueron superiores al 80% y la viabilidad
de las células, determinada mediante tinción de núcleos o ensayos
metabólicos indirectos fue superior al 90%.
Transcurridas las 24 horas, tras la
inmovilización de las células mesenquimales sobre la matriz ósea, se
realizó un lavado del producto obtenido con el objetivo de eliminar
restos celulares y del medio de cultivo. Esta operación se llevó a
cabo mediante filtración empleando como agente de lavado una
solución salina fisiológica. A continuación, se emplazó el producto
obtenido en una bolsa estéril.
En el momento previo de la aplicación del
producto al paciente, se realizó un amalgamado de las partículas
óseas con un gel de fibrina. Para realizar esta operación, se empleó
una relación volumétrica consistente en una unidad de solución de
fíbrinógeno por una unidad volumétrica de solución de trombina y una
unidad volumétrica de matriz ósea colonizada. A continuación, se
dotó a dicho conjunto de la forma que le permitió adaptarse a la
distribución espacial de la lesión y se emplazó en la misma.
Claims (14)
1. Procedimiento para la preparación de un
producto de ingeniería tisular orientado a la regeneración de
tejidos óseos que comprende las etapas de:
- a)
- expansión de células mesenquimales;
- b)
- conjugación/inmovilización de las células mesenquimales obtenidas en (a) en matrices óseas;
- c)
- lavado de la suspensión ósea; y
- d)
- acondicionado final (amalgamado).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que la etapa de conjugación/inmovilización se realiza mediante un
sistema dinámico o un sistema estático.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2,
en el que la matriz ósea es hueso desantigenizado.
4. Procedimiento, según las reivindicaciones
anteriores, en el que la matriz ósea es hueso
desantigenizado/desmine-
ralizado.
ralizado.
5. Procedimiento, según las reivindicaciones
anteriores, en el que el lavado se realiza con solución salina
fisiológica.
6. Procedimiento, según las reivindicaciones
anteriores, en el que el lavado se realiza en ciclos y el agente de
lavado se elimina mediante filtración.
7. Procedimiento, según las reivindicaciones
anteriores, en el que la relación número de células por centímetro
cúbico de matriz ósea en la etapa de conjugación (b) se encuentra en
el intervalo de 1x10^{2} a 1x10^{8} células por centímetro.
8. Procedimiento, según las reivindicaciones
anteriores, en el que el tiempo de conjugación/inmovilización (b) se
encuentra en el intervalo de 4 a 24 horas.
9. Procedimiento, según las reivindicaciones
anteriores, en el que la etapa de conjugación/inmovilización (b) se
realiza en unas condiciones de temperatura de 37ºC, una saturación
de CO_{2} del 5% y humedad relativa del 95%.
10. Procedimiento, según las reivindicaciones
anteriores, en el que la agitación cuando se utiliza el sistema
dinámico en la etapa de conjugación/inmovilización (b) se realizan
en un intervalo de 1 a 120 rpm.
11. Procedimiento, según las reivindicaciones
anteriores, en el que el rendimiento de inmovilización de la etapa
de conjugación/inmovilización (b) es superior al 80% y la viabilidad
de las células, determinada mediante tinción de núcleos o ensayos
metabólicos indirectos, es superior al 90%.
12. Procedimiento, según las reivindicaciones
anteriores, en el que el acondicionado final se realiza mediante el
amalgamado con un gel de fibrina.
13. Procedimiento, según las reivindicaciones
anteriores, en el que el acondicionado final se realiza en el
momento previo de la aplicación del producto al paciente.
14. Uso de un producto que comprende células
mesenquimales inmovilizadas en una matriz ósea, obtenido mediante el
procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
para la fabricación de un medicamento utilizado en la regeneración
ósea.
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