JPH02209811A

JPH02209811A - 関節軟骨および骨再生用組成物および骨格組織移植組織の製造および骨格組織の再生方法

Info

Publication number: JPH02209811A
Application number: JP1112799A
Authority: JP
Inventors: Samuel Itay; サミュエル　イタイ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-04-29
Filing date: 1989-05-01
Publication date: 1990-08-21
Anticipated expiration: 2014-02-17
Also published as: IL90075A; DE68904800T2; AU3380889A; AU625913B2; ES2051914T3; US4904259A; EP0339607A3; EP0339607A2; EP0339607B1; JP2858782B2; DE68904800D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の背崇生体分解可能の性質の「生体重」を形成する、トロンビ
ン、族プロテアーゼ、ブイプリノーゲン、細胞外マトリ
ックスおよび１種またはそれ以上の生長因子からなるビ
ヒクルまたはゲルに包埋された表現型能を有する増殖性
軟骨細胞構造を含む材料の移植による骨および軟骨の補
修に使用する組成物は、米国特許第４．６４２．１２０
号明細書に記載されている。移植前に、細胞を組織培養
において生長させ、次いで収穫し、しかも軟骨細胞集団
を、謬ｍＭ１当たりｉｏｏ、ｏｏｏ個〜５００゜０００
個の細胞の濃度において生体重に包埋する。

この配合物を使用する前に、設または他の関節と同様に
、損傷した軟骨および骨を手術によって切除する。次い
で、配合物の適合移植を、骨節を用いるかまたは用いず
に空洞に挿入して容積の１部を充てんする。細胞増殖は
、系によって生成した許容し得る環境において続行し、
一方外部の影響は制限される。軟骨細胞および造骨細胞
（骨形成ｌ［ｌｌ１）は発達して既存の構造と接合する
ので、ある時開後、移植された構造は周囲の材料から事
実上区別できない。

例えば股関節の、低摩擦金属−プラスチック補綴による
置換に比較して関節軟骨の補修におけるこのアプローチ
から多くの利点が得られる。骨と補綴要素の間の生物力
学的性質の差は、主要な問題である。補綴の移植によっ
て筋肉制御にフィードバックを与える関節嚢における機
械的受容器系が無能になり、摩耗が生じ、逐には置換が
必要になる。回転およびｌ！勤運動におけるように、機
械的受容器系の欠如の故に、関節に必要な運動の多重自
由度は提供できない。ざらに、最良の低摩擦補綴は、介
在前液を有する自然軟骨組織の１００倍より大きい摩擦
を有し、またこの理由のために、摩耗および分解は避け
られない。

米国特許第４，６４２．１２０号明細−の組成物は、関
節軟骨の補修について証明された可能性を有するが、ま
たさらに実Ｓ研究の結果として、多くの＄１１１１を有
することも認められた。必要な細胞増殖能は、胚性軟骨
輻Ｉ！（幼若コミッテッド軟骨細胞）において最も利用
できるが、ヒト用には、有効性が限定され、しかも主な
問題が免疫系反応から生じ得る。骨■幹細胞はこの特許
明細−において、自己分化あるいは、軟骨形成要素の指
示の下に軟骨細胞への変換の可能性を有する間葉輻胞と
共に異なった可能な細胞源として挙げられているにすぎ
ない。これらの前駆細胞を用いる研究はなされていない
。これ以上の詳細な情報および論議は［ユース・オプ・
カルチュアード・チック・エピフィシアル争コンドＯサ
イツ・アズ・ゲラフッ・フォア・デイフエクツ・イン・
チック・アーテイキュラー・カーティラージ（Ｉｊｓｅ
ｏｆＣｕｌｔｕｒｅｄ　Ｃｈｉｃｋ　Ｅｐｉｐｈｙｓｅ
ａｌ　Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ　ａｓＧｒａｆｔｓ　
ｆｏｒ　Ｄｅｆｅｃｔｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｃｋ　Ａｒｔｉ
ｃｕｌａｒＣａｒｔｉｌａａｅ　）　Ｊと題するＳ、　
１ｔａｙらによる論文、クリニカル・オーソピデイクス
（ＣＩｉｎｉｃａｌＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ　）　、２
８４頁〜３０２頁、７月、１９８７に含まれている。

前記の論文は、全体として論題に一般に関連のある多く
の論文を挙げている。これらの３件の論文は、特別に興
味がある。なぜならば、これらの論文は、軟骨細胞を、
少なくとも１部分は、適切な生体内分解性粘弾性材料の
欠如および軟骨生成が不可能のために成功が限られてい
る関節軟骨に移植する試みを明示しているからである。

この３件の論文は、ｅｅｎｔ＋ｅｙ　Ｇ、らの「ホモ　
トランスプランテーション・オブ・アイソレーテッド・
エビフィシアル・アンド・アーテイキュラー・カーティ
ラージ・コンドロサイト・オントウ・ジヨイント・サー
フエーシズφオブφラビツツ（ＨＯＩＯｔｒａｎＳｌ）ＩａｎｔａｔｌＯｎ　ｏｆ　
＋ｓｏ＋ａｔｅｄｅｐｉｐｈｙｓｅａｌａｎｄ　ａｒｔ
＋ｃｕ＋ａｒ　Ｃａｒｔｉｌａ（ｌｅ　ｃｈｏｎｄｒｏ
ｃｙｔｅｓ　ｏｎｔ。

Ｊｏｉｎｔ　５ｕｒｆａｃｅｓ　ｏｆ　ｒａｂｂｉｔｓ
　）　、ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ）　　（１９７１）
　、Ｄａｎｔｌｅｙ、Ｇ、らの「アイソレーテッド・エ
ビフィシアル・コンドロサイト・アログラフト・オント
ウ・ジヨイント・サーフェイス（Ｉｓｏｌａｔｅｄ　Ｅ
ｐｉｐｈｙｓｅａｌ　ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅａｔｌｏ
ａｒａＨｏｎｔｏ　ｊｏｉｎｔ　５ｕｒｆａｃｅ）−ア
ン・エクスペリメンタル・スタデイ・イン・ラビツツ（
Ａｎｅｘｐｅｒ＋ｍｅｎｔａ＋　　５ｔｕｄｙ　　ｉｎ
　　ｒａｂｂｉｔｓ　　）　　、およびＨｅｌｂｉｎｇ
、Ｇ、らの［イン・ビトロ・ウンターズツフンゲン・ア
ン・イゾリールテンφコンドロツイテン・ツール・プロ
グノーゼ・７オン・クノル　ベルトランスプランテン（
ｔｎ　ＶｉｔｒＯＵｎｔｅｒＳｕＣｈｔｌｎ！１ｌ１３
ｎ　ａｎ　１ｓｏｌｌｅｒｔｅｎ　ＣｈＯｎｄｒＯＺＶ
ｔｅｎＺｕｒ　Ｐｒｏ（ｌｎＯ８ｅ　ＶＯｎ　ＫｎＯｒ
ＤｅｌｔｒａｎＳＥ）ｌａｎｔｌ）　、ヘルフエテイ・
シミルルギア・アクタ（Ｈｅ１ｖ、Ｃｈｉｒ。

Ａｃｔａ）４６：　２１　（１９７９）ｔ’ある。

米国特許第４，６４２．１２０号明１ＩＩに指摘された
ように、かつて細胞の壊死を避けるためにゲル１−当た
り約５００．０００個のｍ胞の軟骨細胞濃度について限
界が認められるべきであると考えられた。また、１１Ｉ
！当たり僅かに５単位〜５０単位のトロンビンおよび約
２５■／ｍｌ〜８０１１９／ｍｌのフィブリノーゲンを
用いるべきであり、ゲルの硬化は５０単位／ｍｌ未満に
保たれなければならないトロンビンの濃度によって決定
される。これらの関係およびパラメーターは増殖速度お
よび能力および特に大欠損において移植組織が適当な表
現型表示に熟成および変換する能力を限定するこれ以上
の研究に見られる。従って、関節軟骨の補修に対するこ
のアプローチの拡張によって、新しい組成物および操作
が必要である。

発明の要約骨格組織の再生用の本発明による組成物は、軟骨形成表
現型を示すＩ［ｌ胞を生成する細胞培養物を用いる。こ
れらとしては、骨髄由来軟骨細胞および筋肉線雑芽１１
１０１由来軟骨細胞および胚性軟骨細胞がある。主に１
０％〜２０％の血清の形の生長因子を、培地に用いて、
細胞増殖が容易になる。

組成物中の生体再吸収性固定化ビヒクル（ＢＲＩＶ）は
、血清約１５％〜３０％、フィブリノーゲン１００ｑ／
ｍｌ〜１５０ａｙ／ｘｉ！、トロンビン　６０単位／ｍ
ｌ〜９０単位／ｍｌ１塩化カルシウム（Ｃａ　ｃ、２）
　６　ｏ１＋およびアプロトニン２０００＊位／ｍｌ（
ＫＩＵ）を含む。移植組織中の［１１１１６ｅｆ、８０
Ｘ１０６個／Ｉｄ　ＢＲＩｖ〜１６０Ｘ１０６個／ｍｌ
　　ＢＲＩＶの濃度である。

得られた組成物は、生体内で一層＾速における細胞増殖
を可能にし、−層迅速に成熟し、次いで周囲の軟骨およ
び骨構造と組織的一致に一層容易に変換する。

の　　　　　１本発明は、軟骨および骨における欠損の補修における移
植組成として用いる組成物を指向している。組成物は、
トリプシン処理および組織の破壊による適当なｍ胞の単
離によって製造される。細胞は、適当な培地上で培養さ
れ、収穫され、次いでフィブリノーゲンをベースとする
生体再吸収性固定化ビヒクル（ＢＲＩＶ）と組み合され
る。包埋されたｌＩｗ！ｉを有するＢＲＩＶゲル組成物
は、直ちに利用でき、低温器中で限られた時間（２日〜
３日）貯蔵でき、３年まで低温保存し、あるいは収穫さ
れた細胞は、深冷および使用直前に解凍することによっ
て長時間保存でき、次いで望まれるゲル組成物に包埋で
きる。移植組織を利用する場合、損傷した軟骨および骨
を手術により切除し、ゲルをフィブリノーゲンの溶液に
浸漬し、移植の部位にトロンビンの溶液を噴霧し、次い
でゲル移植組織を欠損または損傷された部位に圧入する
。

利用する細胞は、骨髄プロゲニタール細胞であるのが好
ましいが、筋肉線維芽細胞由来の胚性細１および軟骨細
胞または他の間菓由来の細胞も使用できる。骨髄前駆細
胞または筋肉線維芽細胞由来軟骨細砲によって、患者自
体は、適当な早期に供与体となることができ、自己免疫
応答の機会が一層少ない利点が得られる。

プラスチック上の細胞の培養によって、細砲増殉および
望まれる細胞型の選択に適当な生長環境が与えられる。

培地はウシ胎児血清１０％〜２０％を含有し、細胞の増
殖を容易にすることが判明するＩＧＦ　　　ＦＧＦ　　
　ＴＧＦＢ、ＰＤＧＦな工・　　　■・どの生長因子または任意の他の生長因子を任意に含有し
てもよい。細胞は、純粋な線維芽Ｉｆ胞様細Ｉｌｌ集団
が得られるまで継代培養される。純粋な線維芽細胞様細
胞集団をトリプシン処理し、次いで３×１０６個／ｍｌ
培地〜８Ｘ１０６個／ｊ１１！培地の密度で懸濁培養し
、次にウシ胎児血清（Ｆ、Ｃ。

Ｓ、＞１０％およびアスコルビン酸ナトリウム５０μｇ
／Ｉｄを有するＦ−１２培地（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ、）中
の軟質寒天上で培養する。数日後、線維芽細胞は３０個
〜６０個の細胞の集塊にある。

あるいは、細胞をトリプシン処理し、次いで単細胞懸濁
液を２×１０５個／ｍｌ〜４Ｘ１０５個／ｍｌの密度で
軟質寒天のＨａｍ　　Ｆ−１０培地（Ｓｉｇ−ａ　Ｃｏ
、　）上で培養する。アスコルビン酸ナトリウム　３０
μ９／ＣＣ〜５０μ９／ｃｃを培地に毎日添加する。

移植組織に用いられる細胞を生体再吸収性固定化ビヒク
ル（ＢＲＩＶ）、粘弾性、生体内分解性、生体親和性、
再吸収性マトリックスに、濃度８０Ｘ１０６１／ｍｌ　
　ＢＲＩＶ　〜１６０Ｘ１０６１ｍＭ／ｍｌ　　ＢＲＩ
Ｖにおいて包埋する。ＢＲＩＶ組成物は、栄養液および
栄畏剤の良好な密着性および選択的浸透性を与える。ま
た、ＢＲＩＶゲルは、細胞移動を機械的に防止する。さ
らに欠損部位における軟骨細胞固着の他に、ＢＲＩＶは
、線維芽細胞浸透および増殖を防止しながら軟骨細胞の
生長および分化状態を維持して、適切な細胞外環境とし
ても有効に働く。

ＢＲＩＶの組成は、血清約１５％〜３０％、フィブリノ
ーゲン１００ｑ／ｍｌ　〜１５０１９／ｍｅ、トロンビ
ン　Ｃ０単位／ｌｌｅ〜９０単位／ｍｌ、塩化カルシウ
ム（ＣａＣｌ２）６０ｍＭ、およびアプロトニンのよう
な族プロテアーゼを含む。ＢＲＩＶ移植組成物は、ウシ
胎児血Ｗ４２０％、フィブリノーゲン１５０１１１１ｆ
ｆ／ａｄ、ＣａＣＪ２６０１Ｈ中のトロンビン　９部単
位／ｍ１およびアプロトニン２０００単位／ｍｅ（ＫＩ
ＬＪ＞を含むのが好ましい。

ＢＲＩＶに利用する血清はウシ胎児血清、第２三か１期
からの臍帯血清、または馬血清であり得るが、ウシ胎児
血清が好ましい。一般にマトリックスの迅速溶解を防止
するために天然非血漿プロテアーゼ阻害剤を用いる。多
糖阻害剤と、血漿プロテアーゼ阻害剤および（または）
合成プロテアーゼ阻害剤の組み合せを使用できる。適当
なプロテアーゼ阻害剤は、約２００■／ＩＩ！ゲル〜４
００■／ｍｌゲルの徨で用いられるε−アミノカブＯン
酸および約２００ｍｇ／ｍｌゲル〜４００ｑ／ａＩｅゲ
ルの量で用いられるトラネキサム８１（ｔｒａｎｅｘｅ
ｍｉｃａｃｉｄ）のような化学阻害剤である。多糖阻害
剤も使用できる。また、抗トリプシン（鶏卵白、Ｓｉｇ
ｍａ　、　［１型）のような天然非血漿プロテアーゼ阻
害剤または適当な合成プロテアーゼ阻害剤を使用しても
よい。また血漿プロテアーゼ阻害剤を利用してもよい。

本発明の生体移植組織は、種々の方法で利用できる。新
たに調製された移植組織（包埋された細胞を含有するＢ
ＲＩＶ組成物）は、損傷部位または欠損に直接適用でき
る。さらに、包埋された細胞を有するＢＲＩＶ組成物は
、Ｆ−１２培地（Ｓｉｕａ　Ｃｏｍｐａｎｙ　）および
ウシ胎児血清１０％をもって被覆し、次いでＣ０２定温
器中で約３７℃において２日〜３日間貯蔵する。さらに
、移植組織は、解凍し、次いでＢＲＩＶ中に包埋された
液体窒素中の低温保存細ｍ＜ウシ胎児血１９０％および
ＤＭＳＯ　　１０％）、（３年まで低温保存）から製造
できる。好ましい゛選択として、細胞は遠心分離によっ
て採取でき、しかもＢＲＩＶに包埋されたＩｔ胞を有す
る完全移植組織は、−層長期間液体窒素中に低温保存で
きる（ウシ胎児血清９０％およびジメチルスルホキシド
（ＤＭＳＯ）１０％）。この場合の移植組織を、手術室
において解凍し、次いで直ちに移植する。移植組織は容
積の１部を充てんする骨節または代用骨を任意に含有し
てもよい。

移植組織を利用する場合、ａｍ部位または欠損にトロン
ビン溶液を噴霧し、次いで細胞を含有するＢＲＩＶ基質
を、フィブリノーゲンおよび抗プＯテアーゼを含有する
溶液に浸漬する。欠損を充てんするように移植組織をａ
ｍ部位または欠損に圧入する。トロンビン溶液は、Ｃａ
Ｃｌ２６０１Ｈ中にトロンビン　９０単位／ｍｌを含む
。

移植後４８時間以内に、軟骨細胞増殖が見られる。２週
間後、硝子質軟骨マトリックスがこれらの細胞を囲む。

８週間以内に、欠損は、界面に繊維質組織を形成せずに
隣接軟骨と円滑に一体化する硝子質軟骨で完全に充てん
される。補修組織における細胞含量およびプＯチオグリ
カン合成速度は４か月間高く、次いで周囲軟骨の水準ま
で徐々に減退する。移１６か月後、骨化前線以下の水準
における軟骨性補修組織は、脈管要素および軟骨の骨変
換による浸透を示す。移植１３か月後、骨化前線下の全
移植組織は骨質要素に変換し、一方、移植組織の関節部
分は、元の軟骨の全性質をもって軟骨性である。移植組
織の免疫源拒絶反応または変性変化の徴候は認められな
い。逆に、移植された部分の関節表面は元の表面よりも
若く見える。

本発明の組成物により、生体内で一１高速における細胞
増殖が可能になる。移植組織の細胞は一層迅速に成熟し
、次いで周囲の軟骨および骨組織と組織学的同一に一層
容易に変換する。移植の２か月以内に、欠損は、活性増
殖細胞で適切に充てんされ、次いで縁において、Ｔ／ｓ
雑軟骨または他の軟組織とは良く一体化しない。２か月
〜６か月において、骨軟骨連結下の全移植組織は、骨に
変換し、一方関節軟骨はその軟骨性を保つ。移植組織の
生体内分解性ＢＲＩＶは再吸収された。

最良態様を含む下記の特別の例は本発明をさらに具体的
に説明するために使用できる。例は記載のように製造お
よび試験された。

例１自己または相同性骨鑓は、腸骨稜または脚管がら青虫検
針を用いる吸引によって得られる。吸引された細胞は、
トリプシン０．２５％を含有するリン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）に注入し、次いで逐次１７ゲージ、１３ゲー
ジおよび２０ゲージの針を通して注入して、単＠脂懸濁
液を得る。−層高ゲージの針は若干の細胞破壊を誘発す
ることが分かる。Ｉ細胞を１５％Ｆ、Ｃ，Ｓ、を有する
ＢＧＪｂ培地（Ｇ　Ｉ　ＢＧＯ）を供給した１００ｄの
組織培りＩｌ上に密度５０Ｘ１０６個〜１００ｘ１０６
個において平板培養する。培地は毎日、または細胞の増
殖速度により必要に応じて取り替える。培地は、細胞の
増殖を容易にすることが分かるＩＧＦ　　　ＩＧＦ　　
　ＴＧＦＢ、ＰＤＧＦのよ工・　　　■・うな生長因子または任意の他の生長因子によって補足さ
れる。細胞は、毎週継代培養され、５回〜６回継代培養
侵に、はぼ純粋な線雑芽細胞ストローマ細胞集団が得ら
れる。この細胞集団を、次いでトリプシン処理し、次に
密度３Ｘ１０６個／Ｉ！！培地〜８Ｘ１０６個／ｍｌ培
地において懸濁液培養物に入れ、次に毎日培地に加える
Ｆ、Ｃ．Ｓ．１０％およびアスコルビン酸ナトリウム　
５０μ９／Ｉｄを有するＦ−１２培地（Ｓｉ（ｌｌａ　
Ｃｏ、　）中の軟質寒天上で培養する。線雑芽細胞スト
ローマ細胞は直ちに集合を開始し、しかも３日〜７日後
に、細胞はほとんど３０〜６０個の集塊にある。全集塊
は分析用組織化学および免疫組織化学プローブを用いて
求められる軟骨原性表現型を示す。

母層由来軟骨ＳＷＡはこの例において好ましいが、自己
または相同性源の軟骨細胞または遺骨細胞あるいは相同
コミツテッド軟骨ＩＩ胞または問菓源の任意の他のプロ
ゲニタール細胞を使用し得る。この初期の配合物は、軟
骨形成または骨形成表現型を示す集団の精製、増殖およ
び操作を含むことが分かる。さらにとりわけ、増殖細胞
は貴簡ストローマ細胞、胚性始動軟骨細胞および任意の
未分化門葉Ｉ胞を含む類からのものである。

細胞を生体内分解性粘弾性マトリックスに混入するため
に、細胞の得られたペレットをフィブリノーゲン（１５
０１／ｍｌ）およびウシ胎児血ｒＲ２０％および商標「
ＴｒａｓｙｌｏｌＪ　　（２０００Ｋｌｕ／＋ｄ）の下
に入手し得るアプトニンまたは他の抗プロテア−ぜを含
有する少容畿のリン酸塩緩衝生理食塩水に再懸濁する。

溶液は、細胞（１度８０Ｘ１０　　ａｉ１／ｍｌ〜１６
０Ｘ１０’ｌｌ／ａ！（７）ｉＩｆｉ）、フィブリノー
ゲン、血Ｗ４１５％〜３０％および杭プＯテアーゼを含
有し、しかも溶液Ａと呼び得る。

この例においては、とりわけＢＲＩＶ　　１２０ｘ１０
６個／ｍｌ、ウシ胎児血清２０％、フィブリノーゲン１
５０ｑ／ｍｌ、６０ｍＭ　　ＣａＣｌ２中（７）トロン
ビン９０単位／ｍｌおよびアプロトニン２，０００単位
を用いる。溶液Ｂと呼ぶ第２溶液はトロンビン（６０ｍ
Ｍ　　Ｃａ　ｃ、２中９０単位／ｍｌ）を含む。これら
の溶液を混合して、溶液Ａ対Ｂの比を３：１（ｖ／ｖ）
に保つ。移植組織をＦ、Ｃ。

Ｓ、１０％を含有するＦ−１２培地に浸漬し、次いで直
ちに使用し得る。あるいは、移植組織は、Ｆ、Ｃ．Ｓ．
９０％およびＤＭＳＯ１０％（または任意の他の低温保
存方式）中で低温保存してもよい（例えばＬＮ２中）。

移植において、欠損にトロンビン溶液を噴霧し、次いで
、移植組織を欠損に圧力はめする。

数種（鳥類および哺乳類）の骨―由来軟ａｍ胞および胚
由来軟骨細胞を用いる肉眼観察、組織学的切片および生
化学試験による実験において集めたデータから、２か月
以内の移植部位において欠員は１×１１節表面において
完全な合同および界面における線維軟骨または他の軟組
織とは完全に一体化せずに適切に充てんされる。２か月
〜６か月において、関節軟骨はその軟骨性を保ちながら
、骨軟骨連結下の全移植組織は骨に変換される。長期追
跡期間後に、変性変化または免疫拒絶反応は認められな
い。

この例において、血清は、ウシ胎児血清が優先的である
が、第２三か同期からの映帯血清または馬血清あるいは
これらの任意の組み合せを使用できる。ｍ胞外マトリッ
クスの使用は必要ない。

し出発材料として、艮骨の前端（脛骨、大腿骨、上腕骨）
を用いた。胚性軟骨の単離操作は、前端のトリプシン処
理（１％豚ヒトリプシン、３７℃における６０分温装、
各１０分閤隔の２分湯巻を起こさせ、その後テフロンの
流路をつけたホモジナイザーによる緩やかな機械的解砕
を含む。トリプシン活性は抗たん自分解酵素物質を含有
する血清によって求められる。得られた単ＩＩ胞懸濁液
は、次イテ密［［２Ｘ１０５１１／ｍｌ　〜４Ｘ１０５
１＆Ｉ／ｍｌにおいて軟質寒天（Ｈａｒｎ　　Ｆ−１２
中のＢａＣｔＯ−ａｇａｒｏ、　５％）で被覆された平
板上のＨａｍ　　Ｆ−１２培地（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ、　
）中で数日間（４日〜７日）接種する。アスコルビン酸
ナトリウム５０μ９の量を毎日培地に加える。この生長
期中に、Ｉ！維芽＊ａはほとんど死滅し、しかも軟骨細
胞強化が起こる。細胞は、遠心分離によって捕集し、次
いで新グラフトとしてＢＲＩＶに直接使用する。

あるいは、完全グラフトを、低温保存するか、または細
胞を液体窒素中において一層長期闇低温保存（ウシ胎児
血清（Ｆ、Ｃ，Ｓ、）１０％およびジメチルスルホキシ
ド（ＤＭＳＯ））　、次いで後にＢＲＩＶ中に包埋して
もよい、、ｌｌｌ胞を採取し、次いで濃度５ｏｘｉｏ６
個／Ｉｄ　　例１と同じ粘弾性生体内分解性マトリック
スル１６０×１０６個ＺＩＩＩ　　例１と同じ粘弾性生
体内分解性マトリックスにおいて包埋した。得られた結
果は例１のものと同等である。

旌ｌ自己または相同筋肉を、局部麻酔下に開放生検によって
得る。この筋肉を組織の微小片に細断し、次いで時折渦
巻を起こさせながら、Ｐ、Ｂ、Ｓ。

中トリプシン０．５％およびエチレン　ジアミン四酢１
！　（Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ａ、”）中でトリプシン処理する。

このトリプシン処理されたｌ１ｌＩＩｉｌを、次いで５
３ミクロン１４ｉｔｅＸフイルターでろ過する。次にト
リプシン処理を、Ｆ、Ｃ．Ｓ．１５％を含有する　Ｍ、
Ｅ、Ｍ、（最小必須）培地（ＧＩＢＣＯＣＯ，＞によっ
て停止する。遠心分離後、細胞のベレットをＦ、Ｃ，Ｓ
、１５％を含有する最小必須培地で洗浄する。次いで細
胞を組織培養皿１００顯当たり５×１０　個〜１ｏｏｘ
ｉｏ’個で平板培養し、次にＦ、Ｃ，３，１５％を有す
るＭ。

Ｅ、Ｍ、培地をもって毎日維持する。細胞をＦ。

Ｃ．Ｓ．１５％を有するＭ、Ｅ、Ｍ、培地上で毎週継代
培養し、３回継代培養後、純粋な線維芽細胞様集団が得
られる。次いで、この細胞集団をトリプシン処理し、次
に濃度３Ｘ１０６個／ｍｌ培地〜８Ｘ１０６個／ｍｌ培
地で懸濁培養し、次いで培地に毎日添加するＦ、Ｃ．Ｓ
．１０％およびアスコルビン酸ナトリウム　５０μｇ／
ｍｅを有するＦ−１２培地（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ、　）中
の軟質寒天上で培養する。線雑芽細胞は直ちに集合を開
始し、３日〜７日後に、細胞はほとんど３０個〜６０個
の集塊にある。全集塊は分析用組織化学および免疫組織
化学プローブを用いて、求められる軟骨形成表現型を示
す。

筋肉由来軟骨細胞は、この例において好ましいが、骨箱
由来軟骨Ｉｌｌ胞または始動軟骨細胞も使用できる。細
胞を、遠心分離によって採取し、次いで濃度８０ｘ１０
６個／ｍｌ　　例１におけると同じ粘弾性生体内分解性
マトリックス（ＢＲＩＶ）〜１６０Ｘ１０６個／ｍｌ　
　例１におけると同じ粘弾性生体内分解性マトリックス
（ＢＲＩＶ）で直接に包埋する。あるいは、細胞を液体
窒素中で長期間低温保存（Ｆ、Ｃ．Ｓ．９０％およびＤ
ＭＳＯ１０％中）し、使用前に解凍し、濃度　８０×１
０　個／ｍｌ〜１６０Ｘ１０６個／ＩｄでＢＲＩＶ中に
包埋し、次いで用いる。これ以上の別法として、全移植
組織をＦ、Ｃ．Ｓ．９０％およびＤＭＳＯ　　１０％中
に低温保存して、細胞をＢＲＩＶに包埋し、次いで手術
室中において使用前に解凍できる。、＃Ｒられた結果は
例１のものと同等である。

の骨欠損を再生するために、３法の１つを用いてもよい。

４Ａ、　　長さ２１：１〜４１の小欠損には、例１、例
２または例３に提案された移植組織を用いる。

４Ｂ、　　大きい欠損には、天然骨のものに近い生物力
学的性質を有する支持マトリックスとして用いられる代
用骨の組成物グラフトを用いる。細胞は生体内分解性フ
ィブリノーゲンをベースとする接着剤を介してこのマト
リックスと結合する。

４Ｇ、　　骨鑓ストローマ細胞は生体外で誘導して造骨
細胞表現型を示し、しかも４Ａまたは４Ｂにおけるよう
に直接使用して骨欠損を修正できる。

（これは前脳が骨欠損の患者由来の自己群にのみ使用で
きる。）Ｌ払骨または関節軟骨の外ａ！（骨折）または病原（腫＊＞
あるいは変性疾患欠損を清浄にし、次いで幾何学形状（
立方形または円筒形）に付形する。

関節表面の場合、全操作は、関節鏡によって実施できる
。

損傷された部分を製造した後、同一形状の冷凍移植組織
（例１、例２または例３において詳述されたように製造
）を、３７℃において５分〜１０分生理食塩水に入れる
ことによって迅速に解凍する。

次いで、この移植組織をフィブリノーゲンの溶液に入れ
、次いで移植部位にトロンビン溶液を噴霧する。この移
植組織を、ここで欠損に圧ノＪばめする。関節欠損にお
いて連続受動運動は直ちに開始する。

大欠損の場合、適当な形状の代用骨材料中に（上に）包
埋された、生体移植組織の複合グラフトを使用できる。

この移植組織は、特注または商業標準型である。

種々の代替および修正は前記に提案されたが、本発明は
これに限定されず、添付特許請求の範囲によるすべての
形態および変形を含むと理解される。

Claims

【特許請求の範囲】（１）自己または相同源の骨髄由来軟骨細胞もしくは造
骨細胞、または相同コミツテツド軟骨細胞、あるいは自
己または相同筋肉線維芽細胞由来軟骨細胞あるいは間葉
源からの任意の他のプロゲニタール細胞およびフィブリ
ノーゲン、トロンビン、ＣａＣｌ＿２、プロテアーゼ阻
害剤および血清約１５％〜３０％からなる生体分解性、
生体親和性、生体再吸収性固定化ビヒクル（ＢＲＩＶ）
接着剤膠からなることを特徴とする、移植による関節軟
骨および骨の再生用組成物。（２）細胞８０×１０＾６個／ｍｌＢＲＩＶ〜１６０×
１０＾６個／ｍｌＢＲＩＶを含有する、特許請求の範囲
第１項に記載の組成物。（３）前記血清１５％〜３０％が、第２三か月期からの
ウシ胎児血清または臍帯血清あるは馬血清またはこのよ
うな血清の任意の組み合わせを含む、特許請求の範囲１
項に記載の組成物。（４）細胞が、培養中において誘発されて増殖でき、し
かも変換されて軟骨形成または骨形成表現型を示し得る
、濃度１２０×１０＾６個／ｍｌＢＲＩＶにおいて骨髄
由来軟骨細胞のものである、特許請求の範囲１項に記載
の組成物。（５）細胞が、培養中において誘発されて増殖でき、し
かも変換されて軟骨形成または骨形成表現型を示し得る
、濃度１２０×１０＾６個／ｍｌＢＲＩＶにおいて筋肉
線維芽細胞由来軟骨細胞のものである、特許請求の範囲
第１項に記載の組成物。（６）プロテアーゼ阻害剤が多糖類、血漿プロテアーゼ
、合成および天然非血漿プロテアーゼ阻害剤からなる群
から選ばれた、特許請求の範囲第１項の組成物。（７）ａ、特別の軟骨形成または骨形成表現型を示す細
胞集団の精製、増殖および操作およびｂ、細胞を、血清少なくとも約１５％〜３０％を含む生体再吸収性固定化ビヒクル（ＢＲＩＶ）に包埋することを特徴とする、骨格組織移植組織の製造方法。（８）増殖細胞が、骨髄ストローマ細胞、胚性始動軟骨
細胞または筋肉線維芽細胞由来軟骨細胞および任意の未
分化間葉細胞からなる群から選ばれた、前記特許請求の
範囲第７項に記載の方法。（９）細胞の濃度が、８０×１０＾６個／ｍｌＢＲＩＶ
〜１６０×１０＾６個／ｍｌＢＲＩＶであり、但しＢＲ
ＩＶはフィブリノーゲン１００ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ
／ｍｌおよびトロンビン６０単位／ｍｌ〜９０単位／ｍ
ｌを含み、さらにアプロトニン約２，０００単位／ｍｌ
を含む、前記特許請求の範囲第８項に記載の方法。（１０）細胞が適当に付形された代用骨中のＢＲＩＶに
包埋されている、前記特許請求の範囲第７項に記載の方
法。（１１）ａ、自己骨髄ストローマ細胞を含む増殖細胞集
団を培養し、ｂ、濃度２×１０＾６個／ｍｌ培地より過剰の軟質寒天
上の懸濁液中においてこれらを少なくとも５日間操作し、ｃ、細胞を収穫し、ｄ、細胞を、濃度８０×１０＾６個／ｍｌ（血清１０％
より過剰、フィブリノーゲン１００ｍｇ／ｍｌおよびＣａＣｌ＿２４０ｍＭより過剰中の
トロンビン６０単位／ｍｌおよびアプロトニン２，０００単位を含む）生体再吸収性固定化ビヒクル（ＢＲＩＶ）より過剰において包埋し、ｅ、患者の骨格組織の損傷部分を除いて清浄な幾何学的付形欠損を残し、次いでｆ、欠損を、少なくとも組み合された細胞濃度およびＢＲＩＶを含む移植組織をもつて充てんすることを特徴とする、患者の骨格組織の再生方法。（１２）ＢＲＩＶが血清１５％〜３０％およびＣａＣｌ
＿２６０ｍＭより過剰中のトロンビン６０単位／ｍｌを
含む、前記特許請求の範囲第１１項に記載の方法。（１３）生体移植組織を、Ｆ．Ｃ．Ｓ．９０％およびＤ
ＭＳＯ１０％を含有し、かつ血清約２０％が存在する、
保存培地をもつて調製後、低温条件下に貯蔵する、前記
特許請求の範囲第１１項に記載の方法。（１４）収穫された細胞を、Ｆ．Ｃ．Ｓ．９０％および
ＤＭＳＯ１０％を含有する保存培地をもつて調製後、低
温条件下に貯蔵し、次いで後にＢＲＩＶに包埋する、前
記特許請求の範囲第１１項に記載の方法。（１５）補修する骨格組織が関節軟骨を含み、しかも手
術する関節を移植後連続受動運動に供する、前記特許請
求の範囲１１項に記載の方法。（１６）血清がウシ胎児血清、第２三か月期からの臍帯
血清および馬血清からなる群から選ばれた、特許請求の
範囲第１１項に記載の方法。（１７）ａ、自己筋肉線維芽細胞由来軟骨細胞を含む増
殖細胞集団を培養しｂ、細胞を、懸濁液中で操作し、次いで細胞を濃度２×１０＾６個／ｍｌ培地より過剰において軟
質寒天上で少なくとも３日間培養し、ｃ、細胞を収穫し、ｄ、細胞を、濃度８０×１０＾６個／ｍｌ生体再吸収性
固定化ビヒクル（ＢＲＩＶ）より過剰において包埋し、ＢＲＩＶは、血清１０％より過剰、フィブリノーゲン１００ｍｇ／ｍｌ、Ｃ
ａＣｌ＿２４０ｍＭより過剰中のトロンビン６０単位／
ｍｌおよびアプロトニン２０００単位を含み、ｅ、患者の骨格組織の損傷部分を除いて、清浄な幾何学的付形欠損を残し、次いでｆ、欠損を、少なくとも組み合された細胞濃度およびＢＲＩＶを含む移植組織をもつて充てんすることを特徴とする、患者の骨格組織の再生方法。（１３）ＢＲＩＶが血清１５％〜３０％およびＣａＣｌ
＿２６０ｍＭより過剰中のトロンビン６０単位／ｍｌを
含む、前記特許請求の範囲第１７項の方法。（１９）生体移植組織を、ＦＣＳ９０％およびＤＭＳＯ
１０％を含有し、しかも血清約２０％が存在する保存培
地をもつて調製後に低温条件下に貯蔵する、特許請求の
範囲第１７項に記載の方法。（２０）収穫された細胞を、ＦＣＳ９０％およびＤＭＳ
Ｏ１０％を含有する保存培地をもつて調製後低温条件下
に貯蔵し、次いで後にＢＲＩＶ中に包埋する、前記特許
請求の範囲第１７項に記載の方法。（２１）補修する骨格組織が、関節軟骨および骨を含む
、前記特許請求の範囲第１７項に記載の方法。