KR100603075B1

KR100603075B1 - Ｍｈｃ 클래스 ⅱ 리간드의 예방접종을 위한 항항원체로의이용과 ｌａｇ-3의 암 치료에의 이용

Info

Publication number: KR100603075B1
Application number: KR1020007000265A
Authority: KR
Inventors: 프레데리크 트리에벨
Original assignee: 인스티튜트 구스타브 루시; 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이.
Priority date: 1997-07-25
Filing date: 1998-07-23
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2018-07-23
Also published as: PT1002108E; EA200000161A1; EP0893507A1; ES2262242T3; WO1999004810A2; AU9254798A; EE200000039A; DE69834330T2; CA2293805A1; EA003740B1; CA2293805C; JP2001510806A; WO1999004810A3; US20020192195A1; EP1698701A1; CA2732570C; IL134212A0; KR20010021706A; JP4723722B2; CN1265149A

Abstract

본 발명은 암-면역치료에서의 LAG-3의 이용을 비롯해, 항원 특이적 면역 반응을 포함하는 병리학적 이상을 예방하거나 또는 치료하기 위한 약물의 제조를 위해 CD4와 LAG-3과 같은 MHC 클래스 II 리간드의 용도와 관계한다. 본 발명은 또한 MHC 클래스 II 리간드의 효과량과 함께 항원-특이적 면역 반응을 유도할 수 있는 항원의 일정량으로 이루어진 제약학적 조성물과 관계하는데, 여기서 MHC 클래스 II 리간드는 항항원체-유사 물질이다.

Description

ＭＨＣ 클래스 Ⅱ 리간드의 예방접종을 위한 항항원체로의 이용과 ＬＡＧ-3의 암 치료에의 이용{USE OF MHC CLASS Ⅱ LIGANDS AS ADJUVANT FOR VACCINATION AND OF LAG-3 IN CANCER TREATMENT}

본 발명은 LAG-3과 CD4의 용도와 관계하고, 좀 더 일반적인 방식으로는, 암 면역치료법에서 치료요법물질로서 LAG-3의 용도를 비롯한 항원 특이적 면역 반응을 강화하기 위한 백신목적의 항항원체로서 MHC 클래스 Ⅱ 리간드 또는 이의 유사-리간드의 용도와 관계한다.

MHC 클래스 Ⅱ 영역에 의해 인코드된 단백질은 많은 측면의 면역 인식에 관련되는 것으로 현재 인지되고 있는데, 이런 측면에는 림프구와 같은 상이한 림프계세포와 항원 제공 세포사이의 상호작용이 포함된다. 상이한 관찰을 통해 CD4를 통해 발생하지 않는 다른 기작도 T 헬프 림프구의 작동체 기능에 참여하는 것으로 밝혀졌다.

활성화된 NK 세포뿐만 아니라 인체 CD4⁺와 CD8⁺ 활성화된 T-세포에서 발현되는 림프구 활성화 유전자 3(LAG-3)은 네 개의 세포외 면역글로불린 슈퍼페밀리(lgSF)도메인(1)을 가진 503 아미노산(aa)Ⅰ형 막단백질을 인코드하고 MHC 클래스 Ⅱ 분자의 리간드(2)이다. 이런 서열의 분석에서, 비록 인체 CD4와의 전체 아미노산 서열 상동성은 백그라운드 수준(대략 20% 서열 동일)을 벗어나지 못하지만, CD4에서 대응하는 위치에서 발견된 아미노산 서열의 신전과 눈에 띄는 동일성 흔적이 밝혀졌다. LAG-3 분자에서 도메인2(D2)와 4(D4)사이뿐만 아니라 도메인1(D1)과 3(D3)사이에서도 약간의 내부 서열 상동성이 있는데, 이것은 LAG-3이 이전에 존재하던 2 lgSF 구조(1)로부터 유전자 복제에 의해 CD4처럼 진화했다는 것을 암시한다. 또한, LAG-3과 CD4 유전자는 크로모좀 12(3)의 짧은 팔의 먼 부위에 매우 가까이 근접해 존재한다. LAG-3과 CD4는 그런 이유로 lgSF(2)에서 진화한 " 일차 종형"으로 간주될 수 있다.

CD4처럼, hLAG-3은 도메인 2와 4내 W ×C 기호모티프를 가진 엑토도메인과 같은 lg로 구성된다; 하지만 CD4와의 차이점은 도메인 1(17B4mAb에 의해 인식)에 추가 루프 서열과 인체 LAG-3(hLAG-3)내 프롤린이 풍부한 세포질내 모티프(EP 반복)가 존재한다는 것이다. 최근에, 쥐 림프구 활성화 유전자 3(mLAG-3)이 클론되었는데, 세포질내 꼬리에 동일한 프롤린 풍부 모티프를 가진 hLAG-3과 대략 70%의 상동성이 발견되었다.

항-LAG-3 mAb 존재하에 CD4⁺ T-세포 클론의 항원 특이적 자극은 확대된 증식과 사이토킨 생산(5)을 야기한다. 활성화된 CD4⁺ T 림프구에 대한 hLAG-3의 조절 역할이 T-세포에 발현된 MHC 클래스 Ⅱ 분자를 LAG-3 lg 융합 단백질(6)과 교차연결함으로써 활성화된다는 것이 제시되고 있다. LAG-3 MHC 클래스 Ⅱ 상호작용이 CD4⁺ T-세포에 발현되는 MHC 클래스 Ⅱ 분자를 통과하는 신호(증식과 사이토킨 생산의 감소)를 저해하는데, 이는 LAG-3과 MHC 클래스 Ⅱ 모두 T 헬프 세포 조정 면역 반응의 억제-조절을 위한 작동체 분자라는 것을 암시한다. hLAG-3 lg 융합 단백질이 이종원성 MHC 클래스 Ⅱ 분자(쥐와 원숭이)에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 또한, mLAG-3은 작동체 세포에 파지티브 신호를 전달하는 것으로 제시되고 있는데, 그 이유는 LAG-3 정지돌연변이를 가진 전이원성 쥐는 NK 세포 구역에 결손을 가지고 있기 때문이다.

막을 발현하도록 가공된 쥐 종양 세포계통(B7.1, B7.2, CD95L,..)또는 분비되는 분자를 발현하도록 가공된 쥐 종양 세포계통(IL-2, IL-12, ...)이 종종 면역반응이나 항종양 효과를 조사하기 위하여 사용된다. 이런 접근방식은 많은 종양 세포가 잠재적으로 항원성(9)이고, 이들이 분자를 발현할 때, 면역원성으로 된다는 것을 암시한다. 실험용 쥐 종양은 내재된 면역원성으로 분류되는데, 동계의 쥐속에 비복제성 세포백신으로 단일 투여된 후 이들은 일련의 치명적 도전에 대한 보호 면역 반응을 유도한다. 이런 잔기 면역원성을 보유하지 않은 종양은 미약한 면역원성 또는 비면역원성으로 정의된다.

항종양 면역 반응은 원칙적으로 T-세포(12)에 의해 조정된다. 최근의 연구들은 효율적 종양 백신의 실행을 위한 문제점으로 효율적 항원 제공과 T-세포 기폭의 결핍을 들었다. 실제로, 종양 세포를 IL-2, IL-4, IL-12 또는 GM-CSF와 같은 다양한 사이토킨을 코딩한 유전자로 또는 B7과 같은 보조-자극 분자를 코딩한 유전 자로 감염시키면 변형된 세포의 일차적 거부반응이 일어났고 또한 가끔은 비변형된 종양 세포(13)와의 연이은 도전에 대한 보호 면역이 유도되었다.

전문적인 항원 표현 세포(APCs)는 T-세포 활성화를 위해 필요한 보조-자극 신호의 범위내에서 T-세포에 대한 항원을 받아들이고 가공하고 제공할 수 있기 때문에 최적의 항원을 제공하게 된다. 특히, MHC 클래스 Ⅱ⁺ 수상돌기 세포(DCs)는 면역계에 대한 항원을 가공하고 제공하는데 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다. 본 발명자는 만약 종양이 거대파아지와 수상돌기 세포와 같은 숙주 APCs를 직접적으로 촉발시킬 수 있다면 종양 면역원성이 증가될 수 있을 것이라고 가정하였다. 실제로, mAb나 슈퍼항원을 이용해, 이런 세포에 의해 특이적으로 발현된 MHC 클래스 Ⅱ 분자들이 교차연결되면 신호가 전달돠어 TNFα와 IL-12(14,15)가 생산된다고 알려지고 있다. 이전에 CD4 좌위(1, 16)에 위치한 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3)이 CD4(17, 6)보다 더 높은 친화도를 가진 인체 및 쥐의 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하는 단백질을 인코드한 것으로 보고되었다.

본 출원의 발명자는 세 개의 MHC 클래스 Ⅱ 쥐종양(미약 면역원성 육종 MCA 205와 비면역원성 TS/A+RENCA 선암(종))에서 hLAG-3, 인체 CD4(hCD4) 그리고 mLAG-3 발현이 쥐 종양을 거부하도록 면역반응을 조정하고 조직적 면역을 유도할 수 있는가를 조사했다.

결과로써, 인체 및 쥐의 LAG-3은 고형 종양 세표계내에서 막단백질로 발현되거나 또는 용해성 단백질로 쥐내로 접종되면 악성 쥐 종양에 대한 강력한 면역을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 이런 면역은 T-세포 의존성이고 항원-특이적이었다.

또한 CD4의 역할을 조사해 인체 CD4(hCD4)도 조직적 항종양 반응을 유도한다는 것이 밝혀졌다.

유도된 면역은 T-세포에 의해 조정되는 것으로 발견되었는데, 그 이유는 동일한 항종양 반응이 T-림프구가 결핍된 누드 쥐에서 얻어졌기 때문이다.

항종양 효과는 또한 상이한 MHC 유전자를 발현하는 쥐의 다른 주를 사용할 때를 비롯해 상이한 내재된 면역원성을 보이는 다른 종양 세포계통을 사용할 때에도 발견되었다.

또한, hLAG-3과 hCD4 유도된 효과는 hLAG-3나 hCD4를 발현하는 종양세포계통이 야생형 종양세포계통의 초기접종 위치로부터 먼 위치에 주사될 때도 관찰되었다.

또한, 용해성 hLAG-3의 조직적 투여는 생체내 종양 생장의 억제를 직접적으로 유도한다.

모든 전술된 결과는 LAG-3과 CD4가 항원 특이적 T-세포 조정 면역반응을 유도해 위험한 개체군에서 암의 발생을 예방하기 위한 면역치료 또는 좀 더 일반적으로는 항원-특이적 T-세포 면역반응을 포함한 임의의 면역치료의 한 도구로써 유용하고 또한 LAG-3이 생체내 종양 생장을 제해하기 위한 도구로써도 유용하다는 것을 보여준다.

본 발명자는 추가적으로 용해성 LAG-3이 면역반응이 요구되는 항원과 함께 투여될 때, 백신을 위한 항항원체 역할을 할 수 있음을 보였다.

이런 역할은 피부아래에 위치하고 MHC 클래스 Ⅱ을 통하여 촉발된 전문적 APCs(수상돌기 세포와 거대파아지)에 의한 항원의 향상된 제공에 의해 설명될 수 있다.

따라서, CD8⁺T-세포 면역의 유도는 바이러스성(예, AIDS, 간염과 포진)와 세포내 기생충성 그리고 박테리아성(예, 나세포성 결핵) 감염과 암에 관여하기 때문에, LAG-3은 암 치료 및 이들 질병에 관여하는 병원체물질에 대한 치료요법적 백신에 특히 유용하다.

이런 측면들 중의 한 측면에 의해, 본 발명은 항원 특이적 면역 반응, 적절하게는 항원-특이적 T-세포 조정 면역 반응과 관련된 병리학적 이상을 예방하거나 치료하기 위한 약물의 제조를 위한 MHC 클래스 Ⅱ리간드나 MHC 클래스Ⅱ-유사 리간드의 용도와 관계한다.

첫 구체예에서, MHC 클래스 Ⅱ 결합 분자는 LAG-3 및 LAG-3의 MHC 클래스 리간드에 결합할 수 있는 이의 유도체다.

본 발명의 판단하에서 LAG-3의 유도체란 LAG-3의 돌연변이, 변이체, 그리고 단편, 즉, LAG-3의 용해성 단편을 의미하는데, 단 이들은 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하는 LAG-3의 능력을 유지해야 한다.

따라서, LAG-3의 다음의 형태가 사용될 수 있다.

-전체 LAG-3 단백질

-네 개의 면역글로불린 세포외 도메인(즉, 프랑스 특허 출원 FR 90 00 126에 서 공개된 LAG-3 서열의 23개 아미노산에서 448개의 아미노산에 이르는 세포외 영역으로 이루어진 LAG-3의 용해성 부분)중 하나 이상의 도메인으로 구성된 이의 용해성 폴리펩티드

- 실질적으로 첫 번째 와 두 번째 도메인 모두로 이루어진 LAG-3의 단편

- 실질적으로 첫 번째 와 두 번째 도메인 모두 또는,

- 용해성 LAG-3의 돌연변이 형태 또는 D1과 D2 세포외 도메인을 포함하고,

ㆍARG가 GLU로 치환된 73 위치,

ㆍARG가 ALA 또는 GLU로 치환된 75 위치,

ㆍARG가 GLU로 치환된 76 위치중 어느 한 위치에서 아미노산의 치환, 또는 이들 치환의 두 개 이상의 결합

ㆍASP가 ALA로 치환된 30 위치;

ㆍHIS가 ALA로 치환된 56 위치;

ㆍTYR이 PHE로 치환된 77 위치;

ㆍARG가 ALA로 치환된 88 위치;

ㆍARG가 ALA로 치환된 103 위치;

ㆍASP가 GLU로 치환된 109 위치;

ㆍARG가 ALA로 치환된 115 위치중 어느 한 위치에서 아미노산의 치환

또는 54위치와 66위치 사이로 구성되는 영역의 결손,

또는 이들 치환의 두 개 이상의 결합으로 이루어지는 이의 단편과 같은 WO 95/30750에서 정의된 것과 같이 네 개의 도메인 모두로 구성된 LAG-3의 단편.

이들 돌연변이들은 PNAS, June 997(4)에 기술되어 있다.

-또는 D1, D2, D3을 보유한 용해성 52KD 단백질로 구성된 LAG-3의 생리적인 변이체.

두 번째 구체예에 의하면, MHC 클래스 Ⅱ 결합 단백질은 CD4 또는 CD4의 MHC 클래스 Ⅱ 리간드에 결합할 수 있는 이의 유도체이다.

CD4의 유도체는 LAG-3의 유도체에 대해 정의한 바와 동일하다. 다시 말하면, 이들은 CD4의 돌연변이, 변이체 그리고 단편, 즉, CD4의 용해성 단편인데, 단 이들은 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하는 CD4의 능력을 유지해야 한다.

LAG-3과 CD4, 즉, hLAG-3과 hCD4 또는 전술된 것과 같은 이의 유도체가 상기 분자를 발현하는 재조합 성분, 예를 들면 감염된 세포 또는 재조합 바이러스로서 투여될 것이다.

본 발명은 CD4 또는 LAG-3 또는 이의 유도체와 같은 MHC 클래스 Ⅱ리간드를 적어도 하나 이상 코딩한 DNA로 감염된 종양 세포에도 관계한다.

본 발명의 또 다른 목적은 CD4 또는 LAG-3 또는 이의 유도체와 같은 MHC 클래스 Ⅱ리간드를 적어도 하나 이상 코딩한 DNA로 감염된 종양 세포를 약물, 특히 항원 특이적 T-세포 면역 반응같은 항원 특이적 면역 반응을 포함하는 병리학적 이상을 예방하거나 치료하기 위한 또는 암과 같은 병리학적 질환을 치료하기 위한 약물의 제조를 위하여 이용하는 것이다.

감염된 세포는 적절하게는 포유류 세포이고 특히 포유류 종양 세포이다.

이런 측면들 중 한 측면에 의하면, 본 발명은 CD4또는 LAG-3 또는 이의 유도 체와 같은 MHC 클래스 Ⅱ리간드를 적어도 하나 이상 코딩한 DNA로 감염된 세포를 제조하는 방법에 관계하는데, 이 방법은 환자에게서 세포를 분리하고 상기 세포를 CD4 또는 LAG-3 또는 이의 유도체와 같은 MHC 클래스 Ⅱ리간드를 적어도 하나 이상 코딩한 DNA로 감염시키고 이렇게-감염된 세포를 회수하는 단계로 구성된다.

본 발명에 따른 종양 세포의 제조를 위하여, 이 방법은 환자에게서 분리된 종양 세포에 재현될 수 있다.

하지만, 적절한 구체예에 의하면, MHC 클래스 Ⅱ결합 단백질, 즉, CD4또는 LAG-3 또는 이의 유도체는 자유 형태, 다시 말하면, 용해형태로 s.c, i.m, 또는 i.v 주사와 같이 조직적으로 이들을 접종해 투여된다.

본 발명에 따른 약물은 항원 특이적 면역 반응, 적절하게는 T-세포 조정 면역 반응과 관련된 질환을 예방하기 위한 백신으로 사용될 수 있다.

이런 목적을 위하여, 면역 반응이 요구되는 하나 또는 여러 개의 항원과 함께 적절한 매개체로 투여된다. 이 항원은 불활성화된 또는 독소가 약화된 감염성 물질 또는 정제된 항원으로 감염성 물질의 항원이나 종양 항원과 같은 단백질 재조합 처리에 의해 얻어지는데, 이들 항원들은 T-세포 조정 면역 반응을 유도해 낼 수 있다.

이 백신은 감염성 질병, 예를 들면, 바이러스성, 박테리아성, 또는 기생충 질병과 같은 감염성 질병으로부터 개체를 보호하는데 사용되는데, 여기서 감염성 물질은 항원 특이적 면역 반응, 적절하게는 T-세포 조정 면역 반응을 유도한다.

이 백신은 T-세포 조정 면역 반응, 다시 말하면, CD8⁺ T-세포 조정 면역 반응을 포함해서 위에서 전술된 것과 같은 감염성 질병으로부터 환자를 치료하는데 사용된다.

T-세포 조정 면역의 촉진을 필요로 하는 질병의 예는 다음의 표에 제시되어 있다.

표

이런 경우에 항원은 세포에서 잘게 잘리고 해당되는 펩티드는 MHC 클래스 Ⅰ 분자에 실려 CD8⁺에 의해 인식되는 세포의 표면에 제공된다. 본 발명의 결과에 의하면 LAG-3lg 분자는 동물에서 효과적인 T-세포 반응을 유도하고 실험관내에서 미숙 한 수상돌기 및 단핵세포를 자극하는데, 이것은 LAG-3이 전문적인 APCs내 MHC 클래스 Ⅱ 분자를 교차연결할 수 있는 상황에서 자연적 T-세포 항항원체가 된다는 것을 암시한다.

이 백신은 고형 종양 암 또는 백혈병으로부터 개체를 보호하는데 사용된다.

이 백신은 추가적으로 환자를 치료하는데 사용된다.

이런 경우에, MHC 클래스 Ⅱ 결합 단백질, 즉, LAG-3 또는 CD4는 면역 반응, 특히 T-세포 조정 면역 반응을 유도할 수 있는 하나 또는 여러 개의 항원과 함께 피하내, 피내, 또는 비내 분무로 개체에 투여된다. 항원은 펩티드, 지질펩티드, 재조합 단백질 또는 이들 항원을 코딩한 DNA이다.

항-암 백신은 그들의 유전형에 의해 확인된 위험 개체군(예방 백신)에 또는 종양이 있거나 수술이후 재발의 위험이 큰 환자에게 접종된다.

백신이 전통적 백신(예방)으로 사용되거나 또는 치료백신으로 사용되는 지와 상관없이 가급적 강한 프로모터의 조절하에서 LAG-3이나 CD4를 인코드한 DNA 서열을 통합한 "네이키드" 플라스미드(19)로 투여된다.

이 플라스미드는 가급적 면역반응이 요구되는 항원을 인코드한 DNA를 또한 보유한다.

본 발명의 또 다른 목적은 가급적 T-세포 반응을 통하여 면역계를 자극할 수 있는 항원의 효과적량과 병용하여 MHC 클래스 Ⅱ 리간드의 효과적량으로 이루어진 제약학적 조성물이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 암종양을 가진 환자에게 항-종양 면역치료를 위한 약물로서 LAG-3의 용도와 관계한다.

이런 경우에, LAG-3은 자유 LAG-3 단백질 또는 제약학적 수용가능 매개체내 이의 유도체, 가급적 앞에서 정의된 것과 같은 용해질 유도체로 투여된다.

LAG-3은 종양내 투입이나 s.c, i.v, 또는 i.m과 같은 조직적 주입으로 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 종양 유전자 치료를 위한 방법과 관계하는데, 이것은 환자의 종양 세포의 일부를 떼어내 상기 세포를 CD4 또는 LAG-3 또는 이의 유도체와 같은 MHC 클래스 Ⅱ 리간드를 적어도 하나 이상 코딩한 DNA로 처리하고, 이렇게 감염된 세포를 환자에게 재도입하는 단계로 이루어진다.

다음의 예는 T-세포 조정 면역 반응과 관련된 병리학적 이상의 예방이나 치료에서 LAG-3과 CD4의 활성을 보여준다.

본 발명의 더 나은 이해를 위해 첨부된 도로써 설명한다.

- 도1은 야생형 MCA 205 종양 세포(MCA WT), hCD4로 감염된 MCA 205종양 세포(MCA hCD4) 그리고 hLAG-3으로 감염된 MCA 205 종양 세포(MCA hLAG-3)로 접종된 C57BL/6 쥐의 평균 종양 크기를 나타낸다;

- 도2는 최소 종양 발생량에서 야생형 MCA 종양 세포로 동일한 쥐를 다시 자극한 후 얻어진 결과(평균 종양 크기)를 나타낸다;

- 도3은 무관한 MC 38 종양 세포계통으로 동일한 쥐를 다시 자극한 후 얻어진 결과(평균 종양 크기)를 나타낸다;

- 도4는 별개의 생쥐주(BALB/c)와 야생형의 상이한 종양계통(TS/A) (TS/A wt)또는 hCD4로 감염된 상이한 종양계통(TS/A hCD4)또는 hLAG-3으로 감염된 상이한 종양계통( TS/A hLAG-3)으로 얻어진 결과(평균 종양 크기)를 나타낸다;

- 도5는 hLAG-3을 발현하는 MCA 세포의 서로 다른 약량으로 처리된 후 존재하는 종양으로 얻어진 결과(평균 종양 크기)를 나타낸다;

- 도6은 MCA 세포와 함께 주사된 용해성 LAG-3(MCA wt, MCA wt+25㎍ LAG-3 그리고 MCA wt +250㎍ LAG-3)으로 얻어진 결과(평균 종양 크기)를 나타낸다.

- 도7과 8은 신세포암(종)(RCC)을 가진 다섯명의 환자(P1-P5)에서 종양 침투 림프구(TILs)의 막(membrane)내 LAG-3의 발현결과를 나타낸다;

- 도9는 CD8⁺림프구에 의해 조정된 hLAG-3 종양 세포의 거부반응을 설명한다.

a, hLAG-3 MCA 205 쥐에서 얻은 TILs와 비교한 조절(wt MCA 205)쥐에서 얻은 TILs에 의한 CD8 발현의 FACS 분석. b, CD8⁺ T-세포는 hLAG-3 MCA TS/A 종양 생장의 조절에 기여한다. 쥐는 -3, -2, -1, +4 그리고 +8일째에 200㎍의 정제된 CD4또는 CD8-특이적 mAb를 받았다. 야생형 또는 hLAG-3 TS/A 종양 세포(MTD)가 0일째에 s.c로 접종되었다. 데이터는 단일 실험에서 각 그룹내 5마리 쥐의 평균±s.e.m이다. 이들 실험은 두 번씩 시행되었는데 유사한 결과가 나왔다. c) hLAG-3/TS/A 세포를 거부한 쥐에서 항종양 CTLs의 증가된 활성. 쥐는 5 ×10⁴ hLAG-3/TS/A 세포 의 s.c. 이식체를 받았고 30일째에 2.5 ×10⁵ 부모 TS/A 세포로 다시 자극되었다. 지라가 종양-무(無)쥐에서 60일째에 회수되었고 세포는 방사선에 노출된 지정 표적세포와 6일동안 공동-배양되었다. 지정 표적 세포에 대한 세포 융해 활성은 표준 4 시간 ⁵¹Cr 방출분석에서 상이한 작동체대 표적 비율(E:T)로 시험하였다. 두 마리의 쥐에 대한 결과가 나타나 있다. 이들 실험은 네 마리의 쥐에서 두 번씩 행해졌는데 유사한 결과를 나왔다.

- 도10은 동계의 MCA 205 육종 세포로 이식되고 LAG-3lg의 단일 백신 주사를 맞은 쥐(20C57BL/6 쥐)의 결과(평균 종양 크기)를 보여준다. 6일째에, 5마리씩 다섯 그룹의 쥐들이 형성되어 단일 s.c. 백신 주사(200㎕)를 맞았다. Ag는 방사선(100 Gy)에 노출된 MCA 205 세포에 의해 표현된다.

예에서 설명한 실험은 다음의 재료와 방법을 이용해 시행되었다.

재료와 방법

1. 종양 세포 계통

MHC 클래스 Ⅰ⁺ 그리고 클래스 Ⅱ^- 종양 세포 계통: 미약 면역원성 메틸콜란트렌-유도의 육종 MCA 205 세포계통, (C57BL/6H-2^b 쥐의 동계), 면역원성 선세포암(종) 세포-계통 RENCA 그리고 비-면역원성 비분화 자발성 유방 선암(종) TS/A 세포계통(BALB/C H-2^d 쥐의 양 동계)이 사용되었다. MC38 콜론 암(종) 세포 계통(C57BL/6 쥐의 동계)이 콘트롤 종양으로 재자극 실험에서 사용되었다. 세포가 완전 배지(글루타민, 나트륨 초성포도산염, 페니실린/스트렙토마이신, 10%의 내독성 무(無) 태아소 혈청 그리고 0.05 mM 2-β 멀캡토-에탄올)내 37℃ 10% 습도의 CO₂ 대기하에서 유지되었다. 면역착색 실험과 생체내실험을 위하여 세포가 배양 접시로부터 1mM EDTA를 함유한 PBS로 이동되었다. 피부하 주사(s.c)이전에, 세포는 차가운 PBS 1×에서 세 번 세척되었고 동일한 버퍼에서 재현탁되었다. 세포는 이주이상은 배양하지 않았다.

2. 쥐

6 또는 8주된 암컷 C57BL/6 쥐는 IFFRA-CREDO Laboratories(Lyon, France)로부터 구매되었다. 4 또는 8주된 암컷 BALB/c 쥐가 JANVIER Laboratories, (France)로부터 구매되었다. 이 모든 생쥐주가 특정 병원체 무(無) 조건에서 사육되었다. 암컷 누드는 Institut Gustave Roussy에서 구매되었고 보호되는 미세환경하에서 유지되었다.

3. 유전자 구성체

hLAG-3, mLAG-3 그리고 hCD4의 cDNA가 NT 하이그로마이신 플라스미드 벡터(클로닝 위치는 SRα 프로모터(18)하에서 hLAG-3과 HCD4에 대해서는 Xbal이고 그리고 mLAG-3에 대해서는 Xhol이다)속으로 클론되었다. 역방향으로 클론된 LAG-3 hcDNA가 음성 콘트롤로서 사용되었다. 모든 종양 세포 계통(2.5 ×10⁶세포)이 Eurogentec Apparatus(Belgium)를 이용한 일렉트로포레이션을 통해 감염되었다: 1500㎌, 한정 션트 저항, 200V에서 MCA 205 세포, 300V에서 TS/A 와 RENCA 세포. 감염체가 하이그로마이신 B(Sigma): 100 ㎍/ml RENCA에서 MCA 205와 200 ㎍/ml에서 TS/A 감염체에서 선택되었다. 감염된 분자를 발현하는 저항 세포는 엘리트 세포형광계수기(Coulter, Hialeah, FL)를 이용하여 확인하였고 제한 희석에 의해 클론하였다. 각 종양 세포계통에서 각각의 작제를 위한 최적의 클론이 이 연구에 사용되었다.

4. 세포형광계수 분석

감염된 세포를 발현하는 저항세포는 정제되거나 또는 복수(액) mAbs의 포화량으로 간접적 면역형광에 의해 착색하였다. 세포는 먼저 mAbs: 17B4(항-hLAG-3.1)(2), OKT4(항-hCD4), 음성 콘트롤로서 사용되는 토끼 전면역 혈청(PIS로 지칭) 그리고 토끼 면역 혈청 항-mLAG-3(IS로 지칭)으로 배양하였다. 종양에서 쥐의 MHC 클래스 Ⅰ과 Ⅱ분자의 발현은 다음의 mAbs: H-2 k^d와 Dd에 대해서34-1-2S, H-2 k^b와 D^b에 대해서 28-8-6S, 14-4-4S(E^d에 대해서), M50114(IA와 IE에 대해서)로 감지하였다.

세포는 이후 세척되었고 FITC-접합된 염소 항-쥐 혈청(GAM Coulter)또는 FITC-접합된 염소 항-토끼 혈청(GAR Southern Biotechnologies inc.)으로 배양하였다. 침투성 세포의 존재나 종양표면내 세포의 부착을 연구하기 위하여, 몇 마리의 쥐를 죽여 종양을 분해하였다. 세포는 17B4-FITC 또는 다음의 mAbs(Pharmigan): 항-mCD4-PE(L3T4), 항-mCD8(Ly-2와 Ly-3.2), 항-mNK(2B4) 그리고 항-mCD22(Lyb- 8.2)로 직접 면역 형광에 의해 착색되었다. 세포는 엘리트 세포형광계수기(Coulter)를 이용해 분류하였다.

양성 세포 계통은 이후 제한 희석에 의해 클론하였고 LAG-3⁺또는 CD4+ 클론은 다음 이용을 위하여 동결하였다.

용해성 LAG-3 분자를 만들기 위하여 hLAG-3과 mLAG-3의 세포외 도메인이 전술된 것과(6) 같이 hlgG1과 mlgG2a Fc 부분과 각각 융합되었다. 결과로 생성된 재조합 단백질, hLAG-3lg와 mLAG-3lg은 CHO 세포에서 생산하여 단백질-A 칼럼에서 정제하였다.

5. 생체내 종양 실험

5.1 종양 생장 확립과 백신

종양 세포계통 확립은 MCA 205에 대해 2.10⁵ 세포/쥐에서, TS/A에 대해 5.10⁴ 세포에서, RENCA또는 다섯배의 MTD에 대해 10⁵ 세포에서 최소 종양 발생 약량(MTD)을 이용해 s.c로 시행하였다. 주사 30일후 무(無)종양인 쥐는 부모 종양 세포계통(5 ×MTD)으로 다시 자극하였다. MC38 콜론 암(종)세포 계통은 TS/A 종양을 거부한 C57BL/6쥐에서 콘트롤 종양으로 10⁵세포로 사용하였다. 동일 연령의 고유 C57BL/6 또는 BABL/c 쥐는 종양 세포 계통으로 주사하였다.

종양 생장은 캘리퍼스를 이용한 두 개의 수직 종양직경의 측정에 의해 일주일에 두 세 번 모니터하였다. 일일 생체내 종양실험에서, 세포는 세포형광계수기 에 의해 분석되었고 실험관내 증식분석이 이루어졌다.

5.2 종양 치료 모델

0일에, 야생형 종양 세포 계통이 왼쪽 측면내(MTD) s.c로 접종되었다. 0, 3 또는 6일째에, LAG-3⁺ 종양 세포가 오른쪽 측면(MTD 또는 다섯배 MTD)으로 원 거리에서 감염되지 않은 세포에 대한 항종양 효과를 결정하기 위하여 주사되었다. 종양 생장은 전술한 것과 같이 측정하였다.

5.3 혈구 계산 분석을 위해, 쥐는 전술한 것과 같이 5 ×MTD 종양 세포로 접종하였다. 8일째 종양이 분해되어 CD3-PE, CD4-PE, CD8-PE, CD80-FITC, CD86-FITC, 2B4-PE(NK-세포), CD22-PE(B-세포)또는 hLAG-3-FITC mAbs로 엘리트 세포형광계수기(Coulter)를 이용하여 분석되었다.

5.4 림프구 격감을 위해, 쥐는 -3, -2, -1, +4 그리고 +8일째 i.p로 200㎍의 정제된(18)항-CD4(YTS 191.1.2)또는 항-CD8(YTS 169.4.2.1)mAb를 받았다. 야생형 또는 hLAG-3 TS/A 종양 세포가 0일째(MTD) s.c로 접종되었다. 이들 mAb의 약량을 받아들인 콘트롤 쥐의 세포형광계수 분석에서 지라에서 표적 개체군의 95% 이상의 감소가 밝혀졌다(데이터에 나타나 있지 않음).

6. 실험관내 연구

세포 독성분석을 위해, 종양 특이적 단기 CTL은 혼성 림프구 종양 세포 배양물을 이용해 만들어졌다. 간단히 말하면, 3 ×10⁷지라 세포가 30일째고정된 종양을 거부한 쥐로부터 회수되었다. 이들 세포는 4일동안 완전배지내 3 ×10⁶ 방사선 에 노출된 부모 종양 세포로 자극하고 이후 50 IU/ml의 재조합 hIL-2(Cetus)로 2일동안 보충되었다.

비세포의 작동체 기능은 라벨된 표적 세포: 자가성 종양 세포, h-2^d 무관한 육종 WEHI 164 그리고 NK 민감성 YAC 세포 계통에 대한 표준 4 시간 ⁵¹Cr방출분석(25/1에서 200/1까지의 작동체-대-표적비율)에서 6일째 시험하였다. 삼배체의 용해퍼센트는 [(평균 실험 cpm-평균 자가성 cpm)/(평균 최대 cpm-평균 자가 cpm)] ×100으로 계산하였다. 우리는 특이적 용해를 고유 쥐 비세포의 용해를 제외하고 종양 세포를 거부한 쥐 비세포의 용해로써 정의하였다.

결과

실시예 Ⅰ:

종양 세포 계통에서 hCD4, hLAG-3, mLAG-3 그리고 MHC 분자의 표면 발현.

감염된 종양 클론은 2.2 섹션에서 설명한 것과 같이 착색하였고 hCD4, hLAG-3 그리고 mLAG-3의 발현 수준을 비교하여 분석하였다. 각 구성체를 위한 최적의 클론이 이 연구에 이용되었다. 다음의 종양 세포계통 TS/A는 높은 수준의 MHC 클래스 Ⅰ분자를 발현하고 MCA 205는 낮은 수준의 MHC 클래스 1을 발현한다. 감염된 클론과 비교해 볼 때 부모 종양 세포계통에서 MHC 클래스 Ⅰ 발현은 차이가 별로 관찰되지 없었다.

실시예Ⅱ:

종양 확립 모델과 백신: hCD4와 hLAG-3의 비교효과.

이들 실험은 유전자 감염후 세포의 종양 형성을 검사하기 위하여 시행하였다: 도1과 4에 보이는 MCA 205와 TS/A 그리고 RENCA. LAG-3⁺종양의 항종양 면역의 유도와 부모 종양 세포계통을 비교하였다.

야생형 MCA 205, TS/A 그리고 RENCA 세포는 피하를 통해 동계의 C57 BL/6 또는 BABL/C 쥐 또는 nu/nu 쥐로 이식될 때 점진적으로 성장한다. 하이드로마이신 선별후에 역방향으로 클론된 hLAG cDNA로 안정적으로 감염된 종양 세포는 유사한 성장률을 가졌다.

MCA-LAG-3을 받아들인 동물은 이들 종양을 거부했다. MCA-CD4를 받아들인 동물은 wt MCA를 받아들인 동물보다 낮은 종양 성장률을 보였다. 이들(5개 이상)중 두 개는 완전히 종양을 거부했다(도1).

유사한 결과가 mLAG-3으로 수득되었다(데이터에 나타나 있지 않음).

이들 결과는 hLAG-3, mLAG-3 그리고 hCD4의 이소성 발현이 MCA 육종 세포계통의 면역원성을 증가시키고 MCA 감염체의 종양 형성을 예방한다, 즉, 이것이 악성 쥐 종양에 대해 강력한 면역을 유도한다는 것을 암시한다.

유사한 결과가 BALB/c 쥐에서 TS/A 종양 세포로 수득되었다(도2).

유사한 결과가 동계의 BALB/C 쥐에서 RENCA 종양 세포로 추가적으로 수득되었다.

따라서, 항종양 효과가 수득되었다:

- 상이한 MHC 복합성 유전자를 발현하는 쥐의 상이한 주(株)에서;

- 상이한 종양 세포 계통(다른 내재된 면역원성을 보이는, TS/A < MCA)을 이용해.

누드 쥐(nu/nu)는 wt MCA, MCA hLAG-3 그리고 MCA hCD4형 종양 세포로 접종했고 감염체들은 유사하게 성장했다.

이것은 체계적-, 장기 지속-, 종양 특이적-hLAC-3 또는 hCD4-촉진 면역이 T-세포에 의해 조정된다는 사실을 실증한다.

이전에 wt MCA, MCA hLAG-3 그리고 MCA hCD4형 종양 세포로 접종되었고 MTD 주사 30일 후 종양이 없어진 쥐는 다시 5배의 MTD 부모 종양 세포 또는 무관한 동계의 MC38 콜론 암(종)세포계통으로 자극(1배)하였다.

결과는 도2와 3에 나타나 있다.

자극후, wt MCA의 성장은 MCA-LAG-3 세포와 MCA-CD4 세포(도2)를 받아들인 동물 모두에 대한 생존 동물에서 지체되었다(도2).

이런 효과는 무관한 종양 MC38(도3)로 다시 자극한 동물에서는 관찰되지 않았다.

이것은 hLAG-3과 hCD4의 이소성 발현 모두가 항항원체-유사 효과를 가지고 비변형된 부모 종양에 대한 장기-지속 항원 특이적 면역을 유도한다는 것을 암시한다.

실시예 Ⅲ:

C57BL/6 쥐에서 MCA 205 종양의 MCA-hLAG-3으로의 치료

각 5마리로 이루어진 세 개의 그룹이 실험을 위하여 이용되었다.

각 그룹은 wt MCA로 한 측면에 접종되었고 3일 후, MCA wt(그룹 1), 2.10⁵ 세포로 MCA-hLAG-3(그룹 2) 그리고 1.10⁶세포로 MCA-hLAG-3(그룹 3)으로 접종되었다.

원 종양의 크기를 30일동안 각 그룹에서 측정하였다. 이 결과는 도5에서 나타나 있다.

MCA-hLAG-3이 주사되면 약량 의존 방식으로 종양 생장이 지체되었다.

이 실험은 종양 생장에 대한 LAG-3의 체계적 효과를 입증하고 LAG-3이 고형 종양에 대한 치료요법약물임을 암시한다.

실시예 Ⅳ:

C57BL/6 쥐에서 wt MCA 205 종양의 용해성 LAG-3으로의 치료

각 5마리로 이루어진 세 개의 그룹은 PBS(그룹 1)내에서 또는 25㎍(그룹 2)또는 250㎍(그룹 3)의 양으로 용해성 인체 LAG-3(shLAG-3 D1D4)을 함유한 PBS내에서 현탁된 wt MCA로 동시에 접종하였다.

종양의 크기는 30일 동안 각 그룹에 대해 측정되었다.

결과는 도6에 나타나 있다.

hLAG-3 D1D4가 공동-투여되면 약량 의존 종양 생장이 지체되었다.

이것은 용해성 hLAG-3의 체계적 투여가 생체내 종양 성장의 억제를 직접적으로 유도한다는 것을 보여준다.

실시예 Ⅴ:

인체 종양 림프구 침투성(TILs) 신세포암(종)(RCC)에 대한 생체내 LAG-3 발현.

인체에서, LAG-3은 조직(즉, 염증이 발생한 이차 림프구 기관)에서 발현되지만, PBMCs의 표면위에서, 심지어 생체내 활성화된 CD25⁺, CD69⁺ PBMCs위에서도 발현되지 않는다. LAG-3은 MHC-클래스 Ⅱ-제한 CD4⁺(3)에서보다 MHC 클래스 Ⅰ-제한 CD8⁺세포에서 더 높은 수준으로 발현되고 IL-12에 의한 또는 좀 더 강력한 조합 IL-2 + IL-12에 의한 LAG-3 발현은 CD4⁺세포보다 CD8⁺에서 더 강하다. LAG-3은 실험관 및 생체내에서 약하게 발현되는 활성화 항원이어서 가끔은 새롭게 분리된 종양에서 형광라벨링의 퍼센트와 특이성을 평가하기가 어렵다. LAG-3은 인체 종양에서 MHC class II⁺ APCs를 간섭하기 때문에, T-세포에 의해 침투되는 것으로 공지된 일련의 종양을 면역조직화학(APAAP 처리)을 이용해 이의 발현을 평가하였다. TIL에서 LAG-3 발현은 5 흑(색)종, 10 신세포암(종) 그리고 7 B-세포 임프종을 포함해 검사된 모든 샘플에서 감지되었다.

신세포암(종)에서 종양 침투 림프구에 대한 LAG-3 발현을 8명의 환자에게서 조사하였다.

분리된 종양은 면역형광계수 분석에 의한 실험을 위해 사용되었다. LAG-3의 발현은 림프구 개체군에서 연구하여 이의 크기와 과립성에 따라 결정하였다. 죽은 세포는 프로피디움 요오드화물로 착색함으로써 이 연구에서 배제하였다. TIL은 17B4로 양성 착색되는데, LAG-3 추가루프의 에피토오프의 특이적 단일클론 항체다.

결과는 P1-P3 환자에 대해 도7에 그리고 P4와 P5 환자에 대해서는 도 8에 나타나 있다.

모든 환자에 대해서, 림프구의 표면에 17B4의 결합을 보여주는 형광 절정의 이동이 관찰되었다.

따라서, 모든 환자에서, TIL은 무관한 환자들에서 RCC-TIL의 상당히 높은 비율(30%)로 LAG-3을 실제 발현한다.

모든 샘플에서, CD3⁺ T-세포가 CD8⁺ T-세포에 비해 훨씬 높은 발현(11%-48% 범위)으로 LAG-3을 발현한다.

대조적으로 말초혈 단일핵 세포는 이들 환자들에서 LAG-3^-인데, 여기에서 림프구에 대한 LAG-3의 발현은 종양에서 T-세포 활성과 관련된 현상이라는 것이 밝혀졌다.

또한 ELISA 분석법을 이용해서, 고농도(대략 1 ng/ml)의 용해성 LAG-3이 암에 걸린 환자의 혈액에서 발견되었다.

이들 자료는 LAG-3이 인체내 자연적으로 발생하는 항종양 반응에 관여하는 분자이고 LAG-3이 인체에서 종양 세포의 면역감독을 촉진하는데 사용된다는 것을 보여준다.

실시예 VI:

CD8 ⁺ T-cells 는 일차 거부반응을 조정한다.

hLAG-3 MCA 205와 TS/A 감염체의 거부반응은 T-림프구에 의존하는데, 그 이유는 거부반응이 T-세포-결핍 nu/nu 쥐에서는 관찰되지 않았기 때문이다. 이들 세포를 5 ×MTD 주사한후, 10mm 직경 종양을 8일째 절개하여 분리된 종양 세포와 종양 침투 림프구 모두를 FACS를 통해 분석하였다. LAG-3 감염체인 초기의 CD80^- 및 CD86^-를 비롯해 wt 종양은 접종이후에도 이들 마크에 대해 계속 음성인데 반해 LAG-3은 지속적으로 앤티-LAG-3 17B4 mAb를 이용해서 hLAG-3 종양에서 검출되었다. 8일째 외부이식된 종양에서, CD8⁺ 세포의 비율은 wt MCA 205에서 4%인데 비해 hLAG-3 MCA 205에서는 대략 31%이었다(도 9a), 반면에 CD4⁺, B 또는 NK 세포 부분개체군을 분석할 때는 어떤 차이도 관찰되지 않았다. 결국, CD4⁺ 와 CD8⁺ T-세포의 항종양 반응에 대한 각각의 기여는 이들 세포 부분개체군의 쥐를 격감시킴으로써 시험하였다. 도 9b에서 본 바와 같이, hLAG-3/TS/A MTD 접종시 CD8-특이적 mAb를 투여하면, hLAG-3/TS/A 종양 세포의 거부반응이 소멸된다. CD4⁺ 헬프 T-세포가 침강은 CD4-특이적 mAb에서 관찰된 부분 효과에 의해 이루어진다(도 9b).

실시예 VII:

종양-특이적 CTL 반응은 hLAG-3에 의해 강화된다.

hLAG-3의 항-종양 활성의 배경기작을 추가로 알아내기 위해서, 우리는 세포 독성 T 림프구(CTL)의 발생-비면역원성 TS/A 세포의 사멸-에 대한 LAG-3의 효과를 평가하였다. 비세포는 hLAG-3/TS/A 종양-이식 쥐에서 회수되었는데, 이 쥐는 재자극 실험에서 5 ×MTD wt 종양 세포를 거부할 수 있어 방사선에 노출된 TS/A 세포로 6일 동안 실험관내에서 자극하였다. CTL 활성이 hLAG-3 종양 세포-이식 쥐의 비세포에서 감지되었다(도 9c). 반면에 고유 동물에서 얻은 비세포는 어떠한 세포독성 활성도 보이지 않았다(데이터에 나타나 있지 않음). CTL 활성은 비면역원성 TS/A 세포에 대해 선택적인 것으로 보이는데, 그 이유는 NK-민감성 YAC 세포를 비롯해 동계의 WEHI 육종 세포는 용해되지 않았기 때문이다(도 9c).

실시예 VIII:

정착된 종양의 치료

본 발명자는 종양 생장이 백신 항항원체로 용해성 LAG-분자를 이용하면 조절될수 있다는 것을 보였다. 촉진제(mLAG-3lg, 1㎍ or 0.1㎍)와 항원(방사능 노출 세포)의 혼합물이 단일 주사되어도 효과적이었다(도 10).

생체내 용해성 LAG-3 분자는 MHC 클래스 II 분자를 통해 랑그한스 세포(백신 위치에 존재하는 임의의 APC)에 신호를 전달해 효과적으로 CD8⁺ T-세포를 시발하는 것으로 추정된다.

REFERENCES

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Claims

암 치료를 위해 활성 성분으로 LAG-3, LAG-3의 돌연변이체 및 이의 단편에서 선택된 MHC-클래스 II 리간드를 포함하며,

이때, 선택된 MHC-클래스 II 리간드는 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있으며, LAG-3의 돌연변이체 및 이의 단편은 LAG-3에 결합하는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 능력이 있으며,

이때 LAG-3의 돌연변이체는

-LAG-3의 아미노산 서열의 73번째 잔기 Arg가 Glu로 치환;

-LAG-3의 아미노산 서열의 75번째 잔기 Arg가 Ala로 치환;

-LAG-3의 아미노산 서열의 75번째 잔기 Arg가 Glu로 치환;

-LAG-3의 아미노산 서열의 76번째 잔기 Arg가 Glu로 치환된 돌연변이중 하나로 구성되며;

LAG-3 단편은 LAG-3의 D₁-D₂ 및 D₁-D₄ 단편에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서, MCH 클래스 II 리간드는 항원 특이적 T-세포 중개된 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
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제 2 항에 있어서 암치료는 CD8⁺ T-세포에 따른 면역 반응이 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
제 1, 2, 5항 중 어느 한 항에 있어서, MHC 클래스 II 리간드는 면역 반응이 요구되는 항원과 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
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제 1항에 있어서, 항원은 종양이 되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
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제 1 항에 있어서, 항암 면역요법에 사용되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
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LAG-3, LAG-3의 돌연변이체 및 이의 단편에서 선택된 MHC-클래스 II 리간드를 인코드하는 DNA에 의해 트랜스펙트(transfect)된 종양 세포,

이때, 선택된 MHC-클래스 II 리간드는 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있으며, LAG-3의 돌연변이체 및 이의 단편은 LAG-3에 결합하는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 능력이 있으며,

이때 LAG-3의 돌연변이체는

-LAG-3의 아미노산 서열의 73번째 잔기 Arg가 Glu로 치환;

-LAG-3의 아미노산 서열의 75번째 잔기 Arg가 Ala로 치환;

-LAG-3의 아미노산 서열의 75번째 잔기 Arg가 Glu로 치환;

-LAG-3의 아미노산 서열의 76번째 잔기 Arg가 Glu로 치환된 돌연변이중 하나로 구성되며;

LAG-3 단편은 LAG-3의 D₁-D₂ 및 D₁-D₄ 단편에서 선택되는 것을 특징으로 하는 종양 세포.
제22항의 종양 세포를 활성 성분으로 하는 암 치료용 조성물.
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