JP2001510806A

JP2001510806A - ワクチン用アジュバントとしてのｍｈｃクラスｉｉリガンドの使用および癌治療におけるｌａｇ−３の使用

Info

Publication number: JP2001510806A
Application number: JP2000503862A
Authority: JP
Inventors: フレデリク，トリエーベル
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1997-07-25
Filing date: 1998-07-23
Publication date: 2001-08-07
Anticipated expiration: 2018-07-23
Also published as: PT1002108E; EA200000161A1; EP0893507A1; ES2262242T3; WO1999004810A2; AU9254798A; EE200000039A; DE69834330T2; CA2293805A1; EA003740B1; CA2293805C; WO1999004810A3; US20020192195A1; EP1698701A1; CA2732570C; IL134212A0; KR20010021706A; JP4723722B2; CN1265149A; EP1698701B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、抗原特異的免疫応答を含む病的状態を予防または治療するための薬剤製造にＣＤ４およびＬＡＧ−３の様なＭＨＣクラスIIを用いること、ならびに、癌−免疫療法にＬＡＧ−３を用いること、に関する。また、本発明は、アジュバント様薬剤として存在する有効量のＭＨＣクラスIIリガンドと共に抗原特異的免疫応答を誘導する能力と持つ有効量の抗原を含む医薬組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ＬＡＧ−３およびＣＤ４の用途、より一般的には、抗原特異的免疫
応答を高めるためのワクチン用アジュバントとしてのＭＨＣクラスIIリガンドま
たはＭＨＣクラスII様リガンドの用途、ならびに、癌免疫療法での治療薬剤とし
てのＬＡＧ−３の用途に関する。

【０００２】現在では、ＭＨＣクラスII領域によってコードされるタンパク質は、リンパ球
および抗原提示細胞のような異なるリンパ系細胞の間の相互作用を含む、数多く
の免疫認識の態様に含まれると、認識されている。ＣＤ４を通して起こらないそ
の他の機構は、Tヘルパーリンパ球のエフェクター機能にあずかるという別の見解も示されている。

【０００３】ヒトＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺活性化Ｔ細胞ならびに活性化ＮＫ細胞内に発現す
るリンパ球活性化遺伝子(lymphocyte activation gene 3)（ＬＡＧ−３）は、４
つの細胞外イムノグロブリンスーパーファミリー(immunoglobulin superfamily)
（ＩｇＳＦ）ドメインを持つ５０３アミノ酸（ａａ）からなるＩ型膜タンパク質
をコードし（１）、ＭＨＣクラスＩＩ分子のリガンドでもある（２）。この配列
分析では、ＣＤ４内の相当する位置に認められるアミノ酸配列のストレッチと同
一の注目に値するパッチが認められたが、ヒトＣＤ４との全体的なアミノ酸配列
の相同性は、バックグラウンドのレベルよりわずかに高いのみである（おおよそ
２０％の配列同一性）。また、ＬＡＧ−３分子ではドメイン１（Ｄ１）と３（Ｄ
３）の間ならびにドメイン２（Ｄ２）と４（Ｄ４）の間にある程度の内部配列相
同性が存在し、このことから、ＬＡＧ−３は、先に存在する２つのＩｇＳＦ構造
からの遺伝子複製によりＣＤ４様に進化すると、考えられる（１）。さらに、Ｌ
ＡＧ−３およびＣＤ４遺伝子は、染色体１２の短いアームの末端部分上の非常に
近い位置にある（３）。それ故、ＬＡＧ−３およびＣＤ４は、ＩｇＳＦ内では進
化論上の「実のいとこ」であると考えることができる（２）。

【０００４】ＣＤ４様のｈＬＡＧ−３は、ドメイン２および４内にＷｘＣ記号モチーフを持
つＩｇ様エクトドメインからなる：しかしながら、ＣＤ４との違いは、（１７Ｂ
４ｍＡｂによって認識される）ドメイン１内にループ外配列が存在すること、お
よびヒトＬＡＧ−３（ｈＬＡＧ−３）内に細胞質内でプロリンを多く含むモチー
フ（ＥＰリピート）が存在することである。最近、ネズミのリンパ球活性化遺伝
子３（ｍＬＡＧ−３）がクローン化され、細胞質内尾内に同じプロリンに富むモ
チーフを持つｈＬＡＧ−３と、おおよそ７０％の相同性が認められた。

【０００５】抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂ存在下でのＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンの抗原特異的刺激
は、成長の長期化およびサイトカイン生成を導く（５）。ＣＤ４⁺リンパ球上で
のｈＬＡＧ−３の調節役割は、ＬＡＧ−３Ｉｇ融合タンパク質を持つＴ細胞上
で発現した架橋されたＭＨＣクラスII分子によって活性化されることが、示唆さ
れた（６）。ＬＡＧ−３ＭＨＣクラスII相互作用は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞上に発現
したＭＨＣクラスII分子による信号を阻害し（増殖およびサイトカイン生成の減
少）、このことから、ＬＡＧ−３およびＭＨＣ−３クラスIIは両方共、Ｔヘルパ
ー細胞仲介免疫応答のダウンレギュレーションに関するエフェクター分子である
、と考えられる。ｈＬＡＧ−３Ｉｇ融合タンパク質は、異種（ネズミとサル）
のＭＨＣクラスII分子と結合することが分かった。さらに、ＬＡＧ−３ヌル変異
を持つトランスジェニックマウスはＮＫ細胞区画に欠陥を持つので、エフェクタ
ー細胞内にポジティブシグナルを導入するために、ｍＬＡＧ−３が提供された（
７）。

【０００６】膜（Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＤ９５Ｌ、．．．）に発現するように処理された
、または分子（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、．．．）を分泌する、マウスの腫瘍細胞
系は、免疫応答または抗腫瘍効果を調べるために時折用いられる。この研究は、
多くの腫瘍細胞が潜在的に抗原性を持ち（９）、それらが分子を発現する場合、
免疫原となることを、示唆している。実験マウスの腫瘍は、それを非複製細胞ワ
クチンとして同系マウス内に一回注射した後、次に起こる致命的挑戦に対する防
御免疫応答を同系マウスが誘発する場合の本質的な免疫原に分類される。このよ
うな残存する免疫原性を保っていない腫瘍は、免疫原性に乏しいかまたは非免疫
原性であると定義される。

【０００７】抗腫瘍免疫応答は、主に、Ｔ細胞によって仲介される（１２）。最近の研究は
、理想的癌ワクチンの実用的実施への問題として知られている有効な抗原提示お
よびＴ細胞の不足を包含している。事実、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２また
はＧＭ−ＣＳＦのような様々なサイトカインをコードする遺伝子、またはＢ７の
様な共刺激分子をコードする遺伝子、をもつトランスフェクトされた腫瘍細胞は
、修飾細胞の初期の拒絶反応を導くだけでなく、続いて起こる未修飾の腫瘍細胞
による挑戦に対する防除免疫を誘発する場合もある（１３）。

【０００８】専門化した抗原提示細胞(antigen presenting cells)（ＡＰＣｓ）は、Ｔ細胞
活性化に必要とされる共刺激シグナルでＴ細胞に抗原を取り込ませ、プロセシン
グして提示し、最適な抗原提示を導く能力をもつ。特に、ＭＨＣクラスII⁺樹状
突起細胞(dendritic cells) （ＤＣｓ）は、抗原のプロセシングおよび免疫系へ
の提示に重要な役割を果たすことが立証されている。本発明者らは、腫瘍を修飾
してマクロファージおよび樹状突起細胞のような宿主のＡＰＣｓを直接誘発させ
ることができたならば、腫瘍の免疫原性は増加するであろうと仮定した。事実、
ｍＡｂまたはスーパー抗原を用いて、そのような細胞が特異的に発現するＭＨＣ
クラスII分子を架橋すると、シグナルが導入され、その結果としてＴＮＦαおよ
びＩＬ−１２が生成されると、報告されている（１４、１５）。リンパ球活性化
遺伝子−３ (Lymphocyte Activation Gene-3) （ＬＡＧ−３）は、ＣＤ４座にあ
り（１、１６）、ＣＤ４より高いアフィニティーでヒトおよびネズミのＭＨＣク
ラスII分子と結合するタンパク質をコードすることが、以前から報告されていた
（１７、６）。

【０００９】本出願の発明者らは、３つのＭＨＣクラスII−マウス腫瘍（免疫原性の乏しい
肉腫ＭＣＡ２０５および非免疫原性のＴＳ／Ａ＋ＲＥＮＣＡ腺癌）上のｈＬＡＧ
−３、ヒトＣＤ４（ｈＣＤ４）およびｍＬＡＧ−３の発現が、免疫応答を仲介し
、その結果、マウスの腫瘍を排除し、そして全身性免疫を誘導することができる
か否かについて研究した。

【００１０】結果として、ヒトまたはマウスのＬＡＧ−３は、固体腫瘍細胞系内に膜タンパ
ク質として発現させるか、または悪性の強いマウス腫瘍に対する潜在的免疫を誘
導する可溶性タンパク質としてマウス内に接種されるかのいずれかであることが
分かった。免疫はＴ細胞依存性であり、抗原特異的である。

【００１１】さらに、本発明者らはＣＤ４の役割について研究し、ヒトＣＤ４（ｈＣＤ４）
もまた全身に抗腫瘍応答を誘導することが分かった。

【００１２】同一の抗腫瘍応答がＴリンパ球欠損ヌードマウスでも得られたため、誘導され
た免疫はＴ細胞仲介であることが分かった。

【００１３】抗腫瘍効果は、異なる固有の免疫原性を提示する異なる腫瘍細胞系ならびに異
なるＭＨＣ遺伝子を発現する異なるマウス系を用いた場合にも、認められた。

【００１４】さらに、効果を誘導するｈＬＡＧ−３およびｈＣＤ４は、ｈＬＡＧ−３または
ｈＣＤ４を発現する腫瘍細胞系を野生型腫瘍細胞系の初回接種部位から離れた部
位に注射した場合にも、認められた。

【００１５】さらに、可溶性のｈＬＡＧ−３の全身投与は、直ちに、インビボでの腫瘍の増
殖阻害を誘導する。

【００１６】前記の結果はすべて、ＬＡＧ−３およびＣＤ−４は、抗原特異的Ｔ細胞仲介免
疫応答を促進する能力を持ち、母集団中の癌の発生の危険を防ぐための免疫治療
の道具として、より一般的には抗原特異的Ｔ細胞仲介免疫応答を含む任意の免疫
療法の道具として有用であり、そして、ＬＡＧ−３はさらにインビボでの腫瘍の
増殖を阻害するための道具として有用であることを証明している。

【００１７】さらに、本発明者らは、可溶性ＬＡＧ−３を、免疫応答を探索する抗原と共に
投与した場合に、ワクチンのアジュバントとして働く能力を持つことを示した。

【００１８】この役割は、皮膚直下に位置しＭＨＣクラスIIを通して誘発される、専門化し
たＡＰＣｓ（樹状突起細胞およびマクロファージ）による抗原提示が改善される
ことから説明することができる。

【００１９】このように、ＣＤ８⁺Ｔ細胞免疫の誘導は、ウイルス内（例えば、ＡＩＤＳ、
肝炎およびヘルペス）、ならびに細胞内寄生虫および細菌（例えば、ライ結核）
感染ならびに癌にも含まれるので、ＬＡＧ−３は、これらの疾病に含まれる病原
体作因に対する治療用ワクチンの接種、および癌の治療におけるそれ、に特に有
用となる。

【００２０】その態様の一つによれば、本発明は、抗原特異的免疫応答、好ましくは抗原特
異的Ｔ細胞仲介免疫応答を含む病的状況を予防または治療するための薬剤製造に
ＭＨＣクラスIIリガンドまたはＭＨＣクラスII様リガンドを用いることに関する
。

【００２１】第一の実施態様では、ＭＨＣクラスII結合分子は、ＬＡＧ−３、ならびにＬＡ
Ｇ−３のＭＨＣクラスIIリガンドと結合する能力を持つその誘導体である。

【００２２】本発明では、ＬＡＧ−３の誘導体とは、ＭＨＣクラスII分子を結合するＬＡＧ
−３の能力を維持する限りにおいて、ＬＡＧ−３の突然変異体(mutants) 、変異
体(variants)およびフラグメント、いわゆるＬＡＧ−３の可溶性フラグメント、
を意味する。

【００２３】即ち、以下の形のＬＡＧ−３： −全ＬＡＧ−３タンパク質 −４つのイムノグロブリン細胞外ドメインの少なくとも１つからなる、その可
溶性ポリペプチドフラグメント、即ち、フランス特許出願ＦＲ９００００１２
６に開示されたＬＡＧ−３配列のアミノ酸２３からアミノ酸４４８に及ぶ細胞外
領域を含むＬＡＧ−３の可溶性部分、 −実質上、第一および第二の全ドメインからなるＬＡＧ−３のフラグメント −以下のように、ＷＯ９５／３０７５０に定義されたような、実質上、第一お
よび第二の全ドメインまたは４つの全ドメインからなる、ＬＡＧ−３のフラグメ
ント −可能性ＬＡＧ−３の突然変異型、または、Ｄ１およびＤ２細胞外ドメインを
含む、および以下の位置；・７３位（ＡＲＧをＧＬＵで置換）、・７５位（ＡＲＧをＡＬＡまたはＧＬＵで置換）、・７６位（ＡＲＧをＧＬＵで置換）；の一つでのアミノ酸の置換、または、２つ以上のそれらの置換の組み合わせ、 −以下の位置；・３０位（ＡＳＰをＡＬＡで置換）；・５６位（ＨＩＳをＡＬＡで置換）；・７７位（ＴＹＲをＰＨＥで置換）；・８８位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）；・１０３位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）；・１０９位（ＡＳＰをＧＬＵで置換）；・１１５位（ＡＲＧをＡＬＡで置換）；の一つでのアミノ酸の置換、または５４位と６６位の間に含まれる領域の欠損、
または２つ以上のそれらの置換の組み合わせ、からなるそのフラグメント（その
ようなフラグメントは、ＰＮＡＳ、１９９７年６月（４）に記載されている）、 −または、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３を含む可溶性５２ｋＤタンパク質を含むＬＡ
Ｇ−３の生理的変異体：を用いることができる。

【００２４】第二の実施態様によれば、ＭＨＣクラスII結合タンパク質は、ＣＤ４またはＣ
Ｄ４のＭＨＣクラスIIリガンドと結合する能力を持つその誘導体である。

【００２５】ＣＤ４の誘導体は、ＬＡＧ−３の誘導体として定義されたようなそれらである
。それらは、ＭＨＣクラスII分子と結合するＣＤ４の能力を維持する限りにおい
て、いわゆるＣＤ４の突然変異体、変異体およびフラグメント、即ちＣＤ４の可
溶性フラグメントである。

【００２６】ＬＡＧ−３およびＣＤ４、即ちｈＬＡＧ−３およびｈＣＤ４または上記のよう
なその誘導体は、前記分子を発現する組換え体の一部分、例えばトランスフェク
トされた細胞または組換えウイルスとして投与することができる。

【００２７】また、本発明は、ＣＤ４あるいはＬＡＧ−３またはその誘導体のような、少な
くとも一つのＭＨＣクラスIIリガンドをコードするＤＮＡでトランスフェクトさ
れた腫瘍細胞に関する。

【００２８】また、本発明のさらなる目的は、薬剤、好ましくは抗原特異的免疫応答様抗原
特異的Ｔ細胞仲介免疫応答を含む病的状態を予防または治療するための、または
癌のような病的疾病を治療するための薬剤の製造に、ＣＤ４あるいはＬＡＧ−３
またはその誘導体のような少なくとも一つのＭＨＣクラスＩＩリガンドをコード
するＤＮＡでトランスフェクトされた、腫瘍細胞のような細胞を用いることであ
る。

【００２９】トランスフェクト細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞、特に哺乳動物の腫瘍細
胞である。

【００３０】一つのその態様によれば、本発明は、ＣＤ４あるいはＬＡＧ−３またはその誘
導体のような少なくとも一つのＭＨＣクラスIIリガンドをコードするＤＮＡでト
ランスフェクトされた細胞を調製する方法であって、細胞を患者から採取し、Ｃ
Ｄ４あるいはＬＡＧ−３またはその誘導体のような少なくとも一つのＭＨＣクラ
スIIリガンドをコードするＤＮＡを前記細胞にトランスフェクトし、そしてその
結果得られたトランスフェクト細胞を回収することからなる段階を含む、前記の
細胞調製方法に関する。

【００３１】本発明では、腫瘍細胞を調製するために、この方法を、患者から採取した腫瘍
細胞で再現させる。

【００３２】しかしながら、好ましい実施態様によれば、ＭＨＣクラスII結合タンパク質、
即ちＣＤ４あるいはＬＡＧ−３またはその誘導体を、遊離型、即ち可溶型で、全
身接種、例えば、皮下、筋肉内または静脈内注射によって、投与する。

【００３３】本発明の薬剤は、抗原特異的免疫応答、好ましくはＴ細胞仲介免疫応答と関連
する疾病を防ぐためのワクチンとして用いることができる。

【００３４】そのため、本発明の薬剤は、免疫応答を得るための一つまたはいくつかの抗原
と共に、適当なベヒクル内に投与される。抗原は、好ましくはＴ細胞仲介免疫応
答を促進することのできる、感染作因の抗原または腫瘍抗原のような、最終的に
はタンパク質組換え法によって得られる、不活性化あるいは弱毒化された感染性
作因、または精製された抗原であることができる。

【００３５】ワクチンを用いて、感染性作因が抗原特異的免疫応答、好ましくはＴ細胞仲介
免疫応答を促進する、ウイルス、細菌または寄生虫病のような、感染性疾病から
患者を防御することができる。

【００３６】また、Ｔ細胞仲介免疫応答、いわゆるＣＤ８⁺Ｔ細胞仲介免疫応答、を含む上
記のような感染性疾病の患者を治療するために、ワクチンを用いることができる
。

【００３７】存在するＴ細胞仲介免疫の増進を必要とする疾病の例を、以下の表に提供する
。

【００３８】

【表１】病原体薬剤疾病ウイルスＨＩＶＡＩＤＳＨＢＶ、ＨＣＶヘルペスＨＳＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ移植の失敗、カポジ肉腫ＨＴＬＶ１癌細胞内細菌リステリア属リステリア症ミコバクテリアライ、結核細胞内寄生虫プラスモディウム属等マラリアオンコジーン等大部分の癌腫、黒色腫、白血病そのような場合、抗原は細胞内で切り刻まれ、関連するペプチドがＭＨＣクラ
スＩ分子内に取り込まれ、ＣＤ８⁺細胞によって認識される細胞表面に提示され
る。ＬＡＧ−３ｌｇ分子が動物内に有効なＴ細胞応答を誘導し、インビトロでの
未成熟樹状突起細胞および単球を刺激することを示した本発明者らの結果から、
専門化ＡＰＣｓ内でＭＨＣクラスII分子を架橋することのできる状況下ではＬＡ
Ｇ−３は天然発生のＴ細胞アジュバントであることが、強く示唆される。

【００３９】また、ワクチンを用いると、固形腫瘍癌(solid tumor cancer)または白血病の
いずれの癌からも患者を防御することができる。

【００４０】さらに、癌患者を治療するために、ワクチンを用いることもできる。その場合、ＭＨＣクラスII結合タンパク質、いわゆるＬＡＧ−３またはＣＤ４
は、免疫応答、好ましくはＴ細胞仲介免疫応答を促進することのできる一つまた
はいくつかの抗原と共に、皮下、皮内または鼻腔噴霧のいずれかで、患者に投与
される。抗原は、ペプチド、リポペプチド、組換えタンパク質またはこれらの抗
原をコードするＤＮＡであることができる。

【００４１】抗癌ワクチンを、それらの遺伝子型で同定した危険集団に接種する（予防用ワ
クチン）、または腫瘍を持つ、あるいは手術後の再発の危険性の高い患者に接種
する（治療用ワクチン）ことができる。

【００４２】ワクチンを慣用のワクチン（予防用）として用いる場合も、また治療用ワクチ
ンとして用いる場合も、好ましくは、強力なプロモーター制御下で、ＬＡＧ−３
またはＣＤ４をコードするＤＮＡ配列を取り込んだ「裸」のプラスミド（１９）
として投与することができる。

【００４３】また、好ましくは、プラスミドは、免疫応答を探求する抗原をコードするＤＮ
Ａを含む。

【００４４】従って、本発明のさらなる目的は、有効量のＭＨＣクラスIIリガンドを、好ま
しくはＴ細胞応答を通して、免疫系を強化することのできる有効量の抗原と組み
合わせて含む、医薬組成物である。

【００４５】さらなるもう一つの態様では、本発明は、癌性腫瘍を持つ患者の抗癌免疫療法
のための薬剤としてＬＡＧ−３を用いることに関する。

【００４６】そのような場合、好ましくは、ＬＡＧ−３は、遊離のＬＡＧ−３タンパク質ま
たは医薬として許容しうるベヒクル内のその誘導体として、好ましくは上記のよ
うな可溶性誘導体として、投与される。

【００４７】ＬＡＧ−３を、腫瘍内注射または全身注射、例えば皮下、静脈内または筋肉内
注射として、投与することもできる。

【００４８】本発明のさらなる目的は、腫瘍の遺伝子治療法であって、患者の腫瘍細胞の一
部分を採取し、前記細胞にＣＤ４あるいはＬＡＧ−３またはその誘導体のような
、少なくとも一つのＭＨＣクラスIIリガンドをコードするＤＮＡをトランスフェ
クトし、そしてそうして得られたトランスフェクト細胞を患者に再導入すること
からなる段階を含む、前記の治療方法に関する。

【００４９】以下の実施例は、Ｔ細胞仲介免疫応答を含む病的状況の予防または治療におけ
るＬＡＧ−３およびＣＤ４の活性を示している。

【００５０】本発明をより良く理解するために、以下の添付図を参考にすることができる：図１は、野生型ＭＣＡ２０５腫瘍細胞（ＭＣＡＷＴ）、ｈＣＤをトランスフ
ェクトしたＭＣＡ２０５腫瘍細胞（ＭＣＡｈＣＤ４）およびｈＬＡＧ−３をト
ランスフェクトしたＭＣＡ２０５腫瘍細胞（ＭＣＡｈＬＡＧ−３）、を接種し
たＣ５７ＢＬ／６マウスの平均腫瘍サイズを示し；図２は、野生型ＭＣＡ腫瘍を最少の腫瘍形成性投与量で同一マウスに再投与し
た後に得られた結果（平均腫瘍サイズ）を示し；図３は、無関係の適切なＭＣ３８腫瘍細胞系を同一マウスに再投与した後に得
られた結果（平均腫瘍サイズ）を示し；図４は、異なるマウスの系統（ＢＡＬＢ／ｃ）および異なる腫瘍細胞系（ＴＳ
／Ａ）の野生型（ＴＳ／Ａｗｔ）またはｈＣＤ４（ＴＳ／ＡｈＣＤ４）また
はｈＬＡＧ−３（ＴＳ／ＡｈＬＡＧ−３）でトランスフェクトされたそれを用
いて得られた結果（平均腫瘍サイズ）を示し；図５は、存在する腫瘍を、ｈＬＡＧ−３を発現する異なる投与量のＭＣＡ細胞
で治療して得られた結果（平均腫瘍サイズ）を示し；図６は、可溶性ＬＡＧ−３をＭＣＡ細胞と共に（ＭＣＡｗｔ、ＭＣＡｗｔ
＋２５μｇＬＡＧ−３、およびＭＣＡｗｔ＋２５０μｇＬＡＧ−３）注射
して得られた結果（平均腫瘍サイズ）を示し；図６のフレーム内側の図は、腫瘍を持つマウスの割合（％）を示す。

【００５１】図７および図８は、腎細胞癌(renal cell carcinoma)（ＲＣＣ）の５人の患者
（Ｐ１−Ｐ５）の腫瘍透過性リンパ球(tumor infiltrating lymphosytes)（ＴＩ
ＬＳ）の膜内でのＬＡＧ−３の発現の結果を示し；図９は、ＣＤ８⁺リンパ球によって仲介されるｈＬＡＧ−３⁺腫瘍細胞の排除
を示す。

【００５２】ａ，ｈＬＡＧ−３ＭＣＡ２０５マウスからのＴＩＬｓと対照（ｗｔＭＣＡ
２０５）からのＴＩＬｓを比較した、ＣＤ８発現のＦＡＣＳ分析。ｂ，ＣＤ８⁺ Ｔ細胞は、ｈＬＡＧ−３ＴＳ／Ａ腫瘍の成長を制御する一因となる。マウスは
、−３、−２、−１、＋４および＋８日に、腹腔内に２００μｇの精製ＣＤ４ま
たはＣＤ８−特異的ｍＡｂを投与された。野生型またはｈＬＡＧ−３ＴＳ／Ａ
腫瘍細胞（ＭＴＤ）を０日目に皮下に接種した。データは、一回の実験での、個
々のグループ当たり５マウスの平均値±s.e.m.で示した。このような実験を２回
行い、同様の結果を得た。ｃ，ｈＬＡＧ−３／ＴＳ／Ａ細胞を排除したマウス内
での抗腫瘍ＣＴＬｓの活性の増加。マウスは、皮下に５ｘ１０⁴ｈＬＡＧ−３／
ＴＳ／Ａ細胞の移植を受け、３０日目に非経口で２．５ｘ１０⁵ＴＳ／Ａ細胞を
再投与した。腫瘍を持たないマウスから、６０日目に脾臓を収集し、細胞を、６
日間、照射し指標となる標的細胞と共に同時培養した。指標の標的細胞に対する
細胞溶解活性を、標準４時間⁵¹Ｃｒ遊離アッセイで試験し、エフェクター対標的
の比率(effector-to-target ratio)（Ｅ．Ｔ．）の差で示した。２マウスについ
ての結果を示す。これらの実験は、４マウスで２度行い同様の結果を得た。

【００５３】図１０は、ＬＡＧ−３ｌｇのワクチン接種を一回受けた同系ＭＣＡ２０５肉腫
細胞のＭＴＤを移植したマウス（２０Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の結果（平均腫瘍
サイズ）を示している。６日目に、５マウスづつ４グループに分け、皮下ワクチ
ン接種（２００μｌ）を一回行った。Ａｇは、照射（１００Ｇｙ）ＭＣＡ２０５
細胞を示す。

【００５４】実施例内に示す実験は、以下の材料および方法を用いることによって行われた
。

【００５５】材料および方法１．腫瘍細胞系用いたＭＨＣクラスＩ⁺およびクラスII⁺腫瘍細胞系は：免疫原性の乏しいメ
チルコラントレン誘導肉腫ＭＣＡ２０５細胞系（Ｃ５７ＢＬ／６Ｈ−２^bマウス
と同系）、免疫原性腎癌腫細胞系ＲＥＮＣＡおよび非免疫原性の非分化の自然発
生乳腺癌ＴＳ／Ａ細胞系（両方ともＢＡＬＢ／ＣＨ−２^dマウスと同系）：を用
いた。ＭＣ３８結腸癌細胞系（Ｃ５７ＢＬ／６マウスと同系）を、対照腫瘍とし
て、再投与実験に用いた。細胞を、完全培地（グルタミン、ピルビン酸ナトリウ
ム、ペニシリン／ストレプトマイシン、エンドトキシンを含まない１０％の胎児
ウシ血清および０．０５ｍＭ２−βメルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ
１６４０培養基）中、空気中に１０％ＣＯ₂の給湿大気中で、３７゜Ｃに保持し
た。免疫染色実験およびインビボ実験を行うために、細胞を、１ｍＭＥＤＴＡ
を含むＰＢＳを入れたそれらの培養ベッセルから採取した。皮下注射(Subcutane
ous injection) (s.c.)の前に、細胞を、３回、冷ＰＢＳ１Ｘで洗浄し、同一バッファーに再縣濁した。細胞は、２週間より長くは培養しなかった。

【００５６】２．マウス雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（６−８週齢）を、ＩＦＦＲＡ−ＣＲＥＤＯＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）より購入した。雌のＢＡＬＢ
／ｃマウス（４−８週齢）を、ＪＡＮＶＩＥＲＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆ
ｒａｎｃｅ）より購入した。このマウス系統はすべて、特定の病原体を含まない
状態で飼育した。雌のヌードは、ｔｈｅａｎｉｍａｌｆａｃｉｌｉｔｙｏ
ｆＩｎｓｔｉｔｕｔＧｕｓｔａｖｅＲｏｕｓｓｙより購入し、保護的微小
環境下に保った。

【００５７】３．遺伝子構築物ｈＬＡＧ−３、ｍＬＡＧ−３およびｈＣＤ４のｃＤＮＡを、ＮＴハイグロマイ
シンプラスミドベクター内にクローン化した（クローン化部位は、ＳＲαプロモ
ーター下、ｈＬＡＧ−３およびｈＣＤ４用にはＸｂａｌ、ｍＬＡＧ−３用にはＸ
ｈｏｌである）（１８）。逆方向にクローン化したＬＡＧ−３ｈｃＤＮＡを、
負の対照として用いた。すべての腫瘍細胞系（２．５ｘ１０⁶細胞）を、Ｅｕｒ
ｏｇｅｎｔｅｃａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いてエレクトロポ
レート：ＭＣＡ２０５細胞では２００Ｖ、ＴＳ／ＡおよびＲＥＮＣＡ細胞では３
００Ｖ、１５００μＦおよび無限シャント耐性：によって、トランスフェクトし
た。トランスフェクタントをハイグロマイシンＢ（Ｓｉｇｍａ）中で：ＭＣＡ２
０５を１００μｇ／ｍｌ中で、ＲＥＮＣＡおよびＴＳ／Ａトランスフェクタント
を２００μｇ／ｍｌ中で、選択した。トランスフェクトされた分子を発現する耐
性細胞は、Ｅｌｉｔｅｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈ
ｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を用いて定量し、そして限定希釈を行ってクローン化した
。個々の腫瘍細胞系内の個々の構築物についての最良のクローンをこの研究に用
いた。

【００５８】４．細胞蛍光定量法分析トランスフェクトされた分子を発現する耐性細胞は、飽和量の精製されたかま
たは腹水液のｍＡｂｓで、間接免疫蛍光によって染色した。最初に、細胞を、ｍ
Ａｂｓ：１７Ｂ４（抗−ｈＬＡＧ−３）（１）（２）、ＯＫＴ４（抗−ｈＣＤ４
）、負の対照として用いられるウサギの免疫前血清（ＰＩＳと呼ばれる）および
ウサギの免疫血清抗−ＬＡＧ−３（ＩＳと呼ばれる）：と共に、インキュベート
した。腫瘍上のマウスＭＨＣクラスＩおよびII分子の発現を、以下のｍＡｂｓ：
Ｈ−２Ｋ^dおよびＤ^d用に３４−１−２Ｓ、Ｈ−２Ｋ^dおよびＤ^d用に２８−８−
６Ｓ、１４−４−４Ｓ（Ｅ^d用）、Ｍ５０１１４（ＩＡおよびＩＥ用）：で検出
した。

【００５９】次いで、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣを結合したヤギの抗−マウス血清（ＧＡＭ
Ｃｏｕｌｔｅｒ）またはＦＩＴＣを結合したヤギの抗−ウサギ血清（ＧＡＲＳ
ｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．）とインキュベー
トした。浸潤細胞の存在または腫瘍周辺での細胞の漸増を研究するために、数匹
のマウスを殺し、腫瘍を分離した。細胞を、１７Ｂ４−ＦＩＴＣまたは以下のｍ
Ａｂｓ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；抗−ｍＣＤ４−ＰＥ（Ｌ３Ｔ４）、抗−ｍＣ
Ｄ８（Ｌｙ−２およびＬｙ−３．２）、抗−ｍＮＫ（２Ｂ４）および抗−ｍＣＤ
２２（Ｌｙｂ−８．２）；で、直接免疫蛍光によって染色した。Ｅｌｉｔｅｃ
ｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、細胞を選別した。

【００６０】次いで、陽性の細胞系を、限定希釈によってクローン化し、後に用いるため、
ＬＡＧ−３⁺またはＣＤ４⁺クローンを凍結した。

【００６１】可溶性ＬＡＧ−３分子を生成するために、ｈＬＡＧ−３およびｍＬＡＧ−３の
細胞外ドメインを、（６）に記載の方法に従って、それぞれ、ｈＩｇＧ１および
ｍＩｇＧ２ａＦｃ部分と融合させた。得られた組み換えタンパク質、ｈＬＡＧ
−３ＩｇおよびｍＬＡＧ−３Ｉｇを、ＣＨＯ細胞内で生成させ、プロテイン−Ａ
カラムで精製した。

【００６２】５．インビボでの腫瘍実験５．１腫瘍増殖の確立およびワクチン接種腫瘍細胞系を、最少腫瘍形成量(minimal tumorigenic dose)（ＭＴＤ）、ＭＣ
Ａ２０５では２．１０⁸細胞／マウス、ＴＳ／Ａでは５．１０⁴細胞、そしてＲ
ＥＮＣＡでは１０⁵細胞またはＭＴＤの５倍、を皮下注射することによって確立
した。注射３０日後、腫瘍を持たないマウスに、親の腫瘍細胞系（５ｘＭＴＤ）
を再投与した。対照細胞として、ＭＣ３８結腸癌細胞系を１０⁵細胞、ＴＳ／Ａ
腫瘍を切り取ったＣ５７ＢＬ／６内に、投与した。年齢の釣り合う無垢のＣ５７
ＢＬ／６またはＢＡＬＢ／ｃマウスに腫瘍細胞系を注射した。

【００６３】腫瘍の成長は、カリパスを用いて２つの腫瘍の垂直直径を測定することによっ
て、週に２−３回モニターした。インビボでの腫瘍実験日には、インビトロでも
細胞を細胞蛍光計によって分析し、増殖アッセイを行った。

【００６４】５．２腫瘍治療モデル０日、野生型腫瘍細胞系を左側腹部に皮下接種（ＭＴＤ）した。０、３または
６日目に、ＬＡＧ−３⁺腫瘍細胞を右腹部に注射（ＭＴＤまたは５倍のＭＴＤ）
し、遠隔部位のトランスフェクトされていない細胞への抗腫瘍効果を調べた。腫
瘍増殖を前記の方法に従ってモニターした。

【００６５】５．３サイトメトリー分析を行うために、上記の方法に従って、マウスに５
ｘＭＴＤ腫瘍細胞を皮下接種した。８日目、腫瘍を分離し、Ｅｌｉｔｅｃｙｔ
ｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、ＣＤ３−ＰＥ、ＣＤ４
−ＰＥ、ＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ８０−ＦＩＴＣ、ＣＤ８６−ＦＩＴＣ、２Ｂ４−Ｐ
Ｅ（ＮＫ細胞）、ＣＤ２２−ＰＥ（Ｂ細胞）またはｈＬＡＧ−３−ＦＩＴＣｍ
Ａｂｓで分析した。

【００６６】５．４リンパ球を消耗させるために、−３、−２、−１、＋４および＋８日
目に、マウスに２００μｇの精製された（１８）抗−ＣＤ４（ＹＴＳ１９１．
１．２）または抗−ＣＤ８（ＹＴＳ１６９．４．２．１）ｍＡｂｓを静脈内投
与した。野生型またはｈＬＡＧ−３ＴＳ／Ａ腫瘍細胞を、０日に皮下接種（Ｍ
ＴＤ）した。このような投与量のｍＡｂを投与された対照マウスの細胞蛍光計分
析から、脾臓内の標的集団が９５％以上減少することが、示された（データには
示されていない）。

【００６７】６．インビトロでの研究細胞毒性アッセイのために、腫瘍特異的短期ＣＴＬを、混合リンパ球腫瘍細胞
培養を用いて、生成した。簡単に言えば、確立された腫瘍を除去したマウスから
、３０日目に３ｘ１０⁷の脾臓細胞を収集した。これらの細胞を、完全培地中で
４日間、次いで、５０ＩＵ／ｍｌの組換えｈＩＬ−２（Ｃｅｔｕｓ）を添加して
２日間、３ｘ１０⁶の照射した親腫瘍細胞で刺激した。脾臓細胞のエフェクター
機能を、標識した標的細胞：自己由来の腫瘍細胞、Ｈ−２^d不適切肉腫ＷＥＨＩ
１６４およびＮＫ感受性ＹＡＣ細胞系に対して、標準４時間⁵¹Ｃｒ放出アッセイ
（エフェクター対標的比率２５／１から２００／１まで）で試験した。三重実験
での溶解割合（％）を、［（平均実験ｃｐｍ−平均自然ｃｐｍ）／(平均最大ｃｐｍ−平均自然ｃｐｍ）］ｘ１００として、計算した。我々ユーザーは、特異的
溶解を、腫瘍細胞を排除するマウス脾臓細胞の溶解−無垢なマウス脾臓細胞の溶
解、と定義した。

【００６８】結果実施例Ｉ：腫瘍細胞系上でのｈＣＤ４、ｈＬＡＧ−３、ｍＬＡＧ−３およびＭＨＣ分子の
表面発現トランスフェクトした腫瘍クローンを、２．２節に詳述した方法に従って、染
色し、ｈＣＤ４、ｈＬＡＧ−３およびｍＬＡＧ−３の発現レベルを比較した。個
々の構築物につき最良のクローンをこの研究に用いた。以下の腫瘍細胞系ＴＳ／
Ａは、高レベルのＭＨＣクラスＩ分子を発現し、そしてＭＣＡ２０５は、低レベ
ルのＭＨＣクラスＩを発現する。トランスフェクトしたクローンと比較した親の
腫瘍細胞系上へのＭＨＣクラスＩの発現の間に有意な差異は認められなかった。

【００６９】実施例II：腫瘍確立モデルおよびワクチン接種：ｈＣＤ４およびｈＬＡＧ−３の効果の比
較遺伝子トランスフェクション後の細胞の腫瘍形成性を試験するために、これら
の実験を行った：図１および４に示したＭＣＡ２０５およびＴＳ／ＡならびにＲ
ＥＮＣＡ。ＬＡＧ−３⁺腫瘍の抗腫瘍免疫の誘導を、親の腫瘍細胞系と比較した
。

【００７０】野生型ＭＣＡ２０５、ＴＳ／ＡおよびＲＥＮＣＡ細胞は、同系のＣ５７ＢＬ
／６またはＢＡＬＢ／Ｃマウスまたはｎｕ／ｎｕマウスのいずれかに皮下注入し
た場合、累進的に増殖した。安定にトランスフェクトされ次にヒドロマイシン選
択した逆方向にクローン化したｈＬＡＧ−３ｃＤＮＡを持つ腫瘍細胞も、同様
の増殖速度を持っていた。

【００７１】ＭＣＡ−ＬＡＧ−３を接種された動物は、腫瘍を排除した。ＭＣＡ−ＣＤ４を
接種された動物は、ｗｔＭＣＡを接種された動物より腫瘍増殖が低かった（図
１）。

【００７２】同様の結果は、ｍＬＡＧ−３でも得られた（データは示していない）。これらの結果から、ｈＬＡＧ−３、ｍＬＡＧ−３およびｈＣＤ４の異所性発現
は、ＭＣＡ肉腫細胞系の免疫原性を増加し、ＭＣＡトランスファクタントの腫瘍
形成を妨害する、即ち、それは悪性の高いマウス腫瘍に対する潜在的免疫を誘導
する。

【００７３】類似の結果は、ＢＡＬＢ／ｃマウス内のＴＳ／Ａ腫瘍細胞でも得られる（図２
）。

【００７４】さらに、類似の結果が、同系ＢＡＬＢ／ＣマウスのＲＥＮＣＡ腫瘍細胞でも得
られる。

【００７５】即ち、抗腫瘍効果は、 −異なるＭＨＣ複合遺伝子を発現する異なるマウス系統内で； −（異なる内在性免疫原性、ＴＳ／Ａ＜ＭＣＡ、を提示する）異なる腫瘍細胞
系を用いて；得られる。

【００７６】ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）に、ｗｔＭＣＡ、ＭＣＡｈＬＡＧ−３および
ＭＣＡｈＣＤ４型の腫瘍細胞を接種し、トランスフェクタントを同様に増殖さ
せた。

【００７７】これは、全身性−、長命−、腫瘍特異的−ｈＬＡＧまたはｈＣＤ４−増進免疫
がＴ細胞仲介であるという事実を実証する。

【００７８】前もって、ｗｔＭＣＡ、ＭＣＡｈＬＡＧ−３およびＭＣＡｈＣＤ４を接
種し、ＭＴＤ注射後３０日目に腫瘍を持たないマウスに５倍のＭＴＤ親腫瘍細胞
系または関連しない同系ＭＣ３８結腸癌腫細胞系を再投与（１倍）した。

【００７９】結果を図２および３に示す。再投与後、ＭＣＡ−ＬＡＧ−３細胞およびＭＣＡ−ＣＤ４細胞を投与された動
物の両方が、生き残った動物のｗｔＭＣＡの増殖を遅らせた（図２）。

【００８０】不適切な腫瘍ＭＣ３８を再投与された動物では、そのような効果は認められな
かった。

【００８１】このことから、ｈＬＡＧ−３およびｈＣＤ４の異所性発現は両方ともアジュバ
ント様効果を持ち、非修飾の親腫瘍に対する長期にわたる抗原特異的免疫を誘導
することが、分かる。

【００８２】実施例III：ＭＣＡ−ｈＬＡＧ−３を持つＣ５７ＢＬ／６マウスのＭＣＡ２０５腫瘍の治療
それぞれ５マウスからなる３グループを実験に用いた。

【００８３】それぞれのグループは、片腹にｗｔＭＣＡを、そして３日後にＭＣＡｗｔ
（グループ１）、ＭＣＡ−ｈＬＡＧ−３を２．１０⁵細胞（グループ２）、およ
びＭＣＡ−ｈＬＡＧ−３を１．１０⁶細胞（グループ３）のいずれかを接種した
。

【００８４】元からの腫瘍サイズを、それぞれのグループにつき３０日以上にわたって測定
した。結果を図５に示す。

【００８５】ＭＣＡ−ｈＬＡＧ−３の注入は、投与量依存様式で腫瘍の成長を遅らせた。この実験から、腫瘍成長へのＬＡＧ−３の全身的効果が確認され、ＬＡＧ−３
は固体腫瘍に対する治療薬剤となることが分かった。

【００８６】実施例IV：可溶性ＬＡＧ−３でのＣ５７ＢＬ／６マウス内のｗｔＭＣＡ２０５腫瘍の治
療。

【００８７】それぞれ５マウスからなる３つのグループに、ＰＢＳ（グループ１）または可
溶性ヒトＬＡＧ−３（ｓｈＬＡＧ−３Ｄ１Ｄ４）を２５μｇ（グループ２）あ
るいは２５０μｇ（グループ３）含むＰＢＳのいずれかに縣濁したｗｔＭＣＡを
同時接種した。

【００８８】腫瘍サイズを、それぞれのグループにつき３０日間にわたって測定した。結果を図６に示す。

【００８９】ｈＬＡＧ−３Ｄ１Ｄ４の同時投与は、投与量依存性腫瘍成長遅滞を誘導した
。

【００９０】このことから、可溶性ｈＬＡＧ−３の全身投与は、インビボでの腫瘍成長の阻
害を直ちに誘導することが、証明される。

【００９１】実施例Ｖ：インビボでの、ヒト腫瘍リンパ球浸潤(tumor lymphocytes infiltrating)（Ｔ
ＩＬｓ）腎細胞癌(renal cell carcinoma)（ＲＣＣ）上のＬＡＧ−３の発現。

【００９２】ヒトでは、ＬＡＧ−３を、組織（即ち、炎症を起こした第二リンパ系器官）内
に発現するが、ＰＢＭＣｓの表面上には発現せず（３）、インビボでは活性化さ
れたＣＤ２５⁺、ＣＤ６９⁺ ＰＢＭＣｓ上にさえ発現しない。ＬＡＧ−３は、Ｍ
ＨＣクラスII−制限ＣＤ４⁺細胞（３）上より、活性化されたＭＨＣクラスＩ−
制限ＣＤ８⁺細胞上に、ＩＬ−１２より高いレベルで発現し、ＩＬ−１２によっ
て、あるいはＩＬ−２＋ＩＬ−１２のより可能性のある組み合わせによるＬＡＧ
−３発現の誘導は、ＣＤ４⁺細胞よりＣＤ８⁺細胞上でより強い。ＬＡＧ−３は、
インビトロならびにインビボでは、わずかに発現する活性化抗原であり、新たに
分離された腫瘍内の蛍光標識の割合（％）および／または特異性の評価が難しい
ことがある。ＬＡＧ−３はヒト腫瘍内のＭＨＣクラスII⁺ＡＰＣｓを阻害するこ
とができるので、免疫組織化学（ＡＰＡＡＰ法）を用いて、Ｔ細胞によって浸潤
されることが知られている一連の腫瘍内でのその発現を評価した。ＴＩＬｓ上の
ＬＡＧ−３の発現は、５の黒色腫、１０の腎細胞腺腫、および７のＢ細胞リンパ
腫を含む、試験したサンプルのすべてで検出された。

【００９３】腎細胞癌腫瘍内の腫瘍浸潤リンパ球上のＬＡＧ−３発現について、８患者を調
査した。

【００９４】分離した腫瘍を、細胞蛍光計アッセイによる実験に用いた。ＬＡＧ−３の発現
を、そのサイズおよび顆粒症を測定することによって、リンパ球集団間で研究し
た。死亡した細胞は、ヨウ化プロピジウムで染色することによって研究から除外
した。ＴＩＬｓは１７Ｂ４、ＬＡＧ−３のループ外のエピトープに特異的なモノ
クローナル抗体、で染色された。

【００９５】患者Ｐ１−Ｐ３についての結果を図７に示し、患者Ｐ４およびＰ５の結果を図
８に示している。

【００９６】すべての患者で、リンパ球表面での１７Ｂ４抗体の結合を示す、蛍光ピークの
シフトが認められた。

【００９７】従って、すべての患者で、ＴＩＬｓは、無関係の患者の有意の割合（３０％）
のＲＣＣ−ＴＩＬと共に、ＬＡＧ−３を実際に発現した。

【００９８】すべてのサンプル内で、ＣＤ３⁺Ｔ細胞は、ＣＤ８⁺Ｔ細胞上でより高発現す
るＬＡＧ−３を（１１％−４８％の範囲で）発現することが認められた。

【００９９】対照的に、末梢血液単核細胞は、これらの患者内ではＬＡＧ−３^-であり、こ
のことから、リンパ球上でのＬＡＧ−３の発現は、腫瘍内でのＴ細胞活性化に関
連する現象であることが分かった。

【０１００】さらに、ＥＬＩＳＡアッセイを用いることによって、高濃度（約１ｎｇ／ｍｌ
）の可溶性ＬＡＧ−３を癌患者の血液内に見出した。

【０１０１】これらのデータは、ＬＡＧ−３がヒトの自然発生抗腫瘍応答に含まれる分子で
あることを示しており、ヒトの腫瘍細胞の免疫学的監視を後援するためにＬＡＧ
−３を用いることを支持している。

【０１０２】実施例VI：ＣＤ８⁺Ｔ細胞は初期排除を仲介する。

【０１０３】Ｔ−細胞欠如ｎｕ−ｎｕマウスでは排除は認められなかったため、ｈＬＡＧ−
３ＭＣＡ２０５およびＴＳ／Ａトランスフェクタントの排除は、Ｔリンパ球
に依存する。これら細胞を５ｘＭＴＤ注入した後、１０ｍｍ直径の腫瘍を８日目
に取り出し、分離した腫瘍細胞および腫瘍浸潤リンパ球の両方を、ＦＡＣＳにつ
いて分析した。ｗｔ腫瘍ならびにＬＡＧ−３トランスフェクタント（最初はＣＤ
８０^-およびＣＤ８６^-）は、接種後、依然これらのマーカーについて（−）のま
まであったが、ＬＡＧ−３は、抗−ＬＡＧ−３１７Ｂ４ｍＡｂを用いるとｈ
ＬＡＧ−３腫瘍上に常に検出された（データには示されていない）。外植片化し
た腫瘍−８日目には、ＣＤ８⁺細胞の割合は、ｈＬＡＧ−３ＭＣＡ２０５腫瘍
内で約３１％であったのに対してｗｔＭＣＡ２０５腫瘍内では４％であった（
図９ａ）が、これに対して、ＣＤ４⁺、ＢまたはＮＫ細胞のサブセットを分析し
た場合、差異は認められなかった。同様の結果は、ＴＳ／Ａ腫瘍でも認められた
（データには示されていない）。最終的に、抗腫瘍応答に対するＣＤ４⁺および
ＣＤ８⁺Ｔ細胞のそれぞれの構築は、これらの細胞サブセットのマウスを減らし
て試験した。図９ｂに示すように、ｈＬＡＧ−３／ＴＳ／ＡＭＴＤ接種時にＣ
Ｄ８−特異的ｍＡＢを投与すると、ｈＬＡＧ−３／ＴＳ／Ａ腫瘍細胞は排除され
なくなった。ＣＤ４⁺ヘルパーＴ細胞の参与は、ＣＤ−４特異的ｍＡｂで認めら
れた部分的影響によって示唆される（図９ｂ）。

【０１０４】実施例VII：腫瘍−特異的ＣＴＬ応答はｈＬＡＧ−３によって強められる。

【０１０５】ＬＡＧ−３の抗腫瘍活性の裏に隠されたメカニズムをさらに調べるために、我
々は、細胞毒性Ｔ−リンパ球(cytotoxic T lymphocyte)（ＣＴＬ）の生成へのそ
の影響−非免疫原性ＴＳ／Ａ細胞の刺殺−について評価した。脾臓細胞を、再投
与実験で５ｘＭＴＤｗｔ腫瘍細胞を排除することができたｈＬＡＧ−３／ＴＳ
／Ａ腫瘍−移植マウスから収集し、そして、インビトロで、照射ＴＳ／Ａ細胞で
６日間、再刺激した。ｈＬＡＧ−３腫瘍細胞−移植マウスの脾臓細胞内にＣＴＬ
活性を検出した（図９ｃ）が、無垢の動物からの脾臓細胞は、細胞毒性活性を示
さなかった（データには示されていない）。ＣＴＬ活性は、同系のＷＥＨＩ肉腫
細胞ならびにＮＫ−感受性ＹＡＣ細胞を溶解しなかった（図９ｃ）ため、非免疫
原性ＴＳ／Ａ細胞に選択的であると考えられる。

【０１０６】実施例VIII：確立された腫瘍の治療発明者らは、ワクチンアジュバントとして可溶性ＬＡＧ−分子を用いることに
よって、腫瘍成長が制御されることを示した。抗原（照射腫瘍細胞）＋ブースタ
ー（ｍＬＳＧ−３Ｉｇ、１μｇまたは０．１μｇ）の混合物の一回の注射は効果
的であった（図１０）。

【０１０７】インビボで、可溶性ＬＡＧ−３分子は、ＭＨＣクラスII分子を通してランゲル
ハンス島細胞（またはワクチン部位に存在する任意のＡＰＣ）をシグナル化し、
有効にＣＤ８⁺Ｔ細胞を初期化することが出来ると、考えられる。

【０１０８】参考文献１．Ｔｒｉｅｂｅｌｅｔａｌ，Ｊ．ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９０，１７１：
１３９３−１４０５２．Ｂａｉｘｅｒａｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９２，１７
６：３２７−３３７３．Ｈｕａｒｄｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９４，３
９：２１３４．Ｈｕａｒｄｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．，１９９７，１１：５７４４−５７４９５．Ｈｕａｒｄｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，２
４：３２１６−３２２１６．Ｈｕａｒｄｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，２
６：１１８０−１１８６７．Ｍｉｙａｚａｋｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７２：４
０８８．Ａｎｇｅｖｉｎｅｔａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｌ．Ｊ．ｏｆＣａｎｃｅ
ｒ，１９９７９．Ｌｕｒｑｕｉｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．，１９９２，７１：１０９３１０．Ｔａｋｅｂｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．ａｎｄＣｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．，１９８８，８：４６６１１．Ｃｏｓｇｒｏｖｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．，１９９１，６６：１
０５１１２．Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｍ．Ｐ．＆Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｊ．Ｒ．（１９９
５）ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓ
ｅｓ：ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＴｈｅｒａｐｙｏｆＣａｎｃｅｒ，ｅｄｓ．
ＤｅＶｉｔａＶ．，ＨｅｌｌｍａｎＳ＆Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．（Ｌ
ｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ），ｐｐ３−３７１３．Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１３，３９９−４１５１４．Ｗａｄｅ，Ｗ．Ｆ．，Ｄａｖｏｕｓｔ，Ｊ．，Ｓａｌａｍｅｒｏ，Ｊ．，
Ａｎｄｒｅ，Ｐ．，Ｗａｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．＆Ｃａｍｂｉｅｒ，Ｊ．Ｃ．（１９
９３）ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ１４，５３９−５４２１５．Ｋｏｃｈ，Ｆ．，Ｓｔａｎｚｌ，Ｕ．，Ｊｅｎｎｅｗｅｉｎ，Ｐ．，Ｊａ
ｎｋｅ，Ｋ．，Ｈｅｕｆｌｅｒ，Ｃ．，Ｋａｍｐｇｅｎ，Ｅ．，Ｒｏｍａｎｉ，
Ｎ．＆Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｇ．（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４，７４
１−６１６．Ｂｒｕｎｉｑｕｅｌ，Ｄ．，Ｂｏｒｉｅ．Ｎ．＆Ｔｒｉｅｂｅｌ，Ｆ．
（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４７，９６−９８１７．Ｈｕａｒｄ，Ｂ．，Ｐｒｉｇｅｎｔ，Ｐ．，Ｔｏｕｒｎｉｅｒ，Ｍ．，Ｂ
ｒｕｎｉｑｕｅｌ，Ｄ．＆Ｔｒｉｅｂｅｌ，Ｆ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．２５，２７１８−２７２１１８．ＭｃＫｉｎｎｅｙ，Ｍ．Ｍ．＆Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ，Ａ．（１９８７）
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ９６，２７１−２７３１９．Ｈ．Ｔｉｇｈｅ，Ｍ．Ｃｏｒｒ，Ｍ．Ｒｏｍａｎ＆Ｅ．Ｒａｚ，Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙｔｏｄａｙ，Ｆｅｂ．１９８８，１９，Ｎｏ２，８９−９６

【図面の簡単な説明】

【図１】野生型ＭＣＡ２０５腫瘍細胞（ＭＣＡＷＴ）、ｈＣＤをトランスフェクトし
たＭＣＡ２０５腫瘍細胞（ＭＣＡｈＣＤ４）およびｈＬＡＧ−３をトランスフ
ェクトしたＭＣＡ２０５腫瘍細胞（ＭＣＡｈＬＡＧ−３）、を接種したＣ５７
ＢＬ／６マウスの平均腫瘍サイズを示している。

【図２】野生型ＭＣＡ腫瘍を最少の腫瘍形成性投与量で同一マウスに再投与した後に得
られた結果（平均腫瘍サイズ）を示している。

【図３】無関係の適切なＭＣ３８腫瘍細胞系を同一マウスに再投与した後に得られた結
果（平均腫瘍サイズ）を示している。

【図４】異なるマウスの系統（ＢＡＬＢ／ｃ）および異なる腫瘍細胞系（ＴＳ／Ａ）の
野生型（ＴＳ／Ａｗｔ）またはｈＣＤ４（ＴＳ／ＡｈＣＤ４）またはｈＬＡ
Ｇ−３（ＴＳ／ＡｈＬＡＧ−３）でトランスフェクトされたそれを用いて得ら
れた結果（平均腫瘍サイズ）を示している。

【図５】存在する腫瘍を、ｈＬＡＧ−３を発現する異なる投与量のＭＣＡ細胞で治療し
て得られた結果（平均腫瘍サイズ）を示している。

【図６】可溶性ＬＡＧ−３をＭＣＡ細胞と共に（ＭＣＡｗｔ、ＭＣＡｗｔ＋２５μ
ｇＬＡＧ−３、およびＭＣＡｗｔ＋２５０μｇＬＡＧ−３）注射して得ら
れた結果（平均腫瘍サイズ）を示している。図６のフレーム内側の図は、腫瘍を持つマウスの割合（％）を示している。

【図７】腎細胞癌(renal cell carcinoma)（ＲＣＣ）の５人の患者（Ｐ１−Ｐ５）の腫
瘍透過性リンパ球(tumor infiltrating lymphosytes)（ＴＩＬＳ）の膜内でのＬ
ＡＧ−３の発現の結果を示している。

【図８】腎細胞癌(renal cell carcinoma)（ＲＣＣ）の５人の患者（Ｐ１−Ｐ５）の腫
瘍透過性リンパ球(tumor infiltrating lymphosytes)（ＴＩＬＳ）の膜内でのＬ
ＡＧ−３の発現の結果を示している。

【図９】ＣＤ８⁺リンパ球によって仲介されるｈＬＡＧ−３⁺腫瘍細胞の排除を示して
いる。Ａ）ｈＬＡＧ−３ＭＣＡ２０５マウスからのＴＩＬｓと対照（ｗｔＭＣＡ
２０５）からのＴＩＬｓを比較した、ＣＤ８発現のＦＡＣＳ分析。Ｂ）ＣＤ８⁺ Ｔ細胞は、ｈＬＡＧ−３ＴＳ／Ａ腫瘍の成長を制御する一因となる。マウスは
、−３、−２、−１、＋４および＋８日に、腹腔内に２００μｇの精製ＣＤ４ま
たはＣＤ８−特異的ｍＡｂを投与された。野生型またはｈＬＡＧ−３ＴＳ／Ａ
腫瘍細胞（ＭＴＤ）を０日目に皮下に接種した。データは、一回の実験での、個
々のグループ当たり５マウスの平均値±s.e.m.で示した。このような実験を２回
行い、同様の結果を得た。Ｃ）ｈＬＡＧ−３／ＴＳ／Ａ細胞を排除したマウス内
での抗腫瘍ＣＴＬｓの活性の増加。マウスは、皮下に５ｘ１０⁴ｈＬＡＧ−３／
ＴＳ／Ａ細胞の移植を受け、３０日目に非経口で２．５ｘ１０⁵ＴＳ／Ａ細胞を
再投与した。腫瘍を持たないマウスから、６０日目に脾臓を収集し、細胞を、６
日間、照射し指標となる標的細胞と共に同時培養した。指標の標的細胞に対する
細胞溶解活性を、標準４時間⁵¹Ｃｒ遊離アッセイで試験し、エフェクター対標的
の比率(effector-to-target ratio)（Ｅ．Ｔ．）の差で示した。２マウスについ
ての結果を示している。これらの実験は、４マウスで２度行い同様の結果を得た
。

【図１０】ＬＡＧ−３ｌｇのワクチン接種を一回受けた同系ＭＣＡ２０５肉腫細胞のＭＴ
Ｄを移植したマウス（２０Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の結果（平均腫瘍サイズ）を
示している。６日目に、５マウスづつ４グループに分け、皮下ワクチン接種（２
００μｌ）を一回行った。Ａｇは、照射（１００Ｇｙ）ＭＣＡ２０５細胞を示し
ている。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１０月２６日（２０００．１０．２６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 33/10 Ａ６１Ｐ 35/00 35/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者フレデリク，トリエーベルフランス共和国エフ−78000 ヴェルサイユ，リュー・サン−ルイ 10 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA13 BA44 CA53 MA05 NA14 ZB262 ZB332 ZB352 ZB372 4C085 AA03 AA38 BB01 DD86 EE01 EE06 FF13 FF21 FF30 GG02 GG03 GG04

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗原特異的免疫応答を含む病的状態を予防または治療するた
めの薬剤製造でのアジュバント様薬剤としての、ＣＤ４またはＬＡＧ−３のよう
なＭＨＣクラスIIリガンドの使用。
【請求項２】抗原特異的Ｔ細胞仲介免疫応答を含む病的状態を予防または
治療するための薬剤製造における、ＣＤ４またはＬＡＧ−３のようなＭＨＣクラ
スIIリガンドの使用。
【請求項３】ＭＨＣクラスII結合膜分子が、ＣＤ４またはＬＡＧ−３なら
びに相当するＭＨＣクラスIIリガンドと結合することの出来るその誘導体である
、請求項１記載の使用。
【請求項４】ＭＨＣクラスII結合膜分子が、ＬＡＧ−３、その変異体また
はその可溶性フラグメントである、請求項１記載の使用。
【請求項５】ＣＤ８⁺Ｔ細胞による細胞免疫を含む、病状を治療するため
の治療ワクチン用アジュバントとしての、ＬＡＧ−３の使用。
【請求項６】Ｔ細胞免疫応答を求める抗原と共に可溶性ＬＡＧ−３を投与
する、請求項５記載の可溶性ＬＡＧ−３の使用。
【請求項７】感染症、いわゆるウイルス病、寄生虫病または細菌感染症を
治療するための、請求項５または６記載の可溶性ＬＡＧ−３の使用。
【請求項８】癌を治療するための、請求項５または６記載の可溶性ＬＡＧ
−３の使用。
【請求項９】ＬＡＧ−３可溶性フラグメントが、ＬＡＧ−３のＤ₁−Ｄ₂お
よびＤ₁−Ｄ₄フラグメントからなる群より選択される、請求項４記載の使用。
【請求項１０】薬剤が前記リガンドを発現するトランスフェクト細胞の形
またはそのリガンドの可溶性分子の形で前記ＭＨＣIIリガンドを含む、請求項１
記載の使用。
【請求項１１】病的状態の発生を予防するための、またはひとたび発症し
た疾病を治療するためのワクチン製造における、請求項１または２記載の使用。
【請求項１２】抗原特異的Ｔ細胞仲介免疫応答による影響を原因とする病
的状態の発生を予防するための、またはひとたび発症した疾病を治療するための
ワクチン製造における、請求項１または２記載の使用。
【請求項１３】ＭＨＣクラスIIリガンドが、ＬＡＧ−３またはＣＤ４をコ
ードするＤＮＡ配列を取り込んだ裸のプラスミドで用いられる、請求項１１記載
の使用。
【請求項１４】プラスミドが免疫応答を求める抗原をコードするＤＮＡを
も含む、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】病的疾患が癌である、請求項１記載の使用。
【請求項１６】抗癌免疫療法のための薬剤製造での、ＬＡＧ−３の使用。
【請求項１７】アジュバント様薬剤としての有効量のＭＨＣクラスIIリガ
ンドと共に、抗原特異的免疫応答を誘導する能力を持つ有効量の抗原を含む、医
薬組成物。
【請求項１８】アジュバント様薬剤として有効量のＭＨＣクラスIIリガン
ドと共に、抗原特異的Ｔ細胞仲介免疫応答を誘導する能力を持つ有効量の抗原を
含む、医薬組成物。
【請求項１９】前記ＭＨＣクラスIIリガンドがｈＬＡＧ−３またはｈＣＤ
４である、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】前記ＭＨＣクラスIIリガンドがヒト可溶性ＬＡＧ−３であ
る、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２１】ワクチンとしての、請求項１８−２０のいずれか一項に記
載の医薬組成物。
【請求項２２】ＣＤ４あるいはＬＡＧ−３またはその誘導体のような、少
なくとも一つのＭＨＣクラスIIリガンドをコードするＤＮＡをトランスフェクト
した癌細胞。
【請求項２３】ＣＤ４あるいはＬＡＧ−３またはその誘導体のような少な
くとも一つのＭＨＣクラスIIリガンドをコードするＤＮＡをトランスフェクトし
た細胞、または、請求項１、２および１１−１６のいずれか一項に記載の薬剤製
造における、請求項１８記載の癌細胞の使用。
【請求項２４】ＣＤ４あるいはＬＡＧ−３またはその誘導体のような、少
なくとも一つのＭＨＣクラスIIリガンドをコードするＤＮＡをトランスフェクト
した細胞を調製する方法であって、細胞を患者から採取し、前記細胞にＣＤ４あ
るいはＬＡＧ−３またはその誘導体のような少なくとも一つのＭＨＣクラスIIリ
ガンドをトランスフェクトし、そして得られたトランスフェクト細胞を回収する
ことからなる段階を含む、前記の調製方法。
【請求項２５】ＣＤ４あるいはＬＡＧ−３またはその誘導体のような、少
なくとも一つのＭＨＣクラスIIリガンドをコードするＤＮＡをトランスフェクト
した腫瘍細胞を調製する方法であって、癌細胞を患者から採取し、前記癌細胞に
ＣＤ４あるいはＬＡＧ−３またはその誘導体のような少なくとも一つのＭＨＣク
ラスIIリガンドをトランスフェクトし、得られたトランスフェクト癌細胞を回収
することからなる段階を含む、前記の調製方法。