DE69734218T2

DE69734218T2 - Gewebetransplantat aus der Magensubmukosa

Info

Publication number: DE69734218T2
Application number: DE69734218T
Authority: DE
Inventors: Stephen F. West Lafayette Badylak; Sherry L. Zionsville Voytik-Harbin; Andrew O. West Lafayette Brightman; Robert S. Brookston Tullius
Original assignee: Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 1996-12-10
Filing date: 1997-12-10
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2017-12-11
Also published as: DE69734218D1; CA2267310C; EP0946186B1; AU5526598A; JP2001505919A; JP4302188B2; DE69720252T2; DE69720252D1; AU720274B2; CA2267310A1; WO1998025636A1; US6099567A; EP0946186A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung einer Gewebetransplantatzusammensetzung. Insbesondere richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Herstellung nicht-immunogener Gewebetransplantatzusammensetzungen enthaltend Magensubmukosa, die verwendet werden können, um endogenes Gewebewachstum zu fördern.
Hintergrund und Zusammenfassung der Erfindung
Es ist bekannt, dass Zusammensetzungen, die die Tunica submucosa des Darms von warmblütigen Wirbeltieren enthalten, vorteilhaft als Gewebetransplantatmaterialien benutzt werden können. Siehe dazu US-Patent Nr. 4.902.508 und 5.281.422. Die in diesen Patenten beschriebenen Gewebetransplantatzusammensetzungen sind charakterisiert durch hervorragende mechanische Eigenschaften einschließlich einem hohen Berstdruck und einem effektiven Porositätsindex, was solchen Zusammensetzungen erlaubt, gewinnbringend als Gefäß- und Bindegewebstransplantatkonstrukte benutzt zu werden. Bei Verwendung in dieserlei Anwendungen treten die Transplantatkonstrukte nicht nur auf, um als eine Matrix für die Wiederbildung der durch die Transplantatkonstrukte ersetzten Gewebe zu dienen, sondern veranlassen und rufen in der Tat solch eine Wiederbildung von endogenem Gewebe hervor. Gemeinsame Ereignisse zu diesem Neugestaltungsprozess enthalten: weitverbreitete und sehr schnelle Neovaskularisation, Vermehrung von mesenchymalen Wucherungszellen, Bioabbau/Resorption von implantiertem submukosalen Darmgewebematerial und Mangel an immunologischer Abstoßung.
Ebenfalls ist bekannt, dass die Darmsubmukosa durch Zerkleinerung und/oder enzymatischem Verdau ohne einen Verlust von deren offensichtlichen biotropischen Eigenschaften zur Nutzung in weniger invasiven Verabreichungsmethoden (z.B. durch Injektion oder topische Anwendung) zu Wirtsgeweben bei Bedarf der Wiederherstellung fluidisiert werden kann. Siehe US-Patent Nr. 5.275.826.
Es wurde viel ergänzende Untersuchungsarbeit geleistet, um andere natürliche oder synthetische Materialien mit diesen erforderlichen Eigenschaften zur Verwendung als Gewebetransplantat zu finden. Überraschenderweise wurde gefunden, dass Magensubmukosa, die durch die Ablösung des Magengewebes von warmblütigen Wirbeltieren hergestellt wurde, ähnliche mechanische und biotropische Eigenschaften zu denen aufweist, welche über submukosales Darmgewebe berichtet wurden. Auch kann es in den meisten, wenn nicht gar in allen Anwendungen, welche zuvor für die Darmsubmukosa angeführt wurden, ersatzweise für Darmsubmukosagewebe eingesetzt werden.
Die Zusammensetzung des Gewebetransplantats beinhaltet vom Magengewebe eines warmblütigen Wirbeltieres erhaltene Magensubmukosa. Die Magenwand ist zusammengesetzt aus folgenden Schichten: Tunica mucosa (einschließlich einer Epithelschicht, einer Tunica propria Schicht, die aus netzartigem oder feinem areolaren Gewebe besteht, und einer Drüsenchicht), der Tunica submucosa Schicht (bestehend aus der areolarem Gewebe ohne Drüsen), der Tunica muscularis Schicht (bestehend aus drei Muskelschichten) und der Serosa (einer Schicht aus Mesothelium außerhalb des losen Bindegewebes, welches die Muskelschichten umkleidet). Blutgefäße, lymphatisches Gewebe und neurologisches Gewebe durchdringen ebenfalls die Magengewebe, einschließlich der Tunica submucosa.
Magensubmukosagewebe in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung enthält vom Drüsenteil der Tunica mucosa und den glatten Muskelschichten der Muscularis externa delaminierte Magensubmukosa. Es wurde nachgewiesen, dass die Zusammensetzung die Fähigkeit hat, die Neugestaltung von Bindegewebe und Wundheilung in einer Art und Weise sehr ähnlich der Darmsubmukosa – wie beschrieben in US-Patent Nr. 5.275.826 – zu induzieren. Speziell die Zusammensetzung der Magensubmukosa verursacht Zellvermehrung in vitro, unterstützt Zellwachstum bei Benutzung als ein Wachstumsträgermaterial und ruft die Bildung und die Reparatur von Bindegewebsstrukturen wie die Achillessehne bei Platzierung in xenogenen Wirtsspezies hervor. Die Magensubmukosa scheint nicht-antigenetisch zu sein und ruft Reaktionen in vivo hervor, die als anerkannte Komponenten der Wundheilung, wie Neovaskularisation, das zelluläre Eindringen, die Ablagerung von extrazellulärer Matrix und letztendlich Abbau und Ersatz des implantierten Materials durch Wirtsgewebe, gelten. Die vorliegende Transplantatzusammensetzung kann in einem Wirbeltierwirt implantiert oder injiziert werden, um die Reparatur oder den Austausch von beschädigtem oder defektem Gewebe hervorzurufen.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Die Transplantatgewebezusammensetzung umfasst die Magensubmukosa eines warmblütigen Wirbeltieres, die von benachbarten Magengewebeschichten delaminiert ist. Auf diese Weise beinhaltet die vorliegende Transplantatgewebezusammensetzung die Magensubmukosa, die von den glatten Muskelschichten der Muscularis externa und wenigstens dem luminalen Teil der Mukosalschicht eines Magensegmentes eines warmblütigen Wirbeltieres delaminiert ist. In einer Ausführungsform beinhalten die Zusammensetzungen des Magensubmukosal gewebes die Tunica submucosa und basilare Teile der Tunica mucosa des Magens eines warmblütigen Wirbeltieres. Typischerweise stellt die unten beschriebene Delaminationstechnik eine Gewebezusammensetzung bereit, die im Wesentlichen aus der Magensubmukosa besteht. Jene Zusammensetzungen werden hier im allgemeinen als submukosales Magengewebe in Bezug genommen.
Der Glykosaminoglykan(GAG)-Gehalt der Magensubmukosa wurde analysiert. Die Typen des GAG, die in der Magensubmukosa identifiziert wurden, beinhalten Heparin, Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat B und Hyaluronsäure. Im Gegensatz zur Darmsubmukosa, wurde in der Magensubmukosa kein Heparansulfat gefunden.
Der in einer Probe der Magensubmukosa vorliegende Wassergehalt variiert abhängig von den Bearbeitungsschritten, die nach der Gewebsdelamination angewendet wurden. Gemäß einer Prozedur wurde das Material zur eigenen „Entwässerung" für zehn Minuten auf eine feste Oberfläche gesetzt. Das Materialgewicht wurde anschließend bestimmt und das Material wurde einer mechanischen Wringmaschine zur Entfernung weiteren Wasserüberschusses vor dem Einfrieren und dem Gefriertrocknen unterzogen. Wiederholte Messungen an zwei getrennten Proben zeigten einen Wassergehalt, der im Bereich von ungefähr 80% bis ungefähr 94% lag. Die Höhe der Variabilität ergibt sich zweifellos aus der Veränderlichkeit der Bestimmung des anfänglichen „Nassgewichtes". Immerhin bleibt sicher festzustellen, dass der Wassergehalt der Magensubmukosa zwischen 80% und 95% liegt.
Die Zusammensetzung der Magensubmukosa dieser Erfindung ist typischerweise hergestellt aus dem Magengewebe, welches wiederum von Tieren gewonnen wurde, die für die Fleischproduktion herangezüchtet worden waren, einschließlich bei spielsweise Schweine, Rinder und Schafe oder andere warmblütige Wirbeltiere. Dieses Gewebe ist normalerweise ein verworfenes Nebenprodukt der Fleischproduktion. Auf diese Weise ergibt sich eine kostengünstige kommerzielle Quelle des Magengewebes für die Verwendung bei der Herstellung der Gewebezusammensetzungen im Zusammenhang mit dieser Erfindung.
Die Herstellung der Magensubmukosa aus einem Magensegment ist ähnlich der Prozedur zur Herstellung der Darmsubmukosa, im einzelnen dargelegt im US-Patent Nr. 4.902.508. Ein Segment des Magengewebes wurde zunächst einer Abtragung mit Hilfe einer longitudinalen Wischbewegung zur Entfernung äußerer Schichten (insbesondere der glatten Muskelschichten) und der luminalen Teile der Tunica mucosa Schichten unterworfen. Das erhaltene Submukosagewebe weist eine Stärke von ungefähr 100 bis ungefähr 200 Mikrometern auf und besteht vornehmlich (zu mehr als 98%) aus azellularem, eosinophil anfärbenden (HE-Färbung) extrazellulärem Matrixmaterial. Gelegentlich sind Blutgefäße und Spindelzellen übereinstimmend mit Fibrozyten zufällig über das Gewebe verstreut. Typischerweise wird die Submukosa für annähernd zwei Stunden mit Wasser ausgespült und wahlweise in einem gefrorenen hydratisierten Zustand gelagert, bis zur unten beschriebenen Benutzung. Delamination der Tunica submucosa von sowohl der Muscularis externa als auch wenigstens den luminalen Teilen der Tunica mucosa Schichten und Spülung der Submukosa stellt eine azelluläre magensubmukosale Gewebematrix bereit.
Fluidisierte Magensubmukosa kann nach einer Methode hergestellt werden, ähnlich der Präparation von fluidisierter Darmsubmukosa, wie beschrieben in US-Patent Nr. 5.275.826. Das Submukosagewebe wird zerkleinert durch Zerreißen, Schneiden, Mahlen, Scheren und ähnlichem. Mahlen der Submu kosa im gefrorenem oder gefriergetrocknetem Zustand ist bevorzugt, obwohl auch gute Resultate beim Behandeln einer Suspension von Submukosastücken im Hochgeschwindigkeit- (Hochscherungs-) Mischgerät und nachfolgender Entwässerung durch Zentrifugieren und Dekantieren des überschüssigen Wassers erreicht werden. Zusätzlich wird das zerkleinerte fluidisierte Gewebe durch enzymatischen Verdau der Magensubmukosa, einschließlich der Anwendung von Proteasen wie Trypsin oder Pepsin oder anderen geeigneten Enzymen wie einer Collagenase oder einer Glykosaminglykanase oder unter Anwendung eines Enzymgemischs, für einen ausreichenden Zeitabschnitt zur Auflösung des Gewebes und Bildung einer im wesentlichen homogenen Lösung aufgelöst.
Die submukosalen Magengewebezusammensetzungen dieser Erfindung sind geeignet für eine breite Vielfalt chirurgischer Anwendungen mit Bezug auf die Reparatur oder den Ersatz von beschädigtem Gewebe, einschließlich z.B. der Reparatur von Gefäß- und Bindegewebe. Bindegewebe zum Zwecke dieser Erfindung umfasst Knochen, Knorpel, Muskel, Sehnen, Bänder und Fasergewebe einschließlich der Dermalschicht der Haut.
In Zusammenhang mit der Erfindung wird das submukosale Magengewebe zur Herstellung der Transplantatgewebezusammensetzungen verwendet, die nützlich für die Veranlassung der Bildung von endogenem Gewebe an einer gewünschten Stelle in warmblütigen Wirbeltieren sind. Magensubmukosa enthaltende Zusammensetzungen können einem Wirbeltierwirt in einem Umfang verabreicht werden, der Wachstum des endogenen Gewebes an einer Stelle des Wirtes hervorruft, wenn dieses aufgrund der Anwesenheit eines beschädigten oder erkrankten Gewebes benötigt wird. Die submukosalen Magenzusammensetzungen können einem Wirt entweder in fester oder in Blattform durch chirurgische Implantation allein oder in Kombination mit anderen fachlich anerkannten Implantatzusammensetzungen o der in fluidisierter Form durch Injektion verabreicht werden.
In einer Ausführungsform können die vorliegenden submukosalen Magenzusammensetzungen in Blattform benutzt werden, um Gefäßtransplantate zu formen. Der Durchmesser des Transplantates sollte ungefähr derselbe sein, wie der Durchmesser des empfangenden Blutgefäßes. Dies wird erreicht, indem die Magensubmukosa manipuliert wird, um einen Zylinder mit annähernd demselben Durchmesser zu definieren, wie der des empfangenden Blutgefäßes, und Vernähen oder anderweitige longitudinale Sicherung des Transplantatgewebes, um das besagte Gefäßtransplantat zu bilden. Auf diese Weise kann z.B. ein Gefäßtransplantat durch Auswahl eines sterilen Glasstabes mit einem Außendurchmesser gleich dem des empfangenden Blutgefäßes hergestellt werden, wobei das Magensubmukosalblatt außen um den Glasstab gewickelt und das redundante Gewebe gerafft wird. Der gewünschte Lumendurchmesser wird durch Vernähen entlang der Länge des Transplantates (z.B. unter Verwendung zweier fortlaufender Nahtlinien oder einer einfachen unterbrochenen Nahtlinie) oder unter Verwendung anderer artverwandter Gewebesicherungstechniken erreicht. Ein beschädigtes oder erkranktes Blutgefäß wird chirurgisch unter Anwendung von standardisierten Gefäßchirurgietechniken durch das Gefäßtransplantat ersetzt.
In Übereinstimmung mit der Verwendung von Magensubmukosa als Gefäßtransplantatmaterial besitzt auch die Magensubmukosa mechanische Eigenschaften, die denen der Darmsubmukosa sehr ähnlich und höchst wünschenswert für solche Gewebetransplantatmaterialien sind, einschließlich eines niedrigen Porositätsindex und eines hohen Berstdrucks. Die Fachleute auf diesem Gebiet werden erkennen, dass das Gefäßtransplantatmaterial einerseits von genügend niedriger Porosität sein muss, um intraoperative Blutungen zu vermei den, andererseits auch von genügend hoher Porosität sein muss, um eine Extension eines neuentwickelten Vasa Vasorum durch das Transplantatmaterial zur Ernährung der luminalen Oberfläche erlauben zu können.
Die vorliegenden Magensubmukosasegmente können ebenfalls in Übereinstimmung mit dieser Erfindung als Gewebetransplantatkonstrukt zur Verwendung bei der Reparatur oder dem Ersatz von Bindegeweben bei Anwendung der gleichen Prozeduren, wie für die Verwendung der Darmsubmukosa in US-Patent No. 5.281.422 und 5.352.463 beschrieben, verwendet werden. Die Magensubmukosazusammensetzung kann in ihrer delaminierten, natürlichen Blattform verwendet werden, oder sie kann longitudinal oder lateral zur Formung von elongierten Gewebesegmenten geschnitten werden. Solche Segmente haben einen Zwischenbereich, gegenüberliegende Endbereiche und gegenüberliegende Lateralbereiche, welche zum chirurgischen Anheften an existente physiologische Strukturen unter Verwendung chirurgisch annehmbarer Techniken geformt werden können.
Die in Übereinstimmung mit dieser Erfindung gebildeten und verwendeten Transplantate unterliegen nach der Implantation einer biologischen Neugestaltung. Sie dienen als schnell vaskularisierte Matrix zur Unterstützung und zum Wachstum von neuem endogenen Bindegewebe. Im Fall der Verwendung als Gewebetransplantatmaterial, wurde die Magensubmukosa als trophisch für Wirtsgewebe entdeckt, mit welchen sie verbunden ist oder sonst wie in ihrem implantierten Umfeld assoziiert ist. Es wurde gefunden, dass das Transplantatmaterial umgewandelt wurde (resorbiert und ersetzt durch autogenes differenziertes Gewebe), so dass es die charakterisierenden Eigenschaften derjenigen/desjenigen Gewebe/s annimmt, mit welchen/welchem es an der Implantationsstelle assoziiert ist.
Die Anmelder erwarten, dass die Magensubmukosa als Sehnen- und Bänderersatz und zur Wiederherstellung derselben benutzt werden kann, wie es zuvor für die Darmsubmukosa bereits beschrieben wurde. Darüber hinaus wird das Magensubmukosamaterial für Anwendungen zum Sehnen- und Bänderersatz und andere Bindegewebswiederherstellungsanwendungen typischerweise konditioniert, wie in US-Patent Nr. 5.275.826 beschrieben, um die viskoelastischen Eigenschaften des Submukosagewebes zu ändern und die Dehnung (strain) des ursprünglich isolierten Magensubmukosagewebes zu vermindern. Der Ausdruck Dehnung, wie er hier verwendet wird bezieht sich auf den maximalen Betrag der Gewebeelongation vor dem Reißen des Gewebes, wenn das Gewebe unter angewendeter Last gedehnt wird. Dies wird als ein Prozentsatz der Gewebelänge vor der Belastung ausgedrückt. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform wird die Magensubmukosa, die sowohl von dem luminalen Bereich der Tunica mucosa als auch von den glatten Muskelschichten der Muscularis externa des Magens eines warmblütigen Wirbeltieres delaminiert ist, so konditioniert, dass sie eine Dehnung von nicht mehr als 20% hat. Das Submukosagewebe wird durch Strecken, chemische Behandlung, enzymatische Behandlung oder Exposition des Gewebes gegenüber anderen äußerlichen Faktoren konditioniert.
In einer Ausführungsform werden die Streifen des Magensubmukosagewebes durch longitudinale Dehnung des Submukosagewebes konditioniert, um ein Transplantatkonstrukt zu formen, welches eine Länge hat, die länger als die der Magensubmukosa ist, aus welcher das Transplantatkonstrukt geformt wurde, und ganz besonders durch Dehnung in longitudinaler oder lateraler Richtung, so dass die Streifen des Darmsubmukosagewebes eine Dehnung von nicht mehr als 20% haben.
Ein Verfahren zur „Konditionierung" des Gewebes durch Dehnung beinhaltet die Anwendung einer gegebenen Last auf die Magensubmukosa über drei bis fünf Zyklen. Jeder Zyklus besteht aus dem Anlegen einer Last an das Transplantatgewebe für fünf Sekunden, gefolgt von einer zehnsekündigen Relaxationsphase. Drei bis fünf Zyklen ergeben ein dehnungskonditioniertes Transplantatmaterial mit reduzierter Spannung. Das Transplantatgewebe fällt nicht zurück in seine ursprüngliche Größe; es verbleibt in „gedehnter" Dimension. Beispielsweise kann ein Magensubmukosasegment durch Anhängen eines Gewichts an besagtem Segment über einen Zeitraum konditioniert werden, der ausreichend ist, um ein Gewebe zu produzieren, welches eine Dehnung von weniger als 20% hat, z.B. zwischen 10% und 20%. Optional kann das Transplantatmaterial durch Dehnung in lateraler Richtung vorkonditioniert werden. Das Transplantatmaterial weist ähnliche viskoelastische Eigenschaften in longitudinaler und lateraler Richtung auf.
Das Transplantatsegment wird anschließend gemäß einem Ausführungsbeispiel in einer Vielzahl von Formen und Konfigurationen geformt, beispielsweise um als Bänder- oder Sehnenersatz oder als Flicken für eine gebrochene oder abgerissene Sehne oder ein Band zu dienen. Das Segment kann geformt und gebildet werden, um eine überlagerte oder gar mehrfach überlagerte Konfiguration an zumindest den gegenüberliegenden Endbereichen und/oder den gegenüberliegenden lateralen Bereichen zu ergeben, die gebildet wurden, um viele Schichten des Transplantatmaterials zu haben, um eine Verstärkung zur Anbringung an physiologischen Strukturen, eingeschlossen Knochen, Sehnen, Bänder, Knorpel und Muskel, bereitzustellen. In Anwendungen des Bänderersatzes können die gegenüberliegenden Enden unter Anwendung chirurgischer Standardtechniken jeweils am ersten und zweiten Knochen angeheftet werden, wobei die Knochen typischerweise ein Ge lenk bilden, wie im Falle eines Kniegelenkes.
Die Endbereiche der Magensubmukosazusammensetzung können gebildet, manipuliert oder geformt werden, um sie anzuheften, beispielsweise an einer Knochenstruktur, in einer Art und Weise, die die Möglichkeiten des Transplantatabrisses am Anhaftungspunkt verringert. Vorzugsweise kann das Material gefaltet oder teilweise umgewendet werden, um Mehrfachschichten zum Ergreifen, beispielweise mit mit Spikes behafteten Abdeckscheiben oder Klammern, bereit zu stellen.
Alternativ kann die Magensubmukosazusammensetzung auf sich selbst zurückgefaltet werden, um die Endbereiche zu verbinden, um einen ersten Bindungsbereich bereitzustellen, der beispielsweise an einen ersten Knochen anzubringen ist und eine Biegung im Zwischenbereich, um einen zweiten Bindungsbereich bereitzustellen, der an einem zweiten Knochen anzubringen ist, der mit Bezug auf den ersten Knochen gelenkig verbunden ist. Beispielsweise kann einer der Endbereiche angepasst werden, um durch einen Tunnel befindlich z.B. in dem Oberschenkelknochen hindurch gezogen und dort angeheftet zu werden, während der andere der Endbereiche angepasst sein kann, um durch einen Tunnel im Schienbein hindurchgezogen und dort angehaftet zu werden, um einen Ersatz für das natürliche Kreuzband bereit zu stellen, wobei das Segment angepasst ist, um unter Spannung zwischen den Tunneln platziert zu werden, um eine Bänderfunktion, d.h. eine durch ein normales Band bereitgestellte Spannungs- und Positionierungsfunktion, zu ergeben.
Mehrfachstreifen/stücke der Magensubmukosa können überlappt und unter eine Dehydrierung des Gewebes erlaubenden Bedingungen komprimiert werden, um die Streifen/Stücke des Magensubmukosagewebes zu einem einheitlichen Mehrfachlaminatkonstrukt zu verschmelzen. Es ist zu erwarten, dass der Prozess zur Formung der Darmsubmukosakonstrukte, beschrieben in US-Patentanmeldung 08/418.515, auf Magensubmukosa anwendbar ist und benutzt werden kann, um Mehrfachlaminatkonstrukte der Magensubmukosa zu bilden.
Die vorliegenden Magensubmukosazusammensetzungen können unter Verwendung konventioneller Sterilisationstechniken einschließlich Gerben mit Glutaraldehyd, Formaldehydgerbung bei saurem pH, Behandlung mit Ethylenoxid, Behandlung mit Propylenoxid, Gasplasmasterilisation, Gammastrahlung und Peressigsäuresterilisation sterilisiert werden. Vorzugsweise ist eine Sterilisationstechnik, die nicht signifikant die mechanische Festigkeit und biotropischen Eigenschaften des Transplantates schwächt, zu verwenden. Beispielsweise wird es angenommen, dass starke Gammastrahlung ursächlich für den Verlust an Festigkeit in dem Transplantatmaterial sein kann. Weil eines der höchst attraktiven Merkmale der aus dem Magensubmukosalgewebe gebildeten Transplantatkonstrukte deren Fähigkeit zur Induktion von Wirtsremodellierungsantworten ist, ist es wünschenswert, nicht eine Sterilisationsmethode zu verwenden, die diese Eigenschaft beeinträchtigt. Bevorzugte Sterilisationstechniken beinhalten ein Aussetzen des Transplantatgewebes gegenüber Peressigsäure, Gammastrahlung in niedrigen Dosen (≤ 2,5 mRad) und Gasplasmasterilisation; Peressigsäuresterilisation stellt die am meisten bevorzugte Methode dar. Typischerweise wird die Zusammensetzung, nachdem die Gewebetransplantatzusammensetzung sterilisiert wurde, in eine Hülle aus nicht porösem Plastikmaterial eingewickelt und nochmals unter Verwendung von Ethylenoxid- oder Gammastrahlungs-Sterilisationstechniken sterilisiert.
Die Zusammensetzungen des Magensubmukosalgewebes dieser Erfindung können ebenfalls unter Übereinstimmung mit dieser Erfindung in einem Verfahren und einer Zusammensetzung zur Unterstützung der Vermehrung und Induktion der Differenzierung von in vitro kultivierten eukariotischen Zellen benutzt werden. Prozeduren zur Verwendung des Submukosalgewebes für die in vitro Kultivierung von Zellen ist beschrieben in US-Patentanmeldung Nr. 08/386.452. Allgemein umfasst die Methode den Schritt der Kontaktierung eukariotischer Zellen, in vitro, mit einer von der Magensubmukosa von Wirbeltieren abgeleiteten Matrix unter eukariotisches Zellwachstum förderlichen Bedingungen.
In einer Ausführungsform wird ein Kultursubstrat eukariotischer Zellen enthaltend Submukosalgewebe präpariert. Das Submukosalgewebe kann mit verschiedenen Nährstoffen, Wachstumsfaktoren, Mineralien und Salzen kombiniert werden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet als wichtig in Zellkulturprozeduren bekannt sind. Der Ausdruck „Kontaktierung", wie er hier mit Bezug auf die Zellkulturen benutzt wird, ist gedacht, sowohl den direkten wie auch indirekten Kontakt, beispielsweise in fluider Kommunikation, des Submukosalgewebes und den kultivierten Zellen, einzuschließen. Der Ausdruck „unter für eukariotisches Zellwachstum förderlichen Bedingungen", wie hier benutzt, bezieht sich auf die das Umfeld betreffenden Bedingungen, wie sterile Techniken, Temperatur und Nährstoffversorgung, welche für das eukariotische Zellwachstum unter aktuell verfügbaren Zellkulturprozeduren als optimal gesehen werden. Obwohl die besten Zellkulturbedingungen, welche für die Kultivierung eukariotischer Zellen verwendet werden, etwas von dem jeweiligen Zelltyp abhängig sind, sind Zellwachstumsbedingungen allgemein auf diesem Fachgebiet gut bekannt.
Darüber hinaus kann das Magensubmukosagewebe mit derzeit erhältlichen Kulturmedien kombiniert werden, um die Effektivität von solchen Medien zu steigern, Wachstum, Vermehrung und Differentiation verschiedener Zelltypen zu indu zieren.
Beispiel 1
Präparation von Magensubmukosagewebe
Das Transplantatgewebematerial dieser Erfindung wird in Übereinstimmung mit den folgenden Schritten präpariert:
Zunächst wird der Magen aus der tierischen Quelle durch Abtrennen des Ösophagus und des Dünndarms an deren entsprechenden Eingangs- und Ausgangspunkten am Magen entnommen. Irgendwelches überschüssige Gekrösegewebe oder Fett wird vom Magen entfernt, die Mageninhalte werden entleert und jedwede zurückbleibenden Rückstände werden aus dem Inneren des Magens durch Spülung mit laufendem Leitungswasser entfernt. Der Magen wird anschließend umgestülpt, um die innenliegenden Schichten des Magens nach außen zu kehren. Diejenigen Bereiche des Magens, die die Mageneingangs- oder -Ausgangspunkte zu bilden beginnen, werden entfernt. Der Magen wird typischerweise im Ganzen belassen, der Magen kann jedoch auch zerschnitten und vor der Entfernung des unerwünschten Gewebes geglättet werden.
Die luminale Oberfläche des Magens wird der Abtragung unter Verwendung des Griffbereichs einer Schere oder eines Hämostaten unterworfen, um die inneren Schichten des Magens, einschließlich zumindest des luminalen Bereichs des Tunica mucosa, abzukratzen. Eine dünne Restschicht wird an diesem Punkt zurückbleiben. Wenn das Gewebe im Ganzen zurückgelassen wurde, wurde das Magengewebe abermals umgestülpt, um die luminale Oberfläche des Magens wieder zum Inneren des Transplantatkonstruktes zurück zu führen. Ein schmaler Schnitt wird dann in die äußere Muskelfaserschicht gesetzt. Die Muskelschichten werden daraufhin vom Submukosagewebe durch den Gebrauch einer Schere oder eines Hemostaten dela miniert, um den Schnitt im Muskel zu vergrößern und die Muskelschichten heraus zu kratzen. Das verbliebene Gewebe wird wieder umstülpt, um die luminale Seite an dem Äußeren des Transplantatgewebes zu platzieren. Die luminale Oberfläche wird abgeschabt, um den verbliebenen inneren Rückstand, welcher eine bräunliche Farbe hat, zu entfernen. Das Magengewebe wird solange geschabt, bis das Gewebe rosafarben-weiß erscheint.
Während der Präparation des Magengewebes ist Vorsicht geboten, um das Gewebe durch periodische Wässerung des Gewebes mit Wasser feucht zu halten. Das Magensubmukosagewebe wurde mit fließendem Leitungswasser für annähernd zwei Stunden ausgespült, um jegliches Blut oder lose Gewebeabschabungen, Lyse und verbliebene Zellen zu entfernen. Nach Spülung sollte das Gewebe weiß erscheinen, falls das Gewebe in rosa Farbe erscheint, wird das Gewebe unter Wasser so lange gerieben, bis es weiß erscheint. Nach vollendeter Spülung wurde der Wasserüberschuss durch Wringen des Gewebes mit der Hand oder unter Gebrauch von mechanischen Wringmaschinen entfernt. Das Gewebe wurde dann bei –80°C in flüssigem Stickstoff gelagert.
Beispiel 2
Mechanische Eigenschaften der Magensubmukosa
Die mechanischen Eigenschaften des Magensubmukosabiomaterials wurden unter Verwendung zweier unterschiedlicher Bench-Top-Tests ausgewertet: dem „Nassmembran-Bersttest" und dem „Kugel-Bersttest".
Der Nassmembran-Bersttest beinhaltet die Platzierung des Materials in einer Öffnung, um eine „Membran" zu bilden, welche das Submukosagewebe, gehalten durch einen umgebenden Ring, beinhaltet. Wasserdruck wird auf eine Seite der Mate rials bis zu dessen Bruch angewendet. Die gesammelten Daten von zehn getrennten Testproben von jedem Material sind in Tabelle 1 dargestellt, worin der Nassmembran-Bersttest der Darmsubmukosa, der Harnblasensubmukosa und der Magensubmukosa verglichen wird. Die Ausdrücke „in Medium" und „gefroren" kennzeichnen die Methode, mit der die Materialien im Anschluss an die Gewinnung und vor dem Testen gelagert wurden.
Tabelle 1 Nassmembran-Bersttest (Druck, in kg/cm²)
Die Festigkeit von submukosalen Magengewebetransplantaten kann auch durch den Gebrauch eines Zerreißprüfers eines Material-Test-System (MTS) ermittelt werden. Die Lage des submukosalen Magengewebes wird in einer runden Klammer (Probenklammer) befestigt, um die gleichmäßige Verteilung der Belastung über die ganze Gewebelage hinweg bereitzustellen. Der Griff der Probenklammer ist in seine höchste Position zu bringen, so dass die Einspannbacken der Klammer in der Lage sind, die Testprobe aufzunehmen. Das submukosale Gewebekonstrukt wird zerschnitten, um in die Form der Probenklammer zu passen, die Öffnung der Klammer hat einen Durchmesser von 1 9/16 (4 cm). Annähernd 1,3–1,5 cm des überschüssigen Materials sollten um den Umkreis der Testprobe herum eingeschlossen sein, um einen ausreichenden Einspannbereich zu garantieren. Das submukosale Gewebe wird in den Einspannbacken der Klammer platziert und befestigt; die Klemmkraft wird durch ein an der obersten Klemme angeordnetes Daumenhandrad gesteuert.
Die anfängliche Einstellungsstufe ist so einzustellen, dass die Oberseite der Stahlkugel unmittelbar unter der Ebene der Testprobe angeordnet ist. Die Stahlkugel wird mit einer durch ein Softwareinterface eines Zugversuchgerätes geregelten Geschwindigkeit nach oben gegen das geklammerte Submukosalgewebe gedrückt, um die auf die Testprobe einwirkende Kraft zu regeln und zu messen. Die Kraft wird solange gesteigert, bis ein Bruch der Probe auftritt. Bruch ist definiert als die maximale Belastung, die dem ersten Erscheinen der Kugel durch sichtbare, nicht-natürliche Diskontinuitäten in der Ebene der Probe zuzuordnen ist. Im Falle, dass die höchste Position der Einstellung vor dem Bruch erreicht ist, greifen die Softwarebegrenzungen und unterbrechen den Test. Der Spitzenbelastungswert, angezeigt am Mikroprofiler 458,01, wird gespeichert und die Probe entnommen. Tabelle 2 zeigt die gesammelten Daten des Kugel-Bersttests, der drei unterschiedliche Quellen der Submukosa miteinander vergleicht: Darmsubmukosa, Harnblasensubmukosa und Magensubmukosa. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Ma gensubmukosa das stärkste dieser drei unterschiedlichen Biomaterialien ist.
TABELLE 2 Kugel-Bersttest (max. Belastung in kg)
Beispiel 3
In-Vivo-Neugestaltung
Sektionen der Magensubmukosa wurden als Gerüst zum Ersetzen von Bereichen der operativ entfernten Harnblase beim Hund verwendet. Zwei Untersuchungen wurden durchgeführt. Ein Tier wurde nach drei Wochen geopfert, das zweite Tier nach sechs Wochen. Die morphologische Auswertung der neugestalteten Gewebe zeigte ein Wachstum des Übergangsepitheliums über die Oberfläche des Magensubmukosagerüsts und die Anwesenheit von glatten Muskelzellen inmitten des Biogerüsts. Weil kein endgültiger Weg zur Identifikatian der An- oder Abwesenheit verbleibender Magensubmukosa bestand, konnte das Ausmaß und/oder der Umfang der Abtragung der Magensubmukosa nicht durch diese Untersuchungen bestimmt werden.
Beispiel 4
In-Vitro Zellwachstumseigenschaften der Magensubmukosa
Die Fähigkeit der Magensubmukosa als extrazelluläre Matrix zur Unterstützung von in-vitro-Zellwachstum zu dienen, wurde durch Anwendung mehrerer Zelltypen auf die magensubmukosale Gewebsoberfläche unter standardisierten Zellkulturbedingungen getestet. Die getesteten Zelltypen beinhalteten 3T3 Fibroblasts, Darmepithelzellen und FR (fötale Ratten-) Mesenchymzellen. Alle drei Zelltypen zeigten die Fähigkeit, sich leicht auf dieser extrazellulären Matrix zu vermehren, ohne die Zugabe von Ergänzungsmitteln, die für das Wachstum dieser Zellen auf einer Kunststoffoberfläche nötig wären. Deshalb kann geschlossen werden, dass das Material notwendige Struktur- und Zusammensetzungs-"Nährstoffe" beinhaltet, die als Zellkultursubstrat zur Unterstützung des Zellwachstums dienen.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Gewebetransplantatzusammensetzung, umfassend das Delaminieren der Submukosa von den glatten Muskelschichten der Muscularis externa und des Luminalabschnitts der Mukosaschicht aus einem Segment des Magens eines warmblütigen Wirbeltiers und das Digerieren der Zusammensetzung mit einem Enzym über einen Zeitraum, der für die Solubilisierung der Magensubmukosa ausreicht.
Verfahren zur Herstellung einer Gewebetransplantatzusammensetzung, umfassend das Delaminieren der Submukosa von den glatten Muskelschichten der Muscularis externa und des Luminalabschnitts der Mukosaschicht aus einem Segment des Magens eines warmblütigen Wirbeltiers, das Formen der Zusammensetzung zu einem Zylinder mit vorgegebenem Lumendurchmesser und das Sichern des Zylinders entlang seiner Länge.
Verfahren zur Herstellung einer Gewebetransplantatzusammensetzung, umfassend das Delaminieren der Submukosa von den glatten Muskelschichten der Muscularis externa und des Luminalabschnitts der Mukosaschicht aus einem Segment des Magens eines warmblütigen Wirbeltiers und das Konditionieren der Zusammensetzung zur Verminderung der Dehnung der Magensubmukosa für die Verwendung als Bindegewebssubstrat.